KR101578686B1 - 항-알파2 인테그린 항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 인간화 항-알파 2 (α2) 인테그린 항체 및 항-α2 인테그린 항체를 사용한 치료 방법을 포함하는, α2β1 인테그린에 작용하는 항체 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위, 인간 경쇄 불변 부위 및 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되고 변형된 효과기 기능을 발휘하는 인간화 항-α2 인테그린 항체에 관한 것이다.

Description

항-알파2 인테그린 항체 및 그 용도{ANTI-ALPHA2 INTEGRIN ANTIBODIES AND THEIR USES}
본 발명은 일반적으로 인간화 항-알파2(α2) 인테그린 항체와 항-α2 인테그린 항체를 사용한 치료 방법을 포함하는, α2β1 인테그린에 작용하는 항체 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위(light chain variable region), 인간 경쇄 불변 부위 및 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위(variant human IgG1 heavy chain constant region)를 포함하여 구성되고, 변형된 효과기(effector) 기능을 발휘하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체에 관한 것이다.
인테그린 α2β1(Very late antigen 2; VLA-2)은 혈소판, 혈관 내피 세포, 상피 세포, 활성화된 단핵세포/대식세포, 섬유아세포, 백혈구, 림프구, 활성화된 호중구 및 비만 세포를 포함하는 다양한 세포 유형들에서 발현된다(Hemler, Annu Rev Immunol 8:365:365-400 (1999); Wu and Santoro, Dev. Dyn. 206:169-171 (1994); Edelson et. al., Blood. 103(6):2214-20 (2004); Dickeson et al, Cell Adhesion and Communication. 5: 273-281 (1998)). α2β1을 위한 가장 일반적인 리간드는 콜라겐과 라미닌을 포함하고, 이들은 둘 다 세포 외 기질에서 발견된다. 일반적으로 α2 인테그린의 I-도메인은 콜라겐에 2가-양이온 의존적 방식으로 결합하지만, 같은 도메인이 라미닌에 대해서는 2가-양이온 의존적 메커니즘과 2가-양이온 독립적 메커니즘 두 가지 모두를 통해 결합한다(Dickeson et al, Cell Adhesion and Communication. 5: 273-281 (1998)). α2β1 인테그린의 특이성은 세포 유형에 따라 달라지며, 특정 세포 유형을 위한 콜라겐 및/또는 라미닌 수용체의 역할을 하는데, 예를 들어, α2β1 인테그린은 혈소판을 위한 콜라겐 수용체 및 내피 세포를 위한 라미닌 수용체로 알려져 있다(Dickeson et al, J Biol. Chem. 272: 7661-7668 (1997)). 에코바이러스-1, 데코린, E-카드헤린, 매트릭스 메탈로프로테이나제 I(MMP-I), 엔도레펠린 및 다양한 콜렉틴들 및 C1q 보체 단백질도 α2β1 인테그린을 위한 리간드이다(Edelson et al., Blood 107(1): 143-50 (2006)). α2β1 인테그린은 콜라겐-유도성 혈소판 응집, 콜라겐에서의 세포 이동, 콜라겐 섬유의 세포-의존적 재구성, 그리고 사이토카인 발현 및 증식의 증가를 가져오는 콜라겐-의존적 세포성 반응(Gendron, J. Biol. Chem. 278:48633-48643 (2003); Andreasen et al., J. Immunol. 171:2804-2811 (2003); Rao et al., J. Immunol. 165(9):4935-40 (2000)), T-세포, 비만 세포 및 호중구 기능의 측면(Chan et. al., J. Immunol. 147:398-404 (1991); Dustin and de Fougerolles, Curr Opin Immunol 13:286-290 (2001), Edelson et. al., Blood. 103(6):2214-20 (2004), Werr et al., Blood 95:1804-1809 (2000)), 지연형 과민증 접촉 과민증 및 콜라겐-유도성 관절염의 측면(de Fougerolles et. al., J. Clin. Invest. 105:721- 720 (2000); Kriegelstein et al., J. Clin. Invest. 110(12):1773-82 (2002)), 유선관 형태형성(Keely et. al., J. Cell Sci. 108:595-607 (1995); Zutter et al., Am. J. Pathol. 155(3):927-940 (1995)), 상피 창상 치유(Pilcher et. al., J. Biol. Chem. 272:181457-54 (1997)), 및 VEGF-유도성 혈관신생과 관련된 프로세스(Senger et al., Am. J. Pathol. 160(1):195-204 (2002))을 포함하는 여러 가지 생물학적 및 병리학적 프로세스에 관련되어 있다.
인테그린/리간드 상호작용은 염증성 조직으로의 백혈구 혈관밖유출을 촉진할 수 있고(Jackson et al., J. Med. Chem. 40:3359-3368 (1997); Gadek et al., Science 295(5557):1086-9 (2002), Sircar et al., Bioorg. Med. Chem. 10:2051-2066 (2002)), 염증 부위에서의 전염증성(pro-inflammatory) 세포의 이동, 보충(recruitment) 및 활성화를 포함하는, 염증성 자극에 반응하여 순환계로부터 조직 내로의 백혈구의 초기 혈관밖유출 이후의 하류 현상들에서 역할을 수행한다(Eble J.A., Curr. Phar. Des. 11(7):867-880 (2005)). α2β1 인테그린을 억제하는 몇몇 항체들은 류머티즘성 관절염의 생쥐 모델 및 염증성 장 질환의 모델에서 효능과 지연형 과민 반응에 대한 영향을 나타내는 것으로 보고되었으며(Kriegelstein et al., J. Clin. Invest. 110(12):1773-82 (2002); de Fougerolles et. al., J. Clin. Invest. 105:721- 720 (2000)), 시험관 내에서 내피 세포 증식 및 이동을 감소시키는 것으로 보고되었는데(Senger et al., Am. J. Pathol. 160(1):195-204 (2002)), 이것은 다양한 암들에서 관찰된 바와 같이, α2β1 인테그린의 억제가 비정상적이거나 정상보다 높은 혈관신생(angiogenesis)을 방지/억제할 수 있다는 것을 시사한다.
혈소판의 α2β1 인테그린을 포함하여, α2β1 인테그린에 결합한 치료용 항체가 출혈 합병증을 가져올 수 있다고 예상된다. 예를 들어, GPIb(Vanhoorelbeke et al., Curr. Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 3(2):125-40 (2003)) 또는 GP IIb/IIIa(Schell et al., Ann. Hematol. 81:76-79 (2002), Nieswandt and Watson, Blood 102(2):449-461 (2003), Merlini et al., Circulation 109:2203-2206 (2004))와 같은 다른 혈소판 수용체를 표적으로 하는 항체는 혈소판 감소와 연관되어 있지만, 그 이면의 메커니즘은 충분히 밝혀져 있지 않다. 항체의 혈소판 수용체에 대한 결합이 그것의 3차원 구조를 변화시켜서 정상적으로 노출되지 않은 에피토프를 노출시킬 수 있고, 이는 혈소판 소실을 초래한다고 가설이 세워졌다(Merlini et al., Circulation 109:2203-2206 (2004)). 실제로, GP IIa/IIIb 길항제의 경구 복용과 관련된 출혈 합병증이 이러한 종류의 화합물의 “부정적인 면”으로 언급되어 왔다(Bhatt and Topol, Nat. Rev. Drug Discov. 2(1):15-28 (2003)). α2β1 인테그린이 염증성 조직을 통과하는 백혈구의 이동에 중요한 역할을 하는 경우에, 암, 염증성 질환 및 자가면역 질환을 포함하는, α2β1 인테그린-관련 장애와 같은 질환 및/또는 이러한 장애와 관련된 세포 프로세스에 대해 α2β1을 표적으로 할 수 있는 치료제를 개발하는 것이 바람직할 것이며, 이러한 치료제는 혈소판을 활성화시키지 않는 것을 조건으로 한다. 백혈구의 α2β1 인테그린과 같은 α2β1 인테그린을 표적으로 할 수 있고 해로운 출혈 합병증과 관련되지 않은 인간화 항체(humanized antibodies)가 국제특허공개 WO2007/056858에 기술되어 있다. 여기에 기술된 인간화 항-α2 인테그린 항체는 생체 내 출혈 합병증을 예상 외로 일으키지 않고 그리고/또는 혈소판 α2β1 인테그린을 활성화시키지 않는 것을 특징으로 하는, 항-α2 항체의 신규한 아형(subgroup)을 나타낸다. 그러나, 국제특허공개 WO2007/056858에 개시된 IgG4 항체는 예를 들어, α2β1 인테그린-관련 장애, 예컨대, 암의 치료와 같은, 특정 상황에서 필요로 하고, 치료의 효능을 증가시킬 수 있는, ADCC 및/또는 CDC와 같은 효과기 기능을 수반하지 않는다. 따라서, 이러한 효과기 기능을 높은 수준으로 나타낼 항-α2β1 인테그린 항체를 개발하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명은, 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위, 인간 경쇄 불변 부위 및 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하여 구성되는 인간화 항-α2 인테그린 항체로서, 상기 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위가 모 인간화 항-α2 인테그린 항체(parent humanized anti-α2 integrin antibody)의 인간 IgG1 중쇄 불변 부위에 대한 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 항체가 상기 모 인간화 항-α2 인테그린 항체에 비해 변형된 효과기 기능을 발휘하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 인간화 항-α2β1 인테그린 항체를 암호화하는(encoding) 분리된 핵산(isolated nucleic acid)을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 핵산을 포함하여 구성되는 벡터(vector)를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하여 구성되는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하여 구성되는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 인간화 항-α2 인테그린 또는 상기 조성물 및 α2β1 인테그린-관련 장애의 치료를 위한 설명서(instructions)를 포함하여 구성되는 키트(kit)를 제공한다.
본 발명은 또한 치료적 유효량의 상기 항-α2 인테그린 항체 또는 상기 조성물을 개체(subject)에게 투여하는 것을 포함하는, 개체의 α2β1 인테그린-관련 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 백혈구의 콜라겐에 대한 결합을 억제하는데 효과적인 양의 상기 항-α2β1 인테그린 항체 또는 상기 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 백혈구의 콜라겐에 대한 결합을 억제하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체 또는 상기 조성물의 의약(medicament)으로서의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체 또는 상기 조성물의 α2β1 인테그린-관련 장애의 치료를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 α2β1 인테그린-관련 장애의 치료 방법에 사용하기 위한 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체 또는 상기 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체 또는 상기 조성물의 α2β1 인테그린-관련 장애 치료용 의약의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 모 항체의 아미노산 위치 324의 세린을 아스파라긴으로 대체한 아미노산 치환 S324N을 포함하는 변이체 인간 IgG Fc 부위를 포함하여 구성되는 것으로서, 상기 모 항체에 비해 개선된 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC) 및 개선된 항체 의존적 세포 매개 세포독성(antibody dependent cell mediated/cellular cytotoxicity: ADCC)을 발휘하는 항체를 제공한다.
도 1은 선별된 항-VLA2 항체 변이체: (1) 항-VLA2 IgG4; (2) 항-VLA2 IgG1; (3) 항-VLA2 IgG2; (4) 항-VLA2 IgG3; (5) 항-VLA2 IgG1133; (6) 항-VLA2 IgG3133; (7) 항-VLA2 IgG1-S324N; (8) 항-VLA2 IgG1-S298A, (9) 항-VLA2 IgG1-E269D; (10) 항-VLA2 IgG1-E269D/S298A/S324N; (11) 항-VLA2 IgG1-S298A/S324N; (12) IgG1 대조군; (13) 음성 대조군(항체 불포함)의 세포-기반 CDC 분석을 보여준다.
도 2는 선별된 항-VLA2 항체 변이체: (1) 항-VLA2 IgG4; (2) 항-VLA2 IgG1; (3) 항-VLA2 IgG2; (4) 항-VLA2 IgG3; (5) 항-VLA2 IgG1133; (6) 항-VLA2 IgG3133; (7) 항-VLA2 IgG1-S324N; (8) 항-VLA2 IgG1-S298A, (9) 항-VLA2 IgG1-E269D; (10) 항-VLA2 IgG1-E269D/S298A/S324N; (11) 항-VLA2 IgG1-S298A/S324N; (12) IgG1 대조군; (13) 음성 대조군(항체 불포함)의 0.1μg/ml의 최종 농도에서의 세포-기반 ADCC 분석을 보여준다.
도 3은 선별된 항-VLA2 항체 변이체: (1) 항-VLA2 IgG4; (2) 항-VLA2 IgG1; (3) 항-VLA2 IgG2; (4) 항-VLA2 IgG3; (5) 항-VLA2 IgG1133; (6) 항-VLA2 IgG3133; (7) 항-VLA2 IgG1-S324N; (8) 항-VLA2 IgG1-S298A, (9) 항-VLA2 IgG1-E269D; (10) 항-VLA2 IgG1-E269D/S298A/S324N; (11) 항-VLA2 IgG1-S298A/S324N; (12) IgG1 대조군; (13) 음성 대조군(항체 불포함)의 0.01μg/ml의 최종 농도에서의 세포-기반 ADCC 분석을 보여준다.
본 발명은 모 인간화 항-α2 인테그린 항체에 비해 변형된 효과기 기능을 발휘하는 인간화 항-α2 인테그린 항체에 관한 것이다.
α2β1 인테그린은 알파 인테그린 패밀리의 α2 인테그린 서브유닛 및 베타 인테그린 패밀리의 β1 인테그린 서브유닛으로 구성된 분자이며, 포유류를 포함하는 개체(subject)로부터 유래될 수 있지만, 바람직하게는 인간으로부터 유래된다. α2β1 인테그린은 여하한 천연 공급원으로부터 정제하여 얻을 수 있거나 (예를 들어, 재조합 DNA 기술의 사용으로) 합성하여 만들 수 있다. α2 인테그린 및 β1 인테그린의 핵산 코딩 서열은 각각 Takada and Hemler J. Cell Biol. 109(1):397-407(1989; GenBank submission X17033; 이후에 엔트리 NM 002203으로 업데이트됨) 및 Argraves, W.S, J. Cell. Biol. Sep 105(3):1183-90(1987; Genbank submission X07979.1 및 교대성 접합 변이체(alternatively spliced variants)를 나타내는 관련 서열)에 기술되어 있다.
α2β1 인테그린 분자의 'I' 도메인은, α2 서브유닛 내에 있는 이 α2β1 인테그린 분자의 한 부위를 나타내며, 예를 들어, Kamata et al., J Biol. Chem. 269:9659-9663(1994); Emsley et al., J. Biol. Chem. 272:28512 (1997) 및 Cell 101:47 (2000)에 기술되어 있다. α2 인테그린의 I 도메인은, 리간드 결합을 지지하기 위하여, 주어진 2가 양이온을 위한 특이성과 요건을 갖춘 MIDAS(Metal Ion Dependent Adhesion Site) 형의 리간드 결합 부위를 포함한다.
α2 인테그린-관련 장애는 표적 조직 내의 비정상적인 세포성 반응을 매개하는 α2 인테그린-의존적 프로세스/기능(예를 들어, 결합, 활성)과 관련된 장애, 질환, 또는 병태를 포함한다. 질환에 관련된 α2 인테그린-의존적 프로세스의 예들은 콜라겐-의존적 세포성 반응들, 예컨대, 사이토카인 발현 및 증식의 증가에 관련된 것들, T-세포-, 비만 세포- 및 호중구-기능의 측면, 염증성 장애, 유선관 형태형성, 상피 창상 치유, 및 혈관신생을 포함한다. α2 인테그린-관련 장애의 예들은, 염증성 장 질환(예컨대, 크론 병 및 궤양성 대장염), 이식에 대한 반응(이식 거부 포함), 시신경염, 척수 손상, 류머티즘성 관절염, 다발성 경화증(재발을 특징으로 하는 다발성 경화증뿐만 아니라 관련된 신경학적 후유증의 치료 포함), 자가면역 질환 또는 장애(전신 홍반성 루푸스(SLE), 당뇨병, 레이노 증후군, 실험성 자가면역 뇌척수염, 쇼그렌 증후군, 경피증 포함), 유년 발병형 당뇨병, 및
비정상적이거나 정상보다 높은 혈관신생과 관련된 장애(예컨대, 당뇨 망막병증, 노화성 황반 변성, 심장혈관 질환, 건선, 류머티즘성 관절염 및 암)을 포함하나 이에 한정되지 않는 염증성 질환 또는 장애와 함께, 염증성 반응 유발 감염을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
α2β1 인테그린-관련 장애의 치료는 본 명세서에 기술된 항-α2 인테그린 항체의 치료 용도와 예방 용도를 둘 다 포함한다. 치료가 필요한 대상은 이미 장애를 진단받은 대상뿐만 아니라 장애의 발병을 예방 또는 지연시켜야 하는 대상도 포함한다.
