KR101605908B1 - Ｃｄ154에 특이적으로 결합하는, 항체, 항체 유도체 및 항체 단편을 포함하는 결합 단백질, 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD154(CD40L) 단백질에 특이적으로 결합하는, 항체, 항체 유도체 및 항체 단편을 비롯한 결합 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 1에 따른 가변 중쇄 서열을 포함하고, 서열 번호 2에 따른 가변 경쇄 서열을 포함하는 인간화된 Fab 단편이 특이적으로 결합하는 에피토프에 특이적으로 결합하는, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 완전 인간 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 제공한다. 본 발명의 CD154 결합 단백질은 제2 항CD154 항체에 비해 감소된 이펙터 기능을 유도할 수 있다. 본 발명의 CD154 결합 단백질은 CD154-CD40 상호작용에 의해 매개되는 바람직하지 못한 면역 반응이 관여하는 질환을 비롯한 질환의 치료 및 예방과 같은 진단 방법 및 치료 방법에 유용하다.

Description

ＣＤ154에 특이적으로 결합하는, 항체, 항체 유도체 및 항체 단편을 포함하는 결합 단백질, 및 그의 용도{BINDING PROTEINS, INCLUDING ANTIBODIES, ANTIBODY DERIVATIVES AND ANTIBODY FRAGMENTS, THAT SPECIFICALLY BIND CD154 AND USES THEREOF}
본 출원은 2007년 3월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/920,495호, 2007년 3월 22일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/919,938호, 및 2007년 3월 22일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/919,816호로부터 우선권을 주장한다. US 60/920,495, US 60/919,938 및 US 60/919,816의 전문이 본원에 참고로 인용된다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 CD154(CD40L) 단백질에 특이적으로 결합하는, 항체, 항체 유도체 및 항체 단편을 비롯한 결합 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 1에 따른 가변 중쇄 서열을 포함하고, 서열 번호 2에 따른 가변 경쇄 서열을 포함하는 인간화된 Fab 단편이 특이적으로 결합하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 완전 인간 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 제공한다. 본 발명의 CD154 결합 단백질은 제2 항CD154 항체에 비해 감소된 이펙터 기능을 유도할 수 있다. 본 발명의 CD154 결합 단백질은 CD154-CD40 상호작용에 의해 매개되는 바람직하지 못한 면역 반응이 관여하는 질환을 비롯한 질환의 치료 및 예방과 같은 진단 방법 및 치료 방법에 유용하다.
체액성 면역과 세포 매개 면역의 발생은 활성화된 헬퍼 T 세포와, 항원 제시 세포("APC": antigen-presenting cell) 및 이펙터 T 세포 간의 상호작용에 의해 조정된다. 헬퍼 T 세포의 활성화는 항원에 특이적인 T 세포 수용체("TCR": T-cell receptor)와 그의 동족 펩티드 MHC 리간드의 상호작용에 의존적일 뿐만 아니라, 다수의 세포 부착 및 공동 자극 분자에 의한 조화된 결합 및 활성화를 필요로 한다(예를 들면, [Salazar-Fontana, L. I., and B. E. Bierer (2001) Curr . Opin . Hemat. 8:5]을 참조).
중요한 공동 자극 분자는 CD154인데, 이는 활성화에 의존적이고, 시간에 제한적인 방식으로 CD4+ T 세포의 표면 상에서 발현되는 II형 막관통 단백질이다. CD154는 또한 활성화 이후에 CD8+ T 세포, 호염기구, 비만 세포, 호산구, 자연 살세포, B 세포, 대식세포, 수지상 세포 및 혈소판의 서브세트 상에서도 발현된다. CD154 대응 수용체인 CD40은 APC를 비롯한 다수의 세포 유형의 표면에서 구성적으로 광범위하게 발현되는 I형 막 단백질이다(예를 들면, [Foy, T. M. et al. (1996) Ann. Rev. Immunol. 14:591] 참조).
CD154에 의한 CD40을 통한 신호 전달 과정은 CD40 수용체 보유 세포의 활성화와 최적의 CD4+ T 세포 프라이밍으로 이어지는 일련의 단계적인 이벤트들을 개시 시킨다. 더욱 특히 CD154가 CD40에 결합하는 것은 B 세포가 항체 분비 세포 및 기억 B 세포로 분화되는 것을 촉진시킨다(예를 들면, ([Burkly, L. C. (2001) In Adv. Exp . Med . Bio ., Vol. 489. D. M. Monroe et al. eds. Kluwer Academic/Plenum Publishers, p. 135] (이하, "[Burkly, 상기 문헌 동일]")을 참조). 추가로, CD154-CD40 상호작용은 대식세포 및 수지상 세포의 활성화를 통해 세포 매개 면역을 촉진시키고, 자연 살세포 및 세포독성 T 림프구의 생성을 촉진시킨다(예를 들면, [Burkly, 상기 문헌 동일]을 참조).
체액성 면역 반응과 세포 매개 면역 반응, 둘 모두의 기능을 조절하는데 있어서의 CD154의 중추적 역할이 치료학적 면역 조절을 위해 상기 경로의 억제제를 사용하는 것에 관한 큰 관심을 불러 일으켰다. 예를 들어, 항CD154 항체는 다른 치료용 단백질 또는 유전자 요법, 알레르겐, 자가면역 및 이식에 대한 면역 반응의 매우 다양한 모델에서 유익한 것으로 나타났다(예를 들면, US 5,474,771; [Burkly, 상기 문헌 동일] 참조).
CD40-CD154 상호작용은 질환 유도가 항원 투여시 CD154 길항제로 차단될 수 있는 것인, 실험적으로 유발된 몇 종의 자가면역 질환에 있어서 중요한 것으로 나타났다([Burkly, 상기 문헌 동일]. 항CD154 길항제를 사용하여 질환을 차단하는 것은 또한 자발성 자가면역 질환을 나타내는 동물 모델에서도 관찰되었다(예를 들면, [Burkly, 상기 문헌 동일] 참조).
현재는, 결합 친화도가 더 높고, 원치않는 부작용은 더 적은 개선된 항CD154 항체가 요구되고 있다. 예를 들어, 직접적인 세포독성, 보체 의존적 세포독 성("CDC": complement-dependent cytotoxicity), 항체 의존적 세포독성("ADCC": antibody-dependent cytotoxicity) 및 비정상적인 항체 생산과 같은 증가된 "이펙터 기능"은 치료학적 항체와 관련될 수 있는 원치않는 부작용이다.
몇몇 항체 이펙터 기능은 적어도 부분적으로는, 전형적인 면역글로불린의 불변 도메인 중 항체의 Fc 영역에 결합하는 것인 Fc 수용체(FcR: Fc receeptor)에 의해 매개된다. 상이한 부류의 면역글로불린에 대해 특이적인 Fc 수용체가 다수 존재한다. 면역글로불린 부류로는 IgG, IgE, IgA, IgM, 및 IgD를 포함한다. 면역글로불린 부류는 추가로 서브부류로 분류된다: IgG는 4개의 서브부류(IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4)로 분류되고, IgA는 2개의 서브부류(IgA1 및 IgA2)로 분류된다. IgG에 대한 수용체로는 3개가 공지되어 있다: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), 및 FcγRIII (CD16)). 각각의 FcγR 서브부류는 2개 또는 3개의 유전자에 의해 코딩되고, 선택적 RNA 스플라이싱을 통해 다수의 전사체를 얻을 수 있고, FcγR 이소폼에 있어 다양성은 광범위해진다.
전형적으로, 면역글로불린은 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함하는 Y자형 분자이다. 디설피드 결합은 중쇄 및 경쇄 쌍 뿐만 아니라, 2개의 중쇄를 함께 연결시킨다. 각 쇄는 서열이 다양하고 항원 결합을 담당하는 하나의 가변 도메인으로 구성된다; 이들 도메인은 중쇄 및 경쇄의 경우, 각각 VH 및 VL 도메인으로서 알려져 있다. 경쇄에는 단일의 불변 도메인(CL: 불변 도메인)이 존재하고, 중쇄에는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)이 존재한다. 가변 도메인 및 불변 도메 민을 함유하는 분자가 전항체(whole antibody)로서 지칭될 수 있다.
항체 가변 도메인 중의 잔기는 통상적으로 카뱃(Kabat) 등에 의해 고안된 체계에 따라 번호화된다. 이러한 체계는 [Kabat et al, 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA](이하, "[Kabat et al., 상기 문헌 동일]")에 기재되어 있다. 달리 명시되는 것을 제외하고는 본 명세서에서 이러한 번호화 체계가 사용된다. 카뱃 잔기 지정이 아미노산 잔기를 선형으로 번호화시키는 것과 전적으로 항상 일치하는 것은 아니라는 것에 주의하여야 한다. 실제 선형 아미노산 서열은 기본 가변 도메인 구조의 구조 성분(프레임워크 든, 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)이든 간에)의 단축, 또는 상기 구조 성분 내로의 삽입에 준하여 엄격하게 카뱃 번호화시킨 것보다 더 적은 갯수의 아미노산을 함유하거나, 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기를 정확하게 카뱃 번호화시키는 것은 항체 서열에 있어 "표준" 카뱃 번호화된 서열과 상동성을 지닌 잔기의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
보다 고도로 보존적인 4개의 프레임워크 영역내 서열 세트 중 초가변성인 가변 도메인 내에 3개의 영역이 존재한다. 이들 초가변 CDR은 주로 항원 인식을 담당한다. 중쇄 가변 도메인의 CDR은 카뱃 번호화 체계에 따라 잔기 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 코티아(Chothia)([Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol . Biol, 1987, 196:901-917])에 따르면, CDR-H1에 상당하는 루프는 잔기 26부터 잔기 32까지 걸쳐져 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 'CDR-H1'은 또한 카뱃 번호화 체계 및 코티아의 위상 루프 정의의 조합에 의해 기술되는 바, 26 내지 35에 위치하는 CDR도 포함한다. 경쇄 가변 도메인의 CDR은 카뱃 번호화 체계에 따라 잔기 24-34(CDR-L1), 잔기 50-56(CDR-L2) 및 잔기 89-97(CDR-L3)에 위치한다.
자연 발생 항체는 전항체로서 또는 특이적인 결합 성질을 보유하는 단편으로서 원래는 단일 종으로부터 유래되지만, 예를 들면, 키메라 항체와 같이 공학처리된 항체는 1 초과의 동물 종으로부터 유래될 수 있다. 현재까지, 마우스(뮤린)/인간 키메라 및 뮤린/인간 이외의 영장류 항체가 제조되었으나, 다른 하이브리드 종의 조합 역시 가능하다. 자연 발생 항체 및 공학처리된 항체 폴리펩티드들, 및 그의 유도체 및 단편의 상이한 형태 다수가 현재 알려져 있다. 상기 모두에 공통적인 특징은 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들이 하나 이상의 에피토프 결합 도메인을 통한 항원 결합 특이성을 보유한다는 점이다. 에피토프 결합 이외에 항체 폴리펩티드의 기능적 성질은 예를 들면, Fc 도메인 또는 이펙터 기능을 활성화시키고/거나 다른 세포 경로와 상호작용하는 기타 서열과 같이, 어떤 기타 서열이 존재하느냐에 따라 달라질 수 있다.
비면역글로불린 스캐폴드 또는 프레임워크에 혼입된 에피토프 결합 도메인(예로서, CDR 또는 가변 도메인)을 포함하는 CD154 결합 단백질(예를 들면, ([Binz et al. 2005 Nat Biotech 23: 1257-1268]; [Hosse et al. 2006 Protein Science 15: 14-27]) 참조)은 감소된 이펙터 기능을 나타낼 수 있다. CD154가 CD40에 결합하는 것을 특이적으로 길항시키고, CD154-CD40 복합체의 하류 기능을 감소 또는 제 거하는 신규의 결합 단백질을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 공지된 항CD154 항체와 비교하여 이펙터 기능이 감소된 CD154 결합 단백질, 예로서, 항CD154 항체를 갖는 것 또한 바람직할 수 있다.
본 발명의 요약
본 발명은 인간 CD154 단백질일 수 있는 CD154 단백질에 특이적으로 결합하는, 결합 단백질, 예로서, 단리된 항체, 재조합 항체 또는 합성 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체를 제공함으로써 이들 문제점들 및 다른 문제점들에 대한 해결안을 제공한다. 본 발명의 항CD154 항체는 그의 단편 및 유도체를 포함하여 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 영장류화된 항체, 인간화된 항체 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 본 발명의 항CD154 항체 및 그의 유도체는 다량체, 이종이량체, 반이량체, 1가, 2가, 3가, 이종특이성일 수 있으며, 단일 쇄 항체를 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 CD154에 대해 고도의 선택성을 갖고, 몇몇 실시태양에서는 또한 예를 들어, 항CD154 항체 5c8(US 5,474,771에 기재되어 있는 바와 같이, ATCC 수탁번호 HB 10916하에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 것; 또는 인간화된 5c8)와 비교하여 하나 이상의 감소된 이펙터 기능을 갖는다. 본 발명의 특정 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 CD154 결합에 대해 1가이다.
본 발명의 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체(항체 단편 및 유도체 포함)는 CD154가 CD40에 결합하는 것을 억제시키는데 유용하고, 고도의 특이성으로, 예를 들면, (20 pM과 1.5 μM을 포함하여) 20 pM 내지 1.5 μM 범위의 IC50으로 상기와 같이 억제시킨다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 20 pm 내지 500 pm, 50 pm 내지 500 pm 또는 100 pm 내지 500 pm 범위의 IC50을 가질 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체(항체 단편 및 유도체 포함)는 실질적으로 CD40 활성을 작용화시키지 않는다.
본 발명의 특정 실시태양은 인간 CD154에 대해 고도의 친화도를 나타내는 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체에 관한 것이다. 예를 들어, 특정 실시태양에서, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 표면 플라즈몬 공명(예를 들면, Biacore?)에 의해 측정된 바, (50 nM과 1 pM을 포함하여) 50 nM 내지 1 pM 범위의 KD로 인간 CD154(인간 CD40L)로부터 해리된다. 예를 들어, 인간 CD154에 대한 KD는 50 pm 내지 1 pm, 20 pm 내지 1 pm 또는 심지어는 10 pm 내지 1 pm일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 인간 CD154에 대한 KD는 20 pM 미만이다. 다른 실시태양에서, 인간 CD154에 대한 KD는 10 pM 미만이다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체가 그의 결합 친화도에 기초하여 CD154 결합에 대한 포화 농도로 또는 그를 초과하는 농도로 존재할 경우, CD154 결합 단백질이 먼저 CD154에 첨가되었을 때에는 항체 5c8이 CD154에 결합하는 것을 차단할 수 있고, CD154에 항체 5c8이 첨가된 이후에 CD154 결합 단백질이 첨가되었을 때에는 또한 CD154에 결합된 항체 5c8을 치환시킬 수도 있는 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 제공한다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하고, CDR-H1(서열 번호 3), CDR-H2(서열 번호 4) 및 CDR-H3(서열 번호 5)으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 중쇄(H) 서열(들)을 포함하거나, 그로 구성된 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 제공한다. 추가의 실시태양에서, CD154 결합 단백질 또는 항체는 CDR-H1(서열 번호 3), CDR-H2(서열 번호 4) 및 CDR-H3(서열 번호 5)으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR을 포함하거나, 그로 구성된다. 추가의 다른 실시태양에서, 결합 단백질 또는 항체는 CDR-H1(서열 번호 3), CDR-H2(서열 번호 4) 및 CDR-H3(서열 번호 5)인, CDR H 서열 3개 모두를 포함하거나, 그로 구성된다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하고, CDR-L1(서열 번호 6), CDR-L2(서열 번호 7) 및 CDR-L3(서열 번호 8)으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 경쇄(L) 서열(들)을 포함하거나, 그로 구성된 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 제공한다. 추가의 실시태양에서, CD154 결합 단백질 또는 항체는 CDR-L1(서열 번호 6), CDR-L2(서열 번호 7) 및 CDR-L3(서열 번호 8)으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR을 포함하거나, 그로 구성된다. 추가의 다른 실시태양에서, 결합 단백질 또는 항체는 CDR-L1(서열 번호 6), CDR-L2(서열 번호 7) 및 CDR-L3(서열 번호 8)인, CDR L 서열 3개 모두를 포함하거나, 그로 구성된다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하고, CDR-L1(서열 번호 6), CDR-L2(서열 번호 7) 및 CDR-L3(서열 번호 8)을 포함하거나, 그로 구성된 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 제공하는데, 상기 결합 단백질 또는 항체는 추가로 CDR-H1(서열 번호 3), CDR-H2(서열 번호 4) 및 CDR-H3(서열 번호 5)을 포함하거나, 그로 구성된다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 제공하는데, 상기 CD154 결합 단백질 또는 항체는 서열 번호 1, 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11로부터 선택되는 VH 서열을 포함하거나, 그로 구성된다. 특정 다른 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 제공하는데, 상기 CD154 결합 단백질 또는 항체는 서열 번호 12 및 서열 번호 13으로부터 선택되는 중쇄 서열을 포함하거나, 그로 구성된다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 제공하는데, 상기 CD154 결합 단백질 또는 항체는 서열 번호 2 및 서열 번호 14로부터 선택되는 VL 서열을 포함하거나, 그로 구성된다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 제공하는데, 상기 CD154 결합 단백질 또는 항체는 서열 번호 15의 경쇄 서열을 포함하거나, 그로 구성된다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 제공하는데, 상기 CD154 결합 단백질 또는 항체는 서열 번호 2 및 서열 번호 14로부터 선택되는 VL 서열 및 서열 번호 1, 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11로부터 선택되는 VH 서열을 포함하거나, 그로 구성된다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 제공하는데, 상기 CD154 결합 단백질 또는 항체는 서열 번호 15의 경쇄 서열, 및 서열 번호 12 및 서열 번호 13으로부터 선택되는 중쇄 서열을 포함하거나, 그로 구성된다. 다른 실시태양에서, CD154 결합 단백질 또는 항체는 서열 번호 15의 경쇄 서열, 및 서열 번호 13의 중쇄 서열을 포함하거나, 그로 구성된다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 CD154에 특이적으로 결합하고, CDR-H1(서열 번호 42), CDR-H2(서열 번호 43) 및 CDR-H3(서열 번호 44)으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄(H) CDR 서열(들)을 포함하거나, 그로 구성된 결합 단백질, 예를 들면, 항체에 관한 것이다. 추가의 실시태양에서, 결합 단백질 또는 항체는 CDR-H1(서열 번호 42), CDR-H2(서열 번호 43) 및 CDR-H3(서열 번호 44)으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR을 포함하거나, 그로 구성된다. 추가의 다른 실시태양에서, 결합 단백질 또는 항체는 CDR-H1(서열 번호 42), CDR-H2(서열 번호 43) 및 CDR-H3(서열 번호 44)인 CDR H 서열 3개 모두를 포함하거나, 그로 구성된다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 제공하는데, 상기 결합 단백질 또는 항체는 CDR-L1(서열 번호 45), CDR-L2(서열 번호 46) 및 CDR-L3(서열 번호 47)으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 경쇄(L) 서열을 포함하거나, 그로 구성된다. 추가의 실시태양에서, 결합 단백질 또는 항체는 CDR-L1(서열 번호 45), CDR-L2(서열 번호 46) 및 CDR-L3(서열 번호 47)으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR을 포함하거나, 그로 구성된다. 추가의 다른 실시태양에서, 결합 단백질 또는 항체는 CDR-L1(서열 번호 45), CDR-L2(서열 번호 46) 및 CDR-L3(서열 번호 47)인 CDR L 서열 3개 모두를 포함하거나, 그로 구성된다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 각각, 상기의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하거나, 그로 구성된 상보적 서열, 또는 상기의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 중 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함하거나, 그로 구성된 상보적 서열을 포함한다. 따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 CDR-H1(서열 번호 42), CDR-H2(서열 번호 43) 또는 CDR-H3(서열 번호 44), 및 CDR-L1(서열 번호 45), CDR-L2(서열 번호 46) 또는 CDR-L3(서열 번호 47)을 포함하거나, 그로 구성된다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 제공하는데, 상기 결합 단백질 또는 항체는 하기 3개의 CDR L 서열: CDR-L1(서열 번호 45), CDR-L2(서열 번호 46) 및 CDR-L3(서열 번호 47)을 포함하거나, 그로 구성되고, 상기 결합 단백질 또는 항체는 추가로 하기 3개의 CDR H 서열: CDR-H1(서열 번호 42), CDR-H2(서열 번호 43) 및 CDR-H3(서열 번호 44)을 포함하거나, 그로 구성된다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 CD154에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 54의 가변 경쇄(VL) 서열을 포함하거나, 그로 구성된 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 56의 가변 경쇄(VH) 서열을 포함하거나, 그로 구성된 CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 서열 번호 54의 VL 서열 및 서열 번호 56의 VH 서열, 둘 모두를 포함하거나, 그로 구성될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 CD154에 특이적으로 결합하는 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체에 관한 것인데, 상기 CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 CDR-H1(서열 번호 48), CDR-H2(서열 번호 49) 및 CDR-H3(서열 번호 50)으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄(H) CDR 서열(들)을 포함하거나, 그로 구성된다. 추가의 실시태양에서, CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 CDR-H1(서열 번호 48), CDR-H2(서열 번호 49) 및 CDR-H3(서열 번호 50)으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR을 포함하거나, 그로 구성된다. 추가의 다른 실시태양에서, CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 CDR-H1(서열 번호 48), CDR-H2(서열 번호 49) 및 CDR-H3(서열 번호 50)인 CDR H 서열 3개 모두를 포함하거나, 그로 구성된다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154에 특이적으로 결합하는 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 제공하는데, 상기 CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 CDR-L1(서열 번호 51), CDR-L2(서열 번호 52) 및 CDR-L3(서열 번호 53)으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 경쇄(L) 서열을 포함하거나, 그로 구성된다. 추가의 실시태양에서, CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 CDR-L1(서열 번호 51), CDR-L2(서열 번호 52) 및 CDR-L3(서열 번호 53)으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR을 포함하거나, 그로 구성된다. 추가의 다른 실시태양에서, CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 CDR-L1(서열 번호 51), CDR-L2(서열 번호 52) 및 CDR-L3(서열 번호 53)인 CDR L 서열 3개 모두를 포함하거나, 그로 구성된다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 각각, 상기의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하거나, 그로 구성된 상보적 서열, 또는 상기의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 중 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함하거나, 그로 구성된 상보적 서열을 포함한다. 따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 CDR-H1(서열 번호 48), CDR-H2(서열 번호 49) 및 CDR-H3(서열 번호 50)으로부터 선택되는 CDR H, 또는 CDR-L1(서열 번호 51), CDR-L2(서열 번호 52) 및 CDR-L3(서열 번호 53)으로부터 선택되는 CDR L을 포함하거나, 그로 구성된다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 제공하는데, 상기 CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 CDR-L1(서열 번호 51), CDR-L2(서열 번호 52) 및 CDR-L3(서열 번호 53)인 CDR L 서열 3개 모두를 포함하거나, 그로 구성되고, 상기 상기 결합 단백질, 예를 들면, 항체는 추가로 CDR-H1(서열 번호 48), CDR-H2(서열 번호 49) 및 CDR-H3(서열 번호 50)인 CDR H 서열 3개 모두를 포함하거나, 그로 구성된다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 CD154에 특이적으로 결합하는 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 제공하는데, 상기 CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 서열 번호 58의 VL 서열을 포함하거나, 그로 구성된다. 추가의 실시태양에서, 항체는 서열 번호 60의 VH 서열을 포함하거나, 그로 구성된다. 추가의 실시태양에서, 항체는 서열 번호 60의 VH 서열 및 서열 번호 58의 VL 서열을 포함하거나, 그로 구성된다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질은 서열 번호 62에 따른 경쇄 서열 및 서열 번호 65에 따른 중쇄 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질은 서열 번호 63에 따른 경쇄 서열 및 서열 번호 66에 따른 중쇄 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질은 서열 번호 68에 따른 경쇄 서열 및 서열 번호 71에 따른 중쇄 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질은 서열 번호 69에 따른 경쇄 서열 및 서열 번호 72에 따른 중쇄 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, CD154 결합 단백질은 서열 번호 68, 서열 번호 69, 서열 번호 71 및 서열 번호 72에 따른 서열들 중 적어도 하나를 포함한다.
서열 번호 3-8의 CDR 서열은 래트 모노클로날 항체 342로부터 유래된 것이다. 본 발명의 대체 실시태양에서, 항CD154 항체는 서열 번호 29의 VH 도메인 서열 및 서열 번호 30의 VL 도메인 서열을 포함하는 래트 342 항체이다. 본 발명은 또한 서열 번호 31 및 서열 번호 32로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하거나, 그로 구성된 단리된, 재조합 또는 합성 DNA 분자를 제공한다. 추가로, 서열 번호 33 및 서열 번호 34로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 항CD154 항체들 중 어느 하나가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 선택적으로 결합하는 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체(예를 들면, 342, 381 및 338 항체 및 그의 에피토프 결합 서열)를 제공한다. 특히 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 항체 342 및 338은 항CD154 항체 5c8과의 경쟁 분석법에서 제1 또는 제2 항체로서 사용될 때 유사한 CD154 결합 성질을 나타낸다.
따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13에 따른 중쇄 서열을 포함하고, 서열 번호 15에 따른 경쇄 서열을 포함하는 인간화된 항체(342 Fab 및 Fab' 단편)가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하고, 본원에 기술된 바와 같이, 항CD154 항체 5c8과의 경쟁 분석법에서 제1 또는 제2 항체로서 사용될 때 유사한 CD154 결합 성질을 나타내는 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 58에 따른 VL 도메인 서열 및 서열 번호 60에 따른 VH 도메인 서열을 포함하는 인간화된 항체(338 항체 가변 서열)가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하고, 본원에 기술된 바와 같이, 항CD154 항체 5c8과의 경쟁 분석법에서 유사한 CD154 결합 성질을 나타내는 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체를 제공한다.
본 발명의 CD154 결합 단백질에 관한 상기 실시태양들 중 임의의 것에서, 결합 단백질은 PEG화될 수 있다. CD154 결합 단백질이 항CD154 항체, 항체 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 유도체인 실시태양에서, 항체는 중쇄, 경쇄, 또는 둘 모두의 상에서 PEG화될 수 있다.
본 발명은 또한 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18 및 서열 번호 25로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하거나, 그로 구성된 단리된, 재조합 및/또는 합성 DNA 분자를 제공한다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 또한 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 67, 서열 번호 70 및 서열 번호 73으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하거나, 그로 구성된 단리된, 재조합 및/또는 합성 DNA 분자를 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 28 및 서열 번호 41로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하거나, 그로 구성된 단리된, 재조합 및/또는 합성 DNA 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 단리된, 재조합 및/또는 합성 DNA 분자 중 어느 하나를 포함하는 벡터를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 벡터는 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 41로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 55 및 서열 번호 57로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하거나, 그로 구성된 단리된, 재조합 및/또는 합성 DNA 분자를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 55 및 서열 번호 57, 둘 모두를 포함하거나, 그로 구성된 단리된, 재조합 및/또는 합성 DNA 분자를 제공한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 59 및 서열 번호 61로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하거나, 그로 구성된 단리된, 재조합 및/또는 합성 DNA 분자를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 59 및 서열 번호 61, 둘 모두를 포함하거나, 그로 구성된 단리된, 재조합 및/또는 합성 DNA 분자를 제공한다.
이펙터 기능에 기여하는 서열을 포함하는 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체에 관한 본 발명의 실시태양들 중 임의의 것에서, 상기 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 추가로 본원에서 다른 경우에 기술된 바와 마찬가지로, Fc 영역을 갖는 항CD154 항체와 비교하여 감소된 이펙터 기능을 유도하도록 선택될 수 있거나, 공학처리될 수 있다. 예를 들어, Fc 영역 또는 불변 영역 서열이 없거나, 기능적인 Fc 영역 또는 불변 영역 서열이 없는 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체가 본 발명에서의 사용을 위해 선택될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체는 CD154에의 결합에 대하여 1가이며, 바람직하게는, 피험체에게 투여되었을 경우, 비교가능한 CD154 결합 단백질, 예로서, 2가 항CD154 항체에 비하여 감소된 이펙터 기능을 유도한다.
특정 다른 실시태양에서, Fc 또는 불변 영역 서열이 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체 폴리펩티드에 존재하게 된다면, 이는 천연, 모체 또는 변형되지 않은 Fc 또는 불변 영역 서열을 포함하는 대조군 항CD154 항체과 비교하여 하나 이상의 이펙터 기능(들)을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 변형(예를 들면, 아미노산 치환, 삽입, 부가 또는 결실)을 포함하도록 선택될 수 있거나, 공학처리될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 존재할 경우 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역이거나, 그로부터 유래된 것이다. 몇몇 실시태양에서, 하이브리드 Fc 영역, 즉, IgG1/IgG4 하이브리드 Fc 서열이 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, Fc 영역은 IgG4 항체의 IgG4 Fc 서열을 포함하거나, 그로부터 유래된 것이다. 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키는, 상이한 Fc 영역 간의 임의의 하이브리드 조합이 본 발명에 따라 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
특정 다른 실시태양에서, 항체 Fc 부분의 글리코실화는 본원에 추가로 기술되어 있는 바와 같이, 감소 또는 제거되거나, 항체의 글리코실화 프로파일이 변경된다. 특정 실시태양에서, CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체 폴리펩티드는 보존된 N 연결 글리코실화 부위에 또는 그와 인접한 위치에 변형을 갖는 Fc 영역을 포함하는 CH2 도메인을 포함한다. 보존된 N 연결 글리코실화 부위에서의 변형은 중쇄 글리코실화 부위에서 또는 그와 근접한 위치에서의 돌연변이를 포함할 수 있는데, 상기 돌연변이는 상기 부위에서의 글리코실화를 감소시키거나, 변경시키거나, 방해한다. 추가의 실시태양에서, 변형은 돌연변이 N298Q(EU 카뱃 번호화 사용시 N297)를 포함한다. 특정 실시태양에서, 변형은 CH2 도메인 글리칸 또는 그의 일부의 제거를 포함한다. 특정 대체 실시태양에서, 변형은 글리코실화 부위의 성숙한 N 글리칸의 형성을 방해한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 5, 44 및 50으로부터 선택되는 중쇄 CDR3 서열 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체에 관한 것으로, 상기 변이체 Fc 영역은 제1 아미노산 잔기 및 N 글리코실화 부위를 포함하는데, 상기 제1 아미노산 잔기는 측쇄 화학물질로 변형되거나 아미노산 치환에 의해 변형되어, 변형되지 않은 제1 아미노산 잔기와 비교하였을 때에 입체적 크기가 증가 또는 정전하가 증가함으로써 N 글리코실화 부위에서의 글리코실화 수준이 감소되거나, 다르게는 글리코실화가 변경된 것인 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체에 관한 것이다. 이들 특정 실시태양에서, 변이체 Fc 영역은, 대조군인 변이체 이외의 Fc 영역과 비교하였을 때에 감소된 이펙터 기능을 부여한다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 5, 44 및 50으로부터 선택되는 중쇄 CDR3 서열 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체에 관한 것으로, 상기 변이체 Fc 영역은 제1 아미노산 잔기 및 N 글리코실화 부위를 포함하는데, 상기 제1 아미노산 잔기는 시스테인 티올을 포함함으로써 N 글리코실화 부위에서의 글리코실화 수준이 감소되거나, 글리코실화가 변경되며, 여기서, 변이체 Fc 영역은 감소된 이펙터 기능을 부여하는 것인, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체에 관한 것이다.
특정 실시태양에서, 상기 기술된 변이체 Fc 영역을 포함하는 항CD154 항체의 제1 아미노산 잔기 및 N 글리코실화 부위는 N 연결 글리코실화 모티프에 근접한 위치 또는 그 내부에 존재한다. 추가의 실시태양에서, N 연결 글리코실화 모티프는 아미노산 서열 NXT 또는 NXS를 포함한다. 특정 실시태양에서, N 연결 글리코실화 모티프는 아미노산 서열 NXT를 포함한다. 특정 실시태양에서, N 글리코실화 부위는 카뱃 번호화 체계에 따라 아미노산 297에 위치한다. 추가의 실시태양에서, 변형된 제1 아미노산 잔기는 카뱃 번호화 체계에 따라 아미노산 299에 위치한다.
상기의 특정 실시태양에서, 본원에 기술된 결합 단백질을 포함하는 항체 또는 항체 단편 중 어느 하나에 의해 나타나는 감소된 이펙터 기능은 Fc 수용체(FcR: Fc receptor)에의 결합 감소이다. 특정 실시태양에서, Fc 수용체(FcR)는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII, 및 그의 하나 이상의 서브유형, 예로서, FcγRIIa로부터 선택된다. 몇몇 실시태양에서, FcR 결합은 적어도 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 50배 이상, 또는 약 100배 이상 만큼 감소한다.
특정 실시태양에서, 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 감소된 이펙터 기능(들)을 갖는 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 특이적인 이펙터 수용체 또는 이펙터 수용체 서브유형에 결합하지 못한다. 이들 특정 실시태양에서, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 FcγRIIa에 결합하지 못한다.
특정 실시태양에서, 본원에 기술된 결합 단백질을 포함하는 항체 중 어느 하나에 의해 나타나는 감소된 이펙터 기능은 보체 단백질에의 결합 감소이다. 몇몇 실시태양에서, 보체 단백질은 C1q이다. 특정 실시태양에서, 보체 단백질에의 결합은 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 또는 약 15배 이상 만큼 감소한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 Fc 영역에 하나 이상의 변형 또는 변이를 포함하고, 글리코실화되지 않은 것이며, 피험체에게 투여되었을 때에 하나 이상의 감소된 이펙터 기능을 유도한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 피험체에게 투여되었을 때에 항CD154 항체 5c8 투여시 유발하는 것보다 더 적은 혈전색전성 효과를 유발한다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 상기 기술된 변이체 Fc 영역을 포함하는 CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체의 변형된 제1 아미노산 잔기는 기능적 부분에 연결되어 있다. 추가의 실시태양에서, 기능적 부분은 차단 부분, 검출가능한 부분, 진단적 부분 또는 치료적 부분, 또는 그의 조합이다. 특정 실시태양에서, 차단 부분은 예를 들어, 시스테인 부가물, 혼합된 디설피드, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드일 수 있다. 특정 실시태양에서, 검출가능한 부분은 예를 들어, 형광성 부분, 발광성 부분 또는 동위원소 부분일 수 있다. 진단적 부분이 사용되는 실시태양에서, 진단적 부분은 병태, 질환 또는 질병의 존재 여부를 밝혀낼 수 있다. 다른 실시태양에서, 치료적 부분, 예로서, 소염제, 항암제, 항신경퇴행성 제제, CD154 이외의 분자에 대해 선택성인 항체, 또는 항감염제가 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 변형된 아미노산 잔기를 포함하는데, 상기 변형을 통해서 예를 들면, 부위 지정 페길화를 위한 기능적 부분으로의 단백질 또는 항체의 부위 지정 접합이 이루어질 수 있다. 특정 실시태양에서, 변형된 아미노산 잔기는 시스테인 또는 혼합된 디설피드에 의해 변형된 시스테인 잔기이다. 따라서, 특정 실시태양에서, CD154 결합 단백질은 변형된 아미노산 잔기, 예를 들면, 시스테인 또는 리신 잔기에서 페길화된 항CD154 항체 폴리펩티드이다. 특정 실시태양에서, 항CD154 항체는 PEG-말레이미드로 페길화된 Fab 또는 Fab' 단편이다.
본 발명은 또한 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 코딩하는 핵산, 예를 들면, DNA 서열을 제공한다. 본 발명의 DNA 서열은 합성 DNA, 예를 들면, 화학적 프로세싱에 의해 생산된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 그의 임의 조합물을 포함할 수 있다. 본 발명은 추가로 본 발명의 하나 이상의 핵산, 예를 들면, DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 또한 상기 기술된 합성, 단리된, 및/또는 재조합 핵산 중 임의의 것을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 서열 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 특정 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 벡터 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포가 CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체를 생산하는데 적합한 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시태양에서, 본 방법은 CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체를 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 항CD154 항체 또는 핵산은 검출가능한 마커로 표지되는데, 상기 검출가능한 마커는 방사성 동위원소, 효소, 염료 또는 비오틴일 수 있다. 특정 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 다른 치료제에 접합되는데, 상기의 다른 치료제는 예를 들어, 방사성 동위원소, 방사성 핵종, 독소, 톡소이드, 비CD154 특이 항체 폴리펩티드 또는 단편(즉, 이중특이성 또는 다중특이성 항체를 생성하는 것), 또는 화학요법제일 수 있다. 추가의 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 영상화제에 접합되는데, 상기의 영상화제는 표지 부분일 수 있다. 표지 물질은 또한 비오틴, 형광성 또는 발광성 부분, 방사성 부분, 히스티딘 태그, 또는 펩티드 태그일 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체의 서열 변이체, 및 그를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 서열 변이체는 바람직하게 본 발명의 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 핵산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%의 동일성을 공유한다. 더욱 바람직하게, 서열 변이체는 아미노산 또는 핵산 수준에 있어 적어도 95%, 96%, 97% 또는 98%의 동일성을 공유한다. 가장 바람직하게, 서열 변이체는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 핵산 서열과 적어도 99%, 99.5%, 99.9% 이상의 동일성을 공유한다.
