JP2022537780A - ポリペプチド - Google Patents

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Abstract

【解決手段】とりわけ、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰのＩＬ－７Ｒ（ＩＬ－７Ｒ）への結合を阻害することができるポリペプチドと、これらのポリペプチドを含む構築物および医薬組成物が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰのＩＬ－７Ｒへの結合を阻害することができるポリペプチドと、これらのポリペプチドを含む構築物および医薬組成物に関する。本発明はさらに、上記ポリペプチドをコードする核酸、上記ポリペプチドを調製するための方法、上記ポリペプチドをコードする核酸を含むｃＤＮＡおよびベクター、上記ポリペプチドを発現するまたは発現できる宿主細胞、ならびに上記ポリペプチドの使用に関する。
胃腸管の自己免疫疾患
胃腸管の自己免疫疾患には、クローン病（ＣＤ）などの炎症性腸疾患、および好酸球性食道炎（ＥｏＥ）などの他の自己免疫疾患が挙げられる。クローン病は、クローン症候群や局所腸炎とも呼ばれ、様々な症状を引き起こす。クローン病は主に、腹痛、下痢、嘔吐、および／または体重減少を引き起こすが、貧血、皮疹、関節炎、眼の炎症、疲労、および集中力欠如などの胃腸管（ＧＩＴ）以外の合併症を引き起こすこともあり得る（Ｂａｕｍｇａｒｔ ｅｔ ａｌ ２０１２）。クローン病は、従来の治療では制御が困難な、現時点では生涯続く難治性の胃腸疾患である。ＥｏＥは、食道機能障害を引き起こし、未治療の場合には線維症を引き起こす、食道に限定される著しい病的な好酸球浸潤によって定義される慢性疾患である。食道線維症および食道狭窄は、ＥｏＥの既知の合併症である。
抗体ベースの治療薬は、標的に対する特異性が高く、固有の毒性が低いことから、ＩＢＤおよびＥｏＥなどの自己免疫疾患の有効な治療として大きな可能性を持っている。３つの抗ＴＮＦα抗体、インフリキシマブ（商標名Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、アダリムマブ（商標名Ｈｕｍｉｒａ）、およびセルトリズマブ（または「セルトリズマブペゴル」、商標名Ｃｉｍｚｉａ）が、クローン病の処置に臨床的に使用されている。しかし、これらの抗体は、固有の不安定性があり、消化器系、胃腸管の病変部位に存在する炎症性プロテアーゼ、および腸管微生物叢によってタンパク質分解を受けやすいことから、一般に経口治療薬として投与するには適さないと考えられている。そのため、これらの薬剤は静脈注射や皮下注射で投与する必要があり、皮下注射器または注射針を正確かつ安全に使用するためには専門家のトレーニングが必要である。これらの薬剤は、無菌の機器、治療用ポリペプチドの液体製剤、無菌で安定した形態の前記ポリペプチドのバイアル包装、および針を侵入させるための対象の適切な部位を必要とする。対象は一般的に、注射を受ける前に心理的ストレスを感じ、注射を受けている間に痛みを感じる。このような全身性の抗ＴＮＦα抗体による長期的な治療には、重篤な感染症および癌のリスクの増加が伴う。さらに、製造コストが高いため、現状では、より重篤な患者への使用に限定されている。
現在、いくつかの低分子抗炎症薬および免疫抑制薬がクローン病に対して臨床開発中である（Ｄａｎｅｓｅ ２０１２、Ｓｈｅａｌｙ ｅｔ ａｌ ２０１０、およびＶｅｔｔｅｒ ＆ Ｎｅｕｒａｔｈ ２０１７）。これらの薬物は経口投与されるが、多くは投与後全身に吸収されるため、胃腸管病変に対する作用とは無関係な全身的な免疫抑制作用を有する可能性がある。さらに、低分子は抗体の特異性を欠くため、重大な標的外副作用のリスクは高いままである。
胃腸管の自己免疫疾患に関連する標的に対して高い選択性を持ちつつ、曝露および活性が胃腸管に限定されている経口治療薬を送達する能力は、全身曝露の低減による安全性の大幅な改善と組み合わされて、注射可能な抗体と同様の有効性を与えることができる。
インターロイキン－７（ＩＬ－７）およびインターロイキン－７受容体（ＩＬ－７Ｒ）
インターロイキン７（ＩＬ－７）は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ１５、およびＩＬ－２１を含むサイトカインのファミリーのメンバーである。ＩＬ－７は、リンパ系臓器、腸、皮膚、および肝臓の非造血幹細胞および上皮細胞により構成的に産生され、胸腺におけるＴリンパ球の発達と、末梢Ｔ細胞の生存および恒常性制御に必須である（Ｆｒｙ ａｎｄ Ｍａｃｋａｌｌ， ２００２； Ｆｒｙ ａｎｄ Ｍａｃｋａｌｌ ２００５）。腸粘膜において、ＩＬ－７はさらに、病原性微生物の負荷に対する免疫反応の初期プライミングに重要な自然リンパ球細胞の表現型と機能が異なる集団、ならびにリンパ組織器官形成およびいくつかの樹状細胞集団を促進する能力を有するＣＤ４＋リンパ組織誘導（ＬＴｉ）細胞を制御する（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ ２０１５； Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ ２０１５）。さらに、ＩＬ－７は、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞の増殖を誘導し、エフェクターＴ細胞応答、優先的にはＴヘルパー１（Ｔｈ１）およびＴｈ１７応答を増強する（Ｄｏｏｍｓ、２０１３）。ＩＬ－７のＴ細胞に対する機能的効果により、ＩＬ－７は自己免疫や炎症だけでなく、防御免疫の重要なエンハンサーとなる。
異なる標的細胞に対するＩＬ－７の効果は、ＩＬ－７Ｒαサブユニット（ＣＤ１２７）と共通サイトカイン受容体γ鎖（γｃ）（ＣＤ１３２）を含むヘテロ二量体複合体であるＩＬ－７Ｒを介して媒介される。完全長ヒトＩＬ－７Ｒαは、２１９残基細胞外ドメイン、２５残基膜貫通ドメイン、および１９５残基の細胞内ドメインからなる。ＩＬ－７で誘導された受容体の活性化は、最初にＩＬ－７がＩＬ－７Ｒαと相互作用して複合体を形成し、その後、γｃを動員して、活性化された受容体シグナル伝達複合体を形成すると考えられている。ＩＬ－７による２つの受容体サブユニットの会合は、ＪＡＫ／Ｓｔａｔ、ＰＩ３／Ａｋｔ、ＳＲＣシグナル伝達カスケードを介して細胞内のリン酸化現象を活性化する（Ｗａｌｓｈ、２０１２）。
ＩＬ－７Ｒαは、細胞膜に結合したフォーマットで利用可能なだけでなく、可溶性形態（ｓＩＬ－７Ｒα）としても利用可能である。ｓＩＬ－７Ｒは膜結合型受容体のシェディングによって生成され、膜貫通型ドメインを欠くタンパク質をもたらす（ＩＬ－７Ｒαエクソン６の）選択的スプライシングによって産生され、ヒト血漿中に存在するｓＩＬ－７Ｒαは、主に選択的スプライシングに由来する（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ ２００９）。ＩＬ－７Ｒα遺伝子の４つの共通ハプロタイプが同定されている（Ｔｅｕｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ ２００３）。２つのハプロタイプは、可溶型受容体の発現と産生の変化、および多発性硬化症と１型糖尿病を含む自己免疫疾患に対する感受性に関連付けられている（Ｈａｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２００７）。
ヒトＴ細胞の発生とホメオスタシスにおけるＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒαの役割に加えて、前臨床研究では、異なる自己免疫疾患および炎症性疾患の動物モデルにおいてＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒα経路の関与が証明されている。これらの研究により、疾患病理学に関連するさらなるＩＬ－７依存性のメカニズムが特定され、関連する自己免疫疾患および慢性炎症疾患を抱える患者の治療のための潜在的な標的としてＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒα相互作用が注目されるようになった。
前臨床研究では、ＩＬ－７Ｒα遮断抗体の短期全身投与が、自己免疫疾患や胃腸の炎症モデルにおいて有効な治療をもたらすことが実証されている。ＩＢＤモデルでは、ＩＬ－７Ｒ－アンタゴニスト治療後の有効性に関する主なメカニズムは、中レベル～高レベルのＩＬ－７Ｒα（ＣＤ１２７）を発現し、間質細胞や上皮細胞によるＩＬ－７の産生の増加により炎症腸内で活性化され得る腸炎惹起性Ｔ細胞（ＩＬ－７Ｒ＋エフェクター／メモリーＴ細胞）の局所的枯渇または機能抑制を含むものと考えられている。健常な粘膜では、超低レベルのＩＬ－７Ｒを発現する腸常在性のＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は共生細菌に対する制御異常ＣＤ４＋Ｔ応答を抑制することが予想される。しかしながら、Ｈｅｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１２によって、ＩＬ－７リッチな環境では、ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの従来のＴ細胞の増殖を抑制する能力が損なわれることが示唆されている。したがって、胃腸疾患において、ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒシグナル伝達の遮断は、エフェクターＴ細胞の活性化を阻害し、制御性Ｔ細胞の抑制機能を回復させることによって、Ｔ細胞媒介性の炎症を制御するのに役立つことができる。マウスＩＢＤモデルおよびエクスビボのヒト組織研究からの証拠は、自然リンパ球（ＩＬＣ）を含む自然免疫細胞のＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒα依存的活性化が胃腸炎症性疾患に関与するプロセスに寄与していることも示唆している。
胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）およびＩＬ－７Ｒ
ＴＳＬＰは、生体の粘膜表面における炎症プロセスの制御に関与していると考えられている、皮膚、肺、腸、および眼組織の上皮細胞によって産生されるサイトカインである。ＴＳＬＰは、樹状細胞（ＤＣ）および自然リンパ球細胞（ＩＬＣ）を刺激して、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１３）の分泌を誘導し、Ｔｈ２型炎症の発生を促進する。ＴＳＬＰは、アトピー性皮膚炎、鼻炎などのいくつかのアレルギー性疾患の発生の根底にあり、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含む腸疾患も促進すると考えられている。逆説的ではあるが、ＴＳＬＰは胃腸管における免疫ホメオスタシスの維持や粘膜保護にとって重要であることも報告されている。近年、ＴＳＬＰが２つの異なるアイソフォームとして発現され得ることが発見され、このサイトカインの一見対照的な活性について生物学的な説明がなされている（Ｆｏｒｎａｓａ ｅｔ ａｌ ２０１５； Ｔｓｉｌｉｎｇｉｒｉ ｅｔ ａｌ ２０１７）。分子生物学的研究により、ＴＳＬＰ遺伝子は、２つの異なるプロモーター領域によって制御される２つのコードＲＮＡを生じさせることができることが示されている。転写物の１つは、１５９ａａのＴＳＬＰの長いアイソフォーム（Ｌ－ＴＳＬＰ）（ＵＮＩＰＲＯＴエントリーＱ９６９Ｄ９、配列番号６２）を、もう一つの転写物は、Ｌ－ＴＳＬＰのＣ末端６３ａａを包含するＴＳＬＰの短い形態（Ｓ－ＴＳＬＰ）（ＵＮＩＰＲＯＴエントリーＱ９６９Ｄ９－２、配列番号６３）をコードする。Ｌ－ＴＳＬＰは、ＴＳＬＰ特異的受容体鎖（ＴＳＬＰＲ）とＩＬ－７Ｒα鎖を含む受容体複合体を介して、標的細胞に作用する。近年、構造研究では、ＩＬ－７およびＬ－ＴＳＬＰとＴＳＬＰ－受容体複合体のＩＬ－７Ｒα鎖との相互作用は、共通のＩＬ－７Ｒα結合部位を含むことが示されている（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ ｅｔ ａｌ ２０１７）。
Ｓ－ＴＳＬＰはＴＳＬＰＲに結合せず、Ｌ－ＴＳＬＰのこの受容体への結合を阻害することができない。著者の知る限り、Ｓ－ＴＳＬＰの特異的な受容体は現在までに同定されていない。
重要なことに、Ｓ－ＴＳＬＰが健康な皮膚によって、および、健康な腸粘膜組織において上皮細胞や固有層細胞によって、優先的に発現していることが示されている。Ｓ－ＴＳＬＰは、抗炎症活性を有し、インビトロでは、Ｓ－ＴＳＬＰは、単球由来ＤＣによる炎症促進性サイトカインの産生を阻害し、ＣＤ１０３＋ＤＣを免疫寛容原性の表現型に調整するのに寄与している。このように、腸管上皮によって産生されるＳ－ＴＳＬＰは、樹状細胞およびリンパ球を含む基礎免疫細胞に影響を与え、健康状態における免疫寛容原性反応や制御反応を促進することができると思われる。Ｓ－ＴＳＬＰはさらに、強力な抗菌（細菌および真菌）活性を示し、これは粘膜上皮の微生物侵入に対する保護に重要であると考えられる（Ｂｊｅｒｋａｎ ｅｔ ａｌ ２０１６）。健常組織におけるＳ－ＴＳＬＰの発現は構成的であるが、ビタミンＤ３やＰＰＡＲγアゴニストによってアップレギュレートされたり、炎症促進性の病原性細菌によってダウンレギュレートされたりすることがある。Ｌ－ＴＳＬＰは健常組織には存在しないが、炎症促進性刺激に応答して発現し、ＤＣとＴｈ２細胞のエフェクター機能を活性化することによりＴｈ２サイトカイン関連炎症を促進において重要な役割を担っている。Ｌ－ＴＳＬＰで活性化されたＤＣに曝露された天然ＣＤ４＋Ｔ細胞は、増殖とＴｈ２リンパ球への分化を経験する。Ｌ－ＴＳＬＰは、好塩基球、ＩＬＣ（ＩＬＣ２）、および好酸球の活性化を通じてＴｈ２自然免疫応答を刺激することもできる。
近年の研究により、炎症性腸疾患および好酸球性食道炎（ＥｏＥ）を含む腸疾患において、両ＴＳＬＰアイソフォームの発現パターンが定常状態から劇的に変化していることが明らかになっている。Ｒｉｍｏｌｄｉ ｅｔ ａｌ ２００５は、ＴＳＬＰ（この例では、Ｆｏｒｎａｓａ ｅｔ ａｌ ２０１５の知見と同様に、この例では特にＳ－ＴＳＬＰであったと思われる）は、健康な大腸組織から単離した初代上皮細胞によって構成的に発現されたことを報告した。しかしながら、ＣＤを抱える患者の６／９名からの上皮細胞でＴＳＬＰの発現が検出されないことが判明した。ＣＤ上皮細胞が疾患粘膜でＳ－ＴＳＬＰを産生できないことで、通常、非炎症的環境を作り出すことによって腸のホメオスタシスを維持するのに役立つメカニズムが機能しなくなる。このメカニズムの欠陥は、望ましくないＴｈ１炎症反応を誘発し、ＣＤの発症に寄与する可能性がある。クローン病で優勢な固有層Ｔｈ１細胞とは対照的に、潰瘍性大腸炎の患者のＴ細胞は、Ｔｈ２型サイトカインのＩＬ－５とＩＬ－１３を産生することが示されているが、これらの細胞は低レベルのＩＬ－４産生しか示さないことから、古典的Ｔｈ２細胞の特徴をすべて示しているわけではないことが示唆される。機能的には、ＩＬ－１３は線維症を促進し、腸管上皮細胞におけるタイトジャンクション機能の変化とアポトーシスを引き起こし、それによって粘膜潰瘍を誘導することが示されている。近年、Ｆｏｒｎａｓａ ｅｔ ａｌ ２０１５において、Ｌ－ＴＳＬＰ特異的抗体で検出されるＴＳＬＰの発現が、潰瘍性大腸炎患者の腸組織において、健常な大腸粘膜で検出されるレベルと比較して、有意に上昇していることが報告された。ＴＳＬＰ活性化樹状細胞（ＤＣ）は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ－５、ＩＬ－１３、およびＴＮＦ産生炎症性Ｔｈ２細胞へ分化誘導することができるため（Ｌｉｕ ２００６）、上皮細胞－樹状細胞界面で作用するこの上流サイトカインの阻害は、潰瘍性大腸炎患者の粘膜炎症の治療に有効な戦略であることが証明できるかもしれない。
疫学的データは、ＥｏＥの発症にアトピーのメカニズムと遺伝的要因が関与していることを裏付けている。重要なことに、ゲノムワイド関連研究の結果は、ＴＳＬＰとその受容体ＴＳＬＰＲをＥｏＥの病因の候補遺伝子として同定した（Ｃｉａｎｆｅｒｏｎｉ ａｎｄ Ｓｐｅｒｇｅｌ，２０１５）。ＴＳＬＰの発現はＥｏＥ患者の食道生検標本で増加し、免疫組織化学染色によって層状扁平上皮細胞に局在化している（Ｎｏｔｉ ｅｔ ａｌ ２０１３）。Ｌ－ＴＳＬＰは、炎症と組織リモデリングに寄与する、Ｔｈ２細胞、好塩基球、好酸球、および肥満細胞からのサイトカイン（ＣＣＬ－２６／エオタキシン－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、およびＩＬ－１３を含む）ならびに線維化促進因子の産生を強く促進するため、疾患病理の上流のドライバーであると思われている。
ＥｏＥでは、ＴＳＬＰは炎症カスケードの開始直後から上流の上皮の「マスタースイッチ（ｍａｓｔｅｒ－ｓｗｉｔｃｈ）」として機能していると考えられており、その結果、このサイトカインに拮抗することにより、これまでの標的化抗サイトカイン療法よりもさらに上流で炎症カスケードを停止させることができる可能性がある。この概念は、重症喘息患者におけるファーストインクラス（ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｃｌａｓｓ）のＴＳＬＰアンタゴニストｍＡｂであるテゼペルマブ（ＡＭＧ １５７）の最近の試験で得られたポジティブな結果によって裏付けられている（Ｃｏｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１７）。
上記に照らして、ＩＢＤおよびＥｏＥなどの炎症性疾患および／または自己免疫疾患のより効果的な治療法に対する満たされていないニーズが存在することが理解されるであろう。ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰのＩＬ－７Ｒへの結合を阻害することができる薬剤は、特に経口投与が可能であれば、そのような治療法を表すことができ、したがって、非常に望ましいと考えられることになる。
ＷＯ２０１３０５６９８４号、ＷＯ２０１５１８９３０２号、ＷＯ２０１１０９４２５９号、およびＷＯ２０１１１０４６８７号は、ＩＬ－７Ｒに対して指向する抗体を開示している。
本発明者らは、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰのＩＬ－７Ｒへの結合を阻害することができるポリペプチドを作製した。これらのポリペプチドはＩＬ－７Ｒαに結合する。これらのポリペプチドは、特に、驚くほど高い効力から利益を得る。それらは、カニクイザルＩＬ－７Ｒαと交差反応することができ、小腸と大腸のプロテアーゼに曝露されても安定したままである。
一実施形態では、これらのポリペプチドは、操作によりさらに増強されている。これらのさらに増強されたポリペプチドは、ヒト化されているが、それにもかかわらず、上記の利点を実質的に維持している配列を含んでいる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｂｉａｃｏｒｅ研究において高い親和性でＩＬ－７Ｒに結合し、ＥＬＩＳＡにおいて、ＩＬ－７およびＩＬ－７関連サイトカインＬ－ＴＳＬＰの両方とのＩＬ－７Ｒ相互作用の強力な阻害剤であることが示された。機能的な、細胞ベースのアッセイにおいて、本発明のあるポリペプチドは、臨床抗ＩＬ－７Ｒ ｍＡｂ８２９（「ＧＳＫ２６１８９６０」としても知られ、Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ ２０１９に開示された抗ＩＬ－７Ｒαモノクローナル抗体）と同様の効力を持って両サイトカインの生物学的作用（ＩＬ－７誘導Ｓｔａｔ５リン酸化、Ｌ－ＴＳＬＰ誘導ＴＡＲＣ産生）を阻害する。
インシリコモデリングは、本発明のあるポリペプチドの二重拮抗活性が、両方のサイトカインの共有された結合部位も構成するＩＬ－７Ｒのエピトープへのポリペプチドの結合に起因することを示唆している。特異性試験では、本発明のあるポリペプチドは、他のヒトＩＬ－７Ｒ－ファミリーまたは他のサイトカイン受容体に対してなんの結合活性も示さなかった。異種間の特異性アッセイでは、本発明のあるポリペプチドはマウスＩＬ－７Ｒに結合しなかったが、カニクイザルおよびヒトＩＬ－７Ｒには同様の効力で結合した。したがって、カニクイザルは前臨床開発研究に適した種であると考えられる。
炎症を起こした潰瘍性大腸炎粘膜組織のエクスビボ培養では、本発明の例示的ポリペプチドは、シグナル伝達タンパク質のリン酸化、炎症促進経路および免疫調節経路に関連するサイトカインおよびケモカインの産生を阻害することが示された。その結果は、本ポリペプチドによる粘膜ＩＬ－７Ｒ＋ｖｅ Ｔ細胞の拮抗作用が、疾患環境に密接に関連するモデルにおいて、臨床抗ＩＬ－７Ｒ ｍＡｂ８２９と少なくとも同じくらい効果的に炎症プロセスを阻害できることが実証され、本発明のポリペプチドが特に潰瘍性大腸炎患者において有効である可能性を与えるものである。インビボでは、正常なマウスに本発明のあるポリペプチドを経口投与すると、全消化器系を通過する間に消化に対する耐性を示す、高レベルの結腸内腔曝露（マイクロモル）を実証した。
したがって、これらのポリペプチドは、とりわけ、経口投与される場合、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）あるいは好酸球性食道炎の予防または治療に有用であると期待され得る。
本発明は、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰのＩＬ－７Ｒへの結合を阻害することができるポリペプチドを提供する。本発明はさらに、これらのポリペプチドを含む構築物および医薬組成物も提供する。さらに、上記ポリペプチドをコードする核酸、上記ポリペプチドを調製する方法、上記ポリペプチドをコードする核酸を含むｃＤＮＡおよびベクター、上記ポリペプチドを発現することができる宿主細胞、および上記ポリペプチドの使用も提供される。
上記の用語「および／または」についての疑念を避けるために、「ＩＬ－７のＩＬ－７Ｒへの結合を阻害することができるポリペプチド」は、ＩＬ－７およびＬ－ＴＳＬＰのＩＬ－７Ｒへの結合を阻害することができるポリペプチドを包含する。同様に、「Ｌ－ＴＳＬＰのＩＬ－７Ｒへの結合を阻害することができるポリペプチド」は、ＩＬ－７とＬ－ＴＳＬＰのＩＬ－７Ｒへの結合を阻害することができるポリペプチドを包含する。
本発明のポリペプチドは、少なくともいくつかの実施形態では、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰのＩＬ－７Ｒへの結合を阻害することができる先行技術の物質と比較して、以下の利点のうちの１つ以上を有することができる。
（ｉ）ＩＬ－７Ｒαに対する親和性が増加していること、
（ｉｉ）ＩＬ－７Ｒαに対する特異性が増加していること、
（ｉｉｉ）ＩＬ－７またはＬ－ＴＳＬＰのＩＬ－７Ｒへの結合に対する中和能力が増加していること、
（ｉｖ）ＩＬ－７およびＬ－ＴＳＬＰの両方のＩＬ－７Ｒへの結合を阻害すること、
（ｖ）ヒトやカニクイザルなどの異なる種からのＩＬ－７Ｒαとの交差反応性が増加していること、
（ｖｉ）例えば、マウス、カニクイザル、またはヒトに投与された場合の免疫原性が低下していること、
（ｖｉｉ）プロテアーゼの存在下、例えば（ａ）小腸および／または大腸で見られるプロテアーゼ、および／またはＩＢＤ炎症性プロテアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１２、他のＭＭＰ、およびカテプシンの存在下、ならびに、（ｂ）小腸および／または大腸で見られる微生物細胞の溶解によって活発に分泌および／または放出される、腸共生細菌叢および／または病原細菌からのプロテアーゼの存在下での安定性が増加していること、
（ｖｉｉｉ）生成中のプロテアーゼ分解に対する安定性が増加していること（例えば、酵母プロテアーゼに対する耐性）、
（ｉｘ）経口投与への適合性が増加していること、
（ｘ）経口投与後の腸管および固有層への局所送達に対する適合性が増加していること、
（ｘｉ）経口投与後の食道への局所送達に対する適合性が増加していること、
（ｘｉｉ）大腸菌などの細菌、またはアスペルギルス属、サッカロミセス属、クリベロマイセス属、ハンゼヌラ属、あるいはピキア属に属する酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリスなどの異種宿主における、発現に対する適合性が増加していること、
（ｘｉｉｉ）医薬品での使用のための適合性および改善された特性、
（ｘｉｖ）機能性食品での使用のための適合性および改善された特性、
（ｘｖ）粘膜下固有層にアクセスするために、炎症を起こした結腸粘膜上皮および粘膜下組織の浸透などの組織浸透性が向上していること、
（ｘｖｉ）多特異性フォーマットにおけるフォーマット化の適合性が増加していること、
（ｘｖｉｉ）新規エピトープに結合すること、
上記の利点（ｉ）～（ｘｖｉｉ）は、一価フォーマット、またはビヘッドフォーマット（例えば、ホモビヘッド（ｈｏｍｏｂｉｈｅａｄ）またはヘテロビヘッド（ｈｅｔｅｒｏｂｉｈｅａｄ）フォーマット）などの多価フォーマットで本発明のポリペプチドによって潜在的に実現され得る。
上記の点（および本明細書全体）における「ＩＬ－７Ｒ」の詳述は、本発明のポリペプチドがＩＬ－７ＲのＩＬ－７Ｒαサブユニットに特異的に結合することにより、適宜「ＩＬ－７Ｒα」と置き換えることもできる。
ヒトリンパ球におけるＩＬ－７誘導ｐＳＴＡＴ－５の阻害。 ヒト単球におけるＴＳＬＰ誘導ＴＡＲＣ分泌の阻害。 ＩＬ－７Ｒαに結合したＶ７Ｒ－２Ｅ９のモデル構造。 ヒトリンパ球におけるＩＬ－７誘導ｐＳＴＡＴ５のＡ６２Ｕ、Ａ５９Ｕ、およびｍＡｂ８２９阻害。 ＩＤ－Ａ４０ＵのＩＬ－７Ｒα種との交差反応性 ＩＤ－Ａ５９ＵおよびＩＤ－Ａ６２ＵのヒトおよびカニクイザルのＩＬ－７Ｒαとの交差反応性 ヒトＩＬ－７Ｒαに対するＩＤ－Ａ４０Ｕの特異性 消化器官マトリックス中でのＶ７Ｒ－２Ｅ９、ＩＤ－Ａ２４Ｕ、およびＩＤ－Ａ４０Ｕの生存の割合 ヒト糞便上清中のＩＤ－Ａ６２ＵおよびＩＤ－Ａ４１Ｕの安定性の割合 エタネルセプト、ｍＡｂ８２９、およびＡ４０Ｕ－Ｆ／ＨのＭＭＰによる消化 未希釈の糞便上清中の期待濃度（ＩＤ－Ａ２４Ｕ対ＩＤ－Ａ４０Ｕ対ＩＤ－３８Ｆ） 消化管の未希釈上清中の期待濃度（ＩＤ－Ａ２４Ｕ対ＩＤ－Ａ４０Ｕ対ＩＤ－３８Ｆ） 未希釈糞便上清中の期待濃度（ＩＤ－Ａ４０Ｕ対ＩＤ－３８Ｆ） 消化管の未希釈上清中の期待濃度（ＩＤ－Ａ４０Ｕ対ＩＤ－３８Ｆ） ヒトＩＢＤ組織タンパク質のリン酸化プロファイル ヒトＩＢＤ組織タンパク質のリン酸化プロファイル ヒトＩＢＤ組織タンパク質のリン酸化プロファイル ヒトＩＢＤ組織タンパク質のリン酸化プロファイル 総リン酸化レベル
配列表の記載
配列番号１－ＩＤ－Ａ６２Ｕ ＣＤＲ１のポリペプチド配列、
配列番号２－ＩＤ－Ａ６２Ｕ ＣＤＲ２のポリペプチド配列、
配列番号３－ＩＤ－Ａ６２Ｕ ＣＤＲ３のポリペプチド配列、
配列番号４－ＩＤ－Ａ６２Ｕ ＦＲ１のポリペプチド配列、
配列番号５－ＩＤ－Ａ６２Ｕ ＦＲ２のポリペプチド配列、
配列番号６－ＩＤ－Ａ６２Ｕ ＦＲ３のポリペプチド配列、
配列番号７－ＩＤ－Ａ６２Ｕ ＦＲ４のポリペプチド配列、
配列番号８－ＩＤ－Ａ６２Ｕのポリペプチド配列、
配列番号９－Ｖ７Ｒ－２Ｂ６のポリペプチド配列、
配列番号１０－Ｖ７Ｒ－２Ｅ５のポリペプチド配列、
配列番号１１－Ｖ７Ｒ－２Ｅ９のポリペプチド配列、
配列番号１２－Ｖ７Ｒ－２Ｆ６のポリペプチド配列、
配列番号１３－Ｖ７Ｒ－３Ｂ５のポリペプチド配列、
配列番号１４－Ｖ７Ｒ－４Ｆ６のポリペプチド配列、