“항-α2 인테그린 항체” 또는 “α2에 결합하는 항체” 또는 “α2 인테그린 서브유닛에 결합하는 항체” 또는 “항-VLA-2 항체”라는 용어들은 본 명세서에서 같은 의미로 사용되며, 인간 α2 인테그린에 결합하는, 예를 들어 50nM 이하, 바람직하게는 10nM 이하, 더욱 바람직하게는 1nM 이하, 특히 0.5nM 이하의 친화성(affinity)(Kd)으로 고정화(immobilized) α2β1에 결합하는, 항체, 바람직하게는 인간화 IgG 항체를 포함한다.
본 명세서에서 같은 의미로 사용되는 “모 인간화 항-α2 인테그린 항체” 또는 “모 항-α2 인테그린 항체” 또는 “모 항-VLA-2 항체”라는 용어는 인간-α2 인테그린에 결합하는 항체, 예를 들어 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되도록 변형될 수 있는 인간화 IgG1 항-α2 인테그린 항체를 의미한다. 모 인간화 항-α2 인테그린 항체는, 인간 IgG1 중쇄 불변 부위의 아미노산 변형을 제외하고는 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 항체와 동일하고, 대개는 자연 그대로의 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 가진 항체이다. 아미노산 변형은 동종형이 아닌 것이 바람직하다.
“항체” 또는 “면역글로불린”이라는 용어는, 가장 광범위한 의미로 사용되며, 그들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체(전장(full length) 단일클론 항체 포함), 다중클론 항체 및 다중특이성 항체를 포괄한다. 항체 또는 면역글로불린이라는 용어는 전장 항체뿐만 아니라 항원 결합 특성을 가진, 즉, α2 인테그린에 결합하는, 그 단편도 포함한다. “항체”라는 용어는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 적어도 두 개의 중쇄(H) 및 두 개의 경쇄(L), 또는 그 항원 결합 단편을 포함하여 구성되는 당단백질을 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 부위(본 명세서에서 VH로 약기됨) 및 중쇄 불변 부위로 구성된다. 중쇄 불변 부위는 세 가지 도메인, CHI, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 부위(본 명세서에서 VL로 약기됨) 및 경쇄 불변 부위(본 명세서에서 CL로 약기됨)로 구성된다. 경쇄 불변 부위는 하나의 도메인으로 구성된다. VH 및 VL 부위는 상보성 결정 부위(complementarity determining regions: CDR)라고 하는 과변이 부위들로 더 세분될 수 있으며, 이 상보성 결정 부위들은 골격 부위(framework regions: FR 또는 FW)라고 불리우고 더욱 보존적인(more conserved) 부위들과 섞여 있다. VH 및 VL은 각각 아미노-말단에서 카복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 세 개의 CDR들과 네 개의 FR들로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 부위는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 부위는 면역계의 다양한 세포들(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적 보체계의 첫 번째 성분(C1q)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 명세서에 사용된 “전장 항체”라는 용어는, 가변 및 불변 부위들을 포함하는, 항체의 자연발생적 생물학적 형태를 구성하는 구조를 포함한다. 예를 들어, 인간과 생쥐를 포함하는 대부분의 포유류에서, IgG 클래스(class)의 전장 항체는 테트라머이고, 두 개의 면역글로불린 사슬들의 두 개의 동등한 쌍들로 구성되며, 각 쌍은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄를 가지는데, 각 경쇄는 면역글로불린 도메인 VL 및 CL을 포함하여 구성되고, 각 중쇄는 면역글로불린 도메인 VH, CH1(C[감마]1), CH2(C[감마]2), 및 CH3(C[감마]3)을 포함하여 구성된다. 몇몇 포유류에서, 예를 들어, 낙타 및 라마에서, IgG 항체는 단지 두 개의 중쇄들로 구성될 수 있는데, 각 중쇄는 Fc 부위에 부착된 가변 도메인을 포함하여 구성된다.
본 명세서에 사용된 “키메라 항체(chimeric antibody)”라는 용어는, 가변 부위 서열이 하나의 종(species)으로부터 유래되고, 불변 부위 서열이 또 다른 종으로부터 유래된 항체를 포함하며, 예를 들면 가변 부위 서열이 생쥐 항체로부터 유래되고 불변 부위 서열이 인간 항체로부터 유래된 항체이다.
본 명세서에 사용된 "인간화 항체"라는 용어는, 생쥐와 같은 또 다른 포유류 종의 배선(germline)으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열에 이식된 항체를 포함한다. 추가적인 골격 부위 변형이 인간 골격 서열뿐만 아니라 또 다른 포유류 종의 배선으로부터 유래된 CDR 서열에서도 이루어질 수 있다.
본 명세서에 사용된 “인간 항체”라는 용어는, 골격 부위와 CDR 부위가 둘 다 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 부위를 가진 항체를 포함한다. 또한, 항체가 불변 부위를 포함하는 경우에, 이 불변 부위도 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 특이자리 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본 명세서에 사용된 "인간 항체"라는 용어는, 생쥐와 같은 또 다른 포유류 종의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열에 이식된 항체를 포함하지 않는다.
단일클론 항체는 실질적 동종 항체들의 모집단으로부터 얻은 항체를 포함하며, 예를 들어, 모집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생적 돌연변이들을 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 작용한다. 또한, 일반적으로 항원의 다양한 결정기(determinants)(예를 들어, 에피토프)에 작용하는 다양한 항체를 포함하는 통상적인(예를 들어, 다중클론) 항체 제조와는 달리, 각 단일클론 항체는 항원의 적어도 하나의 단일 결정기에 작용한다. “단일클론”이라는 수식어는 항체의 특성이 항체의 실질적 동종 모집단으로부터 얻어진다는 것을 나타내며, 항체가 어떤 특정한 방법으로 제조될 필요가 있는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature 256:495 (1975)에 최초로 기술된 하이브리도마(hybridoma) 방법에 의해 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 만들 수 있다. 단일클론 항체는 또한 예를 들어, Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 기술된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리(phage antibody libraries)로부터 분리할 수 있다. 단일클론 항체는 또한 미국 특허 제6,025,155호 및 제6,077,677호 그리고 미국 특허 출원 공개 제2002/0160970호 및 제2003/0083293호에 기술된 기술을 사용하여 분리할 수 있다(예를 들어, Lindenbaum, et al., Nucleic Acids Research 32 (21):0177 (2004)를 또한 참조).
과가변 부위(hypervariable region)는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기들을 포함한다. 과가변 부위는 상보성 결정 부위 또는 CDR의 아미노산 잔기들(예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 과가변 루프의 그러한 잔기들(예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))을 포함하여 구성된다. 골격 잔기 또는 FR 잔기는 과가변 부위 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기이다. 본 명세서에 기술된 항체의 경우에, CDR 부위 및 골격 부위는, 중쇄의 CDR1이 옥스퍼드 몰레큘러(Oxford Molecular)의 AbM 정의에 의해 잔기 26 내지 35에 이르는 것으로 정의되는 것을 제외하고는, 카바트 넘버링 시스템(Kabat numbering system)을 토대로 하여 동정된다. 옥스퍼드 몰레큘러(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(http://people.cryst.cck.ac.uk/~ubc07s/) (Martin et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203, 121-153 (1991); Pedersen et al., Immunomethods, 1, 126 (1992); 및 Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172. (1996))는 카바트(Kabat) CDR 및 코티아(Chothia) 과가변 부위 넘버링 시스템들을 통합하여 CDR을 정의한다.
본 명세서의 “아미노산 변형”이라는 용어는 폴리펩타이드 서열의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함한다. 본 명세서에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에 있는 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. 예를 들어, 치환 R94K는 변이체 폴리펩타이드를 나타내며, 이 경우에는 위치 94의 아르기닌이 라이신(lysine)으로 대체된 중쇄 가변 골격 부위 변이체다. 상기 예의 경우에, 94K는 위치 94의 라이신으로의 치환을 나타낸다. 이러한 목적을 위해, 다중 치환은 일반적으로 슬래시(slash)에 의해 구분된다. 예를 들어, R94K/L78V는 치환 R94K 및 치환 L78V을 포함하는 이중 변이체를 나타낸다. 본 명세서에 사용된 “아미노산 삽입” 또는 “삽입”은 모 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에서의 아미노산 첨가를 의미한다. 예를 들어, 삽입 -94는 위치 94에서의 삽입을 나타낸다. 본 명세서에 사용된 “아미노산 결실” 또는 “결실”은 모 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에서의 아미노산 제거를 의미한다. 예를 들어, R94-는 위치 94에서의 아르기닌의 결실을 나타낸다.
본 발명에서 논의된 모든 면역글로불린 중쇄 불변 부위 위치에 있어서, 넘버링은 카바트(Kabat) 논문(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 전체적으로 본 명세서의 참고문헌을 이룸)에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 면역글로불린 중쇄 불변 부위 위치의 넘버링은, 본 명세서에서 동등하게 사용되고 카바트(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스에 따른 넘버링을 뜻하는, “카바트(Kabat)에 기술된 넘버링 시스템” 또는 “카바트(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스”를 나타낸다. “카바트(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스”는 Edelman et al., 1969, PNAS 63:78-85에 기술된 바와 같이 인간 IgGl EU 항체의 잔기 넘버링을 나타낸다.
항체는 불변 부위에 의해 유전적으로 결정된 대로, 동종형(isotypes)이라고도 불리우는, 클래스들로 분류된다. 인간 불변 경쇄는 카파(CK) 경쇄 및 람다(C[lambda]) 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤(mu), 델타(delta), 감마(gamma), 알파, 또는 엡실론(epsilon)으로 분류되고, 항체의 동종형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. IgG 클래스는 치료 목적을 위해 가장 일반적으로 사용된다. 인간의 경우에 이 클래스는 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하여 구성된다. 생쥐의 경우에 이 클래스는 서브클래스 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3을 포함하여 구성된다. IgM은 IgM1 및 IgM2를 포함하나 이에 한정되지 않는 서브클래스들을 가진다. IgA는 IgA1 및 IgA2를 포함하나 이에 한정되지 않는 몇 가지 서브클래스들을 가진다. 따라서, 본 명세서에 사용된 "동종형"은 그들의 불변 부위의 화학적 특성 및 항원 특성에 의해 정의된 면역글로불린의 어떤 클래스 또는 서브클래스를 의미한다. 공지된 인간 면역글로불린 동종형은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD 및 IgE이다.
본 명세서에 사용된 “Fc” 또는 “Fc 부위”라는 용어는, 첫 번째 불변 부위 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 부위를 포함하여 구성되는 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서 Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 끝에 있는 두 개의 불변 부위 면역글로불린 도메인, 및 IgE 및 IgM의 끝에 있는 세 개의 불변 부위 면역글로불린 도메인, 및 유연성 힌지 N-말단(flexible hinge N-terminal)에서 상기 도메인까지를 나타낸다. IgA 및 IgM의 경우에, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 경우에, Fc는 면역글로불린 도메인 C감마2 및 C감마3(C[감마]2 및 C[감마]3) 및 C감마l(C[감마]l) 및 C감마2(C[감마]2) 사이의 힌지를 포함하여 구성된다. Fc 부위의 경계(boundaries)는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 부위는 대개 잔기 C226 또는 P230에서 그것의 카복실-말단까지 포함하여 구성되는 것으로 정의되며, 여기서 넘버링은 카바트(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스를 따른다. Fc는 이 부위를 별도로 나타내거나, Fc 폴리펩타이드, 예컨대, 항체와 관련하여 이 부위를 나타낼 수 있다.
본 명세서에 사용된 “변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위”는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 인간 IgG1 중쇄 불변 부위와 상이한 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 의미한다. 본 명세서에 사용된 “Fc 변이체” 또는 “변이체 Fc” 또는 “변이체 인간 IgG1 Fc 부위”는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 Fc 서열의 것과 상이한 Fc 서열을 의미한다. 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위 또는 Fc 변이체는 모 Fc 폴리펩타이드에 대한 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 변형(들)은 하나 이상의 최적화된 특성을 제공한다. 본 발명의 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위 또는 Fc 변이체는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 그것의 모 IgG1과 아미노산 서열이 다르다. 따라서 본 발명의 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위 또는 Fc 변이체는 모체(parent)에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형을 가진다. 이와 달리, 본 발명의 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위는, 모체에 비해 하나보다 많은 아미노산 변형을 가질 수 있으며, 예를 들어, 전체 불변 부위 면역글로불린 도메인의 전환(conversion) 또는, 바람직하게는, 한 동종형의 Fc 부위의 다른 동종형으로의 전환, 예컨대, 인간 IgG1 중쇄 불변 부위의 Fc 부위의, 인간 IgG3의 Fc 부위로의 전환(인간 IgG1의 CH1, 인간 IgG1의 힌지 및 인간 IgG3의 Fc 부위를 포함하여 구성되는 동종형 변이체를 결과로서 가져옴)을 포함할 수 있다. 변형은 분자생물학을 사용하여 유전학적으로 이루어질 수 있거나 효소적으로 또는 화학적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 Fc 변이체는 대체로 임의의 면역글로불린 유전자의 임의의 이인자형(allotype) 또는 동종이인자형(isoallotype) 에 의해 암호화될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 G1m(1), G1m(2), G1m(3), G1m(17), nG1m(1), nG1 m(2), 및/또는 nG1 m(17)로 분류되는 IgG1 서열들을 포함하여 구성되는 항체 또는 Fc 융합체에서의 용도를 제공한다. 따라서 IgGI 동종형이라는 맥락에서, 본 발명의 Fc 변이체는 위치 214의 Lys(G1m(17)) 또는 Arg(G1m(3)), 위치 431의 Asp356/Leu358(G1m(1)) 또는 Glu356/Met358(nG1m(1)), 및/또는 GIy(G1m(2)) 또는 Ala(nG1m(2))를 포함하여 구성될 수 있다.
본 명세서에 사용된 “동종형 변이체”라는 용어는 하나의 동종형의 적어도 하나의 아미노산을, 바람직하게는 하나의 동종형의 중쇄 불변 부위의 적어도 하나의 아미노산을, 상이한 정렬된 동종형의 상응하는 아미노산으로 전환시키는 아미노산 변형을 포함한다. 아미노산 변형은 전체 불변 부위 면역글로불린 도메인의 전환 또는, 바람직하게는, 한 동종형의 Fc 부위의 다른 동종형으로의 전환, 예컨대, 인간 IgG1 중쇄 불변 부위의 Fc 부위의, 인간 IgG3의 Fc 부위로의 전환(인간 IgG1의 CH1, 인간 IgG1의 힌지 및 인간 IgG3의 Fc 부위를 포함하여 구성되는 동종형 변이체를 결과로서 가져옴)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "힌지" 또는 "힌지 부위" 또는 "항체 힌지 부위"는 항체의 첫 번째 불변 도메인과 두 번째 불변 도메인 사이의 아미노산들을 포함하여 구성되는 유연성 폴리펩타이드를 의미한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 위치 220에서 끝나고, IgG CH2 도메인은 잔기 EU 위치 237에서 시작한다. 따라서 IgG의 경우에 항체 힌지는 본 명세서에서 위치 221(IgGI의 D221) 내지 231(IgGI의 A231)을 포함하는 것으로 정의되며, 여기서 넘버링은 카바트(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스를 따른다.
본 명세서에 사용된 “효과기 기능”이라는 용어는 항체 Fc 부위와 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용에 기인하는 생화학적 사건을 포함한다. 본 명세서에 사용된 “효과기 기능”이라는 용어는 식세포작용, 옵소닌작용(opsonization), 세포 결합, 재조정(resetting), 보체 의존적 세포독성(CDC), C1q 결합, Fc[감마] 수용체에 대한 항체의 결합 친화성 또는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 포함한다. 바람직하게는 효과기 기능은 보체 의존적 세포독성(CDC) 및/또는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)이다. 효과기 기능은 이 분야에 공지되어 있고 상업적으로 이용 가능한 표준 시험관 내 분석에 의해 측정한다. 일반적으로 ADCC는 본 출원의 실시예 2에 기술된 젖산 탈수소효소(LDH)-방출 분석에 의해 측정하고, CDC는 본 출원의 실시예 1에 기술된 세포-기반 분석에 의해 측정한다.
본 명세서에 사용된 “변형된 효과기 기능” 또는 “변형된 효과기 기능을 발휘하는”이라는 용어는, 항체가, 예를 들어, 모 항체에 비해 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하는 인간화 항-α2 인테그린 항체가, 강화된 효과기 기능을 발휘하는 것을 포함하며, 바꿔 말하면, 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 항체의 효과기 기능이 모 항체의 효과기 기능보다 10 % 이상, 바람직하게는 20 % 이상, 더욱 바람직하게는 30 % 이상, 가장 바람직하게는 50 % 이상, 특히 60 % 이상, 가장 구체적으로는 70 % 이상 더 높다.
본 명세서에 사용된 “ADCC” 또는 “항체 의존적 세포-매개성 세포독성”이라는 용어는 Fc[감마]Rs를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에 결합된 항체를 인식하여 표적 세포의 용해(lysis)를 일으키는 세포-매개성 반응을 포함한다. 다양한 측면에서, 강화된 ADCC 효과기 기능은 강화된 역가(potency) 또는 강화된 효능(efficacy)을 의미할 수 있다. 실험과 관련하여 사용된 “역가”라는 용어는 EC50(반수 유효 농도(half maximal effective concentration))의 특정 치료 효과가 관찰될 때의 항체의 농도를 의미한다. 실험과 관련하여 사용된 “효능”이라는 용어는 항체의 포화 수준(saturating levels)에서 최대로 가능한 효과기 기능을 의미한다.