따라서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 68, 서열 번호 69, 서열 번호 71 또는 서열 번호 72의 서열과 적어도 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 단리된 단백질을 제공한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 키메라, 인간화된 또는 인간 항CD154 항체 폴리펩티드는 예를 들어, dAb, Fab, Fab', scFv, Fv, 디설피드 결합된 Fv이거나, CD154 결합에 대하여 특이성이고 1가인 단일의 면역글로불린 가변 도메인, 예로서, VH 또는 VL 도메인을 포함한다. 본 발명의 특정 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 키메라, 인간화된 또는 인간 항CD154 항체 폴리펩티드들은 본 발명의 1개, 2개 또는 그 이상의 CDR 및 대체 스캐폴드 또는 범용 프레임워크 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)로부터 선택되는 단일 가변 도메인을 포함한다.
본 발명은 또한 CD154에의 결합에 대하여 1가이며, 기능적 부분을 포함하지 않는 동일 폴리펩티드에 비하여 그의 생체내 반감기를 증가시키는 기능적 부분에 접합되어 있는 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 키메라, 인간화된 또는 인간 항CD154 항체 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시태양에서, 기능적 부분은 폴리에틸렌 글리콜을 포함하거나, 그로 구성된다. 특정 실시태양에서, 기능적 부분은 알부민 분자, 예로서, 인간 혈청 알부민을 포함하거나, 그로 구성된다. 따라서, 본 발명은 특이적으로 그리고 1가로 CD154에 결합하며, 연결된 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지 않는 동일 폴리펩티드에 비하여 증가된 생체내 반감기를 갖는 PEG에 연결된 CD154 결합 단백질, 예를 들면, PEG에 연결된 키메라, 인간화된 또는 인간 항CD154 항체 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는데, 몇몇 실시태양에서, 상기 약제학적 조성물은 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 임의로 추가의 생체활성 제제 또는 치료제, 예로서, 면역억제 화합물 또는 면역억제제, 또는 면역조절 화합물 또는 면역조절제; 또는 진단학적 제제를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 조성물은 본원에 기술된 바와 같이, 치료학적 유효량의, 항CD154 항체 342 또는 338의 에피토프 특이성을 갖는 페길화된 항CD154 Fab' 항체를 포함한다.
본 발명은 추가로 치료학적 유효량의, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하여 병태, 질병, 질환이 치료 또는 예방되도록 하는 단계를 포함하는, 전체적으로 또는 부분적으로 CD40 신호 전달에 의해 매개되는 인간 병태, 질병, 질환, 또는 상기 중 임의의 것의 증상을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 치료학적 유효량의, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하여 치료학적 또는 예방학적 반응이 일어나도록 하는 단계를 포함하는, 전체적으로 또는 부분적으로 CD40 신호 전달에 의해 매개되는 면역, 자가면역 또는 염증성 반응, 또는 상기 중 임의의 것의 증상 중 하나 이상을 저해하거나 예방하는 방법을 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 방법은 전신 홍반성 루푸스(SLE: systemic lupus erythematosis)의 징후를 나타내거나, 그로 진단받은 피험체를 치료하는데 사용된다. 다른 실시태양에서, 본 방법은 예로서, 류마티스양 관절염(RA: rheumatoid arthritis)과 같은 류마티스양 병태의 징후를 나타내거나, 그로 진단받은 피험체를 치료하는데 사용된다.
본 발명은 CD154에 결합하는 1가의 인간 항체 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시태양에서, CD154에 결합하는 1가의 인간 항체 폴리펩티드는 그의 결합 친화도에 기초하여 CD154 결합에 대한 포화 농도로 또는 그를 초과하는 농도로 존재할 경우, 인간 항체 폴리펩티드가 먼저 CD154에 첨가되었을 때에는 항체 5c8이 CD154에 결합하는 것을 차단하기도 하고, 항체 5c8이 첨가된 이후에 인간 항체 폴리펩티드가 첨가되었을 때에는 CD154에 결합된 항체 5c8을 치환시키기도 한다. 특정 실시태양에서, 인간 항체 폴리펩티드는 PEG에 연결되어 있다. 특정 실시태양에서, 인간 항체 폴리펩티드에는 Fc 도메인이 없다. 상기의 특정 실시태양에서, CD154 결합 단백질 또는 인간 항체 폴리펩티드는 CD40에 결합한 CD154를 치환시키지 않는다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154에 결합하는 1가의 페길화된 항CD154 Fab' 항체를 제공하고, 추가로, 치료학적 유효량의, 페길화된 항CD154 Fab' 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하여 치료학적 또는 예방학적 반응이 일어나도록 하는 단계를 포함하는, 관절염, 예로서, 류마티스양 관절염, 또는 전신 홍반성 루푸스(SLE)의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
도 1은 항CD154 항체 342, 381, 및 338의 상보성 결정 영역(CDR)에 대한 아미노산 서열을 제공하는 표이다.
도 2는 래트 항CD154 항체 342의 VH 및 VL 도메인에 대한 아미노산 및 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 표이다. 밑줄로 표시한 서열은 리더(즉, 신호) 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상응한다.
도 3은 실시예에서 인간화된 항CD154 항체를 생산하기 위해 사용된 인간 수용체 프레임워크의 아미노산 및 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 표이다.
도 4는 342 CDR이 도 3에 제시된 프레임워크 내로 이식되어 있는 VH 및 VL 도메인의 아미노산 및 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 표이다.
도 5는 342 CDR이 인간 수용체 프레임워크 내로 이식되어 있고, 여기서, 특정의 주요 공여체 잔기는 유지되어 있는, 항체 342의 VH 도메인(VH3 gH1 및 VH4 gH1)의 아미노산 및 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 표이다.
도 6은 342 CDR이 인간 수용체 프레임워크 내로 이식되어 있고, 여기서, 특정의 주요 공여체 잔기는 유지되어 있는, 항체 342의 VL 도메인(VK1 gL4)의 아미노산 및 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 표이다.
도 7은 항체 342의 완전한 경쇄(가변 및 불변 경쇄 영역) 및 중쇄 영역에 대한 서열을 제공하는 표이다. 신호/리더 펩티드에 상응하는 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
도 8은 이식편 342 gL4gH1의 Fab(서열 번호 28) 및 Fab'(서열 번호 41) 변형물을 제조하는데 사용된 발현 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 신호/리더 서열은 밑줄로 표시되어 있고, 제한 부위(실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 E. 콜라이(E. coli) 발현 벡터로 클로닝시키는데 사용됨)는 대문자로 굵게 표시되어 있다.
도 9는 342 항체의 인간화에 사용된 인간 생식 계열(수용체) 프레임워크와 함께 래트 342 항CD154 항체(공여체) 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 정렬해 놓은 것을 나타낸다. "경쇄 342"는 래트 VL 도메인 서열이다. "중쇄 342"는 래트 VH 도메인 서열이다. CDR 잔기는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다. 수용체의 프레임워크 경쇄(2 1 1 O12; 서열 번호 35) 및 중쇄(1-1 3-66; 서열 번호 37 및 1-1 4-59; 서열 번호 39)가 제시되어 있다. 인간 생식 계열 수용체 프레임워크 내로 CDR만이 이식된 이식편 또한 나타낸다(VK1 gL3, VH3 gH7 및 VH4 gH6). 특정 인간화된 중쇄 및 경쇄에서, 342 항체의 공여체 잔기는 프레임워크 영역내 유지되고, 이들 주요 공여체 프레임워크 잔기는 굵은 이탤릭체로 하이라이트 표시가 되어 있다. VK1 gL4 공여체 항목은 R38, Y71 및 S85이다. VH3 gH1 공여체 항목은 V24, M48, G49, T73 및 V78이다. VH4 gH1 공여체 항목은 M48, R71 및 V78이다. 제시된 경쇄의 서열 번호는 상단으로부터 하단으로의 순으로 서열 번호 30("342"), 서열 번호 35("2 1 1 O12"), 서열 번호 14("342 gL3") 및 서열 번호 2("342 gL4")이다. 제시된 중쇄(VH3 이식편)의 서열 번호는 상단으로부터 하단으로의 순으로 서열 번호 29("342"), 서열 번호 37("1-1 3-66"), 서열 번호 10("342 gH7"), 및 서열 번호 1("342 gH1")이다. 제시된 중쇄(VH4 이식편)의 서열 번호는 상단으로부터 하단으로의 순으로 서열 번호 29("342"), 서열 번호 39("1-1 4-59"), 서열 번호 9의 변이체("VH4 gH6"(서열 번호 74)), 및 서열 번호 11의 변이체("VH4 gH1"(서열 번호 75))이다. 도 9에 제시한 서열 번호 9 및 서열 번호 11 변이체는 E. 콜라이에서 발현을 위해 아미노산 "E"(각각 도 4 및 5에서의 "Q" 대신)로 시작한다. 따라서, 이들 변이체 서열 번호 9 및 11에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 이들이 "c" 대신 뉴클레오티드 "g"로 시작한다는 점에서, 서열 번호 19 및 서열 번호 21에 기재된 뉴클레오티드 서열과는 다르다.
도 10은 항CD154 항체 381에 대한 VL 및 VH 아미노산 및 상응하는 뉴클레오 티드 서열을 제공한다. CDR 아미노산 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
도 11은 항CD154 항체 338에 대한 VL 및 VH 아미노산 및 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. CDR 아미노산 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
도 12는 림프구 항체 선별 방법(SLAM: Selected Lymphocyte Antibody Method)에 의해 단리된 래트 항인간 CD154 항체를 목록으로 작성한 표이다. 본 표는 비아코어(Biacore)?, CD40 결합 분석법 및 ICAM-1 상향조절 분석법으로 이들 항체를 사용하여 얻은 Kd 및 IC50 값을 제공한다. 항체 342를 사용하여 얻은 데이타는 하이라이트 표시가 되어 있다.
도 13은 비글리코실화된(aglycosylated) 항CD154 항체 hu5c8(hu5c8 비글리P-huIgG4)의 카파 경쇄 아미노산 및 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
도 14는 비글리코실화된 항CD154 항체 hu5c8(hu5c8 비글리P-huIgG4)의 중쇄 아미노산 및 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 변이체를 비글리코실화시키는 돌연변이(카뱃 EU 명명법으로 S228P/T299A; 잔기 226 및 297)는 성숙 단백질 서열에서 굵은 밑줄체로 표시되어 있다.
도 15는 비글리코실화된 항CD154 항체 hu342(hu342 비글리P-huIgG4)의 카파 경쇄 아미노산 및 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
도 16은 비글리코실화된 항CD154 항체 hu342(hu342 비글리P-huIgG4)의 중쇄 아미노산 및 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 변이체를 비글리코실화시키는 돌연변이(카뱃 EU 명명법으로 S228P/T299A; 잔기 226 및 297)는 성숙 단백질 서 열에서 굵은 밑줄체로 표시되어 있다.
도 17은 예시적인 Fab' 단편, 및 항CD154 항체의 Fab' 단편의 부위 특이 PEG화를 보여주는 겔을 나타낸다. Fab'는 PEG-말레이미드와 힌지에 있는 단일의 시스테인 잔기의 반응에 의해 페길화되었다.
도 18은 Fab' 단편 및 항체-PEG 접합체를 비롯한, 인간화된 342 gL4gH1 항체의 다른 실시태양에 대한 비아코어?, CD40 결합 분석법, ICAM-1 상향조절 분석법 및 CD40L 경쟁 결합 분석법에서 얻은 Kd 및 IC50 값을 제공하는 표이다.
도 19는 염수 대조군 또는 다양한 용량의 항CD154 항체를 투여받은 사이노몰거스 원숭이에서 시간 함수에 따른 항TT(파상풍 톡소이드: tetanus toxoid) IgG 역가 값을 나타내는 2개의 그래프이다. 상단에 있는 그래프는 항체 처리 및 TT 시험감염 후 0-20일간의 IgG 역가 값을 나타내고(1차 면역 반응), 하단에 있는 그래프는 항체 처리 및 30일째의 2차 TT 시험감염 후 30-50일간의 값을 나타낸다.
도 20은 단일 용량(hu5c8, 비글리코실(aglycosyl) 5c8 및 비글리코실 342의 경우, 20 mg/kg, 및 342 Fab'-PEG 및 342 DFM-PEG의 경우, 40 mg/kg)으로 다양한 포맷의 항CD154 항체를 투여받은 사이노몰거스 원숭이에서 시간 함수에 따른 항TT(파상풍 톡소이드) IgG 역가 값의 그래프이다. DFM-PEG는 2개의 Fab' 단편이 PEG화된 디말레이미드 브릿지로 가교결합된 항체 단편이다.
도 21은 염수 대조군 또는 다양한 용량의 항CD154 항체를 투여받은 사이노몰거스 원숭이에서 시간 함수에 따른 항TT(파상풍 톡소이드) IgM 역가 값의 그래프이 다. 본 그래프는 TT로 시험감염한 후 0-20일간의 IgM 역가 값을 나타낸다(1차 반응).
도 22는 사이노몰거스 원숭이에서 342 Fab'-PEG 항체와 hu5c8 항체의 약동학적 성질을 비교하는 그래프이다.
도 23은 각 패널에 표시된 바와 같이(23A - A33; 23B - 338; 23C - 402; 23D - 381; 23E - 300; 23F - 294; 23G - 335; 23H - 303), 표지되지 않은 제1 항CD154 Fab'가 사전에 결합되어 있는 CD154 발현 D 1.1 주르카트(Jurkat) 세포에 결합하는 표지된 342 Fab' 결합의 교차 차단에 관한 유세포 측정법 분석 결과를 나타낸다(실시예 9 참조). A33은 이소형 대응 대조군 항체이고, 이는 비특이적인 교차 차단은 존재하지 않는다는 것을 확인시켜 준다.
도 24는 각 패널에 표시된 바와 같이(24A - 338; 24B - 402; 24C - 381; 24D - 303; 24E - 335; 24F - 300; 24G - 294; 24H - A33), 표지되지 않은 제1 항CD154 Fab'가 사전에 결합되어 있는 CD154 발현 D 1.1 주르카트 세포에 결합하는 표지된 Hu5c8 Fab' 결합의 교차 차단에 관한 유세포 측정법 분석 결과를 나타낸다(실시예 9 참조). A33은 이소형 대응 대조군 항체이고, 이는 비특이적인 교차 차단은 존재하지 않는다는 것을 확인시켜 준다.
도 25 A-F는 가용성 CD154 단백질(ECD) 또는 CD40:CD154 복합체에 결합하는 다양한 형태의 342 및 Hu5c8 항체의 경쟁적 결합에 관한 비아코어? 분석 결과를 나타낸다. FL - 전장. CD40hFc - 인간 CD40 융합 단백질.
도 26은 Hu5c8 항CD154 항체, 342 Fab'-PEG 항CD154 항체, 및 대조군 항체를 사용하여 실시된, 실시예 11에 기재되어 있는 혈소판 응집 분석법(분석 1)의 결과를 나타내는 그래프이다. 첫번재 패널은 전 IgG와 함께 형성한 CD40L 복합체를 사용하여 얻은 결과를 나타내고, 두번째 패널은 Fab'-PEG 또는 디Fab'-PEG와 함께 형성한 복합체를 나타낸다. 세번째 패널은 트리Fab'-PEG 및 비글리코실화된 항CD154 항체 hu342를 사용하여 얻은 결과를 나타낸다.
도 27은 양성 및 음성 대조군 항체를 사용하여 실시된, 실시예 11에 기재되어 있는 혈소판 응집 분석법(분석 2)의 결과를 나타내는 그래프이다. 본 결과는 혈소판 응집이 양성 대조군 항CD154 항체와 재조합 인간 가용성 CD40L(sCD154)의 복합체 의해 특이적으로 증진된다는 것을 입증한다.
도 28은 인간(서열 번호 76) 및 마우스(서열 번호 77)의 가용성 CD40L 아미노산 서열의 서열 정렬을 나타낸다. 인간 서열과 마우스 서열 사이의 상이한 서열은 적색으로 표시되어 있다. Hu5c8 에피토프 서열은 청색으로 표시되어 있다. 내부 잔기는 "│ "로 표시되어 있다. 인간 잔기가 가용성 마우스 CD40L 내로 도입되어 있는 6개 영역(1-6)의 서열을 선별하였다.
도 29는 342 Fab' 및 hu5c8 Fab'의 교차 차단을 입증하는 경쟁 ELISA 분석법의 결과를 나타낸다(실시예 14 참조). 도 29A는 CD154 상에서 비오틴 342 Fab'의 적정 결과를 나타낸다. 1 nM 농도가 곡선의 선형부 상에 있다. 도 29B는 CD154 상에서 비오틴 hu5c8 Fab'의 적정 결과를 나타낸다. 0.3 nM 농도가 곡선의 선형부 상에 있다. 도 29C는 표지되지 않은 342 Fab'에 의한 비오틴 342 및 비오틴 5c8의 교차 차단을 나타낸다. ch342 Fab는 키메라 342 Fab'이다. 도 29D는 표지되지 않은 5c8 Fab'에 의한 비오틴 342의 교차 차단을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본원에 기술된 본 발명을 보다 충분히 이해할 수 있도록 하기 위해 하기의 상세한 설명을 기재한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 용어와 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련인이 보편적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 그와 등가인 방법 및 재료 또한 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있으며, 이러한 것이 당업자에게는 자명한 것이지만, 예시적인 방법과 재료를 하기에 기술한다.
본 출원 전반에 걸쳐 다양한 특허, 공개문헌 및 참고 문헌을 참고로 한다. 이러한 특허, 공개문헌 및 참고 문헌의 개시 내용 전문이 본 출원의 참고로서 인용된다.
당업자에게 알려져 있는 재조합 DNA 기술의 일반 원리를 설명하는 표준 참고 연구로는 ([Ausubel et al, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998 and Supplements to 2001)]; [Sambrook et al, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989)]; [Kaufman et al, Eds., Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995)]; [McPherson, Ed., Directed Mutagenesis : A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991)])을 포함한다.
당업자에게 알려져 있는 면역학적 방법의 일반 원리를 설명하는 표준 참고 연구로는 ([Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1999)]; 및 [Roitt et al., Immunology, 3d Ed., Mosby-Year Book Europe Limited, London (1993)])을 포함한다. 당업자에게 알려져 있는 의학 생리학 및 약리학적 방법의 일반 원리를 설명하는 표준 참고 연구로는 ([Fauci et al., Eds., Harrison's Principles Of Internal Medicine, 14th Ed., McGraw-Hill Companies, Inc. (1998)]을 포함한다.
정의
본원에서 사용되는 바, "CD154 결합 단백질"이라는 용어는 CD154에 특이적으로 결합하거나, 그를 길항시키는, 항체를 비롯한 임의의 분자를 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, 항CD154 항체는 CD154에 특이적으로 결합하는 단백질 중의 한 부류이다. 본 발명의 CD154 결합 단백질은 본원에 개시된 바와 같이, 적어도 하나의, 바람직하게는, 2개, 3개 또는 그 이상의 CDR을 포함할 수 있다. CD154 결합 단백질 또는 상기와 같은 다른 CD154 길항제는 고전적 항체 단편 또는 유도체는 아니지만, 그럼에도 불구하고, CD154 에피토프 결합 특이성을 부여하는 아미노산 서열 및/또는 화학적 구조체를 포함하는 종을 포함할 수 있다. 그러한 CD154 길항제는 예를 들면, 대체 스캐폴드로부터 제조될 수 있다(예를 들어, [Binz et al. 2005 Nat Biotech 23: 1257-1268] 및 [Hosse et al. 2006 Protein Science 15: 14-27] 참조). 그러한 CD154 결합 단백질 또는 길항제는 본원에 기술된 바와 같이, 기능이 부족한 항체 Fc 영역에 또는 이종성 기능적 부분에 융합되어 CD154 결합 단백질의 반감기 및/또는 다른 생체내 성질을 개선시킬 수 있다.
CD154 결합 단백질은 생체적합성 프레임워크 구조체 내로 혼입되어 있는, 본원에 기술된 CDR 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일례로, 생체적합성 프레임워크 구조체는 국부적인 표면 영역 중 항원에 결합하는 하나 이상의 아미노산 서열(예로서, CDR, 가변 도메인 등)을 제시할 수 있는, 구조적으로 안정적인 구조 지지체를 형성하기에 충분한 폴리펩티드 또는 그의 일부, 또는 프레임워크, 또는 스캐폴드를 포함한다. 그러한 구조체는 자연 발생 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 "폴드"(구조적 모티프)일 수 있거나, 자연 발생 폴리펩티드 또는 폴드와 비교하여 예로서, 아미노산의 부가, 결실, 또는 치환과 같은 하나 이상의 변형을 가질 수 있다. 이러한 스캐폴드는 예로서, 인간, 다른 포유동물, 다른 척추동물, 무척추동물, 식물, 세균 또는 바이러스와 같은 임의의 종(또는 1 초과의 종들)의 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다.
전형적으로 생체적합성 프레임워크 구조체는 면역글로불린 도메인 이외의 단백질 스캐폴드 또는 골격에 기초한다. 예를 들어, 피브로넥틴, 앤키린, 리포칼린, 네오카르시노스타틴, 시토크롬 b, CP1 아연 핑거, PST1, 꼬인 코일, LACI-D1, Z 도메인 및 텐드라미사트(tendramisat) 도메인에 기초한 것이 사용될 수 있다(예를 들면, [Nygren and Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469] 참조).
본 발명과 관련하여 본원에서 사용되는 "항체"라는 용어는 단리된 항체, 재조합 항체 또는 합성 항체, 항체 접합체 또는 항체 유도체를 포함한다. "항체"라는 용어는 대개 달리 명시되지 않거나, 문맥상 달리 이해되는 것이 아니라면, 항원 결 합 단편을 비롯한 항체 단편을 포함하고자 한다. 항원 결합 단편은 특이적인 결합에 대해 무손상 항체와 경쟁한다. 일반적으로, [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]를 참조한다. 항원 결합 단편은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 항원 결합 단편은 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, F(ab')3, Fd, Fv, 도메인 항체(dAb), 다른 1가 및 2가 단편, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일 쇄 항체(예를 들면, scFv, scFab, 및 scFabΔC), 키메라 항체, 디아바디, 트리아바디, 미니바디, 나노바디, 및 적어도 폴리펩티드에 특이적인 항원 결합을 부여하기에 충분한 항체의 일부를 함유하는 폴리펩티드들; 및 상기의 융합체 및 유도체를 포함한다. 예를 들면, ([Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136 (2005)] 및 [Hust et al., BMC Biotech 7: 14 (2007)])을 참조한다.
"Fd 단편"은 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편이고; "Fv 단편"은 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 것이며; "scFv 단편"은 펩티드 링커로 연결된 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단일 쇄 항체이고; "scFab 단편"은 펩티드 링커에 의해 경쇄에 연결되기 어려운 단편(Fd: fragment difficult)을 포함하는 단일 쇄 항체이며; "scFabΔC" 단편은 시스테인을 포함하지 않는 scFab 변이체이고(예를 들면, [Hust et al., 상기 문헌 동일] 참조); 및 "dAb 단편"(단일 도메인 항체)은 단일 가변 도메인(예를 들면, VH 또는 VL 도메인)을 포함한다([Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)]). 추가로, 디아바디 및 트리아바디 또한 포함된다. 본 발명의 디아바디 및 트리아바디는 예를 들어, 동종이량체 및 이종이량체 디아바디 및 트리아바디를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시태양에서, 트리아바디를 구성하는 가변 도메인은 상이한 3개의 에피토프에 또는 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
달리 언급하지 않는 하거나, 문맥상 달리 암시하지 않는 경우에, 본 발명의 "항체"는 전항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편, 항체 접합체(즉, 기능적 부분에 접합되어 있거나, 그에 결합되어 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편)를 비롯한, 하나 이상의 변형(예를 들면, 아미노산 삽입, 결실, 치환, 번역후 변형 또는 그의 결핍 등)을 포함할 수 있는 항체 유도체 또는 변이체를 포함한다. 항체 접합체를 비롯한 항체 유도체는 CD154에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항원 결합 단편에 기초할 수 있거나, 그를 포함할 수 있다. 추가로, 상기 언급한 항체 실시태양은 뮤린, 햄스터, 염소, 토끼의 키메라 항체, 인간화된 항체, 또는 완전 인간 항체, 단편, 유도체, 또는 접합체일 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, "항체"라는 용어는 상기 언급한 항체 실시태양들 중 하나 이상을 제외시킬 수 있으며; 그러한 조건은 당업자에게 자명하다는 것을 이해할 것이다.
"페길화," "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"라는 용어는 커플링제를 포함 또는 포함하지 않거나, 커플링 또는 활성화 부분으로(예를 들면, 티올, 트리플레이 트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란으로, 또는 바람직하게는 말레이미드 부분, 예를 들면, PEG-말레이미드로) 이루어진 유도체화를 포함 또는 포함하지 않는 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 그의 유도체를 포함한다. 다른 적절한 폴리알킬렌 글리콜 화합물로는 말레이미도 모노메톡시 PEG, 활성화된 PEG 폴리프로필렌 글리콜 뿐만 아니라, 하기 유형의 하전된 중합체 또는 중성 중합체: 덱스트란, 콜로민산 또는 다른 탄수화물계 중합체, 아미노산 중합체, 및 비오틴 및 다른 친화성 시약 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"이펙터 기능"이라는 용어는 면역계 단백질 및/또는 세포와 결합할 수 있는, 항체의 Fc 또는 불변 영역의 기능 능력을 지칭한다. 이펙터 기능이 감소된 항체 및 그러한 항체를 조작하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고(예를 들면, WO 05/18572, WO 05/03175, 및 US 6,242,195 참조), 본원에도 추가로 상세히 기술되어 있다. 전형적인 이펙터 기능으로는 보체 단백질(예를 들면, 보체 단백질 C1q), 및/또는 Fc 수용체(FcR)(예를 들면, FcγRI, FcγRII, FcγRIIa, FcγRIII, 및/또는 FcγRIIIb)와 결합할 수 있는 능력을 포함한다. 상기 분자들 중 하나 이상에 결합할 수 있다는 것의 기능상의 결과로는 제한없이 옵소닌화, 포식작용, 항체 의존적 세포독성(ADCC), 보체 의존적 세포독성(CDC) 및/또는 이펙터 세포 조정을 포함한다. 이펙터 기능의 감소란, 비록 결합 친화도는 감소되었거나, 유사하거나, 동일하거나, 또는 증가되었어도 항체(또는 그의 단편)의 가변 영역의 항원 결합 활성은 유지하면서 적어도 부분적으로는 Fc의 동족 수용체에의, 또는 보체 단백질 또는 이펙터 세포에의 결합에 의해 생화학적 또는 세포 활성 중 하나 이상이 감소하는 것을 지칭 한다. 본 발명의 특정 항체는 감소된 이펙터 기능을 나타낸다. 이펙터 기능, 예를 들면, Fc 수용체 또는 보체 단백질에의 Fc 결합의 감소는 감소 배수(예를 들면, 1.5배, 2배 만큼 등의 감소)로 표시될 수 있고, 예를 들면, 당업계에 공지된(예를 들어, WO 05/18572) 결합 분석법을 사용하여 측정된 결합 활성의 감소율(%)에 기초하여 계산될 수 있다.
문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하여야 하고, 복수 용어는 단수를 포함하여야 한다.
본 명세서와 청구의 범위 전역에 걸쳐 "포함하다," 또는 그의 파생어인 "포함하다(comprise)," 또는 "포함하는"이라는 단어는 언급된 정수 또는 정수들의 군을 포함하나, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군을 배제시키지는 않는다는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
CD154
CD154는 예로서, CD40 리간드(CD40L: CD40 ligand), CD40 대응 수용체(CD40CR: CD40 counter receptor), gp39, T-BAM, T 세포 활성화 분자, TRAF, TNF 관련 활성화 단백질(TRAP: TNF-Related Activation Protein), 및 종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 5(TNFSF5: Tumor Necrosis Factor Ligand Superfamily Member 5)와 같이, 당업계에서 여러 다른 명칭으로 알려져 있다(([Gauchat et al., 1993 FEBS Lett. 315: 259-266]; [Graf et al. 1992, Europ. J. Immun. 22: 3191-3194]; [Hollenbaugh et al., 1992 EMBO J. 11: 4313-4321])). 이러한 용어들은 본 출원 전역에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 항체를 비롯한, CD154 결합 단백질은 인간 CD154에 특이적으로 결합하고, 다른 종의 CD154와 교차반응할 수 있고, 이로써 그에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체를 비롯한, CD154 결합 단백질은 인간 CD154, 마우스 CD154 또는 인간 이외의 영장류 CD154에 특이적으로 결합한다.
항 CD154 항체 및 CD154 결합 단백질
본원에서 사용되는 바, "항CD154 항체"라는 용어는 CD154 항원 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항CD154 항체는 천연 공급원으로부터, 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 무손상 면역글로불린일 수 있고, 무손상 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다.
따라서, 본 발명의 모든 실시태양 및 방법에서 지칭되는 바와 같이, "항CD154 항체"는 (달리 명시되지 않는 한, 또는 문맥상 달리 제시되지 않는 한) 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 뮤린 항체, 햄스터 항체, 염소 항체, 토끼 항체, 키메라 항체, 영장류화된 항체, 인간화된 항체, (완전) 인간 항체, 다량체 항체, 이종이량체 항체, 반이량체 항체, 2가, 3가, 또는 4가 항체, 이중특이성 항체, 단일 쇄 항체(예를 들면, scFv, scFab, 및 scFabΔC), 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, 단일 도메인 항체, 및 변형된 Fab 단편을 포함한다. 특정 실시태양에서, 항CD154 항체는 오직 단일 가변 면역글로불린 도메인만을 포함하는 항체이다. 따라서, 1가의 항체는 오직 하나의 면역글로불린 가변 도메인(즉, 단일의 가변 경쇄 또는 중쇄)만을 포함하고, CD154에 특이적으로 결합하는 항체를 포함 한다. 추가로, 본 발명의 항CD154 항체는 CD154에 대해 1가, 2가, 또는 다가일 수 있다.
특정 실시태양에서, 이펙터 기능이 감소된 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 CD154 항원에 대한 특이적인 결합을 유지하기에 충분한 항CD154 항체의 임의의 부분을 포함한다. 예를 들어, 항체는 오직 단일의 가변 면역글로불린 도메인 - VH 또는 VL 도메인만을 포함할 수 있다.
따라서, 특정 실시태양에서, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 예를 들어, Fab 단편, F(ab)2 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, F(ab')3, 단편, 단일 쇄 F(v) 단편 또는 F(v) 단편 및 상기 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편을 포함한다(예를 들어, [Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136] 참조). 본 발명의 항체 단편은 하기에 좀더 상세히 기술한다.
일례로, CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 천연 또는 변형된 힌지 영역을 갖는 항체(예를 들면, IgG4 서브유형의 항체) 또는 단편(예를 들면, Fab' 단편)이다. 다수의 변형된 힌지 영역이 예를 들면, US 5,677,425, WO 99/15549, 및 WO 98/25971에 기재되어 있다. 또다른 일례로, 본 발명의 항체는 WO 05/003169, WO 05/003170 및 WO 05/003171에 기재되어 있는 항체와 같이, 그의 불변 영역이 변형되어 있다. 상기 언급된 항CD154 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편 중 임의의 것이 본 발명의 항체 접합체를 형성하는데 사용될 수 있다. 상기 항체, 단편, 및 접 합체 중 임의의 것이 제2 항CD154 항체와 비교하여 감소된 이펙터 기능을 유도할 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의 부류(예로서, IgG, IgE, IgM, IgD 또는 IgA) 또는 서브부류일 수 있다. 항체의 불변 영역 도메인이 존재할 경우, 이는 항체 분자의 제안된 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히 인간 IgG 불변 영역 도메인, 특히 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4가 사용될 수 있다. IgG2 및 IgG4 이소형은, 항체 분자가 항체 이펙터 기능이 감소되거나 제거되는 것이 바람직한 치료학적 용도를 위한 것인 특정 실시태양에서 사용될 수 있다. 별법으로, IgG1 및 IgG3 이소형은, 항체 분자가 항체 이펙터 기능이 필요한 치료학적 용도를 위한 것일 때 사용될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항체의 CDR 중 하나 이상이 하나 이상의 면역글로불린 도메인, 범용 프레임워크, 단백질 스캐폴드 또는 면역글로불린 도메인 이외의 단백질 스캐폴드 또는 골격에 기초한 생체적합성 프레임워크 구조체 내로 혼입될 수 있다(([Nygren & Uhlen, 1997, Curr . Opin. Strural Biol. 7:463-469]; [Saragovi et al, 1992, Bio / Technology 10:773-779]; [Skerra, 2000, J. Mol Recognition 13:167-187])). 특정 실시태양에서, 항CD154 항체의 CDR은 범용 프레임워크(즉, 상이한 프레임워크들의 다량의 수집물이 원래 유지하고 있는 기능, 특이성, 또는 성질을 완전히 변화시키는데 사용될 수 있는 프레임워크, U.S. 6,300,064 참조) 내로 혼입된다. 다른 실시태양에서, 대체 스 캐폴드(예를 들어, ([Binz et al. 2005 Nat Biotech 23: 1257-1268] 및 [Hosse et al. 2006 Protein Science 15: 14-27]))는 본 발명의 CD154 결합 단백질을 생성하는데 사용될 수 있다.
"항CD154 항체"라는 용어는 또한 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 합성 항체 또는 재조합 항체, 예로서, 박테리오파지에 의해 발현된 항체를 포함한다. "항CD154 항체"라는 용어는 또한 항체를 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체로서, 상기 DNA 분자는 항체 단백질, 또는 항체를 지정하는 아미노산 서열을 발현하고, 여기서, DNA 또는 아미노산 서열은 당업계에서 이용가능하며 잘 알려져 있는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용함으로써 수득된 것인 항체를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 모노클로날 항체인 "항CD154 항체"를 제공한다. 모노클로날 항체는 실질적으로 동종인 항체들의 군집으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 군집을 포함하는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하면 동일한 것이다. "모노클로날"이라는 수식어구는 실질적으로 동종인 항체 군집으로부터 수득되었는 바, 이러한 항체의 특징을 지시하는데, 이는 임의의 특정 방법에 의해 항체를 생산하여야 하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마(뮤린 또는 인간) 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들면, US 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들면, ([Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J Mol . Biol., 222:581-597 (1991)])에 기재된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양은 CD154에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 상이한 모노클로날 항체를 포함하는 조성물, 즉, 상이한 에피토프 특이성을 갖는 다수의 모노클로날 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 조성물에 관한 것으로도 여겨진다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, "항CD154 항체"는 키메라 항체, 또는 항체 유도체 또는 접합체 또는 그의 항원 결합 단편인 항체를 지칭한다. 전형적으로, 키메라 항체는 또다른 종(전형적으로 인간)의 불변 영역에 융합된 하나의 종(전형적으로 마우스)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역(CDR 및 프레임워크 잔기, 둘 모두를 포함)을 포함한다. 이들 키메라 마우스/인간 항체는 대략 75%의 인간 아미노산 서열과 25% 마우스 아미노산 서열을 함유한다. 인간 서열은 항체의 불변 영역을 나타내는 반면, 마우스 서열은 항체의 가변 영역(및 따라서, 항원 결합 부위를 함유)을 나타낸다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체인 CD154 결합 단백질은 하나의 항체로부터는 프레임워크 영역을, 그리고 또다른 항체로부터는 CDR 영역을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 항체, 항체 유도체 및 항원 결합 단편을 포함한다.
더욱 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체는 상이한 인간 항체로부터 유래된 프레임워크 영역 및 CDR 영역을 포함하는 키메라 항체를 포함한다.
상기 기술된 모든 키메라 항체를 제조하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, (US 5,807,715; [Morrison et al. (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81(21):6851-5]; [Sharon et al. (1984) Nature 309(5966):364-7]; [Takeda et al. (1985) Nature 314(6010):452-4])을 참조한다.