配列番号１５－Ｖ７Ｒ－６Ｃ１２のポリペプチド配列、
配列番号１６－ＩＤ－Ａ２Ｕのポリペプチド配列、
配列番号１７－ＩＤ－Ａ３Ｕのポリペプチド配列、
配列番号１８－ＩＤ－Ａ４Ｕのポリペプチド配列、
配列番号１９－ＩＤ－Ａ５Ｕのポリペプチド配列、
配列番号２０－ＩＤ－Ａ６Ｕのポリペプチド配列、
配列番号２１－ＩＤ－Ａ７Ｕのポリペプチド配列、
配列番号２２－ＩＤ－Ａ８Ｕのポリペプチド配列、
配列番号２３－ＩＤ－Ａ９Ｕのポリペプチド配列、
配列番号２４－ＩＤ－Ａ１０Ｕのポリペプチド配列、
配列番号２５－ＩＤ－Ａ１１Ｕのポリペプチド配列、
配列番号２６－ＩＤ－Ａ１２Ｕのポリペプチド配列、
配列番号２７－ＩＤ－Ａ１３Ｕのポリペプチド配列、
配列番号２８－ＩＤ－Ａ１４Ｕのポリペプチド配列、
配列番号２９－ＩＤ－Ａ１５Ｕのポリペプチド配列、
配列番号３０－ＩＤ－Ａ１６Ｕのポリペプチド配列、
配列番号３１－ＩＤ－Ａ１７Ｕのポリペプチド配列、
配列番号３２－ＩＤ－Ａ１８Ｕのポリペプチド配列、
配列番号３３－ＩＤ－Ａ１９Ｕのポリペプチド配列、
配列番号３４－ＩＤ－Ａ２０Ｕのポリペプチド配列、
配列番号３５－ＩＤ－Ａ２１Ｕのポリペプチド配列、
配列番号３６－ＩＤ－Ａ２３Ｕのポリペプチド配列、
配列番号３７－ＩＤ－Ａ２４Ｕのポリペプチド配列、
配列番号３８－ＩＤ－Ａ２５Ｕのポリペプチド配列、
配列番号３９－ＩＤ－Ａ２６Ｕのポリペプチド配列、
配列番号４０－ＩＤ－Ａ２７Ｕのポリペプチド配列、
配列番号４１－ＩＤ－Ａ２８Ｕのポリペプチド配列、
配列番号４２－ＩＤ－Ａ２９Ｕのポリペプチド配列、
配列番号４３－ＩＤ－Ａ３０Ｕのポリペプチド配列、
配列番号４４－ＩＤ－Ａ３１Ｕのポリペプチド配列、
配列番号４５－ＩＤ－Ａ３２Ｕのポリペプチド配列、
配列番号４６－ＩＤ－Ａ３３Ｕのポリペプチド配列、
配列番号４７－ＩＤ－Ａ３４Ｕのポリペプチド配列、
配列番号４８－ＩＤ－Ａ３５Ｕのポリペプチド配列、
配列番号４９－ＩＤ－Ａ３６Ｕのポリペプチド配列、
配列番号５０－ＩＤ－Ａ３７Ｕのポリペプチド配列、
配列番号５１－ＩＤ－Ａ３８Ｕのポリペプチド配列、
配列番号５２－ＩＤ－Ａ３９Ｕのポリペプチド配列、
配列番号５３－ＩＤ－Ａ４０Ｕのポリペプチド配列、
配列番号５４－ＩＤ－Ａ４３Ｕのポリペプチド配列、
配列番号５５－ＩＤ－Ａ５０Ｕのポリペプチド配列、
配列番号５６－ＩＤ－Ａ５２Ｕのポリペプチド配列、
配列番号５７－ＩＤ－Ａ５３Ｕのポリペプチド配列、
配列番号５８－ＩＤ－Ａ５４Ｕのポリペプチド配列、
配列番号５９－ＩＤ－Ａ５５Ｕのポリペプチド配列、
配列番号６０－ＩＤ－Ａ５７Ｕのポリペプチド配列、
配列番号６１－ＩＤ－Ａ５９Ｕのポリペプチド配列、
配列番号６２－Ｌ－ＴＳＬＰのポリペプチド配列、
配列番号６３－Ｓ－ＴＳＬＰのポリペプチド配列、
配列番号６４－完全長のヒト共通γ－鎖受容体のポリペプチド配列、
配列番号６５－完全長のヒトＩＬ－７Ｒαのポリペプチド配列、
配列番号６６－完全長のカニクイザルＩＬ－７Ｒαのポリペプチド配列、
配列番号６７－カニクイザルＩＬ－７Ｒα細胞外ドメインのポリペプチド配列、
配列番号６８－ヒトＩＬ－７Ｒα細胞外ドメインのポリペプチド配列、
配列番号６９－ＩＤ－Ａ５９Ｕをコードするポリヌクレオチド配列、
配列番号７０－ＩＤ－Ａ６２Ｕをコードするポリヌクレオチド配列、
配列番号７１－Ｖ７Ｒ－２Ｂ６ ＣＤＲ１のポリペプチド配列、
配列番号７２－Ｖ７Ｒ－２Ｅ９ ＣＤＲ２のポリペプチド配列、
配列番号７３－Ｖ７Ｒ－２Ｆ６ ＣＤＲ２のポリペプチド配列、
配列番号７４－Ｖ７Ｒ－４Ｆ６ ＣＤＲ２のポリペプチド配列、
配列番号７５－Ｖ７Ｒ－２Ｂ６ ＣＤＲ２のポリペプチド配列、
配列番号７６－ＩＤ－Ａ１４Ｕ ＣＤＲ２のポリペプチド配列、
配列番号７７－Ｖ７Ｒ－６Ｃ１２ ＣＤＲ３のポリペプチド配列、
配列番号７８－Ｖ７Ｒ－２Ｂ６ ＣＤＲ３のポリペプチド配列、
配列番号７９－ＩＤ－Ａ６２Ｕ ＦＲ２（配列番号５）の残基９－１４を好適に占めるポリペプチド配列、
配列番号８０－ＩＤ－Ａ６２Ｕ ＦＲ２（配列番号５）の残基９－１４を好適に占めていないポリペプチド配列、
配列番号８１－ＳｐｅＩ部位を含む３’プライマーのポリヌクレオチド配列、
配列番号８２－配列番号１の残基１において任意の保存的置換を有するＣＤＲ１のポリペプチド配列、
配列番号８３－配列番号２の残基２、３、７、１２、および１６において任意の保存的置換を有するＣＤＲ２のポリペプチド配列、
配列番号８４－配列番号３の残基３および９において任意の保存的置換を有するＣＤＲ３のポリペプチド配列、
配列番号８５－プロテアーゼ不安定リンカー式１のポリペプチド配列、
配列番号８６－プロテアーゼ不安定リンカー式２のポリペプチド配列、
配列番号８７－プロテアーゼ不安定リンカー式１および２の好ましい変異体のポリペプチド配列、
配列番号８８－非プロテアーゼ不安定リンカー式３のポリペプチド配列、
配列番号８９－好ましい非プロテアーゼ不安定リンカーのポリペプチド配列。
ＶＨおよびＶＨＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメイン（ＩＣＶＤ）を含む抗体および抗体フラグメントなどのポリペプチド
ポリペプチドは、鎖状に結合した多数のアミノ酸残基からなる有機ポリマーである。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」は、「タンパク質」および「ペプチド」と互換的に使用される。ポリペプチドは、標的上のエピトープに、親和性（好適には、本明細書にさらに記載するように、Ｋｄ値、Ｋａ値、ｋｏｎ－ｒａｔｅ、および／またはｋｏｆｆ－ｒａｔｅとして表される）をもって結合できる、結合部位を形成する１つ以上のアミノ酸残基の伸長を含む場合に、結合ポリペプチドであると言われる。
結合ポリペプチドは、ＤＡＲＰｉｎｓ（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３）、Ａｆｆｉｍｅｒｓ（商標）（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１２）、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（商標）（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００７）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１６）、Ａｆｆｉｔｉｎｓ（例えば、Ｎａｎｏｆｉｔｉｎｓ（登録商標）、Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．２００８）、循環ペプチド、抗体、および抗体フラグメントなどのポリペプチドを含む。結合ポリペプチドは、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（Ｎｙｇｒｅｎ ２００８）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．２００７）、Ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ（Ｄｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ ２０１４）、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ ２００８）、Ａｖｉｍｅｒｓ（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ ２００５）、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド（Ｎｉｘｏｎ ａｎｄ Ｗｏｏｄ ２００６）、Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ（Ｋｏｉｄｅ ａｎｄ Ｋｏｉｄｅ ２００７）、ｎａｎｏＣＬＡＭＰｓ（Ｓｕｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ ２０１７）、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ２０１１）、および二環式ペプチドを含む。
従来の抗体または免疫グロブリン（Ｉｇ）は、４つのポリペプチド鎖：２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質である。それぞれの鎖は、定常領域と可変領域に分かれている。重鎖可変ドメインは本明細書ではＶＨＣと省略され、軽鎖可変ドメインは本明細書ではＶＬＣと省略される。これらのドメイン、それに関連するドメイン、およびそれに由来するドメインは、本明細書において免疫グロブリン鎖可変ドメインと呼ばれる。ＶＨＣドメインとＶＬＣドメインは、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化され、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれるより保存性の高い領域に散在され得る。フレームワーク領域と相補性決定領域は正確に定義されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ １９９１）。従来の抗体では、ＶＨＣとＶＬＣはそれぞれ、以下のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で、アミノ末端からカルボキシ末端まで配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成されている。２つの免疫グロブリン重鎖と２つの免疫グロブリン軽鎖の従来の抗体四量体は、例えば、ジスルフィド結合によって相互接続された免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖で形成され、免疫グロブリン重鎖は類似性接続（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）されている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインを含む。軽鎖定常領域はＣＬという１つのドメインで構成されている。重鎖の可変ドメインと軽鎖の可変ドメインは、抗原と相互作用する結合ドメインである。抗体の定常領域は典型的には、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）と古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子に対する抗体の結合を媒介する。抗体という用語は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（およびその亜型）のタイプの免疫グロブリンを含み、免疫グロブリンの軽鎖はカッパ型またはラムダ型であってもよい。２つの同一の重（Ｈ）鎖と２つの同一の軽（Ｌ）鎖ポリペプチドから組み立てられた免疫グロブリン－γ（ＩｇＧ）抗体の全体構造は、十分に確立されており、哺乳動物において高度に保存されている（Ｐａｄｌａｎ １９９４）。
従来の抗体構造に対する例外は、ラクダ科の血清で見られる。従来の抗体に加えて、これらの血清は特別なＩｇＧ抗体を有している。これらのＩｇＧ抗体は、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）として知られ、Ｌ鎖ポリペプチドを欠き、第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を欠いている。そのＮ末端領域において、ホモ二量体タンパク質のＨ鎖は、ＶＨＨと呼ばれる専用の免疫グロブリン鎖可変ドメインを含み、これはその同族抗原と会合する役割を果たす（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ２０１３，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ １９９３，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ １９９４）。
本明細書で使用されるような抗原結合フラグメント（または「抗体フラグメント」あるいは「免疫グロブリンフラグメント」）は、ＩＬ－７Ｒαに特異的に結合する抗体の一部（例えば、１つ以上の免疫グロブリン鎖が完全長ではないが、ＩＬ－７Ｒαに特異的に結合する分子）を意味する。抗原結合フラグメントという用語の中に包含される結合フラグメントの例としては、以下のものが含まれる：
（ｉ）ＦＡｂフラグメント（ＶＬＣ、ＶＨＣ、ＣＬ、およびＣＨ１のドメインからなる一価フラグメント）、
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により結合される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）、
（ｉｉｉ）（ＶＨＣおよびＣＨ１のドメインからなる）Ｆｄフラグメント、
（ｉｖ）（抗体の単一のアームのＶＬＣおよびＶＨＣのドメインからなる）Ｆｖフラグメント、
（ｖ）ｓｃＦｖフラグメント（合成リンカーによって、組換え方法を用いて連結されたＶＬＣドメインとＶＨＣドメインからなり、上記リンカーによって、ＶＬＣドメインとＶＨＣドメインは単一のタンパク質鎖として作られ、ＶＬＣ領域とＶＨＣ領域は対になって一価分子を形成する）、
（ｖｉ）ＶＨ（ＶＨＣドメインからなる免疫グロブリン鎖可変ドメイン（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ １９８９）、
（ｖｉｉ）ＶＬ（ＶＬＣドメインからなる免疫グロブリン鎖可変ドメイン）、
（ｖｉｉｉ）Ｖ－ＮＡＲ（軟骨魚類ＩｇＮＡＲ由来のＶＨＣドメインからなる免疫グロブリン鎖可変ドメイン（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ １９９８およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ ２０１３）、
（ｉｘ）ＶＨＨ。
ＶＨＨまたはＶＨにおけるアミノ酸残基の総数は１１０～１３０の範囲であってよく、好適には１１５～１２０であり、最も好適には１１８である。
本発明の免疫グロブリン鎖可変ドメインは、例えば、核酸合成のための技術を使用して免疫グロブリン鎖可変ドメインをコードする核酸を調製し、その後、このようにして得られた核酸を発現させることによって、得ることができる。特定の実施形態によれば、本発明の免疫グロブリン鎖可変ドメインは、天然に存在する抗体のＶＨドメインまたはＶＨＨドメインなどの天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列とまったく同じ（すなわち、このアミノ酸配列と１００％の配列同一性を共有する）アミノ酸配列を有していない。
本明細書で提供される例は、ＩＬ－７Ｒαに結合する免疫グロブリン鎖可変ドメインそれ自体に関する。しかしながら、本明細書に開示される本発明の原則は、抗体と抗体フラグメントなどの任意のＩＬ－７Ｒα結合ポリペプチドに等しく適用可能である。例えば、本明細書に開示される抗－ＩＬ－７Ｒα免疫グロブリン鎖可変ドメインは、完全長抗体などのポリペプチドに組み込まれてもよい。このようなアプローチは、ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌ ２０１４によって実証されており、ＭｃＣｏｙらは二量体構築物として発現される、ヒトＦｃ領域（ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３のドメインを含む）との融合体として設計された抗ＨＩＶ ＶＨＨを提供している。
非ヒト免疫グロブリン鎖可変ドメインのフレームワーク領域における少なくとも１つのアミノ酸残基をヒト免疫グロブリン鎖可変ドメインからの対応する残基で置換することがヒト化である。可変ドメインのヒト化は、ヒトにおける免疫原性を低下させる可能性がある。
好適には、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン鎖可変ドメインを含む。より好適には、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインからなる。好適には、本発明のポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。より好適には、本発明のポリペプチドは抗体フラグメントである。好適には、抗体フラグメントは、ＶＨＨ、ＶＨ、またはＶＬなどの免疫グロブリン可変ドメインである。好適には、抗体フラグメントは、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖ－ＮＡＲ、ｓｃＦｖ、ＦＡｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。好適には、抗体フラグメントは免疫グロブリン重鎖可変ドメインである。より好適には、抗体フラグメントはＶＨＨまたはＶＨであり、最も好適にはＶＨＨである。
特異性、親和性、結合活性、および交差反応性
特異性とは、特定の抗原結合ポリペプチドが結合することができる抗原または抗原決定基の異なる種類の数を指す。抗原結合ポリペプチドの特異性とは、抗原結合ポリペプチドが特定の抗原を固有の分子実体として認識し、別の抗原と区別する能力のことである。
標的の結合ポリペプチドからの解離に関する平衡定数（Ｋｄ）で表される親和性は、標的と結合ポリペプチド上の結合部位との間の結合強度を示す指標であり、Ｋｄの値が小さければ小さいほど、標的と結合ポリペプチドとの間の結合力が強い（代替的に、親和性は親和性定数（Ｋａ）としても表すこともでき、１／Ｋｄとなる）。親和性は、対象となる特定の抗原に応じて、既知の方法によって決定することができる。好適には、親和性は、動的に切り替え可能なバイオ表面（例えば、「ｓｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥＲ」、Ｋｎｅｚｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ ２０１２を参照）または表面プラズモン共鳴を使用して決定される。
結合活性は、抗原結合ポリペプチドと適切な抗原の間に制限する強度の指標である。結合活性は、抗原結合ポリペプチド上の抗原決定基とその抗原結合部位との間の親和性と、抗原結合ポリペプチド上に存在する適切な結合部位の数との両方に関連する。
好適には、本発明のポリペプチドは、１０－７Ｍ以下、より好適には１０－８Ｍ以下、より好適には１０－９Ｍ以下、およびより好適には１０－１０Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋｄ）で、ＩＬ－７Ｒαに結合する。
好適には、本発明のポリペプチドは、同じアッセイにおいてｍＡｂ８２９の平衡解離定数よりも低い平衡解離定数でＩＬ－７Ｒαに結合する。好適には、本発明のポリペプチドは、５．６７×１０－１０Ｍ以下、より好適には５．６７×１０－１０Ｍよりも低い平衡解離定数でＩＬ－７Ｒαに結合する。ｍＡｂ８２９はさらに、Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ ２０１９で開示される抗ＩＬ－７Ｒαモノクローナル抗体である「ＧＳＫ２６１８９６０」としても知られている。
一実施形態では、本発明のポリペプチドの親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（または同等の）センサープレート上に直接コーティングすることによって、あるいは、Ｆｃへの融合と抗ヒトＩｇＧ Ｆｃによる捕捉によって確立され、ポリペプチドは、結合を検出するためにプレート全体に流される。好適には、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００プレートは、３０ｕｌ／分で、ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ランニング緩衝液中にて２５℃で使用される。
抗ＩＬ－７Ｒαポリペプチド、ＩＬ－７Ｒα結合ポリペプチド、ＩＬ－７Ｒαと相互作用するポリペプチド、またはＩＬ－７Ｒαに対するポリペプチドはいずれもＩＬ－７Ｒαに結合する有効なポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒα上の線状エピトープまたは立体構造のエピトープに結合することができる。
好適には、本発明のポリペプチドはヒトＩＬ－７Ｒαに結合する。より好適には、本発明のポリペプチドは、ヒトＩＬ－７Ｒαと、ヒヒＩＬ－７Ｒα、マーモセットＩＬ－７Ｒα、カニクイザルＩＬ－７Ｒα、およびアカゲザルＩＬ－７Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つの追加の霊長類のＩＬ－７Ｒαとの双方に結合する。より好適には、本発明のポリペプチドは、ヒトＩＬ－７ＲαとカニクイザルＩＬ－７Ｒαの両方に結合する。
好適には、本発明のポリペプチドは、ヒトＩＬ－７ＲへのヒトＩＬ－７および／またはヒトＬ－ＴＳＬＰの結合を中和する。より好適には、本発明のポリペプチドは、ヒトＩＬ－７Ｒと、ヒヒＩＬ－７Ｒ、マーモセットＩＬ－７Ｒ、カニクイザルＩＬ－７Ｒ、およびアカゲザルＩＬ－７Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの追加の霊長類のＩＬ－７Ｒとの双方への、ヒトＩＬ－７および／またはヒトＬ－ＴＳＬＰの結合を中和する。最も好適には、本発明のポリペプチドは、ヒトＩＬ－７ＲへのヒトＩＬ－７およびヒトＬ－ＴＳＬＰの結合を中和する。
好適には、本発明のポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒα（例えば、ヒト－ＩＬ－７Ｒα、配列番号６５、および／または、カニクイザルＩＬ－７Ｒα、配列番号６６）またはγ鎖受容体（例えば、ヒト共通γ鎖受容体、配列番号６４）に結合する。より好適には、本発明のポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒαに結合し、最も好適にはヒトＩＬ－７Ｒαに結合する。より具体的には、本発明のポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒαの細胞外領域（配列番号６７および６８、それぞれカニクイザルおよびヒトＩＬ－７Ｒαの細胞外領域）、すなわち、膜貫通ヘリックスおよび細胞質ドメインを欠くＩＬ－７Ｒαのポリペプチド配列に結合する。
好適には、ＩＬ－７Ｒαは、配列番号６５または配列番号６６を含むポリペプチドであり、より好適には、ＩＬ－７Ｒαは、配列番号６５または配列番号６６からなるポリペプチドである。より好適には、ＩＬ－７Ｒαは配列番号６５を含むポリペプチドであり、より好適には、ＩＬ－７Ｒαは配列番号６５からなるポリペプチドである。成熟した完全長ヒトＩＬ－７Ｒαのポリペプチド配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ１６８７１の下でも入手可能である。
ヒトからのＩＬ－７Ｒα、および別の種からのＩＬ－７Ｒα、例えば、カニクイザルＩＬ－７Ｒαと反応することができる（「交差反応」）ポリペプチドは、動物モデルにおいて前臨床研究をより容易に行うことができるため有利である。
好適には、本発明のポリペプチドは、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰの受容体結合部位にある、および／またはその一部を形成する、ＩＬ－７Ｒα上のエピトープに対して向けられており、本発明の上記ポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒαに結合すると、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰのシグナル伝達を阻害または低減することができる。
本発明のポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒα上の１つ以上のエピトープに結合する。本発明の１つの態様では、Ｖ７Ｒ－２Ｅ５、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９、Ｖ７Ｒ－２Ｆ６、Ｖ７Ｒ－６Ｃ１２、Ｖ７Ｒ－２Ｂ６、Ｖ７Ｒ－３Ｂ５、またはＶ７Ｒ－４Ｆ６と同じＩＬ－７Ｒα上のエピトープに結合するポリペプチドが提供されている。
好適には、本発明のポリペプチドは単離される。「単離された」ポリペプチドは、その元の環境から除去されたものである。例えば、天然に存在する本発明のポリペプチドは、天然系に共存する物質の一部またはすべてから分離された場合に、単離される。
効力、阻害、および中和
効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）とは、所定の強さの効果をもたらすのに必要とされる量の観点から表された治療薬の活性の指標である。低効力の薬剤が低濃度でより小さな反応を引き起こすのと比較して、高効力の薬剤は低濃度でより大きな反応を引き起こす。効力は親和性と有効性の関数である。有効性（ｅｆｆｉｃａｃｙ）とは、標的リガンドとの結合時に生物学的反応を引き起こす治療薬の能力と、この反応の量的な大きさを指す。最大の有効濃度（ＥＣ５０）という用語は、指定された暴露時間後のベースラインと最大濃度との中間の反応を引き起こす治療薬の濃度を指す。治療薬は、抑制または刺激を引き起こす可能性がある。これは一般的に、そして、本明細書でも効力の指標として使用される。
本発明の目的のための中和ポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒαに結合するポリペプチドであり、ＥＬＩＳＡによって測定されるようにＩＬ－７ＲとＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰの結合を阻害する。この文脈での阻害のレベルを決定するのに適切な特定のＥＬＩＳＡ法は、以下の実施例３に詳述されている。
好適には、本発明のポリペプチドは、２．００ｎＭ以下、例えば、１．５０ｎＭ以下、例えば、１．００ｎＭ以下、例えば、０．９０ｎＭ以下、例えば、０．８０ｎＭ以下、例えば、０．７０ｎＭ以下、例えば、０．６５ｎＭ以下、例えば、０．６０ｎＭ以下、例えば、０．５５ｎＭ以下、例えば、０．５０ｎＭ以下、例えば、０．４５ｎＭ以下、例えば、０．４ｎＭ以下、例えば、０．３５ｎＭ以下、例えば、０．３０ｎＭ以下のＥＣ５０でＩＬ－７へのＩＬ－７Ｒの結合を中和する。
好適には、ＥＣ５０は、以下の実施例３に詳述するＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ中和ＥＬＩＳＡを使用して確立される。
ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列