본 명세서에 사용된 “CDC” 또는 “보체 의존적 세포독성”은 하나 이상의 보체 단백질 성분이 표적 세포에 결합된 항체를 인식하여 표적 세포의 용해를 일으키는 반응을 포함한다.
본 명세서에 사용된, “개체(subject)”라는 용어는 여하한 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. “비인간 동물”이라는 용어는 모든 척추 동물, 예를 들어, 포유류 및 비-포유류, 예컨대, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 바람직하게는 개체는 인간이다.
세포독성제(cytotoxic agent)는 세포의 기능을 억제하거나 방해하고 그리고/또는 세포를 파괴시키는 물질을 포함한다. 이것은 방사성 동위원소(예를 들어, 131I, 125I, 90Y 및 186Re), 화학요법제 및 독소, 예컨대, 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소적 활성 독소, 또는 그 단편을 포함할 수 있다. 비-세포독성제는 세포의 기능을 억제하거나 방해하지 않고 그리고/또는 세포를 파괴시키지 않는 물질을 나타낸다. 비-세포독성제는 활성화되어 세포에 유해하게 될 수 있는 작용제를 포함할 수 있다. 비-세포독성제는 비드(bead), 리포솜, 매트릭스 또는 입자를 포함할 수 있다(예를 들어, 본 명세서의 참고문헌을 이루는, 미국 특허 공개 제2003/0028071호 및 제2003/0032995호 참조). 이러한 작용제들은 본 명세서에 기술된 항-α2β1 인테그린 항체와 접합되거나, 커플링되거나, 연결되거나 결합될 수 있다.
화학요법제는 암의 치료에 유용한 화합물을 나타낸다. 화학요법제의 예들은 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노사이드("Ara-C"), 사이클로포스파마이드, 티오테파, 탁소티어(도세탁셀), 부설판(Busulfan), 사이톡신(Cytoxin), 택솔(Taxol), 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파마이드, 미토마이신 C, 미토산트론(Mitoxantrone), 빈크레이스틴(Vincreistine), 비노렐빈(Vinorelbine), 카보플라틴, 테니포사이드(Teniposide), 다우노마이신, 카미노마이신(Carminomycin), 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신(Mitomycins), 에스페라미신(Esperamicins) (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
분리된 핵산 분자라 함은, 공급원, 예를 들어, 항체 핵산의 천연 공급원에서 그것이 일반적으로 결합되어 있는 것인, 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 동정되어 분리된 핵산 분자를 나타낸다. 분리된 핵산 분자는 그것이 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르다. 따라서 분리된 핵산 분자는 자연 세포에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나 분리된 핵산 분자는, 예를 들어, 핵산 분자가 자연 세포와 상이한 염색체 위치에 있는, 항체를 일반적으로 발현하는 세포에 포함된 핵산 분자를 포함한다.
세포, 세포주, 및 세포 배양물은 흔히 구분 없이 사용되며, 모든 이러한 명칭들은 자손을 포함한다. (예를 들어, 핵산, 벡터, 바이러스 등의 핵산전달감염(transfection), 형질전환(transformation) 또는 형질도입(transduction)에 의해 얻어진) 형질전환체 및 형질전환된 세포는 전달 횟수에 상관없이 그로부터 유래된 1차 개체 세포(primary subject cell)와 배양물을 포함한다. 모든 자손이 의도적이거나 우연한 돌연변이로 인해 DNA 콘텐츠에서 정확히 동일하지 않을 수 있는 것으로 또한 이해된다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 돌연변이 자손이 포함된다. 독특한 명칭이 의도되는 경우에, 문맥으로 보아 명백하게 될 것이다.
변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하여 구성되는 인간화 항-α2 인테그린 항체
본 발명은, 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위, 인간 경쇄 불변 부위 및 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 인간화 항-α2 인테그린 항체로서, 상기 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위가 모 인간화 항-α2 인테그린 항체의 인간 IgG1 중쇄 불변 부위에 대한 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 항체가 상기 모 인간화 항-α2 인테그린 항체에 비해 변형된 효과기 기능을 발휘하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체를 제공한다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위, 인간 경쇄 불변 부위 및 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 것으로서, 상기 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위가 인간 IgG1의 CH1, 인간 IgG1의 힌지 및 인간 IgG3의 Fc 부위를 포함하여 구성되는 동종형 변이체인, 인간화 항-α2 인테그린 항체를 제공한다.
하나의 구체예에서, 동종형 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위는 서열 번호: 35를 포함하여 구성된다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위, 인간 경쇄 불변 부위 및 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 것으로서, 상기 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위가 인간 IgG3의 CH1, 인간 IgG1의 힌지 및 인간 IgG3의 Fc 부위를 포함하여 구성되는 동종형 변이체인, 인간화 항-α2 인테그린 항체를 제공한다.
하나의 구체예에서, 동종형 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위는 서열 번호: 36을 포함하여 구성된다.
한 측면에 있어서, 본 발명은, 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위, 인간 경쇄 불변 부위 및 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 것으로서, 상기 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위가 모 인간화 항-α2 인테그린 항체의 인간 IgG Fc 부위에 대한 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 인간 IgG1 Fc 부위를 포함하여 구성되는, 인간화 항-α2 인테그린 항체를 제공한다.
하나의 구체예에서, 아미노산 변형은 269, 298, 및 324로 이루어진 군(group)으로부터 선택되는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환, 바람직하게는 아미노산 위치 298 및/또는 324에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 상기 군의 각 멤버의 아미노산 위치는 카바트(Kabat)에 기술된 넘버링 시스템을 사용하여 표시된다.
또 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 E269D, S298A, 및 S324N으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환, 바람직하게는 아미노산 치환 S298A 및/또는 S324N을 포함하고, 여기서, 상기 군의 각 멤버의 아미노산 위치는 카바트(Kabat)에 기술된 넘버링 시스템을 사용하여 표시된다.
또 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 269/298, 269/324, 298/324, 및 269/298/324, 바람직하게는 298/324, 또는 269/298/324로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 아미노산 치환들의 조합을 포함하고, 여기서, 상기 군의 각 멤버의 아미노산 위치는 카바트(Kabat)에 기술된 넘버링 시스템을 사용하여 표시된다.
또 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 E269D/S298A, E269D/S324N, S298A/S324N, 및 E269D/S298A/S324N, 바람직하게는 S298A/S324N 또는 E269D/S298A/S324N으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환들의 조합을 포함하고, 여기서, 상기 군의 각 멤버의 아미노산 위치는 카바트(Kabat)에 기술된 넘버링 시스템을 사용하여 표시된다.
하나의 구체예에서, 변이체 인간 IgG1 Fc 부위는 서열 번호: 37-43로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하여 구성된다.
변형된 효과기 기능은 일반적으로 보체 의존적 세포독성(CDC) 및/또는 C1q 결합 및/또는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 및/또는 Fc[감마] 수용체에 대한 항체의 결합 친화성, 바람직하게는 보체 의존적 세포독성(CDC) 및/또는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)이다. CDC, C1q 결합, ADCC, 및 Fc[감마] 수용체에 대한 항체의 결합 친화성은 이 분야에 공지되어 있고 상업적으로 이용 가능한 표준 시험관 내 분석에 의해 측정한다. 일반적으로 ADCC는 본 출원의 실시예 2에 기술된 젖산 탈수소효소(LDH)-방출 분석에 의해 측정하고, CDC는 본 출원의 실시예 1에 기술된 세포-기반 분석에 의해 측정한다.
바람직하게는 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 본 발명의 인간화 항-α2 인테그린 항체는 상술한 시험관 내 분석에서 모 인간화 항체에 비해 개선된 CDC를 발휘한다. 본 명세서에 사용된 “개선된 CDC의 발휘” 또는 “개선된 CDC를 발휘하는”이라는 용어는, a) 모 항체에 비해 강화된 CDC의 발휘(즉, 모 인간화 항-α2 인테그린 항체가 CDC를 이미 발휘하고, 이 CDC가 인간 IgG1 중쇄 불변 부위의 아미노산 변형에 의해 강화됨) 및 b) 모 인간화 항-α2 인테그린 항체에 비해 새로운 CDC의 발휘(즉, 모 인간화 항-α2 인테그린 항체가 CDC를 발휘하지 않으며, 따라서 CDC가 인간 IgG1 중쇄 불변 부위의 아미노산 변형에 의해 새로 도입됨)을 포함한다.
따라서 또 다른 측면에서 본 발명은, 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위, 인간 경쇄 불변 부위 및 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 인간화 항-α2 인테그린 항체로서, 상기 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위가 모 인간화 항-α2 인테그린 항체의 인간 IgG1 중쇄 불변 부위에 대한 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 항체가 상기 모 인간화 항체에 비해 개선된 보체 의존적 세포독성(CDC)을 발휘하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체를 제공한다. 모 인간화 항체에 비해 개선된 보체 의존적 세포독성(CDC)을 발휘하는 인간화 항-α2 인테그린 항체의 바람직한 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위는 S324N, S298A/S324N, 및 E269D/S298A/S324N으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하는 변이체 인간 IgG1 Fc 부위를 포함하여 구성되고, 더욱 바람직하게는 변이체 인간 IgG1 Fc 부위는 서열 번호: 39, 42 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하여 구성된다.
하나의 구체예에서, 모 인간화 항-α2 인테그린 항체에 비해 개선된 보체 의존적 세포독성(CDC)을 발휘하는 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 인간화 항-α2 인테그린 항체는 모 인간화 항체와 동등한 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 발휘한다. 모 인간화 항체와 동등한 ADCC의 발휘는, 모 인간화 항체의 ADCC의 ± 50%, 바람직하게는 ± 40%, 더욱 바람직하게는 ± 30%, 가장 바람직하게는 ± 20%, 특히 ± 10%의 ADCC를 포함한다. 모 항체로서의, IgG1 항체, 예를 들어 인간화 IgG1 항-α2 인테그린 항체는 ADCC를 발휘하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 하나의 변형, 예를 들어, IgG1 중쇄 불변 부위의 개선된 보체 의존적 세포독성(CDC)을 제공하는 아미노산 치환이 ADCC에 영향을 주는지는 단정할 수 없다. 이리하여, 개선된 CDC를 발휘하는 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 본 발명의 인간화 항-α2 인테그린 항체는 놀랍게도 모 인간화 항체와 동등한 ADCC를 발휘한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위, 인간 경쇄 불변 부위 및 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 인간화 항-α2 인테그린 항체로서, 상기 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위가 모 인간화 항-α2 인테그린 항체의 인간 IgG Fc 부위에 대한 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 인간 IgG1 Fc 부위를 포함하여 구성되고, 상기 항체가 상기 모 인간화 항체에 비해 개선된 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 발휘하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체를 제공한다. 모 인간화 항체에 비해 개선된 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 발휘하는 인간화 항-α2 인테그린 항체의 바람직한 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위는 E269D, S298A, S298A/S324N, 및 E269D/S298A/S324N으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하는 변이체 인간 IgG1 Fc 부위를 포함하여 구성되고, 더욱 바람직하게는 변이체 인간 IgG1 Fc 부위는 서열 번호: 37, 38, 42 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하여 구성된다.
또 다른 측면에서 본 발명은, 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위, 인간 경쇄 불변 부위 및 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 인간화 항-α2 인테그린 항체로서, 상기 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위가 모 인간화 항-α2 인테그린 항체의 인간 IgG Fc 부위에 대한 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 인간 IgG1 Fc 부위를 포함하여 구성되고, 상기 아미노산 변형이 아미노산 치환 S298A/S324N 또는 E269D/S298A/S324N이며, 상기 항체가 상기 모 인간화 항-α2 인테그린 항체에 비해 개선된 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 개선된 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 발휘하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체를 제공한다.
본 발명의 항체는 생쥐의 단일클론 항체 클론 BHA2.1의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위 모두의 CDR들을 포함하여 구성되었다(Hangan et al., Cancer Res. 56:3142-3149 (1996)). 항체를 구성하기에 바람직한 출발 물질은, 인간 α2 인테그린에 작용하는 기능-억제 항체이며 그 결합 및 활성이 표적 α2 인테그린 내의 온전한 I-도메인의 존재에 좌우되는, BHA2.1 하이브리도마(예를 들어, TMC-2206)에 의해 분비되는 것들과 같은 항-α2 인테그린 항체이다. α2 인테그린 분자의 비활성 형태에 결합하고 그리고/또는 리간드 유사체로 작용하지 않는 항체를 포함하는, TMC-2206 (또는 BHA2.1)의 에피토프 특이성을 가진 인간화 항체가 바람직하다. 백혈구 및 혈소판 모두에 존재하는 α2β1 인테그린과 상호작용하기는 하지만, 혈소판을 활성화시키지 않고, 활성화된 혈소판의 콜라겐에 대한 응집을 손상시키고, 출혈에 최소한의 영향을 주거나 전혀 영향을 주지 않고 그리고/또는 생체 내 치료 용량을 포함하는 투여 농도에서 출혈 합병증과 관련되지 않은, TMC-2206(또는 BHA2.1)의 에피토프 특이성을 가진 인간화 항체가 바람직하다.
따라서, 아미노산 서열 GFSLTNYGIH(서열 번호:1)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 VIWARGFTNYNSALMS(서열 번호:2)을 포함하는 HCDR2 및 아미노산 서열 ANDGVYYAMDY(서열 번호:3)을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 부위를 포함하여 구성되는 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체가 또한 제공된다.
아미노산 서열 SAQSSVNYIH(서열 번호:4)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 DTSKLAS(서열 번호:5)을 포함하는 LCDR2 및 아미노산 서열 QQWTTNPLT(서열 번호:6)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하여 구성되는 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체가 또한 제공된다.
아미노산 서열 GFSLTNYGIH(서열 번호:1)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 VIWARGFTNYNSALMS(서열 번호:2)을 포함하는 HCDR2 및 아미노산 서열 ANDGVYYAMDY(서열 번호:3)을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 부위; 및/또는 아미노산 서열 SAQSSVNYIH(서열 번호:4)를 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 DTSKLAS(서열 번호:5)를 포함하는 LCDR2 및 아미노산 서열 QQWTTNPLT(서열 번호:6)를 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하여 구성되는 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체가 또한 제공된다.
하나의 구체예에서, 상기 중쇄 가변 부위는 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하여 구성된다.
하나의 구체예에서, 상기 중쇄 가변 부위는 (a) 위치 71이 라이신(Lys)이고, (b) 위치 73이 아스파라긴(Asn)이며, (c) 위치 78이 발린(Val)이거나, (d) (a)-(c)의 임의의 조합인, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하여 구성된다.
하나의 구체예에서, 상기 중쇄 가변 부위는 서열 번호:8-19로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 구성된다.
하나의 구체예에서, 상기 중쇄 가변 부위는 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하여 구성된다.
하나의 구체예에서, 상기 중쇄 가변 부위는 아미노산 서열 WGQGTLVTVSS(서열 번호:20)을 포함하는 FW4 부위를 더 포함하여 구성된다.
하나의 구체예에서, 상기 경쇄 가변 부위는 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하여 구성된다.
하나의 구체예에서, 상기 경쇄 가변 부위는, (a) 위치 2가 페닐알라닌(Phe)이고, (b) 위치 45가 라이신(Lys)이며, (c) 위치 48이 티로신(Tyr)이거나, (d) (a)-(c)의 임의의 조합인, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하여 구성된다.
하나의 구체예에서, 상기 경쇄 가변 부위는 서열 번호: 22-33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 구성된다.
하나의 구체예에서, 상기 경쇄 가변 부위는 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하여 구성된다.
하나의 구체예에서, 상기 경쇄 가변 부위는 아미노산 서열 FGQGTKVEIK(서열 번호: 34)을 포함하는 FW4 부위를 더 포함하여 구성된다.
상기 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 부위들 및 인간 경쇄 불변 부위를 포함하여 구성되는 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체가 또한 제공된다.
따라서, 다른 구체예에서, 항-α2 인테그린 항체는 서열 번호: 47을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 56을 포함하는 경쇄를 포함하여 구성된다.
다른 구체예에서, 항-α2 인테그린 항체는 서열 번호: 48을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 56을 포함하는 경쇄를 포함하여 구성된다.
다른 구체예에서, 항-α2 인테그린 항체는 서열 번호: 49-55로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 서열 번호: 56을 포함하는 경쇄를 포함하여 구성된다.
모 항체의 아미노산 위치 324의 세린을 아스파라긴으로 대체한 아미노산 치환 S324N을 포함하는 변이체 인간 IgG Fc 부위를 포함하여 구성되는 것으로서, 개선된 보체 의존적 세포독성(CDC)을 발휘하는 항체가 또한 제공된다.