본 발명의 특정 실시태양에서, CD154에 결합하는 항CD154 항체는 생체내 면역 반응 동안 고친화성 항체를 생산하는 세포를 임의의 종으로부터 단리시킬 수 있는 림프구 항체 선별 방법(SLAM)(([Babcook et al., 1996, Proc . Natl . Acad . Sci, 93, 7843-7848]; WO 92/02551; [de Wildt et al., 1997, J. Immunol . Methods, 207:61-67] 및 [Lagerkvist, et al., 1995, BioTechniques 18:862-869]))에 의해 생성된다. 다른 기법으로는 ([de Wildt et al., 1997, J. Immunol. Methods, 207:61-67] 및 [Lagerkvist et al., 1995, BioTechniques 18(5):862-869])에 기재되어 있는 것을 포함한다. 상기 방법은 개별 항체를 생산하는 세포를 단리시킨 후, 클론 확장시키고, 이어서, 항CD154 항체를 생산하는 상기 클론에 대해 스크리닝한 후, 이어서, 그의 가변 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 유전자의 서열을 동정하는 것에 의존한다. 특정 스크리닝 방법은 WO 04/051268에 설명되어 있다. 따라서, CD154에 대한 항체에 대해서 양성인 B 세포가 단리된다. B 세포는 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 염소, 또는 다른 포유동물 종으로부터 유래될 수 있다. 이들 B 세포에서 항체 유전자는 예를 들면, 종래 재조합 DNA 기술에 의해 숙주 세포에서 클로닝되고 발현될 수 있다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다. 다른 숙주 세포 들은 하기에 설명되어 있다. 이들 세포에서 발현된 항체(항체 단편, 예로서, Fab' 단편 포함)는 종래 수단에 의해 정제될 수 있다. 항체가 인간 이외의 공급원으로부터 유래된 경우, 이는 종래 방법에 의해, 예로서, 그들 유전자의 돌연변이화에 의해 인간화될 수 있다. 이어서, 인간화된 항체는 숙주 세포에서 발현될 수 있고, 정제될 수 있다.
모노클로날 항체는 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법, 예로서, 하이브리도마 기법([Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256:495-497]), 트리오마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법([Kozbor et al, Immunology Today, 1983, 4, 72]) 및 EBV-하이브리도마 기법([Cole et al, "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985])에 의해 제조될 수 있다. 재조합 항체를 생성하고 제작하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, US 4,816,397; US 6,331,415; [Simmons et al, 2002, Journal of Immunological Methods, 263, 133-147]; WO 92/02551; [Orlandi et al., 1989, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 86, 3833]; [Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323]; US 5,585,089; WO 91/09967; [Mountain and Adair, 1992, Biotechnol Genet . Eng . Rev, 10, 1-142]; [Verma et al., 1998, J. Immunol . Methods, 216:165-181]; [Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136] 참조).
본 발명의 항체는 또한 당업계에 알려져 있는 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있고, ([Brinkman et al., 1995, J. Immunol . Methods, 182:41-50]; [Ames et al., 1995, J. Immunol . Methods, 184, 177-186]; [Kettleborough et al. 1994, Eur . J. Immunol, 24, 952-958]; [Persic et al., 1997, Gene, 187, 9-18]; 및 [Burton et al., 1994, Advances in Immunol, 57, 191-280]; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; 및 WO 95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 및 5,969,108)에 개시된 것을 포함한다.
또한, 트랜스제닉(예를 들면, 유전공학처리된) 마우스, 또는 다른 포유동물을 비롯한 다른 유기체들이 본 발명의 결합 단백질 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있다(예를 들어 US 6,300,129 참조). 예를 들어, 마우스 면역 유전자좌의 가변 영역(중쇄 V, D, 및 J 세그먼트, 및 경쇄 V 및 J 세그먼트)만을 상응하는 인간 가변 서열로 대체시켜 공학처리된 마우스가 인간 가변 서열을 갖는 고친화성 항체를 대량 생산하는데 사용될 수 있다는 것이 알려져 있다(예를 들면, US 6,586,251; US 6,596,541, 및 US 7,105,348 참조).
본 발명의 또다른 실시태양에서, "항CD154 항체"는 영장류화된 또는 인간화된 항체, 항체 유도체 또는 접합체, 또는 항원 결합 단편을 지칭한다. 영장류화된 항체 및 인간화된 항체는 전형적으로 인간 이외의 영장류 또는 인간 항체 V 영역 프레임워크 내로 이식된, 일반적으로는 인간 불변 영역을 추가로 포함하는, 뮤린 항체로부터 유래된 중쇄 및/또는 경쇄 CDR을 포함한다. 예를 들면, [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327]; US 6,054,297; 5,821,337; 5,770,196; 5,766,886; 5,821,123; 5,869,619; 6,180,377; 6,013,256; 5,693,761; 및 6,180,370을 참조한다.
상기와 같은 영장류화된 항체 또는 인간화된 항체를 사용하는 근본적인 이유는 마우스 CDR이 부여한 마우스 항체의 (인간) 항원 특이성은 유지하기 위해서, 그러나, 가능한 많은 인간 프레임워크 서열을 사용함으로써 마우스 항체(마우스 항체는 마우스 이외의 다른 종에서는 상기 항체에 대한 면역 반응을 유발할 것이다)의 면역원성을 감소시키기 위해서이다. 그러한 항체는 원치않는 부작용, 예로서, 면역 반응을 최소화시키거나, 제거하기 위해 인간 요법에서 사용될 수 있다. 인간에서 면역원성이 감소된 동종의 인간 이외의 영장류 수용체 프레임워크 상에, 항원에 특이적인 인간 이외의 항체로부터 이식된 공여체 CDR을 포함하는 항체가 기재되어 있다(US 2005/0208625; US 2002/0062009; US 7,338,658)
따라서, 인간 이외의(예로서, 뮤린) 항체의 인간화된 형태는 인간 이외의 면역글로불린으로부터 유래된 서열과 인간 면역글로불린 서열을 함유하는, 특이적인 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편(예로서, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서브서열)이다. 대부분 인간화된 항체는, 수혜자 항체의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 유래된 잔기가, 원하는 특이성, 친화성 및 수용능을 갖는 인간 이외의 종(공여체 항체), 예로서, 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터 유래된 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이다. 몇몇 일례로, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 인간 이외의 FR 잔기에 의해 대체된다.
추가로, 인간화된 항체는 수혜자 항체에서도, 유입된 CDR 또는 FR 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 정련시키고 최적화시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 인간 이외의 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기가 인간 면역글로불린 공통 서열의 것인, 적어도 하나의 가변 도메인, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 수 있다. 인간화된 항체는 임의로는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다.
인간화된 항체(예를 들면, 항체 단편, 및 항체 유도체 또는 접합체를 포함)는 DNA 재조합 기술에 의해 생산될 수 있는데, 여기서, 항원 결합에 필요하지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄의 아미노산의 일부 또는 모두(예를 들면, 불변 영역 및 가변 도메인의 프레임워크 영역)가 인간 이외의 동족 항체의 경쇄 또는 중쇄로부터의 상응하는 아미노산을 치환시키는데 사용된다. 인간화된 항체를 제조하는 방법은 항체 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, (EP 239400; [Jones et al. (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327]; [Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536]; [Queen et al. (1989) Proc . Nat . Acad . Sci . USA 86:10029]; [Orlandi et al. (1989) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 86:3833]; US 6,180,370, 및 EP 519596(표면 잔기의 항체 버니어링(veneering)를 기재))을 참조한다.
따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 항CD154 항체는 인간 항체 상에 뮤 린 또는 래트(또는 인간 이외의 다른 종) CDR을 이식시켜 생성된 인간화된 항체(제한없이, 인간화된 항원 결합 단편 및 인간화된 항체 유도체 또는 접합체 포함)를 지칭한다. 더욱 특히 이러한 인간화는 하기와 같이 이루어진다: (1) 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 cDNA를, 항체를 분비하는 하이브리도마 또는 B 세포로부터 단리시키고; (2) CDR을 비롯한, 가변 도메인의 DNA 서열을 서열 분석하여 결정하고; (3) CDR을 코딩하는 DNA를 부위 지정 돌연변이유발법에 의해 인간 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 코딩 서열의 상응하는 영역으로 이전하고; (4) 원하는 이소형의 인간 불변 영역 유전자 세그먼트(예를 들면, CH의 경우, l 그리고 CL의 경우, k)를 첨가한다. 최종적으로, 인간화된 중쇄 및 경쇄 유전자를 포유동물 숙주 세포(예를 들면, CHO 또는 NSO 세포)에서 공동발현시켜 가용성 인간화된 항체를 생산한다.
때로는 CDR을 인간 프레임워크로 직접 이전하는 것이 생성된 결합 단백질 또는 항체의 항원 결합 친화도를 손실시킨다. 몇몇 동족 항체에 있어서 프레임워크 영역 내의 특정 아미노산이 CDR과 상호작용하고, 이에 따라 항체의 전반적인 항원 결합 친화도에 영향을 미치기 때문에 항원 결합 친화도 손실이 일어날 수 있다. 이러한 경우에, 동족 항체의 항원 결합 활성을 유지하도록 수용체 항체의 프레임워크 영역에 "역 돌연변이"를 도입하는 것이 중요하다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 역 돌연변이를 형성하는 일반적인 접근법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, ([Queen et al. (1989) Proc . Nat . Acad . Sci . USA 86:10029]; [Co et al. 1991. Proc . Nat . Acad . Sci . USA 88:2869-2873; WO 90/07861]; [Tempest 1991. Biotechnology 9: 266-271])을 참조한다. 본 발명의 항체에 대한 예시적인 역 돌연변이는 공여체 항목 하에 도 9에 도시되어 있는 잔기를 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 카멜리드 이외의 VH 도메인 또는 뮤린 면역글로불린 가변 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 항체 폴리펩티드는 인간 VH 도메인과 비교하여 카멜리드 면역글로불린 가변 도메인에 특이적인 하나 이상의 아미노산을 함유하지 않는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, "항CD154 항체"는 완전 인간 항체(항원 결합 단편 및 항체 유도체 또는 접합체 포함)를 지칭한다. 완전 "인간" 항체는 인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열(예를 들면, 인간 면역글로불린 코딩 서열로부터 수득된 것)을 갖는 항체 폴리펩티드 또는 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. "인간 항체"라는 용어는 예를 들어, 인간 생식 계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역(존재하는 경우)을 갖는 항체를 포함한다. 본원에서 항체이나 단편, 예로서, 가변 도메인에 적용되는 "인간"이라는 용어는 인간 불변 영역 서열을 항체 폴리펩티드 상에 이식시켜(즉, 인간 이외의 불변 영역을 인간 불변 영역으로 대체시켜), 또는 인간 V 영역 프레임워크 서열을 인간 이외의 포유동물로부터 유래된 면역글로불린 가변 도메인 상에 이식시켜(즉, 인간 이외의 V 도메인의 프레임워크 영역을 인간 프레임워크 영역으로 대체시켜) "인간화된" 또다른 종, 예를 들면, 마우스로부터 유래된 항체를 포함하지 않는다. 상보성 결정 잔기를 합리 적으로 변형시켜 면역글로불린 가변 영역을 인간화시키는 방법이 기재되어 있다(US 2006/0258852).
특정 실시태양에서, 인간 항체는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내 무작위 돌연변이 또는 부위 특이에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러므로, 특정 실시태양에서, 본 발명은 인간 생식 계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열, 또는 총괄적으로 인간 생식 계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 상기의 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 비교하여 5개 이하의 아미노산 차이를 포함하는 상기 프레임워크 영역 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 프레임워크 영역(예를 들면, FW1, FW2, FW3, 및/또는 FW4)을 갖는 가변 도메인을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다. 추가의 실시태양에서, 가변 도메인의 프레임워크 영역(FW1, FW2, FW3, 및 FW4)의 아미노산 서열은 인간 생식 계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일한 것이거나, FW1, FW2, FW3, 및 FW4의 서열은 총괄적으로 인간 생식 계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 상응하는 프레임워크 영역의 서열과 비교하여 10개 이하의 아미노산 차이를 함유한다. 예시적인 생식 계열 항체 유전자 세그먼트는 예를 들어, DP47, DP45, DP48, 및 DPK9(US 2006/0062784), 및 실시예 및 도에 기술되어 있는 수용체 프레임워크 서열을 코딩하는 세그먼트를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 인간 항체(항체 단편 또는 가변 도메인 서열 포함)는 자 연 발생 인간 항체와 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 87%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 이상의 서열 동일성 포함)을 갖는다.
완전 인간 또는 인간 항체는 인간 항체 유전자(가변(V), 다양성(D), 연결(J), 및 불변(C) 엑손 수반) 또는 인간 세포로부터 유래된 인간 V, D 및 J 영역을 수반하는, 트랜스제닉(예를 들면, 유전공학처리된, 예로서, 넉인) 마우스로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 이제는 면역화시 내인성 면역글로불린이 생산되지 못할 때에는 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전공학처리된 동물(예를 들면, 마우스)을 생산할 수 있다(예를 들면, [Jakobovits et al., PNAS, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33(1993)]; 및 [Duchosal et al. Nature 355:258 (1992)]) 참조). 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 유전자로부터 유래된 유전자 서열을 함유하도록 트랜스제닉 마우스 계통(예를 들면, 넉아웃, 넉인, 유전자 대체 등을 비롯한 유전공학처리된 마우스 계통)을 공학처리할 수 있다. 인간 서열은 인간 항체의 중쇄 및 경쇄, 둘 모두를 코딩할 수 있고, 재배열을 통해 인간에서와 유사한 광범위한 항체 레퍼토리를 제공함으로써 마우스에서 올바르게 작용할 것이다. 유전공학처리된 마우스를 표적 단백질(예를 들면, CD154, 그의 단편, 또는 CD154를 발현하는 세포)로 면역화시켜 특이적인 항체 및 그를 코딩하는 RNA의 다양한 어레이를 생성할 수 있다. 이어서, 상기 항체의 항체 쇄 성분들을 코딩하는 핵산을 동물로부터 디스플레이 벡터로 클로닝할 수 있다. 전형적으로, 중쇄 및 경쇄 서열을 코딩하는 별도의 핵산 군집을 클로닝하고, 이어서, 별도의 군집을 벡터 내 로 삽입부 상에서 재조합함으로써 임의의 주어진 벡터 카피는 중쇄 및 경쇄의 무작위 조합물을 수용하게 된다. 항체 쇄가 조립될 수 있고, 벡터를 함유하는 디스플레이 패키지 외부 표면 상에서 디스플레이될 수 있도록 하기 위해서 항체 쇄를 발현하도록 벡터를 디자인한다. 예를 들어, 항체 쇄는 파지의 외부 표면으로부터 유래된 파지 코트 단백질을 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이후, 디스플레이 패키지는 표적에 결합하는 항체의 디스플레이에 대하여 스크리닝될 수 있다.
추가로, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다(([Hoogenboom et al., J. Mol . Biol, 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol . Biol, 222:581-597 (1991)]; [Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)], US 6,300,064)). 합성 인간 항체 V-영역의 무작위화된 조합을 사용하는 합성 파지 라이브러리가 생성될 수 있다. 항원 상에서 선별함으로써 V-영역이 사실상 인간과 매우 유사한 완전 인간 항체를 제조할 수 있다. (US 6,794,132, 6,680,209, 4,634,666, 및 [Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2:361-367])를 참조한다.
인간 항체를 생성하는 경우에는 ([Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)], [Green and Jakobovits J. Exp . Med . 188:483-495 (1998)])도 참조한다. 인간 항체는 U.S. 5,939,598 및 6,673,986에 추가로 논의되어 있고, 서술되어 있다. 또한, U.S. 6,114,598, 6,075,181, 및 6,162,963도 참조한다. 또한, US 6,150,584, US 6,713,610, US 6,657,103, US 2003/0229905 A1, US 2004/0010810 A1, US 2004/0093622 A1, US 2006/0040363 A1, US 2005/0054055 A1, US 2005/0076395 A1 및 US 2005/0287630 A1도 참조한다. 또한, EP 0463151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, 및 WO 98/24893도 참조한다.
대체 접근법에서는 "미니유전자좌(minilocus)" 접근법을 사용하였다. 미니유전자좌 접근법에서는 외인성 Ig 유전자좌의 조각(개개의 유전자)을 포함시킴으로써 상기 Ig 유전자좌를 모방한다. 따라서, 동물 내로 삽입시킬 작제물 내로 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, 뮤 불변 영역, 및 제2 불변 영역(바람직하게는 감마 불변 영역)을 형성시킨다. 이러한 접근법은 예를 들면, US 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 및 5,643,763에 기재되어 있다. 또한, US 5,569,825, 5,877,397, 6,300,129, 5,874,299, 6,255,458, 및 7,041,871(상기 개시 내용 전문이 본원에서 참고로 인용된다)도 참조한다. 또한, EP 0546073, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, 및 WO 98/24884도 참조한다. 추가로, ([Taylor et al. (1992 Nuc . Acids . Res., 20: 6287)], [Chen et al. (1993 Int . Immunol . 5: 647)], [Tuaillon et al. (1993 PNAS USA . 90: 3720-4)], [Choi et al., (1993 Nature Genetics 4: 117)], [Lonberg et al. (1994 Nature 368: 856-859)], [Taylor et al. (1994 International Immunology 6: 579-591)], 및 [Tuaillon et al. (1995 J Immunol . 154: 6453-65)], [Fishwild et al. (1996 Nature Biotechnology 14: 845)], 및 [Tuaillon et al. (2000 Eur J Immunol. 10: 2998-3005)])을 참조한다.
본 발명의 더욱 특징적인 실시태양에서, 완전 인간 항체는 시험관내 감작 된(primed) 인간 비장세포[Boerner et al. 1991. J. Immunol. 147:86-95]를 사용하여 제조된다.
본 발명의 더욱 특징적인 실시태양에서, 완전 인간 항체는 레퍼토리 클로닝에 의해 제조된다([Persson et al. 1991. Proc . Nat . Acad . Sci . USA 88: 2432-2436]; [Huang and Stollar 1991. J. Immunol . Methods 141:227-236]). 추가로, US 5,798,230에는 인간 B 세포로부터 인간 모노클로날 항체를 제조하는 것에 대해 기재되어 있는데, 여기서, 인간 항체를 생산하는 B 세포는 불멸화에 필요한 단백질인 엡슈타인 바르 바이러스 핵 항원 2("EBNA2": Epstein-Barr virus nuclear antigen 2)를 발현하는 엡슈타인 바르 바이러스, 또는 그의 유도체로 감염시켜 불멸화시킨다. 이어서, EBNA2 기능을 차단하여, 항체 생산을 증가시킨다.
완전 인간 항체를 생산하기 위한 다른 방법은 비활성화된 내인성 Ig 유전자 좌를 갖고, 재배열되지 않은 인간 항체 중쇄 및 경쇄 유전자에 대해 트랜스제닉된 인간 이외의 동물을 사용하는 것을 포함한다. 상기 트랜스제닉 동물을 활성화된 T 세포 또는 D1.1 단백질로 면역화시킬 수 있고(US 5,474,771; 6,331,433; 및 6,455,044), 하이브리도마는 그로부터 유래된 B 세포로부터 생성될 수 있다. 이러한 방법에 대한 상세한 설명은 당업계에 설명되어 있다. 예로서, US 5,789,650을 비롯한, 인간 Ig 미니유전자좌를 함유하는 트랜스제닉 마우스에 관한 다양한 공개문헌/특허; US 6,075,181; 6,150,584; 및 6,162,963을 비롯한, 제노마우스(XENOMOUSE)? 마우스에 관한 다양한 공개문헌/특허; [Green, 1997, Nature Genetics 7:13-21]; [Mendez, 1997, Nature Genetics 15: 146-56]; 및 EP 843961 및 [Tomizuka, 1997, Nature Genetics 16: 1433-43]을 비롯한 "트랜소믹(transomic)" 마우스에 관한 다양한 공개문헌/특허를 참조한다.
본 발명의 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체는 또한 교차 차단하는 결합 단백질 또는 항체, 또는 본원에 기술된 항체 중 임의의 것과 동일한 에피토프에 결합하거나, 본원에 기술된 항체 중 임의의 것과 밀접한 관계에 있는 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합하는 결합 단백질 또는 항체에 관한 것이다. 교차 차단하는 결합 단백질 또는 항체는 본원에 기술된 항체 중 임의의 것을 경쟁적으로 저해시킬 수 있거나, 그의 결합을 경쟁적으로 차단할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13에 따른 중쇄 서열을 포함하고, 서열 번호 15에 따른 경쇄 서열을 포함하는 인간화된 항체(342 Fab 및 Fab' 단편)가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하고, 본원에 기술된 바와 같이, 항CD154 항체 5c8과의 경쟁 분석법에서 유사한 CD154 결합 성질을 나타내는 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 58에 따른 VL 도메인 서열, 및 서열 번호 60에 따른 VH 도메인 서열을 포함하는 인간화된 항체(338 항체 가변 서열)가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하고, 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 항CD154 항체 5c8과의 경쟁 분석법에서 유사한 CD154 결합 성질을 나타내는 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체를 제공한다.
본 발명의 특정 실시태양에서, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는 인간 CD154에 대하여 높은 친화도를 나타낸다. 예를 들어 특정 실시태양에서, CD154 결합 단백질은 표면 플라즈몬 공명(예를 들면, 비아코어?)에 의해 측정된 바, (50 nM과 1 pM을 포함하여) 50 nM 내지 1 pM 범위의 KD로 인간 CD154(인간 CD40L)로부터 해리된다. 예를 들어, 인간 CD154에 대한 KD는 25 nM 내지 1 pM, 10 nM 내지 1 pM, 5 nm 내지 1 pM, 1 nM 내지 1 pM, 0.5 nM 내지 1 pM, 0.1 nM 내지 1 pM, 75 pM 내지 1 pM, 50 pM 내지 1 pM, 20 pm 내지 1 pm, 또는 심지어는 10 pm 내지 1 pm일 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질은 표면 플라즈몬 공명(예를 들면, 비아코어?)에 의해 측정된 바, (500 pM과 1 pM을 포함하여) 500 pM 내지 1 pM 범위의 KD로 인간 CD154로부터 해리된다. 몇몇 실시태양에서, 인간 CD154에 대한 KD는 50 pM 미만이다. 예를 들어, 본 발명의 몇몇 실시태양에서, CD154 결합 단백질은 20 pM 미만의 KD로 인간 CD154로부터 해리된다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, CD154 결합 단백질은 10 pM 미만의 KD로 인간 CD154로부터 해리된다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질은 고친화도로 CD154에 결합하지만, CD40으로부터 결합된 CD154로 치환시키지는 못한다. 항체 친화도는 당업계에 공지된 방법에 의해 증진될 수 있다(예를 들면, [Clark et al. 2006 Protein Sci. 15(5): 949-60](상기 문헌에는 구조에 기반한 전산 디자인을 사용하여 항체 친화도를 증진시키는 것이 기재되어 있다), 및 [Chao et al. 2006 Nat Protoc 1:755-768](상기 문헌에는 효소 표면 디스플레이를 사용하여 원하는 성질을 갖는 scFv를 단리시키고, 공학처리하는 방법이 기재되어 있다)을 참조).
상기 언급된 CDR들 중 하나 이상을 함유하는 본 발명의 항체의 친화도를 향상시키는 것이 바람직할 경우, 친화도가 향상된 상기 항체는 CDR 유지[Yang et al., J. Mol . Biol , 254, 392-403, 1995], 쇄 셔플링[Marks et al, Bio/Technology, 10, 779-783, 1992], E. 콜라이 돌연변이 균주 사용[Low et al., J. Mol . Biol ., 250, 350-368, 1996], DNA 셔플링[Patten et al, Curr. Opin . Biotechnol, 8, 724-733, 1997], 파지 디스플레이[Thompson et al., J. Mol. Biol, 256, 7-88, 1996] 및 유성 PCR(sexual PCR)[Crameri, et al, Nature, 391, 288-291, 1998]을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 친화도 성숙 프로토콜에 의해 수득할 수 있다. 이러한 친화도 성숙 방법 모두가 [Vaughan et al. {Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998)]에 의해 논의되어 있다. 따라서, 본 발명은 또한 CD154에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체의 서열 변이체를 제공한다. 그러한 서열 변이체는 그의 서열 내에 하나 이상의 반보존적 또는 보존적 치환을 포함하고, 그러한 치환은 바람직하게는 폴리펩티드의 바람직한 활성에 유의적인 영향을 미치지 않는다. 치환은 자연 발생일 수 있거나, 예를 들면, 돌연변이유발법(예로서, [Hutchinson et al., 1978, J. Biol . Chem . 253:6551])을 사용하여 도입될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 대개 서로서로 치환될 수 있다(지방족 측쇄를 갖는 아미노산). 이들 가능한 치환 중 글리신 및 알라닌이 서로서로를 치환하는데 사용되고(이들은 상대적으로 짧은 측쇄를 갖기 때문이다), 발린, 류신 및 이소류신이 서로서로를 치환하는데 사용되는 것(이들은 소수성인 보다 큰 지방족 측쇄를 갖기 때문이다)이 바람직하다. 대개 서로서로를 치환하는데 사용될 수 있는 다른 아미노산으로는
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산);
- 리신, 아르기닌, 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황을 함유하는 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체의 결합 친화도는 또한 상대적인 의미로 기술될 수 있거나, CD154에 또한 특이적으로 결합하는 제2 항체(예를 들면, CD154에 특이적인 제2 항CD154 항체, 상기 항체는 본원에서 "제2 CD154 특이 항체"로서 지칭될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 제2 CD154 특이 항체 는 항체 5c8(US 5,474,771에 기재되어 있는 바와 같이, 수탁 번호 HB 10916 하에 ATCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 것) 또는 인간화된 5c8일 수 있다)의 결합 친화도와의 비교로 기술될 수 있다. 다른 실시태양에서, 제2 CD154 특이 항체는 본 발명의 항체, 예로서, 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 또는 402 중 임의의 것일 수 있다(도 12). 따라서, 본 발명의 특정 실시태양은 항체 5c8보다 더 큰 친화도로, 또는 항체 5c8의 KD보다 더 낮은 KD로 인간 CD154에 결합하는 항CD154 항체에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 또한 같은 몰 농도의 제2 CD154 특이 항체, 예로서, 5c8보다 더 큰 정도로 CD154 활성을 저해하 거나, CD154:CD40 상호작용을 차단한다. CD154:CD40 상호작용을 차단할 수 있는 항CD154 항체의 상대적인 능력은 예를 들면, 본원에 기술된 ICAM-1 상향조절 분석법 및 경쟁 결합 분석법과 같은 임의의 이용가능한 분석법에 의해 측정될 수 있다.
따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체 (항체 단편 및 유도체 포함)는 CD154가 CD40에 결합하는 것을 저해하는데 유용하며, 이는 높은 특이성으로, 예를 들면, (10 pM과 1.5 μM을 포함하여) 10 pM 내지 1.5 μM 범위의 IC50으로 상기와 같이 저해한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항체는 10 pm 내지 500 pm, 50 pm 내지 500 pm, 100 pm 내지 500 pm, 250 pm 내지 750 pm, 500 pm 내지 1 μM 또는 750 pm 내지 1.5 μM 범위의 IC50을 가질 수 있다. 추가의 실시태양에서, 항CD154 항체는 실질적으로 CD40 활성을 작용화시키거나, CD40 신호 전달을 활성화시키거나 하지는 않는다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 CD154 또는 CD40, 또는 이들 모두의 활성을 길항시킨다.
그러므로, 본 발명의 특정 실시태양은 제2 CD154 특이 항체(예를 들면, 항체 5c8 또는 인간화된 5c8)와 비교하여 그보다 크거나, 그와 동일한 친화도로, 또는 제2 CD154 특이 항체의 KD보다 더 작거나, 그와 동일한 KD로 인간 CD154에 결합하는 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체로, 여기서, 항CD154 항체는 제2 CD154 특이 항체와 비교하여 CD154:CD40 상호작용을 실질적으로 저해하지는 않는 것인 CD154 결합 단백질 및 항CD154 항체에 관한 것이다. 그러한 항체는 예를 들어, 결합 분석법 및 진단학적 시약으로서 유용할 수 있다. 인간 CD154에 대하여 높은 친화도를 나타내지만, 제2 CD154 특이 항체와 비교하여서는 더 낮은 정도로 CD154:CD40을 저해하는 항체의 예로는 본원에 기술된 항체 381 및 338이 있다. 예를 들어, 본 발명은 (예를 들어, 제2 CD154 특이 항체, 예로서, 인간화된 5c8과 비교하여) 더 높거나, 그와 동일한 친화도로 인간 CD154에 특이적으로 결합하지만, 제2 CD154 특이 항체가 차단한 것보다는 더 적은 정도로 CD154:CD40 상호작용을 차단하는 항CD154 항체를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 제2 CD154 특이 항체가 저해한 것보다 더 적은 정도로 CD154(CD40L)가 CD40에 결합하는 것을 저해하는 이들 항CD154 항체는 또한 실질적으로 CD40 활성을 작용화시키거나, CD40 신호 전달을 활성화시키거나 하지는 않는다. 예를 들어, 실시예 7에 기술되어 있는 시험관내 효능 분석에서 투여된 경우에 상기 항체는 대조군 치료법보다 통계학적으로 유의적인 길항작용을 나타내지 않을 수 있거나, 양성 대조군(예를 들면, CD154 리간드)과 비교하여 1%, 2%, 3%, 5%, 또는 10%의 길항작용을 나타낼 수 있다. [Vidalain et al. (The EMBO Journal (2000) 19: 3304-3313)] 및 [Pearson et al. (International Immunology (2001) 13 :273-283)]에는 CD40 신호 전달 경로가 기재되어 있고, 이는 또한 CD154:CD40 상호작용이 차단 또는 저해되는지 여부, 및 어느 정도까지 차단 또는 저해되는지를 측정하는데 사용될 수 있는 분석법을 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 CDR-H1(서열 번호 3), CDR-H2(서열 번호 4) 및 CDR-H3(서열 번호 5)으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다. 바람직하게, 항체는 CDR-H1(서열 번호 3), CDR-H2(서열 번호 4) 및 CDR-H3(서열 번호 5)으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR, 및 더욱 바람직하게는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 이들 3개 모두를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 CDR-L1(서열 번호 6), CDR-L2(서열 번호 7) 및 CDR-L3(서열 번호 8)으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 바람직하게, 항체는 CDR-L1(서열 번호 6), CDR-L2(서열 번호 7) 및 CDR-L3(서열 번호 8)으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR, 및 더욱 바람직하게는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 이들 3개 모두를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 항체는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3(서열 번호 3-5) 3개 모두, 및 CDR-L15 CDR-L2 및 CDR-L3(서열 번호 6-8) 3개 모두를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 항CD154 항체는 서열 번호 1, 9, 10 또는 11 중 어느 하나에 따른 가변 중쇄 서열을 포함하고, 서열 번호 2 또는 14에 따른 가변 경쇄 서열을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 CDR-H1(서열 번호 42), CDR-H2(서열 번호 43) 및 CDR-H3(서열 번호 44)으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다. 바람직하게, 항체는 CDR-H1(서열 번호 42), CDR-H2(서열 번호 43) 및 CDR-H3(서열 번호 44)으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR, 및 더욱 바람직하게는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 3개 모두를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 CDR-L1(서열 번호 45), CDR-L2(서열 번호 46) 및 CDR-L3(서열 번호 47)으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 바람직하게, 항체는 CDR-L1(서열 번호 45), CDR-L2(서열 번호 46) 및 CDR-L3(서열 번호 47)으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR, 및 더욱 바람직하게는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 이들 3개 모두를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 항체는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3(서열 번호 42-44), 3개 모두, 및 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3(서열 번호 45-47), 3개 모두를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 항CD154 항체는 서열 번호 56에 따른 가변 중쇄 서열을 포함하고/거나, 서열 번호 54에 따른 가변 경쇄 서열을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 CDR-H1(서열 번호 48), CDR-H2(서열 번호 49) 및 CDR-H3(서열 번호 50)으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다. 바람직하게, 항체는 CDR-H1(서열 번호 48), CDR-H2(서열 번호 49) 및 CDR-H3(서열 번호 50)으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR, 및 더욱 바람직하게는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 이들 3개 모두를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 CDR-L1(서열 번호 51), CDR-L2(서열 번호 52) 및 CDR-L3(서열 번호 53)으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 바람직하게, 항체는 CDR-L1(서열 번호 51), CDR-L2(서열 번호 52) 및 CDR-L3(서열 번호 53)으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR, 및 더욱 바람직하게는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 이들 3개 모두를 포함한다.
특정 실시태양에서, 항체는 각각 상기 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 상보적인 서열, 또는 상기 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 중 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함하는 상보적인 서열을 갖는다. 따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 CDR-H1(서열 번호 48), CDR-H2(서열 번호 49) 또는 CDR- H3(서열 번호 50), 및 CDR-L1(서열 번호 51), CDR-L2(서열 번호 52) 또는 CDR-L3(서열 번호 53)을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 항체는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3(서열 번호 48-50), 3개 모두, 및 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3(서열 번호 51-53), 3개 모두를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 항CD154 항체는 서열 번호 60에 따른 가변 중쇄 서열을 포함하고/거나, 서열 번호 58에 따른 가변 경쇄 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질은 서열 번호 62에 따른 경쇄 서열 및 서열 번호 65에 따른 중쇄 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질은 서열 번호 63에 따른 경쇄 서열 및 서열 번호 66에 따른 중쇄 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질은 서열 번호 68에 따른 경쇄 서열 및 서열 번호 71에 따른 중쇄 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질은 서열 번호 69에 따른 경쇄 서열 및 서열 번호 72에 따른 중쇄 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, CD154 결합 단백질은 서열 번호 68, 서열 번호 69, 서열 번호 71 또는 서열 번호 72에 따른 서열 중 하나를 포함한다.
본 발명은 또한 바람직하게는 본 발명의 CD154 결합 단백질과 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%의 동일성을 공유하는 CD154 결합 단백질을 제공한다. 더욱 바람직하게, CD154 결합 단백질은 적어도 95%, 96%, 97% 또는 98%의 동일성을 공유한다. 가장 바람직하게, CD154 결합 단백질은 본 발명의 CD154 결합 단백질과 적어도 99%, 99.5%, 99.9% 이상의 동일성을 공유한다. 본 발명의 CD154 결합 단백질은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 14, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58 또는 서열 번호 60의 가변 도메인, 또는 하나 이상의 그의 CDR과 적어도 85% 동일한 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양은 이중특이성 항체에 관한 것이다. 이중특이성 항체는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체로서, 적어도 2개의 상이한 항원에의 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이들은 단독으로 사용될 수 있거나, 폴리클로날 군집을 포함하는 조성물로 혼합될 수 있다. 본 발명에서, 결합 특이성 중 하나는 CD154 항원에 대한 것이며, 그 나머지 하나의 결합 특이성은 임의의 다른 항원, 및 바람직하게는, 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유니트에 대한 것이다. 예를 들어, 다른 결합 특이성은 인간 혈청 알부민(HSA: human serum albumin), TNFα, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-γ, CD2, CD4, CD8, CTLA4, LFA1, LFA3 및 VLA4 중 그로부터 선택되는 리간드에 대한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 항CD154 항체는 일반 리간드 결합 부위를 포함한다. 일반 리간드(예를 들면, 폴리펩티드)는 표적 리간드 특이성과는 상관없이 레퍼토리의 기능적 구성원에 결합할 수 있다. 그러므로, 일반 리간드는 레퍼토리의 기능적 구성원(예로서, 항체의 항원 결합 특이성과는 상관없이 항체 수집물 또는 항체 군)을 (예를 들여, 정제 및 스크리닝 공정에서와 같이) 동정하거나 선별하는데 사용될 수 있다. 일반 리간드로는 예를 들어, 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L 을 포함한다. 일반 리간드를 사용하여 파지 라이브러리의 구성원을 사전 선별하는 것은 WO 99/20749에 교시되어 있다.
항체 단편
본 발명은 또한 항원 결합 또는 에피토프 결합 항CD154 항체 단편에 관한 것이다. 항CD154 항체와 관련된 상기 기술된 모든 방법과 물질은 본 발명의 항CD154 항체 단편을 생산하고 사용하는데 유사하게 사용될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 항CD154 항체 단편은 헤테로머성 항체 복합체 및 항체 융합체, 예로서, 이중특이성 항체, 반이량체 항체, 다가 항체(즉, 4가 항체) 및 단일 쇄 항체를 포함한다. 반이량체 항체는 하나의 Fc 부분과 하나의 Fab 부분으로 구성된다. 단일 쇄 항체는 단일 단백질 쇄 중 단백질 스페이서에 의해 연결되는 가변 영역으로 구성된다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체 단편은 또한 하나 이상의 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄를 함유하는 단백질, 예로서, 이들 쇄의 단량체 및 동종다량체 또는 이종다량체(예로서, 이량체 또는 삼량체)를 포함하는데, 여기서, 이들 쇄는 임의로 디설피드 결합되어 있거나, 다르게는 가교결합되어 있는 것이다. 이들 항체는 하나 이상의 항원에 결합할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 전항체의 항원 결합 단편, 예로서, Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, F(ab')3, F(v), Fd, dAb, 디아바디, 미니바디, 및 나노바디 항체 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 오직 단일의 가변 도메인, 예로서, VH 또는 VL 도메인만을 포함하는 단편, 또는 중쇄 또는 경쇄 도메인만을 포함하는 단편에 관한 것이다. 단편은 인간화된 단편 또는 완전 인간 단편일 수 있다. 본 발명은 또한 대체 스캐폴드로부터 제조되거나(예를 들면, [Binz 상기 문헌 동일] 및 [Hosse 상기 문헌 동일] 참조), 또는 범용 프레임워크를 포함하는 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 예를 들면, 기능적 부분, 예로서, 캐리어 단백질 또는 PEG에 공유 또는 비공유적으로, 또는 직접 또는 간접적으로 접합된 CD154에 특이적으로 결합하는 임의의 항원 결합 단편 또는 CD154 결합 단백질을 포함하는 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 항CD154 항체는 2가 항체를 포함한다. 따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명은 공유 결합에 2개의 항체 중쇄 및 적어도 하나의 중합체 분자를 포함하는데, 상기의 각 중쇄는, 하나의 쇄 중 시스테인 잔기의 황 원자를 다른 나머지 하나의 쇄 중 시스테인 잔기의 황 원자에 연결시키는 적어도 하나의, 디설피드 결합 이외의 쇄간 브릿지에 의해 다른 나머지 중쇄에 공유적으로 연결되고, 상기의 시스테인 잔기는 각 쇄의 가변 영역 도메인의 바깥쪽에 위치하며, 적어도 하나의 디설피드 결합 이외의 쇄간 브릿지가 공유적으로 연결된 중합체 분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 2가 항CD154 항체 단편에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바, "디설피드 결합 이외의"라는 용어는 예로서, 보통 항체에서 발견되는 유형의 S-S 브릿지를 제외한 것을 의미하고자 한다. 그러나, 본 발명에 따른 단편에 존재하는 쇄간 브릿지 유형은 이하 기술하는 바와 같이 여전히 -S-S- 결합에 의해 중쇄에 연 결될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 2가 항체 단편 중의 각 중합체 분자는 쇄간 브릿지의 일부를 형성한다. 각각의 결합이 2개의 중쇄를 연결시키는 역할을 하고, 각각 쇄에서는 시스테인 잔기의 황 원자에 공유적으로 연결될 것이다. 공유 결합은 일반적으로 디설피드 결합일 것이며, 또는 특정 실시태양에서는 황-탄소 결합일 것이다. 예시적인 2가 항체 구조체의 경우, WO 99/64460 및 WO 05/061005를 참조한다.