２つの密接に関連するポリペプチド配列を比較する目的で、第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列との間の「配列同一性％」は、ポリペプチド配列の標準設定（ＢＬＡＳＴＰ）を使用して、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０を用いて計算することができる。２つの密接に関連するポリヌクレオチド配列を比較する目的で、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性％」は、ヌクレオチド配列の標準設定（ＢＬＡＳＴＮ）を使用して、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０を用いて計算することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、期待値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５ （１９８９）を参照）のアラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、両方の鎖の比較を用いる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７ （１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸の比較における最小和確率が約０．２未満、より好適には約０．０１未満、最も好適には約０．００１未満の場合に、参照配列に類似するとみなされる。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、その全長にわたって１００％の配列同一性を共有する場合に、他のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列と同一または類似であると呼ばれる。配列中の残基は、左から右に、すなわち、ポリペプチドの場合はＮ末端からＣ末端へ、ポリヌクレオチドの場合は、５’末端から３’末端まで番号が振られる。
配列間の「差」は、第１の配列と比較した、第２の配列の位置における単一のアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を意味する。２つのポリペプチド配列は、１つ、２つ、またはそれ以上のこのようなアミノ酸の差を含むことができる。それ以外に第１の配列と同一（１００％配列同一性）である第２の配列に挿入、欠失、または置換を行うと、配列同一性の割合が減少する。例えば、同一の配列が９アミノ酸残基長である場合、第２の配列における１つの置換は、８８．９％の配列同一性をもたらす。同一の配列が１７アミノ酸残基長である場合、第２の配列における２つの置換は８８．２％の配列同一性をもたらす。同一の配列が７アミノ酸残基長である場合、第２の配列における３つの置換は５７．１％の配列同一性をもたらす。第１および第２のポリペプチド配列が９アミノ酸残基長であり、６つの同一の残基を共有する場合、第１および第２のポリペプチド配列は６６％超の同一性を共有する（第１および第２のポリペプチド配列は６６．７％の同一性を共有する）。第１および第２のポリペプチド配列が１７アミノ酸残基長であり、１６個の同一の残基を共有する場合、第１および第２のポリペプチド配列は９４％超の同一性を共有する（第１および第２のポリペプチド配列は９４．１％の同一性を共有する）。第１および第２のポリペプチド配列が７アミノ酸残基長であり、３個の同一の残基を共有する場合、第１および第２のポリペプチド配列は４２％超の同一性を共有する（第１および第２のポリペプチド配列は４２．９％の同一性を共有する）。
代替的に、第１の参照ポリペプチド配列を第２の比較ポリペプチド配列と比較する目的で、第２の配列を生成するために第１の配列に加えられた付加、置換、および／または欠失の数を確認することもできる。付加とは、第１のポリペプチドの配列に１つのアミノ酸残基を加えること（第１のポリペプチドのいずれかの末端での付加を含む）である。置換とは、第１のポリペプチドの配列中の１つのアミノ酸残基を１つの異なるアミノ酸残基と置き換えることである。欠失とは、第１のポリペプチドの配列から１個のアミノ酸残基が欠失すること（第１のポリペプチドのいずれかの末端における欠失を含む）である。
第１の参照ポリヌクレオチド配列を第２の比較ポリヌクレオチド配列と比較する目的で、第２の配列を生成するために第１の配列に加えられた付加、置換、および／または欠失の数を確認することもできる。付加とは、第１のポリヌクレオチドの配列に１つのヌクレオチド残基を加えること（第１のポリヌクレオチドのいずれかの末端での付加を含む）である。置換とは、第１のポリヌクレオチドの配列中の１つのヌクレオチド残基を１つの異なるヌクレオチド残基と置き換えることである。欠失とは、第１のポリヌクレオチドの配列から１個のヌクレオチド残基が欠失すること（第１のポリヌクレオチドのいずれかの末端における欠失を含む）である。
「保存的」アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基が同様の化学構造の別のアミノ酸残基と取り替えられ、かつ、ポリペプチドの機能、活性、またはその他の生物学的特性にほとんど影響を与えないと予想される、アミノ酸置換である。このような保存的置換は、好適には、以下の群内の１つのアミノ酸が、同じ群内からの別のアミノ酸残基で置換される置換である。
Figure 2022537780000001
好適には、疎水性アミノ酸残基は、非極性アミノ酸である。より好適には、疎水性アミノ酸残基は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、またはＣから選択される。
本明細書で使用されるように、ポリペプチド配列の番号付け、およびＣＤＲとＦＲの定義は、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ １９９１）に従って定義される通りである。第１および第２のポリペプチド配列間の「対応する」アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔシステムに従って第２の配列中のアミノ酸残基と同じ位置を共有する第１の配列中のアミノ酸残基であるが、第２の配列中のアミノ酸残基は第１の配列とは同一性が異なる場合がある。フレームワークとＣＤＲがＫａｂａｔの定義に従って同じ長さである場合、適切に対応する残基は同じ番号（および文字）を共有する。アラインメントは、手動で、または、例えば、標準的な設定を用いたＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０（ＢＬＡＳＴＰまたはＢＬＡＳＴＮ）などの配列アラインメントのための既知のコンピュータアルゴリズムを使用して、達成することができる。
本発明のポリペプチドであるＩＤ－Ａ６２Ｕのポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔフォーマットで以下に記載される。
Figure 2022537780000002
本発明のさらなるポリペプチドである、ＩＤ－Ａ５９Ｕのポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔフォーマットで以下に記載される。
Figure 2022537780000003
本発明のさらなるポリペプチドである、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９のポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔフォーマットで以下に記載される。
Figure 2022537780000004
Ｎ末端からＣ末端までの残基番号付けが下段に記載されている。Ｋａｂａｔの番号付けは「Ｈ」接頭辞を含み、２段目に提供されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ「ＣＤＲ－Ｈ１」、「ＣＤＲ－Ｈ２」、および「ＣＤＲ－Ｈ３」として標識される。
（実施例２および３で議論されている）本発明のさらなるポリペプチドのポリペプチド配列を以下に整列する（Ｖ７Ｒ－６Ｃ１２は以下ではＩＬ－７Ｒ－６Ｃ１２と呼ぶことに注意されたい）。
Figure 2022537780000005
好適には、本発明で使用されるポリヌクレオチドは単離されている。「単離された」ポリヌクレオチドは、その元の環境から除去されたものである。例えば、天然に存在するポリヌクレオチドは、天然系に共存する物質の一部またはすべてから分離された場合に、単離される。ポリヌクレオチドは、例えば、その自然環境の一部ではないベクターにクローン化されている場合、またはｃＤＮＡ内に含まれない場合に、単離されているとみなされる。
本発明の１つの態様では、本発明のポリペプチドまたは構築物をコードするポリヌクレオチドが提供される。好適には、ポリヌクレオチドは、配列番号６９または７０、最も好適には配列番号７０と７０％以上、例えば、８０％以上、例えば、９０％以上、例えば、９５％以上、例えば、９９％以上の配列同一性を共有する配列を含み、または、上記配列からなる。より好適には、ポリヌクレオチドは、配列番号６９または７０のいずれか、最も好適には配列番号７０を含み、または、（最も好適には）上記からなる。さらなる態様では、前記ポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡが提供される。
本発明の１つの態様では、コードされた免疫グロブリン鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３をコードする、配列番号６９または７０のいずれかの一部の任意の１つと７０％以上、例えば、８０％以上、例えば、９０％以上、例えば、９５％以上、例えば、９９％以上の配列同一性を共有する配列を含む、または上記配列からなるポリヌクレオチドが提供される。
好適には、本発明のポリペプチド配列は、天然の配列に対して少なくとも１つの改変を含む。好適には、本発明のポリヌクレオチド配列は、天然の配列に対する少なくとも１つの改変を含む。好適には、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列に対する改変は、腸管に存在するプロテアーゼ（例えば、トリプシンおよびキモトリプシン）に対するポリペプチドまたはコードされたポリペプチドの安定性を高めるためになされる。
本発明のポリペプチドのＣＤＲとフレームワークの潜在的な特徴が以下に記載される。
ＣＤＲ１
好適には、本発明のポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号１と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
代替的に、本発明のポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号１と比較して、２以下、より好適には１以下の付加を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号１と比較して、２以下、より好適には１以下の置換を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号１と比較して、２以下、より好適には１以下の欠失を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
好適には、配列番号１のそれらの対応する残基と異なるＣＤＲ１の任意の残基は、それらの対応する残基と比べて保存的置換である。
好適には、ＣＤＲ１の残基は以下の同一性（配列番号８２）を有する。
Figure 2022537780000006
好適には、ＣＤＲ１は、配列番号１または配列番号７１を含み、あるいは配列番号１または配列番号７１からなる。より好適には、ＣＤＲ１は配列番号１を含み、または、より好適には、配列番号１からなる。
ＣＤＲ２
好適には、本発明のポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号２と、６５％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、または、より好適には上記配列からなる。
代替的に、本発明のポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号２と比較して、８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の付加を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号２と比較して、８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の置換を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号２と比較して、８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の欠失を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
好適には、配列番号２のそれらの対応する残基と異なるＣＤＲ２の任意の残基は、それらの対応する残基と比べて保存的置換である。
好適には、ＣＤＲ２の残基は以下の同一性（配列番号８３）を有する。
Figure 2022537780000007
好適には、配列番号２の残基番号１６に対応するＣＤＲ２の残基は、ＱまたはＫであり、最も好ましくはＫである。好適には、ＣＤＲ２は、配列番号２、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、または配列番号７６を含み、または、上記配列番号からなる。より好適には、ＣＤＲ２は配列番号２を含み、または、より好適には配列番号２からなる。
ＣＤＲ３
好適には、本発明のポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号３と、６０％以上、７０％以上、または８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、または、より好適には上記配列からなる。
代替的に、本発明のポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号３と比較して、３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の付加を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号３と比較して、３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の置換を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号３と比較して、３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の欠失を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、いかなる置換も配列番号３のそれらの対応する残基に対して保存的である。
好適には、配列番号３のそれらの対応する残基と異なるＣＤＲ３の任意の残基は、それらの対応する残基と比べて保存的置換である。
好適には、ＣＤＲ３の残基は以下の同一性（配列番号８４）を有する。
Figure 2022537780000008
好適には、ＣＤＲ３の配列は、配列番号３、配列番号７７、または配列番号７８を含み、あるいは、上記配列からなる。より好適には、ＣＤＲ３は配列番号３を含み、または、より好適には配列番号３からなる。
特別なＣＤＲ
いくつかの特に適切なＣＤＲ配列が以下の表で示される。好適には、本発明のポリペプチドのＣＤＲ１は、以下に表記されたＣＤＲ１配列のうちの１つである。好適には、本発明のポリペプチドのＣＤＲ２は、以下に表記されたＣＤＲ２配列のうちの１つである。好適には、本発明のポリペプチドのＣＤＲ３は、以下に表記されたＣＤＲ３配列のうちの１つである。好適には、本発明のポリペプチドは、以下に表記されたＣＤＲ配列のうちの２つ、またはより好適には３つの組み合わせを含む。
本発明のポリペプチドの特定のＣＤＲが以下で提供される。「例」は、そのＣＤＲとその配列に対応する配列識別番号を含む例示的なＩＣＶＤを示す。
Figure 2022537780000009
ＦＲ１
好適には、本発明のポリペプチドのＦＲ１は、配列番号４と、５％、１２％、１８％、２６％、３２％、３８％、４６％、５２％、５８％、６２％、６６％、６８％、７２％、７５％、７８％、８２％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列同一性を共有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
代替的に、本発明のポリペプチドのＦＲ１は、配列番号４と比較して、２８以下、より好適には２６以下、より好適には２４以下、より好適には２２以下、より好適には２０以下、より好適には１８以下、より好適には１６以下、より好適には１４以下、より好適には１３以下、より好適には１２以下、より好適には１１以下、より好適には１０以下、より好適には９以下、より好適には８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の付加を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＦＲ１は、配列番号４と比較して、２８以下、より好適には２６以下、より好適には２４以下、より好適には２２以下、より好適には２０以下、より好適には１８以下、より好適には１６以下、より好適には１４以下、より好適には１３以下、より好適には１２以下、より好適には１１以下、より好適には１０以下、より好適には９以下、より好適には８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の置換を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＦＲ１は、配列番号４と比較して、２８以下、より好適には２６以下、より好適には２４以下、より好適には２２以下、より好適には２０以下、より好適には１８以下、より好適には１６以下、より好適には１４以下、より好適には１３以下、より好適には１２以下、より好適には１１以下、より好適には１０以下、より好適には９以下、より好適には８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の欠失を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
好適には、配列番号４のそれらの対応する残基と異なるＦＲ１の任意の残基は、それらの対応する残基と比べて保存的置換である。好適には、配列番号４の残基番号１に対応するＦＲ１の残基は、ＤまたはＥであり、もっとも好適には、Ｄである。好適には、配列番号４の残基番号１～５に対応するＦＲ１の残基は、ＤＶＱＬＶである。好適には、ＦＲ１は配列番号４を含み、または、より好適には、配列番号４からなる。好適には、配列番号４の残基番号２４に対応するＦＲ１の残基は、Ｓである。
ＦＲ２
好適には、本発明のポリペプチドのＦＲ２は、配列番号５と、１０％、１５％、２５％、３０％、４０％、４５％、５５％、６０％、７０％、７５％、８５％、９０％、またはそれ以上の配列同一性を共有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
代替的に、本発明のポリペプチドのＦＲ２は、配列番号５と比較して、１３以下、より好適には１２以下、より好適には１１以下、より好適には１０以下、より好適には９以下、より好適には８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の付加を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＦＲ２は、配列番号５と比較して、１３以下、より好適には１２以下、より好適には１１以下、より好適には１０以下、より好適には９以下、より好適には８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の置換を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＦＲ２は、配列番号５と比較して、１３以下、より好適には１２以下、より好適には１１以下、より好適には１０以下、より好適には９以下、より好適には８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の欠失を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
好適には、配列番号５のそれらの対応する残基と異なるＦＲ２の任意の残基は、それらの対応する残基と比べて保存的置換である。好適には、配列番号５の残基番号１０に対応するＦＲ２の残基は、ＲまたはＬであり、最も好適にはＬである。好適には、配列番号５の残基番号８～１１に対応するＦＲ２の残基は、ＫＥＸＥであり、ＸはＲまたはＬであり、最も好適には、Ｌである。代替的に、配列番号５の残基番号９～１２に対応するＦＲ２の残基は、ＧＬＥＷである。好適には、ＦＲ２は配列番号５を含み、または、より好適には、配列番号５からなる。好適には、配列番号５の残基番号２に対応するＦＲ２の残基はＦであり、より好適には、さらに、配列番号５の残基番号１４に対応するＦＲ２の残基は、Ａである。好適には、配列番号５の残基９～１４に対応するＦＲ２の残基は、ＥＬＥＦＬＡ（配列番号７９）である。好適には、配列番号５の残基９～１４に対応するＦＲ２の残基は、ＧＬＥＷＶＳ（配列番号８０）ではない。好適には、配列番号５の残基番号９に対応するＦＲ２の残基は、Ｇではない。より好適には、配列番号５の残基番号９に対応するＦＲ２の残基は、Ｅである。
ＦＲ３
好適には、本発明のポリペプチドのＦＲ３は、配列番号６と、８％、１５％、２０％、２６％、３２％、４０％、４５％、５２％、５８％、６５％、７０％、７６％、８０％、８２％、８５％、９０％、９２％、９５％、またはそれ以上の配列同一性を共有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
代替的に、本発明のポリペプチドのＦＲ３は、配列番号６と比較して、２９以下、より好適には２７以下、より好適には２５以下、より好適には２３以下、より好適には２１以下、より好適には１９以下、より好適には１７以下、より好適には１５以下、より好適には１３以下、より好適には１１以下、より好適には９以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の付加を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＦＲ３は、配列番号６と比較して、２９以下、より好適には２７以下、より好適には２５以下、より好適には２３以下、より好適には２１以下、より好適には１９以下、より好適には１７以下、より好適には１５以下、より好適には１３以下、より好適には１１以下、より好適には９以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の置換を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＦＲ３は、配列番号６と比較して、２９以下、より好適には２７以下、より好適には２５以下、より好適には２３以下、より好適には２１以下、より好適には１９以下、より好適には１７以下、より好適には１５以下、より好適には１３以下、より好適には１１以下、より好適には９以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の欠失を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
好適には、配列番号６のそれらの対応する残基と異なるＦＲ３の任意の残基は、それらの対応する残基と比べて保存的置換である。好適には、ＦＲ３は配列番号６を含み、または、より好適には、配列番号６からなる。好適には、配列番号６の残基番号１８、１９、および２０に対応するＦＲ３の残基は、ＮＳＬである。好適には、配列番号６の残基番号２１に対応するＦＲ３の残基は、Ｒである。好適には、配列番号６の残基番号２２に対応するＦＲ３の残基は、Ａである。
ＦＲ４
好適には、本発明のポリペプチドのＦＲ４は、配列番号７と、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の配列同一性を共有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
代替的に、本発明のポリペプチドのＦＲ４は、配列番号７と比較して、１０以下、より好適には９以下、より好適には８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の付加を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＦＲ４は、配列番号７と比較して、１０以下、より好適には９以下、より好適には８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の置換を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドのＦＲ４は、配列番号７と比較して、１０以下、より好適には９以下、より好適には８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の欠失を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
好適には、配列番号７のそれらの対応する残基と異なるＦＲ４の任意の残基は、それらの対応する残基と比べて保存的置換である。好適には、ＦＲ３は配列番号６を含み、または、より好適には、配列番号７からなる。
全ポリペプチド
好適には、本発明のポリペプチドは、配列番号８と、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を共有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
代替的に、本発明のポリペプチドは、配列番号８と比較して、２０以下、より好適には１５以下、より好適には１０以下、より好適には９以下、より好適には８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の付加を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドは、配列番号８と比較して、２０以下、より好適には１５以下、より好適には１０以下、より好適には９以下、より好適には８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の置換を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。好適には、本発明のポリペプチドは、配列番号８と比較して、２０以下、より好適には１５以下、より好適には１０以下、より好適には９以下、より好適には８以下、より好適には７以下、より好適には６以下、より好適には５以下、より好適には４以下、より好適には３以下、より好適には２以下、より好適には１以下の欠失を有する配列を含み、または、より好適には、上記配列からなる。
好適には、ポリペプチドのＮ末端はＤである。好適には、ポリペプチドは配列番号８を含み、または、より好適には、配列番号８からなる。
フレームワークの実施形態