모 항체의 아미노산 위치 324의 세린을 아스파라긴으로 대체한 아미노산 치환 S324N을 포함하는 변이체 인간 IgG Fc 부위를 포함하여 구성되는 것으로서, 모 항체에 비해 개선된 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 개선된 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 발휘하는 항체가 또한 제공된다. 항체는 모 항체의 아미노산 위치 269의 글루타메이트를 아스파르테이트로 대체한 아미노산 치환 E269D 및/또는 모 항체의 아미노산 위치 298의 세린을 알라닌으로 대체한 치환 S298A을 더 포함하여 구성될 수 있다. 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전한 인간 항체(fully human antibody)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 항체는 바람직하게는 인간화 항체, 더욱 바람직하게는 인간화 항-α2 인테그린 항체이다.
하나의 구체예에서, 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체는 인간 α2 인테그린의 I 도메인을 인식한다.
하나의 구체예에서, 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체는 α2β1 인테그린에 결합한다.
하나의 구체예에서, 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체는 α2 또는 α2β1 인테그린의 α2β1 인테그린 리간드에 대한 결합을 억제한다. 일반적으로 α2β1 인테그린 리간드는 콜라겐, 라미닌, 에코바이러스-1, 데코린, E-카드헤린, 매트릭스 메탈로프로테이나제 I(MMP-I), 엔도레펠린, 콜렉틴 및 C1q 보체 단백질로부터 선택되고, 바람직하게는 콜라겐이다.
상기 인간화 항-α2 인테그린 항체를 암호화하는 분리된 핵산, 상기 핵산을 포함하여 구성되는 벡터, 및 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하여 구성되는 숙주 세포가 또한 제공된다.
상기 인간화 항-α2 인테그린 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하여 구성되는 조성물이 또한 제공된다.
치료적 유효량의 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체 또는 상기 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체의 α2β1 인테그린-관련 장애를 치료하는 방법이 또한 제공된다. α2β1 인테그린-관련 장애는, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 비정상적이거나 증가된 혈관신생을 특징으로 하는 질환, 특히 염증성 장 질환, 크론 병, 궤양성 대장염, 이식에 대한 반응, 시신경염, 척수 손상, 류머티즘성 관절염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 당뇨병, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 실험성 자가면역 뇌척수염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 유년 발병형 당뇨병, 당뇨 망막병증, 노화성 황반 변성, 심장혈관 질환, 건선, 암 그리고 염증성 반응을 유발하는 감염, 더욱 구체적으로, 다발성 경화증, 류머티즘성 관절염, 시신경염 및 척수 손상을 포함한다.
상기 인간화 항-α2 인테그린 항체 또는 상기 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은, 편평 세포 암, 폐암, 예컨대, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 폐의 선암, 및 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위암, 예컨대, 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 종류의 두경부암, 그리고 B-세포 림프종, 예컨대, 낮은 등급/소포성 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma: NHL); 소림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포성 NHL; 중간 등급 미만성(diffuse) NHL; 높은 등급 면역아세포 NHL; 높은 등급 림프아구성 NHL; 높은 등급 소 비균열 세포 NHL; 큰 종양(bulky disease) NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia); 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL); 급성 림프아구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia: ALL); 모발상 세포 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 및 장기 이식 후 림프증식성 질환(post-transplant lymphoproliferative disorder: PTLD), 그리고 모반증과 관련된 비정상적 혈관 증식, 뇌종양과 관련된 것과 같은 부종, 메이그스 증후군, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 섬유육종, 골육종 및 표피양 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 명세서에 기술된 항-α2 인테그린 항체를 사용하여 바람직하게 치료되는 암은 유방암, 결장직장암, 직장암, 비-소세포 폐암, 비호지킨 림프종(NHL), 신세포 암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연부-조직 육종, 카포시 육종, 유암종(carcinoid carcinoma), 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 치료를 받을 수 있는 암성 질환(cancerous conditions)은 전이암들을 포함한다. 따라서 더욱 바람직한 것은 유방암, 결장직장암, 직장암, 비-소세포 폐암, 비호지킨 림프종(NHL), 신세포 암, 전립선암, 전이된 전립선암, 간암, 췌장암, 연부-조직 육종, 카포시 육종, 유암종, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 다발성 골수종, 전이된 결장직장암 및 전이된 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다. 특히 바람직한 것은 비-소세포 폐암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 전립선암, 전이된 전립선암, 중피종, 섬유육종, 골육종, 표피양 암종, 전이된 결장직장암, 전이된 전립선암 및 전이된 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다. 더욱 특별히 바람직한 것은 비-소세포 폐암, 췌장암, 교모세포종, 간암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 전립선암, 중피종, 섬유육종, 전이된 결장직장암, 전이된 전립선암 및 전이된 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다. 더욱 더 특별히 바람직한 것은 췌장암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 비-소세포 폐암, 섬유육종, 전이된 결장직장암, 전립선암, 전이된 전립선암 및 전이된 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다. 가장 특별히 바람직한 것은 췌장암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 비-소세포 폐암 및 섬유육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다. 가장 바람직한 것은 췌장암, 유방암 또는 전이된 유방암이며, 췌장암이 특히 바람직하다. 마찬가지로 가장 특히 바람직한 것은 전립선암 또는 전이된 전립선암이다. 본 명세서에 언급된 “유방암”은 유방 선암을 포함한다. 본 발명의 방법은 혈관이 분포된 종양(vascularized tumors)의 치료에 특히 적합하다.
바람직하게는 본 발명의 방법은 (a) 혈소판 활성화, (b) 혈소판 응집, (c) 순환 혈소판 총수(circulating platelet count)의 감소, (d) 출혈 합병증, 또는 (e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합과 관련되지 않는다.
백혈구의 콜라겐에 대한 결합을 억제하는데 효과적인 양의 상기 인간화 항-α2 인테그린 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 콜라겐에 대한 백혈구 결합을 억제하기 위한 방법이 또한 제공된다.
상기 인간화 항-α2 인테그린 항체 또는 상기 조성물 및 α2β1 인테그린-관련 장애의 치료를 위한 설명서를 포함하여 구성되는 키트가 또한 제공된다.
인간화 항-α2 인테그린 항체 및 접합체의 구성
경쇄 가변 부위를 위한 인간 수용체 분자가 생쥐 항체의 경쇄 가변 부위와 잠재적 수용체 분자 가변 부위들 사이의 상동성을 고려하여 선택되는, 항체가 구성될 수 있다. 잠재적인 면역원성을 감소시키는 위해서 배선 후보 인간 수용체 분자가 바람직하다. 배선 데이터베이스는 중쇄 FW3 부위의 끝을 통과하여 부분적으로 CDR3 서열까지 판독하는 항체 서열들로 구성된다. FW4 부위의 선택에 있어서, 선택된 배선 분자로부터 유래된 성숙한 항체 서열의 데이터베이스를 검색하는 것이 바람직하며, 재조합 항체 분자에 사용하기에 알맞게 상동적인(homologous) FW4 부위를 선택하는 것이 또한 바람직하다. 인간 수용체 분자는, 바람직하게는 생쥐 공여체 분자(murine donor molecule)와 동일한 경쇄 클래스로부터 선택되며, 생쥐 공여체 분자의 가변 부위의 동일한 표준 구조 클래스(canonical structural class)의 것이다. 경쇄 가변 부위를 위한 인간 수용체 분자의 선택에 있어서 두 번째 고려사항은 생쥐 공여체 분자와 인간 수용체 분자 사이의 CDR 길이에 있어서의 상동성을 포함한다. 인간 수용체 항체 분자는 바람직하게는 V-BASE 데이터베이스에 대한 상동성 검색에 의해 선택되며, 카바트(Kabat) 및 공공 NCBI 데이터베이스와 같은 다른 데이터베이스도 이용할 수 있다. TMC-2206과 동일하거나 유사한 에피토프 특이성(epitope specificity) 및/또는 기능성을 가진 인간화 항-α2 인테그린 항체에 있어서, 바람직한 경쇄 인간 수용체 분자는 FW 1-3 부위의 경우에 배선 항체 서열 A14이고, 성숙한 카파 1 경쇄들(예를 들어, 경쇄 서열 AAB24132(NCBI entry gi/259596/gb/AAB24132))의 공통 FW-4를 나타내는 FW4(서열 번호:34)의 경우에 서열 FGQGTKVEIK이다.
중쇄 가변 부위를 위한 인간 수용체 분자가 생쥐 항체의 중쇄 가변 부위와 잠재적 수용체 분자 가변 부위들 사이의 상동성을 고려하여 선택되는, 항체가 구성될 수 있다. 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해서 배선 후보 인간 수용체 분자가 바람직하다. 배선 후보 인간 수용체 분자는 잠재적 항원성을 감소시키는 것이 바람직하다. 배선 데이터베이스는 중쇄 FW3 부위의 끝을 통과하여 부분적으로 CDR3 서열까지 판독하는 항체 서열들로 구성된다. FW4 부위의 선택에 있어서, 선택된 배선 분자로부터 유래된 성숙한 항체 서열의 데이터베이스를 검색하는 것이 바람직하며, 재조합 항체 분자에 사용하기에 알맞게 상동적인FW4 부위를 선택하는 것이 또한 바람직하다. 인간 수용체 분자는, 바람직하게는 생쥐 공여체 분자와 동일한 중쇄 클래스로부터 선택되며, 생쥐 공여체 분자의 가변 부위의 동일한 표준 구조 클래스의 것이다. 중쇄 가변 부위를 위한 인간 수용체 분자의 선택에 있어서 두 번째 고려사항은 생쥐 공여체 분자와 인간 수용체 분자 사이의 CDR 길이에 있어서의 상동성을 포함한다. 인간 수용체 항체 분자는, 카바트(Kabat) 및 공공 NCBI 데이터베이스와 같은 다른 데이터베이스도 이용할 수 있지만, V-BASE 데이터베이스에 대한 상동성 검색에 의해 선택하는 것이 바람직하다. TMC-2206과 동일하거나 유사한 에피토프 특이성 및/또는 기능성을 가진 항-α2 인테그린 항체에 있어서, 바람직한 중쇄 수용체 분자는 FW 1-3 부위의 경우에 배선 항체 서열 4-59이고, FW 4 부위(서열 번호:20)의 경우에 4-59 배선 서열로부터 유래된 성숙한 항체인, 항체 CAA48104.1(NCBI entry, gi/33583/emb/CAA48104.1)이다.
단일클론 항체는 Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)에 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 만들 수 있거나 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제6,204,023호)에 의해 만들 수 있다. 단일클론 항체는 또한 미국 특허 제6,025,155호 및 제6,077,677호 그리고 미국 특허 출원 공개 제2002/0160970 호 및 제2003/0083293 호에 기술된 기술을 사용하여 만들 수 있다(예를 들어, Lindenbaum, et al., Nucleic Acids Research 32 (21):0177 (2004)를 또한 참조).
인간화 항-α2β1 인테그린 항체의 아미노산 서열 변이체는 인간화 항-α2β1 인테그린 항체 DNA에 적절한 뉴클레오타이드 변화를 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변이체는, 예를 들어, 본 발명의 항-α2 인테그린 항체에 대해 제시된 아미노산 서열내의 잔기들의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구성체가 바람직한 특성을 가진다면, 최종 구성체에 도달하기 위해 아미노산 결실, 삽입 및 치환의 어떤 조합이든 이루어진다. 당화 자리(glycosylation sites)의 수 또는 위치의 변화와 같은, 아미노산 변화가 또한 인간화 항-α2 인테그린 항체의 해독 후 프로세스를 바꿀 수 있다.
항체를 인간형으로 또는 인간-유사형으로(예를 들어, “인간화”) 만들기 위해 사용되는 많은 방법들이 있다. 항체를 인간화하는 접근법은 수년간에 걸쳐 변화하여 왔다. 이러한 하나의 접근법은 인간 불변 부위에 융합된 생쥐의 가변 부위, 소위 쥐과-인간 Fc 키메라를 생성시키는 것이었다(예를 들어, Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); 미국 특허 제5,807,715호 참조). 또 다른 접근법은 CDR들이 그들의 과가변 특성(Kabat et al, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977), Kabat, Adv. Protein Chem. 32:1-75 (1978)) 및 표준 구조(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196(4):901-17 (1987); Lazakani et al., J. Mol. Biol. 272:929 (1997))를 토대로 하여 쉽게 동정될 수 있고, 예를 들어, Jones et al., Nature 321(6069):522-5 (1986)에 기술된 바와 같이, 비-인간 CDR 부위(공여체 CDR이라 함)를 인간 골격(수용체 골격(acceptor frameworks)이라 함)에 이식함으로써 인간화될 수 있다는 사실을 이용하였다(예를 들어, 미국 특허 제5,225,539호; 미국 특허 제6,548,640호 참조). 여섯 CDR 루프들이 무리를 이루어 제공되며, 결정구조 분석을 기반으로 하여, CDR의 측면에 있는 소위 “버니어(Vernier)” 구역 내 또는 중쇄-경쇄 경계면(interface)에 있는 주요 골격 잔기들을 쉽게 동정할 수 있다(예를 들어, Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196(4):901-17 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 186(3):651-63 (1985); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (1989) 참조). 이러한 잔기는 여섯 CDR의 올바른 상대적 배향성을 회복하기 위해 생쥐의 잔기로 역-돌연변이가 일어날 수 있다(예를 들어, Verhoyen et al., Science 239(4847):1534-6 (1988); Reichman et al., Nature 332(6162):323-7 (1988); Tempest et al., Biotechnology (NY) 9(3):266-71 (1991) 참조). 가변 부위들이 생쥐와 인간 사이에 비교적 높은 상동성을 가진 패밀리들로 분류될 수 있기 때문에(예를 들어, Pascual and Capra Adv. Immunol. 49:1-74 (1991)에서 검토됨), 이러한 초기 연구들은 또한 인간 수용체 분자로서 사용하기 위해 관심있는 생쥐 항체에 대해 가장 높은 상동성을 가진 인간 배선 서열을 선택함으로써 이식된 항체에서 친화성 손실 가능성이 최소화될 수 있음을 보여주었다(예를 들어, 미국 특허 제5,225,539호; Verhoyen et al., Science 239(4847):1534-6 (1988) 참조).
비-인간 α2 인테그린 항체를 인간화하기 위한 방법들이 예를 들어 국제특허공개 WO2007/056858에 기술되어 있다. 항-α2 인테그린 항체를 인간화하기 위해, 예를 들어, 면역법으로부터의 제조에 의해 또는 상업적으로 입수가능한 항체의 구입에 의해, 비인간 항체 출발 물질을 얻는다. 예를 들어, TMC-2206을 인간화하기 위해, 본 발명에 사용된 항체를 인간화하기 위한 예시적인 기술이 국제특허공개 WO2007/056858에 기술되어 있다.
항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적 변형(modifications)은, (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 형상과 같은, 치환 영역의 폴리펩타이드 백본(backbone)의 구조, (b) 표적 자리에 있는 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄(side chain)의 크기(bulk)를 유지하는데 미치는 그들의 영향이 현저히 상이한, 치환들을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생적 잔기들은 공통 측쇄 특성을 토대로 다음과 같은 군들로 나누어진다: (1) 소수성: 노르루신(norleucine), 메티오닌(met), 알라닌(ala), 발린(val), 루신(leu), 이소루신(ile); (2) 중성 친수성: 시스테인(cys), 세린(ser), 트레오닌(thr); (3) 산성: 아스파르트산(asp), 글루탐산(glu); (4) 염기성: 아스파라긴(asn), 글루타민(gln), 히스티딘(his), 라이신(lys), 아르기닌(arg); (5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: 글리신(gly), 프롤린(pro); 및 (6) 방향족: 트립토판(trp), 티로신(tyr), 페닐알라닌(phe). 인간화 항-α2 인테그린 항체의 바람직한 확립을 유지하는데 관여하지 않는 시스테인 잔기도, 일반적으로 세린으로, 치환되어 분자의 산화 안정성을 향상시키고 비정상적인 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 항체에 추가되어 그것의 안정성을 향상시킬 수 있다(특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
항체의 아미노산 변이체의 또 다른 종류는 항체의 본래의 당화(glycosylation) 패턴을 변경한다. 변경(altering)이라 함은 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 제거하는 것 그리고/또는 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 당화 자리를 추가하는 것을 의미한다.
항체의 당화는 일반적으로 N-연결(N-linked)이거나 O-연결(O-linked)이다. N-연결이라 함은 탄수화물 모이어티의 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 부착을 나타낸다. 트라이펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티의 아스파라긴 측쇄에 대한 효소적 부착을 위한 인식 서열(recognition sequence)이다. 따라서, 폴리펩타이드에서 이러한 트라이펩타이드 서열들 중의 어느 하나의 존재는 잠재적 당화 자리를 만들어낸다. O-연결 당화는, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신도 사용될 수 있지만, 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 대한, 하나의 당류, N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 또는 자일로오스의 부착을 나타낸다.