본 발명은 또한 1가의 항체 또는 1가의 항원 결합 단편인 항CD154 항체를 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "1가"라는 용어는 주어진 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들면, Fv, 단일 쇄 scFv, dAb, Fab, Fab', Fd, scFab, scFabΔC 등)이 그의 표적 중 오직 단일의 분자에만 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 자연 발생 항체는 각각이 VH 및 VL 도메인을 포함하는 2개의 기능성 항원 결합 암을 갖는다는 점에서 일반적으로는 2가이다. 2가 항체는 입체 장애가 문제가 되지 않는다면 동일 항원의 2개의 별개 분자에 결합할 수 있다. 그와 대조적으로, "1가" 항체는 표적에 대하여 하나의 항원 결합 부위를 갖는다. 1가의 항체의 항원 결합 도메인은 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있거나, 각각, 상응하는 VL 또는 VH 도메인 필요없이도 CD154에 결합할 수 있는 능력을 갖는, 오직 단일의 면역글로불린 가변 도메인, 즉, VH 또는 VL 도메인만을 포함할 수 있다. 그러한 1가의 항체의 예로는 단일의 면역글로불린 가변 도메인을 포함하고, 오직 하나의 CD154 항원 분자에 결합할 수 있는 Fd 단편이 있다. 1가의 항체에는 단일 항원의 분자와 가교 결합할 수 있는 능력이 없다.
본 발명은, 각각 서열 번호 12 또는 13에 따른 중쇄 서열과 서열 번호 15에 따른 경쇄 서열을 포함하는 인간화된 Fab 또는 Fab' 단편이 특이적으로 결합하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항CD154 항체를 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 1, 9, 10 또는 11에 따른 가변 중쇄 서열과 서열 번호 2 또는 14에 따른 가변 경쇄 서열을 포함하는 항체 단편이다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 12 또는 13에 따른 중쇄 서열과 서열 번호 15에 따른 경쇄 서열을 포함하는 항체 단편이다.
특정 실시태양에서, CD154 결합 단백질 또는 항체는 서열 번호 15의 경쇄 서열 및 서열 번호 13의 중쇄 서열을 포함하거나, 그로 구성된다. 특정 실시태양에서, CD154 결합 단백질 또는 항체는 서열 번호 15의 경쇄 서열 및 서열 번호 12의 중쇄 서열을 포함하거나, 그로 구성된다.
대체 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 56에 따른 가변 중쇄 서열을 포함하고, 서열 번호 54에 따른 가변 경쇄 서열을 포함하는 항체 단편을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 60에 따른 가변 중쇄 서열을 포함하고, 서열 번호 58에 따른 가변 경쇄 서열을 포함하는 항체 단편이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 CD154에 특이적으로 결합하는 Fab' 또는 F(ab')2 또는 F(ab')3 단편을 제공한다. 이러한 Fab' 또는 F(ab')2 또는 F(ab')3 단편은 인간화된 단편일 수 있고, 서열 번호 13의 서열을 포함하거나, 그로 구성된 중쇄 서열을 가질 수 있고, 서열 번호 15의 서열을 포함하거나, 그로 구성된 경쇄 서열을 가질 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 Fc 도메인이 없는 항CD154 항체에 관한 것이다. 그러한 Fc가 부족한 항체 또는 단편은 1가, 2가, 또는 추가로 다가일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기술된 Fab' 또는 F(ab')2 또는 F(ab')3 단편이 특이적으로 결합하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 이러한 항체 또는 항체 단편은 본원(실시예 9)에 기술되어 있는 교차 차단 분석법에 의해 동정될 수 있다. 이러한 항체 또는 항체 단편은 단리된, 재조합 또는 합성된 것일 수 있거나, 제2 분자에 결합하여 항체-접합체를 형성할 수 있다.
이펙터 기능이 감소된 항체
항체 및 항체-항원 복합체와 면역계 세포가 상호작용하면 다양한 반응을 일으키는데, 본원에서는 이를 이펙터 기능이라 지칭한다. IgG 항체는 세포 표면 Fcγ 수용체 패밀리의 구성원 및 보체계의 C1q에 결합함으로써 면역계의 이펙터 경로를 활성화시킨다. 군집된 항체에 의해 이펙터 단백질이 결찰되면 염증성 사이토카인 방출, 항원 생산 조절, 세포내이입 및 세포 사멸을 비롯한, 다양한 반응이 일어난다. 몇몇 임상적 적용에 있어서, 이러한 반응은 모노클로날 항체 효능에 중요하다. 반면 다른 경우에는 염증 및 항원 수반 세포의 제거와 같은 원치않는 부작용을 일으킨다. 따라서, 본 발명은 추가로 이펙터 기능이 변경된, 예를 들면, 감소된 CD154 결합 단백질(항체 포함)에 관한 것이다. 중요한 것은, 감소된 이펙터 기능이 반드시 CD154-CD40 상호작용을 차단함으로써 하나 또는 수개의 질환을 저해할 수 있는 항CD154 항체의 능력을 감소시킨다는 것은 아니다(WO 05/03175(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다) 참조).
이펙터 기능(예를 들면, Fc 매개된 이펙터 기능; 하기 참조)이 감소된 항CD154 항체는 특히 바람직하지 못한 혈전색전성 활성의 가능성이 존재하는 피험체에서 사용하기에 바람직할 수 있다. 추가로, 항CD154 항체의 감소된 이펙터 기능은 예로서, CD154를 발현하도록 유도된, 활성화된 T 세포 및 다른 세포 군집의 결손 또는 Fc에 의존하는 단핵구/대식세포의 활성화와 같은, 항CD154 항체 요법의 바람직하지 못한 다른 잠재적인 부작용을 감소시키거나, 제거할 수 있다.
본 발명의 항CD154 항체의 이펙터 기능은 다수의 공지된 분석법들 중 하나를 사용하여 측정할 수 있다. 항CD154 항체의 이펙터 기능은 제2 항CD154 항체와 비교하여 감소될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 제2 항CD154 항체는 CD154에 특이적으로 결합하는 임의의 항체일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 제2 항CD154 항체는 항체 5c8(US 5,474,771에 기재되어 있는 바와 같이, 수탁 번호 HB 10916하에 ATCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 것) 또는 인간화된 5c8일 수 있다. 다른 실시태양에서, 제2 CD154 특이 항체는 본 발명의 항체, 예로서, 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 또는 402 중 임의의 것일 수 있다(도 12). 다른 실시태양에서, 관심의 대상이 되는 항CD154 항체가 이펙터 기능의 감소를 위해 변형된 것일 경우, 제2 항CD154 항체는 변형되지 않은 항체이거나, 모체 버전의 항체일 수 있다.
본 발명의 항CD154 항체의 이펙터 기능은 또한 예를 들면, 항CD154 항체로 처리함으로써 유발된 혈소판 응집 또는 활성화 수준을 대조군 항체와 비교하여 측정함으로써 측정할 수 있다. 그러므로, 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 표준 혈소판 응집 또는 활성화 분석법에서 혈소판 응집 또는 활성화를 매개하지 않거나, 증진시키지 않는다. 다른 실시태양에서, 항CD154 항체는 제2 항CD154 항체(예를 들면, 5c8 또는 인간화된 5c8)와 비교하여 혈소판 응집 또는 활성화를 더 낮은 수준으로 매개한다.
예시적인 이펙터 기능으로는 Fc 수용체 결합, 포식작용, 아포프토시스, 염증전 반응, 세포 표면 수용체(예로서, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절 등을 포함한다. 다른 이펙터 기능으로는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)(이에 의해 항체는 세포독성 T 세포, 자연 살세포(NK: natural killer), 또는 세포를 사멸시키는 대식세포 상의 Fc 수용체에 결합한다), 및 보체 의존적 세포독성(CDC)(이는 보체 캐스캐이드의 활성화에 의해 유도되는 세포 사멸이다)을 포함한다(([Daeron, Annu. Rev . Immunol . 15:203-234 (1997)]; [Ward and Ghetie, Therapeutic Immunol . 2:77-94 (1995)]; 및 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev . Immunol. 9:457-492 (1991)])에서 리뷰됨). 그러한 이펙터 기능을 위해서는 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들면, 항체 가변 도메인)과 결합하여야 하며, 이는 당업계에 공지되어 있는 표준 분석법을 사용하여 평가될 수 있다(예를 들면, WO 05/018572, WO 05/003175, 및 U.S. 6,242,195 참조).
이펙터 기능은 Fc 도메인이 없는 항체 단편, 예로서, Fab, Fab'2, 또는 단일 쇄 Fv의 사용으로 방지할 수 있다. 대안으로, FcγRI에는 결합하지만, C1q 및 Fcγ RII 및 RIII에는 불충분하게 결합하는 IgG4 서브유형 항체를 사용하는 것이 있다. IgG2 서브유형은 또한 Fc 수용체에의 결합을 감소시키지만, FcγRIIa의 H131 동종이형, 및 C1q에 대한 유의적인 결합은 유지한다. 따라서, Fc 수용체 모두, 및 C1q에의 결합을 제거하기 위해서는 Fc 서열이 추가로 변형되어야 한다.
ADCC를 비롯한 수개의 항체 이펙터 기능은, 항체의 Fc 영역에 결합하는 Fc 수용체(FcR)에 의해 매개된다. 특정 FcR에 대한 항체의 친화도, 및 따라서, 항체에 의해 매개되는 이펙터 활성은 아미노산 서열을 변경하고/거나, 항체의 Fc 및/또는 불변 영역을 번역후에 변형시킴으로써 조정될 수 있다.
FcR은 면역글로불린 이소형에 대한 그의 특이성에 의해 정의된다; IgG 항체에 Fc 수용체는 FcγR로서, IgE의 경우에는 FcεR로서, IgA의 경우에는 FcαR 등으로서 지칭된다. FcγR은 3개의 서브부류: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)으로 동정되었다. FcγRII 및 FcγRIII, 둘 모두 2개의 유형: FcγRIIA(CD32) 및 FcγRIIB(CD32); 및 FcγRIIIA(CD16a) 및 FcγRIIIB(CD16b)을 갖는다. 각각의 FcγR 서브부류가 2개 또는 3개의 유전자에 의해 코딩되기 때문에, 그리고, 선택적인 RNA 스플라이싱을 통해 다수의 전사체가 형성되기 때문에 매우 다양한 FcγR 이소폼이 존재한다. 예를 들어, FcγRII(CD32)는 이소폼 IIa, IIb1, IIb2, IIb3, 및 IIc를 포함한다.
FcγR에 대한 인간 및 뮤린 항체 상의 결합 부위는 잔기 233-239(([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)], [Woof et al. Molec. Immunol. 23:319-330 (1986)]; [Duncan et al. Nature 332:563 (1988)]; [Canfield and Morrison, J Exp . Med . 173:1483-1491 (1991)]; [Chappel et al., Proc. Natl . Acad . Sci USA 88:9036-9040 (1991)])에서와 같은 EU 인덱스 번호화)로 구성된 소위 "하부 힌지 영역(lower hinge region)"으로 이전에 지도화되었다. 잔기 233-239 중, P238 및 S239가 결합에 관여할 가능성이 있는 것으로 언급되었다. FcγR에의 결합에 관여할 가능성이 있는 것으로 이전에 언급된 다른 영역은 인간 FcγRI에 대한 G316-K338(인간 IgG)(오직 서열 비교에 의해서만; 치환 돌연변이체는 평가되지 않음)[Woof et al. Molec Immunol. 23:319-330 (1986)]; 인간 FcγRIII에 대한 K274-R301(인간 IgG1)(펩티드에 기초함)[Sarmay et al. Molec . Immunol. 21:43-51 (1984)]; 및 인간 FcγRIII에 대한 Y407-R416(인간 IgG)(펩티드에 기초함)([Gergely et al. Biochem. Soc. Trans. 12:739-743(1984)] 및 [Shields et al. J Biol Chem 276: 6591-6604 (2001)], [Lazar GA et al. Proc Natl Acad Sci 103: 4005-4010 (2006)])이다. FcR 결합에 관여하는 이런 저런 아미노산 잔기 신장부 또는 영역은 Ig-FcR 복합체의 결정 구조체 조사로부터 당업자에게 명백해질 수 있다(예를 들면, [Sondermann et al. 2000 Nature 406(6793):267-73] 및 [Sondermann et al. 2002 Biochem Soc Trans. 30(4):481-6] 참조). 따라서, 본 발명의 항CD154 항체는 상기 언급된 잔기에 하나 이상의 변형을 포함한다.
mAb 이펙터 기능을 감소시키는 공지된 다른 접근법으로는 이펙터 결합 상호작용에 관여하는, mAb 표면 상에 있는 아미노산을 돌연변이화시키는 것([Lund, J., et al. (1991) J. Immunol. 147(8):2657-62]; [Shields, R. L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(9): 6591-604]); 및 상이한 서브유형 서열 세그먼트 조합물(예를 들면, IgG2 및 IgG4 조합물)을 사용하여 서브유형 중 어느 하나만을 단독으로 사용하였을 때보다 Fcγ 수용체에의 결합을 더 크게 감소시키는 것([Armour et al., Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-1624; Mol . Immunol. 40 (2003) 585-593])을 포함한다.
몇몇 또는 모든 Fc 수용체 서브유형에 대한 친화도가 변경되거나/되고 감소된(및 따라서 이펙터 기능이 변경되거나/되고 감소된) 다수의 Fc 변이체가 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, US 2007/0224188; US 2007/0148171; US 2007/0048300; US 2007/0041966; US 2007/0009523; US 2007/0036799; US 2006/0275283; US 2006/0235208; US 2006/0193856; US 2006/0160996; US 2006/0134105; US 2006/0024298; US 2005/0244403; US 2005/0233382; US 2005/0215768; US 2005/01 18174; US 2005/0054832; US 2004/0228856; US 2004/132101;US 2003/158389를 참조한다; 또한, US 7,183,387; 6,737,056; 6,538,124; 6,528,624; 6,194,551; 5,624,821; 5,648,260도 참조한다.
CDC에서 항체-항원 복합체가 보체와 결합하면 보체 캐스캐이드는 활성화되고, 막 공격 복합체가 생성된다. 보체계의 제1 성분(C1q)이, 항체의 동족 항원에 결합되어 있는 (적절한 서브부류의) 항체에 결합하면 고전적 보체 경로의 활성화가 개시된다; 따라서, 보체 캐스캐이드의 활성화는 부분적으로는 C1q 단백질에 대한 면역글로불린의 결합 친화도에 의해 조절된다. 보체 캐스캐이드를 활성화시키기 위해서는 C1q가 IgG1, IgG2, 또는 IgG3 중 적어도 2개의 분자에 결합하는 것이 필요 하지만, 항원 표적에 부착된 IgM의 단 하나의 분자에 결합하는 것이 필요하다[Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995) p. 80]. 보체 활성화를 평가하기 위하여 예를 들면, [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163(1996)]에 기재되어 있는 바와 같이 CDC 분석을 실시할 수 있다.
CH2 도메인 상의 Glu318, Lys320 및 Lys322 잔기, 동일한 베타 스트랜드에 근접하게 위치한 선회부 상에 위치하는 아미노산 잔기 331, 하부 힌지 영역에 위치하는 Lys235 및 Gly237 잔기, 및 CH2 도메인의 N 말단 영역에 위치하는 잔기 231 내지 238을 비롯한, IgG 분자의 다양한 잔기가 C1q에의 결합에 관여하는 것으로 제안되었다(예를 들면, [Xu et al., J. Immunol. 150:152A (Abstract) (1993)], WO 94/29351; [Tao et al, J. Exp . Med ., 178:661-667 (1993)]; [Brekke et al., Eur. J. Immunol, 24:2542-47 (1994)]; [Burton et al; Nature, 288:338-344 (1980)]; [Duncan and Winter, Nature 332:738-40 (1988)]; [Idusogie et al., Immunol 164: 4178-4184 (2000)]; U.S. 5,648,260, 및 U.S. 5,624,821 참조). IgG1에서의 일례로서 인간 IgG1의 CH2 도메인의 COOH 말단 영역내 2개의 돌연변이-K322A 및 P329A-는 CDC 경로를 활성화시키지 못하며, C1q 결합을 100배 초과로 감소시키는 것으로 나타났다(US 6,242,195).
따라서, 본 발명의 특정 실시태양에서, 본원에서 제공하는 CD154 항체의 CDC 활성을 감소시키기 위해 이들 잔기 중 하나 이상이 변형, 치환 또는 제거될 수 있거나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 추가의 활성화 면역 반응의 가능성을 감소시키거나 제거하기 위해서는 대상 항 체의 이펙터 기능(들)을 감소시키거나 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 이펙터 기능이 감소된 항체는 또한 항체를 받은 피험체에서 혈전색전성 사례의 위험을 감소시킬 수 있다.
특정 다른 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 FcR 수용체에의 결합은 감소되었지만, 보체에 결합할 수 있는 능력을 유지하는(예를 들면, 천연 항CD154 항체, 변이체 이외의 항CD154 항체, 또는 모체 항CD154 항체와 유사한 정도로, 또는 몇몇 실시태양에서는 그보다 더 적은 정도로 유지하는) 항CD154 항체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 항CD154 항체는 FcR, 예로서, FcγRIIa(예를 들면, 혈소판 상에서 발현되는 FcγRIIa)에의 결합은 감소를 보이면서, 보체에 결합하고 그를 활성화시킬 수 있다. FcγRIIa(예를 들면, 혈소판 상에서 발현되는 FcγRIIa)에의 결합이 감소되어 있거나, 그에 결합하지는 않지만, 적어도 어느 정도는 C1q에 결합하고 보체 캐스캐이드를 활성화시킬 수 있는 상기 항체는 아마도 바람직한 이펙터 기능은 유지시키면서 혈전색전성 사례의 위험은 감소시킬 것이다. 대체 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 하나 이상의 FcR에의 결합은 감소를 보이지만, 하나 이상의 다른 FcR에 결합할 수 있는 능력은 유지한다. 예를 들면, FcRI, FcRII, 및/또는 FcRIII에의 결합이 감소된 항체를 생성하는 다양한 아미노산 변형 뿐만 아니라, 하나의 FcR에의 결합은 증가시키지만, 또다른 FcR에의 결합은 감소시키는 아미노산 치환에 관해 기재하고 있는 US 2007-0009523, 2006-0194290, 2005-0233382, 2004-0228856, 및 2004-0191244를 참조한다.
따라서, 항CD154 항체의 불변 영역이 관여하는 이펙터 기능은 불변 영역, 및 특히 Fc 영역의 성질을 변경시킴으로써 조정될 수 있다. 특정 실시태양에서, 이펙터 기능이 감소된 항CD154 항체는, 이펙터 기능을 가지며, 이펙터 기능을 매개하는 천연 불변 또는 Fc 영역을 포함하는 변이체 이외의 항체, 천연 항체, 또는 모체 항체(예를 들면, 항체 342 또는 항체 5c8(이는 US 5,474,771에 기재되어 있다))일 수 있는 제2 항체와 비교된다. 특정 실시태양에서, 이펙터 기능 조정은 활성이 파괴되거나, 완전히 존재하지 않게 되는 경우를 포함한다.
천연 서열 Fc 또는 불변 영역은 자연 상태에서 발견되는 Fc 또는 쇄 불변 영역과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 상대적인 이펙터 기능을 평가하기 위해 사용되는 대조군 분자는 시험 또는 변이체 항체가 포함하는 것과 동일한 유형/서브유형의 Fc 영역을 포함한다. 변이체 또는 변경된 Fc 또는 불변 영역은 적어도 하나의 아미노산 변형(예로서, 번역후 변형, 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실)에 의해 천연 서열 중쇄 영역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 변이체 불변 영역은 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 함유함으로써 번역후 변형을 변경, 예를 들면, 글리코실화 패턴을 변경시킬 수 있다. 모체 항체 또는 Fc 영역은 예를 들면, 이펙터 기능이 변경된, 예를 들어, 감소된 불변 영역(즉, Fc)을 작제하기 위해 사용되는, 정상적인 이펙터 기능을 갖는 변이체이다.
이펙터 기능(들)이 변경된(예를 들면, 감소 또는 제거된) 항체는 변이체 불변, Fc, 또는 중쇄 영역으로 항체를 공학처리하거나 생산함으로써 생성할 수 있다. 재조합 DNA 기술 및/또는 세포 배양 및 발현 조건을 사용하여 기능 및/또는 활성이 변경된 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 사용하여 이펙터 기능을 비롯한 항체 기능에 영향을 주는 영역(예로서, Fc 또는 불변 영역)내 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 공학처리할 수 있다. 별법으로, 번역후 변형, 예로서, 글리코실화 패턴(하기 참조)은, 그에 의해 항체가 생산되는 숙주 세포 및 세포 배양 및 발현 조건을 조작함으로써 변화시킬 수 있다.
아미노산 변경, 예로서, 아미노산 치환은 항원 결합 친화도에는 영향을 주지 않으면서 본 발명의 항CD154 항체의 이펙터 기능을 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 기술된 아미노산 치환(예를 들면, Glu318, Kys320, Lys332, Lys235, Gly237, K332, 및 P329)을 사용하여 이펙터 기능이 감소된 항체를 생성할 수 있다.
다른 실시태양에서, 아미노산 치환은 중쇄 불변 영역의 하기 아미노산 잔기: 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 및 322 중 하나 이상에 대하여 이루어질 수 있다(US 5,624,821 및 US 5,648,260 참조). 그러한 치환은 항원 결합 활성은 유지시키면서 이펙터 기능을 변경시킬 수 있다. 아미노산 234, 235, 236, 및 237 중 하나 이상이 변경되면 FcγRI 수용체에 대한 Fc 영역의 결합 친화도는 변형되지 않은 항체 또는 변이체 이외의 항체와 비교하여 감소할 수 있다. 아미노산 잔기 234, 236, 및/또는 237은 알라닌으로 치환될 수 있으며, 예를 들어, 아미노산 잔기 235는 글루타민으로 치환될 수 있고, 예를 들어. 또다른 실시태양에서, 항CD154 IgG1 항체는 234번 위치의 Leu가 Ala로 치환된 것, 235번 위치의 Leu가 Glu로 치환된 것, 및 237번 위치의 Gly가 Ala로 치환된 것을 포함할 수 있다.
추가로, 또는 별법으로, 318, 320, 및 322에 있는 Fc 아미노산 잔기가 변경 될 수 있다. 마우스 및 인간 IgG에서 고도로 보존되는 것인 이들 아미노산 잔기가 보체 결합을 매개한다. 이들 아미노산 잔기를 변경시키면 C1q 결합은 감소하지만, 항원 결합, 단백질 결합, 또는 마우스 대식세포에 결합할 수 있는 Fc의 능력은 변경되지 않는 것으로 나타났다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 이펙터 기능을 감소 또는 제거하는 치환을 포함하는 IgG4 면역글로불린이다. 본 발명의 항CD154 항체의 IgG4 Fc 부분은 하기 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 잔기 233에 있는 글루타메이트가 프롤린으로 치환된 것, 잔기 234에 있는 페닐알라닌이 알라닌 또는 발린으로 치환된 것, 및 잔기 235에 있는 류신이 알라닌 또는 글루타메이트로 치환된 것(EU 번호화, [Kabat, E. A. et al. (1991), 상기 문헌 동일]). 추가로, 잔기 297에 있는 Asn을 Ala로 치환시킴으로써 IgG4 Fc 영역 내의 N 연결 글리코실화 부위를 제거하면 이펙터 기능이 추가로 감소될 수 있고, 존재할 수 있는 임의의 잔류 이펙터 활성은 제거될 수 있다. 이펙터 기능이 감소된 또다른 예시적인 IgG4 돌연변이체는 중쇄 불변 영역내 돌연변이 S228P 및 L235E(PE 돌연변이)를 함유하는 IgG4 서브유형 변이체이다. 이러한 돌연변이를 통해 이펙터 기능은 감소하게 된다. US 5,624,821 및 US 5,648,260을 참조한다. 이펙터 기능이 감소된, IgG4 관련 돌연변이는 본원에 기술된 S228P/T229A이다.
불변 영역 내의 다른 예시적인 아미노산 서열 변화로는 (Bluestone et al.)(WO 94/28027 및 WO 98/47531; 또한, [Xu et al. 2000 Cell Immunol 200; 16-26] 참조)에 의해 기재된 Ala-Ala 돌연변이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따 라서 특정 실시태양에서, Ala-Ala 돌연변이를 비롯한, 불변 영역내 돌연변이를 갖는 항CD154 항체를 사용하여 이펙터 기능을 감소 또는 파괴시킬 수 있다. 이러한 실시태양에 따라, 항CD154 항체의 불변 영역은 234번 위치에서 알라닌으로의 돌연변이 또는 235번 위치에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함한다. 추가로, 불변 영역은 이중 돌연변이: 234번 위치에서 알라닌으로의 돌연변이 및 235번 위치에서 알라닌으로의 제2 돌연변이를 함유할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 항CD154 항체는 IgG4 프레임워크를 포함하는데, 여기서, Ala-Ala 돌연변이는 234번 위치에서 페닐알라닌으로부터 알라닌으로의 돌연변이(들) 및/또는 235번 위치에서 류신으로부터 알라닌으로의 돌연변이를 설명할 것이다. 또다른 실시태양에서, 항CD154 항체는 IgG1 프레임워크를 포함하는데, 여기서, Ala-Ala 돌연변이는 234번 위치에서 류신으로부터 알라닌으로의 돌연변이(들) 및/또는 235번 위치에서 류신으로부터 알라닌으로의 돌연변이를 설명할 것이다. 별법으로 또는 추가로, 항CD154 항체는 CH2 도메인내 점 돌연변이 K322A[Hezareh et al. 2001 J Virol. 75: 12161-8]를 비롯한 다른 돌연변이를 수반할 수 있다.
다른 예시적인 아미노산 치환은 WO 94/29351(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 제공되어 있는데, 상기 문헌에는 FcRI에 결합할 수 있는 항체의 능력을 변경시킴으로써 C1q에 결합할 수 있는 항체의 능력을 감소시켜, 결국에는 보체를 고정시킬 수 있는 항체의 능력을 감소시키는 돌연변이를 CH2 도메인의 N 말단 영역내 갖고 있는 항체가 자세히 기술되어 있다. 또한, FcR 결합을 저하시키는, IgG2 중 상부 CH2 영역 내의 돌연변이를 기재하고 있는 [Cole et al. (J Immunol. (1997) 159: 3613-3621)]도 참조한다.
아미노산 치환을 포함하는 상기 언급한 항체 변이체들 중 임의의 것을 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 방법으로는 항체 또는 적어도 항체의 불변 영역을 코딩하는, 제조된 DNA 분자에 대한 부위 지정(또는 올리고뉴클레오티드 매개) 돌연변이유발법, PCR 돌연변이유발법, 및 카세트 돌연변이유발법에 의한 제조를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
부위 지정 돌연변이유발법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들면, [Carter et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443(1985)] 및 [Kunkel et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 82:488 (1987)] 참조).
PCR 돌연변이유발법 또한 출발 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 제조하는데 적합하다. ([Higuchi, in PCR Protocols, pp.177-183(Academic Press, 1990)]; 및 [Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733(1989)])을 참조한다.
서열 변이체를 제조하는 또다른 방법인 카세트 돌연변이유발법은 [Wells et al., Gene 34:315-323(1985)]에 기재된 기법에 기초한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 항체의 Fc 영역 또는 그의 일부가 자연적으로 감소된 이펙터 유도 활성을 갖는 Fc 영역(또는 그의 일부)으로 교환된, 이펙터 기능이 감소된 항CD154 항체에 관한 것이다. 예를 들어, 인간 IgG4 불변 영역은 감소된 보체 활성화를 나타내거나, 보체 활성화를 나타내지 않는다. 추가로, IgG 분자가 상이하면 그들의 FcR에의 결합 친화도가 상이한데, 이는 적어도 부분적으로는 IgG의 힌지 영역의 길이와 가요성이 다르기 때문일 수 있다(IgG3>IgG1>IgG4>IgG2 순서로 감소한다). 예를 들어, IgG4는 FcγRIIa에의 감소된 결합을 나타내거나, FcγRIIa에의 결합을 나타내지 않는다. 키메라 분자 및 키메라 불변 영역의 일례는 예를 들면, ([Gillies et al. (Cancer Res. 1999, 59: 2159-2166)] 및 [Mueller et al. (Mol . Immunol . 1997, 34: 441-452)])을 참조한다.
본 발명은 또한 Fc 영역이 완전히 없는, 이펙터 기능이 감소된 항CD154 항체에 관한 것이다. 그러한 항체는 또한 본 발명의 항체 유도체 및 항원 결합 단편으로서도 지칭될 수 있다. 그러한 유도체 및 단편은 항체 이외의 단백질 서열 또는 단백질 이외의 구조체, 특히 동물, 예를 들면, 인간 피험체에 투여될 때 전달 및/또는 생체이용성을 용이하게 하는 구조체에 융합될 수 있다(하기 참조)
상기 논의된 바와 같이, 힌지 영역 내의 변화 또한 이펙터 기능에 영향을 준다. 예를 들어, 힌지 영역이 결실되면 Fc 수용체에 대한 친화도는 감소할 수 있고, 보체 활성화도 감소할 수 있다[Klein et al. 1981 PNAS USA 78: 524-528]. 따라서, 본 개시는 힌지 영역이 변경된 항체에 관한 것이다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 저해하도록 변형될 수 있다. 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 도입함으로써 CDC 활성을 조정할 수 있다(예를 들면, US 6,194,551 및 US 6,242,195 참조). 별법으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여 쇄간 디설피드 결합이 형성될 수 있도록 할 수 있다. 그렇게 생성된 동종이량체 항체는 내재화 능력을 향상 또는 감소시킬 수 있고/거나, 보체에 매개되는 세포 사멸을 증가 또는 감소시킬 수 있다. ([Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol . 148:2918-2922 (1992)], WO 99/51642, [Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988)]; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351)을 참조한다.
추가로, 이펙터 기능이 항체의 결합 친화도에 따라 달라질 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 친화도가 높은 항체는 상대적으로 친화도가 낮은 항체와 비교하여 보체계를 활성화시키는데 있어 더욱 효과적일 수 있다[Marzocchi-Machado et al. 1999 Immunol Invest 28: 89-101]. 따라서, 항체는 그의 항원에의 결합 친화도가 감소되도록 변경될 수 있다(예를 들면, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 부가, 또는 결실과 같은 방법에 의해 항체의 가변 영역을 변화시킴으로써 변경). 결합 친화도가 감소된 항체는 예를 들어, 감소된 ADCC 및/또는 CDC를 비롯한, 감소된 이펙터 기능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 이펙터 기능이 감소된 항CD154 항체는 모체 항CD154 항체 또는 변이체 이외의 항CD154 항체와 비교하여 하나 이상의 Fc 수용체(FcR)에의 결합 친화도가 감소된 것인 항체를 포함한다. 따라서, FcR 결합 친화도가 감소된 항CD154 항체는 모체 항CD154 항체 또는 변이체 이외의 항CD154 항체(예를 들면, 항체 342 또는 5c8)와 비교하여 하나 이상의 Fc 수용체에의 결합 친화도가 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배, 또는 5배 이상 감소된 것인 항CD154 항체를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 이펙터 기능이 감소된 항CD154 항체는 모체 항체 또는 변이체 이외의 항체와 비교하여 약 10배 적은 친화도로 FcR에 결합한다. 다른 실시태양에서, 이펙터 기능이 감소된 항CD154 항체는 모체 항체 또는 변이체 이외의 항체와 비교하여 약 15배 적은 친화도로 또는 약 20배 적은 친화도로 FcR에 결합한다. FcR 수용체는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), 및 FcγRIII, 그의 이소폼, 및 FcεR, FcμR, FcΔR, 및/또는 FcαR 중 하나 이상일 수 있다. 특정 실시태양에서, 이펙터 기능이 감소된 항CD154 항체는 FcγRIIa에의 결합 친화도가 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배, 또는 5배 이상 감소된 것을 나타낸다.
따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 제2 항CD154 항체와 비교하여 보체 단백질에의 감소된 결합을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 제2 항CD154 항체와 비교하여 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 또는 약 15배 이상 만큼 감소된 결합을 나타낸다.
따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명은 피험체에게 투여되었을 때에 이펙터 기능의 감소를 유도하는 항체에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 항체를 투여받은 피험체에서는 혈전증을 유발시키지 않는다. 혈전증은 예를 들어, 혈전색전성 사례를 포함한다. 그러한 사례로는 예를 들면, 혈관병증(예를 들면, 혈관 변화, 예로서, 내막 비후 및 혈관벽 변화)을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 제2 CD154 특이 항체(예를 들면, 항체 342, 항체 5c8 또는 인간화된 5c8)와 비교하여 혈전색전성 사례를 덜 유발시킨다. 이펙터 기능이 감소된 항CD154 항체는 피험체에게 투여되었을 때에 변이체 이외의 항CD154 항체 또는 모체 항CD154 항체와 비교하여 혈전색전성 사례의 수를 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 또는 50% 감소시킬 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 시험관내 혈소판 응집 또는 활성화를 유발하지 않고/거나, 제2 CD154 특이 항체(예를 들면, 항체 5c8 또는 인간화된 5c8; 실시예 1 참조)와 비교하여 더 적은 정도로 혈소판 응집 또는 활성화를 증진시킨다. 따라서, 특정 실시태양에서, 표준 혈소판 응집 또는 활성화 분석법에서 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체가 존재하는 경우 응집 또는 활성화는 음성 대조군 분석법에서 관찰된 응집 또는 활성화에 비하여 20%, 25%, 30% 또는 50% 초과로 일어나지 않는다. 예시적인 표준 혈소판 응집 또는 활성화 분석법은 본원에 기술되고(실시예 11의 분석 1), 도 26에 나타낸 분석법이다. 표준 분석법 및 본 발명에 사용될 수 있는 대체 혈소판 응집 분석법(분석 2, 도 27), 둘 모두 실시예 11에 기술되어 있다. CD154 결합 단백질은 가용성일 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 또한 CD40L에 특이적으로 및 1가로 결합하는 단일의 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는데, 상기 가용성 단백질이 CD154에 결합하는 것은 실질적으로 주르카트 T 세포에서의 JNK 인산화를 유도하지 않는 것인, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 CD154에 특이적으로 및 1가로 결합하는 단일의 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는데, 상기 가용성 단백질이 CD154에 결합하는 것은 실질적으로는 항CD3 항체로 함께 공동 자극을 받은 주르카트 T 세포에 의한 IFN-감마 분비를 유도하지 않는 것인, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 제공한다.