本発明の１つの態様では、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含むポリペプチドが提供され、各フレームワーク領域は、ＩＤ－Ａ６２Ｕ（すなわち、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７）の対応するフレームワーク領域の変異体である。好適には、各変異体フレームワーク領域は、ＩＤ－Ａ６２Ｕのその対応するフレームワーク領域と、少なくとも５０％、より好適には少なくとも６０％、より好適には少なくとも７０％、より好適には少なくとも８０％、またはより好適には少なくとも９０％の同一性を共有する。より好適には、変異体フレームワーク領域は、ＩＤ－Ａ６２Ｕの対応するフレームワーク領域を含み、または、より好適には、上記フレームワーク領域からなる。好適には、４つのフレームワーク領域を含むポリペプチドは、抗体または抗体フラグメントである。好適には、抗体フラグメントは、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖ－ＮＡＲ、ｓｃＦｖ、ＦＡｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。より好適には、抗体フラグメントはＶＨＨまたはＶＨであり、最も好適にはＶＨＨである。
エピトープ
実施例５は、本発明のポリペプチドであるＶ７Ｒ－２Ｅ９について行ったエピトープモデリング作業について詳述している。この作業は、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９がＩＬ－７Ｒαの以下の残基と結合することを示す。界面に特に重要な領域を埋める残基は、太字で強調されている。残基の番号付けは配列番号６５に対応する。
Figure 2022537780000010
したがって、本発明の１つの態様では、Ｇｌｕ２７、Ｓｅｒ３１、Ｌｅｕ５７、Ｖａｌ５８、Ｇｌｕ５９、Ｌｙｓ７７、Ｌｙｓ７８、Ｐｈｅ７９、Ｌｅｕ８０、Ｌｅｕ８１、Ｉｌｅ８２、Ｔｈｒ１０４、Ｌｙｓ１３７、Ｌｙｓ１３８、Ｔｙｒ１３９、Ｌｙｓ１４１、Ｈｉｓ１９１、Ｔｙｒ１９２、およびＰｈｅ１９３からなるリストから選択されるＩＬ－７Ｒα（配列番号６５）の少なくとも１つの残基を含む、ＩＬ－７Ｒα上のエピトープに結合するポリペプチドが提供される。好適には、ポリペプチドは、このリストから選択されるＩＬ－７Ｒαの少なくとも８個、より好適には少なくとも１５個、より好適には少なくともすべての残基を含むＩＬ－７Ｒα上のエピトープに結合する。
ＩＬ－７Ｒαのある残基は、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９との界面に特に重要な領域を埋めることに注目してもよい。これに応じて、本発明のさらなる態様では、Ｓｅｒ３１、Ｖａｌ５８、Ｐｈｅ７９、Ｌｅｕ８０、Ｌｅｕ８１、Ｉｌｅ８２、Ｌｙｓ１３８、Ｔｙｒ１３９、およびＰｈｅ１９３からなるリストから選択されるＩＬ－７Ｒαの少なくとも１つの残基を含むＩＬ－７Ｒα（配列番号６５）の上のエピトープに結合するポリペプチドが提供される。好適には、ポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒαの少なくともＶａｌ５８、Ｌｅｕ８０、およびＬｙｓ１３８を含むＩＬ－７Ｒα上のエピトープに結合する。より好適には、ＩＬ－７ＲαのＶａｌ５８、Ｌｅｕ８０、Ｌｙｓ１３８、Ｉｌｅ８２、およびＴｙｒ１３９である。より好適には、ＩＬ－７ＲαのＶａｌ５８、Ｌｅｕ８０、Ｌｙｓ１３８、Ｉｌｅ８２、Ｔｙｒ１３９、Ｌｅｕ８１、およびＰｈｅ７９である。好適には、ポリペプチドは、Ｓｅｒ３１、Ｖａｌ５８、Ｐｈｅ７９、Ｌｅｕ８０、Ｌｅｕ８１、Ｉｌｅ８２、Ｌｙｓ１３８、Ｔｙｒ１３９、およびＰｈｅ１９３から選択されるＩＬ－７Ｒαの少なくとも５、より好適には少なくとも７、より好適にはすべての残基を含むＩＬ－７Ｒα上のエピトープに結合する。
好適には、この文脈における「エピトープに結合する」とは、ポリペプチド結合時に、エピトープを構成するＩＬ－７Ｒαの関連する残基が、関連する残基に関して上記の表で言及された少なくともそのＢＳＡを有すると定義することができる。
リンカーと多量体
本発明に係る構築物は、複数のポリペプチドを含み、好適には多価であり得る。このような構築物は、本発明に係る少なくとも２つの同一のポリペプチドを含み得る。本発明に係る２つの同一のポリペプチドからなる構築物は、「ホモビヘッド」である。本発明の１つの態様では、本発明の２つ以上の同一のポリペプチドを含む構築物が提供される。
代替的に、構築物は、異なるが両方とも本発明に係るポリペプチド（「ヘテロビヘッド」）である少なくとも２つのポリペプチドを含み得る。
代替的に、このような構築物は、（ａ）本発明に係る少なくとも１つのポリペプチドと、（ｂ）本発明のポリペプチド（「ヘテロビヘッド」でもある）ではない、抗体またはその抗原結合フラグメントなどの少なくとも１つのポリペプチドとを含んでいてもよい。（ｂ）の少なくとも１つのポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒに（例えば、異なるエピトープを介して（ａ）のそれに）結合してもよく、または、代替的にＩＬ－７Ｒ以外の標的に結合してもよい。好適には、異なるポリペプチド（ｂ）は、例えば、インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、および－１８など）、インターロイキン受容体（ＩＬ－６Ｒなど）、転写因子（ＮＦ－ｋＢなど）、サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－βなど）、膜貫通タンパク質（ｇｐ１３０およびＣＤ３など）、表面糖タンパク質（ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ４０など）、可溶性タンパク質（ＣＤ４０Ｌなど）、インテグリン（ａ４ｂ７およびＡｌｐｈａＥｂｅｔａ７など）、接着分子（ＭＡｄＣＡＭなど）、ケモカイン（ＩＰ１０およびＣＣＬ２０など）、ケモカイン受容体（ＣＣＲ２およびＣＣＲ９など）、抑制タンパク質（ＳＭＡＤ７など）、キナーゼ（ＪＡＫ３など）、Ｇタンパク質共役型受容体（スフィンゴシン－１－Ｐ受容体など）、ヒトの病理学的プロセスに関与するその他の炎症性メディエーターまたは免疫学的に関連するリガンドに結合する。したがって、異なるポリペプチド（ｂ）は、例えば、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１－β、ＩＬ－１７Ａ、ＴＮＦ－α、またはＣＤ３、あるいは、ヒトの病理学的プロセスに関与する他の炎症性メディエーターまたは免疫学的に関連するリガンドに結合する。
構築物は、多価および／または多特異的であり得る。多価構築物（二価構築物など）は２つ以上の結合ポリペプチドを含み、したがって、１つ以上の抗原に結合が生じ得る２つ以上の部位を提示する。多価構築物の例は、ホモビヘッドまたはヘテロビヘッドであり得る。多特異性構築物（例えば、二重特異性構築物）は、（ａ）２つ以上の異なる抗原への結合が生じ得、または（ｂ）同じ抗原上の２つ以上の異なるエピトープへの結合が生じ得る２つ以上の部位を提示する、２つ以上の異なる結合ポリペプチドを含んでいる。多特異性構築物はヘテロビヘッドであり得る。多特異性構築物は多価である。
好適には、構築物内に含まれるポリペプチドは抗体フラグメントである。より好適には、構築物内に含まれるポリペプチドは、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖ－ＮＡＲ、ｓｃＦｖ、ＦＡｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントからなるリストから選択される。より好適には、構築物内に含まれるポリペプチドはＶＨまたはＶＨＨであり、最も好適には、ＶＨＨである。
好適には、構築物内に含まれるポリペプチドは、ＩＣＶＤ（例えば、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ）、Ｖ－ＮＡＲ、ｓｃＦｖ、ＦＡｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントからなるリストから選択される。より好適には、構築物内に含まれるポリペプチドはＩＣＶＤであり、より好適には、構築物内に含まれるポリペプチドはＶＨまたはＶＨＨであり、最も好適には、ＶＨＨである。
本発明のポリペプチドは、互いに直接（すなわち、リンカーを使用せずに）、またはリンカーを介して、連結することができる。好適には、リンカーはプロテアーゼ不安定リンカーまたは非プロテアーゼ不安定リンカーである。リンカーは好適にはポリペプチドであり、ポリペプチドとそのエピトープへの結合を可能にするように選択される。治療目的で使用される場合、リンカーは、ポリペプチドが投与される対象において、好適には非免疫原性である。好適には、ポリペプチドはすべて非プロテアーゼ不安定リンカーによって接続されている。好適には、プロテアーゼ不安定リンカーは、［－（ＧａＳ）ｘ－ＢＪＢ’－（ＧａＳ）ｙ－］ｚというフォーマットのものであり、ここで、Ｊはリジンまたはアルギニンであり、ＢはＲ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｗ、Ｐ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｋ、またはＩから選択される０～５個のアミノ酸残基であり、Ｂ’はＲ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｋ、またはＩから選択される０～５個のアミノ酸残基であり、ａは１～１０であり、ｘは１～１０であり、ｙは１～１０であり、および、ｚは１～１０である（配列番号８５）。好適には、ａは４である。最も好適には、ａは４であり、Ｊはリジンであり、Ｂは０であり、ｘは１であり、ｙは１であり、およびｚは１である。代替的には、プロテアーゼ不安定リンカーは、－（Ｇ４Ｓ）ｘ－Ｋ－（Ｇ４Ｓ）ｙ－というフォーマットのものであり、ここで、ｘおよびｙはそれぞれ独立して、１～５（配列番号８６）、より好適には－（Ｇ４Ｓ）２－Ｋ－（Ｇ４Ｓ）２－（配列番号８７）である。
好適には、非プロテアーゼ不安定リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｘ（配列番号８８）というフォーマットのものである。より好適には、ｘは１～１０であり、より好適には、ｘは４～８であり、より好適にはｘは４、６、または８である。最も好適には、ｘは６である（配列番号８９）。
ベクターと宿主
「ベクター」という用語は、本明細書に使用されるように、結合された別の核酸を運ぶことができる核酸分子を指すことを意図している。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、それは、付加的なＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントはウイルスゲノムへライゲーションされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律増殖が可能である（例えば、複製およびエピソームの哺乳動物および酵母のベクターの細菌起源を有する細菌ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムへ統合することができ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作自在に結合される遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、「組換え発現ベクター」（または単に「組換えベクター」）と本明細書で呼ばれる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしば、プラスミドの形態である。本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるため、互換的に使用することができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態、ならびにバクテリオファージ系およびファージミド系を含むことを意図している。本発明はさらに、ポリペプチド配列、あるいは多価および／または多特異性構築物をコードするヌクレオチド配列にも関する。本明細書で使用されるように、「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことを意図している。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫を指すことも意図している。
本発明の１つの態様では、本発明のポリペプチドまたは構築物をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、あるいは前記ポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡが提供される。本発明のさらなる態様では、本発明のポリペプチドまたは構築物を発現することができる、前記ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。好適には、宿主細胞は、大腸菌などの細菌、アスペルギルス属、サッカロミセス属、クリベロマイセス属、ハンゼヌラ属、またはピキア属に属する酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリスである。
自己免疫疾患および／または炎症性疾患
免疫系が正常な体組織に有害に反応する場合、自己免疫疾患が発症する。自己免疫疾患は、体組織の損傷、異常な臓器の成長、および／または臓器機能の変化を結果としてもたらし得る。障害は、１つの臓器あるいは組織のタイプのみに影響を及ぼし得るか、または複数の臓器および組織に影響を及ぼし得る。自己免疫疾患によって一般に影響を受けた臓器および組織は、血液成分、例えば、赤血球、血管、結合組織、内分泌腺、例えば、甲状腺または膵臓、筋肉、関節、および皮膚を含む。炎症性疾患は、炎症によって特徴付けられる疾患である。多くの炎症性疾患は自己免疫疾患であり、その逆もまた同様である。
本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、薬剤としての使用に適しており、自己免疫性および／または炎症性の疾患の処置での使用により適している。
ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰが病態の少なくともある割合に寄与する、本発明のポリペプチド（好適には、経口的に送達される場合）は、炎症性疾患を理想的に処置し、ポリペプチドは、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰが生物学的に活性である組織にアクセスすることができる。
本発明のポリペプチドは受容体（ＩＬ－７Ｒ）に結合する。したがって、それはまた、疾患に関与し得るまだ未発見のサイトカインまたはＩＬ－７Ｒの他の結合パートナーを妨害し得る。
ＩＬ－７およびＬ－ＴＳＬＰ結合ＩＬ－７Ｒの阻害
ＴＳＬＰの様々なアイソフォームが差動的に発現され、様々なシグナル伝達経路を介して作用するという証拠により、このサイトカインの短いアイソフォームの生理学的に有益な効果ではなく、Ｌ－ＴＳＬＰの疾患関連活性を選択的に標的とすることができることが示唆されている。本発明のポリペプチドは、ＩＬ－７ＲへのＩＬ－７の結合を阻害する。Ｖ７Ｒ－２Ｅ９分子とＩＬ－７Ｒαの相互作用のイン・シリコでモデル化およびＴＳＬＰ：ＴＳＬＰＲ：ＩＬ－７Ｒ複合体（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅら、２０１７）の最近公開された構造からの情報により、本発明のＶ７Ｒ－２Ｅ９および他のポリペプチドが、ＩＬ－７ＲαへのＩＬ－７とＬ－ＴＳＬＰの両方の結合を阻害するということが強く示唆された。ＩＬ－７（ＩＬ－７誘導性ＳＴＡＴ５リン酸化）とＬ－ＴＳＬＰ（ＴＳＬＰ誘導性ＴＡＲＣ分泌）の両方の受容体結合および細胞ベースの生物学的活性を強力に遮断するＶ７Ｒ－２Ｅ９の能力が確認された。Ｖ７Ｒ－２Ｅ９がＴＳＬＰではなくＩＬ－７Ｒαに結合するため、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９および関連するＩＣＶＤがＬ－ＴＳＬＰの炎症促進性活性のみを遮断すること、および、Ｓ－ＴＳＬＰの重要な粘膜の恒常性機能が影響されないことが予想される。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）
小児と成人の両方を苦しめる慢性の炎症性腸疾患、クローン病、および潰瘍性大腸炎は、ＧＩＴの自己免疫疾患および炎症性疾患の例である（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら、２００２）。潰瘍性大腸炎は、炎症反応および形態変化が依然として結腸に限局されている状態として定義される。直腸は、患者の９５％に関与する。炎症は、大部分は粘膜に制限され、結腸の長さに沿った潰瘍、浮腫、および出血を伴う、可変重症度の連続的な障害からなる（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら ２００２）。潰瘍性大腸炎は通常、排便の通過中の最も重度の下部の腹部痙攣とともに、便が混ざった血液と粘液の存在によって明示される。臨床的に、血液と粘液を伴う下痢の存在により、潰瘍性大腸炎と、血液が存在しない過敏性腸症候群とが区別される。潰瘍性大腸炎とは異なり、クローン病の症状は通常微妙であり、これが診断の遅れにつながる。障害の位置、範囲、および重症度などの因子は、胃腸症状の範囲を決定する。回結腸の障害（ｉｌｅｏｃｏｌｏｎｉｃ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）を有する患者は通常、食後の腹痛症を有し、右下腹部の圧痛、および時折、炎症性腫瘤を伴う。胃十二指腸のクローン病に関連する症状には、早期の満腹、悪心、嘔吐、心窩部痛、または嚥下障害が含まれる。肛門皮膚垂（ａｎａｌ ｔａｇｓ）、深い裂肛、およびフィステルを伴う肛門周囲の疾患は、一般的である（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら ２００２）。
好適には、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰが疾患の病態に寄与するＧＩ（胃腸）管の自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置で使用される。
好適には、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸疾患（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、糖尿病ＩＩ型、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、シェーグレン症候群、セリアック病、および薬物誘導性あるいは放射線誘発性の粘膜炎（より好適にはクローン病もしくは潰瘍性大腸炎、最も好適には潰瘍性大腸炎）からなるリストから選択されるＧＩ管の自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置で使用される。
好酸球性食道炎（ＥｏＥ）
好酸球性食道炎（ＥｏＥ、好酸球性食道炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｏｅｓｏｐｈａｇｉｔｉｓ）とも綴られ、アレルギー性食道炎としても知られる）は、白血球の一種である好酸球が関与する食道のアレルギー性の炎症性疾病である。症状は、嚥下障害、食片圧入、嘔吐、および胸やけである。好適には、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、好酸球性食道炎の処置で使用される。より好適には、ポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、好酸球性食道炎の処置で使用され、経口投与される。
他の自己免疫疾患／炎症性疾患
例えば、本発明のポリペプチドの経口投与によって処置され得るＧＩＴの他の疾患としては、例えば、炎症性疾患の粘膜炎（好適には、薬物誘導性および放射線誘導性の粘膜炎）、喘息、特発性肺線維症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、ネザートン症候群、食物アレルギー、アレルギー性下痢、好酸球性胃腸炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、アレルギー性真菌性副鼻腔炎、癌、ＣＯＰＤ、ケロイド、慢性副鼻腔炎（ＣＲＳ）、鼻のポリープ、慢性好酸球性肺炎、好酸球性気管支炎、セリアック病、およびチャーグ・ストラウス症候群が挙げられる。
粘膜炎では、病変が口から肛門までのいかなる場所にも生じる場合があり、口と食道の病変の場合、可変ドメインを含有する口腔洗浄薬またはクリームの調製物が使用され得る。肛門と直腸の病変の場合、可変ドメインを含有する坐薬、クリーム、またはフォームが、局所適用に適している。免疫グロブリン鎖可変ドメインは、炎症部位での血流中への吸収を介して、またはリンパ管のクリアランス（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）とその後の血流への流入を介して、固有層あるいは他の炎症性部位から除去される。したがって、ドメインは、血流により肝臓に到達し、腎臓中の糸球体濾過により除去される。それゆえ、ドメインは、自己免疫性肝炎、ＩＩ型糖尿病、および糸球体腎炎などの疾患において治療的に機能するという十分な論理的根拠が存在する。
一実施形態では、本発明のポリペプチドまたは構築物は、好適には、クリーム、ナノ粒子、軟膏、またはヒドロゲルの形態で、好適には、皮膚へのおよび／または皮膚を介した局所的送達によって、アトピー性皮膚炎の処置または予防で使用される。
好適には、ポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰが観察された病態のある割合の原因となる他の自己免疫疾患／炎症性疾患の処置で使用される。
治療用の使用および送達
治療上有効な量の本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、対象への単回投与または複数回投与の際に、対象において有意な程度に、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰがＩＬ－７Ｒに結合するのを阻害するのに有効な量である。治療上有効な量は、疾患状態、個体の年齢、性別、および体重、および、個体において所望の反応を誘発するポリペプチド、医薬組成物、または構築物の能力などの因子に応じて変わる場合がある。治療上有効な量はまた、治療上有益な効果が、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物の任意の毒性または有害な効果を上回る量である。本発明のポリペプチドまたは構築物は、対象への投与に適している医薬組成物へと組み込まれてもよい。本発明のポリペプチドまたは構築物は、薬学的に許容可能な塩の形態であってもよい。
本発明の医薬組成物は、経口、筋肉内、皮下、または静脈内の送達に好適に製剤化され得る。本発明の医薬組成物は、様々な形態であってもよい。これらの形態には、例えば、液体溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、分散体または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム、ならびに坐剤などの、液体、半固形、および固形剤形が含まれる。固形剤形が好ましい。本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、賦形剤とともに組み入れられ、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウェーハなどの形態で使用されてもよい。好酸球性食道炎の処置の場合、ロゼンジの形態での送達が特に好ましい。アトピー性皮膚炎の処置の場合、クリームの形態での送達が特に好ましい。
典型的には、医薬組成物は、本発明のポリペプチドまたは構築物と、薬学的に許容可能な希釈液または担体とを含む。薬学的に許容可能な担体の例としては、水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つ以上、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容可能な担体は、本発明のポリペプチドまたは構築物の有効期間または有効性を増強する、湿潤剤あるいは乳化剤、防腐剤あるいは緩衝液などの少量の補助物質をさらに含む。医薬組成物は、粘着防止剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒｅｎｔｓ）、結合剤、コーティング、崩壊剤、香料、着色剤、滑沢剤、吸着剤、防腐剤、甘味剤、凍結乾燥賦形剤（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）（リオプロテクタント（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）を含む）または圧縮助剤を含む。
ＥｏＥとＵＣの患者では、炎症を起こした腸粘膜の上皮性関門が損なわれると考えられ、結果的に、根底にある粘膜組織への本発明の経口投与されたポリペプチドの透過が促進され、場合によっては、炎症部位での標的組織におけるＩＬ－７活性とＬ－ＴＳＬＰ活性の両方の阻害を結果としてもたらす。本発明のポリペプチドを経口投与することで、ＩＬ－７活性とＬ－ＴＳＬＰ活性の全身的な阻害を制限し、注射によって投与される従来のＩＬ－７とＴＳＬＰ抗体と関連する一般的な免疫抑制のリスクを減らすはずである。動物モデルで行われるなどの短期間の抗ＩＬ－７Ｒ抗体処置は、病原性Ｔ細胞の枯渇により、長期間の臨床効果（寛解）をもたらすことが可能である。しかし、既存のＩＬ－７Ｒα－遮断抗体の患者への反復全身投与は、胸腺Ｔ細胞の発達の阻害および末梢Ｔ細胞の枯渇を結果としてもたらし、有意な全身的な免疫抑制を結果としてもたらす可能性が高い。炎症性腸疾患（クローン病と潰瘍性大腸炎）およびＥｏＥは、大部分が胃腸管に限局され、結果的に、炎症を起こした腸管粘膜への本発明のポリペプチドの経口投与は、制限された全身的な曝露により局所的効果を達成し、それによって、疾患によって影響を受けていない組織における免疫抑制のリスクを減らす可能性を提供する。
したがって、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、好適に経口投与される。ポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、頬側口腔、咽頭、および食道（より好適には食道）に経口的に送達されるか（ＥｏＥの処置のためなど）、または、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および／または肛門管に経口的に送達されてもよい（ＩＢＤの処置のためなど）。
経口送達分に関する重要な問題は、十分なポリペプチド、医薬組成物、または構築物が、必要とされる胃腸管の領域に到達することを確実にすることである。本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物が、必要とされる胃腸管の領域に到達するのを防ぐ因子は、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物を分解することができる消化分泌液中のプロテアーゼの存在を含む。好適には、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、ポリペプチドまたはその構築物の固有特性のおかげで、そのようなプロテアーゼの１つ以上の存在下で実質的に安定している。好適には、本発明のポリペプチドまたは構築物は、医薬組成物に組み込まれる前に凍結乾燥される。
