CN108929377B

CN108929377B - Cd40突变体及其在弥漫性大b淋巴瘤的治疗中的应用

Info

Publication number: CN108929377B
Application number: CN201710367546.4A
Authority: CN
Inventors: 张笑人; 李玲玲
Original assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Priority date: 2017-05-23
Filing date: 2017-05-23
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2037-05-23
Also published as: CN108929377A

Abstract

本发明涉及CD40突变体及其在弥漫性大B淋巴瘤的治疗中的应用。本发明揭示了针对人CD40蛋白进行糖基化位点突变的蛋白，所述的突变蛋白不仅易于重组表达，表达效率高，而且对于弥漫性大B淋巴瘤(DLBCL)治疗有疗效。

Description

CD40突变体及其在弥漫性大B淋巴瘤的治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及CD40突变体及其在弥漫性大B淋巴瘤的治疗中的应用。

背景技术

CD40(Bp50)，肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，是与T细胞和B细胞功能相关的一种表面抗原，表达于B细胞、胸腺上皮细胞、活化的单核/巨噬细胞、树突状细胞和一些肿瘤细胞系，如肝癌细胞系HepG2、黑色素瘤细胞系HS294T等。CD40信号参与多种生物学过程，对人体健康发展和监测中发挥重大作用。

CD40除了在自身免疫病中发挥疗效，其在B淋巴瘤中的功效也愈益显出。已经有研究证明CD40可直接或间接地参与到B淋巴瘤相关信号通路中，从而调控B细胞的增殖分化，可削弱肿瘤细胞的生存能力以抑制其发生发展，如直接通过结合作用影响肿瘤免疫，亦或通过增强抗原呈递和影响T细胞刺激能力，或通过影响络氨酸磷酸化或去磷酸化作用影响相关蛋白的激活或者抑制作用来影响B细胞系，又或者通过影响Bcl6、ATR等因子影响基因转录等作用间接地影响B淋巴细胞的增殖分化，从而影响B淋巴瘤的发生发展。

此外，CD40-CD40L信号通路研究越渐火热，其中研究最多的是阻断该信号通路。如通过外加CD40蛋白，使其与体内CD40蛋白竞争结合CD40L治疗疾病。有研究报道，CD40-CD40L是AD发病早期的检测方向。另外，近些年研究火热的免疫治疗都需要CD40-CD40L作用基础，克服临床上免疫抑制肿瘤微环境，而且肿瘤的消除也是需要CD40-CD40L信号通路作用，从而更好地针对性提高免疫治疗效果。Wang Jae Lee等研究者发现，乳腺癌细胞和激活性T细胞间CD40-CD40L相互作用，TGF-β生产和Th17细胞的分化，促进乳腺癌细胞的增殖。另外，有研究发现CD40激动动机或者拮抗剂可以抑制B淋巴瘤的生存发展，所以能够为临床治疗提供新的策略。改变细胞表面的糖基化作用可以改变相关的黏附作用，从而可以促进恶性淋巴瘤的凋亡。

弥漫性大B淋巴瘤(DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤(NHL)亚型，约占所有成人NHL的30-40％，可发生于各个年龄段，多见于老年人，中位年龄60岁；男性比女性略多。DLBCL占临床上“侵袭性”或“中高度恶性”淋巴瘤的大多数病例，大约40％的DLBCL患者在诊断后由于复发或者难治导致平均生命期不超过5年。另外，中国的DLBCL发病率更高一些。所以针对DLBCL的特异性治疗的研究具有非常重要的意义。据有关研究报道，DLBCL可能是与先天遗传、细胞凋亡机制的失控以及DNA修复缺陷有关，但是目前关于DLBCL具体病因仍不清楚。过去的二十年里，临床上DLBCL治疗效果明显改善，主要是由于传统的利妥昔单抗化疗作为初始治疗和细化高剂量化疗和字体干细胞移植以治疗DLBCL策略。但是此两种治疗方案中都存在DLBCL治疗的耐药性问题，从而影响了相关药物的临床应用，所以新的治疗策略亟待提出。近期研究发现，CD40在DLBCL中发挥重要作用，而且在DLBCL中，高表达CD40患者的寿命相对低表达CD40患者的平均寿命高。这也使得CD40蛋白可能作为治疗DLBCL的一个靶点。

因此，本领域有必要重组表达和改造CD40蛋白，以深入研究其应用，例如其在弥漫性大B淋巴瘤的治疗中的应用，开发有用的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供CD40突变体及其在弥漫性大B淋巴瘤的治疗中的应用。

在本发明的第一方面，提供人CD40蛋白突变体，所述蛋白突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，第133位发生突变；或第160位发生突变；或第133位和第160位同时发生突变。