본 발명의 특정 실시태양은 DR-H1(서열 번호 3), CDR-H2(서열 번호 4) 및 CDR-H3(서열 번호 5)으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR 서열을 포함하며, 추 가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 것인 항CD154 항체에 관한 것이다. 추가의 실시태양에서, 항CD154 항체는 CDR 중 적어도 2개를 포함하고, 다른 실시태양에서, 항체는 CDR-H1(서열 번호 3), CDR-H2(서열 번호 4) 및 CDR-H3(서열 번호 5)인, 중쇄 CDR 서열, 3개 모두를 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양은 CDR- L1(서열 번호 6), CDR-L2(서열 번호 7) 및 CDR-L3(서열 번호 8)으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 서열을 포함하며, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 것인 항CD154 항체에 관한 것이다. 추가의 실시태양에서, 항CD154 항체는 경쇄 CDR 중 적어도 2개를 포함하고, 다른 실시태양에서, 항체는 CDR-L1(서열 번호 6), CDR-L2(서열 번호 7) 및 CDR-L3(서열 번호 8)인 경쇄 CDR 서열, 3개 모두를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 이펙터 기능이 감소된 항CD154 항체는 CDR-L1(서열 번호 6), CDR-L2(서열 번호 7) 및 CDR-L3(서열 번호 8)인 경쇄 CDR 서열, 3개 모두를 포함하고, CDR-H1(서열 번호 3), CDR-H2(서열 번호 4) 및 CDR-H3(서열 번호 5)인, 중쇄 CDR 서열, 3개 모두를 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 1, 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11로부터 선택되는 VH 서열을 포함하는 항CD154 항체를 제공한다. 특정 다른 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백 질에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 12 및 서열 번호 13으로부터 선택되는 VL 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 상기 기술된 CDR 또는 중쇄 또는 경쇄 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 항CD154 항체는 Fab 또는 Fab' 단편 또는 그의 유도체이다. 추가의 다른 실시태양에서, 항체는 F(ab')2 단편 또는 그의 유도체이다. CD154 단백질에 특이적으로 결합하는 CDR 또는 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함하는 다른 항체 단편 또는 그의 유도체 또한 포함한다. 이들 항체는 이펙터 기능의 감소를 유도하거나, 이펙터 기능이 없도록 유도하기 위해 변형될 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11로부터 선택되는 VH 서열을 포함하고, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 것인 항CD154 항체에 관한 것이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 2 및 서열 번호 14로부터 선택되는 VL 서열을 포함하고, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 것인 항CD154 항체에 관한 것이다.
몇몇 실시태양에서, 항체는 서열 번호 2의 가변 경쇄 서열을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 서열 번호 2를 포함하는 항체는 Fab 또는 Fab' 단편 또는 그의 유도체이다. 추가의 다른 실시태양에서, 항체는 F(ab')2 단편 또는 그의 유도체이다. CD154 단백질에 특이적으로 결합하는 CDR 또는 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함하 는 다른 항체 단편 또는 그의 유도체 또한 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 2 및 서열 번호 14로 구성된 군으로부터 선택되는 VL 서열을 포함하고, 추가로, 서열 번호 1, 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11로부터 선택되는 VH 서열을 포함하며, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 것인 항CD154 항체에 관한 것이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 29의 VH 서열 및 서열 번호 30의 VL 서열을 포함하고, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 것인 항CD154 항체에 관한 것이다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하며, 서열 번호 15의 경쇄 서열을 포함하는 항CD154 항체를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 서열 번호 15의 경쇄 서열을 포함하는 항체는 추가로 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역(예를 들면, 글리코실화가 변경되고/거나, 다른 변형을 갖는 Fc 영역)을 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 15의 경쇄 서열 및 서열 번호 12 및 서열 번호 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 서열을 포함하고, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역(예를 들면, 글리코실화가 변경되고/거나, 다른 변형을 갖는 Fc 영역)을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 2 또는 14에 기재되어 있는 바와 같은 경쇄 서열 및 서열 번호 1, 9, 10 또는 11에 기재되어 있는 바와 같은 중쇄 서열을 포함하는 항CD154 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 항CD154 항체는 항체 단편일 수 있다. 추가의 실시태양에서, 항체는 Fab 또는 Fab' 단편 또는 그의 유도체이다. 추가의 다른 실시태양에서, 항체는 F(ab')2 단편 또는 그의 유도체이다. CD154 단백질에 특이적으로 결합하는 CDR 또는 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함하는 다른 항체 단편 또는 그의 유도체 또한 포함한다. 추가로, 항체는 감소된 이펙터 기능을 나타낼 수 있다. 예를 들어, Fc 영역을 포함하는 항체는 항체가 이펙터 기능(들)의 감소를 유도하거나, 이펙터 기능이 없도록 유도하기 위해 하나 이상의 변형(예를 들면, 글리코실화 변경, 접합화 등)을 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 15의 경쇄 서열 및 서열 번호 13의 중쇄 서열을 포함하고, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 15의 경쇄 서열 및 서열 번호 12의 중쇄 서열을 포함하고, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 CDR-H1(서열 번호 42), CDR-H2(서열 번호 43) 및 CDR-H3(서열 번호 44)으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR 서열을 포함하고, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 항CD154 항체는 중쇄 CDR 중 적어도 2개를 포함하고, 다른 실시태양에서, 항체는 CDR-H1(서열 번호 42), CDR-H2(서열 번호 43) 및 CDR-H3(서열 번호 44)인 중쇄 CDR 서열, 3개 모두를 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CDR-L1(서열 번호 45), CDR-L2(서열 번호 46) 및 CDR-L3(서열 번호 47)으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 서열을 포함하고, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 항CD154 항체는 경쇄 CDR 중 적어도 2개를 포함하고, 다른 실시태양에서, 항체는 CDR-L1(서열 번호 45), CDR-L2(서열 번호 46) 및 CDR-L3(서열 번호 47)인 경쇄 CDR 서열, 3개 모두를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시태양은 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하고, CDR-L1(서열 번호 45), CDR-L2(서열 번호 46) 및 CDR-L3(서열 번호 47)인 경쇄 CDR 서열, 3개 모두를 포함하며, CDR-H1(서열 번호 42), CDR-H2(서열 번호 43) 및 CDR-H3(서열 번호 44)인 중쇄 CDR 서열, 3개 모두를 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 CDR-H1(서열 번호 48), CDR-H2(서열 번호 49) 및 CDR-H3(서열 번호 50)으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR 서열을 포함하고, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다. 추가의 실시태양에서, 항 CD154 항체는 중쇄 CDR 중 적어도 2개를 포함하고, 다른 실시태양에서, 항체는 CDR-H1(서열 번호 48), CDR-H2(서열 번호 49) 및 CDR-H3(서열 번호 50)인 중쇄 CDR 서열, 3개 모두를 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CDR-L1(서열 번호 51), CDR-L2(서열 번호 52) 및 CDR-L3(서열 번호 53)으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 서열을 포함하고, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다. 추가의 실시태양에서, 항체는 경쇄 CDR 중 적어도 2개를 포함하고, 다른 실시태양에서, 항체는 CDR-L1(서열 번호 51), CDR-L2(서열 번호 52) 및 CDR-L3(서열 번호 53)인 경쇄 CDR 서열, 3개 모두를 포함한다.
특정 실시태양에서, 이펙터 기능이 감소된 항CD154 항체는 CDR-L1(서열 번호 51), CDR-L2(서열 번호 52) 및 CDR-L3(서열 번호 53)인 경쇄 CDR 서열, 3개 모두를 포함하고, 추가로, CDR-H1(서열 번호 48), CDR-H2(서열 번호 49) 및 CDR-H3(서열 번호 50)인 중쇄 CDR 서열, 3개 모두를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하며, 서열 번호 54의 VL 서열을 포함하는 항CD154 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 56의 VH 서열을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항CD154 항체는 서열 번호 54의 VL 서열 및 서열 번호 56의 VH 서열, 둘 모두를 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 항체는 Fab 또는 Fab' 단편 또는 그의 유도체이다. 추가의 다 른 실시태양에서, 항체 또는 항체 단편은 F(ab')2 단편 또는 그의 유도체이다. 항체 또는 단편은 또한 인간화된 항체 또는 완전 인간 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양은 서열 번호 54의 VL 서열 및 서열 번호 56의 VH 서열을 포함하고, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하며, 서열 번호 58의 VL 서열을 포함하는 항CD154 항체를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 항체는 서열 번호 60의 VH 서열을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 항체 또는 단편은 서열 번호 60의 VH 서열 및 서열 번호 58의 VL 서열을 포함한다. 항체는 Fab 또는 Fab' 단편 또는 그의 유도체일 수 있다. 추가의 다른 실시태양에서, 항체는 F(ab')2 단편 또는 그의 유도체이다. 항체는 또한 인간화된 항체 또는 완전 인간 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 58의 VH 서열 및 서열 번호 60의 VL 서열을 포함하고, 추가로는 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항CD154 항체에 관한 것이다.
글리코실화가 변경된 항 CD154 항체
글리칸을 제거하면 종을 막론한 Fc 수용체 패밀리의 모든 구성원에의 결합을 상당 감소시켜야 하는 구조상의 변화가 일어난다. 항CD154 항체를 비롯한, 글리코 실화된 항체에서 Fc 이량체의 CH2 도메인 중 보존된 N 연결 부위에 부착된 글리칸(올리고당)은 CH2 도메인 사이에 둘러싸여 있고, 당 잔기는 대향 CH2 도메인 상의 특이적인 아미노산 잔기와 접촉하고 있다. 상이한 글리코실화 패턴은 항체의 상이한 생물학적 성질과 관련이 있다([Jefferis and Lund, 1997, Chem . Immunol, 65: 111-128]; [Wright and Morrison, 1997, Trends Biotechnol , 15: 26-32]). 특이적인 특정 글리코형태가 잠재적으로 이로운 생물학적 성질을 부여한다. 글리칸이 손실되면 도메인 사이의 간격은 변화하게 되고, 서로서로에 대한 그들의 이동성이 증가하게 되며, 이는 Fc 수용체 패밀리의 모든 구성원의 결합에 저해 효과를 나타낼 것으로 기대된다. 예를 들어, 다양한 글리코실화된 항체를 사용한 시험관내 연구를 통해서, CH2 글리칸이 제거되면 Fc 구조가 변경되고, 이로써, Fc 수용체 및 보체 단백질 C1Q에의 항체 결합이 현저히 감소한다는 것이 입증되었다. 이펙터 기능을 감소시키는 것으로서 공지된 또다른 접근법으로는 Fc의 CH2 도메인 중 297번 위치의(EU 번호화) N 연결 글리칸 생산을 저해하거나, 상기 N 연결 글리칸을 제거하는 방법이 있다([Nose et al., 1983 PNAS 80: 6632]; [Leatherbarrow et al., 1985 Mol . Immunol. 22: 407]; [Tao et al., 1989 J. Immunol. 143: 2595]; [Lund et al., 1990 Mol . Immunol . 27: 1145]; [Dorai et al., 1991 Hybridoma 10:211]; [Hand et al., 1992 Cancer Immunol . Immunother . 35:165]; [Leader et al., 1991 Immunology 72: 481]; [Pound et al., 1993 Mol . Immunol . 30:233]; [Boyd et al., 1995 Mol . Immunol . 32: 1311]). 상이한 글리코형태가 약동학적 성질, 약력학적 성질, 수용체 상호작용 및 조직 표적 특이 표적화를 비롯한, 치료제의 성질에 크게 영향을 줄 수 있다는 것도 알려져 있다[Graddis et al., 2002, Curr Pharm Biotechnol. 3: 285-297]. 특히 항체의 경우, 올리고당 구조는 항체의 이펙터 기능(예를 들면, CDC를 유도하는, 보체 복합체 C1에의 결합, 및 ADCC 경로를 조정하는 것을 담당하는, FcγR 수용체에의 결합) 이외에도 프로테아제 내성과 관련된 성질, FcRn 수용체에 의해 매개되는 항체의 혈청 반감기, 포식작용 및 항체 피드백에 영향을 줄 수 있다([Nose and Wigzell, 1983]; [Leatherbarrow and Dwek, 1983]; [Leatherbarrow et al.,1985]; [Walker et al., 1989]; [Carter et al., 1992, PNAS, 89: 4285-4289]).
따라서, 항체의 이펙터 기능을 조정하는 또다른 수단으로는 항체 불변 영역의 글리코실화를 변경시키는 것을 포함한다. 글리코실화 변경은 예를 들면, 글리코실화된 잔기 개수의 감소 또는 증가, 글리코실화된 잔기의 패턴 또는 위치의 변화 뿐만 아니라, 당 구조체(들) 변화를 포함한다. 인간 IgG 상에서 발견되는 올리고당은 항체의 이펙터 기능 정도에 영향을 주며[Raju, T. S. BioProcess International April 2003. 44-53]; 인간 IgG 올리고당의 미세불균일성은 생물학적 기능, 예로서, CDC 및 ADCC, 다양한 Fc 수용체에의 결합, 및 C1q 단백질에의 결합에 영향을 줄 수 있다([Wright A. & Morrison SL. TIBTECH 1997, 15 26-32]; [Shields et al. J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604]; [Shields et al. J Biol Chem . 2002; 277(30):26733-40]; [Shinkawa et al. J Biol Chem. 2003 278(5):3466-73]; [Umana et al. Nat Biotechnol . 1999 Feb; 17(2): 176-80]). 예를 들어, C1q에 결합할 수 있고, 보체 캐스캐이드를 활성화시킬 수 있는 능력은 2개의 보체 캐스캐이드 사이 에 위치하는 당질 부분(이는 보통 Asn297에 부착되어 있다)의 존재, 부재, 또는 변형에 의존할 수 있다[Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995)].
Fc를 함유하는 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 예로서, IgG 항체 중 글리코실화 부위는 표준 기법에 의해 확인할 수 있다. 글리코실화 부위를 확인하는 것은 실험에 의할 수 있거나, 서열 분석 또는 모형화 데이타에 기초할 수 있다. 공통 모티프, 즉, 글리코실 트랜스퍼라제에 의해 인식되는 아미노산 서열이 기술되어 있다. 예를 들어, N 연결 글리코실화 모티프에 대한 공통 모티프는 흔히 NXT 또는 NXS(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다)이다. 잠재적인 글리코실화 모티프의 위치를 밝혀내는 수개의 알고리즘 또한 기술되어 있다. 따라서, 항체 또는 Fc를 함유하는 단편 내의 잠재적인 글리코실화 부위를 확인하기 위해서는 항체의 서열을 예를 들어 공식적으로 입수가능한 데이터베이스, 예로서, 생물학 서열 분석 센터(Center For Biological Sequence Analysis)에서 제공하는 바와 같은 웹사이트(N 연결 글리코실화 부위의 예측을 위해서는 NetNGlyc 서비스를, 그리고 0 연결 글리코실화 부위의 예측을 위해서는 NetOGlyc 서비스를 참조)를 이용하여 조사하면 된다.
생체내 연구를 통해 비글리코실 항체의 이펙터 기능이 감소되었음을 확인하였다. 예를 들어, 비글리코실 항CD8 항체는 마우스에서 CD8을 수반하는 세포를 제거할 수 없고[Isaacs, 1992 J. Immunol . 148: 3062], 비글리코실 항CD3 항체는 마우스 또는 인간에서 사이토카인 방출 증후군을 유도하지 못한다([Boyd, 1995 상기 문헌 동일]; [Friend, 1999 Transplantation 68:1632]).
CH2 도메인내 글리칸을 제거하면 이펙터 기능에 상당한 영향을 미치는 것으로 보이는 반면, 항체의 다른 기능적 성질 및 물리적 성질은 변경되지 않고 그대로 유지된다는 점이 중요하다. 특히 글리칸을 제거하는 것이 혈청 반감기 및 항원에의 결합에는 영향을 거의 미치지 않거나, 전혀 미치지 않는 것으로 나타났다([Nose, 1983 상기 문헌 동일]; [Tao, 1989 상기 문헌 동일]; [Dorai, 1991 상기 문헌 동일]; [Hand, 1992 상기 문헌 동일]; [Hobbs, 1992 Mol . Immunol. 29:949]).
생체내에서 비글리코실 접근법으로 확인된 바도 있지만, 비글리코실 mAb를 사용하여 잔여 이펙터 기능에 대해 보고되기도 하였다(예를 들면, [Pound, J. D. et al. (1993) Mol . Immunol 30(3): 233-41]; [Dorai, H. et al. (1991) Hybridoma 10(2): 211-7]). (Armour et al.)은 FcγRIIa 및 FcγRIIb 단백질에의 잔여 결합을 제시하였다([Eur . J. Immunol. (1999) 29: 2613-1624]; [Mol . Immunol. 40 (2003) 585-593]). 따라서, 몇몇 일례로, 이펙터 기능, 특히 보체 활성화를 추가로 감소시키는 것이 활성을 확실하게 완전히 제거하는데 중요할 수 있다. 그러한 이유에서 IgG2 및 IgG4 및 G1/G4 하이브리드의 비글리코실 형태는 이펙터 기능이 감소된, 본 발명의 방법 및 항체 조성물에서 유용한 것으로 구상된 것이다.
탈글리코실화된 항 CD154 항체 또는 비글리코실 항 CD154 항체 생성
본 발명의 항CD154 항체는, 임의로 Fc 부분의 매우 유용한 다른 특성들은 유지하면서 (제2 CD154 특이 항체와 비교하여) 감소된 이펙터 기능(들)을 유도하기 위해 변형되거나 변경될 수 있다.
따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명은 이펙터 기능이 감소되어 있고, 항체 Fc 부분의 CH2 도메인 중 보존된 N 연결 부위에서의 변형을 특징으로 하는 비글리코실 항CD154 항체에 관한 것이다. Fc 이량체의 CH2 도메인 중 보존된 N 연결 부위가 변형되면 비글리코실 항CD154 항체를 얻을 수 있다. 그러한 변형의 예로는 Fc 이량체의 CH2 도메인 중 보존된 N 연결 부위의 돌연변이, CH2 도메인 중 N 연결 부위에 부착된 글리칸의 제거, 및 글리코실화 방지를 포함한다. 예를 들어, 비글리코실 항CD154 항체는 중쇄 CH2 도메인 중의 정규 N 연결 Asn 부위를 Gln 잔기로 교체함으로써 생성될 수 있다(예를 들어, WO 05/03175 및 US 2006-0193856 참조).
본 발명의 하나의 실시태양에서, 변형은 중쇄 글리코실화 부위에서의 글리코실화를 막기 위한 상기 부위에서의 돌연변이를 포함한다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 비글리코실 항CD154 항체는 중쇄 글리코실화 부위의 돌연변이에 의해, 즉, N298Q(카뱃 EU 번호화 사용시 N297)의 돌연변이에 의해 제조되고, 적절한 숙주 세포에서 발현된다. 예를 들어, 이러한 돌연변이는 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham-Pharmacia Biotech)?(미국 뉴저지주 피츠카타웨이 소재)로부터 입수한 독특한 부위 돌연변이유발 키트용의 제조업자 추천 프로토콜에 따라 수행할 수 있다.
돌연변이화된 항체는 숙주 세포(예로서, NSO 또는 CHO 세포)에서 안정하게 발현시킨 뒤 정제할 수 있다. 일례로, 정제는 단백질 A 및 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 수행할 수 있다. 추가 발현 및 정제 방법 또한 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 비글리코실 항CD154 항체는 감소된 이펙터 기능을 가지는데, 상기 항체 또는 항체 유도체의 Fc 부분의 CH2 도메인 중 보존된 N 연결 부위에서의 변형은 CH2 도메인 글리칸의 제거, 즉, 탈글리코실화를 포함한다. 이러한 비글리코실 항CD154 항체는 통상적인 방법으로 생성한 뒤, 효소적으로 탈글리코실화시킬 수 있다. 항체를 효소적으로 탈글리코실화시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다([Williams, 1973]; [Winkelhake & Nicolson, 1976 J. Biol Chem. 251:1074-80]).
본 발명의 또다른 실시태양에서, 탈글리코실화는, 항체를 생산하는 숙주 세포를 글리코실화 저해제, 예로서, 투니카마이신을 포함하는 배양 배지 중에서 배양함으로써 탈글리코실화를 달성할 수 있다[Nose & Wigzell, 1983]. 즉, 변형은 상기 항체의 Fc 부분의 CH2 도메인 중 보존된 N 연결 부위에서의 글리코실화를 감소시키거나, 막는 것이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 항원으로서는 재조합 CD154 폴리펩티드(또는 상기 폴리펩티드를 함유하는 세포 또는 세포막)를 사용하여 항CD154 항체 또는 항체 유도체를 생성한 뒤, 탈글리코실화시킬 수 있다.
대체 실시태양에서, 본 발명의, 글리코실화가 감소된 비글리코실 항CD154 항체 또는 항CD154 항체는 (WO 05/18572 및 US 2007-0048300)(Taylor et al.)에 기재된 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 항CD154 비글리코실 항체는 (예를 들면, 치환, 삽입, 결실에 의해, 또는 화학적 변형에 의해) 제1 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 생산될 수 있는데, 여기서, 변경된 제1 아미노산 잔기가 입체 장애 또는 전하, 또는 그 둘 모두에 의해 제2 잔기의 글리코실화를 저 해한다. 특정 실시태양에서, 제1 아미노산 잔기는 아미노산 치환에 의해 변형된다. 추가의 실시태양에서, 아미노산 치환은 Gly, Ala, Val, Leu, He, Phe, Asn, Gln, Trp, Pro, Ser, Thr, Tyr, Cys, Met, Asp, Glu, Lys, Arg, 및 His로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시태양에서, 아미노산 치환은 비번역 아미노산 잔기에서 이루어진다. 제2 아미노산 잔기는 글리코실화 모티프, 예를 들어, 아미노산 서열 NXT 또는 NXS를 함유하는 N 연결 글리코실화 모티프에 근접하게, 또는 그 안에 존재할 수 있다. 하나의 예시적인 실시태양에서, 카뱃 번호화에 따라, 제1 아미노산 잔기는 아미노산 299이고, 제2 아미노산 잔기는 아미노산 297이다. 예를 들어, 제1 아미노산 치환은 카뱃 번호화에 따라, T299A, T299N, T299G, T299Y, T299C, T299H, T299E, T299D, T299K, T299R, T299G, T299I, T299L, T299M, T299F, T299P, T299W, 및 T299V일 수 있다. 특정 실시태양에서, 아미노산 치환은 T299C이다.
이펙터 기능은 또한 항체가 차단 부분을 함유하도록 본 발명의 항체를 변형시킴으로써 감소될 수 있다. 예시적인 차단 부분은, 예를 들면, 폴리펩티드를 글리코실화시킬 수 있는 글리코시다제의 능력을 차단함으로써 글리코실화가 감소되도록 하는 충분한 입체적 크기 및/또는 전하의 부분을 포함한다. 추가로, 또는 별법으로, 차단 부분은 예를 들어, 수용체 또는 보체 단백질에 결합할 수 있는 Fc 영역의 능력을 저해시킴으로써 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 5, 44 및 50으로부터 선택되는 중쇄 CDR3 서열 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체에 관한 것으로, 상기 변이체 Fc 영역은 제1 아미노산 잔기 및 N 글리코실화 부위를 포함하는데, 상기 제 1 아미노산 잔기는 측쇄 화학물질로 변형되어, 변형되지 않은 제1 아미노산 잔기와 비교하였을 때에 입체적 크기가 증가 또는 정전하가 증가함으로써 N 글리코실화 부위에서의 글리코실화 수준이 감소되거나, 다르게는 글리코실화가 변경된 것인 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체에 관한 것이다. 이들 특정 실시태양에서, 변이체 Fc 영역은 대조군인 변이체 이외의 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여한다. 추가의 실시태양에서, 입체적 크기가 증가된 측쇄는 Phe, Trp, His, Glu, Gln, Arg, Lys, Met 및 Tyr로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 측쇄이다. 추가의 다른 실시태양에서, 정전하가 증가된 측쇄 화학물질은 Asp, Glu, Lys, Arg, 및 His로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 측쇄의 것이다.
따라서, 하나의 실시태양에서, 글리코실화 및 Fc 결합은 T299를 하전된 측쇄 화학물질을 갖는 것, 예로서, D, E, K, 또는 R로 치환함으로써 조정될 수 있다. 생성된 항체는 불리한 정전기적 상호작용으로 인하여 감소된 글리코실화 뿐만 아니라, Fc 수용체에 대한 감소된 Fc 결합 친화도를 가질 것이다.
또다른 실시태양에서, 비글리코실화되어 있으면서 동시에 시스테인 부가물도 형성할 수 있는 T299C 변이체 항체는 그의 비글리코실화된 항체 대조물(예를 들면, WO 05/18572 참조)과 비교하여 더 적은 이펙터 기능(예를 들면, FcγRI 결합)을 나타낼 수 있다. 따라서, 글리코실화 모티프에 인접해 있는 제1 아미노산을 변경시키면 제2 아미노산 잔기에서의 항체 글리코실화를 저해시킬 수 있고; 제1 아미노산이 시스테인 잔기인 경우, 항체는 더욱더 추가로 감소된 이펙터 기능을 나타낼 수 있 다. 추가로, IgG4 서브유형의 항체 글리코실화를 저해시키면 FcγRI 결합에 미치는 효과는 다른 서브유형에서의 비글리코실화가 미치는 효과와 비교하여 더욱 클 수 있다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 글리코실화는 변경되어 있고, 하나 이상의 FcR 수용체에의 결합은 감소되어 있으며, 임의로는 또한 하나 이상의 Fc 수용체 및/또는 보체에의 결합은 증가되어 있거나 정상적인 항CD154 항체, - 예를 들면, 글리코실화는 변경되어 있고, 적어도, 천연의 대조군 항CD154 항체와 동일하거나 유사한 하나 이상의 Fc 수용체 및/또는 보체에의 결합 친화도를 유지하는 항체에 관한 것이다. 예를 들어, 글리칸 구조체로서 Man5GlcNAc2N-글리칸이 지배적으로 존재하는 것인 항CD154 항체(예를 들면, 여기서, Man5GlcNAc2N-글리칸 구조체는 Ig 조성물 중 그 다음으로 지배적인 글리칸 구조체보다 적어도 약 5몰% 더 많은 수준으로 존재한다)는, Man5GlcNAc2N-글리칸 구조체가 지배적이지 않은 항CD154 항체 군집과 비교하여 변경된 이펙터 기능을 나타낼 수 있다. 이러한 글리칸 구조체를 지배적으로 포함하고 있는 항체는 FcγRIIa 및 FcγRIIb에의 감소된 결합, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb에의 증가된 결합, 및 C1 복합체의 C1q 서브유니트에의 증가된 결합을 나타낸다(US 2006-0257399 참조). 이러한 글리칸 구조체는, 이것이 지배적인 글리칸 구조체일 경우, ADCC 증가, CDC 증가, 혈청 반감기 증가, B 세포의 항체 생산 증가, 및 대식세포에 의한 포식작용 감소를 부여한다.
일반적으로, 당단백질 상의 글리코실화 구조체는 발현 숙주 및 배양 조건에 따라 달라질 수 있을 것이다[Raju, TS. BioProcess International April 2003. 44-53]. 그러한 차이로 인하여 이펙터 기능 및 약동학적 성질, 둘 모두가 변화될 수 있다([Israel et al. Immunology. 1996; 89(4):573-578]; [Newkirk et al. P. Clin. Exp. 1996; 106(2):259-64]). 예를 들어, 글리코실화는 세포 배양 조건에 따라 달라질 수 있는데, 이를 통해 몇몇 면역글로불린 조성물은 그의 특이적인 갈락토스 패턴에 따라 면역원성을 띠게 될 수 있다[Patel et al., 1992. Biochem J. 285: 839-845]. 인간 이외의 포유동물 세포에 의해 생산된 당단백질의 올리고당 구조체는 인간 당단백질의 것과 더욱더 밀접한 관련이 있는 경향이 있다. 추가로, 단백질 발현 숙주 시스템은 지배적인 Ig 글리코형태를 발현하도록 공학처리되거나, 선별될 수 있거나, 별법으로 상기 시스템은 지배적인 글리칸 구조체를 갖는 당단백질을 자연적으로 생산할 수 있다. 지배적인 글리코형태를 갖는 당단백질을 생산하는, 공학처리된 단백질 발현 숙주 시스템의 예로는 유전자 넉아웃/돌연변이[Shields et al., 2002, JBC, 277: 26733-26740]; 유전공학[Umana et al., 1999, Nature Biotech., 17: 176-180], 또는 그 둘 모두의 조합을 포함한다. 별법으로, 예를 들어, 닭, 인간 및 소와 같은 특정 세포는 자연적으로 지배적인 글리코형태를 발현한다[Raju et al., 2000, Glycobiology, 10: 477-486]. 따라서, 글리코실화가 변경된(예를 들면, 하나의 특이적인 글리칸 구조체가 지배적으로 존재하는) 항CD154 항체 또는 항체 조성물은 다수의 발현 숙주 시스템 중 적어도 하나의 선별에 의해서 당업자에 의해 발현될 수 있다. 본 발명의 항CD154 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 단백질 발현 숙주 시스템으로는 동물, 식물, 곤충, 세균 세포 등을 포 함한다. 예를 들어, US 2007-0065909, 2007-0020725, 및 2005-0170464에는 세균 세포에서의 비글리코실화된 면역글로불린 분자 생산에 관해 기재되어 있다. 추가의 일례로, (Wright)와 (Morrison)은 글리코실화가 부족한 CHO 세포주에서 항체를 생산하였고[1994 J Exp Med 180: 1087-1096], 이러한 세포주에서 생산된 항체는 보체에 의해 매개되는 세포용해를 할 수 없다는 것을 제시하였다. 당업계에서 발견된, 당단백질 생산을 위한 발현 숙주 시스템의 다른 예로는 CHO 세포(WO 99/22764(Raju) 및 WO 03/35835(Presta)); 하이브리도마 세포([Trebak et al., 1999, J. Immunol . Methods, 230: 59-70]); 곤충 세포([Hsu et al., 1997, JBC, 272:9062-970]), 및 식물 세포(WO 04/74499(Gerngross et al.))를 포함한다. 주어진 세포 또는 추출물이 주어진 모티프를 글리코실화시킨다는 점에서, 상기 모티프가 글리코실화되었는지 여부를 결정하는 기법으로서, 예를 들면, 겔 전기영동 및/또는 질량 분광분석법과 같이 당업계에서 공인된 기법을 이용할 수 있다.
항체의 글리코실화 부위를 변경시키는 추가의 방법은 예를 들면, US 6,350,861 및 US 5,714,350, WO 05/18572 및 WO 05/03175에 기재되어 있으며; 이들 방법을 사용하여 글리코실화가 변경되거나, 감소되어 있거나, 또는 글리코실화되지 않은 본 발명의 항CD154 항체를 생산할 수 있다.
이펙터 기능이 감소된 비글리코실 항CD154 항체는 변형을 포함한 항체이거나, 또는 접합되어 기능적 부분을 포함할 수 있는 항체일 수 있다. 그러한 부분으로는 차단 부분(예를 들면, PEG 부분, 시스테인 부가물 등), 검출가능한 부분(예를 들면, 형광성 부분, 방사성 동위원소 부분, 방사선 부분 등(진단적 부분 포함)), 및/또는 치료적 부분(예를 들면, 세포독성제, 소염제, 면역조절제, 항감염제, 항암제, 항신경퇴행성 제제, 방사성 핵종 등)을 포함한다.
항체 접합체
투여되었을 때에 항체는 대개 순환으로부터 빠르게 제거되고, 이로써 상대적으로 반감기가 짧은 약리학적 활성을 유도할 수 있다. 그 결과, 항체 치료의 치료학적 효능을 지속시키기 위해서는 상대적으로 다량의 항체를 빈번하게 주사하는 것이 필수적일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 생체내에서의 보전성 및 수명을 증가시키기 위해 변형된(예를 들면, 상기 이종의 기능적 부분이 다른 부분에 부착) 항체일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항CD154 항체는 안정화를 증가시켜 항체의 혈청 반감기를 연장시킬 수 있는 부분(기능적 부분)을 포함하도록 변형된 항체일 수 있다. 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항체의 혈청 반감기는 적어도 3일, 적어도 7일, 적어도 14일, 적어도 21일, 적어도 28일, 적어도 1개월 이상일 수 있다. 예를 들면, 항체의 반감기를 증가시키는 상기와 같은 기능적 부분은 항체가 항체 단편인 실시태양에서 특히 유용할 수 있다.
항체 변형은 또한 수용액 중 단백질의 가용성을 증가시킬 수 있고, 응집을 제거할 수 있으며, 단백질의 물리적 및 화학적 안정성을 증진시킬 수 있고, 단백질의 면역원성 및 항원성을 현저히 감소시킬 수 있다. 그 결과, 상기 중합체 단백질 부가물을 변형되지 않은 단백질보다 덜 빈번하게, 또는 더 소량으로 투여함으로써 원하는 생체내 생물학적 활성을 획득할 수 있다.
따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 이종의 기능적 부분에 부착되어 항체 접합체를 형성하는 항체이다. "기능적 부분"은 본 발명의 항체에 결합된 임의의 기능적 부분(예를 들면, 폴리펩티드, 단백질 도메인, 캐리어, 중합체 등)을 지칭한다. 항CD154 항체와의 결합은 공유 또는 비공유 부착에 의해 이루어질 수 있고, 이는 또한 가역적이거나 조절이 가능한 것일 수 있다. 본 발명의 CD154 항체 접합체를 형성하는데 사용될 수 있는 분자의 예로는 기능적 부분, 예로서, 예를 들면, 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적으로 활성인 단백질, 예를 들어, 효소, 다른 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편, 합성(예를 들어, PEG) 또는 자연 발생 중합체, 핵산 및 그의 단편, 예로서, DNA, RNA 및 그의 단편, 압타머, 방사성 핵종, 특히 방사성 요오드화물, 방사성 동위원소, 킬레이트화된 금속, 나노입자 및 리포터기, 예로서, 형광성 또는 발광성 화합물 또는 예로서, NMR 또는 ESR 분광분석법과 같은 기법에 의해 영상화하여 검출할 수 있는 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
추가의 일례로, 본 발명의 항체가 접합되는 기능적 부분이 항체의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있고/거나, 항체의 면역원성을 감소시킬 수 있고/거나, 상피 장벽을 가로지른 면역계로의 항체 전달을 증진시킬 수 있다. 적합한 이러한 유형의 기능적 부분의 예로는 중합체, 덱스트란, 하이드록시프로필메타크릴아미드(HPMA), 트랜스페린, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예로서, PCT/GB2005/002084에 기재된 것을 포함한다.
기능적 부분이 중합체인 경우에는 일반적으로 합성 또는 자연 발생 중합체, 예를 들어, 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지형 또는 비분지형의 다당류, 예로서, 동종 또는 이종 다당류일 수 있다. 예를 들어, ([Veronese and Pasut, 2005, Drug Discovery Today, 10(21): 1451-1458]; [Pasut et al, 2004, Expert Opinion in Therapeutic Patents, 14(6):859-894])를 참조한다.
상기 언급한 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 특정의 임의 치환체로는 하나 이상의 하이드록시, 메틸, 또는 메톡시 기를 포함한다.
합성 중합체의 특정 일례로는 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알코올) 또는 그의 유도체, 특히 임의로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예로서, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 그의 유도체를 포함한다.
특정의 자연 발생 중합체로는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 그의 유도체를 포함한다. 이와 관련하여 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어, 티올 선택적 반응기, 예로서, 말레이미드 등을 포함하는 것으로 한다. 반응기는 직접, 또는 링커 세그먼트를 통해 중합체에 연결될 수 있다. 몇몇 일례로, 상기 기의 잔기가 항체 단편과 중합체 사이의 연결기로서 생성물의 일부를 형성할 것이라는 것을 이해할 것이다.
중합체 크기는 원하는 바에 따라 달라질 수 있지만, 일반적으로 그의 평균 분자량은 500 Da 내지 50000 Da, 바람직하게, 5000 Da 내지 40000 Da, 더욱 바람직하게, 20000 Da 내지 40000 Da 범위일 것이다. 중합체 크기는 특히 예로서, 종양과 같은 특정 조직으로 국부화시킬 수 있거나, 순환 반감기를 연장할 수 있는 생성물의 사용 용도에 기초하여 선택될 수 있다.([Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545]). 따라서, 예를 들어, 생성물이 예로서, 종양 치료에 사용되는 경우와 같이, 순환을 떠나 조직을 침투하는 것으로 사용될 경우, 저분자량의 중합체, 예를 들면, 약 5000 Da의 분자량을 갖는 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 순환에 남아있는 경우에 적용하기 위해서는 고분자량의 중합체, 예를 들면, 분자량 범위가 20000 Da 내지 40000 Da인 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
특히 바람직한 중합체로는 폴리알킬렌 중합체, 예로서, 폴리(에틸렌글리콜) 또는, 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 그의 유도체, 및 특히 분자량 범위가 약 15000 Da 내지 약 40000 Da인 것을 포함한다.