本発明のポリペプチドはまた、腸溶コーティングと共に提供され得る。腸溶コーティングは、胃の低いｐＨからポリペプチドを保護するのを助ける、経口薬剤に適用されるポリマーバリアである。腸溶コーティングに使用される材料には、脂肪酸、ワックス、シェラック、プラスチック、および植物性繊維が含まれる。好適な腸溶コーティング成分は、メチルアクリレート－メタクリル酸コポリマー、セルロースアセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ヒプロメロースアセテートスクシネート）、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、メチルメタクリレート－メタクリル酸コポリマー、アルギン酸ナトリウム、およびステアリン酸を含む。好適な腸溶コーティングはｐＨ依存性放出ポリマーを含む。これらは、胃内で認められる強酸性のｐＨでは不溶性であるが、弱酸性のｐＨで迅速に溶解するポリマーである。したがって、好適には、腸溶コーティングは、胃（ｐＨ～３）の酸性分泌液には溶解しないが、小腸（６を上回るｐＨ）または結腸（７．０を上回るｐＨ）に存在するより高いｐＨ環境に溶解する。本発明のポリペプチドまたは構築物が、その投与量が小腸に到達するおよその時間で放出されるように、ｐＨ依存性放出ポリマーは選択される。
ＩＢＤの処置のために経口投与される場合、本発明のポリペプチドは腸溶コーティングと共に好適に提供される。ＥｏＥの処置のために経口投与される場合、本発明のポリペプチドは圧縮したトローチの形態で好適に提供される。
本発明のポリペプチド、構築物、または医薬組成物は、局所的に送達される。そのような医薬組成物は、好適には、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、フォーム、経皮パッチ、粉末、ペースト、あるいはチンキの形態であってもよく、好適には、ビタミンＤ３アナログ（例えば、カルシポトリオールならびにマキサカルシトール）、ステロイド（例えば、プロピオン酸フルチカゾン、吉草酸ベタメタゾン、ならびにプロピオン酸クロベタゾール）、レチノイド（例えば、タザロテン）、コールタール、およびジトラノールを含んでいてもよい。局所的薬剤は、しばしば、互いに組み合わされて使用されるか（例えば、ビタミンＤ３とステロイド）、またはサリチル酸などの薬剤とさらに組み合わされる。
本発明のポリペプチド、構築物、または医薬組成物は、水性溶媒または非水性溶媒、例えば、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールへの溶解、懸濁、または乳化により、および、望ましくは、従来の添加剤、例えば、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および保存料を用いて、注射用の調製物へ製剤化可能である。許容可能な担体、賦形剤、および／または安定剤は、使用された投与量と濃度でレシピエントに無毒であり、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン、およびクエン酸を含む抗酸化剤；保存料（エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－ｃｈｌｏｒ－ｍ－クレゾール、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、あるいはこれらの組み合わせ）；アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、およびこれらの組み合わせなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、および他の炭水化物；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；ゼラチンまたは血清アルブミンなどのタンパク質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸などの糖；ならびに／あるいは、ポリソルベート、ＰＯＥエーテル、ポロキサマー、トリトン－Ｘ、またはポリエチレングリコールなどの非イオン界面活性剤を含む。
すべての送達様式について、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、組成物のｐＨを、５～５０、または、より好適には１５～４０、または、より好適には２５～３０ｇ／リットルの間の濃度で安定化させるために、緩衝液中で製剤化されてもよい。適切な緩衝液成分の例としては、クエン酸ナトリウムおよび／またはクエン酸などの生理的食塩が挙げられる。好適には、緩衝液は１００～２００、より好適には１２５～１７５ｍＭの生理的食塩、例えば、塩化ナトリウムを含む。好適には、緩衝液は、組成物のｐＨまたは患者の生理的ｐＨに近いｐＫａを有するように選択される。
医薬組成物中の例示的なポリペプチドまたは構築物の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬ、または約５０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍｌ、または約１５０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。
本発明のポリペプチド、構築物、または医薬組成物の水性製剤は、ｐＨ緩衝溶液、例えば、約４．０～約７．０または約５．０～約６．０の範囲、あるいは、代替的に約５．５のｐＨで調製され得る。適切な緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、および他の有機酸緩衝液が挙げられる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液および製剤の所望の張性に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、または約５ｍＭ～約５０ｍＭであり得る。
医薬組成物の張性は、張性調節剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を含めることによって変えることができる。このような張性調節剤は、荷電または非荷電の化学種であり得る。代表的な非荷電張性調節剤としては、糖または糖アルコールまたは他のポリオール、好ましくはトレハロース、スクロース、マンニトール、グリセロール、１，２－プロパンジオール、ラフィノース、ソルビトールまたはラクチトール（特にトレハロース、マンニトール、グリセロール、または１，２－プロパンジオール）が挙げられる。代表的な荷電張性調節剤としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、またはカルシウムイオンと、塩化物イオン、硫酸イオン、炭酸イオン、亜硫酸イオン、硝酸イオン、乳酸イオン、コハク酸イオン、酢酸イオン、またはマレイン酸イオン（特に塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウム）との組み合わせなどの塩；あるいは、アルギニンまたはヒスチジンなどのアミノ酸が挙げられる。好適には、水性製剤は等張性であるが、高張性または低張性の溶液が適している場合もある。「等張」という用語は、生理食塩液または血清などの、比較対象となる一部の他の溶液と同じ張力を有する溶液を表す。等張化剤は、約５ｍＭ～約３５０ｍＭの量、例えば、１ｍＭ～５００ｎＭの量で使用されてもよい。好適には、少なくとも１つの等張化剤が組成物中に含まれる。
製剤化されたポリペプチドまたは構築物の凝集を低減し、および／または製剤中の微粒子の形成を最小化し、および／または吸着を低減するために、界面活性剤を医薬組成物に添加することもできる。例示的な界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（ポロキサマー、プルロニック（登録商標））、およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。適切なポリオキシエチレンソルビタン－脂肪酸エステルの例としては、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０が挙げられる。界面活性剤の例示的な濃度は、約０．００１％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの範囲であり得る。
凍結乾燥プロセス中に不安定化条件から本発明のポリペプチドまたは構築物を保護するために、リオプロテクタントも添加され得る。例えば、既知のリオプロテクタントは、糖類（グルコース、スクロース、マンノース、およびトレハロースを含む）；ポリオール（マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを含む）；およびアミノ酸（アラニン、グリシン、およびグルタミン酸を含む）を含む。リオプロテクタントは、約１０ｍＭ～５００ｍＭの量で含まれ得る。
本発明のポリペプチド、医薬組成物、または本発明の構築物の投与のための投与量範囲は、所望の治療効果を生成するためのものである。必要な投与量範囲は、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物の正確な性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の疾患の性質、程度、あるいは重症度、（もしあれば）禁忌、および主治医の判断に依存する。これらの投与量レベルの変動は、最適化のための標準的で経験的な方法を使用して調節することができる。
本発明のポリペプチド、医薬組成物、または本発明の構築物の適切な毎日の投与量は、１ｋｇ当たり５０ｎｇ～５０ｍｇの範囲であり、例えば、体重の１ｋｇ当たり５０ｕｇ～４０ｍｇ、例えば、１ｋｇ当たり５～３０ｍｇである。単位投与量は、１００ｍｇ未満から変動する場合があるが、典型的には１投与当たり２５０～２０００ｍｇの範囲であり、単位投与量は、毎日またはより頻繁で、例えば、１日当たり２、３、あるいは４回、またはより少ない頻度で、例えば、一日おきに、あるいは週に１回、２週間に１回、または月に１回投与されてもよい。
本発明の一態様では、自己免疫疾患の処置のための薬剤の製造における、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物の使用が提供される。本発明のさらなる態様では、必要とする人に治療上有効な量の本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物を投与する工程を含む、自己免疫疾患を処置する方法が提供する。
本発明の一態様では、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置のための薬剤の製造における、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物の使用が提供される。本発明のさらなる態様では、必要とする人に治療上有効な量の本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物を投与する工程を含む、自己免疫疾患および／または炎症性疾患を処置する方法が提供される。
「処置」との用語は、治療用処置と同様に予防も包含するように意図される。疾患の処置はその悪化の処置も包含し、および、疾患症状の再発を防ぐために、疾患症状から寛解している患者の処置も包含する。
組み合わせ療法
本発明の医薬組成物は、１つ以上の活性薬剤（例えば、本明細書で記載される疾患を処置するのに適切な活性薬剤）も含み得る。自己免疫疾患の処置で通常使用される他の確立されている治療の補助剤として、あるいはその確立されている治療と組み合わせて、自己免疫疾患の処置のための治療方法で本発明の医薬組成物を使用することは、本発明の範囲内である。
ＩＢＤ（クローン病または潰瘍性大腸炎などの）の処置の場合、可能性のある組み合わせとしては、例えば、５－アミノサリチル酸、またはそのプロドラッグ（スルファサラジン、オルサラジン、あるいはビサラジド（ｂｉｓａｌａｚｉｄｅ）など）；コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、あるいはブデソニド）；免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキセート、アザチオプリン、あるいは６－メルカプトプリン）；抗ＴＮＦ－α抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、あるいはゴリムマブ）；抗ＩＬ１２／ＩＬ２３抗体（例えば、ウステキヌマブ）；抗ＩＬ６Ｒ抗体あるいは小分子ＩＬ１２／ＩＬ２３阻害剤（例えば、アピリモド（ａｐｉｌｉｍｏｄ））；抗α－４－β－７抗体（例えば、ベドリズマブ）；ＭＡｄＣＡＭ－１遮断薬（例えば、ＰＦ－００５４７６５９）；細胞接着分子α－４－インテグリンに対する抗体（例えば、ナタリズマブ）；ＩＬ２受容体αサブユニットに対する抗体（例えば、ダクリズマブあるいはバシリキシマブ）；ＪＡＫ３阻害剤（例えば、トファシチニブあるいはＲ３４８）；Ｓｙｋ阻害剤、およびそのプロドラッグ（例えば、ホスタマチニブならびにＲ－４０６）；ホスホジエステラーゼ－４阻害剤（例えば、テトミラスト）；ＨＭＰＬ－００４；プロバイオティクス；デルサラジン（Ｄｅｒｓａｌａｚｉｎｅ）；セマピモド（ｓｅｍａｐｉｍｏｄ）／ＣＰＳＩ－２３６４；および、プロテインキナーゼＣ阻害剤（例えば、ＡＥＢ－０７１）を含むリストから選択される１つ以上の活性薬剤との組み合わせが挙げられる。最も適切な組み合わせ剤は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴ、またはゴリムマブである。
したがって、本発明の別の態様は、１つ以上のさらなる有効な薬剤、例えば、上に記載される１つ以上の活性薬剤と組み合わせた、本発明の医薬組成物を提供する。
本発明のさらなる態様では、ポリペプチド、医薬組成物、または構築物は、上記リストから選択される少なくとも１つの活性薬剤と順次に、同時に、あるいは別々に投与される。
同様に、本発明の別の態様は、
（Ａ）本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物、および
（Ｂ）１つ以上の他の活性薬剤
を含む組み合わせ製品（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）を提供し、ここで、成分（Ａ）と（Ｂ）の各々は、薬学的に許容可能なアジュバント、希釈液、または担体と混合して製剤化される。本発明のこの態様では、組み合わせ製品は、単一（組み合わせ）製剤またはキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ－ｏｆ－ｐａｒｔｓ）のいずれかであり得る。したがって、本発明のこの態様は、薬学的に許容可能なアジュバント、希釈液、または担体と混合された、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物、および別の治療剤を含む組み合わせ製剤を包含する。
本発明は、
（ｉ）薬学的に許容可能なアジュバント、希釈液、または担体と混合された、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または構築物、および
（ｉｉ）薬学的に許容可能なアジュバント、希釈液、または担体と混合された、１つ以上の他の活性薬剤を含む製剤
の成分を含むキット・オブ・パーツも包含し、成分（ｉ）と（ｉｉ）はそれぞれ、他方と組み合わせて投与するのに適した形態で提供される。
したがって、キット・オブ・パーツの成分（ｉ）は、薬学的に許容可能なアジュバント、希釈液、または担体と混合された上記成分（Ａ）である。同様に、成分（ｉｉ）は、薬学的に許容可能なアジュバント、希釈液、または担体と混合された上記成分（Ｂ）である。１つ以上の他の活性薬剤（つまり、上記成分（Ｂ））は、例えば、ＩＢＤ（例えば、クローン病および／または潰瘍性大腸炎）などの自己免疫疾患の処置に関して上述された、薬剤のいずれかであり得る。成分（Ｂ）が１つを超える活性薬剤の場合、これらのさらなる活性薬剤は、互いと製剤化されるか、成分（Ａ）と製剤化されるか、または、これらは別々に製剤化され得る。一実施形態では、成分（Ｂ）は１つの他の治療剤である。別の実施形態では、成分（Ｂ）は２つの他の治療剤である。本発明のこの態様の組み合わせ製品（組み合わせた製剤またはキット・オブ・パーツのいずれか）は、自己免疫疾患（例えば、本明細書で述べられる自己免疫疾患）の処置または予防で使用されてもよい。
安定性
一実施形態では、本発明のポリペプチドまたは構築物は経口的に送達される。したがって、本発明のポリペプチドまたは構築物は好適には、経口的に送達される場合、中和能力および／または中和効力を実質的に保持する。
好適には、本発明のポリペプチドまたは構築物は、経口投与された場合、および腸管への曝露後（例えば、小腸および／または大腸のプロテアーゼならびに／あるいはＩＢＤ炎症性プロテアーゼへの曝露後）に、中和能力および／または効力を実質的に保持する。そのようなプロテアーゼとしては、エンテロペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシン、および過敏性腸疾患炎症性プロテアーゼ（ＭＭＰ３、ＭＭＰ１２、およびカテプシンなど）が挙げられる。小腸および／または大腸のプロテアーゼ、または上記小腸および／または大腸で産生されるプロテアーゼは、腸内共生細菌叢および／または病原性細菌から供給されるプロテアーゼを含み、例えば、プロテアーゼは細胞膜付着プロテアーゼ、排泄プロテアーゼ、および細胞溶解時に放出されるプロテアーゼである。最も好適には、プロテアーゼは、トリプシンおよびキモトリプシンである。
好適には、腸管は、イヌ、ブタ、ヒト、カニクイザル、またはマウスの腸管である。より好適には、腸管は、ヒト、カニクイザル、またはマウスの腸管であり、最も好適にはヒトの腸管である。小腸は好適には十二指腸、空腸、および回腸からなる。大腸は好適には盲腸、結腸、直腸、および肛門管からなる。胃腸管は、胃腸管とは対照的に、小腸および大腸のみからなる。一実施形態では、本発明のポリペプチドまたは構築物は、胃腸管、最も好適には、ヒト胃腸管のプロテアーゼに対して実質的に耐性がある。
頬側口腔、咽頭、および食道での安定性
頬側口腔、咽頭、および食道は、胃腸管において胃に先行する。好適には、本発明のポリペプチドまたは構築物は、経口的に、かつ頬側口腔、咽頭、および食道への曝露後（例えば、頬側口腔、咽頭、および食道のプロテアーゼへの曝露後）に送達される時、実質的に中和能力および／または中和効力を保持する。頬側口腔、咽頭、および食道のプロテアーゼは、共生細菌叢および／または病原性細菌から調達されるプロテアーゼを含み、例えば、プロテアーゼは、細胞膜付着プロテアーゼ、排泄プロテアーゼ、および細胞溶解で放出されたプロテアーゼである。
好適には、頬側口腔、咽頭、および食道は、イヌ、ブタ、ヒト、カニクイザル、またはマウスのものである。より好適には、頬側口腔、咽頭、および食道は、ヒト、カニクイザル、またはマウスのもの、最も好適にはヒトのものである。
本発明のポリペプチドまたは構築物は、本発明のポリペプチドまたは構築物の本来の中和能力の、好適には１０％以上、より好適には２０％以上、より好適には３０％以上、より好適には４０％以上、より好適には５０％以上、より好適には６０％以上、より好適には７０％以上、より好適には８０％以上、より好適には９０％以上、より好適には９５％以上、または最も好適には１００％が、小腸および／または大腸に存在するプロテアーゼ、ならびに／あるいはＩＢＤ炎症性プロテアーゼに曝露された後も保持されている場合に、中和能力を実質的に保持する。
好適には、本発明のポリペプチドまたは構築物は、小腸および／または大腸に存在するプロテアーゼ、ならびに／あるいはＩＢＤ炎症性プロテアーゼに、例えば、３７℃で、最大少なくとも２時間、より好適には最大少なくとも３時間、より好適には最大少なくとも４時間、より好適には最大少なくとも５時間、より好適には最大少なくとも５．５時間、より好適には最大少なくとも６、より好適には最大少なくとも６．５時間、より好適には最大少なくとも７、より好適には最大少なくとも７．５、より好適には最大に少なくとも１０、より好適には最大少なくとも１３、または、より好適には最大少なくとも１６時間にわたって曝露された後に、中和能力を実質的に保持する。
本発明のポリペプチドまたは構築物の中和能力の好適には１０％以上、より好適には２０％以上、より好適には３０％以上、より好適には４０％以上、より好適には５０％以上、より好適には６０％以上、より好適には７０％以上、より好適には８０％以上、より好適には９０％以上、より好適には９５％は、腸管の条件、より好適には小腸または大腸、より好適にはヒトの糞便抽出物への曝露の少なくとも２時間、より好適には少なくとも３時間、より好適には少なくとも４時間、より好適には少なくとも５時間、より好適には少なくとも６時間、より好適には少なくとも７時間、より好適には９時間、より好適には少なくとも１１時間、より好適には少なくとも１３時間、より好適には少なくとも１６時間後に保持されている。
本発明のポリペプチドまたは構築物の中和能力の好適には１０％以上、より好適には２０％以上、より好適には３０％以上、より好適には４０％以上、より好適には５０％以上、より好適には６０％以上、より好適には７０％以上、より好適には８０％以上、より好適には９０％以上、より好適には９５％以上、好適には少なくとも１時間、より好適には少なくとも２時間、より好適には少なくとも３時間、より好適には少なくとも４時間、より好適には少なくとも５時間、またはより好適には少なくとも６時間のマウス小腸の上清への曝露後に保持される。
本発明のポリペプチドまたは構築物の投与量の好適には１０％以上、より好適には２０％以上、より好適には３０％以上、より好適には４０％以上、より好適には５０％以上、より好適には６０％以上、より好適には７０％以上は、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰに対する中和能力を保持し、ならびに、投与後少なくとも２時間、より好適には少なくとも３時間、より好適には少なくとも４時間、より好適には少なくとも５時間、より好適には少なくとも６時間、より好適には少なくとも７時間、より好適には少なくとも９時間、より好適には少なくとも１１時間、より好適には少なくとも１３時間、またはより好適には少なくとも１６時間後に、マウス、カニクイザル、および／またはヒトの糞便（好適には、排泄された糞便、あるいは腸管から取り出された糞便）中に残っている。
本発明のポリペプチドまたは本発明の構築物の投与された量の好適には１０％以上、より好適には２０％以上、より好適には３０％以上、より好適には４０％以上、より好適には５０％以上、より好適には６０％以上、より好適には７０％以上、より好適には８０％以上、より好適には９０％以上、より好適には９５％以上、より好適には９９％以上、最も好適には１００％が、小腸および／または大腸に存在するプロテアーゼならびに／あるいはＩＢＤ炎症性プロテアーゼに曝露後、インタクトなままであるときに、本発明のポリペプチドまたは本発明の構築物は実質的にはインタクトなままである。
「安定性」および「生存」、例えば、「安定性％」および「生存％」は、本明細書で交換可能に使用される。「中和能力を実質的に保持する」および「実質的に耐性である」は、本明細書で交換可能に使用される。
本発明の一実施形態では、ヒト糞便上清の消化物におけるそれらの安定性に基づいて、以下に記載されるＩＣＶＤのいずれか１つのポリペプチド配列を含むか、またはより好適にはそのポリペプチド配列からなるポリペプチドが提供される。
Ｖ７Ｒ－２Ｅ９、ＩＤ－Ａ５９Ｕ、ＩＤ－Ａ２Ｕ、ＩＤ－Ａ９Ｕ、ＩＤ－Ａ１０Ｕ、ＩＤ－Ａ１１Ｕ、ＩＤ－Ａ１２Ｕ、ＩＤ－Ａ１４Ｕ、ＩＤ－Ａ１５Ｕ、ＩＤ－Ａ１６Ｕ、ＩＤ－Ａ１７Ｕ、ＩＤ－Ａ１８Ａ、ＩＤ－Ａ１９Ｕ、ＩＤ－Ａ２０Ｕ、ＩＤ－Ａ２１Ｕ、ＩＤ－Ａ２４Ｕ、ＩＤ－Ａ４３Ｕ、ＩＤ－Ａ２５Ｕ、ＩＤ－Ａ３０Ｕ、ＩＤ－Ａ３１Ｕ、ＩＤ－Ａ５０Ｕ、ＩＤ－Ａ３３Ｕ、ＩＤ－Ａ５２Ｕ、ＩＤ－Ａ３４Ｕ、ＩＤ－Ａ５３Ｕ、ＩＤ－Ａ３５Ｕ、ＩＤ－Ａ５４Ｕ、ＩＤ－Ａ３６Ｕ、ＩＤ－Ａ５５Ｕ、ＩＤ－Ａ３７Ｕ、ＩＤ－Ａ３８Ｕ、ＩＤ－Ａ５７Ｕ、ＩＤ－Ａ３９Ｕ、ＩＤ－Ａ４０Ｕ、Ｖ７Ｒ－２Ｆ６、Ｖ７Ｒ－６Ｃ１２、Ｖ７Ｒ－２Ｂ６、Ｖ７Ｒ－３Ｂ５、Ｖ７Ｒ－４Ｆ６、Ｖ７Ｒ－２Ｅ５、ＩＤ－Ａ３Ｕ、ＩＤ－Ａ４Ｕ、ＩＤ－Ａ５Ｕ、ＩＤ－Ａ６Ｕ、ＩＤ－Ａ７Ｕ、ＩＤ－Ａ８Ｕ、ＩＤ－Ａ１３Ｕ、ＩＤ－Ａ２３Ｕ、ＩＤ－Ａ２６Ｕ、ＩＤ－Ａ２７Ｕ、ＩＤ－Ａ２８Ｕ、ＩＤ－Ａ２９Ｕ、およびＩＤ－Ａ３２Ｕ。
３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１－ＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１－ＦＲ４）とを含む、ポリペプチドも提供され、ここで、ＣＤＲ１は、上記のＩＣＶＤのいずれかのＣＤＲ１配列を含むか、またはより好適にはそのＣＤＲ１配列からなり、ＣＤＲ２は、上記のＩＣＶＤのいずれかのＣＤＲ２配列を含むか、またはより好適にはそのＣＤＲ２配列からなり、および、ＣＤＲ３は、上記のＩＣＶＤのいずれかのＣＤＲ３配列を含むか、またはより好適にはそのＣＤＲ３配列からなる。最も好適には、ポリペプチドは、上記の１つのＩＣＶＤからの３つのＣＤＲをすべて含む。
ヒトの糞便上清の消化物にけるそれらの安定性に基づいて、より好適には、以下に記載されるＩＣＶＤのいずれか１つのポリペプチド配列を含むか、またはより好適にはそのポリペプチド配列からなるポリペプチドが提供される。
Ｖ７Ｒ－２Ｅ９、ＩＤ－Ａ５９Ｕ、ＩＤ－Ａ２Ｕ、ＩＤ－Ａ９Ｕ、ＩＤ－Ａ１０Ｕ、ＩＤ－Ａ１１Ｕ、ＩＤ－Ａ１２Ｕ、ＩＤ－Ａ１４Ｕ、ＩＤ－Ａ１５Ｕ、ＩＤ－Ａ１６Ｕ、ＩＤ－Ａ１７Ｕ、ＩＤ－Ａ１８Ａ、ＩＤ－Ａ１９Ｕ、ＩＤ－Ａ２０Ｕ、ＩＤ－Ａ２１Ｕ、ＩＤ－Ａ２４Ｕ、ＩＤ－Ａ４３Ｕ、ＩＤ－Ａ２５Ｕ、ＩＤ－Ａ３０Ｕ、ＩＤ－Ａ３１Ｕ、ＩＤ－Ａ５０Ｕ、ＩＤ－Ａ３３Ｕ、ＩＤ－Ａ５２Ｕ、ＩＤ－Ａ３４Ｕ、ＩＤ－Ａ５３Ｕ、ＩＤ－Ａ３５Ｕ、ＩＤ－Ａ５４Ｕ、ＩＤ－Ａ３６Ｕ、ＩＤ－Ａ５５Ｕ、ＩＤ－Ａ３７Ｕ、ＩＤ－Ａ３８Ｕ、ＩＤ－Ａ５７Ｕ、ＩＤ－Ａ３９Ｕ、ＩＤ－Ａ４０Ｕ、Ｖ７Ｒ－２Ｆ６、Ｖ７Ｒ－６Ｃ１２、Ｖ７Ｒ－２Ｂ６、Ｖ７Ｒ－３Ｂ５、Ｖ７Ｒ－４Ｆ６、およびＶ７Ｒ－２Ｅ５。
３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１－ＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１－ＦＲ４）とを含む、ポリペプチドも提供され、ここで、ＣＤＲ１は、上記のＩＣＶＤのいずれかのＣＤＲ１配列を含むか、またはより好適にはそのＣＤＲ１配列からなり、ＣＤＲ２は、上記のＩＣＶＤのいずれかのＣＤＲ２配列を含むか、またはより好適にはそのＣＤＲ２配列からなり、および、ＣＤＲ３は、上記のＩＣＶＤのいずれかのＣＤＲ３配列を含むか、またはより好適にはそのＣＤＲ３配列からなる。最も好適には、ポリペプチドは、上記の１つのＩＣＶＤからの３つのＣＤＲをすべて含む。
ヒトの糞便上清の消化物にけるそれらの安定性に基づいて、より好適には、以下に記載されるＩＣＶＤのいずれか１つのポリペプチド配列を含むか、またはより好適にはそのポリペプチド配列からなるポリペプチドが提供される。