항체에 대한 당화 자리의 추가 또는 제거는 아미노산 서열을 (N-연결 당화 자리에 대한) 하나 이상의 상술한 트라이펩타이드 서열을 포함하거나 결여하도록 변경함으로써 편리하게 수행된다. 변경은 또한 원 항체(original antibody)의 (O-연결 당화 자리) 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 치환 또는 결실에 의해 이루어질 수 있다. 인간화 항-α2 인테그린 항체의 핵산 분자 암호화 아미노산 서열 변이체는 이 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법은, 천연 공급원으로부터의 분리(자연 발생적 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 인간화 항-α2 인테그린 항체의 이전에 제조된 변이체 또는 비-변이체 형의 올리고뉴클레오타이드-매개성(또는 자리-지향성(site-directed)) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 또는 카세트(cassette) 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일반적으로, 인간화 항-α2 인테그린 항체의 아미노산 서열 변이체는, 중쇄 또는 경쇄의 어느 하나의 원 인간화 항체 아미노산 서열(예를 들어, 각각 서열 번호:17 또는 서열 번호:30에서와 같은 가변 부위 서열)과 적어도 75% 아미노산 서열 동일성(identity), 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95%(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 100%를 포함함)의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가질 것이다. 본 명세서에서, 이 서열에 대한 동일성 또는 상동성은, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요하다면, 서열을 정렬시키고 갭(gaps)을 도입한 후에, 그리고 (상술한 바와 같은) 보존적 치환을 서열 동일성의 일환으로 고려하지 않은, 인간화 항-α2 인테그린 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율(percentage)로서 정의된다. N-말단, C-말단, 또는 항체 서열에 대한 내부 연장(internal extensions), 결실 또는 삽입의 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않아야 한다. 따라서 서열 동일성은 두 폴리펩타이드의 아미노산의 위치의 유사성을 비교하기 위해 일반적으로 사용되는 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 두 폴리펩타이드를 (일측 또는 양측 폴리펩타이드의 서열의 전장을 따라, 또는 일측 또는 양측 폴리펩타이드의 서열의 미리 정해진 부분을 따라) 그들 각각의 아미노산들의 최적 매칭을 위해 정렬시킨다. 이 프로그램들은 디폴트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디폴트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며, PAM250(표준 스코어링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3 (1978) 참조)과 같은 스코어링 매트릭스가 이 컴퓨터 프로그램과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 동일성 퍼센트는, 동일한 매치들(matches)의 총수에 100을 곱한 다음에, 매칭된 범위(matched span) 내의 더 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬시키기 위해 더 긴 서열에 도입된 갭들의 수의 합으로 나누어줌으로써 계산될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 적어도 두 개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가진 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 인간화 항-α2 인테그린 항체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. (예를 들어, 두 개의 상이한 결합 아암(binding arms)을 가진) 전형적인 이중특이성 항체가 α2β1 인테그린 단백질의 두 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이와 달리, 항-α2 인테그린 아암은 세포 방어 메커니즘을 그 표면에 α2β1 인테그린이 결합된 세포에 집중시키기 위해 백혈구, 예컨대, T-세포 수용체 분자(예를 들어, CD2 또는 CD3), 또는 IgG를 위한 Fc 수용체(FcγR), 예컨대, FcγR1(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16) 상의 유발 분자(triggering molecule)에 결합된 아암과 결합할 수 있다. 이중특이성 항체는 세포독성제를 그 표면에 α2β1 인테그린이 결합된 세포에 국한시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 항체는 α2β1 인테그린 결합 아암 및 세포독성제(예를 들어, 겔로닌(gelonin), 사포린(saporin), 항-인터페론 알파, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 리신 A 사슬(ricin A chain), 또는 방사성동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 가진다.
이중특이성 항체를 만들기 위한 또 다른 접근법에 의하면, 한 쌍의 항체 분자들 사이의 경계면을 재조합 세포 배양물로부터 회수된 헤테로다이머의 비율을 최대화하기 위해 조작할 수 있다. 바람직한 경계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 한 부분을 포함하여 구성된다. 이 방법에서, 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄들을 더 작은 것들(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)와 동일하거나 더 작은 크기의 보상 캐비티들(compensatory cavities)이 제2 항체의 경계면에 만들어진다. 이것은 헤테로다이머의 수율을 호모다이머와 같은 다른 원치 않는 최종 산물보다 증가시키기 위한 메커니즘을 제공한다(예를 들어, 국제특허공개 WO96/27011 참조).
이중특이성 항체는 가교 또는 헤테로접합체(heteroconjugate) 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로접합체에서 항체들 중의 하나가 아비딘에 결합되고, 다른 하나가 바이오틴에 결합될 수 있다. 헤테로접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 만들 수 있다. 많은 가교 기술과 함께, 적합한 가교제가 이 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
2 보다 큰 결합가(valencies)를 가진 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이성 항체가 제조될 수 있다(예를 들어, Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991) 참조).
면역접합체(immunoconjugates)는 작용제의 α2 인테그린-발현 세포, 조직 또는 기관에 대한 표적화를 위해, 모이어티, 예를 들어, 분자, 조성물, 복합물, 또는 작용제, 예를 들어, 세포독성제, 예컨대, 화학요법제, 독소(예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소적 활성 독소, 또는 그 단편), 또는 방사성 동위원소(예를 들어, 방사성접합체(radioconjugate))에 접합된 인간화 항-α2 인테그린 항체를 포함하여 구성된다. 이러한 면역접합체는 α2 또는 α2β1 인테그린의 존재를 특징으로 하는 작용의 특정 자리에 대한 모이어티 또는 작용제의 표적화 방법에 사용될 수 있다.
이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제가 위에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (Pseudomonas aeruginosa의) 외독소 A 사슬, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신(alpha-sarcin), 유동 나무(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴(dianthin) 단백질, 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 커신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(neomycin) 또는 트라이코테센(tricothecenes)을 포함한다. 다양한 방사성 핵종을 방사성접합된 항-알파 2 인테그린 항체의 제조를 위해 사용할 수 있다. 그 예들은 212 Bi, 131In, 90Y 또는 186Re를 포함한다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올레인(IT), 이미도에스터의 이관능성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스터(예컨대, 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대, 글루터알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트 (예컨대, 톨릴렌 2,6-다이아이소시아네이트), 또는 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용하여 만든다. 예를 들어, 리신 면역독소(ricin immunotoxin)는 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지 1-아이소티오시아나토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성 핵종의 항체에 대한 접합을 위한 전형적인 킬레이팅제이다(예를 들어, 국제특허공개 WO94/11026 참조).
또 다른 구체예에서, 항체는 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음에, 제거제(clearing agent)를 사용하여 순환계로부터 미결합 접합체를 제거한 후, 세포독성제(예를 들어, 방사성-핵종)와 같은 작용제에 접합된 리간드(예를 들어, 아비딘)를 투여하는, α2 인테그린-발현 세포, 조직 또는 기관의 추적(pretargeting)에 사용하기 위한 수용체(예컨대, 스트렙타비딘(streptavidin))에 접합될 수 있다.
본 명세서에 개시된 항-α2 인테그린 항체는 또한 면역리포솜으로서 제조될 수 있다. 항체를 함유하는 리포솜은 Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기술된 것과 같은 이 분야에 공지된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증가된 리포솜이 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
인간화 항-α2 인테그린 항체는 또한 전구약물(예를 들어, 펩타이딜 화학요법제, 예를 들어, 국제특허공개 WO81/01145 참조)을 활성 약물(예를 들어, 국제특허공개 WO88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호 참조)로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 항체를 접합시킴으로써 항체 지향성 효소 전구약물 치료법(Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy: ADEPT)에 사용할 수 있다.
효소는 위에 논의된 헤테로 이관능성 가교 시약의 사용을 포함하는, 이 분야에 잘 알려져 있는 기술에 의해 항-α2 인테그린 항체에 공유 결합될 수 있다. 이와 달리, 효소의 적어도 하나의 기능적 활성부에 연결된 항-α2 인테그린 항체의 항원 결합 부위를 적어도 포함하여 구성되는 융합 단백질을 이 분야에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술을 사용하여 만들 수 있다(예를 들어, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984) 참조).
인간화 항-α2 인테그린 항체의 공유 변형(covalent modifications)은 예를 들어, 항체의 화학적 합성에 의해 또는 효소적 또는 화학적 분해에 의해 이루어질 수 있다. 항체의 공유 변형의 다른 종류는 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제(derivatizing agent)와 반응시킴으로써 분자에 도입된다. 예를 들어, 가장 일반적으로 사용되는 시스테이닐 잔기는 α-할로아세테이트(및 상응하는 아민), 예컨대, 클로로아세트산 또는 클로로아세트아마이드와 반응하여 카복시메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체들을 만든다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트라이플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미다졸릴)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 다이설피드, 메틸 2-피리딜 다이설피드, p-클로로머큐리벤조산, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-다이아졸과의 반응에 의해 유도체화된다. 예를 들어, 히스티딜 잔기는, pH 5.5-7.0에서 다이에틸피로카보네이트와의 반응에 의해 유도체화된다(이 작용제가 히스티딜 측쇄에 비교적 특이적이기 때문임). 파라-브로모페나실 브로마이드도 또한 유용하며; 반응은 바람직하게는 pH 6.0에서 0.1M 카코딜산나트륨에서 수행된다. 예를 들어, 라이시닐(Lysinyl) 및 아미노-말단 잔기들은, 숙신산 또는 다른 카복실산 무수물들과 반응된다. 이 작용제들과의 유도체화는 라이시닐 잔기의 전하를 반전시키는 효과를 가진다. α-아미노-함유 잔기를 유도체화하기에 적합한 다른 시약은 이미도에스터, 예컨대, 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트라이니트로벤젠설폰산, O-메틸아이소우레아, 2,4-펜탄다이온, 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제-촉매 반응을 포함한다. 예를 들어, 아르기닐 잔기는, 페닐글리옥살, 2,3-부탄다이온, 1,2-사이클로헥산다이온, 및 닌하이드린 중의 하나 또는 몇몇 통상적인 시약과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 작용기의 높은 pKa 때문에 반응이 알칼리성 조건에서 수행되는 것을 필요로 한다. 또한, 이러한 시약은 라이신의 기들뿐 아니라 아르기닌 엡실론-아미노 기와 반응할 수 있다. 예를 들어, 티로실 잔기는, 방향족 다이아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의해 티로실 잔기에 스펙트럼 표지를(spectral labels)를 도입하는데 특별한 관심을 두고 특이적으로 변형된다. 가장 일반적으로, N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄이 각각 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 만들기 위해 사용된다. 티로실 잔기는 방사 면역 분석용 표지된 단백질을 만들기 위해 125I 또는 131I를 사용하여 요오드화된다. 카복실 측쇄 기, 예컨대, 아스파틸 또는 글루타밀은, 카보다이이미드(R-N=C=N-R')와의 반응에 의해 선택적으로 변형되는데, 여기서, R 및 R'는 상이한 알킬 기, 예컨대, 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸) 카보다이이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-다이메틸펜틸) 카보다이이미드다. 또한, 아스파틸 및 글루타밀 잔기들은 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기들로 전환된다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기들은 흔히 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기들로 탈아미드화된다. 이러한 잔기들은 중성 또는 염기성 조건 하에서 탈아미드화된다. 이러한 잔기들의 탈아미드화된 형태는 본 발명의 범위 내에 속한다. 다른 변형은 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카복실 기의 아마이드화를 포함한다.
또 다른 종류의 공유 변형은 항체에 화학적 또는 효소적 커플링된 글리코사이드를 포함한다. 이러한 과정은 N- 또는 O-연결 당화를 위한 당화 능력을 가진 숙주 세포에서 항체를 제조할 필요가 없다는 이점이 있다. 사용된 커플링 방식에 따라, 당(류)가 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실 기, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 설프하이드릴 기, (d) 세린, 트레오닌, 또는 하이드록시프롤린의 것과 같은 유리 하이드록실 기, (e) 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아마이드 기에 부착될 수 있다(예를 들어, 국제특허공개 WO87/05330; Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981) 참조).
항체에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 예를 들어, 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 화학적 탈당화는 항체의 트라이플루오로메탄설폰산 화합물, 또는 동종 화합물에 대한 노출을 필요로 한다. 이러한 처리는 항체를 온전하게 유지하면서, 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당류를 분해시킨다(예를 들어, Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987); Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981) 참조). 항체의 탄수화물 모이어티의 효소적 분해는 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 이루어질 수 있다(예를 들어, Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987) 참조).
항체의 또 다른 종류의 공유 변형은 항체를 다양한 비단백질성 폴리머, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 연결하는 것을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호 참조).
인간화 항-α2 인테그린 항체를 암호화하는 분리된 핵산(들)과 함께, 핵산을 포함하여 구성되는 벡터 및 숙주 세포, 그리고 항체의 제조를 위한 재조합 기술이 본 명세서에 기술되어 있다. 항체의 재조합 제조의 경우에, 항체를 암호화하는 핵산(들)이 분리되어 추가적인 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터에 삽입된다. 항체를 암호화하는 DNA는 쉽게 분리되어 통상적인 과정을 사용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용하여) 배열이 결정된다. 많은 벡터들이 사용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제의 기점(origin), 하나 이상의 표지 유전자(marker genes), 인핸서 요소(enhancer element), 프로모터, 및 전사 종결 서열 중의 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
항-α2 인테그린 항체는, 바람직하게는 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적 분열 부위(specific cleavage site)를 가진 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드인, 이종성 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 포함하여, 재조합적으로 만들어질 수 있다. 선택된 이종성 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되어 프로세싱된(예를 들어, 신호 펩티다제에 의해 분열된) 서열이다. 진핵 생물 신호 서열(예를 들어, 면역글로불린 신호 서열)을 인식하여 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우에, 신호 서열은 예를 들어, 펙테이트 리사제(pectate lysase)(예컨대, pelB), 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 내열성 장독소 II 리더를 포함하는 원핵 생물 신호 서열로 치환된다. 이스트 분비의 경우에, 예를 들어, 이스트 인버타제 리더, (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더들을 포함하는) 인자 리더(factor leader), 또는 산 포스파타제 리더, C. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 국제특허공개 WO90/13646에 기술된 신호를 포함하는, 이스트 신호 서열이 사용될 수 있다. 포유류의 세포 발현에서, 포유류의 신호 서열뿐 아니라 바이러스 분비성 리더, 예를 들어, 단순 포진 gD 신호가 유용하며, 활용될 수 있다. 이러한 전구체 부위(예를 들어, 신호 서열)의 DNA는 판독 틀에서 항-α2 인테그린 항체를 암호화하는 DNA에 결찰된다.
발현 벡터와 클로닝 벡터는 모두 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 이 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 관계없이 복제할 수 있게 하는 서열이며, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 이스트, 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 예를 들어, 플라스미드 pBR322의 복제 기점은 대부분의 그램-음성박테리아에 적합하고, 2 μ 플라스미드 복제 기점은 이스트에 적합하며, 다양한 바이러스성 기점(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)이 포유류 세포의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 포유류의 발현 벡터에는 복제 성분의 기점이 필요하지 않다(예를 들어, SV40 기점은 그것이 초기 프로모터를 포함하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있는 것이다).
발현 벡터와 클로닝 벡터는 선택 표지(selectable marker)로도 불리우는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 일반적인 선택 유전자는 (a) 항생 물질 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하고, (b) 영양 요구성 결핍(auxotrophic deficiencies)을 보충하고, 또는 (c) 복합 배지(complex media)로부터 입수할 수 없는 주요 영양물을 공급하는, 단백질을 암호화한다(예를 들어, 바실리(Bacilli)의 D-알라닌 라세미화효소를 암호화하는 유전자).
선택 스킴(selection scheme)의 하나의 예는 숙주 세포의 성장을 억제하기 위해 약물을 사용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 저항성을 부여하고 그에 따라 선택 레짐(selection regimen)을 극복하는 단백질을 만든다. 이러한 우성 선택(dominant selection)의 예들은 약물 메토트렉세이트, 네오마이신, 히스티디놀(histidinol), 퓨로마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.
포유류 세포에 적합한 선택 표지의 또 다른 예는, DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등과 같은, 항-α2 인테그린 항체 핵산에 적격인 세포의 동정을 가능케 하는 것들이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 포함하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 동정된다. 야생형 DHFR을 사용하는 경우에 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포주다.
이와 달리, 항-α2 인테그린 항체를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주 세포(특히 내생적 DHFR을 포함하는 야생형 숙주), 야생형 DHFR 단백질, 및 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)와 같은 또 다른 선택 표지는, 아미노글리코사이드 항생 물질, 예컨대, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418을 포함하는, 선택 표지를 위한 선택제(selection agent)를 함유한 배지에서의 세포 성장에서 선택될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,965,199호 참조).