在一个优选例中，所述的突变体中，第133位突变为Ala和/或第160位突变为Ala。

在另一优选例中，所述的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7或SEQID NO:9所示。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的突变体。

在一个优选例中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的人CD40蛋白突变体的方法，包括步骤：

(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离所述的人CD40蛋白突变体。

在一个优选例中，所述的宿主细胞是毕赤酵母细胞，在发酵罐规模发酵时，步骤(1)中，通过流加甘油补充碳源，待OD600值200±50时(较佳地，200±30时；更佳地200±20时)，停止补加甘油，待甘油耗净时，补加甲醇进行诱导表达，以初始发酵液1L计，先以0.133±0.6ml/min的速度补加，在3-5小时内逐渐提高补加速度至1.33±0.2ml/min的速度；诱导15-24小时(较佳地为16-20小时)。

在另一优选例中，甲醇诱导表达时，先以0.133±0.6ml/min的速度补加，每半小时调节1次，至4小时时达到1.33±0.2ml/min的速度。

在另一优选例中，补加甲醇进行诱导表达时，以初始发酵液3L计，先以0.4±0.2ml/min的速度补加，在3-5小时内逐渐提高补加速度至4±0.5ml/min的速度；诱导15-24小时(较佳地为16-20小时)。

在另一优选例中，甲醇诱导表达时，先以0.4±0.2ml/min的速度补加，每半小时调节1次，至4小时时达到4±0.5ml/min的速度。

在另一优选例中，步骤(2)中，采用超滤、分子筛和例子交换的方法进行纯化，分离获得所述的人CD40蛋白突变体。

在本发明的另一方面，提供所述的人CD40蛋白突变体的用途，用于制备缓解或治疗弥漫性大B淋巴瘤的组合物。

在一个优选例中，所述的人CD40蛋白突变体与体内的CD40竞争结合CD40配体，影响下游TNFα基因的表达，从而在疾病缓解或治疗上起到作用。

在本发明的另一方面，提供一种提高人CD40蛋白的表达水平以及提高人CD40蛋白与配体结合能力的方法，所述方法包括：将人CD40蛋白的氨基酸序列进行突变，对应于SEQID NO:1，对第133位进行突变；或对第160位进行突变；或对第133位和第160位同时进行突变。

在一个优选例中，将其第133位突变为Ala和/或第160位突变为Ala。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、CD40-1蛋白的纯化分析。

A.凝胶过滤层析图：Y轴为OD280nm吸收值，X轴为流过层析柱液体体积/ml；蓝色线代表OD280nm吸收值，红色线代表OD254nm吸收值。

B.SDS-PAGE考马斯亮蓝分析图：纯化过程中各个峰的蛋白表达情况。

C.SDS-PAGE考马斯亮蓝分析图：纯化的第5个吸收峰，每个接收管内的蛋白表达情况。

D.SDS-PAGE考马斯亮蓝、蛋白免疫印迹分析图：CD40-1蛋白纯化过程中蛋白表达情况图。

图2、CD40-2蛋白的表达纯化。

B.SDS-PAGE考马斯亮蓝分析图：摇瓶过程中蛋白的表达情况以及纯化过程中各个峰的蛋白表达情况。

C.SDS-PAGE蛋白免疫印迹分析图：CD40-2蛋白纯化过程中蛋白表达情况图。

图3、CD40-G28-5、CD40-CD40Ligand系统探究。

A.CD40-G28-5：实时定量PCR分析CD40-G28-5最佳作用时间(time/h)和G28-5及蛋白的最适用量(ug/ml)。

B.CD40-CD40L：实时定量PCR分析CD40-CD40L最佳作用时间(time/h)和CD40L及蛋白的最适用量(ug/ml)。

图4、CD40及其糖基化位点突变蛋白功能比较分析。

A.SDS-PAGE考马斯亮蓝分析图：CD40及其糖基化位点突变蛋白定量分析。

B.蛋白免疫印迹实验。

C.实时定量分析：定量后的CD40-G28-5间的功能比较分析。

D.Octet分析比较CD40-CD40ligand间亲和力。

图5、CD40及其糖基化位点突变蛋白在PDX疾病中治疗应用。

图6、甲醇诱导后，蛋白表达情况。

图7、甲醇诱导后，SDS-PAGE考马斯亮蓝染色实验的结果。

图8、不同甲醇浓度梯度下，蛋白的表达情况。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了针对人CD40蛋白进行糖基化位点突变的蛋白，所述的突变蛋白不仅易于重组表达，表达效率高，而且对于弥漫性大B淋巴瘤(DLBCL)治疗有疗效。

如本文所用，除非另外说明，所述的“人CD40蛋白的突变体”、“突变型人CD40蛋白”可互换使用，是指对应于野生型人CD40蛋白(如SEQ ID NO:1)，第133位发生突变，或第160位发生突变，或第133位和第160位同时发生突变。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的人CD40蛋白突变体”是指人CD40蛋白突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化人CD40蛋白突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，“重组的”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。