Ｖ７Ｒ－２Ｅ９、ＩＤ－Ａ５９Ｕ、ＩＤ－Ａ２Ｕ、ＩＤ－Ａ９Ｕ、ＩＤ－Ａ１０Ｕ、ＩＤ－Ａ１１Ｕ、ＩＤ－Ａ１２Ｕ、ＩＤ－Ａ１４Ｕ、ＩＤ－Ａ１５Ｕ、ＩＤ－Ａ１６Ｕ、ＩＤ－Ａ１７Ｕ、ＩＤ－Ａ１８Ａ、ＩＤ－Ａ１９Ｕ、ＩＤ－Ａ２０Ｕ、ＩＤ－Ａ２１Ｕ、ＩＤ－Ａ２４Ｕ、ＩＤ－Ａ４３Ｕ、ＩＤ－Ａ２５Ｕ、ＩＤ－Ａ３０Ｕ、ＩＤ－Ａ３１Ｕ、ＩＤ－Ａ５０Ｕ、ＩＤ－Ａ３３Ｕ、ＩＤ－Ａ５２Ｕ、ＩＤ－Ａ３４Ｕ、ＩＤ－Ａ５３Ｕ、ＩＤ－Ａ３５Ｕ、ＩＤ－Ａ５４Ｕ、ＩＤ－Ａ３６Ｕ、ＩＤ－Ａ５５Ｕ、ＩＤ－Ａ３７Ｕ、ＩＤ－Ａ３８Ｕ、ＩＤ－Ａ５７Ｕ、ＩＤ－Ａ３９Ｕ、ＩＤ－Ａ４０Ｕ。
３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１－ＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１－ＦＲ４）とを含む、ポリペプチドも提供され、ここで、ＣＤＲ１は、上記のＩＣＶＤのいずれかのＣＤＲ１配列を含むか、またはより好適にはそのＣＤＲ１配列からなり、ＣＤＲ２は、上記のＩＣＶＤのいずれかのＣＤＲ２配列を含むか、またはより好適にはそのＣＤＲ２配列からなり、および、ＣＤＲ３は、上記のＩＣＶＤのいずれかのＣＤＲ３配列を含むか、またはより好適にはそのＣＤＲ３配列からなる。最も好適には、ポリペプチドは、上記の１つのＩＣＶＤからの３つのＣＤＲをすべて含む。
調製方法
本発明のポリペプチドは、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ２０１２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓで開示される技術を使用して取得または操作することができる。
モノクローナル抗体は、組織培養中で増大するその能力および抗体鎖合成の非存在について選択された骨髄腫（Ｂ細胞癌）細胞を、特異的抗体を産生するＢ細胞と融合させることによって、ハイブリドーマ技術を使用して産生することができる（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ １９７５、および Ｎｅｌｓｏｎら ２０００）。
決定された抗原に対して向けられるモノクローナル抗体は、例えば、
ａ）ハイブリドーマを形成するために、決定された抗原で、不死の細胞で、および好ましくは骨髄細胞であらかじめ免疫化された動物の末梢血から得られたリンパ球を不死化すること、
ｂ）形成された不死化細胞（ハイブリドーマ）を培養し、所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を回収すること、
によって得られ得る。
あるいは、ハイブリドーマ細胞の使用は必要とされない。したがって、モノクローナル抗体は、
ａ）ベクターへと、特にファージ、より具体的には糸状バクテリオファージへと、（好適に、決定された抗原であらかじめ免疫された）動物のリンパ球、特に末梢血リンパ球から得られたＤＮＡあるいはｃＤＮＡ配列をクローニングする工程、
ｂ）抗体の産生を可能にする条件で、上記ベクターで原核細胞を形質転換する工程、
ｃ）抗体を抗原－親和性の選択にさらすことによって、抗体を選択する工程、
ｄ）所望の特異性を有する抗体を回収する工程、
を含むプロセスによって得られ得る。
ラクダ科の動物を免疫化し、血液中を循環するＢ細胞のＶＨＨレパートリーをクローニングし（ＣｈｏｍｅｚｙｎｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉ １９８７）、および、ファージ、酵母、あるいはリボソームディスプレイを使用して、免疫（Ａｒｂａｂｉ－Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら １９９７）および非免疫（Ｔａｎｈａら ２００２）のライブラリからの抗原特異性ＶＨＨを単離するための方法は既知である（ＷＯ９２／０１０４７、Ｎｇｕｙｅｎら ２００１年、およびＨａｒｍｓｅｎら ２００７）。
ｓｃＦｖフラグメントおよびＦｖフラグメントなどの抗体の抗原結合フラグメントは単離され、大腸菌で発現される（Ｍｉｅｔｈｅら ２０１３、Ｓｋｅｒｒａら １９８８、Ｗａｒｄら １９８９）。
ポリペプチドのアミノ酸配列についてはサイレントであるが、特定の宿主での翻訳に好ましいコドンをもたらすポリペプチドをコードする突然変異を、ＤＮＡあるいはｃＤＮＡに対して作ることができる。例えば、大腸菌、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける核酸の翻訳に好ましいコドンは既知である。
ポリペプチドの突然変異は、例えば、ポリペプチドをコードする核酸への置換、付加、または欠失によって達成され得る。ポリペプチドをコードする核酸への置換、付加、または欠失は、例えば、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド指向性突然変異、アセンブリＰＣＲ、ＰＣＲ突然変異誘発、インビボの突然変異誘発、カセット変異誘発、繰り返しアンサンブル突然変異誘発、指数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的な突然変異誘発（Ｌｉｎｇら １９９７）、遺伝子再構成、遺伝子部位飽和変異誘発（ＧＳＳＭ）、合成ライゲーション再構成（ＳＬＲ）、またはこれらの方法の組み合わせを含む多くの方法で導入することができる。核酸への修飾、付加、または欠失はまた、組換え、繰り返し配列組換え、ホスホチオエート修飾されたＤＮＡ変異誘発、ウラシル含有鋳型変異誘発、ギャップ付き二重鎖変異誘発、点ミスマッチ修復変異誘発、修復－欠損宿主株変異誘発、化学変異誘発、放射原性（ｒａｄｉｏｇｅｎｉｃ）変異誘発、欠失変異誘発、制限－選択変異誘発、制限－精製変異誘発、アンサンブル変異誘発、キメラ核酸多量体生成、またはそれらの組合せを含む方法によって導入することができる。
特に、人工遺伝子合成が使用されてもよい（Ｎａｍｂｉａｒら １９８４、ＳａｋａｍａｒとＫｈｏｒａｎａ １９８８、ウェルら １９８５、およびＧｒｕｎｄｓｔｒｏｍら １９８５）。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、固相ＤＮＡ合成によって合成的に産生され得る。遺伝子全体は、前駆体鋳型ＤＮＡを必要とせずに、デノボ合成され得る。所望のオリゴヌクレオチドを得るために、ビルディングブロックは、産物の配列によって必要とされる順序で、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に順次にカップリングされる。鎖集合が完成すると、産物は固相から溶液へと放出され、脱保護され、採取される。産物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって単離され、高純度の所望のオリゴヌクレオチドが得られ得る（ＶｅｒｍａとＥｃｋｓｔｅｉｎ １９９８）。
ＶＨとＶＨＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインの発現は、細菌、例えば、大腸菌などの原核細胞などの適切な発現ベクターを使用して達成することができる（例えば、ＷＯ９４／０４６７８で開示されるプロトコルに従って（この文献は参照により本明細書に組み込まれ、以下でさらに詳述される））。ＶＨとＶＨＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインの発現はまた、真核細胞、例えば、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、あるいはＰｉｃｈｉａ属に属する酵母などの適切な酵母菌を使用して、達成することができる。好適には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが使用される（例えば、ＷＯ９４／０２５５９１で開示されるプロトコルに従って（この文献は参照により本明細書に組み込まれ、以下でさらに詳述される））。
具体的に、ＶＨＨは、
ａ）Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、任意にＨｉｓ－タグを含むＶＨＨ（例えば、ラクダ科の動物のリンパ球から得られるか、または合成的に産生される）をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡの配列をクローニングする工程、
ｂ）ＸｈｏＩ部位を含有するＶＨＨに特異的な５’プライマー、および配列ＴＣ ＴＴＡ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＴＧ（配列番号８１）を有するＳｐｅＩ部位を含有する３’プライマーを使用した増幅後に、クローン化されたフラグメントを回収する工程、
ｃ）ＸｈｏＩとＳｐｅＩの制限酵素を用いたベクターの消化の後に、Ｉｍｍｕｎｏ ＰＢＳベクター（Ｈｕｓｅら １９８９）に、同相（ｉｎ ｐｈａｓｅ）で回収されたフラグメントをクローニングする工程、
ｄ）工程ｃの組換えＩｍｍｕｎｏ ＰＢＳベクターでのトランスフェクションによって、宿主細胞、特に大腸菌を形質転換する工程、
ｅ）例えば、プロテインＡ、陽イオン交換、あるいはＶＨＨがＨｉｓタグを含む場合、ニッケル親和性樹脂を使用したカラム上のクロマトグラフィーなどのアフィニティー精製によって、ＶＨＨコード配列の発現産物を回収する工程
を含むプロセスによって、大腸菌細胞を使用して、ＷＯ９４／０４６７８で開示される方法に従って調製することができる。
あるいは、ＶＨとＶＨＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインは、
ａ）決定された特異的抗原結合部位を有する、ＶＨＨをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡの配列を得る工程、
ｂ）開始コドンおよびＨｉｎｄｌｌｌ部位を含有する５’プライマーと、ＸｈｏＩ部位を有する終止コドンを含有する３’プライマーとを使用して、得られたＤＮＡまたはｃＤＮＡを増幅する工程、
ｃ）プラスミドｐＭＭ９８４のＨｉｎｄｌｌｌ（位置２６５０）部位とＸｈｏＩ（位置４０６７）部位へと、増幅されたＤＮＡまたはｃＤＮＡを組み換える工程（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら １９８３）、
ｄ）許容細胞、特にＮＢ－Ｅ細胞（Ｆａｉｓｓｔら １９９５）を組換えプラスミドでトランスフェクトする工程、
ｅ）得られた産物を回収する工程
を含むプロセスによって得ることができる。
さらに、ＶＨＨまたはＶＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインは、以下のように、大腸菌またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用して、Ｆｒｅｎｋｅｎら ２０００年およびＷＯ９９／２３２２１（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）で開示される方法に従って産生することができる。
免疫化されたラマから血液試料を採取し、フィコール（水溶液に容易に溶解する、中性の非常に分岐した高質量で親水性の多糖類－Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の不連続のグラジエント遠心分離によりリンパ球集団を濃縮し、酸性グアニジウムチオシアネート抽出（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）（ＣｈｏｍｅｚｙｎｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉ １９８７）によって全ＲＮＡを単離し、第１の鎖ｃＤＮＡ合成（例えば、ＲＰＮ １２６６ Ａｍｅｒｓｈａｍ）などのｃＤＮＡキットを使用）を行った後、ＷＯ９９／２３２２１の２２ページと２３ページ目に詳述される特異的なプライマーを使用して、ＶＨＨとＶＨフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントおよび短いヒンジ領域または長いヒンジ領域の一部は、ＰＣＲ使用によって増幅される。ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＢｓｔＥＩＩを有するＰＣＲフラグメント消化の際に、約３００～４５０ｂｐの長さのＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル電気泳動によって精製され、大腸菌ファージミドベクターｐＵＲ４５３６あるいはエピソームのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＵＲ４５４８にそれぞれライゲーションされる。ｐＵＲ４５３６はｐＨＥＮ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら １９９１）に由来し、ラマＶＨＨとＶＨ遺伝子のクローニングを可能にするために、ｌａｃＩｑ遺伝子と特有の制限部位とを含有する。ｐＵＲ４５４８はｐＳＹ１（Ｈａｒｍｓｅｎら １９９３）に由来する。ｌｅｕ２遺伝子中のＢｓｔＥＩＩ部位は、ＰＣＲによってこのプラスミドから除去され、ＳＵＣ２シグナル配列とターミネーターとの間のクローニング部位は、ＶＨ／ＶＨＨ遺伝子フラグメントのクローニングを促進するために置き換えられる。ＶＨ／ＶＨＨは検出のために、Ｃ末端にｃ－ｍｙｃタグを有する。個々の大腸菌ＪＭ１０９コロニーは、１％のグルコースおよび１００ｍｇのＬ－１アンピシリンを補充した１５０ｍｌの２ＴＹ培地を含む、９６ウェルマイクロタイタープレートに移される。一晩増殖させた後（３７℃）、プレートは、１００ｍｇのＬ－１アンピシリンおよび０．１ｍＭのＩＰＴＧを含む２ＴＹ培地中で２つ組みとする。さらに一晩インキュベーションし、任意選択で凍結および解凍した後、細胞は、遠心分離され、ペレット化され、上清はＥＬＩＳＡにおいて使用され得る。個別のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコロニーは、選択的な最少培地（必須アミノ酸および塩基を補充した、０．７％の酵母窒素原基礎培地（ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ）、２％のグルコース）を含む試験管に移され、３０℃で４８時間増殖させる。その後、培養物は、ＹＰＧａｌ培地（１％の酵母エキス、２％のｂａｃｔｏペプトン、および５％のガラクトースを含む）中で１０倍希釈される。２４時間および４８時間の増殖後、細胞はペレット化され、培養液上清はＥＬＩＳＡで分析され得る。６００ｎｍ（ＯＤ６００）の吸光度が任意選択で測定される。
さらに、ＶＨ／ＶＨＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインは、以下のような手順を使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用して産生することができる。
ＶＨ／ＶＨＨをコードする天然に存在するＤＮＡ配列を単離するか、または、５’－ＵＴＲ、シグナル配列、終止コドンを含み、かつＳａｃＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位と隣接した、ＶＨ／ＶＨＨをコードする合成的に生成されたＤＮＡ配列を得る（そのような合成配列は上に概説されるように生成することができるか、あるいは、例えば、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの商業的供給業者に注文してもよい）。
マルチコピー組込み（ＭＣＩ）ベクターｐＵＲ８５６９またはｐＵＲ８５４２へとＶＨ／ＶＨＨ遺伝子を移すために、制限部位を以下のように使用する。２５ｕｌのＶＨＨ ＤＮＡ（ＧｅｎｅａｒｔプラスミドあるいはＭＣＩベクター）、１ｕｌのＳａｃＩ、１ｕｌのＨｉｎｄＩＩＩ、ＮＥＢ緩衝液１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）などの二重消化（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）に適切な３ｕｌの緩衝液を使用して、シャトルベクター、カセット、または他の合成遺伝子構築物内に任意選択で含まれるＶＨＨをコードするＤＮＡ配列、およびＳａｃＩとＨｉｎｄＩＩＩを有するＭＣＩベクターを、３７度℃で一晩切断する。ＶＨＨをコードする消化されたＤＮＡ２５ｕｌ、および消化されたＭＣＩベクター２５ｕｌを、１×ＴＡＥ緩衝液を含む１．５％のアガロースゲル上で泳動させ、その後、例えば、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル抽出を実施する。消化されたＭＣＩベクターおよびＶＨ／ＶＨＨをコードする消化されたＤＮＡのライゲーションを、１００ｎｇのベクター、３０ｎｇのＶＨＨ遺伝子、１．５ｕｌの１０×リガーゼ緩衝液、１ｕｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ、およびｄｄＨ２Ｏに設定する。その後、ライゲーションを１６℃で一晩実施する。
次に、大腸菌細胞を形質転換する。化学コンピテントＸＬ－１ブルー細胞の場合、２００ｕｌの熱コンピテントＸＬ－１ブルー細胞を解凍し、氷上で５ｕｌのライゲーションミックスを約３０分添加し、その後、４２℃で９０秒間熱ショックを実施する。その後、２％のグルコースを補充した８００ｕｌのＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ低塩培地を添加し、細胞を３７℃で２時間回復させる。Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ寒天およびアンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）プレート上に細胞をプレーティングし、３７℃で一晩維持した。電気コンピテントＴＧ１大腸菌細胞の場合、エレクトロポレーションキュベットを使用する。エレクトロポレーションキュベット中で、５０ｕｌの電気コンピテントＴＧ１細胞および１ｕｌのライゲーションミックスを、約１５分間氷上で解凍する。ホルダーにキュベットを置き、パルスをかける。５００ｕｌの２ＴＹ培地を添加し、３７℃で３０分間細胞を回復させる。アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）および２％のグルコースを含むＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ、寒天プレート上に１００ｕｌの細胞をプレーティングする。プレートを３７℃で一晩維持する。
上に詳述されるようにＶＨ／ＶＨＨ遺伝子を大腸菌にクローニングした後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを線形化されたＭＣＩベクターで形質転換することができる。形質転換を実施する前に、以下のいくつかの工程を行う：（ｉ）ＤＮＡは消化によって環状から線形に変化されなければならないか、そうでなければ、ＤＮＡは酵母ゲノムに統合することができない、および（ｉｉ）消化されたＤＮＡは、エタノール沈澱によって不純物が除去されなければならない。さらに、変化プロセス中に酵母菌は半透過性になり、そのためＤＮＡが細胞膜を通ることができる。
酵母形質転換の準備：以下のように、ＶＨ／ＶＨＨ遺伝子を発現する選択された大腸菌コロニーから調製されたミディプレップ（ｍｉｄｉ－ｐｒｅｐ）のＨｐａＩ消化を実施する。２０ｎｇのミディプレップ、５ｕｌのＨｐａＩ、ＮＥＢ４緩衝液（ＢｉｏＬａｂｓ）などの１０ｕｌの適切な緩衝液、およびｄｄＨ２Ｏを含む１００ｕｌの溶液を調製する。
ＨｐａＩを有するＤＮＡを室温で一晩切断する。次に、エタノール沈澱を実施する（および、ＨｐａＩ消化からの５ｕｌの試料を片側に置く）。３００ｕｌのエタノール１００％を、９５ｕｌのＨｐａＩの消化されたミディプレップに添加し、ボルテックスし、フルスピードで５分間回転させる。ペレットが存在する場合、慎重にデカントし、１００ｕｌのエタノール７０％を添加し、その後、５分間再びフルスピードで回転させる。再び試料をデカントし、ペレットが乾燥するまで５０～６０℃で維持する。ペレットを５０ｕｌのｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。５ｕｌを、５ｕｌのＨｐａＩ消化試料と並べてゲル上で泳動させる。
酵母形質転換：ＹＮＢｇｌｕプレートを調製する。１０ｇの寒天＋４２５ｍｌの水（殺菌済み）、２５ｍｌの濾過した２０×ＹＮＢ（２５ｍｌの殺菌したＨ２Ｏ中の３．３５ｇのＹＮＢ（酵母窒素原基礎培地））、および５０ｍｌの無菌２０％グルコースを使用し、ペトリ皿に注ぐ。マスタープレートから１つの酵母コロニーを取り、３ｍｌのＹＳＤ（酵母エキスソイトンデキストロース（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｏｙｔｏｎｅ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ））中で３０℃で一晩増殖させる。次の日、約６００ｍｌのＹＳＤを調製し、これを使用して、３つのフラスコを２７５ｍｌ、２２５ｍｌ、および１００ｍｌのＹＳＤで充填する。２７．５ｕｌの酵母ＹＳＤ培養物を第１のフラスコに添加し、穏やかに混合する。第１のフラスコから７５ｍｌをとり、第２のフラスコ入れ、穏やかに混合する。第２のフラスコから１００ｍｌをとり、第３のフラスコに入れ、穏やかに混合する。１～２のＯＤ６６０に到達するまで増殖させる。このＯＤに到達したフラスコを、４つのＦａｌｃｏｎチューブにそれぞれ±４５ｍｌで分ける。４２００ｒｐｍで２分間回転させる。上清を廃棄する。４５ｍｌのＨ２Ｏを含む２つのＦａｌｃｏｎチューブにペレットを溶解する（チューブの数を４から２に減らす）。４２００ｒｐｍで２分間回転させる。４５ｍｌのＨ２Ｏにペレットを溶解する（チューブを２つから１に）。４２００ｒｐｍで２分間回転させる。５ｍｌの酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）（１００ｍＭ）にペレットを穏やかに溶解し、数秒間回転させる。慎重に一部のＬｉＡｃを廃棄し、ＬｉＡｃの半分以上をチューブ内に保持する。細胞をボルテックスし、担体ＤＮＡを５分間沸騰させ、氷水中で素早く冷却する。２４０ｕｌのＰＥＧ、５０ｕｌの細胞、３６ｕＬｉＡｃ（１Ｍ）、２５ｕｌの担体ＤＮＡ、４５ｕｌのエタノール沈殿したＶＨ／ＶＨＨを含む１５ｍｌチューブに添加する。各工程後に穏やかに混合する（ブランク試料を同様に処理する、ただし、エタノール沈殿ＶＨ／ＶＨＨを用いない）。３０℃で３０分間インキュベートし、３～４回穏やかに反転させ、その後、４２℃で２０～２５分間熱ショックを行う。最大６０００ｒｐｍで短時間回転させる。上清を穏やかに取り除き、２５０ｕｌのｄｄＨ２Ｏを添加し、混合する。そのすべてを、プレートが乾燥するまでＹＮＢｇｌｕプレート上にストリークさせ、３０℃で４～５日間増殖させる。最後に、６つの等しい部分にプレートを分けることによってＹＮＢｇｌｕを調製し、その部分を１から６に番号を付け、最も大きなコロニーを播種し、番号１をストリークする。大きいものから小さいものへ、１から６へと、他のコロニーに対して繰り返す。コロニーが産生されるまで、３０℃で３～４日間大きく増殖させる。ＶＨ／ＶＨＨクローンは、炭素源としてグルコースを使用して増殖させ、ＶＨ／ＶＨＨ発現の誘導は、０．５％のガラクトースの添加により、ガラクトース－７－プロモーターを活性化することによって行われる。３ｍＬの小規模培養を実施してコロニーを試験し、ＶＨまたはＶＨＨの最良の発現を示すものを選択する。その後、このコロニーを精製で使用する。
精製：ＶＨ／ＶＨＨは、強力なアニオン樹脂（Ｃａｐｔｏ Ｓなど）による陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製される。１日目に、５ｍｌのＹＳＤ培地（ＹＳ培地＋２％のグルコース）に、ＶＨ／ＶＨＨを発現する選択された酵母コロニーを播種し、２５ｍＬの密封した滅菌チューブ内で細胞を３０℃で一晩増殖させる（１８０ｒｐｍで振盪させながら）。２日目に、５ｍｌの一晩の培養物を、５０ｍＬの新たに調製したＹＳ培地＋２％のグルコース＋０．５％のガラクトースに希釈し、２５０ｍｌの曝気し調節されたフラスコ内で細胞を３０℃で２晩かけて増殖させる（１８０ｒｐｍで振盪させながら）。４日目に、細胞を心分離機で４２００ｒｐｍで２０分間回転させる。強力なアニオン樹脂を使用した陽イオン交換精製工程：リガンドを含む上清のｐＨを３．５に調節する。５０ｍＬの上清につき０．７５ｍｌの樹脂（＋／－０．５ｍＬのスラリー）を５０ｍＬのｄｄＨ２Ｏで洗浄し、その後、結合緩衝液で３回洗浄する。洗浄した樹脂を上清に添加し、振盪機上で、懸濁液を４℃で１．５時間インキュベートする。５００ｇで２分間の遠心分離によって樹脂に結合したＶＨ／ＶＨＨをペレット化し、これを洗浄緩衝液で洗浄する。上澄をデカントし、１０ｍＬの結合緩衝液で樹脂を再懸濁する。ＰＤ－１０カラム内にフィルターを置き、カラムに樹脂を注ぎ、樹脂をしばらくの間沈降させ、その後、樹脂の上にフィルターを加える。結合緩衝液がすべて流れ出るまで待つ。６×０．５ｍｌの溶出緩衝液でＶＨ／ＶＨＨを溶出する。エッペンドルフチューブ内に溶出液画分を集める。Ｎａｎｏｄｒｏｐにより、６つの溶離した画分のタンパク濃度を測定する。ＶＨＨを含む画分をプールし、３，５００Ｄａのカットオフの透析膜に溶液を移す。３ＬのＰＢＳに対して、精製されたタンパク質溶液を４℃で一晩透析する。５日目に、２Ｌの新鮮なＰＢＳに対して、精製されたタンパク質溶液を４℃でさらに２時間透析する。最後に、ＢＣＡによって最終濃度を計算する。
ＶＨ／ＶＨＨに関して述べられているが、上述される技術は、必要に応じて、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖ、および他の抗体フラグメントに使用されてもよい。複数の抗原結合フラグメント（好適にＶＨ／ＶＨＨ）は、Ｂｌａｔｔｌｅｒら １９８５などによって記載される有機誘導体化剤とアミノ酸残基を反応させることによって、化学的架橋によって融合され得る。あるいは、抗原結合フラグメントは、ＤＮＡレベルで遺伝学的に融合さてもよく、すなわち、１つ以上の抗原結合フラグメントを含む完全なポリペプチドの構築物をコードするポリヌクレオチド構築物が形成されてもよい。遺伝子経路を介して複数の抗原結合フラグメントを接合する１つの方法は、抗原結合フラグメントをコードする配列を、直接あるいはペプチドリンカーを介して連結することによるものである。例えば、第１の抗原結合フラグメントのカルボキシ末端は、次の抗原結合フラグメントのアミノ末端に連結され得る。この連結モードは、トリ－、テトラ－などの官能性の構築物の構築のために抗原結合フラグメントを連結するべく、拡張することができる。多価（二価など）のＶＨＨポリペプチド構築物を産生する方法は、ＷＯ９６／３４１０３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で開示されている。
好適には、本発明のポリペプチド（特に、本発明のＶＨＨ）は、ＷＯ０２／４８３８２で開示された方法に従って、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの真菌において産生することができ、これは炭素源を含む培地上での真菌の増殖を含み、ここで、５０～１００ｗｔ％の前記炭素源はエタノールである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＶＨＨフラグメントの大規模産生は、Ｔｈｏｍａｓｓｅｎら ２００２に記載されている。