이스트에 사용하기에 적합한 선택 유전자 중의 하나는 이스트 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다(Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판 부재시의에서 성장 능력이 부족한 이스트의 돌연변이 균주(예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1)를 위한 선택 표지를 제공한다(예를 들어, Jones, Genetics, 85: 12 (1977) 참조). 이스트 숙주 세포 게놈에 trp1 병변이 존재하면, 트립토판 부재 시의 성장에 의한 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다. 마찬가지로, Leu2-결핍 이스트 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)은 Leu2 유전자를 가진 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
또한, 1.6μ 원형 플라스미드 pKD1으로부터 유래된 벡터는 클루베로마이세스 (Kluyveromyces) 이스트의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 이와 달리, 재조합 칼프 키모신(calf chymosin)의 대규모 생산을 위한 발현 시스템이 K. 락티스(K. lactis)에 대해 Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)에 보고되었다. 클루베로마이세스(Kluyveromyces)의 산업 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정된 다복제(multi-copy) 발현 벡터가 또한 개시되었다(예를 들어, Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991) 참조).
발현 벡터와 클로닝 벡터는 숙주 유기체에 의해 인식되고 항-α2 인테그린 항체 핵산에 작용 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것이 일반적이다. 원핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 아라비노스 프로모터(예를 들어, araB), phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 혼성 프로모터, 예컨대, tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터들도 적합하다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터도 항-α2 인테그린 항체를 암호화하는 DNA에 작용 가능하게 연결된 샤인-달가모(Shine-Dalgamo: S.D.) 서열을 포함할 것이다.
프로모터 서열이 진핵 생물에 대해 공지되어 있다. 대부분의 진핵 생물 유전자는 전사가 개시되는 자리로부터 상류쪽으로 대략 25 내지 30 염기에 위치된 AT-풍부 부위를 가진다. 많은 유전자들의 전사의 개시부(start)로부터 상류쪽으로 70 내지 80 염기에서 발견된 또 다른 서열은, N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는, CNCAAT 부위이다. 대부분의 진핵 생물 유전자들의3' 말단에는 폴리 A 꼬리(tail)를 코딩 서열의3' 말단에 추가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 이러한 서열은 진핵 생물 발현 벡터에 적절히 삽입된다.
이스트 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예들은, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대, 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루브산염 데카복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루브산염 키나제, 트라이오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제를 위한 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 전사가 성장 조건에 의해 제어된다는 추가적인 이점을 가진 유도성 프로모터인, 다른 이스트 프로모터는 알코올 탈수소효소 2, 아이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 및 말토스 및 갈락토오스 활용을 맡고 있는 효소들을 위한 프로모터 부위이다. 이스트 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 EP 73,657호에 더 상세히 기술되어 있다. 이스트 인핸서도 이스트 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유류 숙주 세포에서 벡터로부터의 항-α2 인테그린 항체 전사는, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 또는 원숭이 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종성 포유류 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열-충격(heat-shock) 프로모터로부터, 얻은 프로모터에 의해 제어되는데, 이는 이러한 프로모터들이 숙주 세포 시스템과 친화성 있는(compatible) 것을 조건으로 한다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터들은 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 인간 거대세포 바이러스의 즉시 초기 프로모터(immediate early promoter)는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있으며, 이 시스템의 변형이 미국 특허 제4,601,978호에 기술되어 있다(또한 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 생쥐 세포에서의 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 관한 Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) 참조). 이와 달리, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복 서열(long terminal repeat)이 프로모터로서 사용될 수 있다.
고등 진핵 생물에 의한 항-α2 인테그린 항체를 암호화하는 DNA의 전사는 흔히 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가된다. 포유류 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질, 및 인슐린)의 많은 인핸서 서열들이 현재 공지되어 있다. 그러나 진핵 세포 바이러스의 인핸서가 흔히 사용된다. 그러한 예는 복제 기점(bp 100-270) 후방 측의 SV40 인핸서, 거대세포 바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 후방 측의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다(또한, 예를 들어, 진핵 생물 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소(enhancing elements)에 관한 Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) 참조). 인핸서는 항-α2 인테그린 항체-암호화 서열에 대해 위치 5' 또는 3'에서 벡터에 접합될 수 있으나, 프로모터로부터 위치 5'에 있는 것이 바람직하다. 이 분야에 잘 알려져 있는 다른 유전자 조절 시스템(예를 들어, 테트라사이클린 유도성 시스템 및 GeneSwitch™와 같은 유도성 시스템)이 항-α2 인테그린을 암호화하는 DNA의 전사를 제어하기 위해 사용될 수 있다.
진핵 숙주 세포(이스트, 균류, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종결을 위해 그리고mRNA의 안정화를 위해 필요한 서열을 포함할 것이다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵 생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 그리고, 때때로 3', 미번역 부위로부터 입수 가능하다. 이러한 부위는 항-α2 인테그린 항체를 암호화하는 mRNA의 미번역 부분의 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 단편을 포함한다. 유용한 전사 종결 성분 중의 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위이다(예를 들어, 국제특허공개 WO94/11026 및 거기에 개시된 발현 벡터 참조).
본 발명에서 벡터의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포는 위에 기술된 바와 같은 원핵 생물, 이스트, 또는 고등 진핵 생물 세포이다. 이 목적에 적합한 원핵 생물은 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예를 들어, 장내 세균과 세균(Enterobacteriaceae), 예컨대, 에셰리키아(Escherichia), 예를 들어, 대장균(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 그리고 바실리(Bacilli), 예컨대, B. 섭틸리스(B. subtilis) 및 B. 리체니포르미스(B. licheniformis), 프슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대, P. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하는 유박테리아를 포함한다. 적합한 E. coli 클로닝 숙주는 E. coli 294(ATCC 31,446), E. coli B, E. coli X1776(ATCC 31,537) 및 E. coli W3110(ATCC 27,325)을 포함한다.
원핵 생물에 더하여, 사상성 균류 또는 이스트와 같은 진핵 미생물은 항-알파 2 인테그린 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반적인 제빵용 이스트가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대, K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), K. 위케라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), K. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), K. 서모톨러란스(K. thermotolerans), 또는 K. 마르시아누스(K. marxianus); 야로이야(yarrowia)(유럽 특허 EP 402,226호); 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)(유럽 특허 EP 183,070호); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia)(유럽 특허 EP 244,234호); 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)와 같은 슈반니오마이세스(Schwanniomyces); 및 사상성 균류, 예컨대, 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 또는 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대, A. 니둘란스(A. nidulans) 또는 A. 니거(A. niger)와 같은 많은 다른 속, 종 및 균주가 일반적으로 입수 가능하며 유용하다.
당화된 항-α2 인테그린 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추 동물 세포의 예들은 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(캐터필러(caterpillar)), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti)(모스퀴토(mosquito)), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모스퀴토), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(프루트플라이(fruitfly)), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용된 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 핵산전달감염을 위한 다양한 바이러스 균주가 공중에 의해 이용 가능하며, 예를 들어, 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주, 및 이러한 바이러스들은, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 핵산전달감염을 위해, 사용될 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 콩, 피튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양조직이 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
그러나, 척추 동물 세포에 대한 관심이 커졌으며, 다양한 포유류 세포를 포함하는 척추 동물 세포의 보급이 일상적인 과정이 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포의 예는: SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인(예를 들어, COS-7, ATCC CRL 1651); 현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 인간 태아 신장 라인 293 또는 293 세포(예를 들어, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977) 참조); 어린 햄스터 신장 세포(예를 들어, BHK, ATCC CCL 10); DHFR 결핍 CHO 세포를 포함하는, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(예를 들어, DHFR Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980) 참조); 생쥐 세르톨리 세포(예를 들어, TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(예를 들어, CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(예를 들어, VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암종 세포(예를 들어, HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(예를 들어, MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포(예를 들어, BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(예를 들어, W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(예를 들어, Hep G2, HB 8065); 생쥐 유방 종양(예를 들어, MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(예를 들어, Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982) 참조); MRC 5 세포; FS4 세포; 또는 인간 간종양 라인(예를 들어, Hep G2)을 포함한다.
숙주 세포는, 항-α2 인테그린 항체 제조를 위한 상술한 발현 벡터 또는 클로닝 벡터에 의해 형질전환되며, 프로모터를 유발하고 형질전환체를 선택하고 그리고/또는 원하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기에 적합하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
항-α2 인테그린 항체를 제조하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 구입가능한 배지, 예컨대, 햄 F10(Ham's F10)(Sigma사), 최소 필수 배지((Minimal Essential Medium: MEM), Sigma사), RPMI-1640(Sigma사) 및 둘베코 변형 이글 배지((Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM), Sigma사)가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; 국제특허공개 WO90103430; 국제특허공개 WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 번호 30,985에 기술된 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이러한 배지들 중 어느 것이든 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장 인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제(예컨대, HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생 물질(예컨대, GENTAMYCINTM 약물), 미량 원소(마이크로몰 범위의 최종 농도에서 통상적으로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 여하한 다른 필수 보충물들이 또한 이 분야의 통상의 지식을 가진 자들에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 이전에 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사용되었던 배양 조건을 포함하는, 온도, pH 등과 같은 배양 조건이 이 분야의 통상의 지식을 가진 자들에 의해 선택된다.
항-α2 인테그린 항체는 예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및/또는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 미생물 또는 포유류 세포를 포함하는 세포로부터 정제될 수 있다. 단백질 A의 친화성 리간드로서의 적합성은 항체에 존재하는 면역글로불린 Fc 도메인의 종(species) 및 동종형에 좌우된다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제하기 위해 사용할 수 있다(예를 들어, Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983) 참조). 단백질 G는 생쥐 동종형에 그리고 인간 γ3에 유용하다(예를 들어, Guss et al, EMBO J. 5:1516-1517 (1986) 참조). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 대체로 아가로스이나, 다른 매트릭스들이 사용 가능하다. 기계적으로 안정된 매트릭스들, 예컨대, 제어 기공 유리(controlled pore glass) 또는 폴리(스티렌다이비닐)벤젠은 더 빠른 흐름 속도를 가능케 하며, 더 짧은 프로세싱 시간이 아가로스로 달성될 수 있다. 항체가 CH3 도메인을 포함하여 구성되는 경우에, Bakerbond ABXTM(J.T. Baker사, 뉴저지, 필립스버그)가 정제에 유용하다. 단백질 정제는 이온-교환 컬럼 상의 분획법, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSETM 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예를 들어, 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 기술들 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 임의의 정제 단계(들) 후에, 관심있는 항체 및 오염 물질을 포함하여 구성되는 혼합물을 약 2.5-4.5 사이의 pH의 용리 완충 용액을 사용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피로 처리하는 것이 유용할 수 있으며, 이것은 (예를 들어, 약 0-0.25M 염으로부터의) 낮은 염 농도에서 수행되는 것이 바람직하다.
치료적 투여를 위한 것들을 포함하는, 항-α2 인테그린 항체의 포뮬레이션은, 원하는 등급의 순도를 가진 항체를 임의의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여 보관을 위해 동결 건조된 포뮬레이션 또는 수용액 형태로 제조된다. 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 농도 및 투여량에서 수용자에게 무독성이며, 완충제, 예컨대, 포스페이트, 구연산염, 및 다른 유기 산; 산화방지제, 예컨대, 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 낮은 분자량(약 10 보다 적은 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 또는 다른 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당류, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 치료 용도를 위해 본 발명의 항-α2인테그린 항체는 예를 들어 0,03% Tween-80TM을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)에서 포뮬레이팅될 수 있다.
항체 포뮬레이션은 치료 중인 특정 조치를 위한 하나보다 많은 활성 화합물들, 바람직하게는 서로 나쁜 영향을 미치지 않는 상보적 활성들을 가진 활성 화합물들을 또한 포함할 수 있다. 문제의 그 장애를 예방하거나 치료하기 위해 일반적으로 사용되는 하나 이상의 작용제에 더하여 항-α2 인테그린 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 면역억제제를 더 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 적절히 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐에, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 또는 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 가두어질 수 있다. 이러한 기술은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
생체 내 투여를 위해 사용될 포뮬레이션은 바람직하게는 무균 상태이다. 이것은 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 이루어진다.
서방형 제제(sustained-release preparations)가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고형 소수성 폴리머의 반투성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스들은 성형물, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
서방형 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 난분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 젖산-글리콜산 코폴리머, 예컨대, Lupron DepotTM(젖산-글리콜산 코폴리머 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산과 같은 폴리머는 100일 동안에 걸친 분자의 방출을 가능케 하지만, 특정 하이드로겔은 단기간 동안 단백질을 방출한다. 피포성(encapsulated) 항체들이 장기간 동안 체내에 남아있을 때, 그들은 37ºC에서 수분에 노출된 결과로서 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성이 손실되고 면역원성이 변할 수 있다. 관련 메커니즘에 따라 안정화를 위해 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-다이설피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 설프하이드릴 잔기를 변경하고, 산성 용액으로부터 동결 건조하고, 수분 함량을 제어하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 그리고 특이적 폴리머 매트릭스 조성물을 개발함으로써 안정화가 달성될 수 있다.
인간화 항-α2 인테그린 항체의 치료 용도
항-α2 인테그린 항체는 본 명세서에 기술된 다양한 α2β1 인테그린 관련 장애를 치료하기 위해 사용할 수 있다. 항-α2 인테그린 항체는 비경구적, 피하, 복막 내, 폐 내 또는 비강 내를 포함하는 여하한 적합한 수단에 의해 투여된다. 국소적 면역억제성 치료가 바람직한 경우에, (관류(perfusing) 또는 다른 방법으로 이식편을 이식 전에 항체와 접촉시키는 것을 포함하는) 항체의 병변 내 투여가 수행된다. 비경구적 투여는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복막 내, 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항-α2 인테그린 항체는 예를 들어, 펄스 주입(pulse infusion)에 의해, 항체의 투여량을 감소시켜서 적절히 투여된다. 투약은 바람직하게는 주사, 가장 바람직하게는 정맥 내 또는 피하 주사에 의한다. 이것은 투여가 단기간인지 장기간에 걸친 것인지에 얼마간 좌우될 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 명세서에 기술된 항-α2 인테그린 항체 또는 그 조성물은 본 발명의 방법에서 정맥 내 주입, 정맥 내 대량주입(bolus), 피하 투여, 피하 주입 또는 피하 대량주입에 의해 투여되지만, 정맥 내 주입 또는 정맥 내 대량주입이 가장 바람직하다. “정맥 내 주입”이라는 용어는 약 5분 보다 긴 시간 동안, 바람직하게는 약 30 내지 90분 사이의 시간 동안 동물 또는 인간 환자의 정맥에 약물을 투여하는 것을 나타내지만, 본 발명에 의하면 정맥 내 주입은 이와 달리 10 시간 이하의 시간 동안 투여된다. “정맥 내 대량주입” 또는 “정맥 내 푸시(push)”라는 용어는 몸이 약 15분 이내에, 바람직하게는 5분 이내에 약물을 받아들이도록 동물 또는 인간의 정맥에 약물을 투여하는 것을 나타낸다. “피하 투여”라는 용어는 약물 용기로부터의 비교적 느린, 지속적인 전달에 의해, 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내에, 약물을 도입하는 것을 나타낸다. 포켓은 피부를 하부 조직 위로 잡아당겨서 만들 수 있다. “피하 주입”이라는 용어는 30 분 이내, 또는 90 분 이내를 포함하나 이에 한정되지 않는 기간 동안 약물 용기로부터의 비교적 느린, 지속적인 전달에 의해, 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내에, 약물을 도입하는 것을 나타낸다. “피하 대량주입”이라는 용어는 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에 약물을 투여하는 것을 나타내며, 이 경우 대량주입 약물 전달은 바람직하게는 약 15분 미만, 더욱 바람직하게는 5분 미만, 그리고 가장 바람직하게는 60초 미만에 이루어진다. 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내에 투여하는 것이 바람직하며, 이 경우, 포켓은 예를 들어, 피부를 하부 조직 위로 잡아당겨서 만든다. 선택적으로, 주입은 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에 이식되는 약물 전달 펌프의 피하 이식에 의해 이루어질 수 있으며, 여기서, 펌프는 미리 정해진 기간 동안, 예컨대, 30분, 90분, 또는 치료 계획의 기간에 따른 시간 동안 미리 정해진 양의 약물을 전달한다. 주기적 또는 정기적 투약은 특정 기간 동안 계속되고 바람직하게는 1일 이상의 정기적인 간격으로 이루어지는 투약이다.
본 명세서에 같은 의미로 사용된 “치료적 유효량” 또는 “유효량”은 치료 중인 개체의 증상을 호전시키거나 예방하고 또는 치료 중인 개체의 생존을 연장하는데 효과적인 본 명세서에 기술된 항-α2 인테그린 항체의 양을 나타낸다. 치료적 유효량의 결정은, 특히 본 명세서에 제공된 발명의 상세한 설명에 비추어, 이 분야의 통상의 지식을 가진 자들의 능력 범위 내에서 만족스럽게 이루어진다. 본 명세서에 기술된 항-α2 인테그린 항체의 “치료적 유효량”이라는 용어는 특히, 예를 들어, 종양 성장과 같은 암을 지연시키거나 억제하기 위해 필요한 양을 나타낸다.