바람직하게, 이펙터 기능이 감소된 항체 또는 단편을 비롯한, 본 발명의 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편은 폴리알킬렌 중합체, 특히 폴리(에틸렌글리콜) (본원에서 PEG로 약칭함) 또는 그의 유도체에 부착되어 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편은 중쇄 또는 경쇄, 또는 둘 모두 상에서 PEG에 부착되어 있는 Fab' 또는 F(ab')2 단편 또는 그의 유도체인 항체 단편이다. 그의 이러한 Fab' 또는 F(ab')2 단편은 인간 또는 인간화된 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 기능적 부분, 예로서, 수용성 중합체, 예로서, 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(에틸렌글리콜)와 폴리(프로필렌글리콜)의 공중합체, 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리(비닐알코올), 폴리(비닐피롤리돈) 또는 폴리(프롤린)의 공유 부착에 의해 변형된 항체인데, 상기 모두는 상응하는 변형되지 않은 단백질에 비하여 정맥내 주사후 실질적으로 더욱 장기간의 혈중 반감기를 나타내는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, ([Abuchowski et al. 1981. In: "Enzymes as Drugs", Holcenberg et al. (ed.) 1981. Wiley-Inter science, New York, NY, 367-383 (1981)]; [Anderson, W.F. 1992. Human Gene Therapy. Science 256:808-813]; [Newmark et al. 1982. J. Appl. Biochem . 4:185-189]; [Katre et al. 1987. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84: 1487-1491])을 참조한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체는 기능적 부분, 예로서, 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 부분에 부착된 항체이다. 하나의 특정 실시태양에서, 항체는 항체 단편이고, PEG 분자는 예를 들어, 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실, 또는 카복실 기와 같은, 항체 단편에 위치하는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 관능기를 통해 부착될 수 있다. 그러한 아미노산은 항체 단편에서 자연적으로 발생할 수 있거나, 재조합 DNA 방법을 사용함으로써 단편 내로 공학처리될 수 있다(예를 들어 US 5,219,996; US 5,667,425; WO 98/25971 참조). 또다른 실시태양에서, 본 발명의 Fab 단편은 기능적 부분이 부착될 수 있도록 단편 중쇄의 C 말단 종단부에 하나 이상의 아미노산을 부가함으로써 변형된다. 바람직하게, 추가의 아미노산은 기능적 부분이 부착될 수 있는, 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 2개 이상의 PEG 분자를 부착시키기 위 해서는 다중 부위가 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, PEG 분자는 본 발명의 항체 단편에 위치하는 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올기를 통해 공유적으로 연결된다. 변형된 항체 단편에 부착된 각각의 PEG 분자는 상기 단편에 위치하는 시스테인 잔기의 황 원자에 공유적으로 연결될 수 있다. 공유 결합은 일반적으로 디설피드 결합, 또는 특히 황-탄소 결합일 것이다. 적절하게 활성화된 기능적 부분의 부착점으로서 티올기가 사용되는 경우, 예를 들어, 티올 선택적 유도체, 예로서, 말레이미드 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 PEG는 상기 기술된 바와 같이 PEG-변형된 항체 단편의 제조에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 PEG는 티올 반응기, 예로서, α-할로카복실산 또는 에스테르, 예로서, 요오드아세트아미드, 이미드, 예로서, 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설피드를 함유하는 임의의 PEG일 수 있다. 특정 실시태양에서, 항CD154 항체 접합체는 2개의 말레이미드 분자와 2개의 PEG 분자를 포함할 수 있다. 출발 물질은 상업적으로 입수할 수 있거나(예를 들면, 미국 앨러배마주 헌츠빌 소재의 Nektar(구 Shearwater Polymers Inc.)로부터 입수), 또는 통상적인 화학적 방법을 사용하여 상업적으로 이용가능한 출발 물질로부터 제조할 수 있다. 특정 PEG 분자로는 20K 메톡시-PEG-아민(Nektar(구 Shearwater); Rapp Polymere; 및 SunBio로부터 입수) 및 M-PEG-SPA(Nektar(구 Shearwater)로부터 입수)을 포함한다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는, 예로서, EP 0948544(또한, (["Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York], ["Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC] 및 ["Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York]; [Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545])도 참조)에 개시된 방법에 따라, PEG화된, 즉, 그에 PEG(폴리(에틸렌글리콜))가 공유적으로 부착되어 있는 변형된 Fab 단편이다. 일례로, PEG는 힌지 영역 중 시스테인에 부착되어 있다. 또다른 일례로, PEG로 변형된 Fab 단편은 변형된 힌지 영역 중 단일의 티올기에 공유적으로 연결된 말레이미드기를 갖는다. 리신 잔기는 말레이미드기에 공유적으로 연결될 수 있고, 리신 잔기 상에 있는 각각의 아민기에는 분자량이 대략 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 부착될 수 있다. 따라서, Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 대략 40,000 Da일 수 있다.
또다른 실시태양에서, 기능적 부분은 PEG이고, WO 98/25971 및 WO 04/72116에 기재되어 있는 방법을 사용하여 부착되며, 이에 의해, 리실-말레이미드기는 중쇄의 C 말단 종단부에 있는 시스테인 잔기에 부착되며, 리실 잔기의 각각의 아미노기는 그에 공유적으로 연결되어 있는, 분자량이 약 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 갖는다. 따라서, 항체에 부착된 PEG의 총 분자량은 대략 40,000 Da이다.
또다른 실시태양에서, 기능적 부분은 PEG이고, WO 98/25971 및 WO 04/072116 에 기재되어 있는 방법을 사용하여 F(ab)2 단편에 부착되며, 이에 의해, 리실-디말레이미드기는 각 Fab 중쇄의 C 말단 종단부에 있는 시스테인 잔기에 부착되며, 리실 잔기의 각각의 아미노기는 그에 공유적으로 연결되어 있는, 분자량이 약 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 갖는다. 따라서, F(ab)2 항체에 부착된 PEG의 총 분자량은 대략 40,000 Da이다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 Fab' 항체 단편인데, 이는 완전 인간 또는 인간화된 것일 수 있으며, 중쇄, 경쇄, 또는 그 둘 모두에서 PEG화되어 있는 것이다. 다른 실시태양에서, 완전 인간 또는 인간화된 것일 수 있는 항체 단편은 하나 또는 둘 모두의 중쇄 상에서, 또는 하나 또는 둘 모두의 경쇄 상에서, 또는 중쇄 및 경쇄, 둘 모두 상에서 PEG화되어 있는 것이다.
따라서, 특정 실시태양에서, 항CD154 항체는 PEG가 시스테인에서 또는 리신 잔기에서 항체에 연결되어 있는 PEG에 연결된 항체(예를 들면, PEG에 연결된 인간 항체)이다. 특정 실시태양에서, PEG화된 항CD154 항체의 유체역학적 크기는 적어도 24 kDa이다. 다른 실시태양에서, PEG의 크기는 (20 kD와 60 kD를 포함하여) 대략 20에서 60 kD 정도로 다양할 수 있다. 추가의 실시태양에서, PEG에 연결된 항CD154 항체의 유체역학적 크기는 적어도 200 kD이다. 항CD154 항체가 PEG 부분에 연결되어 있는 것인 본 발명의 실시태양에서, PEG화된 항CD154 항체는 PEG 부분이 없는 항CD154 항체와 비교하여 증가된 생체내 반감기를 가질 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 15의 경쇄 서열 및 서열 번호 13의 중쇄 서열을 포함하며, 단백질이 PEG화되어 있는 것인 CD154 결합 단백질을 제공한다.
본 발명의 항체의 생체내 보전성 및 수명을 향상시키는데 유용할 수 있는 다른 기능적 부분으로는 폴리펩티드들을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항CD154 항체 또는 항체 단편은 인간 혈청 알부민(HSA) 폴리펩티드를 포함하도록 변형될 수 있다. 그러한 항체 접합체는 접합되지 않은 항체 또는 항원 결합 단편과 비교하여 증가된 안정성 및 증가된 혈청 반감기를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 특정 실시태양에서, HSA에 접합된 항CD154 항체는 접합되지 않은 항CD154 항체에 비해 증가된 생체내 반감기를 나타낼 수 있다. HSA에 접합된 항체의 반감기(tα 또는 tβ 반감기)는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상 만큼 증가할 수 있다. 예를 들어, tα 반감기 범위는 0.25분 내지 12시간 이내일 수 있는 반면, 예를 들어, tβ 반감기는 12-48시간 이내일 수 있다. tα 또는 tβ 반감기는 적어도 3일, 적어도 7일, 적어도 14일, 적어도 21일, 적어도 28일, 적어도 1개월 이상인 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 검출가능한 마커, 예를 들어, 방사성 동위원소, 효소, 염료 또는 비오틴, 또는 다른 친화성 시약으로 표지함으로써 기능적 부분을 갖도록 변형된 항체이다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 치료제, 예를 들어, 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들면, 111In 또는 90Y), 독소 부분 (예를 들면, 파상풍 톡소이드 또는 리신), 톡소이드 또는 화학요법제에의 접합에 의해 기능적 부분을 갖도록 변형된 항체이다(U.S. 6,307,026).
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 영상화제에의 접합에 의해 변형된 항체이다. 영상화제는 용이한 분리 또는 검출을 위해 예를 들어, 표지 부분(예를 들면, 비오틴, 형광성 부분, 방사성 부분, 히스티딘 또는 myc 태그 또는 다른 펩티드 태그)을 포함할 수 있다.
본 발명의 항CD514 항체의 변형을 위한, 또는 그에의 접합을 위한 기능적 부분의 추가적인 예로는 세포에 유해한(예로서, 세포를 사멸시키는) 임의의 제제를 비롯한, 혈청독소 또는 세포독성제를 포함할 수 있다. 예로는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탄시노이드, 스폰지스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스텔린, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 그의 유도체 및 동족체를 포함한다.
접합에 유용한 기능적 부분으로는 항엽산제(예로서, 아미노프테린 및 메토트렉세이트), 항대사물질(예로서, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예로서, 메클로레타민, 티오테파, 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플래티넘(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예로서, 다우노루비신(구 다우노 마이신) 및 독소루비신), 항생제(예로서, 닥티노마이신(구 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리키아미신 또는 두오카마이신, CC-1065, 에네디엔, 네오카지노스타틴), 및 항유사분열제(예로서, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 상세한 설명을 위해서 [Garnett, 2001, Advanced drug Delivery Reviews 53:171-216]을 참조한다.
다른 기능적 부분으로는 킬레이트화된 방사성 핵종, 예로서, 131I, 111In 및 90Y, Lu177, 비스무스213, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 턴스텐188/레늄188, 211아스타틴; 또는 약물, 예로서, 제한없이, 알킬포스포콜린, 토포이소머라제 I 저해제, 톡소이드 및 수라민을 포함할 수 있다.
추가의 기능적 부분으로는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심의 대상이 되는 효소로는 단백질분해 효소, 하이드롤라제, 리아제, 이소머라제, 트랜스퍼라제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 관심의 대상이 되는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드로는 면역글로불린, 독소, 예로서, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소, 메이탄시노이드(예를 들어, 제한없이, DM1), 단백질 예로서, 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성제, 혈전제 또는 항혈관형성제, 예를 들면, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 안지오게닌, 겔로닌, 돌스타틴, 소홈(minor groove) 결합제, 비스-이도-페놀 머스타드 또는 생물학적 반응 조절물질, 예로서, 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-6(IL-6), 과립구 대식세 포 집락 자극 인자(GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF: granulocyte colony stimulating factor), 신경 성장 인자(NGF: nerve growth factor) 또는 다른 성장 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다른 기능적 부분으로는 예를 들면, 진단에 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결분자단, 형광성 물질, 발광성 물질, 생체발광성 물질, 방사성 핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방출 단층촬영술용), 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 진단제용으로서, 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 일반적으로 US 4,741,900을 참조한다. 적합한 효소로는 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타 갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하고; 적합한 보결분자단으로는 스트렙타비딘, 아비딘 및 비오틴을 포함하고; 적합한 형광성 물질로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 적합한 발광성 물질로는 루미놀을 포함하고; 적합한 생체발광성 물질로는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사성 핵종으로는 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다.
핵산
특정 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
따라서, 특정 실시태양에서 본 발명은 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 41, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 67, 서열 번호 70 및 서열 번호 73으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열(들)을 포함하는 단리된, 재조합 및/또는 합성 DNA 분자에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 개시는 서열 번호 1, 서열 번호 2; 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 14; 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58 또는 서열 번호 60의 가변 도메인 서열의 서열과 적어도 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 29, 서열 번호 서열 번호 56 또는 서열 번호 60의 가변 도메인의 서열을 코딩하는 핵산에 (예를 들면, 엄격한 조건하에서) 하이브리드화하는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 서열(들)을 포함하는 단리된 핵산을 특징으로 한다.
본 발명의 핵산은 추가로 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열, 비번역 5' 영역, 및 비번역 3' 영역) 및/또는 벡터 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산이 벡터를 구성한다. 추가의 다른 실시태양에서, 본 발명은 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 (예를 들면, Fc 영역이 존재할 경우) 감소된 글리코실화를 나타내거나, 글리코실화를 나타내지 않는 항체를 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기술된 핵산의 서열 변이체에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 본원에서 제공하는 서열들 중 임의의 것과 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100% 동일한 핵산 서열, 및 그의 단편 및 그에 대한 상보체를 포함한다. 본 발명은 또한 유전자 코드의 축퇴성에 기인하여, 특히 본원에서 제공하는 서열들과 상이한 핵산을 포함한다.
추가로, 본 발명은 본원에서 제공하는 핵산들 중 임의의 것과 특이적으로 하이브리드화하는 서열을 포함한다. "특이적으로 하이브리드화한다"라는 용어는 본원에서 제공하는 서열, 또는 그에 상보적인 서열의 적어도 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 100개의 연속적인 뉴클레오티드에 하이브리드화함으로써 대조군 핵산(예를 들면, 본원에서 제공하는 특이적인 항체 서열 이외의 비특이 DNA 또는 RNA)에는 15% 미만, 바람직하게, 10% 미만, 및 더욱 바람직하게는 5% 미만의 배경 하이브리드화를 갖는 것인 핵산 서열의 능력을 지칭한다. 다양한 하이브리드화 조건을 사용하여 특이적인 하이브리드화를 검출할 수 있으며, 엄격도는 주로 하이브리드화 분석법 중 세척 단계에 의해 결정된다. 일반적으로 고온 및 저염농도가 높은 엄격도를 제공하는 반면, 저온 및 고염농도는 낮은 엄격도를 제공한다. 낮은 엄격도의 하이브리드화는 예를 들면, 50℃하에 약 2.0 x SSC 중에서 세척함으로써 이루어지고, 높은 엄격도는 50℃하의 약 0.2 x SSC로 이루어진다.
본 발명의 CD154 결합 단백질을 코딩하는 핵산은 리더 또는 신호 서열을 포함할 수 있다. 리더 및 신호 서열은 달라질 수 있고, 대체 리더 서열로 치환될 수 있으며, 특정 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질은 리더 서열을 포함하지 않는 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 임의의 적합한 대체 리더 또는 신호 서열이 사용될 수 있다.
숙주 세포
본 발명은 도 2-8, 10, 11 및 13-16에 제공되어 있는 DNA 분자 중 임의의 것(그의 서열 변이체 포함)을 발현하도록 공학처리된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 발현하는 숙주 세포 또한 제공한다. 결합 단백질이든 항체이든 간에, 이는 오직 하나의 쇄만을 포함할 수 있으며, 이러한 경우, 오직 상기 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 DNA 서열만이 세포를 형질감염시키는데 사용되어야 한다. 2개의 쇄를 포함하는 항체를 생산하는 경우, 세포주는 2개의 벡터로 형질감염될 수 있다. 별법으로, 적절할 경우, 단일의 벡터는 발현시키고자 하는 특정 항체 구조체에 따라 2개의 쇄 서열 모두, 예로서, 항CD154 항체의 경쇄 및 중쇄, 둘 모두, 및 변형물을 코딩할 수 있다. 숙주 세포는 예를 들어, 원핵 세포, 예로서, E. 콜라이, 또는 다른 미생물 세포, 또는 포유동물 세포, 예로서, 인간, 마우스, 원숭이, 토끼, 염소, 햄스터, 또는 래트 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 식물 세포, 및 하등 진핵 세포, 예로서, 진균 세포(하기 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 진핵 세포일 수 있다. 숙주 세포 기관은 재조합적으로 발현된 단백질을 글리코실화시키는 것을 담당하는 바, 본 발명의 항체의 이펙터 기능을 추가로 변경시키기 위해서는 특정 글리코실화 패턴이 선택될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 본 발명을 실시하는데 유용한 숙주 세포는 예를 들어, (1) 세균 세포, 예로서, E. 콜라이, 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus), 스트렙토코씨(Streptococci), 스타필로코씨(Staphylococci), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 세포, 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium); (2) 진균 세포 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 세포, 효모 세포, 예로서, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 다른 피키아(Pichia) 종, K. 락티스(K. lactis) (3) 곤충 세포주, 예로서, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터 유래된 것 - 예를 들면, Sf9 및 Sf21 세포주, 및 익스프레스SF(expresSF)™ 세포(미국 코네티컷주 메리든 소재의 Protein Sciences Corp.) - 초파리 S2 세포, 및 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 하이 파이브(High Five)? 세포(미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Invitrogen); (4) 포유동물 세포, 또는 (5) 식물 세포일 수 있다.
따라서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체는, 외인성 핵산 서열을 발현하도록 공학처리될 수 있는 임의의 이용가능한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 본 발명의 항CD154 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 하등 진핵 숙주 세포로는 당업계에 기술되어 있는 세포를 포함한다(예를 들면, WO 02/00879, WO 03/056914, WO 04/074498, WO 04/074499, [Choi et al., 2003, PNAS, 100: 5022-5027]; [Hamilton et al., 2003, Nature, 301:1244-1246] 및 [Bobrowicz et al., 2004, Glycobiology, 14: 757-766] 참조).
전형적인 포유동물 세포로는 COS1 및 COS7 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, NSO 골수종 세포, NIH 3T3 세포, 293 세포, HEPG2 세포, HeLa 세포, C127, 3T3, BHK, 보우스 흑색종(Bowes melanoma) 세포, L 세포, MDCK, HEK293, WI38, 뮤린 ES 세포주(예를 들면, 균주 129/SV, C57/BL6, DBA-1, 129/SVJ로부터 유래), K562, 주르카트 세포, 및 BW5147을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체를 발현하는 세포를 제공하는데, 이는 하이브리도마 세포, B 세포, 혈장 세포 뿐만 아니라, 본 발명의 항체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유동물 및 인간 숙주 세포(예를 들면, 성인 배아 줄기 세포)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 유용한 포유동물 세포주는 잘 알려져 있고, 미국 표준 균주("ATCC": American Type Culture Collection)(미국 버지니아주 마나싸스 소재) 및 코리엘 세포 저장소의 국립 종합의학연구소(NIGMS) 인간 유전 세포 저장소(National Institute of General Medical Sciences(NIGMS) Human Genetic Cell Repository at the Coriell Cell Repositories)(미국 뉴저지주 캠던 소재)로부터 쉽게 입수할 수 있다. 이러한 세포 유형은 단지 대표적인 것이며, 상기 목록에 빠짐없이 철저하게 작성되어 있는 것은 아니다.
상기에 일부가 기술되어 있는 다른 고려 사항 중에서 숙주 세포는 발현된 항CD154 항체를 원하는 방식으로 프로세싱할 수 있는 그의 능력에 대하여 선택될 수 있다. 변형된 글리코실화 및 비글리코실화 이외에도, 상기와 같은 폴리펩티드의 번역후 변형으로는 아세틸화, 카르복실화, 카복시메틸화, 인산화, 지질화 및 아실화 를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 무세포 번역에 의해 제조되거나, 시험관내에서 합성된다. 이들 단백질을 코딩하는 유전자는 시험관내에서 합성될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체는 대규모 생산을 용이하게 하기 위하여 항체 발현 세포를 함유하는 생체반응기에서 생산된다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질 또는 항CD154 항체는 대규모 생산을 용이하게 하기 위하여 우유에서 항체를 발현하는, 유전공학처리된 포유동물 또는 트랜스제닉 포유동물(예를 들면, 염소, 소, 양)에서 생산된다(US 5,827,690; [Pollock et al. 1999. J. Immunol . Meth. 231(l-2):147-57]).
치료학적 방법
본 발명의 하나의 실시태양에서, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 피험체에서 면역 반응을 저해할 수 있다. 본 발명의 항체, 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 유효한 저해량으로 피험체에게 투여된다.
특정 실시태양에서, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 "유효한 저해량"은 투여받는 피험체에서 CD154-CD40 상호작용을 저해하는데 효과적인 임의의 양이다. "저해량"을 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 포함된 피험체의 종류, 피험체의 크기 및 연령, 전달되는 특정 치료제의 약동학적 성질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 인자들에 따라 달라진다.
본 발명의 또다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 CD154-CD40 상호작용을 저해시킴으로써 면역 반응을 저해시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 염증을 저해시킬 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 염증성 반응은 붉어짐, 팽윤, 발열 및 통증, 모세관 확장의 결과로서 부종 및 포식성 백혈구의 유주를 특징으로 한다. 염증성 반응의 몇몇 일례로는 관절염, 접촉성 피부염, 과다 IgE 증후군, 염증성 장 질환, 알레르기성 천식, 및 특발성 염증성 질환을 포함한다. 특발성 염증성 질환으로는 예를 들어, 건선 및 루푸스(예를 들면, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 약물 유도성 홍반성 루푸스, 및 루푸스 신염)를 포함한다. 예를 들면, [Gallin 1989. Fundamental Immunology, Chapter 26, Raven Press, 2d Ed., pp. 721-733, New York]을 참조한다. 본 발명은 SLE의 증상을 치료 또는 예방하는데 유효한 양으로 1가 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 1가의 항CD154 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 전신 홍반성 루푸스(SLE)의 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
관절염의 몇몇 일례로는 류마티스양 관절염, 비류마티스양 염증성 관절염, 라임병과 관련된 관절염 및 염증성 골관절염을 포함한다. 특발성 염증성 질환의 몇몇 일례로는 건선 및 전신성 루푸스를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 피험체의 이식된 기관에 대한 거부를 저해할 수 있다.
본 발명의 보다 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 피험체의 이식된 심장, 신장, 간, 피부, 췌장도세포 또는 골수에 대한 거부를 저해할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 피험체에서 이식편대숙주병을 저해할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 피험체에서 알레르기성 반응, 예를 들어, 건초열, 또는 페니실린 또는 다른 약물에 대한 알레르기를 저해할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 자가면역 질환을 앓는 피험체에서 자가면역 반응을 저해할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 자가면역 반응은 류마티스양 관절염, 중증 근육무력증, 전신 홍반성 루푸스, 그레이브스병, 특발성 혈소판감소성 자반증, 용혈 빈혈, 당뇨병, 염증성 장 질환, 크론병, 다발성 경화증, 건선, 약물 유도성 자가면역 질환, 또는 약물 유도성 루푸스로 구성된 군으로부터 선택되는 병태와 관련이 있거나, 그로부터 유래된다. 특정 실시태양에서, 자가면역 반응은 전신 홍반성 루푸스와 관련이 있거나, 그로부터 유래된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 감염성 질환으로부터 유래된 자가면역 반응을 앓는 피험체에서 자가면역 반응을 저해할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 라이터증후군, 척추관절염, 라임병, HIV 감염, 매독, 또는 결핵으로부터 유래된 자가면역 반응을 앓는 피험체에서 자가면역 반응을 저해시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 피험체에서 섬유증을 저해시킬 수 있다.
섬유증의 몇몇 일례로는 폐섬유증 또는 섬유질병을 포함한다. 폐섬유증의 몇몇 일례로는 성인성 호흡곤란증후군에 속발하는 폐섬유증, 약물 유도성 폐섬유증, 특발성 폐섬유증, 또는 과민성 폐렴을 포함한다. 섬유질병의 몇몇 일례로는 C형 간염; B형 간염; 경화; 독성 상해에 속발하는 간경화; 약물에 속발하는 간경화; 바이러스 감염에 속발하는 간경화; 및 자가면역 질환에 속발하는 간경화를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 위장 질환을 저해시킬 수 있다. 위장 질환의 몇몇 일례로는 식도 운동 장애, 염증성 장 질환(크론병 및 궤양성 대장염 포함), 위염, 콜라겐성 대장염(임파성 대장염 및 미세형 대장염), 복강 질환(글루텐 장병증, 비열대 스프루, 또는 글루텐 소화장애로도 명명됨), 및 공피증을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 혈관 질환을 저해시킬 수 있다. 혈관 질환의 몇몇 일례로는 죽상동맥경화증, 신장 동맥 질환, 림프부종, 허혈성 질병, 및 재관류 손상을 포함한다. 콜라겐성 혈관 질환/면역복합체병, 예로서, 전신 홍반성 루푸스 또는 한랭글로불린혈증도 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 T 세포 암, - 예를 들면, T 세포 백혈병 또는 림프종을 앓는 피험체에서 T 세포 종양 세포의 증식을 저해시킬 수 있다. 그러한 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 상기 피험체에서 T 세포 종양 세포의 증식을 저해시키는데 유효한 양으로 피험체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 1형 인간 T 세포 림프영양성 바이러스(HTLV I: human T-cell lymphotropic virus type 1)에 의한 피험체 T 세포의 바이러스성 감염을 저해시킬 수 있다. 그러한 항CD154 항체 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 바이러스성 감염을 저해시키는데 유효한 양으로 피험체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 항체가 특이적으로 결합하는 CD154 단백질을 발현하는 피험체에서 종양 세포 또는 신생물성 세포를 영상화시킬 수 있다. 피험체에서 종양 세포 또는 신생물성 세포를 영상화시 키는 방법은 종양 세포 또는 신생물성 세포의 표면 상에서 항체와 단백질 사이에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건하에서 유효량의, 본 발명의 항CD154 항체, 또는 그를 포함하는 조성물을 피험체에게 투여하는 단계; 및 형성된 임의의 항체/단백질 복합체를 영상화시켜 피험체에서 임의의 종양 세포 또는 신생물성 세포를 영상화시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 항체가 특이적으로 결합하는 CD154 단백질을 발현하는 피험체에서 종양 세포 또는 신생물성 세포의 존재 여부를 검출할 수 있다. 피험체에서 종양 세포 또는 신생물성 세포의 존재 여부를 검출하는 상기와 같은 방법은 종양 세포 또는 신생물성 세포의 표면 상에서 항체와 단백질 사이에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건하에서 유효량의, 본 발명의 항CD154 항체, 또는 그를 포함하는 조성물을 피험체에게 투여하는 단계; 피험체로부터 임의의 비결합 영상화제를 제거하는 단계; 및 형성된 임의의 항체/단백질 복합체의 존재 여부, 즉, 피험체에서 종양 세포 또는 신생물성 세포의 존재 여부를 나타내는 상기 복합체의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함한다.
약제학적 조성물
본 발명은 본 발명에 기술된 바와 같이, CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의, 본 발명의 CD154 결합 단백질, 예를 들면, 항CD154 항체를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 비글리코실 항CD154 항체(또는 다른 이펙터 기능이 감소된 항CD154 항체), 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 CD154 항원(예를 들면, ATCC 수탁번호 PTA-4931을 갖는 세포주에 의해 생산된 비글리코실 hu5c8이 특이적으로 결합하는 CD154 항원)에 결합할 수 있으며, 여기서, 비글리코실 항CD154 항체는 N298Q(EU 카뱃 번호화 사용시 N297) 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하며, 추가로는 본원에서 다른 경우에 기술된 바와 마찬가지로 감소된 이펙터 기능을 나타낸다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 비글리코실 항CD154 항체(또는 다른 이펙터 기능이 감소된 항CD154 항체), 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 이펙터 수용체에는 결합하지 못한다. 보다 구체적인 실시태양에서, 비글리코실 항CD154 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 ATCC 수탁번호 PTA-4931을 갖는 세포주에 의해 생산된 비글리코실 hu5c8이 특이적으로 결합하는 CD154 단백질에 결합할 수 있으며, 여기서, 비글리코실 항CD154 항체 또는 약제학적 조성물은 이펙터 수용체에는 결합하지 못한다.
본 발명의 구체적인 실시태양에서, 비글리코실 항CD154 항체(또는 이펙터 기능이 감소된 다른 항CD154 항체 또는 CD154 결합 단백질), 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 혈전색전성 사례를 비롯한, 혈전증을 유발하지 않는다. 본 발명의 보다 구체적인 실시태양에서, 비글리코실 항CD154 항체 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 ATCC 수탁번호 PTA-4931을 갖는 세포주에 의해 생산된 비글리코실 hu5c8이 특이적으로 결합하는 CD154 단백질에 결합할 수 있으며, 여기 서, 비글리코실 항CD154 항체 또는 약제학적 조성물은 혈전증을 유발하지 않는다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 애주번트, 전달 비히클, 완충액, 및/또는 안정화제 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 항체의 제조 및 투여에 관한 예시적인 기법은 예를 들어, ["Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA(최신판)]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 더욱 특징적인 실시태양에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는 인산염 완충처리된 염수, 생리식염수, 물, 시트레이트/수크로스/트윈(Tween) 제제 및 에멀젼 - 예를 들면, 유/수 에멀젼이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 약제학적 조성물은 조성물에 대한 숙주 면역 반응을 감소 또는 예방하기 위하여 미세캡슐화 장치 내에서 전달될 수 있다. 예로서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편과 같은 결합 물질 또한 예로서, 리포좀 또는 다른 캡슐화되거나 면역보호화된 전달 비히클과 같이 막 내에 존재하도록 미세캡슐화되어 전달될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 약제학적 조성물은 멸균 주사용 제제 형태, 예를 들면, 멸균 주사용의 수성 또는 유성 현탁제 형태일 수 있다. 이러한 현탁제는 적합한 분산제, 습윤화제, 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 약제학적 조성물은 경구적으로, 국소적으로 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 전신 투여되는 경우, 치료학적 조성물은 pH, 등장 성 및 안정성을 충분히 고려하여, 멸균이어야 하며, 실질적으로 발열물질이 없어야 하고, 비경구적으로 허용가능한 용액 중에 존재하여야 한다. 예를 들어, 인간 치료제로서 투여하기에 적합하도록 하기 위해서는 약제학적 제제에는 실질적으로 발열물질이 없다. 이러한 조건은 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 보다 구체적인 실시태양에서, 경구 투여용 약제학적 조성물은 적합한 캡슐제, 정제, 수성 현탁제 또는 액제로 제형화된다. 경구 투여용 조성물의 고체 제형은 적합한 담체 또는 부형제, 예로서, 옥수수 전분, 젤라틴, 락토스, 아카시아, 수크로스, 미정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 이인산칼슘, 탄산칼슘, 염화나트륨 또는 알긴산을 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 붕해제는, 제한없이, 미정질 셀룰로스, 옥수수 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 및 알긴산을 포함한다. 사용될 수 있는 정제 결합제는 아카시아. 메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈(포비돈(Povidone)™), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 수크로스, 전분 및 에틸셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 실리콘 유액, 활석, 왁스, 오일 및 콜로이드성 실리카를 포함한다.
본 발명의 보다 구체적인 실시태양에서, 국소 적용을 위한 약제학적 조성물은 적합한 연고로 제형화할 수 있다. 국소용 조성물의 제형 중 몇몇 예로는 활성 성분 및 다양한 지지물 및 비히클을 함유하는 점적제, 팅크제, 로션, 크림제, 액제, 및 연구를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 국소 반고체 연고 제형은 전형적으로 담체, 예로서, 약제학적 크림 베이스 중 활성 성분을 약 1 내지 20% - 예를 들면, 5 내지 10%의 농도로 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 흡입 및 경피 조성물용 약제학적 조성물 또한 쉽게 제조할 수 있다. 치료학적 조성물은 예를 들면, 액상 또는 분말 에어로졸(동결건조됨)로서 코 또는 폐를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 물 또는 다른 수성 비히클 중에서 제조된 경구 투여용 약제학적 조성물의 액상 제형은 다양한 현탁화제, 예로서, 메틸셀룰로스, 알기네이트, 트래거캔스, 펙틴, 켈긴, 카라기난, 아카시아, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리비닐 알코올을 함유할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 액상 제형은 활성 화합물(들)과 함께, 습윤제, 감미제 및 착색제와 향미제를 함유하는, 액제, 에멀젼, 시럽제 및 엘릭시르제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물의 다양한 액상 및 분말 제형은 치료받는 포유동물 폐로 흡입될 수 있도록 하는 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 주사용 약제학적 조성물의 액상 제형은 다양한 담체, 예로서, 식물성 오일, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카르보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 폴리올 - 즉, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등을 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 조성물은 시트레이트/수크로스/트윈 담체를 포함한다. 정맥내 주사를 위해 수용성 버전의 조성물을 점적법으로 투여하여, 항진균제 및 생리학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 약제학적 제형을 주입할 수 있다. 생리학적으로 허용가 능한 부형제는, 예를 들어, 5% 덱스트로스, 0.9% 염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 불용성 형태의 조성물은, 장쇄 지방산의 에스테르, 예로서, 에틸 올레이트와 같이 약제학적으로 허용가능한 오일 베이스 또는 수성 베이스 중 현탁제로서 제조 및 투여될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 중 본 발명의 항CD154 항체를 약 0.1 내지 90 중량%(예로서, 1 내지 20% 또는 1 내지 10%)로 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 각 약제학적 조성물 중 본 발명의 항CD154 항체의 최적 백분율은 제형 그 자체 및 특이적인 병리에서의 요구되는 치료 효과 및 관련된 치료 요법에 따라 달라진다. 약제학적 제형은 당업계에 잘 확립되어 있다. 의학 분야의 숙련자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 약제학적 조성물을 피험체에게 투여할 수 있다.
따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 장기 방출형 제형에 관한 것이다. 장기 방출형, 또는 방출 조절형 또는 서방형이란 피험체에게 투여된 후 장기간에 걸쳐 활성 약물, 예로서, 폴리펩티드 또는 항체 약물을 방출하는 약물 제형을 지칭한다. 폴리펩티드 약물은 원하는 시간 범위에 걸쳐(예를 들면, 약물 제형에 따라, 수일, 수시간, 수일, 수주 또는 그 이상의 시간에 걸쳐) 장기간 방출될 수 있는데, 이는, 혈류를 통한 즉각적 흡수 또는 즉각적 분포를 위해서 실질적으로 완전한 단위 제형으로 이용가능한 것인 표준 제형과는 상이하다. 특정 실시태양에서, 장기 방출형 제형은 단일 투여로부터 예를 들어, 8시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이 상, 36시간 이상, 48시간 이상, 60시간 이상, 72시간 이상, 84시간 이상, 96시간 이상 동안, 혹은 그 이상의 시간까지도, 예를 들어, 1주 또는 2주 이상 동안, 예를 들어, 1개월 이상 동안 지속되는 순환 약물 수준을 얻을 수 있다. 장기 방출형 조성물은 본 발명의 1가의 항CD154 항체를 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 1가의 항체는 인간화된 항체 또는 완전 인간 항체이다. 추가의 실시태양에서, 항CD154 항체, 항CD154 항체는 본원에 기술되어 있는 바와 같은 이펙터 기능이 감소된 항체이다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 약제학적 조성물은 면역억제 화합물 또는 면역조절 화합물을 추가로 포함한다. 예를 들어, 그러한 면역억제 화합물 또는 면역조절 화합물은 CD28을 통한 T 세포 공동 자극 신호 전달을 방해하는 제제; 칼시네우린 신호 전달을 방해하는 제제, 코르티코스테로이드, 항증식제; 및 CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 및 RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTβ 및 VLA-4를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 면역 세포의 표면 상에 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나일 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 면역억제 화합물 또는 면역조절 화합물은 타크롤리무스, 시롤리무스, 마이코페놀레이트 모페틸 또는 그의 활성 형태인 마이코페놀산, 미조루빈, 데옥시스퍼구알린, 브레퀴나 나트륨, 레플루노마이드, 라파마이신 또는 아자스피란이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 그를 포함하는 약제학적 조성물은 용기, 패키지 또는 디스펜서 중에 단독으로, 또는 키트의 한 부분으로서 라벨 및 투여 설명서와 함께 포함될 수 있다.
투여 및 전달 경로
본 발명의 항CD154 항체 및 본 발명의 약제학적 조성물은 의학적으로 허용가능한 임의의 방식으로 피험체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 "투여"란 당업자에게 알려져 있는, 항체, 항체 단편 또는 약제학적 조성물의 임의의 표준 투여 방법을 의미하는 것으로, 본원에 제공된 예로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체 및 본 발명의 약제학적 조성물은 표준 방법을 사용하여 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 수질내, 심실내, 경막외, 동맥내, 혈관내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 포막내, 간장내, 척수내, 종양내, 두개내; 장내, 폐내, 점막내, 자궁내, 설하 경로로 주사하여, 또는 염증 또는 종양 성장 부위에서 국소 주사하여 피험체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체 및 본 발명의 약제학적 조성물은 경구적으로 또는 비강으로, 또는 흡입에 의해, 눈, 직장 또는 국소 경로로 피험체에게 투여될 수 있다.
보다 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체, 및 본 발명의 약제학적 조성물은 캡슐제, 정제, 수성 현탁제 또는 액제 형태로 피험체에게 경구 투여될 수 있다.
보다 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체 및 본 발명의 약제학적 조성물은 크림제, 연고 등을 도포하여 피험체에게 국소 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체, 및 본 발명의 약제 학적 조성물은 또한 연무기, 건조 분말 흡입기 또는 정량식 흡입기를 사용하여 흡입 투여될 수 있다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체, 및 본 발명의 약제학적 조성물은 서방형 투여로, 수술 도중 직접 적용되는 침식성 임플란트의 데포 주사와 같은 수단으로, 또는 주입 펌프 또는 생체적합성 서방형 임플란트의 삽입으로 피험체에게 투여될 수 있다.