本発明の一態様では、本発明のポリペプチドまたは構築物の調製のためのプロセスが提供され、上記プロセスは、
ｉ）本発明のポリヌクレオチドをプラスミドなどのベクターにクローニングする工程、
ｉｉ）本発明のポリペプチドまたは構築物を産生することができる細菌細胞あるいは酵母細胞などの細胞を、ポリペプチドまたは構築物の産生を可能にする条件において、前記ベクターで形質転換する工程、
ｉｉｉ）親和性クロマトグラフィーなどによって、ポリペプチドまたは構築物を回収する工程を含む。
本発明の実施形態さらに設定する項は、以下の通りである。
項
１．ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰのＩＬ－７Ｒへの結合を阻害することができる、ポリペプチド。
２．ポリペプチドは、ＩＬ－７ＲへのＩＬ－７の結合を阻害することができる、項１に記載のポリペプチド。
３．ポリペプチドは、ＩＬ－７ＲへのＬ－ＴＳＬＰの結合を阻害することができる、項１に記載のポリペプチド。
４．ポリペプチドは、ＩＬ－７ＲへのＩＬ－７の結合およびＩＬ－７ＲへのＬ－ＴＳＬＰの結合を阻害することができる、項１－３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
５．ポリペプチドはＩＬ－７Ｒαに結合する、項１－４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
６．ポリペプチドは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１－ＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１－ＦＲ４）とを含み、ここで、ＣＤＲ１は配列番号１と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号２と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、および、ＣＤＲ３は配列番号３と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含む、項１－５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
７．ＣＤＲ１は、配列番号１と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号３と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含む、項６に記載のポリペプチド。
８．ＣＤＲ１は配列番号１または配列番号７１を含み、ＣＤＲ２は配列番号２、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、または配列番号７６を含み、および、ＣＤＲ３は配列番号３、配列番号７７、または配列番号７８を含む、項７に記載のポリペプチド。
９．ポリペプチドは配列番号８を含む、項８に記載のポリペプチド。
１０．ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである、項１－９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１１．ポリペプチドは、２ｎＭ以下のＥＣ５０で、ＩＬ－７に結合するＩＬ－７Ｒを中和する、項１－１０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１２．ポリペプチドは、ヒト胃腸管のプロテアーゼに対して実質的に耐性がある、項１－１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１３．薬剤として使用される、項１～１２のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１４．自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置で使用される、項１３に記載のポリペプチド。
１５．ポリペプチドは経口投与で使用される、項１３または１４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
次に、本発明を、以下の非限定的な例によってさらに説明する。
実施例１：免除化およびファージライブラリ構築
２頭のラマをそれぞれ、可溶性ヒト組換えＩＬ－７Ｒαで免疫化した。免疫処理中に様々な時点で両方のラマから血液を採取し、ＩＬ－７Ｒαに対する免疫応答の発達をモニタリングするために、ＩＬ－７Ｒα結合および中和を試験した。その分析により、一方のラマだけが良好な抗ＩＬ－７Ｒα抗体価を発達させ、他方のラマがＩＬ－７Ｒα免疫処理に反応することができないことが示された。免疫化の終わりに、反応性のラマから採取した白血球から単離したＲＮＡを使用して、１２の別個のファージディスプレイライブラリを生成した。
実施例２：ヒトＩＬ－７Ｒα結合活性を有するファージのためのライブラリ選択
ライブラリ選択戦略を開発して、ＩＬ－７ＲへのＩＬ－７の結合を妨害するＩＣＶＤを含む、ＩＬ－７Ｒαサブユニットの細胞外ドメイン上に存在するエピトープに結合するＩＣＶＤを単離した。高い結合親和性および腸プロテアーゼに対する耐性を含む、ＩＬ－７Ｒα結合特性および他の望ましい性質を有するＩＣＶＤを呈するファージの選択的な濃縮のために、いくつかの方法を使用した。様々なライブラリ選択からの溶出液中に存在するファージを使用して、大腸菌を感染させ、個々のコロニーをマスタープレートに取り、増殖させ、クローン培養物を生成した。選択されたモノクローナルＩＣＶＤを含む周辺質上清を一次評価試験に使用し、必要とされる特性を有するものを同定した。
スクリーニングされた元の８つのマスタープレートに取った合計６３０のライブラリ選択されたクローンから、大腸菌における産生のために７つの一次クローンの最終セットを選択し、ＩＣＶＤをアフィニティー精製し、さらに詳細な評価試験を行った。
上で単離された７つの一次クローン（Ｖ７Ｒ－２Ｅ５、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９、Ｖ７Ｒ－２Ｆ６、Ｖ７Ｒ－６Ｃ１２、Ｖ７Ｒ－２Ｂ６、Ｖ７Ｒ－３Ｂ５、およびＶ７Ｒ－４Ｆ６）のＤＮＡ配列を、大腸菌における産生のためにベクターｐＭＥＫ２２２に再クローン化し（したがって、Ｃ末端ＦＬＡＧおよび６ｘＨｉｓタグを導入し）、その後、アフィニティー精製を行って、さらに詳細な評価試験を行った。ＦＬＡＧとＨｉｓタグを除くこれらのＩＣＶＤのポリペプチド配列は、「ポリペプチドとポリヌクレオチド配列」と題されたセクションにおいて上に提供されるアライメントで示される。臨床抗ＩＬ－７Ｒ抗体ｍＡｂ８２９（重鎖と軽鎖を含む１５０ｋＤａ抗体、Ｅｌｌｉｓら ２０１９で開示される「ＧＳＫ２６１８９６０」としても知られる）を産生し、多くの以下の実施例において対照薬として使用した。
以下の実施例の重要な目的は、ＩＬ－７Ｒに結合するＩＬ－７を阻害する能力を有し、かつ小腸のプロテアーゼによる不活性化に対してある程度の内因性の耐性を有する、それらのＩＣＶＤクローンを同定することであった。
実施例３：一次クローンの効力およびプロテアーゼ耐性
効力
ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ中和ＥＬＩＳＡを使用して、７つの一次クローンの効力を評価した。
一次クローンを、ファージミドからｐＭＥＫ２２２プラスミドにサブクローン化し、Ｃ末端ＦＬＡＧ－６ｘＨｉｓタグを添加し、大腸菌中で発現させた。これらのＩＣＶＤを大腸菌ＴＧ１から発現させ、６ｘＨｉｓタグを介して精製した。
クローンの７点希釈系列は、３００ｎＭから開始し、３．２の希釈係数を使用して、１％のＢＳＡ（２×アッセイ濃度）中で調製した。ｍＡｂ８２９対照薬抗体は、１０ｎＭ～０．０８８ｎＭの濃度範囲（２×アッセイ濃度）でＥＬＩＳＡにおいて陽性対照として使用した。各クローン希釈のために、三連に十分な量を調製し、ｍＡｂ８２９のために２つの三連（２つのプレート）に十分な量を調製した。８５μＬ（または１７０μＬ）の各ＩＣＶＤ（またはｍＡｂ８２９）希釈液を、８５μＬ（または１７０μＬ）の１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（２×アッセイ濃度）と混合した。８５μＬのＩＬ－７を８５μＬの遮断緩衝液と混合して、各プレート中でＩＬ－７（１×）完全結合シグナルを持たせた。ブランクとして遮断緩衝液のみを各プレートに添加した。その後、結合したＩＬ－７は、ビオチン化抗ｈＩＬ－７を使用して、その後、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを使用して測定した。ＴＭＢ反応を３０分後に止めた。
ＥＬＩＳＡシグナルブランクで補正したＡ４５０データおよび「対数（阻害剤）ｖｓ．反応－－可変勾配（４つのパラメータ）」を使用して、ＧｒａｐｈｐａｄプリズムでＥＣ５０値を生成し、曲線にフィットさせてＥＣ５０を生成した。これらの値を下の表１に示す。ＩＣＶＤはすべて、ｈＩＬ－７ＲへのｈＩＬ－７の結合を阻害する際に対照薬ｍＡｂ８２９と同じくらい効果的であることが示され、ｍＡｂ８２９よりもわずかに効果的であることを示した。
プロテアーゼ耐性
７つの精製したＩＣＶＤを、マウス小腸の上清（「マウスＳＩ」）およびプールされたヒト糞便の試料から調製した上清（「ＨＦＰ」）の存在下でインキュベートした。
すべてのＩＣＶＤのストック希釈は、２５０μｇ／ｍＬ（３０μＬの最終量）で１％のＢＳＡを含む１×ＰＢＳ中で調製した。その後、６０μＬの最終量でＰＣＲストリップにおいて、各ＩＣＶＤのために消化混合反応物を調製し、ＩＣＶＤは、２０μｇ／ｍＬの最終濃度（２５０μｇ／ｍＬで５５．２μＬの消化マトリックス＋４．８μＬのＩＣＶＤ）である。非ＩＣＶＤ対照のために、４．８μＬの１×ＰＢＳを代わりに使用した。その後、２５μＬの個々の消化反応を、（ｉ）冷たい停止緩衝液（これらはＴ＝０時点として使用）を含む新しいＰＣＲ管に移し、－８０℃で冷凍した；および（ｉｉ）新しい空のＰＣＲ管に移し、３７℃での消化のためにＰＣＲサーモサイクラー中でインキュベートした（消化された非ＩＣＶＤ対照の試料）。マウスＳＩ中の消化された試料を２時間後にサーモサイクラーから取り出し、ＨＦＰ中の消化された試料を４時間後に取り出した。試料を、２５μＬの冷たい停止緩衝液で直ちに停止し、分析まで－８０℃で冷凍した。
消化された試料は、１：１００の最終の開始希釈で上記「効力」で詳述したＥＬＩＳＡで試験し、その後、１．８（消化された試料用）または２．１（消化されていない試料用）の希釈係数を使用した６つの段階希釈し、各プレートにおいて三連のウェルで分析した。これらの試料中でプロテアーゼ消化が理論上生じないはずであるため、消化されていない試料（０時間）を標準曲線とみなす（それらを氷上で処理し、消化マトリックスの添加した直後に停止緩衝液を添加する）。
「消化された」試料中で消化が生じる場合、左への曲線のシフトがあると予想される（Ｔ＝と０時間と比較）。そのシフトがより大きいほど、ＩＣＶＤはより不安定になる。「生存％」は、消化後に保持された活動のレベルを表す。
クローンはすべて、両方のマトリックス中のタンパク質分解に対する高いレベルの耐性を示し、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９は最もプロテアーゼ耐性のＩＣＶＤとして同定し、最大４時間にわたってヒト糞便のプール消化に対する完全な耐性を示した。
これらの結果を下の表１にまとめる。
Figure 2022537780000011
本発明のこれらのポリペプチドはすべて、消化マトリックスにおいて驚くほど高い効力および生存率を示した。これらのＩＣＶＤは明らかに関連しているが、これらのポリペプチドのＣＤＲとフレームワークは、多くの残基が互いと異なることに留意されたい（上記「ポリペプチドとポリヌクレオチド配列」で提供されたアライメントを参照）。
実施例４：Ｖ７Ｒ－２Ｅ９および対照薬ｍＡｂ８２９に対して実施したさらなる効力アッセイ
ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒの中和ＥＬＩＳＡ
実施例３で上述されたＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ中和ＥＬＩＳＡを、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９および臨床抗ＩＬ－７Ｒ対照薬抗体、ｍＡｂ８２９に対して再び実施した。これらの結果を下の表２に示す。
ＴＳＬＰ／ＴＳＬＰＲ／ＩＬ－７Ｒ ＥＬＩＳＡ
ＩＬ－７ＲαへのＬ－ＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ－Ｒ複合体の結合を中和するＶ７Ｒ－２Ｅ９の能力を試験した。９６ウェルプレートを、０．２５μｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－７Ｒα－Ｈｉｓ６－Ｆｃ＋５μｇ／ｍＬのＢＳＡでコーティングし、その後、遮断した。Ｖ７Ｒ－２Ｅ９を連続的に希釈し、組換えヒトＬ－ＴＳＬＰ（１５ｎｇ／ｍＬの最終濃度）およびヒトＴＳＬＰ－Ｒ（２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度）で１：１：１に混合した。その後、その混合物を３０分間インキュベートして結合させてから、ＩＬ－７Ｒαコーティングプレートに添加した。２時間のインキュベーション後、結合したＬ－ＴＳＬＰを、５０μＬ／ウェルの０．３μｇ／ｍＬの０をビオチン化ウサギ抗ｈＴＳＬＰ抗体で検出し、その後、５０μＬ／ウェルの１／２０００のＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰで検出し、ＩＣＶＤによるＩＬ－７ＲαへのＬ－ＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ－Ｒ複合体の結合の中和レベルを、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムを使用して決定した。その結果を下の表２に示す。
ｈＰＢＭＣにおけるＩＬ－７誘導性ｐＳＴＡＴ５
ＩＬ－７ＲαへのＩＬ－７の結合を阻害し、ＳＴＡＴ５リン酸化を妨害するＶ７Ｒ－２Ｅ９の能力を、ヒトリンパ球においてインビトロで試験した。このヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＩＬ－７Ｒシグナル伝達を介する細胞内ＳＴＡＴ５リン酸化の刺激によって外因性ＩＬ－７に反応するが、この反応は、ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ結合を防ぐＩＬ－７Ｒα特異的ＩＣＶＤによって無効にされ得る。
リンパ球に富んだ集団をヒトバフィーコートから単離し、液体窒素中の９０％のＦＢＳ １０％のＤＭＳＯ中で保存した。細胞を解凍し、完全なＲＰＭＩ－１６４０中で回復のために静止させた。回復後、細胞は、１００μｌ、２．５×１０５細胞／ウェルで丸底の９６ウェルプレートにプレーティングし、ＦＢＳを含まない完全なＲＰＭＩ中で１時間飢餓させた。飢餓後、所望のＩＣＶＤ濃度を各ウェルに添加し（５０μＬ／ウェル）、プレートを室温で１５分間インキュベートした。その後、ＩＬ－７の５０μＬ／ウェルを各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％のＣＯ２で１５分間インキュベートした。氷上でプレートを迅速に冷やすことによって反応を止め、その後、遠心分離し、上清を取り除いた。その後、細胞を、固定、透過処理、およびｐＳＴＡＴ５の細胞内染色のために処理した。細胞を、氷上で１００μＬ／ウェルのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃５５４７２２）と２０分間インキュベートし、１５０μｌ／ウェルの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃５５４７２３）で２回洗浄し、氷上で２００μＬ／ウェルのＰｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃５５８０５０）と３０分間インキュベートし、１５０μＬ／ウェルの１×ＰＢＳ ２％のＢＳＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）で２回洗浄した。その後、細胞を、２５μＬ／ウェルのｐＳＴＡＴ５抗体（［４７／Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）］（Ａ４８８）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃６１２５９８））あるいはアイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（［Ｂ１１／６］（ＦＩＴＣ）（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ９１３５６））で、室温で１時間染色した。１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液を添加することによって反応を止めた。１回の洗浄／遠心分離の工程の後、細胞を、２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に最後に再撹拌し、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でデータを得た。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータ分析を実施した。その結果を下の表２に示す。
ヒト単球におけるＴＳＬＰ誘導性ＴＡＲＣ分泌
詳述されるヒト単球の細胞アッセイでＩＬ－７Ｒ中和活性を確認するために、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９も試験した。ヒト単球は、細胞表面ＩＬ－７ＲとＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ－Ｒの結合の結果、ＴＳＬＰによる刺激の後に培地中でＴＡＲＣ分泌反応を示す。ＩＬ－７ＲへのＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ－Ｒの結合を阻害し、かつＴＡＲＣ分泌を妨害する抗ＩＬ－７ＲαＩＣＶＤの能力を、ヒト単球においてインビトロで試験した。
単球をヒトバフィーコートから単離し、完全なＲＰＭＩ中の平底の９６ウェルプレート（１×１０５細胞を含む１００μｌ／ウェル）にプレーティングした。単球の純度を高めるために、プレーティングした細胞を、３７℃ ５％のＣＯ２で２時間静止させ、その後、各ウェル中の培地を吸引し、続いて、温かいｃＲＰＭＩで穏やかに２回洗浄することによって、非付着性細胞を取り除いた。細胞を、３７℃ ５％のＣＯ２（完全なＲＰＭＩ中で希釈、１００μＬ／ウェルの最終量）で、２４時間、ＴＳＬＰの存在下で所望の濃度のＩＣＶとインキュベートした。２４時間インキュベートした後、７５μＬの上清／ウェルを集めて、分泌されたＴＡＲＣのさらなる分析のために－８０℃で保存した。
抗ＩＬ－７Ｒα剤によるヒトＴＳＬＰの中和レベルを試験した。９６ウェルプレートを５０μＬ／ウェルの抗ヒトＴＡＲＣ抗体でコーティングし、その後、遮断した。ヒトＴＡＲＣ標準物質をアッセイ希釈液中で連続的に希釈し、その後、５０μＬ／ウェルの回収した培養液上清と共に５０μＬ／ウェルの標準物質を、抗ＴＡＲＣでコーティングしたプレートに添加した。結合したヒトＴＡＲＣを、ビオチン化抗ヒトＴＡＲＣポリクローナル抗体で、その後、アビジン－ＨＲＰで検出した。薬剤によるヒトＴＳＬＰの中和レベルを決定した。その結果を下の表２に示す。
Figure 2022537780000012
要約すると、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９は、ＥＬＩＳＡと細胞のアッセイの両方で、対照薬臨床抗ＩＬ－７Ｒ抗体ｍＡｂ８２９と同様の効力で、ＩＬ－７ＲへのＩＬ－７およびＬ－ＴＳＬＰの結合を阻害することが示された。
実施例５：エピトープモデル化
Ｖ７Ｒ－２Ｅ９のためのモデル構造およびエピトープをイン・シリコで確立した。このモデルは、鋳型として蛋白質構造データバンク（ＰＤＢ）「４ｙｂｑ」ファイルを使用して開発した。４ｙｂｑは、ラットＧＬＵＴ５促進グルコース輸送体メンバー５に結合したＦＶの重鎖である。４ｙｂｑ鋳型は、ＣＤＲ３ループ長と予想されるコンフォメーションの点で、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９に特に類似する。ＰＤＢエントリー「３ｄｉ３」は、ＩＬ－７Ｒαに結合したＩＬ－７の高分解能構造である。この構造からＩＬ－７を単に除去するだけで、予測されたＶ７Ｒ－２Ｅ９構造とドッキングするための標的受容体を得た。
使用したＨＥＸ ８．０ドッキング方法が各ドメインの表面わたって局在的に作用するため、ＩＬ－７Ｒα構造よりも多くの標的領域が選択され、並行して実施された。Ｖ７Ｒ－２Ｅ９のための最良の溶液は、４６の溶液のクラスタの代表であり、それは、－８９４（ＤＡＲＳ力場）の非常に高エネルギーのスコアを有しており、エネルギー最小化の後に「突起（ｂｕｍｐｓ）」（容認されないほど近い原子の位置）を有していなかった。図３は、ＩＬ－７Ｒα標的上でドッキングしたＶ７Ｒ－２Ｅ９の位置に関するリボン模式図を示す。Ｖ７Ｒ－２Ｅ９は、Ｎ末端とＣ末端のドメイン間の界面に位置する。
表３は、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９と接触するＩＬ－７Ｒαのエピトープ残基を示す。界面で特に重要な面積を埋める残基が太字で強調される（配列番号６５を参照することによって）。
Figure 2022537780000013
実施例６：免疫原性を減少するための最適化
Ｖ７Ｒ－２Ｅ９のアミノ酸配列を、ヒトＶＨ３生殖系列抗体配列とアライメントさせ、可能性のあるヒト化変化を特定した。１８の単一突然変異の選択、およびフレームワーク２の終わり／ＣＤＲ２の始まりでの変化の２つの組み合わせを、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９親ＩＣＶＤ配列に導入し、大腸菌から突然変異体を生成した。ＩＣＶＤを、最初に、ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ中和ＥＬＩＳＡにおける効力に関して試験した。クローンは、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９と同等の、またはＶ７Ｒ－２Ｅ９よりも大きいＩＬ－７Ｒ中和活性を示し、このことは、親ＩＣＶＤに導入されたいずれの突然変異も、抗原結合に対する有害な効果を有していないことを示した。その後、すべてのクローンをヒト糞便の上清材料中で１６時間消化し、それらの相対的生存を測定した（表４）。
Figure 2022537780000014
その後、ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒα－Ｈｉｓ６－Ｆｃ ＥＬＩＳＡにおいて高い効力を保持し、かつ、ヒト糞便のプールに類似する耐性を維持した突然変異を組み合わせて、１９のヒト化ＩＣＶＤを産生した（表５）。
Figure 2022537780000015
表６では、これらの１９のヒト化ＩＣＶＤのうち、効力、および、ヒト糞便プロテアーゼとマウス小腸プロテアーゼの両方に対する耐性を維持した最も有利なヒト化ＩＣＶＤを要約する。
Figure 2022537780000016
特に注目に値するＩＣＶＤはＩＤ－Ａ６２Ｕであり、これには、Ｅ１Ｄ（酵母発現用、環化Ｎ末端基グルタミン酸塩を有する産物が生成される可能性を回避するため）およびヒト化突然変異Ｒ４５Ｌ、Ｑ６５Ｋ、Ｋ８７Ｒ、およびＳ８８Ａが含まれる。別の特に注目に値するＩＣＶＤはＩＤ－Ａ５９Ｕであり、これには、Ｅ１Ｄ、Ｑ６５Ｋ、Ｋ８７Ｒ、およびＳ８８Ａが含まれる。ＩＤ－Ａ５９Ｕは、５．１のｐＩおよび１２．９６６ｋＤａの分子量を有する（ｐＩおよび分子量は、ＣＬＣ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖｉｅｗｅｒを使用して計算した）。
実施例７：ヒト化Ｖ７Ｒ－２Ｅ９変異体に対して実施される効力アッセイ
ＩＤ－Ａ４０Ｕ（大腸菌で産生）の阻害の効力および有効性（最大阻害）を、ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ中和ＥＬＩＳＡで、およびヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ－７誘導性ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイでインビトロで確認した。ＥＣ５０値を、ＥＬＩＳＡシグナルブランク補正Ａ４５０データおよび「対数（阻害）ｖｓ．反応－－可変勾配（４つのパラメータ）」を使用して、Ｇｒａｐｈｐａｄプリズムで生成し、曲線にフィットさせ、ＥＣ５０を生成した。
その結果を対照薬と一緒に表７ａに示す。
Figure 2022537780000017
別の実験では、これらの同じアッセイを、対照薬と一緒にＩＤ－Ａ６２Ｕ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで産生）に対して実施した。その結果を表７ｂおよび図４に示す。
Figure 2022537780000018
ＩＬ－７ＲαへのＬ－ＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ－Ｒ複合体の結合を中和するＩＤ－Ａ６２Ｕの能力は、実施例４において上述される方法で、ｍＡｂ８２９とともに試験した。その結果を下の表７ｃに示す。図示する前に、データセットに対して減算を実施し、試験した抗体の最も高い濃度に正規化した（プレート上の高レベルのバックグラウンドを克服するため）。
Figure 2022537780000019
まとめると、ＩＤ－Ａ６２ＵおよびＩＤ－Ａ４０Ｕは、対照薬臨床抗ＩＬ－７Ｒ抗体ｍＡｂ８２９に匹敵するか、またはそれよりも大きい効力を有することが示された。
実施例８：ＩＣＶＤ－ＩＬ－７Ｒ結合親和性のＢｉａｃｏｒｅ推定
ＩＤ－Ａ４０Ｕの結合キネティクスを、Ｂｉａｃｏｒｅ試験においてｍＡｂ８２９臨床抗体と比較した。ＩＬ－７Ｒα－Ｈｉｓ６－ＦｃをＢｉａｃｏｒｅセンサープレート（ｍＡｂ８２９分析用）上に直接コーティングし、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＩＣＶＤ分析用）によって捕捉し、ＩＣＶＤ／Ａｂをプレート上に流して結合を検出した。ＩＤ－Ａ４０Ｕは７．８×１０－１１Ｍの親和性（ＫＤ）を有し、ｍＡｂ８２９はわずかに低い５．６７×１０－１０Ｍの親和性（ＫＤ）を有していた。その結果は、ＩＤ－Ａ４０Ｕが抗原への強力な結合を実証することを示す。
実施例９：毒物学的な種からのＩＬ－７Ｒαとの交差反応性
毒物学的な種からのＩＬ－７Ｒαに結合するＩＤ－Ａ４０Ｕ、ＩＤ－Ａ５９Ｕ、およびＩＤ－Ａ６２Ｕの交差反応性を調べた。