α2β1 인테그린-관련 장애의 예방 또는 치료를 위한, 항체의 적절한 투여량은 위에 정의된 바와 같은, 치료받을 질환의 종류, 질환의 중증도 및 경과, 항-α2 인테그린 항체가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전의 치료요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응성 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료 기간에 걸쳐 환자에게 적절히 투여된다.
항-α2 인테그린 항체는 따라서 개체에게, 바람직하게는 인간에게, 본 발명의 방법에서, 약 0.1. 내지 약 100mg/kg 범위 내의 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약 1 내지 약 20mg/kg 범위 내의 치료적 유효량, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 약 10mg/kg 범위 내의 치료적 유효량이 개체에게, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 치료적 유효량의 인간화 항체 또는 그 결합 단편(binding fragment)이 하나 이상의 치료적 유효 용량들로 개체에게 투여될 수 있다.
α2β1 인테그린-관련 장애의 예방 또는 치료를 위한, 항체의 적절한 투여량은 위에 정의된 바와 같은, 치료받을 질환의 종류, 질환의 중증도 및 경과, 항-α2 인테그린 항체가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전의 치료요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응성 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료 기간에 걸쳐 환자에게 적절히 투여된다.
α2β1 인테그린-관련 장애의 종류 및 중증도에 따라, 약 0.1mg/kg 내지 약 100mg/kg의 항체가, 예를 들어, 1회 이상의 개별적인 투여에 의하든, 연속적인 주입에 의하든, 개체에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 예를 들어 인간에 대한 일반적인 1일 투여량은 위에 언급한 요인들에 따라, 0.1mg/k 내지 20mg/kg또는 그 이상의 범위 내에 있을 수 있다. 병태에 따라, 수일 또는 그 이상의 기간에 걸친 반복된 투여를 위해, 질환 증상의 바람직한 억제가 일어날 때까지 치료가 지속된다. 그러나, 다른 투약 요법이 유용할 수 있으며, 예를 들면, 2주 마다 1회의 투약 요법이 바람직한 것으로 보인다. 이 투약 요법의 경과는 이 분야의 통상의 지식을 가진 자들이 쉽게 모니터링한다.
항-α2 인테그린 항체 조성물은 좋은 의료 행위에 어긋나지 않는 방식으로 제제화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려할 요인들은 치료 중인 특정 장애, 치료를 받고 있는 특정 포유류, 개별 환자의 임상 조건, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여의 스케쥴링, 약물학적 연구 및 독성 연구의 결과 및 의료인에게 공지된 다른 요인을 포함한다. 투여될 항체의 치료적 유효량은, 이와 같은 것들을 고려하여 결정되며, α2β1 인테그린-관련 장애의 예방, 호전, 또는 치료에 필요한 최소량이다. 이러한 양은 숙주에게 유독하고 숙주를 훨씬 더 감염되기 쉽게 만드는 양보다 적은 것이 바람직하다.
항-α2 인테그린 항체는 문제의 그 장애를 예방 또는 치료하기 위해 일반적으로 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 선택적으로 제제화되거나, 공동투여되거나 부가 요법으로서 사용될 수 있으나 그럴 필요가 없을 수 있다. 예를 들어, 류머티즘성 관절염에서, 항체는 글루코코르티코스테로이드, Remicaid® 또는 류머티즘성 관절염에 대해 승인된 치료와 함께 주어질 수 있다. 다발성 경화증의 경우에, 항체는 인터페론β, 아보넥스(Avonex), 코파손(Copaxon), 또는 다발성 경화증의 징후 및 증상의 치료를 위한 다른 승인된 요법과 함께 주어질 수 있다. 이식의 경우에, 항체는 면역억제 효과를 조절하기 위해, 사이클로스포린 A와 같은, 위에 정의된 면역억제제와 동시에 또는 따로따로 투여될 수 있다. 이와 달리, 또는 이에 더하여, α2β1 인테그린 길항제가 α2β1 인테그린-관련 장애로 고통 받는 포유류에게 투여될 수 있다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 포뮬레이션에 존재하는 항-α2 인테그린 항체의 양, 장애 또는 치료의 종류, 및 위에 논의된 다른 요인들에 좌우된다. 이들은 일반적으로 위에 사용된 것과 동일한 투여량으로 그리고 위에 사용된 투여 경로에 의해 또는 이전에 사용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
다음의 실시예는 본 발명을 한정하는 것이 아닌 그 예시로서 제공된다. 본 명세서의 모든 인용 문헌들은 명백히 본 명세서의 참고문헌을 이룬다.
실시예
실시예 1: 강화된 보체-매개성 효과기 기능을 가진 인간화 항-α2 인테그린 항체 변이체
본 명세서에 기술된 인간화 항-α2 인테그린 항체는, 생체 내 출혈 합병증을 예상 외로 일으키지 않고 그리고/또는 혈소판 α2β1 인테그린을 활성화시키지 않는 것을 특징으로 하는, 항-α2(항-VLA2) 항체의 신규한 아형을 나타낸다. 그러나 국제특허공개 WO2007/056858에 개시된 IgG4 항체는, 예를 들어 α2β1 인테그린-관련 암의 치료와 같은, 특정 상황에서 필요로 하고, 치료의 효능을 증가시킬 수 있는, ADCC 및/또는 CDC와 같은 효과기 기능을 수반하지 않는다. 따라서, 이러한 효과기 기능을 높은 수준으로 발휘할 항-α2β1 인테그린 항체를 개발하는 것이 바람직할 것이다.
인간 IgG의 네 가지 동종형들은 효과기 기능 및 다른 활성들의 역가가 서로 다르다. 일반적으로, 역가의 순위는 ADCC의 경우에 IgG1 1 IgG3 >> IgG4 1 IgG2이고, CDC의 경우에 IgG3 IgG1 >> IgG2 =IgG4이다(Niwa R. et al., J Immunol Methods 2005; 306:151-60). 이 연구에서, 국제특허공개 WO2007/056858에 개시된 하나의 항-VLA-2 IgG4 항체(중쇄 서열 번호: 57이고, 경쇄 서열 번호: 56임)를 자연 발생적 인간 항체 동종형 변이체 IgG1, IgG2, 및 IgG3; 조작된(engineered) 인간 IgG1 동종형 변이체들 및 인간 IgG1 및 인간 IgG3 동종형 변이체들의 키메라들로 이루어진 항-VLA2 항체의 새로운 아형을 만들기 위해 사용하였다. 모든 변이체들을 오버랩 PCR 어셈블리 방법을 기반으로 하는 돌연변이유발 기술로 만들었다.
완전 항체 변이체(full antibody variants)를 생성시키기 위해, 각각의 새로 만들어진 중쇄 벡터를 동일한 항-VLA-2 카파 경쇄 벡터로 핵산전달감염시켰는데, 이 벡터는 항-VLA-2 카파 경쇄 cDNA 코딩 경쇄 서열(서열 번호: 56)을 가지며 아래에 기술된 중쇄 벡터와 동일한 발현 조절 요소를 가지는 것이었다. 그 결과, 신규한 항-VLA2 항체 변이체의 중쇄는 신규한 완전 항체 변이체를 정의하고; 따라서 중쇄 및 상응하는 완전 항체는 동일한 명칭으로 지칭된다.
자연 발생적 인간 항체 동종형을 기반으로 하는 변이체
자연 발생적 동종형 변이체 중쇄를 만들기 위해, 서열 번호: 57(카바트(Kabat) 잔기 119(서열 번호: 57의 잔기 121에 해당)에서 그것의 C-말단까지의 서열)의 중쇄 힌지 및 불변 도메인들을 암호화하는 항-VLA-2 IgG4 항체의 cDNA를 인간 IgG1(NCBI GenBank 검색 번호(accession no.) J00228.1, 잔기 1에서 그것의 C-말단까지의 서열), 인간 IgG2(NCBI GenBank 검색 번호 J00230.1, 잔기 1에서 그것의 C-말단까지의 서열) 및 인간 IgG3(NCBI GenBank 검색 번호 X03604.1, 잔기 2에서 그것의 C-말단까지의 서열)의 힌지 및 불변 도메인들의 아미노산을 암호화하는 상응하는 cDNA 서열로 대체하였다. 이러한 자연 발생적 중쇄 변이체들은, 그 결과로서 각각 중쇄 항-VLA2 IgG1(서열 번호: 44), 중쇄 항-VLA2 IgG2(서열 번호: 45) 및 중쇄 항-VLA2 IgG3(서열 번호: 46)으로 지칭되는, 신규한 항-VLA2 항체들을 정의한다.
인간 IgG1/IgG3 힌지-Fc 도메인 셔플링(shuffling)을 기반으로 하는 변이체
인간 IgG3 항체는 일반적으로 인간 IgG1 항체에 비해 강화된 CDC를 가지는데, 이는 부분적으로 IgG3 Fc가 IgG1 Fc보다 높은 C1q-결합 친화성을 가지기 때문이다(Schumaker VN et al., Biochemistry, 1976, 15:5175-81). 인간 IgG3 의 힌지 및 불변 도메인들과 인간 IgG1 힌지 및 불변 도메인들의 셔플링 전략을 수행하여 강화된 CDC를 가진 항-VLA-2 IgG4의 키메라를 생성시켰다.
두 가지 키메라들이 구성되었다. 항-VLA-2 IgG4를 기반으로 하는 제1 키메라는 인간 IgG1의 힌지 및 CH1을 인간 IgG3의 Fc 부위에 융합하도록 조작되었으며, 본 명세서에서 이를 중쇄 항-VLA-2 IgG-1133(서열 번호: 47)이라 하는 반면에; 항-VLA-2 IgG3을 기반으로 하는 제2 구성체는 인간 IgG3의 힌지를 인간 IgG1의 힌지로 치환하도록 조작되었으며, 이러한 후자의 키메라는 본 명세서에서 중쇄 항-VLA-2 IgG-3133(서열 번호: 48)이라 한다.
항-VLA-2 IgG-1133 중쇄 cDNA 코딩 서열(서열 번호: 47)을 만들기 위해, 항-VLA-2 IgG1의 발현 벡터에서 CH2 및 CH3 불변 도메인들을 암호화하는(카바트(Kabat) 잔기 231 내지 그것의 c-말단을 암호화하는) 항-VLA-2 IgG1의 중쇄 cDNA의 일부가 인간 IgG3 중쇄 유전자(NCBI GenBank 검색 번호 X03604.1, 잔기 161 내지 377)의 상응하는 부분으로 대체되었다. 항-VLA-2 IgG-3133 중쇄 cDNA 코딩 서열(서열 번호: 48)의 경우, 항-VLA-2 IgG3 중쇄의 발현 벡터에서 힌지 부위(NCBI GenBank 검색 번호 X03604.1의 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP)를 암호화하는 항-VLA-2 IgG3의 중쇄 cDNA의 일부가 인간 IgG1 중쇄 유전자(NCBI GenBank 검색 번호 J00228.1)의 상응하는 부분(EPKSCDKTHTCPPCP)으로 대체되었다.
강화된 CDC를 가진 아미노산 돌연변이체 항-VLA2 항체
항-VLA-2 IgG1의 수많은 변이체들이 보체 의존적 세포독성(CDC) 강화를 목표로 설계되었다. Fcγ 수용체와 Fc 상호작용이 ADCC를 매개하는 것과 동일한 방식으로, 보체 성분 C1q와 Fc 상호작용이 CDC를 매개한다. 현재 Fc/C1q 복합체를 설명할 수 있는 3D 구조가 없지만, 몇몇 연구는 C1q에 대한 인간 IgG 상의 결합 부위를 잔기 D270, K322, P329 및 P331 을 중심으로 하는 부위에 맵핑하였다(Idusogie et al., J Immunol Methods 2000, 164:4178-4184). 항-VLA-2 IgG1 항체에서 CDC를 강화시킬 수 있는 변이체를 연구하기 위해 CH2 도메인의 D269-K334 부위에 아미노산 변형을 설계하였다.
이러한 변이체 cDNA 코딩 서열을 만들기 위해, 항-VLA-2 IgG1 중쇄(서열 번호: 44)를 코딩하는 cDNA를 S324N(본 명세서에서 항-VLA-2 IgG1-S324N이라 함; 서열 번호: 49), E269D(본 명세서에서 항-VLA-2 IgG1-E269D라고 함; 서열 번호:50) 및 S298A(본 명세서에서 항-VLA-2 IgG1-S298A라고 함; 서열 번호: 51)의 치환들을 포함하도록 돌연변이시켰다. 이러한 점 돌연변이들을 둘씩 결합시켜서 한층 더한 변이체들을 만들었는데: E269D와 S298A를 결합시킨 본 명세서에서 항-VLA-2 IgG1-E269D/S298A(서열 번호: 52)이라 하는 변이체; E269D 및 S324N으로 구성된, 본 명세서에서 항-VLA-2 IgG1-E269D/S324N(서열 번호: 53)이라 하는, 또 하나의 결합체; S298A 및 S324N 돌연변이들을 합친, 본 명세서에서 항-VLA-2 IgG1- S298A/S324N(서열 번호: 54)이라 하는 제3 결합체를 생성시켰다. 최종적으로 세 돌연변이들을 모두 합하여 본 명세서에서 항-VLA-2 IgG1-E269D/S298A/S324N(서열 번호: 55)이라 하는 변이체를 만들었다.
이러한 변이체 코딩 DNA 서열을 CMV 프로모터 및 소 성장 호르몬 폴리-아데닐화 신호를 가진 변형된 pREP4(Invitrogen사, 미국, 캘리포니아주) 벡터를 기반으로 하는 벡터에 결찰시켰다. 이 발현-벡터에서, 생쥐의 VJ2C 리더 펩타이드에 의해 분비가 이루어졌다.
항-VLA2 항체 변이체의 제조
일시적 발현을 위해, 동일한 양의 각각의 (상기) 벡터 중쇄 및 항-VLA-2 카파 경쇄 벡터를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 부유성(suspension-adapted) HEK-EBNA 세포(ATCC-CRL-10852)에 공동-핵산전달감염시켰다. 일반적으로, 밀도가 ml 당 0.8-1.2 백만 세포인 세포 현탁액 100ml를, 변이체 중쇄를 암호화하는 50μg의 발현 벡터 및 50μg의 발현 벡터 경쇄를 함유하는 DNA-PEI 혼합물로 핵산전달감염시킨다. 각각의 조작된 사슬 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 숙주 세포에 도입될 때, 0.1% 플루론산(pluronic acid), 4mM 글루타민 및 0.25μg/ml 제네티신이 보충된 배양 배지(EX-CELL 293, HEK293-무혈청 배지, Sigma사, 스위스, 부크스)에 분비가 일어나도록 세포를 4일 내지 5일 동안 더 배양함으로써 구성체가 제조된다. 그 다음에 구성체를 재조합 유선형 rProtein A 미디어(GE Healthcare Europe GmbH사, 스위스, 글라트브루크)를 사용하여 무세포 상청액으로부터 정제하고, 추가적인 분석을 위해 사용하였다.
이러한 일부 변이체들의 발현 수준이 표 1에 기재되어 있다.
Figure 112012076607384-pct00001
HT1080 세포에서의 보체-매개성 독성
세포-기반 분석을 사용하여 변이체의 CDC 매개 능력을 측정하였다. 어린 토끼 보체(Harlan Laboratories, C-0099F, AN VENRAY, 네덜란드)에 의한 변이체-옵소닌화(opsonized) HT1080 세포의 용해를 관찰하기 위해 젖산 탈수소효소(LDH)의 방출을 이용하여 용해를 측정하였다. 표적 세포(HT1080, ATTC ® No. CCL-121)를 완전 배지(10% 소 태아 혈청(FBS, Chemie Brunschwig AG사, PAA, 스위스, 바젤) 및 1% 울트라글루타민(Lonza사, 벨기에, 베르비에)가 보충된 RPMI-1640 배지(Chemie Brunschwig AG사, PAA, 스위스, 바젤))를 사용하여 원심분리 및 재현탁에 의해 2회 세척하였다. 변이체-항체들을 1μg/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 어린 토끼 혈청을 완전 배지를 사용하여 7.5%로 희석시켜서, 항체-옵소닌화 표적 세포에 첨가하였다. 플레이트를 37°C에서 3시간 동안 배양하였다. 세포의 세포독성을 Cyto Tox 96 비방사성 세포독성 분석 키트(Promega사, 미국, 매디슨)을 사용하여 측정하였다.