本发明的蛋白可以是重组蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括所述人CD40蛋白突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的人CD40蛋白突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的人CD40蛋白突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，对应于野生型人CD40蛋白，第133位发生突变，或第160位发生突变，或第133位和第160位同时发生突变，也即这些位点上的突变是确定发生的。

在本发明中，术语“人CD40蛋白突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人CD40蛋白突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，对应于野生型人CD40蛋白，第133位发生突变，或第160位发生突变，或第133位和第160位同时发生突变，也即这些位点上的突变是确定发生的。

本发明还提供了编码本发明人CD40蛋白突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

在本发明的优选实施方式中，提供了密码子优化的人CD40蛋白突变体多核苷酸，具有SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。当应用于重组表达时，所述的密码子优化的人CD40蛋白突变体多核苷酸在表达效率上更为理想。

本发明的人CD40蛋白突变体核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或人CD40蛋白突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的人CD40蛋白突变体。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人CD40蛋白突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人CD40蛋白突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人CD40蛋白突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。在本发明的优选实施方式中，采用的宿主细胞是酵母细胞，较佳地为毕赤酵母细胞。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在本发明的优选实施例中，所述的宿主细胞是毕赤酵母细胞，本发明人优化了发酵罐规模发酵时的发酵方法：在发酵罐规模发酵时，步骤(1)中，通过流加甘油补充碳源，待OD600值200±50时(较佳地，200±30时；更佳地200±20时)，停止补加甘油，待甘油耗净时，补加甲醇进行诱导表达，以初始发酵液1L计，先以0.133±0.6ml/min的速度补加，在3-5小时内逐渐提高补加速度至1.33±0.2ml/min的速度；诱导15-24小时(较佳地为16-20小时)。

可以采用多种方法或它们的组合来从发酵液中纯化处本发明的人CD40蛋白突变体，这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。在本发明的优选实施方式中，采用超滤、分子筛和例子交换的方法进行纯化。

弥漫性大B淋巴瘤(DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤(NHL)亚型，约占所有成人NHL的30％-40％，可发生于各个年龄段，男性比女性略多。中国的DLBCL发病率更高一些。所以针对DLBCL的特异性治疗的研究具有非常重要的意义。DLBCL病因复杂，目前临床上主要依赖的治疗策略主要是含利妥昔单抗的免疫化学疗法(R-CHOP或R-CHOP样方案)。但是，这两种治疗方案也存在耐药性和临床风险等问题。近些年研究报道，CD40-CD40在DLBCL中发挥重要作用。这也使得CD40蛋白可能作为治疗DLBCL的一个靶点。

本发明中，通过体外实验，本发明人发现，本发明的人CD40突变蛋白可以与体内的CD40竞争结合其配体CD40L，从而可以在疾病治疗上起到作用。在体内，这种竞争性结合可以抑制下游的下游TNFα基因的表达，影响DLBCL疾病的进展。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料和方法

1.CD40-N突变

1.1 CD40-N胞外段氨基酸序列

根据CD40-N蛋白的胞外段氨基酸序列，方框标记的氨基酸代表的是CD40-CD40Ligand结合位点，另外两个下划线标记的氨基酸代表的是糖基化位点。也即：CD40-N胞外段含有两个糖基化位点。

EPPTACREKQ

LINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDT

NR ETHCHQHK

CDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEG

HCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLR(SEQ ID NO:1)

1.2CD40-N毕赤酵母密码子优化

根据1.1的氨基酸序列，Genbank上给出了相应的CD40基因序列。本发明人作出了前期CD40-N基因序列优化工作，如下所示：

优化前(524bp，SEQ ID NO:2)：

GAGAACCACCCACTGCATGCAGAGAAAAACAGTACCTAATAAACAGTCAGTGCTGTTCTTTGTGCCAGCCAGGACAGAAACTGGTGAGTGACTGCACAGAGTTCACTGAAACGGAATGCCTTCCTTGCGGTGAAAGCGAATTCCTAGACACCTGGAACAGAGAGACACACTGCCACCAGCACAAATACTGCGACCCCAACCTAGGGCTTCGGGTCCAGCAGAAGGGCACCTCAGAAACAGACACCATCTGCACCTGTGAAGAAGGCTGGCACTGTACGAGTGAGGCCTGTGAGAGCTGTGTCCTGCACCGCTCATGCTCGCCCGGCTTTGGGGTCAAGCAGATTGCTACAGGGGTTTCTGATACCATCTGCGAGCCCTGCCCAGTCGGCTTCTTCTCCAATGTGTCATCTGCTTTCGAAAAATGTCACCCTTGGACAAGCTGTGAGACCAAAGACCTGGTTGTGCAACAGGCAGGCACAAACAAGACTGATGTTGTCTGTGGTCCCCAGGATCGGCTGAGATAA