９６ウェルプレートを０．５μｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－７ＲαＨｉｓ６－Ｆｃ＋５μｇ／ｍＬのＢＳＡでコーティングし、その後、遮断した。０．５ｎＭのＩＣＶＤを、１％のＢＳＡ中で連続的に希釈した選択の試験化合物と１：１に混合し、その後、３０分間インキュベートして結合させてから、ＩＬ－７Ｒαでコーティングしたプレートに添加した。２時間のインキュベーション後、結合したＩＣＶＤを、５０ｕＬ／ウェルの１／２００００抗ＦＬＡＧ－ＨＲＰヤギ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、ＧＴＸ２１２３８）で検出し、試験化合物によるＩＣＶＤ－ＩＬ－７Ｒα結合の中立レベルを決定した。
このアッセイでは、マウスＩＬ－７ＲαがＩＣＶＤ／ＩＬ－７Ｒα結合を妨害しないことがわかり、マウスまたはラットが毒物学的試験に不適切な種であることを示していた。しかし、カニクイザルＩＬ－７Ｒαは、ヒトＩＬ－７ＲαへのこれらのＩＣＶＤ結合を妨害し（図５および６）、カニクイザルをこれらのＩＣＶＤおよび関連するＩＣＶＤに適切な毒物学種にした。
実施例１０：非標的のサイトカインに対する特異性
実質的に実施例９で上述される方法で、ヒトＩＬ－７Ｒαと会合するタンパク質に対する選択性についてＩＤ－Ａ４０Ｕを試験した。ヒトＩＬ－１２Ｒβ１およびヒトＩＬ－１２Ｒβ２は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴｐツールを使用して同定したＩＬ－７Ｒαと最も密接に関連するヒトタンパク質であることがわかり、それぞれ２９％と３０％のＩＬ－７Ｒαとの配列同一性を有していた。競合ＩＬ－７Ｒ結合ＥＬＩＳＡアッセイでは、ｈＩＬ－１２Ｒβ１、およびＩＬ－７Ｒファミリー（ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ、およびＩＬ－９Ｒ）内の受容体の選択、または関連しない受容体（ＴＮＦＲ－２およびＩＬ－６Ｒ）は、プレート上で固定されたヒトＩＬ－７ＲαへのＩＤ－Ａ４０Ｕの結合を阻害するそれらの能力について試験した。ヒトＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－９Ｒ、ＴＮＦＲ－２、またはＩＬ－６Ｒのいずれも、ＩＬ－７ＲαへのＩＤ－Ａ４０Ｕの結合を妨害しなかったが、ヒトＩＬ－７Ｒαの増加する量を添加することで、用量依存的曲線を生成した（図７）。これは、オフターゲット分子へのＩＤ－Ａ４０Ｕ ＩＣＶＤの結合が、ヒトにおいて生じる可能性が非常に低いことを示した。
実施例１１：胃腸の抽出物に対する耐性
腸の上清中のエクスビボのインキュベーションは、カニクイザルおよびヒトの胃腸管においてＩＣＶＤの安定性を予測することができる。主要な小腸のプロテアーゼ、トリプシン、およびキモトリプシンの活性は、哺乳動物種にわたって保存されるが、大腸に存在するプロテアーゼは、宿主の種に特異的な腸内細菌叢によって生成される可能性が高い。これらの２つの環境を反映する試験マトリックスを生成するために、プールされたマウスの小腸の上清およびプールされた糞便の上清を調製した。これらのマトリックスは両方とも、未選択で未操作のＩＣＶＤに対して高度に消化性である。
ＩＣＶＤ ＩＤ－３８Ｆがこれらのマトリックスの高い安定性を有すること（ＷＯ２０１６／１５６４６５を参照）、および、この特性により、ＩＤ－３８Ｆが腸を通過する間の高い安定性が予測される。
Ｖ７Ｒ－２Ｅ９、ＩＤ－Ａ２４Ｕ、およびＩＤ－Ａ４０Ｕを、マウスとヒトの両方の供給源からの胃腸の抽出物において、それらの生存について試験した。ＩＣＶＤを、マウスの小腸の上清で３７℃で６時間、およびヒト糞便の上清で１６時間インキュベートした。生存は、ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ中和ＥＬＩＳＡによって測定した。すべての構築物は、試験したすべての消化マトリックスにおいて良好な生存を示した（図８、図中、「ＳＩ」＝マウス小腸液および「ＨＦ」＝ヒト糞便の上清）。ＩＤ－Ａ４０Ｕは、酵母で産生されたＩＤ－Ａ５９Ｕと同じ機能突然変異（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を含む。
別の実験では、ＩＤ－Ａ６２Ｕを、ＩＤ－Ａ４１Ｕ（不安定な対照薬ＩＣＶＤ）とともに、同じヒト糞便の上清アッセイで生存率に関して試験した。ＩＤ－Ａ６２Ｕは、ＩＤ－Ａ４１Ｕの約４０％の生存と比較して、約１００％の生存を示した（図９）。
これらは、長時間のインキュベーションを含む厳格な試験であった。したがって、これらのＩＣＶＤのいずれも、胃腸の環境において非常に良好に生存すると予想される。
実施例１２：胃腸マトリックスメタロプロテアーゼに対する耐性
活性化されたマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のレベルは、腸疾患患者の炎症を起こした粘膜中で増大する。これらのＭＭＰは、ヒトＩｇＧスキャフォールド（Ｂｉａｎｃｈｅｒｉら ２０１５）を含む天然のヒトＩｇＧおよび治療剤を消化することができる。抗ＴＮＦα治療エタネルセプトの場合には、この消化が、ＴＮＦα中和効力の有意な減少を引き起こす。ＩＤ－Ａ４０ＵがＭＭＰに対して耐性があることを確認するために、ｍＡｂ８２９を、ＩＤ－Ａ４０ＵとＥｎｂｒｅｌとともに、ヒトＭＭＰ３、ＭＭＰ１２、またはＴＣＮＢ緩衝液の存在下で、３７℃で２２時間インキュベーション後のウェスタンブロッティングによって検出した。ＥｎｂｒｅｌとｍＡｂ８２９は、γ鎖に特異的なペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧによって検出した。ＩＤ－Ａ４０ＵおよびＴＣＮＢの緩衝液のみの対照は、ｐＡｂ １２１９、および初代ウサギα－ＩＣＶＤおよび第２のＨＲＰとコンジュゲートしたｐＡｂ ＳｗｉｎｅαＲａｂｂｉｔで検出した。
インキュベーション後、ウェスタンブロッティングによって測定されるように、ＩＤ－Ａ４０ＵはＭＭＰによって消化されず（図１０）、予想した完全長のＩＣＶＤ（消化中に切断されるＦｌａｇ－Ｈｉｓ６タグを欠いている）に対応する分子量を持ったバンドを示す。しかし、同じインキュベーション時間後、ＭＭＰ３およびＭＭＰ１２は、完全長のエタネルセプトおよびｍＡｂ８２９を消化し、より小さなフラグメントにした。ＭＭＰのインキュベーション後、ＩＤ－Ａ４０Ｕは、ＩＬ７／ＩＬ－７Ｒ機能性ＥＬＩＳＡを使用して測定されるように、ＩＬ－７Ｒの中和に完全に効力があることが示された。図１０中の「Ｆ／Ｈ」は、ＦＬＡＧ／Ｈｉｓタグの存在を意味する。
実施例１３：マウス胃腸管中の通過および生存
上述のインビトロの試験の結果により、最適化されたＶ７Ｒ－２Ｅ９誘導体は、マウス小腸の内容物から調製された上清抽出物に存在するプロテアーゼによる不活性化に対して耐性があることが示された。後の試験は、マウス胃腸系の通過中のＩＤ－Ａ２４ＵおよびＩＤ－Ａ４０Ｕの安定性を調べるために実施した。
ＩＤ－Ａ２４ＵとＩＤ－Ａ４０Ｕの両方は、低いｐＨでの変性および胃中のペプシンによる消化から保護するために、ミルクと重炭酸塩の混合物中で、ＩＤ－３８Ｆ（抗ＴＮＦαＩＣＶＤ、ＷＯ２０１６／１５６４６５を参照）で製剤化した。経口胃管栄養法によってマウスにＩＣＶＤを投与した後、胃、小腸、盲腸、および結腸におけるＩＣＶＤの濃度を、投与６時間後に決定した。加えて、一時間ごとの間隔で採取した糞便ペレットのＩＣＶＤ濃度を測定した。
すべてのマウスから投与の４時間～６時間後に集めた糞便中のＩＤ－Ａ２４ＵおよびＩＤ－Ａ４０Ｕを測定し、２匹のマウスから３時間の時点でＩＤ－Ａ４０Ｕも測定した（図１１）。代わりに、最初の３時間の間に、マウス６（Ｍ６）から集めた糞便中のＩＤ－Ａ２４Ｕを測定し、このマウスでは、通過が他のマウスと比べて特に速かったことが示された。
これらの結果により、ＩＤ－Ａ２４ＵとＩＤ－Ａ４０Ｕの両方は、マウスＧＩ管を通過しても生存することができることが示唆される。全体的に、ＩＤ－Ａ２４ＵおよびＩＤ－Ａ４０Ｕの通過時間は、各群内の１匹のマウス（Ｍ６とＭ１２）を除いて、非常に類似しているように思われる。選別（６時間）の時点で、ＩＤ－Ａ２４ＵとＩＤ－Ａ４０Ｕのほとんどが、すべてのマウスの盲腸（ＣＡＥ）と結腸（ＣＯＬ）に存在し、適度に高い量が依然として胃（ＳＴＯ）と小腸（ＳＩ）中で測定された。スラリー調製物に使用した希釈係数を考慮に入れて計算した濃度に基づいて、選別の時点でのＩＤ－Ａ２４ＵおよびＩＤ－Ａ４０Ｕの予想された濃度は、糞便中でそれぞれ２２．７μＭ～１４０μＭの間と１２μＭ～２２．５μＭの間であった（図１１）。盲腸および結腸中のＩＤ－Ａ２４Ｕの予想された濃度は、それぞれ２．９μＭ～８μＭの間と９．７μＭ～１６．５μＭの間であった。盲腸および結腸中のＩＤ－Ａ４０Ｕの予想された濃度は、それぞれ０．９μＭ～１．２μＭの間と０．８μＭ～６．２μＭの間であった（図１２）。
この試験で対照として使用されるＩＤ－３８Ｆは、以前観察されたように、すべての糞便と下部ＧＩＴの試料中で高いレベルで測定された。ＩＤ－３８Ｆの予想された濃度は、６匹のマウスにおいて、６時間の時点で、盲腸中で０．０４μＭ～２．１μＭの間で、結腸中で０．３３μＭ～５．１μＭの間で、糞便中で４．９μＭ～４８μＭの間で変化する。ＩＤ－Ａ４０ＵおよびＩＤ－３８Ｆに対して反復実験を実施した。同様の結果が得られた（図１３および１４）。
全体的に、これらの結果は、マウスを通過する際に、ＩＤ－Ａ２４ＵおよびＩＤ－Ａ４０Ｕが良好にかつＩＤ－３８Ｆと同様に生存し、高濃度の活性なＩＣＶＤを盲腸と結腸に送達する。これは、以前にインビトロで観察された、これらの腸コンパートメントにおける各ＩＣＶＤの相対的安定性を反映する可能性がある。ＩＤ－Ａ２４ＵおよびＩＤ－Ａ４０Ｕは、マウス小腸において安定していることが示された。したがって、これらおよび関連するＩＣＶＤが、ヒトＧＩ管において高い安定性を有することが予想される。
実施例１４：ヒトＩＢＤ組織試験
炎症性腸疾患組織の環境を再現するヒトのエクスビボモデルにおいて、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９の活性を調べるために、試験を実施した。Ｖ７Ｒ－２Ｅ９および対照（ＩＤ－２Ａ、抗Ｃ．ディフィシル毒素ＩＣＶＤ；ｍＡｂ８２９、およびＩｇＧ１ｋ（非ＩＬ－７Ｒ結合精製（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ）ヒトＩｇＧ１ｋアイソタイプ対照の組換え抗体）を、活性な潰瘍性大腸炎患者４人から採取した組織を使用して、組織リンタンパク質レベルおよび炎症性サイトカインの産生に対するそれらの効果について、エクスビボ培養物中で試験した。
Ｐａｔｈｓｃａｎリンタンパク質アレイ上の組織溶解物の分析（図１５～１８）により、４人のＵＣ患者のうち３人の生検中で、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９処理は、対応するＩＤ－２Ａで処理した生検と比較して、アレイ上で検出された３９のタンパク質の実質的な割合のリン酸化を阻害したことが示された。ｍＡｂ８２９はまた、同じ３人のＵＣ患者の生検中のタンパク質リン酸化レベルを阻害し、得られた阻害のパターンは、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９で達成された阻害のパターンに類似しているように思われる。各生検のリン酸化強度値の合計は、アレイ上の３９のリンタンパク質すべての強度から計算した。図１９に提示される結果は、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９およびｍＡｂ８２９が、３人の反応性ＵＣ患者の生検中の総リン酸化レベルを阻害したが、患者ＵＣ２７００の生検中では総リン酸化に対して効果がほとんどまたはまったくなかったことを示す。この患者は、それらの薬剤の一部としてアザチオプリン（Ｔ細胞阻害剤）が投与されている間も活性な疾患を呈しており、したがって、Ｔ細胞に向けられた治療に対する耐性は、ＩＬ－７Ｒ媒介性Ｔ細胞活性化を標的とした抗体（Ｖ７Ｒ－２Ｅ９およびｍＡｂ８２９）に対する反応がないことの説明となる可能性がある。
患者ＵＣ２６９８、ＵＣ２７０１、およびＵＣ２７０３の生検からの培地を分析すると、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９処理は、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＴＮＦαを含むいくつかのサイトカインの産生も阻害したが、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の産生に対しては効果がなかったことが示された（データは示さず）。リンタンパク質分析の結果と一致して、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９は、患者ＵＣ２７００の生検中の培養物中の炎症促進性サイトカインの産生を阻害しなかった。
結論として、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９によるＵＣ生検組織中のＩＬ－７Ｒのアンタゴニズムは、シグナル伝達タンパク質のリン酸化、および炎症促進性ならびに免疫制御性の経路と関連するサイトカインおよびケモカインの産生を阻害した。結果は、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９（およびｍＡｂ８２９）による粘膜のＩＬ－７Ｒ＋ｖｅ Ｔ細胞のアンタゴニズムが、疾患環境と密接に関するモデルにおいて炎症過程を阻害することができることを示した。
実施例１５：発酵培養における酵母生産性
ＩＤ－Ａ５９Ｕを発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、５リットルのエタノール供給発酵（ｅｔｈａｎｏｌ－ｆｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）に接種した。発酵終了時（ＥｏＦ）のブロス上清を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒα－Ｈｉｓ６－Ｆｃ機能性ＥＬＩＳＡによってＩＤ－Ａ５９Ｕ濃度について分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは≦２ｇ／Ｌの高収率を示し、機能性ＥＬＩＳＡは、ＩＤ－Ａ５９ＵがＥｏＦで完全に活性であり、最終収率は少なくとも１．５ｇ／Ｌであることを確認した。ＩＤ－Ａ６２Ｕを発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、５０ｍＬの振盪フラスコ発現系に接種した。高収率のＩＣＶＤを得た。
上記実施例からの結論
ＩＬ－７ＲαへのＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰの結合の阻害を含むＩＬ－７Ｒα活性の中和を測定する細胞アッセイ系での高い効力から利益を得るポリペプチドを同定した。これらのポリペプチドはまた、場合によっては、さらに小腸および／またはヒト糞便の上清における高い安定性から利益を得る。１つの特定のポリペプチド（Ｖ７Ｒ－２Ｅ９）のヒト化された誘導体が産生され、この誘導体は、未修飾のＶ７Ｒ－２Ｅ９と比較して、実質的に効力を保持したか、または増加した効力から利益を得たが、腸のプロテアーゼに対する耐性、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて有効に産生される能力も保持した。Ｅ１Ｄ酵母産生突然変異を含む、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９（Ｒ４５Ｌ、Ｑ６５Ｋ、Ｋ８７Ｒ、Ｓ８８Ａ）への突然変異の最も好ましい組み合わせは、ＩＤ－Ａ６２Ｕによって具体化される。
雑則
特許と特許出願を含む、本出願で言及される文献はすべて、可能な限り最大限に参照することによって本明細書に組み込まれる。
本明細書および続く請求項全体にわたって、文脈が別段必要としない限り、単語「含む」、および「含む」と「含むこと」などのバリエーションは、記載された整数、工程、整数の群、または工程の群を含むことが暗示されるが、他の整数、工程、整数の群、または工程の群を除外しないことが認識される。
この明細書および請求項が一部を形成する本出願は、任意の後の出願に関する優先権の基礎として使用されてもよい。そのような後の出願の請求項は、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組み合わせに関し得る。それらは、プロダクト、組成物、プロセス、または使用のクレームの形態をとってもよく、例として、限定されることなく、以下の請求項を含み得る。
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下記の参考文献は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
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Claims (32)

  1. ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰのＩＬ－７Ｒへの結合を阻害することができるポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒαに結合する免疫グロブリン鎖可変ドメインを含み、前記免疫グロブリン鎖可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１－ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１－ＦＲ４）を含み、ここで、ＣＤＲ１は配列番号１と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号２と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ３は配列番号３と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含む、ポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドは、ＩＬ－７ＲへのＩＬ－７の結合を阻害することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記ポリペプチドは、ＩＬ－７ＲへのＬ－ＴＳＬＰの結合を阻害することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 前記ポリペプチドは、ＩＬ－７ＲへのＩＬ－７の結合およびＩＬ－７ＲへのＬ－ＴＳＬＰの結合を阻害することができる、請求項１－３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
  5. ＣＤＲ１は、配列番号１と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、または前記配列からなり、ＣＤＲ２は、配列番号２と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、または前記配列からなり、および、ＣＤＲ３は、配列番号３と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、または前記配列からなる、請求項１－４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
  6. ＣＤＲ１は配列番号８２を含み、または、配列番号８２からなり、ＣＤＲ２は配列番号８３を含み、または、配列番号８３からなり、およびＣＤＲ３は配列番号８４を含み、または、配列番号８４からなる、請求項５に記載のポリペプチド。
  7. ＣＤＲ１は配列番号１または配列番号７１を含み、あるいは配列番号１または配列番号７１からなり、ＣＤＲ２は配列番号２、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、または配列番号７６を含み、あるいは配列番号２、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、または配列番号７６からなり、および、ＣＤＲ３は配列番号３、配列番号７７、または配列番号７８を含み、あるいは配列番号３、配列番号７７、または配列番号７８からなる、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. ＣＤＲ１は配列番号１を含み、または、配列番号１からなり、ＣＤＲ２は配列番号２を含み、または、配列番号２からなり、およびＣＤＲ３は配列番号３を含み、または、配列番号３からなる、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 前記ポリペプチドは、配列番号８と、５０％以上の配列同一性を共有し、例えば、５５％以上の配列同一性を共有し、例えば、６０％以上の配列同一性を共有し、例えば、６５％以上の配列同一性を共有し、例えば、７０％以上の配列同一性を共有し、例えば、７５％以上の配列同一性を共有し、例えば、８０％以上の配列同一性を共有し、例えば、８５％以上の配列同一性を共有し、例えば、９０％以上の配列同一性を共有し、例えば、９５％以上の配列同一性を共有し、例えば、９６％以上の配列同一性を共有し、例えば、９７％以上の配列同一性を共有し、例えば、９８％以上の配列同一性を共有し、例えば、９９％以上の配列同一性を共有する配列を含み、または、前記配列からなる、請求項１－８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
  10. 前記ポリペプチドは配列番号８を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
  11. 前記ポリペプチドは配列番号８からなる、請求項１０に記載のポリペプチド。
  12. 前記ポリペプチドは、Ｇｌｕ２７、Ｓｅｒ３１、Ｌｅｕ５７、Ｖａｌ５８、Ｇｌｕ５９、Ｌｙｓ７７、Ｌｙｓ７８、Ｐｈｅ７９、Ｌｅｕ８０、Ｌｅｕ８１、Ｉｌｅ８２、Ｔｈｒ１０４、Ｌｙｓ１３７、Ｌｙｓ１３８、Ｔｙｒ１３９、Ｌｙｓ１４１、Ｈｉｓ１９１、Ｔｙｒ１９２、およびＰｈｅ１９３からなるリストから選択されるＩＬ－７Ｒαの少なくとも１つの残基を含むＩＬ－７Ｒα上のエピトープに結合する、請求項１～１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
  13. ＩＬ－７Ｒα上のエピトープに結合するポリペプチドであって、前記エピトープは、Ｇｌｕ２７、Ｓｅｒ３１、Ｌｅｕ５７、Ｖａｌ５８、Ｇｌｕ５９、Ｌｙｓ７７、Ｌｙｓ７８、Ｐｈｅ７９、Ｌｅｕ８０、Ｌｅｕ８１、Ｉｌｅ８２、Ｔｈｒ１０４、Ｌｙｓ１３７、Ｌｙｓ１３８、Ｔｙｒ１３９、Ｌｙｓ１４１、Ｈｉｓ１９１、Ｔｙｒ１９２、およびＰｈｅ１９３からなるリストから選択されるＩＬ－７Ｒαの少なくとも１つの残基を含む、ポリペプチド。
  14. 前記ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである、請求項１－１３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
  15. 前記免疫グロブリン鎖可変ドメインはＶＨＨ、ＶＨ、またはＶＬである、請求項１－１４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
  16. 前記免疫グロブリン鎖可変ドメインはＶＨＨまたはＶＨである、請求項１５に記載のポリペプチド。
  17. 請求項１～１６のいずれか１つに記載の少なくとも１つのポリペプチドと、少なくとも１つの異なるポリペプチドとを含む、構築物。
  18. 前記ポリペプチドは、２．００ｎＭ以下、例えば、１．５０ｎＭ以下、例えば、１．００ｎＭ以下、例えば、０．９０ｎＭ以下、例えば、０．８０ｎＭ以下、例えば、０．７０ｎＭ以下、例えば、０．６５ｎＭ以下、例えば、０．６０ｎＭ以下、例えば、０．５５ｎＭ以下、例えば、０．５０ｎＭ以下、例えば、０．４５ｎＭ以下、例えば、０．４ｎＭ以下、例えば、０．３５ｎＭ以下、例えば、０．３０ｎＭ以下のＥＣ５０でＩＬ－７へのＩＬ－７Ｒの結合を中和する、請求項１～１７のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは構築物。
  19. 前記ポリペプチドは、１０－７Ｍ以下、例えば、より好適には１０－８Ｍ以下、例えば、１０－９Ｍ以下、例えば、１０－１０Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋｄ）で、ＩＬ－７Ｒαに結合する、請求項１～１８のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは構築物。
  20. トリプシンとキモトリプシンに対して実質的に耐性を有する、請求項１－１９のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは構築物。
  21. 請求項１～２０のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは構築物と、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤または担体とを含む、医薬組成物。
  22. 少なくとも１つのさらなる活性薬剤を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 薬剤として使用するための、請求項１～２２のいずれか１つに記載のポリペプチド、医薬組成物、または構築物。
  24. 前記ポリペプチド、前記医薬組成物、または前記構築物は自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置で使用するためのものである、請求項２３に記載のポリペプチド、医薬組成物、または構築物。
  25. 自己免疫疾患および／または炎症性疾患を処置する方法であって、それを必要とする人に、治療上有効な量の請求項１～２２のいずれか１つに記載のポリペプチド、医薬組成物、または構築物を投与する工程を含む、方法。
  26. 自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置のための薬剤の製造における、請求項１～２２のいずれか１つに記載のポリペプチド、医薬組成物、または構築物の使用。
  27. 自己免疫疾患および／または炎症性疾患はクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項２４～２６のいずれか１つに記載のポリペプチド、医薬組成物、構築物、方法、または使用。
  28. 自己免疫疾患および／または炎症性疾患はアトピー性皮膚炎である、請求項２４～２６のいずれか１つに記載のポリペプチド、医薬組成物、構築物、方法、または使用。
  29. 前記ポリペプチド、前記医薬組成物、または前記構築物は経口投与において使用するためのものである、請求項２３～２８のいずれか１つに記載のポリペプチド、医薬組成物、構築物、方法、または使用。
  30. 前記ポリペプチド、前記医薬組成物、または前記構築物は局所投与において使用するためのものである、請求項２３～２８のいずれか１つに記載のポリペプチド、医薬組成物、構築物、方法、または使用。
  31. 請求項１～２０のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
  32. 前記ポリヌクレオチドは配列番号７０を含み、または、配列番号７０からなる、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
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