도 1은, 3회 수행된 데이터 ± 표준 편차로 된, 상기 분석의 일반적인 결과를 보여준다. 이 분석에서, IgG1 대조군(데이터 포인트 번호 12) 또는 모 항-VLA-2 IgG4 항체(데이터 포인트 번호 1) 또는 항-VLA-2 IgG2(데이터 포인트 번호 3) 항체로 인한 특이적 용해는 거의 관찰되지 않는다. 후자의 자연 발생적 동종형들의 경우에 CDC가 없거나 아주 낮은 수준인 것으로 예상되지만, IgG1 항체 동종형이 IgG4 및 IgG2 동종형들보다 높은 CDC를 가지는 것으로 예측되었었기 때문에, 항-VLA-2 IgG1(데이터 포인트 번호 2)이 CDC를 크게 증가시키지 않은 것은 다소 놀랍다. 오직 S324N 돌연변이가 존재할 때만, CDC가 항-VLA-2 IgG1-S324N(데이터 포인트 번호 7)의 경우에 적어도 6.4 배, 항-VLA-2 IgG1-S298A/S324N(데이터 포인트 번호 11)의 경우에 6.6 배, 그리고 항-VLA-2 IgG1-E269D/S298A/S324N(데이터 포인트 번호 10)의 경우에 9 배 증가된다. 또한 보체-유도성 용해는 인간 IgG3 항체 동종형 불변 부위를 가진 항체 변이체의 경우에 크게 증가되었으며, CDC는 항-VLA-2 IgG-1133(데이터 포인트 번호 5)의 경우에 적어도 5.6 배, 그리고 항-VLA-2 IgG-3133(데이터 포인트 번호 6)의 경우에 적어도 8.6 배 증가되었다. 최상의 CDC 증가는 자연 발생적 변이체 항-VLA-2 IgG3(데이터 포인트 번호 4)의 경우에 관찰되었는데, 모 항-VLA-2 IgG4 항체보다 적어도 9.6 배 강화되었다. 결론적으로, 이러한 결과는 항-VLA-2 IgG3 변이체가 항-VLA2 항체 변이체들 중 CDC 도출에 있어 가장 강력하기는 하지만, 항-VLA-2 IgG1 항체와 관련된 S324N 돌연변이가 보체-유도성 용해를 강화시킬 수 있다는 증거를 제공한다.
실시예 2: 강화된 항체-의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 가진 인간화 항-알파2 인테그린 항체 변이체
실시예 1의 연구에서 조사된 항-VLA2 항체 변이체들을 그들의 ADCC 도출 능력에 대해 평가하였다.
항체의 ADCC 활성은 Cyto Tox 96 비방사성 세포독성 분석 키트(Promega사, 미국, 매디슨)를 사용하여 젖산 탈수소효소(LDH)-방출 분석에 의해 측정하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(Human peripheral blood mononuclear cells: PBMC)를 표준 피콜-파크(Ficoll-paque) 분리법에 의해 구연산첨가 전혈(citrated whole blood)로부터 정제하고, 완전 배지(10 % 소 태아 혈청(FBS, Chemie Brunschwig AG사, PAA, 스위스, 바젤), 2mM 울트라글루타민 1(Lonza사, 벨기에, 베르비에) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Chemie Brunschwig AG사, PAA, 스위스, 바젤)이 보충된 RPMI-1640 배지(Chemie Brunschwig AG사, PAA, 스위스, 바젤))와 100U/ml의 인간 IL-2(Sigma사, 미국, 미주리)에 재현탁시키고, 37ºC에서 밤새 배양하였다. 그 다음 날, 원심 분리에 의해 PBMC를 수집하고, 2회 세척하고, 8 x 106 세포/ml의 밀도로 배양 배지에 재현탁시켰다. 세포주 HT1080을 표적 세포로서 사용하였다. HT1080 세포를 2회 세척하고, 0.2 x 106 세포/ml 밀도로 완전 배지에 재현탁시켰다. 1.5μg/ml에서 희석되어 0.1μg/ml(도 2) 또는 0.01μg/ml(도 3)의 최종 농도를 가진 50 마이크로리터의 항체를 50μl의 표적 세포와 혼합하고, U형-바닥 96-웰 플레이트 안의 동등한 부피의 PBMC에 첨가하였다. 1:40의 표적 대 효과기 비율을 실험 내내 사용하였다. 37ºC에서의 4시간 동안 배양한 후에, 세포들을 원심 분리하고, 무세포 상청액의 50μl 샘플들을 수거한 후, 평면-바닥 96-웰 플레이트로 옮겨서, 분석하였다. 용해 퍼센트를 다음과 같이 계산하였다: (샘플의 방출 - 표적의 자발적 방출(spontaneous release) - 효과기의 자발적 방출) / (최대 방출 - 표적의 자발적 방출)* 100; 여기서, 표적의 자발적 방출은 표적 세포들만이 담긴 웰들의 형광(fluorescence)이고, 효과기의 자발적 방출은 효과기 세포들만이 담긴 웰들의 형광이며, 최대 방출은 용해 완충제로 처리된 표적 세포들이 담긴 웰들의 형광이다. 샘플의 용해 퍼센트에서 항체의 부재 하에 얻은 백그라운드 용해 퍼센트(표적 + 효과기 세포들)를 뺏으며; 제시된 데이터는 하나의 공여체로부터 분리된 PBMC을 사용하여 3회 실시한 웰들의 평균 세포독성 퍼센트 ± 표준 편차를 나타낸 것이다.
도 2에서 IgG1 대조군 항체 또는 모 항-VLA-2 IgG4 항체(각각 데이터 포인트 번호 1 및 12)로 인한 특이적 ADCC는 거의 보이지 않으며; 도시된 데이터는 항-VLA2 항체의 자연 발생적 인간 IgG1 동종형이 VLA-2+ 발현 세포에 대해 강화된 세포 매개 세포독성을 가지며, 더욱 바람직하게는 항-VLA2-IgG1 항체 점 돌연변이체들이 다음과 같은 역가 순위를 가진다는 것을 나타낸다: 항-VLA2-IgG1-S298A/S324N(데이터 포인트 번호 11; 2 배 증가) > 항-VLA2-IgG1-S298A(데이터 포인트 번호 8; 1.8 배 증가) > 항-VLA2-IgG1(데이터 포인트 번호 2; 1.7 배 증가) 또는 항-VLA2-IgG1-E269D/S298A/S324N(데이터 포인트 번호 10; 1.7 배 증가) > 항-VLA2-IgG1-E269D(데이터 포인트 번호 9; 1.5 배 증가).
도 3은 항-VLA2 항체 변이체에 대한 ADCC 역가의 순위가 항체의 10-배 희석에서도 비슷하게 유지된다는 것을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> ANTI-ALPHA2 INTEGRIN ANTIBODIES AND THEIR USES <130> US <150> US 61/307,009 <151> 2010-02-23 <160> 57 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 [CDR1 of heavy chain variable region] <400> 1 Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Ile His 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 [CDR2 of heavy chain variable region] <400> 2 Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR3 [CDR3 of heavy chain variable region] <400> 3 Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR1 [CDR1 of light chain variable region] <400> 4 Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR2 [CDR2 of light chain variable region] <400> 5 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 [CDR3 of light chain variable region] <400> 6 Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized VH region <220> <221> VARIANT <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 can be Thr or Ile <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 can be Asn or Ser <220> <221> VARIANT <222> (37)..(37) <223> Xaa at position 37 can be Val or Ile <220> <221> VARIANT <222> (48)..(48) <223> Xaa at position 48 can be Leu or Ile <220> <221> VARIANT <222> (67)..(67) <223> Xaa at position 67 can be Val or Leu <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> Xaa at position 71 can be Lys or Val <220> <221> VARIANT <222> (73)..(73) <223> Xaa at position 73 can be Asn or Thr <220> <221> VARIANT <222> (78)..(78) <223> Xaa at position 78 can be Val or Phe <220> <221> VARIANT <222> (94)..(94) <223> Xaa at position 94 can be Phe or Tyr <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Xaa Xaa Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Xaa Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Xaa Thr Ile Ser Xaa Asp Xaa Ser Lys Asn Gln Xaa Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Xaa Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVH2.0 <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVH3.0 <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVH4.0 <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVH5.0 <400> 11 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVH6.0 <400> 12 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVH7.0 <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVH9.0 Position 48 can be Leucine or Isoleucine <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVH10.0 <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVH11.0 Position 48 can be Leucine or Isoleucine <400> 16 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVH12.0 Position 48 can be Leucine or Isoleucine <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVH13.0 <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVH14.0 Position 48 can be Leucine or Isoleucine <400> 19 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FW4 4-59 [NCBI entry gi/33583] <400> 20 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized VL region <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 can be Gln or Asp <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 can be Phe or Val <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 can be Leu or Met <220> <221> VARIANT <222> (45)..(45) <223> Xaa at position 45 can be Lys or Leu <220> <221> VARIANT <222> (46)..(46) <223> Xaa at position 46 can be Trp or Leu <220> <221> VARIANT <222> (48)..(48) <223> Xaa at position 48 can be Tyr or Lys <220> <221> VARIANT <222> (70)..(70) <223> Xaa at position 70 can be Tyr or Phe <400> 21 Xaa Xaa Val Xaa Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Xaa Xaa Ile Xaa 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Xaa Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVL2.0Q <400> 22 Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVL3.0Q <400> 23 Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVL4.0Q <400> 24 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVL5.0Q <400> 25 Asp Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizedVL6.0Q <400> 26 Gln Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile 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Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 53 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain anti-VLA2 IgG1 E269D/S324N <400> 53 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Asp Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 54 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain anti-VLA2 IgG1 S298A/S324N <400> 54 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 55 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain anti-VLA2 IgG1 E269D/S298A/S324N <400> 55 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Asp Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 56 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain anti-VLA2 IgG4 <400> 56 Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 57 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain anti-VLA2 IgG4 <400> 57 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445

Claims (58)

  1. 모 항체의 아미노산 위치 269의 글루타메이트를 아스파르테이트로 대체한 아미노산 치환 E269D, 모 항체의 아미노산 위치 298의 세린을 알라닌으로 대체한 아미노산 치환 S298A, 및 모 항체의 아미노산 위치 324의 세린을 아스파라긴으로 대체한 아미노산 치환 S324N의 아미노산 치환들을 포함하는 변이체 사람 IgG Fc 부위를 포함하는 항체로서,
    여기서 아미노산 위치의 넘버링은 카바트 (Kabat)에서와 같은 EU 인덱스 넘버링에 따른 것이고,
    상기 항체가 모 항체에 비해 향상된 보체 의존적 세포독성(CDC)과 향상된 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 발휘하는 것인, 변이체 사람 IgG Fc 부위를 포함하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가,
    a) 아미노산 서열 GFSLTNYGIH(서열 번호:1)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 VIWARGFTNYNSALMS(서열 번호:2)을 포함하는 HCDR2 및 아미노산 서열 ANDGVYYAMDY(서열 번호:3)을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 부위; 및
    b) 아미노산 서열 SAQSSVNYIH(서열 번호:4)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 DTSKLAS(서열 번호:5)을 포함하는 LCDR2 및 아미노산 서열 QQWTTNPLT(서열 번호:6)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 부위를 추가로 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전한 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 43의 변이체 Fc 부위를 포함하는, 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 8-19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위를 포함하는, 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 중쇄 가변 부위가 아미노산 서열 WGQGTLVTVSS(서열 번호:20)을 포함하는 골격 4 (FW4) 부위를 추가로 포함하는, 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 22-33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는, 항체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 경쇄 가변 부위가 아미노산 서열 FGQGTKVEIK(서열 번호: 34)을 포함하는 골격 4 (FW4) 부위를 추가로 포함하는, 항체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체가, 서열 번호: 55 및 서열번호: 56의 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함하는, 항체.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 분리된 핵산.
  11. 제10항의 핵산을 포함하는 벡터.
  12. 제10항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  13. 제11항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 제2항의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 편평 세포 암, 폐암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막의 암, 간세포성 암, 위장암, 위암, 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁 내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 신세포암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 다양한 종류의 두경부암, B-세포 림프종, 낮은 등급의 소포성 비호지킨 림프종(NHL), 소림프구성(SL) NHL, 중간 등급의 소포성 NHL, 중간 등급의 미만성 NHL, 높은 등급의 면역아세포성 NHL, 높은 등급의 림프아구성 NHL, 높은 등급의 소 비균열 세포 NHL, 큰 종양 NHL (bulky disease NHL), 맨틀 세포 림프종, AIDS-관련 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 모발상 세포 백혈병, 만성 골수아세포성 백혈병, 장기 이식 후 림프증식성 질환(PTLD), 모반증과 관련된 비정상적 혈관 증식, 뇌종양과 관련된 부종, 메이그스 증후군, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 섬유육종, 골육종, 표피양 암종, 전이성 유방암, 전이성 결장직장암, 및 전이성 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료하기 위한 조성물.
  15. 제2항의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 염증성 장 질환, 크론 병, 궤양성 대장염, 이식에 대한 반응, 시신경염, 척수 손상, 류머티즘성 관절염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 실험성 자가면역 뇌척수염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 유년 발병형 당뇨병, 당뇨 망막병증, 노화성 황반 변성, 심장혈관 질환 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환을 치료하기 위한 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 조성물이, (a) 혈소판 활성화, (b) 혈소판 응집, (c) 순환 혈소판 총수의 감소, 및 (d) 출혈 합병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 증상과 관련되지 않는 것인, 조성물.
  17. 제14항의 조성물 및 암의 치료를 위한 설명서(instructions)를 포함하는 키트.
  18. 제15항의 조성물 및 염증성 질환의 치료를 위한 설명서(instructions)를 포함하는 키트.
  19. 제15항에 있어서, 조성물이, (a) 혈소판 활성화, (b) 혈소판 응집, (c) 순환 혈소판 총수의 감소, 및 (d) 출혈 합병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 증상과 관련되지 않는 것인, 조성물.
  20. 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위, 인간 경쇄 불변 부위 및 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위를 포함하는 인간화 항-α2 인테그린 항체로서, 상기 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 부위가 인간 IgG1 Fc 부위에 대한 아미노산 변형을 포함하는 변이체 인간 IgG1 Fc 부위를 포함하고, 이때 상기 아미노산 변형이 E269D, S298A 및 S324N의 아미노산 치환들이고, 상기 항체가 모 인간화 항-α2 인테그린 항체에 비해 향상된 보체 의존적 세포독성(CDC) 또는 향상된 CDC 및 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 발휘하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제20항에 있어서, 인간화 항-α2 인테그린 항체가 서열 번호: 43의 변이체 인간 IgG1 Fc 부위를 포함하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체.
  24. 제20항에 있어서, 상기 중쇄 가변 부위가 서열 번호: 8-19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 중쇄 가변 부위가 아미노산 서열 WGQGTLVTVSS(서열 번호:20)을 포함하는 골격 4 (FW4) 부위를 추가로 포함하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체.
  26. 제20항에 있어서, 상기 경쇄 가변 부위가 서열 번호: 22-33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체.
  27. 제26항에 있어서, 상기 경쇄 가변 부위가 아미노산 서열 FGQGTKVEIK(서열 번호: 34)을 포함하는 골격 4 (FW4) 부위를 추가로 포함하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체.
  28. 제20항에 있어서, 상기 항체가, 서열 번호: 55 및 서열번호: 56의 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체.
  29. 제20항에 있어서, 상기 항체가,
    a) 아미노산 서열 GFSLTNYGIH(서열 번호:1)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 VIWARGFTNYNSALMS(서열 번호:2)을 포함하는 HCDR2 및 아미노산 서열 ANDGVYYAMDY(서열 번호:3)을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 부위; 및
    b) 아미노산 서열 SAQSSVNYIH(서열 번호:4)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 DTSKLAS(서열 번호:5)을 포함하는 LCDR2 및 아미노산 서열 QQWTTNPLT(서열 번호:6)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 부위를 추가로 포함하는, 인간화 항-α2 인테그린 항체.
  30. 삭제
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  44. 제20항의 항체를 암호화하는 분리된 핵산.
  45. 제44항의 핵산을 포함하는 벡터.
  46. 제44항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  47. 제20항의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 편평 세포 암, 폐암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막의 암, 간세포성 암, 위장암, 위암, 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁 내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 신세포암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 다양한 종류의 두경부암, B-세포 림프종, 낮은 등급의 소포성 비호지킨 림프종(NHL), 소림프구성(SL) NHL, 중간 등급의 소포성 NHL, 중간 등급의 미만성 NHL, 높은 등급의 면역아세포성 NHL, 높은 등급의 림프아구성 NHL, 높은 등급의 소 비균열 세포 NHL, 큰 종양 NHL (bulky disease NHL), 맨틀 세포 림프종, AIDS-관련 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 모발상 세포 백혈병, 만성 골수아세포성 백혈병, 장기 이식 후 림프증식성 질환(PTLD), 모반증과 관련된 비정상적 혈관 증식, 뇌종양과 관련된 부종, 메이그스 증후군, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 섬유육종, 골육종, 표피양 암종, 전이성 유방암, 전이성 결장직장암, 및 전이성 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료하기 위한 조성물.
  48. 제20항의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 염증성 장 질환, 크론 병, 궤양성 대장염, 이식에 대한 반응, 시신경염, 척수 손상, 류머티즘성 관절염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 실험성 자가면역 뇌척수염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 유년 발병형 당뇨병, 당뇨 망막병증, 노화성 황반 변성, 심장혈관 질환 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환을 치료하기 위한 조성물.
  49. 제47항에 있어서, 조성물이, (a) 혈소판 활성화, (b) 혈소판 응집, (c) 순환 혈소판 총수의 감소, 및 (d) 출혈 합병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 증상과 관련되지 않는 것인, 조성물.
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