보다 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체, 및 본 발명의 약제학적 조성물은 1개월, 3개월 또는 6개월 데포 주사가능성 또는 생체분해성 물질 및 방법을 사용하여, 주사가능한 데포 투여 경로로 피험체에게 투여될 수 있다.
보다 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체, 및 본 발명의 약제학적 조성물은, 항체, 항체 유도체 또는 약제학적 조성물을 함유하는 경피성 패치를 피험체 피부에 적용하여, 일반적으로 패치당 1 내지 5시간 동안 이 패치를 피험체 피부와 접촉시키는 방식으로 피험체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체, 및 본 발명의 약제학적 조성물은 의학적으로 허용가능한 체중 1 kg당의 임의 투여량 및 임의의 투여 빈도로 피험체에게 투여될 수 있다. 허용가능한 투여량은 약 0.01 내지 200 mg/kg 피험체 체중 범위를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 사용하는 임의의 방법에서, 항체 또는 약제학적 조성물은 단일 또는 다중 용량으로 매일, 매 2, 3, 4, 5 또는 6일마다, 매주, 매월, 또는 그의 분할된 시간 또는 배가된 시간마다 피험체에게 투여될 수 있고, 추가로는, 전문의에 의해 결정되는 바와 같이, 매일 내지 두 달에 한번씩의 범위로 간격을 두고 반복적으로 피험체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 사용하는 임의의 방법에서, 결합 단백질, 항체 또는 그를 포함하는 약제학적 조성물은 수일 또는 수주 내지 피험체의 수명에 이르는 의학적으로 처방된 기간 동안 간격을 두고 투여될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체, 및 본 발명의 약제학적 조성물은 매일 내지 두 달에 한번씩의 범위로 간격을 두고 반복적으로 피험체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 항CD154 항체, 및 본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하다면 하루에 다회 투여량으로 투여하여, 원하는 전체 하루 투여량을 얻을 수 있다. 치료법의 효과는 질병의 공지된 징후 또는 증상에 대해 환자를 모니터링하여 평가할 수 있다.
본 발명의 모든 실시태양의 경우, 원하는 효과를 얻는데 효과적인 본 발명의 항CD154 항체 및 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량 및 투여 속도는 다양한 인자, 예를 들어, 치료하고자 하는 질환의 성질, 피험체의 크기 및 연령, 치료 목적, 사용되는 특정 약제학적 조성물, 활성제의 약동학적 성질, 및 치료하는 의사의 판단에 따라 달라질 것이다.
따라서, 본 발명의 항CD154 항체, 및 본 발명의 약제학적 조성물은 그들의 의도하는 목적을 달성하는데 효과적인 양으로 투여될 것이다. 치료학적 유효량이란 질환의 증상을 예방, 완화 또는 호전시키거나, 치료받는 피험체의 생존을 연장시키는데 효과적인 양을 지칭할 수 있다. 치료학적 유효량은 대상 항체의 투여량 및 투 약 투여 스케줄을 변경시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 항CD154 항체, 및 본 발명의 약제학적 조성물은 피험체에게 단기간 노출된 항원, 예로서, 단일간의 치료시에 투여된 외인성 항원에 대한 면역 반응을 방지하는 것과 같은, 특별한 조치를 위해 단일 용량으로 투여될 수 있다. 그러한 요법의 예로는 치료제, 예를 들어, 항원성 약제, 알레르겐 또는 혈액 생성물, 또는 유전자 요법 벡터와 함께 본 발명의 항체 단편을 동시투여하는 것을 포함한다. 예로서, 이식된 조직 또는 만성적으로 투여된 항원성 약제에 대한 면역 반응을 조절하는 것과 같이, 항원이 만성적으로 존재하는 경우의 조치에 있어서, 본 발명의 항체 단편 또는 약제학적 조성물은 수일 또는 수주 내지 피험체의 수명에 이르는 의학적으로 처방된 기간 동안 간격을 두고 투여된다.
본원에 기술된 방법 중 임의의 것에서, 항체 또는 약제학적 조성물은 제2 제제와 함께 피험체에게 투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 제제는 치료제, 예로서, 면역조절제 또는 면역억제제이다. 면역조절제 또는 면역억제제는 하기 중 임의의 것일 수 있다:
(a) CD28을 통한 T 세포 공동 자극 신호 전달을 방해하는 제제;
(b) 칼시네우린 신호 전달을 방해하는 제제;
(c) 코르티코스테로이드;
(d) 항증식제; 및
(e) CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 및 RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTβ, 및 VLA-4를 포함하나, 이에 한정되지 않는 면역 세포의 표면 상에 발현된 단백질에 특 이적으로 결합하는 다른 항체. 면역조절제 또는 면역억제제는 예를 들어, 타크롤리무스, 시롤리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 미조루빈, 데옥시스퍼구알린, 브레퀴나 나트륨, 레플루노마이드, 라파마이신 또는 아자스피란일 수 있다. 항체 및 제2 제제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
몇몇 일례로, 본 발명의 하나 이상의 핵산을 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것이 이로울 수 있다. 잘 알려져 있는 방법에 따라 본 발명의 적어도 하나의 핵산을 투여하는 단계를 포함하는 본 발명의 치료학적 방법 및 진단학적 방법이 본 발명의 범주내 포함된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 기술된 방법에 의해 치료받을 수 있는 피험체(들)는 동물이다. 바람직하게, 동물은 포유동물이다. 치료받을 수 있는 포유동물의 예로는 인간, 인간 이외의 영장류, 설치류(래트, 마우스, 햄스터 및 기니 피그), 소, 말, 양, 염소, 돼지, 개 및 고양이를 포함한다. 바람직하게, 포유동물은 인간이다.
본 발명은 하기의 실시예에 기초하여 더욱더 잘 이해될 수 있다. 그러나, 당업자는 논의되는 특정 방법과 결과는 단순히 본원에 기술된 본 발명을 예시하는 것임을 쉽게 이해할 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 생성물을 예시한다. 당업자에게 자명한 분자 생물학 분야에서 일반적으로 접하게 되는 기술한 조건 및 파라미터의 적합한 변형 및 변경은 본 발명의 정신 및 범주 내에 속한다.
실시예 1: SLAM 에 의한 항인간 CD154 항체 생성
림프구 항체 선별 방법(SLAM)([Babcook et al., 1996, Proc . Natl . Acad . Sci, 93, 7843-7848]; WO 92/02551; [de Wildt et al., 1997, J. Immunol . Methods, 207:61-67] 및 [Lagerkvist, et al., 1995, BioTechniques 18:862-869])을 사용하여 항인간 CD154 항체를 동정하고 단리시켰다. 생체내 면역 반응 동안 생성되는 높은 친화도의 항체를 생산하는 세포를 SLAM을 통해 임의의 종으로부터 단리시킬 수 있다. 이어서, 단리된 개별 항체를 생산하는 세포를 클론 확장시키고, 이어서, 항CD154 항체를 생산하는 상기 클론에 대해 스크리닝한 후, 이어서, 그의 가변 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 유전자의 서열을 동정한다. 특정 스크리닝 방법은 WO 04/051268에 설명되어 있다. 이로써, CD154에 대한 항체에 양성인 B 세포가 단리되었다.
SLAM 기술을 사용하여 수개의 래트 항인간 CD154 항체를 동정하고, 단리시켰다(도 12). 이러한 항체들 중 하나인 CA081 00342("342 항체")를 하기 실시예에 기술되어 있는 바와 같이 인간화시켰다. 그의 DNA 서열과, 도출되는 아미노산 서열은 도 2에 제시되어 있다. 이러한 항체를 코딩하는 유전자를 클로닝하였다.
실시예 2: CA081 00342의 인간화 - 342. G2 생성
인간 생식 계열 프레임워크 상에 CDR을 이식시켜 SLAM 항체 342를 인간화시켰다. 디자인된 인간화된 서열과 함께, 래트 항체(공여체) 서열과 인간 생식 계열(수용체) 프레임워크를 함께 정렬한 것을 도 9에 제시한다. 선택된 경쇄 생식 계열 수용체 서열은 인간 VK1 2-1-(1)O12 V-영역 + JK1 J-영역(V BASE, 영국 소재의 MRC Centre for Protein Engineering; 서열 번호 35 및 36)이었다(도 3). 선택된 중쇄 생식 계열 수용체 서열은 인간 VH3 1-1 3-66 V-영역 + JH4 J-영역(V BASE, 영국 소재의 MRC Centre for Protein Engineering; 서열 번호 37 및 38)이었다(도 3). 추가로, 다른 VH 수용체 프레임워크인 인간 VH4 1-1 4-59 서열(서열 번호 39 및 40)을 선택하였다(도 3). 공여체로부터 수용체 서열로 이식된 CDR은 카뱃[Kabat et al. Sequence of proteins of immunological interest (1987). Bethesda MD, National Institutes of Health, US]에 의해 정의되는데, 단, 예외적으로, CDR-H1은 조합된 코티아/카뱃 정의를 사용한다(WO 91/09967 참조). 오직 CDR만이 공여체 항체로부터 수용체 프레임워크 상으로 이전된 이식편의 경우, 주요 공여체 프레임워크 잔기도 포함하고 있는 변형물이 작제되었다. 이러한 잔기는 WO 91/09967에 기재된 방법에 기초한 방법을 사용하여 동정하였다. 예를 들어, 경쇄 이식편 VK1 gL4는 38, 71 및 85번 위치에 공여체 잔기를 함유하고; 중쇄 이식편 VH3 gH1은 24, 48, 49, 73 및 78번 위치에 공여체 프레임워크 잔기를 함유하고; 중쇄 이식편 VH4 gH1은 48, 71 및 78번 위치에 공여체 프레임워크를 함유한다. 이들 이식편 모두의 서열이 도 9에 제시되어 있다.
도급맡은 유전자 합성 회사(Entelechon GmBH; DNA 2.0; Blue Heron)에 의해 표준 분자생물학 기법을 사용함으로써 상기의 V-영역 서열을 코딩하는 유전자를 디자인하고 작제하였다. 이식된 변이체를 생성하기 위하여 PCR로 표준 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이유발법을 사용함으로써 변형시켰다. 포유동물 세포 발현 벡터 를 사용하여 발현될 수 있도록 하기 위해 원래의 래트 항체로부터 유래된 신호 펩티드 서열을 원래의 유전자 디자인에 포함시켰다.
이식된 경쇄 유전자를 경쇄 발현 벡터로 서브클로닝하였는데, 이는 인간 C-카파 불변 영역(Km3 동종이형)을 코딩하는 DNA를 함유한다. 이식된 중쇄 유전자를 인간 감마-4 발현 벡터로 서브클로닝하였는데, 이는 돌연변이 S241P를 안정화시키는 힌지를 함유하는 인간 감마-4 불변 영역을 코딩하는 DNA를 함유한다[Angal et al, Mol Immunol. 1993, 30(1):105-8]. 임의의 적합한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 원래의 래트 항체 유전자 또한 이들 벡터로 서브클로닝하여 분석에서 기준이 되는, 키메라 래트 V-영역/인간 C-영역 항체를 발현하는 플라스미드를 생성하였다.
CHO 세포 내로 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자 플라스미드를 공동 형질감염시킴으로써 IgG를 발현시킬 수 있었고, 비아코어(Biacore)?에 의해 인간 CD154 결합을 분석할 수 있었다.
E. 콜라이에서의 발현과 1가 Fab'로서의 활성을 분석하기 위하여 주요 작제물의 유전자를 발현 벡터 pTTOD(Fab)(WO 03/48208, WO 03/031475)로 서브클로닝하였다. 2단계 공정으로 서브클로닝하였다: 먼저 VK 유전자 단편을 EcoRV-BsiWI 단편으로서 클로닝한 후; VH 유전자 단편을 PvuII-Xhol 단편으로서 클로닝하였다. 이러한 공정을 통해 OmpA 단백질로부터 유래된 신호 펩티드를 코딩하는 DNA는 경쇄 및 중쇄, 둘 모두를 코딩하는 유전자에 융합됨으로써 번역된 단백질이 세균 원형질막 주위공간으로 분비된다. 생성된 발현 플라스미드를 E. 콜라이 K-12 균주 W3110 내로 형질전환시키고, 소규모 진탕 플라스크에서 고밀도의 세포 발효를 위한 유도 실 험에 사용하였다.
비아코어 ?에 의한 342 Fab 작제물의 친화도(1 L의 발효로부터 정제된 Fab )
이식편 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) KD(pM)
gL4gH1 1.53E+07 6.97E-05 4.55E-12 4.55
분석에서의 활성과 E. 콜라이 발효에서의 Fab의 발현 수준, 이 둘 모두를 고려하여 최적의 이식편을 선별하였다. 비아코어?에 의한 친화도 측정에 관한 예는 표 1에 제시되어 있다. 이를 기초로 하여 이식편 gL4gH1을 선택하였다.
이식편 gL4gH1의 Fab' 변형물을 코딩하는 플라스미드를 제조하였다. 이러한 이식편의 삽입 삽입체의 DNA 서열이 도 8(서열 번호 41)에 제시되어 있다. 도 8은 또한 Fab 단편의 발현을 위한 삽입체의 서열(서열 번호 28)도 제공하는데, 이는 F(ab)2 단편을 제조하는데 사용될 수 있다.
실시예 3: 부위 지정 돌연변이유발법에 의한 비글리코실화된 HU5C8 및 HU342 항체 생성
후속 실험에서 사용되는 비글리코실화된 hu5c8 및 hu342 항체는 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 생성하였다. 비글리코실화된 hu5c8은 실질적으로 US2006/0193856에 기재되어 있는 바와 같이 제조하였는데, 단, 예외적으로 이펙터 기능을 추가로 감소시키기 위해 앞서 사용된 IgG1 Fc 도메인을 huIgG4 Fc 도메인으로 치환시켰다. 비글리코실화된 hu5c8의 카파 경쇄 서열은 도 13(서열 번호 62, 서열 번호 63 및 서열 번호 64)에 제시되어 있다. 비글리코실화된 hu5c8의 중쇄는 CH2(T299A, 카뱃 EU) 및 힌지(S228P 카뱃 EU) 도메인에 부위 지정 돌연변이유발법에 의해서 제조된 2개의 돌연변이를 함유한다(도 14; 서열 번호 65, 서열 번호 66 및 서열 번호 67). T299A 돌연변이는 CH2 도메인 중 N 글리코실화 부위를 변형시킴으로써 이는 더 이상 N 글리코실화 효소에 대한 기질이 되지 못하며, 이로써, 분자는 비글리코실화된다.
비글리코실화된 hu342 항체는 342 Fab 단편 벡터로부터 유래되었다. 인간 불변 도메인 서열은 인간 신호 서열 및 적절한 인간 불변 도메인 서열을 부가함으로써 변형시켰다. 비글리코실화된 hu342 항체 또한 huIgG4 Fc 도메인을 포함한다. 비글리코실화된 hu342의 카파 경쇄 서열은 도 15(서열 번호 68, 서열 번호 69 및 서열 번호 70)에 제시되어 있다. 비글리코실화된 hu342의 중쇄는 CH2(T299A, 카뱃 EU) 및 힌지(S228P 카뱃 EU) 도메인에 부위 지정 돌연변이유발법에 의해서 제조된 2개의 돌연변이를 함유한다(도 16; 서열 번호 71, 서열 번호 72 및 서열 번호 73). T299A 돌연변이는 CH2 도메인 중 N 글리코실화 부위를 변형시킴으로써 이는 더 이상 N 글리코실화 효소에 대한 기질이 되지 못하며, 이로써, 분자는 비글리코실화된다. 비글리코실화된 hu5c8 및 hu342, 이 둘 모두 CHO 세포에서 안정적으로 발현되었다.
실시예 4: CD154 에의 결합: 결합 친화도 측정
비아코어? 기술은 표지할 필요없이 실시간으로 생체분자간의 결합을 모니터한다. 상호작용자(interactant) 중 하나인 소위 리간드는 직접 고정화되거나, 고정화된 표면 상에 포획되는 반면, 그 나머지 하나인 소위 분석물은 용액 중에서 포획 표면 위를 지나간다. 분석물이 리간드에 결합하여 표면 상에서 복합체를 형성함에 따라 센서는 센서 표면 상의 질량 변화를 검출한다. 이는 결합 과정에 상응한다. 해리 과정은, 분석물을 완충액으로 대체하였을 때에 모니터한다. 친화도 비아코어? 분석에서, 리간드는 항CD154 항체, 예로서, 342 항체이고, 분석물은 인간 CD154의 세포외 도메인이다.
본 방법의 상세한 설명은 다음과 같다:
장치: 비아코어? 3000(스웨덴 웁살라 소재의 비아코어 AB(Biacore AB)).
센서 칩: CM5(검색 등급) 카탈로그 번호: BR-1001-14(스웨덴 웁살라 소재의 비아코어 AB). 칩을 4℃에서 보관하였다.
BIA 표준화 용액: 70%(w/w) 글리세롤. BIA유지 키트 카탈로그 번호: BR-1002-51(스웨덴 웁살라 소재의 비아코어 AB)의 일부. BIA유지 키트를 4℃에서 보관하였다.
아민 커플링 키트: 카탈로그 번호: BR-1000-50(스웨덴 웁살라 소재의 비아코어 AB). 에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)(증류수 중 75 mg/mL로 제조되고, 200 ㎕ 분취량으로 -70℃에서 보관됨). N-하이드록시숙신이미드(NHS)(증류수 중 11.5 mg/mL로 제조되고, 200 ㎕ 분취량으로 -70℃에서 보관됨). 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드-NaOH(pH 8.5)(200 ㎕ 분취량으로 -70℃에서 보관됨).
완충액: 영동 완충액은 HBS-EP(0.01 M HEPES(pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20임)이다. 카탈로그 번호: BR-1001-88(스웨덴 웁살라 소재의 비아코어 AB). 완충액을 4℃에서 보관하였다. 고정 완충액은 아세테이트 5.0(10 mM 아세트산나트륨(pH 5.0)임)이다. 카탈로그 번호: BR-1003-51(스웨덴 웁살라 소재의 비아코어 AB). 완충액을 4℃에서 보관하였다.
리간드 포획: 어피니퓨어(Affinipure) F(ab')2 단편 염소 항인간 IgG(Fab' 단편 특이(카탈로그 번호: 109-006-097) 또는 Fc 단편 특이(카탈로그 번호: 109-006-098))(미국 펜실페니아주 소재의 잭슨 이뮤노리서치 인크(Jackson ImmunoResearch Inc). 시약을 4℃에서 보관하였다.
리간드: 항CD154 항체.
분석물: 인간 CD154의 재조합 세포외 도메인. 물질을 인산염 완충처리된 염수 중 2 mg/mL (40 μM)로 제조하고, 4℃에서 보관하고, 분석을 위해 HBE-EP 영동 완충액 중에서 희석시켰다. 전형적으로, 친화도 분석을 위해 희석물을 배가시켜 CD154를 대략 1 nM 내지 대략 100 pM으로 희석시켰다.
재생 용액: 증류수를 사용하여 11.6 M 스톡 용액(영국 풀 소재의 BDH, 카탈로그 번호: 101254H)으로부터 희석시켜 40 mM HCl을 제조하였다. 증류수를 사용하여 50 mM 스톡 용액(카탈로그 번호: BR-1003-58(스웨덴 웁살라 소재의 비아코어 AB))으로부터 희석시켜 5 mM NaOH를 제조하였다.
분석 방법: 비아코어? 3000(Biacore AB)을 사용하여 BIA(비아몰레큘라 인터렉션 아날리시스(Biamolecular Interaction Analysis))를 실시하였다. 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항인간 IgG(Fc 단편 특이 또는 Fab' 단편 특이)(Jackson ImmunoResearch)은 아민 커플링 화학물질을 통해 CM5 센서 칩 상에 대략 6000 반응 단위(RU: response unit)의 포획 수준으로 고정시켰다. HBS-EP 완충액(10 mM HEPES(pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, Biacore AB)을 영동 완충액으로서 사용하였는데, 그의 유속은 10 ㎕/분이었다. 항CD154 항체 또는 Fab 단편은, 일단 고정화된 항인간 IgG-Fc(또는 항인간 IgG Fab') 표면에 의해 포획되고 나면, 대략 200 RU의 신호를 낼 수 있는 농도로 사용되었다. 인간 CD154를 다양한 농도로 포획된 항체 상에서 적정하였다. 90 ㎕의 CD154를 표면 상에 주입한 후(결합 단계), 240초의 해리 단계로 이어졌는데, 여기서 모든 유속은 30 ㎕/분이었다. 40 mM HCl 10 ㎕를 2회에 걸쳐 주입한 후, 5 mM NaOH 5 ㎕를 주입하여(유속 10 ㎕/분) 표면을 재생시켰다. 표준 방법에 따라 BIA이벨류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어(버전 3.2)를 사용하여 배경 감산 결합 곡선을 분석하였다. 피팅 알고리즘으로부터 동역학적 파라미터를 결정하였다.
이러한 방법을 사용하여 본 발명의 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편 중 임의의 것의 CD154 단백질, 또는 그의 단편에 대한 친화도를 평가할 수 있다. 비아코어?에 의해 수득한 값으로서, SLAM에 의해 단리된 항CD154 항체에 대한 Kd 값이 도 12 및 18에 제시되어 있다.
실시예 5: CD40 결합 저해
유세포 측정법에 기반한 분석법을 사용하여 CD154 발현 D 1.1 세포에의 표지된 CD40의 결합을 평가하였다. D 1.1 주르카트 세포(American Type Culture Collection)를, 10%(v/v) 우태아 혈청(FCS: fetal calf serum), 2 mM 글루타민(Invitrogen, 23030024), 1 mM 피루브산나트륨(Invitrogen, 11360-039), 1%(v/v) D-(+)-글루코스(Sigma, G8769) & 10 mM HEPES(Sigma, H0887)를 함유하는 RPMI 1640 배지(Gibco, 31870-025)에 유지시켰다. 분석시에 100,000개의 D 1.1 세포를 일련으로 희석된 항CD154 항체의 존재 또는 부재하 실온에서 15분 동안 100 ㎕ RPMI 1640 배지 + 10% FCS에서 인큐베이션시켰다. 이어서, hCD40-mFc-PE(Alexis Corp, ANC-504-050)의 1:75 희석액 5 ㎕를 첨가하고, 실온에서 추가로 30분 동안 인큐베이션시켰다. 1%(w/v) 우혈청 알부민(BSA 분획 V, Serologicals Proteins Inc, 81-068-5) 및 0.02%(w/v) 아지드화나트륨(BDH, 103692K)을 함유하는 인산염 완충처리된 염수(PBS) 중에서 2회에 걸쳐 세척한 후, 세포를 200 ㎕ PBS/1% BSA/0.02% 아지드화나트륨 중에 재현탁시키고, 벡톤 디킨슨 FACScan(Becton Dickinson FACScan) 유세포 측정법을 실시하였다. 모든 사례에서 기하 평균 형광(FL2) 값을 평가하였다. hCD40-mFc-PE 결합 저해율은 항체 부재하의 신호(0% 저해)와 hCD40-mFc-PE 부재하의 신호(100% 저해)에 대한 비율로 하기 식을 사용하여 계산하였다:
Figure 112009064702079-pct00001
상기 데이타로부터 얻는 IC50 값은 활성 베이스 패키지(Activity Base package)의 일부로서 XL피트를 사용하여 수득하였다.
SLAM에 의해 단리된 항CD154 항체에 대한 CD40 결합 IC50 값은 도 12 및 18 에 제시되어 있다.
실시예 6: 경쟁 결합 분석
유세포 측정법에 기반한 분석법을 사용하여 CD154 발현 D 1.1 세포에의 항CD154 항체의 결합을 평가하였다. D 1.1 주르카트 세포(American Type Culture Collection)를, 10%(v/v) 우태아 혈청(FCS), 2 mM 글루타민(BioWhittaker, 17-605E) 및 1 페니실린-스트렙토마이신(Mediatech, 30002107)을 함유하는 RPMI 1640 배지(Gibco, 31870-025)에 유지시켰다. 분석시에 100,000개의 D 1.1 세포를 일련으로 희석된 항CD154 항체 및 비오틴화된 항CD154 Fab(클론 342)의 존재 또는 부재하에 4℃에서 2시간 동안 10 mL PBS, 0.1% BSA, 0.02% 아지드화나트륨(FACS 완충액)에서 인큐베이션시켰다. 세포를 FACS 완충액 중에서 3회에 걸쳐 세척하였으며, 양 세척 단계 사이에 3분 동안 290 x g로 원심분리하였다. 150 μM FACS 완충액 중 1:500의 스트렙타비딘-R-피코에리트린 접합체(Jackson Immunoresearch, 016-110-084) 희석액을 첨가하고, 세포를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 1회에 걸쳐 세척하고, 10분 동안 실온에서 3% 포름알데히드를 사용하여 PBS 중에서 고정시켰다. 세포를 FACS 완충액 중에 재현탁시키고, FacsCalibur(BD) 상에서 유동시켰다. 모든 사례에서 기하 평균 형광(FL2) 값을 평가하였다. 비오틴 342 Fab 결합을 경쟁 항체 농도에 대하여 플롯팅하여, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용함으로써 4-파라미터 곡선 피트로 피팅된 S자형 저해 곡선을 수득하였다. 상기 분석에서 얻은 IC50 값은 도 18에 제시되어 있다.
실시예 7: ICAM -1 상향조절 분석
CD40L:CD40의 세포 표면 상호작용을 저해할 수 있는 항CD154 항체의 능력을 시험관내 공배양 효능분석법으로 측정하였다. CD40과 CD154(CD40L)의 결찰(예를 들면, 결합)은 B 림프구를 활성화시켜 세포 표면 상에서 CD54(ICAM-1)를 상향조절시키는데, 이와 같이 접촉에 의존하는 CD40L:CD40 B 세포 활성화는 항CD154에 의해 차단될 수 있다. 간략하면, CD154 발현 D 1.1 주르카트 T 림프종 세포(CRL-10915, 미국 버지니아주 마나싸스 소재의 American Type Culture Collection(ATCC)) 및 CD40을 발현하는 라모스(Ramos) 2G6.4C10 B 림프종 세포(CRL-1923, ATCC)를 1:4의 비율로 밤새도록 5% CO2 하의 37℃ 인큐베이터에서 공배양하고, 항CD154 Fab 또는 대조군 무손상 Ab(hu5C8)로 적정하였다. 본 분석법은 RPMI 완전 배지(10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 피루브산나트륨 및 10 mM HEPES(pH 6.8)을 함유하는 RPMI, 미국 메릴랜드주 로크빌 소재의 Gibco BRL) 중 1 X 106 세포/ml의 농도로 96 웰 둥근 바닥형 플레이트에서 실시하였다. 그 다음날, 1% BSA 및 0.1% 아지드화나트륨을 함유하는 PBS 중에서 각각 1:100 및 1:200의 농도로 BD 파미겐(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 BD Pharmingen)으로부터 입수한 CD20 FITC(#555622) 및 CD54 APC(#559771)로 4℃에서 1시간 동안 세포를 염색하였다. 세포를 세척하고, 1% 파라포름알데히드로 고정시키고, FACScan Calibur 유세포측정기(BD Biosciences) 상에서 분석하였다. 델타그래프 소프트웨어(DeltaGraph software)(미국 유타주 솔트 레이크 시티 소재의 Red Rock Software)를 사용하여 라모스 세포(이중 양성 세포)의 기하 평균 형광 대 항CD154(CD40L)의 농도를 4-파라미터 곡선으로 피팅하였다(도 12 및 18). IC50 값을 사용하여 항CD154 항체의 상대적인 효능을 측정하였다.
실시예 8: 사이노몰거스 원숭이 모델에서의 면역 반응의 활성
생체내 활성을 입증하는데 사용된 모델은 [Gobburu et al. (1998) J Pharmacol Exp Therapeutics 286: 925]에 기재되어 있다. 0.5 mL 단일 용량의 파상풍 톡소이드(TT)를 i.m.으로 시험감염하기 4시간 전에 단일 용량의 염수, Hu5c8 항체 또는 반응 용량의 Fab'-PEG를 i.v.로 사이노몰거스 원숭이에 투여하였다. 각각의 시험군은 3마리의 수컷과 3마리의 암컷을 포함하였다. 30일째 2차 용량의 저해제를 투여하고, 동물을 TT로 다시 시험감염시켰다(2차 반응). IgG 및 IgM 항TT, 둘 모두에 대한 역가를 분석하기 위하여 50일째까지 선택된 시간 기간에 혈액 시료를 채취하였다(도 19 및 21). 본 데이타는 342 Fab'-PEG가 용량에 의존하는 방식으로 TT에 대한 IgG 및 IgM 면역 반응을 저해한다는 것을 나타낸다.
단일 용량(hu5c8, 비글리코실 5c8 및 비글리코실 342의 경우, 20 mg/kg, 및 342 Fab'-PEG 및 342 DFM-PEG의 경우, 40 mg/kg)의, 다양한 형태의 항CD154 항체로 처리한 후, 사이노몰거스 원숭이에서의 IgG 항TT 역가 또한 측정하였다(도 20). 평가한 모든 항체에서 TT 면역 반응이 저해된 것이 관찰되었다.
실시예 9: 형광 활성 세포 분류 교차 차단 분석
본 발명의 항CD154 Fab' 단편의 결합 성질을 교차 차단 항체 분석법에 의해 연구하였다. 간략하면, CD154를 발현하는 D1.1 주르카트 세포를 실온에서 60분 동 안 배지와 함께, 또는 10 ㎍/ml 표지되지 않은 제1 항CD154 Fab'와 함께 인큐베이션시켰다. 세척하지 않고 그 이후에, 최적의 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488-표지된 제2 항CD154 Fab'(300 ng/ml) 희석액을 60분 동안 첨가하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 유세포 측정법에 의해 분석하였다. 제1 및 제2 Fab'가 동일한 에피토프에 결합한다면, 제1 Fab'가 제2 Fab의 결합을 경쟁적으로 차단할 것이다. 2개의 항체가 상이한 에피토프에 결합한다면, 제1 Fab'는 제2 Fab의 결합을 차단하지 못할 것이다. 시험하는, 표지된 제2 Fab'가 342일 경우, 342 Fab'는 338(도 23B), 381(도 23D) 및 335(도 23G) Fab'에 의해 교차 차단되지만, 295(나타내지 않음), 402(도 23C), 300(도 23E), 303(도 23H) 또는 294(도 23F) Fab'에 의해서는 교차 차단되지 않는다는 것이 입증될 수 있다. 표지된 Fab'가 hu5c8일 경우, 338(도 24A), 402(도 24B), 381(도 24C), 303(도 24D), 335(도 24E), 300(도 24F) 및 294(도 24G) Fab'에 의한 교차 차단이 입증될 수 있다. A33(이소형 대응 대조군 항체)으로 시험함으로써 비특이적인 교차 차단은 없다는 것을 확인하였다(도 23A 및 24H). 항체 342 및 hu5c8은 표지되지 않은 Fab'(제1)이건, 표지된 Fab'(제2)이건 그에 상관없이 CD154 결합에 대하여 서로서로 경쟁하였다.
실시예 10: 항체 결합의 비아코어 ? 분석
가용성 CD154 단백질(sCD154)(세포외 도메인; ECD: extracellular domain)에의 342 및 hu5c8 항체 결합에 관한 비아코어? 분석을 통해 342를 두번째로 sCD154에 첨가하였을 때에 342는 sCD154에의 hu5c8 결합을 치환시켰다는 것이 제시되었다(도 25A 및 B). 5c8을 두번째로 sCD154에 첨가하였을 때에 5c8은 sCD154로부터 342를 치환시키지 못했다(도 25C). 항체 338은 hu5c8 경쟁 분석에서 비가역적인 결과와 관련하여 342와 유사한 반응을 나타내었다.
Hu5c8 Fab는 342 전장(FL: full length)/sCD154 복합체에 결합할 수 있다(도 25D). 이러한 결과는, 342 FL이 먼저 첨가되면 hu5c8은 342 FL 결합 부위와 경쟁하지 못한다는 것을 제안한다. 이론으로 제한하지 않으면서, 이러한 결과는 342가 sCD154 삼량체의 1개 또는 2개의 암에 결합하는 것은 hu5c8이 "유리" 암(들)에 결합하는 것을 막지 못한다는 것을 제안한다.
hu5c8 Fab 다음에 342 Fab'를 첨가하였을 때 결합은 미세하게 증가한다(대략 20 RU)(도 25E). 이러한 결과는 hu5c8 Fab'가 342 Fab'의 결합을 차단했다던지, 또는 342 Fab'가 포획된 sCD154 상에서 hu5c8 Fab'를 대체했다던지 하는 가능성을 제기한다.
342 Fab' 또는 hu5c8 Fab' 어떤 것도 CD40:sCD154 복합체에 결합하지 못하거나, 단백질 분석에서 상기 복합체의 해리에 영향을 주지 못한다. 어떤 Fab'로 복합체에 결합하지 못한다는 사실은, 복합체가 sCD154 암, 3개 모두를 사용한다던지 또는 복합체가 "유리" 암에의 어떤 Fab'의 접근도 입체적으로 방해한다는 것을 제안한다.
실시예 11: 인간 혈소판 활성화
분석 1
공개된 분석법(예를 들면, [Florian et al. (2005) Thrombosis Hemostasis 93: 1137])을 사용하여 혈소판 응집을 측정할 수 있다. 하나의 분석법에서, 정상적 인 공여체의, 혈소판이 풍부한 혈장으로부터 혈소판을 BSA로 코팅된 튜브 중 HEPES 완충처리된 염수에서 세척하고, 1 마이크로리터(㎕) 당 250,000개로 조정하였다. 이어서, 세척한 혈소판을 응집측정기 큐벳(Chrono-Log 490D)으로 피펫팅하고, 블랭킹을 위해 HEPES(분석용) 완충액을 사용하여 미량의 신호를 응집율 0%로 보정하였다. 상기 장치에서 큐벳은 37.0℃로 유지되고, 실리콘으로 처리된 자기 막대는 1000 rpm으로 혈소판을 교반시킨다. 완전하게 형성된 면역 복합체(즉, 삼량체로서 재조합 인간 가용성 CD40L(rhsCD40L)을 처리하였을 때에 1:1의 화학양론으로 형성된 항체 + rhsCD40L)를 혈소판에 첨가하고, 용액의 광학 밀도로부터 유도된 자취로서 응집을 평가하였다. 구체적으로, 15 ㎕의 면역 복합체를 285 ㎕의 세척된 혈소판 현탁액에 첨가하자, 큐벳에 첨가된 후에 sCD40L의 최종 농도는 10 ㎍/ml이고, IgG 항체의 것은 27.8 ㎍/ml이거나, Fab'-PEG 경우에는 16.7 ㎍/ml였다. 이러한 데이타는, 무손상 IgG 항CD40L 항체 Hu5c8의 존재하에서는 응집이 일어나지만, 342 Fab'-PEG에서는 응집이 일어나지 않는다는 것을 나타낸다(도 26).
분석 2
WO 07/59332에 기재된 또다른 분석법으로, 혈소판을 혈소판 활성화제(예를 들면, 아데노신 2인산(ADP: adenosine diphosphate), 콜라겐, 트롬빈, 트롬복산, 중성호성백혈구 엘라스타제, p-셀렉틴, 또는 컨불신)와 접촉시키고, 활성화된 혈소판을 항CD154 항체와 접촉시킨 후, 활성화된 혈소판을 가교 물질(예를 들면, 가용성 CD154(sCD154), 항인간 IgG 항체, 항hFc 항체, RF, Fc 수용체 양성 보조 세포, 가용성 단백질 A, 또는 가용성 인간 Fc 수용체)과 접촉시켜 혈소판 응집을 측정한 다. 이어서, 혈소판 침강에 의해 응집을 정량하는데, 여기서, 혈소판 침강이 혈소판의 응집을 나타내는 것이다. 응집 분석은 혈소판이 풍부한 혈장(PRP: platelet rich plasma)에서 실시하였다. 대략 50 mL의 전혈을, 0.5 mL의 3.8% 시트르산나트륨을 함유하는 4.5 mL 진공 채혈관에 분취량으로 수집하였다. 항응고된 혈액을 200 g으로 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 수거하여 RPR를 제조하였다. 상기 분석을 실시하기 위하여 혈소판이 충분치 못한 혈장(PPP: platelet poor plasma)만을 함유하는 큐벳을 사용하여 바이오데이타(Biodata) 4-채널 혈소판 응집 프로파일러(PAP-4; 펜실베니아주 햇보로 소재의 Biodata Corp.)를 블랭킹시켰다. 대략 2 내지 5 x 108/mL 혈소판을 함유하는 350 ㎕ 분취량의 PRP를, 교반 막대가 있는 큐벳에 첨가하였다. 항CD40L 항체, 인간 IgG, 정상적인 인간 혈청, CD40-Fc, 또는 항hFc를 총 부피 100 ㎕로 첨가하였다. 로딩된 큐벳을 기계에 장착시키고, ADP를 첨가하기 전에 반응 성분들을 혼합하였다.
50 ㎕ 중 준최적 농도의 ADP를 첨가하여 응집을 개시시켰다(최종 농도는 각각의 개별 시료에 따라 다르다). 응집 프로파일러는 4개의 포트를 갖는데, 이는 동시에 작동할 수 있다. ADP를 첨가한 후 4분 동안 각 시료에 대한 응집을 추적하였다. 추적 종결시, 장치는 시료를 통과한 빛의 투과량을 PPP 블랭크를 통과한 빛의 투과량과 비교하여 응집율을 계산한다. 각 실험 시작시에 적정을 실시하고, 이후의 실행은 준최적 ADP 농도로 실시하였다.
상기 분석으로부터 얻은 결과는 도 27에 제시되어 있다. 건강한 개체 1명으 로부터 PRP를 수득하였다. 상기 공여체에 대해 준최적인 것으로 결정된 농도인 0.75 μM의 ADP를 사용하여 응집을 유도하였다. 양성 대조군 항CD154 항체 및 음성 대조군 hIgG는 200 ㎍/mL, sCD154는 30 ㎍/mL로 평가하였다. PRP를 함유하는 큐벳에 첨가하기 전에 20분 이상 동안 항CD154 항체 또는 hIgG를 재조합 sCD154와 혼합하였다. 막대는 데이타 점 2개의 평균과 표준 편차를 나타낸다. 음성 대조군 인간 IgG(hIgG) 및 sCD154는 함께 혈소판 응집에 어떤 영향도 미치지 못하는 반면, 양성 대조군 항CD154 항체는 혈소판 응집을 증진시켰다는 결과가 나왔다. 양성 및 음성 대조군을 사용한 상기 분석으로부터 얻은 결과는, 본 발명의 항체가 혈소판 응집에 미치는 상대적인 효과를 비교하는데 상기 분석법을 사용할 수 있다는 것을 입증한다.
혈소판이 그의 표면 상에 CD154를 발현하는지 여부를 측정하기 위하여 혈소판을 비오틴이 접합된 항CD154 항체와 함께 인큐베이션시키고, 결합된 비오틴화된 항CD40L 항체를 정량함으로써 표면 CD154의 존재 여부를 측정하였다. 그에 따라, 10 μM ADP와 함께 또는 그를 포함하지 않은 채로 인큐베이션시킨지 1, 10, 20, 40, 및 60분이 경과한 후에 CD154의 표면 발현을 평가하였다. CD40L의 표면 발현은 일찌감치 활성화시킨지 1분 경과시에 ADP로 활성화된 혈소판 상에서 검출가능하였고, 시간이 경과함에 따라 증가하였다. 비오틴이 접합된 항CD154 항체를 sCD154와 함께 사전에 인큐베이션시켰을 때에는 활성화된 혈소판에의 결합이 저해되었는 바, 비오틴이 접합된 항CD154 항체의 결합은 CD154에 대해 특이적이다. 불활성화된("휴지기") 혈소판 상에서 검출된 표면 CD154의 양 또한 시간이 경과함에 따라 증가하 였다. 이러한 현상은 실험 조건하의 혈소판 활성화의 기저 수준 때문일 가능성이 있다.
실시예 12: 비글리코실화된 항체 및 다른 변이체 항체의 변경된 이펙터 기능을 측정하는 방법
하기 실시예는 본 발명의 비글리코실화된 항체 및 다른 변형된 변이체 항체를 측정하고, 그의 특징을 규명하는데 유용한 분석법을 설명한다.
본 발명의 비글리코실화된 항체 및 다른 변형된 변이체 항체의 이펙터 기능은 항원에 결합할 수 있고, 또한 Fc 수용체 또는 보체 분자, 예로서, C1q에 결합할 수 있는 항체의 능력을 특징으로 할 수 있다. 특히 FcγR 결합 친화도는 CD154 항원과, Fc 수용체를 수반하는 세포 사이에 "브릿지"를 형성할 수 있는 항체의 능력에 기초하는 분석법으로 측정할 수 있다. C1q 결합 친화도는 CD154 항원과 C1q 사이에 "브릿지"를 형성할 수 있는 항체의 능력에 기초하여 측정할 수 있다. 본 발명의 항체와, FcR 또는 보체와의 상호작용 또한 비드 기반의 알파스크린(AlphaScreen)? 기술(Perkin Elmer?)에 의해 측정할 수 있다.
Fc 수용체 결합 분석
(예를 들면, 4℃에서 밤새도록 PBS 중 1 ㎍/ml 농도의([Karpusas et al. 1995 Structure 3(10): 1031-1039 and 3(12): 1426] 및 [Karpusas et al. 2001 Structure 9(4): 321-329])) 재조합 가용성 인간 CD154 리간드로 96 웰 맥시소브(Maxisorb) ELISA 플레이트(미국 뉴욕주 소재의 Nalge-Nunc Rochester)를 코팅하여 FcγR 브릿지 형성 분석을 실시하였다. 글리코실화된 형태 또는 비글리코실화된 형태의 항CD154 항체 적정물을 37℃에서 30분 동안 CD154에 결합시킨 후, 플레이트를 세척하고, 형광 표지된 U937(CD64+) 세포의 결합을 측정한다. U937 세포를, 10% FBS, 10 mM HEPES, L-글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 배지에서 배양하고, 1:2로 분할하고, 분석하기 전 하루 동안 1000 단위/ml의 IFNγ로 활성화시켜 Fc 수용체(FcγRI) 발현을 증가시킬 수 있다.
본 분석의 또다른 변형으로, 추가의 또다른 Fc 수용체, 예로서, FcγRIII(CD 16)에 결합할 수 있거나, 또는 그에 결합할 수 없는 본 발명의 항체의 능력에 관해서는 CD16 발현 작제물로 형질감염된 형광 표지된 인간 T 세포(주르카트 세포)에 대한 상기 브릿지 형성 분석법을 사용하여 실시하였다. 96 웰 조직 배양 플레이트에서 배양된, CD154를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(미국 매사추세츠주 소재의 Corning Life Sciences Acton)의 단층에 의해 리간드를 생산할 수 있다. 예를 들어, CHO-CD154+ 세포를 96 웰 플레이트에 1 X 105 세포/ml로 시딩하고, 10%의 투석된 FBS, 100 nM 메토트렉세이트, L-글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 α-MEM(미국 메릴랜드주 로크빌 소재의 Gibco-BRL) 중 컨플루언시에 도달할 때까지 배양한다. CD16+ 주르카트 세포를 10% FBS, 400 pg/ml 제네티신(Geneticin), 10 mM HEPES, 피루브산나트륨, L-글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI(Gibco-BRL)에서 배양하고, 분석을 실시하기 하루 전날 1:2로 분할하였다.
두 수용체 모두에 대한 분석에서, Fc 수용체를 수반하는 세포를 37℃에서 20 분 동안 2',7'-비스-(2-카르복시에틸)-5-(앤드-6)-카르복시플루오레세인 아세톡시메틸 에스테르(BCECF-AM)(미국 오리건주 유진 소재의 Molecular Probes)로 표지할 수 있다. 세척하여 과량의 표지를 제거한 후, 분석시 1 x 105개의 표지된 세포를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 결합하지 못한 FcγR 양성 세포는 수회에 걸쳐 세척함으로써 제거하고, 플레이트를 마이크로플레이트 판독기(Cytofluor 2350 Fluorescent Microplate Reader(미국 매사추세츠주 베트퍼스 소재의 Millipore Corporation)) 상에서 485 nm의 여기 파장 및 530 nm의 방출 파장에서 판독한다.
상기 기술된 분석법 이외에도, Fc 수용체에의 본 발명의 항체의 결합은 알파스크린™(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay(Perkin Elmer))을 사용하여 경쟁 포맷으로, 또는 직접적으로 표면 플라즈몬 공명(Biacore?)를 사용하여 측정할 수 있다. 비아코어 분석법은 비아코어? 3000 장치를 사용하여 단백질 A/G에 포획된 항체에의 분석물 수용체의 결합을 모니터할 수 있다. 비아코어?는 단백질-단백질 상호작용의 특징을 규명하는데 있어 잘 확립되어 있는 방법이며([Myszka 1997 Curr Opin Biotechnol . 8:50-57.]; [Malmborg & Borrebaeck 1995 J Immunol Methods 183:7-13]), FcγRIII에의 IgG 항체의 결합을 측정하는데 성공적으로 사용되어 왔다[Galon et al., 1997 Eur J Immunol . 27:1928-1932]. 예를 들어, 단백질 A/G는 센서 칩(예를 들면, NHS 화학물질을 사용하는 CM5 센서 칩)에 공유 결합한다. 영동 완충액(예를 들면, HBS-EP(0.01 M HEPES(pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005%(v/v) 계면활성제 P20(비아코어?)), 및 칩 생성 완충액(예를 들 면, 글리신 1.5(10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)(비아코어?)))을 분석에 사용한다. 이펙터 기능이 감소된 변이체 항CD154 항체 및 야생형 또는 천연 항CD154 항체를 영동 완충액(예를 들면, HBS-EP 완충액) 중에서 100 nM으로 희석시키고, 5분 동안 단백질 A/G 칩에 결합시킨다. 수용체는 결합 단계에서 일련의 농도로 결합하게 되고, 이어 완충액의 사용으로 해리 단계로 이어진다. 항체를 사용하지 않는 사이클은 기준선 반응을 제공한다. 예를 들면, 센서그램을 전체적으로 1:1 랭무어(Langmuir) 결합 모델로 피팅시킴으로써 BIA이벨류에이션 소프트웨어 v4.1(비아코어?)을 사용하여 평형 해리 상수(KDS)를 수득할 수 있다.
알파스크린에서는 스트렙타비딘 공여체 비드에 결합된 비오틴화된 IgG와, 항GST 수용체 비드에 결합된 FcγR-His-GST 사이의 상호작용을 비교하기 위하여 태깅되지 않은 항체를 사용한다. 야생형 또는 천연 항CD154 항체(예로서, IgG1 항체)를 표준 방법으로 비오틴화시키고, PBS에서 투석시킨다. 항GST 수용체 비드 및 스트렙타비딘 공여체 비드는 상업적 업체로부터 이용가능하고, 20 ㎍/ml의 최종 농도로 사용할 수 있다. 1 x 분석 완충액(예를 들면, 25 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.01% 트윈-20(pH 7.4)) 중 FcγRI-His-GST, FcγRIIIa-His-GST, FcγRIIa-His-GST, 또는 임의의 다른 태깅된 FcR을 96 웰 플레이트의 각 웰에 0.5 nM의 최종 농도로 분배한다. 야생형 또는 천연 항CD154 항체, 변이체 항CD154 항체, 또는 완충액을 1 x 분석 완충액 중에서 ½ 로그 희석액으로 제조하고, 각각의 웰에 직접 분취한다. 단시간 동안 원심분리한 후, 1 x 분석 완충액 중 비오틴화된 야생형 항 CD154 항체(예를 들면, IgG1 항체)를 각각의 웰에 5 nM의 최종 농도로 첨가한다. 100 ㎍/ml 항GST 수용체 비드를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 암실에서 인큐베이션시킨다. 100 ㎍/ml 스트렙타비딘 공여체 비드를 각각의 웰에 첨가하고, 단시간 동안 원심분리한 후, 플레이트를 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션시킨다. 반응 시료를 백색의 불투명한 플레이트로 이전시키고, 퓨전™ 알파-FP HT(Fusion™ Alpha-FP HT) 마이크로플레이트 판독기(Perkin Elmer)에서 형광을 판독한다. 데이타는 가장 높은 신호(비경쟁)로 표준화시키고, 예를 들면, 소프트웨어 그래프패드 프리즘(GraphPad software)으로 비선형 회귀를 사용함으로써 1개 부위 경쟁 모델로 피팅할 수 있다.
당업자는 예를 들어, FcγRIIa를 비롯한 임의의 FcR에 대한 항체 변이체의 결합을 측정하기 위하여 상기의 분석법 또는 그와 유사한 분석을 실시할 수 있다.
C1q 결합 분석
96 웰 맥시소브 ELISA 플레이트(미국 뉴욕주 소재의 Nalge-Nunc Rochester)를 PBS 중 4℃에서 밤새도록 10 ㎍/ml의 50 ㎕ 재조합 가용성 인간 CD154 리간드로 코팅하여 C1q 결합 분석을 실시할 수 있다[Karpusas et al. Structure, 15; 3(12): 1426 (1995)]. 웰을 흡인시키고, 세척 완충액(PBS, 0.05% 트윈 20)으로 3회에 걸쳐 세척하고, 200 ㎕/웰의 차단/희석 완충액(0.1 M Na2HPO4(pH 7.0), 1 M NaCl, 0.05% 트윈 20, 0.1% 젤라틴)을 사용하여 적어도 1시간 동안 차단시킨다. 시험하고자 하는 항체를 차단/희석 완충액 중에서 15 ㎍/ml에서 출발하여 3배 희석액으로 희석시 킨다. 웰당 50 ㎕씩 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다.
상기와 같이 흡인시키고, 세척한 후, 차단/희석 완충액 중에서 희석된 50 ㎕/웰의 2 ㎍/ml 시그마(Sigma) 인간 C1q(C0660)를 첨가하고, 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션시킨다. 상기와 같이 흡인시키고, 세척한 후, 차단/희석 완충액 중에서 3,560배 희석된 50 ㎕/웰의 양의 항C1q(Serotec AHP033)를 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 상기와 같이 웰을 흡인시키고, 세척한다. 이어서, 차단/희석 완충액 중에서 1:10,000으로 희석된 50 ㎕/웰의 당나귀의 항양 IgG HRP 접합체(Jackson ImmunoResearch 713-035-147)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다.
상기와 같이 흡인시키고, 세척한 후, 100 ㎕ TMB 기질(0.1 M 아세트산나트륨/시트르산 완충액(pH 4.9) 중 420 μM TMB, 0.004% H2O2)을 첨가하고, 100 ㎕ 2 N 황산을 사용하여 반응을 종결시키기 전에 2분 동안 인큐베이션시킨다. 소프트맥스 PRO(Softmax PRO) 장치를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 판독하고, 소프트맥스 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 피트로 상대 결합 친화도(C 값)를 측정한다.
대안적 C1q 결합 분석법은 C1q에의 항CD154 결합을 측정하기 위해 ELISA를 사용하지만 브릿지로서 CD154를 사용하지는 않는다. 간략하면, 4℃에서 밤새도록 분석 플레이트를 코팅 완충액 중의 변이체 항체 또는 모체 항체(대조군)로 코팅시킬 수 있다. 이어서, 플레이트를 세척하고 차단시킬 수 있다. 세척한 후, 분취량의 인간 C1q를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 추가로 세척한 후, 100 ㎕의 양의 항보체 C1q 퍼옥시다제 접합된 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 플레이트를 다시 세척 완충액로 세척하고, OPD(O-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(Sigma))를 함유하는 기질 완충액 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가할 수 있다. 황색의 출현으로 관찰되는 산화 반응을 30분 동안 진행시키고, 100 ㎕의 4.5 NH2SO4를 첨가하여 상기 반응을 종결시킬 수 있다. 이어서, (492-405) nm에서 흡광도를 판독할 수 있다.
예시적인 항체 변이체는 본 분석법에서 "C1q 결합이 현저히 감소한" 것으로 나타난 것이다. 몇몇 실시태양에서, 현저한 감소란, 약 100 ㎍/ml의 항체 변이체가 돌연변이화되지 않은 IgG1 Fc 영역을 갖는 대조군 항체 100 ㎍/ml와 비교하여 C1q 결합에 있어 약 50배 이상 감소한 것을 나타낸다는 것일 수 있다. 가장 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드(즉, 항체) 변이체는 C1q에 결합하지 않고, 즉, 100 ㎍/ml의 항체 변이체는 100 ㎍/ml의 대조군 항체와 비교하여 C1q 결합에 있어 약 100배 이상 감소한 것을 나타낸다.
보체 활성화 및 CDC
보체 활성화를 평가하기 위해, 예로서, [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163(1996)]에 기재되어 있는 바와 같이, 보체 의존적 세포독성(CDC) 분석을 실시할 수 있다. 간략하면, 다양한 농도의 폴리펩티드(즉, 항체) 변이체 및 인간 보체를 완충액으로 희석시킬 수 있다. 폴리펩티드 변이체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 약 1 X 106 세포/ml의 밀도로 희석시킬 수 있다. 폴리펩 티드 변이체, 희석된 인간 보체 및 항원을 발현하는 세포의 혼합물을 편평한 바닥형의 조직 배양용 96 웰 플레이트에 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션시켜 보체에 의해 매개되는 세포 용해를 촉진시킬 수 있다. 이어서, 50 ㎕의 알라마르 블루(Accumed International)를 각 웰에 가하고, 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시킬 수 있다. 여기 파장을 530 nm로, 방출 파장을 590 nm로 하여 96 웰 형광계를 사용함으로써 흡광도를 측정한다. 본 결과는 상대 형광 단위(RFU: relative fluorescence unit)로 표시할 수 있다. 시료 농도를 표준 곡선으로부터 전산처리할 수 있고, 비변이체 폴리펩티드와의 비교로서, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드 변이체의 활성율(%)을 기록한다.
실시예 13: CD154 단백질 상의 342 항체 결합 부위 지도화
342의 결합에 중요한, 인간 CD154 중의 아미노산 잔기를 동정하기 위해 인간-마우스 키메라 CD154 단백질을 사용하여 본 실험들을 수행하였다. 342는 높은 친화도로 인간 CD154에 결합하지만, 마우스 CD154에는 결합하지 못한다. 그러므로, CD154 마우스 잔기를 상응하는 인간 잔기의 것으로 돌연변이화시키고, 돌연변이화된 단백질의 342에 대한 친화도 상의 변화를 측정함으로써 중요한 결합 잔기를 동정할 수 있다. 선별된 영역에 있는 인간 잔기가 가용성 마우스 CD154로 도입되어 있는(도 28에서 1-6으로 표시됨) 6개의 돌연변이체 군을 선별하였다. 돌연변이화되지 않은 인간 및 마우스 가용성 CD154(sCD154) 단백질 또한 평가하였다. 칩 상에 고정화되어 있는 342(IgG 포맷으로)과, 용액상의 sCD154 상등액을 사용하여 비아코 어? 실험에서 상이한 sCD154 단백질을 사용하였다. 본 결과는, 342 결합은 오직 인간 잔기 5군이 마우스 CD154로 도입되었을 때에만 일어난다는 것을 입증하였다.
실시예 14: 경쟁 ELISA 교차 차단 분석
342 및 5c8 Fab's의 교차 차단을 입증하기 위하여 본 발명자들은 경쟁 ELISA를 사용하였다. 본 분석법에서 항Myc 항체 9E10을 ELISA 플레이트 상에 코팅시켰다. Myc로 태깅된 CD154는 상기 항체에 의해 포획되었다. 표지되지 않은 342 또는 5c8 Fab'의 일련의 희석액을 PBS, 0.05% 트윈-20, 1% BSA 중 실온에서 2시간 동안 플레이트 상에서 1 nM 비오틴 342 Fab' 또는 0.3 nM 비오틴 5c8과 함께 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 2차 항체로서 스트렙타비딘 HRP를 사용하여 비오틴화된 5c8 Fab의 결합량을 측정하였다. 신호를 그래프로 작성하고, 프리즘 소프트웨어(Graph Pad)로 1개 부위 결합 쌍곡선 또는 2개 부위 결합 쌍곡선의 곡선 피트를 사용하여 피팅하였다.
교차 차단 분석에 대한 적절한 농도를 측정하기 위해 CD154 상에서 비오틴 342 Fab'의 적정을 실시하였다(도 29A). 1 nM 농도가 곡선의 선형부 상에 있는 것으로 나타났다. 교차 차단 분석에 대한 적절한 농도를 측정하기 위해 CD154 상에서 비오틴 5c8 Fab'의 적정 또한 실시하였다(도 29B). 0.3 nM 농도가 곡선의 선형부 상에 있는 것으로 나타났다. 표지되지 않은 342 Fab'에 의한 비오틴 342 및 비오틴 5c8의 교차 차단을 분석하는 실험에서 342 Fab'는 비오틴 342 Fab' 결합을 저해하였는데, 친화도는 0.09 nM이었다(도 29C). 342 Fab'는 비오틴 5c8 결합을 저해하였는데, 친화도는 0.134 nM 및 76 nM, 2개로 나타났다(도 29C). 표지되지 않은 5c8 Fab'에 의한 비오틴 342의 교차 차단은 도 29D에 제시되어 있다. 상기 곡선 상에서 5c8 Fab'의 최대 농도인 50 nM은 5c8의 포화점을 훨씬 넘고, 비오틴 342의 1 nM 농도도 훨씬 넘는다. 이러한 농도에서 완벽하게 저해하지 못한다는 것은 5c8이 CD40L 상의 모든 342 결합 부위를 완벽하게 차단하지 못한다는 것을 제안한다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOGEN IDEC MA INC. UCB PHARMA S.A. <120> BINDING PROTEINS, INCLUDING ANTIBODIES, ANTIBODY DERIVATIVES AND ANTIBODY FRAGMENTS, THAT SPECIFICALLY BIND CD154 AND USES THEREOF <130> 000455-0381-WO1 <140> PCT/US08/003735 <141> 2008-03-21 <150> 60/920,495 <151> 2007-03-27 <150> 60/919,938 <151> 2007-03-22 <150> 60/919,816 <151> 2007-03-22 <160> 77 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr 20 25 30 His Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 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taccgtttac 300 ctccagatga actctctccg cgcagaggac acagcagtct attactgtgc acgtcaactg 360 acccactatt acgttttggc agcctggggt caagggactc tggtcacagt ctcgagcgct 420 tctacaaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtcg acaagaaagt tgagcccaaa 720 tcttgt 726 <210> 27 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 27 atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa 60 gctgaggttc agctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggtgg gagcctgcgt 120 ctctcttgtg cagtgagcgg cttcagctct accaattacc atgtgcactg ggtgcgtcag 180 gcacctggga agggcctgga gtggatgggt gttatttggg gcgacggcga tacatcctac 240 aactccgtcc tgaagagccg tttcaccatt tcccgtgaca cctcaaagaa taccgtttac 300 ctccagatga actctctccg cgcagaggac acagcagtct attactgtgc acgtcaactg 360 acccactatt acgttttggc agcctggggt caagggactc tggtcacagt ctcgagcgct 420 tctacaaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtcg acaagaaagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcgccgcg 750 <210> 28 <211> 1438 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 28 atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa 60 gctgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg 120 actattacct gtcgtgccag tgaggacctc tattacaacc tggcctggta tcagcgtaaa 180 ccgggcaaag ccccgaagct gctcatctat gatacgtacc gcctggctga cggtgtgcca 240 agccgtttca gtggcagtgg cagcggtact gactataccc tcacaatttc gtctctccag 300 ccggaagatt tcgcctctta ctattgtcag caatattaca agttcccttt caccttcggt 360 cagggcacta aagtagaaat caaacgtacg gtagcggccc catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct caccagtaac aaaaagtttt aatagagggg agtgttaaaa tgaagaagac 720 tgctatagca attgcagtgg cgctagctgg tttcgccacc gtggcgcaag ctgaggttca 780 gctggtcgag tctggaggcg ggcttgtcca gcctggtggg agcctgcgtc tctcttgtgc 840 agtgagcggc ttcagctcta ccaattacca tgtgcactgg gtgcgtcagg cacctgggaa 900 gggcctggag tggatgggtg ttatttgggg cgacggcgat acatcctaca actccgtcct 960 gaagagccgt ttcaccattt cccgtgacac ctcaaagaat accgtttacc tccagatgaa 1020 ctctctccgc gcagaggaca cagcagtcta ttactgtgca cgtcaactga cccactatta 1080 cgttttggca gcctggggtc aagggactct ggtcacagtc tcgagcgctt ctacaaaggg 1140 cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct 1200 gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc 1260 cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct 1320 cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt 1380 gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat cttgttaa 1438 <210> 29 <211> 117 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 29 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr 20 25 30 His Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Arg Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Ala 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser 115 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Val Glu Cys Arg Ala Ser Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Asn Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Thr Leu Pro Ser 65 70 75 80 Gly Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 31 <211> 321 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 31 gacatccaga tgacacagtc tccagcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactgtcacc 60 gtcgaatgtc gagcaagtga ggacctttac tataatttag cgtggtatca gcggaaacca 120 gggaactctc ctcaactcct gatctatgat acatataggt tggcagatgg ggtcccatca 180 cggttcagtg gcagtgggtc tggcacacag tattctctaa agataaacac cctgccatct 240 ggagatgtcg caagttattt ctgtcaacag tattacaaat ttccattcac gttcggctca 300 gggaccaagc tggaactgaa a 321 <210> 32 <211> 351 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 32 caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtgcagc cctcagagac cctgtctctc 60 acctgcactg tctctgggtt ctcatcaacc aattatcatg tgcactgggt tcgacagcct 120 ccaggaaaaa gtcttgagtg gatgggagta atatggggtg atggagacac atcatataat 180 tcagttctca aatcccgact gagcatcacc agggacacct ccaggagcca agttttctta 240 aaaatgagca gtctgcaaac ggaggacact gccacctact attgtgccag gcaattgact 300 cattactatg ttctggctgc ctggggtcaa ggagcttcag tcactgtctc g 351 <210> 33 <211> 381 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 33 atgggtgtgc ccactcatct cctggggttg ttgctactgt ggattacaga tgccatatgt 60 gacatccaga tgacacagtc tccagcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactgtcacc 120 gtcgaatgtc gagcaagtga ggacctttac tataatttag cgtggtatca gcggaaacca 180 gggaactctc ctcaactcct gatctatgat acatataggt tggcagatgg ggtcccatca 240 cggttcagtg gcagtgggtc tggcacacag tattctctaa agataaacac cctgccatct 300 ggagatgtcg caagttattt ctgtcaacag tattacaaat ttccattcac gttcggctca 360 gggaccaagc tggaactgaa a 381 <210> 34 <211> 408 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 34 atggctgtcc tggtgctgtt gctctgcctg atgacatttc caagctgtgt cctgtcccag 60 gtgcagctga aggagtcagg acctggcctg gtgcagccct cagagaccct gtctctcacc 120 tgcactgtct ctgggttctc atcaaccaat tatcatgtgc actgggttcg acagcctcca 180 ggaaaaagtc ttgagtggat gggagtaata tggggtgatg gagacacatc atataattca 240 gttctcaaat cccgactgag catcaccagg gacacctcca ggagccaagt tttcttaaaa 300 atgagcagtc tgcaaacgga ggacactgcc acctactatt gtgccaggca attgactcat 360 tactatgttc tggctgcctg gggtcaagga gcttcagtca ctgtctcg 408 <210> 35 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 36 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccttggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 37 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 <210> 38 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatagcg gtggtagcac atactacgca 180 gactccgtga agggcagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag atactttgac 300 tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcc 333 <210> 39 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 <210> 40 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag atactttgac 300 tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcc 333 <210> 41 <211> 1459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 41 atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa 60 gctgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg 120 actattacct gtcgtgccag tgaggacctc tattacaacc tggcctggta tcagcgtaaa 180 ccgggcaaag ccccgaagct gctcatctat gatacgtacc gcctggctga cggtgtgcca 240 agccgtttca gtggcagtgg cagcggtact gactataccc tcacaatttc gtctctccag 300 ccggaagatt tcgcctctta ctattgtcag caatattaca agttcccttt caccttcggt 360 cagggcacta aagtagaaat caaacgtacg gtagcggccc catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct caccagtaac aaaaagtttt aatagagggg agtgttaaaa tgaagaagac 720 tgctatagca attgcagtgg cgctagctgg tttcgccacc gtggcgcaag ctgaggttca 780 gctggtcgag tctggaggcg ggcttgtcca gcctggtggg agcctgcgtc tctcttgtgc 840 agtgagcggc ttcagctcta ccaattacca tgtgcactgg gtgcgtcagg cacctgggaa 900 gggcctggag tggatgggtg ttatttgggg cgacggcgat acatcctaca actccgtcct 960 gaagagccgt ttcaccattt cccgtgacac ctcaaagaat accgtttacc tccagatgaa 1020 ctctctccgc gcagaggaca cagcagtcta ttactgtgca cgtcaactga cccactatta 1080 cgttttggca gcctggggtc aagggactct ggtcacagtc tcgagcgctt ctacaaaggg 1140 cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct 1200 gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc 1260 cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct 1320 cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt 1380 gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa 1440 aactcacaca tgcgccgcg 1459 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ala 1 5 10 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 His Asp Asp Ser Pro Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Leu Ala Gly Glu Asp Ile Ser Asn Val Leu Ala 1 5 10 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Ala Ala Asn Arg Leu Gln Asp 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Gln Gln Thr Phe Arg Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Gly Phe Ser Leu Thr Ser His His Ile Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Val Met Trp Asn Asp Gly Gly Thr Leu Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Gly Lys Met His Tyr Tyr Val Leu Asp Ala 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Gln His Tyr Ser Asn Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Gly Glu Asp Ile Ser Asn Val 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gly Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Asn Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gly Met Arg Pro 65 70 75 80 Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys 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117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Gln Val Gln Leu Thr Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser His 20 25 30 His Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Met Trp Asn Asp Gly Gly Thr Leu Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Pro Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Lys Met His Tyr Tyr Val Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser 115 <210> 61 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 61 caggtgcagc tgacggagtc agggcctggc ctggtgcagc cctcacagac cctgtctctc 60 acctgcactg tctctgggtt ctcattaacc agccatcata tatcctgggt tcgacagcct 120 ccaggaaaag gtctggagtg ggtgggagtc atgtggaatg atggaggcac attatataat 180 tcagctctca agtctcgacc gagcatcagt agggacacct ccaagagtca ggtcttctta 240 aaaatgagca gtctgcaaac tgaagacaca gccacttact actgtgccag gggcaaaatg 300 cattactatg ttctggatgc ctggggtcaa ggagcttcag tcactgtctc g 351 <210> 62 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 62 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg 35 40 45 Val Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 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acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 240 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggactg acttcaccct caccatctct 300 tctgtggagc cggaggattt tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattcctccg 360 acgttcggtg gagggaccaa gctggagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 717 <210> 65 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys 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tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 720 cccccatgcc caccgtgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 780 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcgcgta ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080 cgagagccac aagtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tcctcgattc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1380 tctctgggtt ga 1392 <210> 68 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 68 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 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gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta g 711 <210> 71 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 71 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ser 35 40 45 Thr Asn Tyr His Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Val Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 85 90 95 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Thr 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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Ala Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 73 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 73 atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggctgtag caccaggtgc ccactccgaa 60 gtacaattgg tcgagtctgg aggcgggctt gtccagcctg gtgggagcct gcgtctctct 120 tgtgcagtga gcggcttcag ctctaccaat taccatgtgc actgggtgcg tcaggcacct 180 gggaagggcc tggagtggat gggtgttatt tggggcgacg gcgatacatc ctacaactcc 240 gtcctgaaga gccgtttcac catttcccgt gacacctcaa agaataccgt ttacctccag 300 atgaactctc tccgcgcaga ggacacagca gtctattact gtgcacgtca actgacccac 360 tattacgttt tggcagcctg gggtcaaggg actctggtca cagtctcgag cgcttcaacc 420 aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagat ctacctccga gagcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 720 cccccatgcc caccgtgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 780 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcgcgta ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080 cgagagccac aagtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tcctcgattc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1380 tctctgggtt ga 1392 <210> 74 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr 20 25 30 His Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 75 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 75 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr 20 25 30 His Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 76 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser 1 5 10 15 Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr 20 25 30 Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val 35 40 45 Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser 50 55 60 Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu 65 70 75 80 Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr 85 90 95 His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly 100 105 110 Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp 115 120 125 Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu 130 135 140 Lys Leu 145 <210> 77 <211> 146 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77 Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu Ala Asn 1 5 10 15 Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr 20 25 30 Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val 35 40 45 Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gln Val Thr Phe Cys Ser 50 55 60 Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly Leu Trp Leu 65 70 75 80 Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala Asn Thr 85 90 95 His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Val His Leu Gly Gly 100 105 110 Val Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Glu 115 120 125 Ala Ser Gln Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser Ser Phe Gly Leu Leu 130 135 140 Lys Leu 145

Claims (84)

  1. (i) 각각, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5를 서열로 하는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및
    (ⅱ) 각각, 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8을 서열로 하는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3
    을 포함하는 CD154 결합 단백질.
  2. (a) 서열 번호 1, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 29로부터 선택된 VH 도메인 서열; 및
    (b) 서열 번호 2, 서열 번호 14 및 서열 번호 30으로부터 선택된 VL 도메인 서열
    을 포함하는 CD154 결합 단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    (a) 각각, 서열 번호 1 및 서열 번호 2;
    (b) 각각, 서열 번호 11 및 서열 번호 2;
    (c) 각각, 서열 번호 9 및 서열 번호 14;
    (d) 각각, 서열 번호 10 및 서열 번호 14; 및
    (e) 각각, 서열 번호 29 및 서열 번호 30
    으로부터 선택된 VH 및 VL 도메인 서열을 포함하는 CD154 결합 단백질.
  4. (a) 서열 번호 12, 서열 번호 13 및 서열 번호 72로부터 선택된 중쇄 서열; 및
    (b) 서열 번호 15 및 서열 번호 69로부터 선택된 경쇄 서열을 포함하는 CD154 결합 단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    (a) 각각, 서열 번호 12 및 서열 번호 15;
    (b) 각각, 서열 번호 13 및 서열 번호 15; 및
    (c) 각각, 서열 번호 72 및 서열 번호 69
    로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 CD154 결합 단백질.
  6. 각각, 서열 번호 13 및 서열 번호 15의 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 CD154 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결합 단백질은 항CD154 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 CD154 결합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 영장류화 항체 및 인간화 항체로부터 선택되는 CD154 결합 단백질.
  9. 제7항에 있어서, 상기 항체는 다량체 항체, 이종이량체 항체, 반이량체 항체, 4가 항체, 이중특이적 항체 및 단일 쇄 항체로부터 선택되는 것인 CD154 결합 단백질.
  10. 제7항에 있어서, 상기 단편은 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, F(ab')3, Fd, Fv 및 도메인 항체로부터 선택되는 CD154 결합 단백질.
  11. 제7항에 있어서, 기능적 부분의 공유 부착에 의해 변형된 것인 CD154 결합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 기능적 부분은 폴리(에틸렌글리콜), 히드록시폴리(에틸렌글리콜), 메틸폴리(에틸렌글리콜), 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 PEG 말레이미드인 CD154 결합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 CD154 결합 단백질은 Fab' 항원 결합 단편이고, 변형된 힌지 영역 내의 티올기는 리신 잔기에 공유 결합된 말레이미드기에 공유 결합되며, 분자량이 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 리신의 각 아민기에 부착되는 것인 CD154 결합 단백질.
  14. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질은 비면역글로불린 도메인 단백질 스캐폴드를 포함하는 CD154 결합 단백질.
  15. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질은 면역글로불린 Fc 영역이 결여된 CD154 결합 단백질.
  16. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 Fc 영역로부터 선택되거나 또는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역으로부터 유도된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 CD154 결합 단백질.
  17. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질은 천연 또는 모체 Fc 영역과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 부여하는 변이체 Fc 영역을 추가로 포함하는 것인 CD154 결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 상기 변이체 Fc 영역은 1 초과의 Ig Fc 도메인 유형으로부터 유래된 서열을 포함하는 하이브리드 Fc 영역인 CD154 결합 단백질.
  19. 제1항 내지 제6항 및 제14항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결합 단백질은 글리코실화되지 않은 CD154 결합 단백질.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 감소된 이펙터 기능은 Fc 수용체(FcR)에의 감소된 결합인 CD154 결합 단백질.
  21. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 감소된 이펙터 기능은 보체 단백질에의 감소된 결합인 CD154 결합 단백질.
  22. 제1항 내지 제6항 및 제14항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결합 단백질, 항체 또는 단편은 기능적 부분에 연결된 것인 CD154 결합 단백질.
  23. 제1항 내지 제6항 및 제14항 내지 제18항 중 어느 하나의 항의 CD154 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  24. 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 41, 서열 번호 70 및 서열 번호 73으로부터 선택된 서열을 포함하는 DNA 분자.
  25. 제23항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  26. 제24항의 DNA 분자를 포함하는 벡터.
  27. 제25항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. a) 제27항의 숙주 세포가 CD154 결합 단백질을 발현하기에 적합한 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 CD154 결합 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하는 CD154 결합 단백질의 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포인 제조 방법.
  30. 제1항 내지 제6항 및 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항의 CD154 결합 단백질과, 적합한 약학적 담체를 포함하는 염증, 자가면역 질환 또는 섬유증을 치료하거나 예방하기 위한 약학 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 추가의 면역억제제를 더 포함하는 약학 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 염증, 자가면역 질환 또는 섬유증은 류마티스양 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 척추관절염, 염증성 장 질환, 크론병, 건선, 공피증, 루푸스 신염, 특발성 혈소판감소성 자반증, 혈관 질환 및 다발성 경화증으로부터 선택되는 약학 조성물.
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