优化后(524bp，SEQ ID NO:3)：

GAGAGCCACCCACAGCTTGCAGAGAGAAACAATATCTGATTAACTCCCAGTGTTGCTCTCTGTGCCAACCAGGTCAGAAATTGGTGTCTGATTGCACTGAATTTACCGAGACAGAATGCCTTCCATGCGGCGAATCAGAATTCCTTGATACCTGGAATCGTGAAACTCACTGTCATCAACATAAGTACTGTGATCCTAACTTAGGATTGAGGGTACAGCAAAAGGGAACTTCCGAAACCGACACAATCTGTACTTGTGAGGAGGGTTGGCATTGTACTTCAGAAGCTTGTGAAAGTTGTGTCTTGCACAGATCCTGTTCCCCTGGTTTTGGTGTCAAGCAAATTGCAACGGGTGTCTCTGATACTATATGTGAACCTTGCCCCGTTGGCTTTTTCTCTAACGTTAGTTCTGCCTTCGAGAAGTGTCACCCATGGACTTCATGTGAGACGAAAGATTTAGTTGTTCAGCAAGCTGGAACCAATAAAACAGACGTGGTTTGTGGACCTCAAGACAGACTACGATAA

1.3 CD40-N进一步突变

根据1.1的氨基酸序列以及1.2中优化后的CD40-N基因序列，结合进一步的研究试验，本发明人设计了CD40-N糖基化位点突变序列，并且设计了相对应引物，交由公司进行全基因合成。

CD40-N突变蛋白的基因序列(双下划线标记代表发生突变的碱基)：

CD40-1(522bp，SEQ ID NO:4)：

GAGCCACCCACAGCTTGCAGAGAGAAACAATATCTGATTAACTCCCAGTGTTGCTCTCTGTGCCAACCAGGTCAGAAATTGGTGTCTGATTGCACTGAATTTACCGAGACAGAATGCCTTCCATGCGGCGAATCAGAATTCCTTGATACCTGGAATCGTGAAACTCACTGTCATCAACATAAGTACTGTGATCCTAACTTAGGATTGAGGGTACAGCAAAAGGGAACTTCCGAAACCGACACAATCTGTACTTGTGAGGAGGGTTGGCATTGTACTTCAGAAGCTTGTGAAAGTTGTGTCTTGCACAGATCCTGTTCCCCTGGTTTTGGTGTCAAGCAAATTGCAACGGGTGTCTCTGATACTATATGTGAACCTTGCCCCGTTGGCTTTTTCTCT

GTTAGTTCTGCCTTCGAGAAGTGTCACCCATGGACTTCATGTGAGACGAAAGATTTAGTTGTTCAGCAAGCTGGAACCAATAAAACAGACGTGGTTTGTGGACCTCAAGACAGACTACGATAA

其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:5，方框内为突变氨基酸)：

EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFS

VSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLR

CD40-2(SEQ ID NO:6，522bp)：

GAGCCACCCACAGCTTGCAGAGAGAAACAATATCTGATTAACTCCCAGTGTTGCTCTCTGTGCCAACCAGGTCAGAAATTGGTGTCTGATTGCACTGAATTTACCGAGACAGAATGCCTTCCATGCGGCGAATCAGAATTCCTTGATACCTGGAATCGTGAAACTCACTGTCATCAACATAAGTACTGTGATCCTAACTTAGGATTGAGGGTACAGCAAAAGGGAACTTCCGAAACCGACACAATCTGTACTTGTGAGGAGGGTTGGCATTGTACTTCAGAAGCTTGTGAAAGTTGTGTCTTGCACAGATCCTGTTCCCCTGGTTTTGGTGTCAAGCAAATTGCAACGGGTGTCTCTGATACTATATGTGAACCTTGCCCCGTTGGCTTTTTCTCTAACGTTAGTTCTGCCTTCGAGAAGTGTCACCCATGGACTTCATGTGAGACGAAAGATTTAGTTGTTCAGCAAGCTGGAACC

AAAACAGACGTGGTTTGTGGACCTCAAGACAGACTACGATAA

其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)：

EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGT

KTDVVCGPQDRLR

CD40-(1+2)(SEQ ID NO:8，522bp)：

GTTAGTTCTGCCTTCGAGAAGTGTCACCCATGGACTTCATGTGAGACGAAAGATTTAGTTGTTCAGCAAGCTGGAACC

AAAACAGACGTGGTTTGTGGACCTCAAGACAGACTACGATAA

其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)：

VSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGT

KTDVVCGPQDRLR

2.CD40-2基因克隆

2.1将培养RKO细胞裂解后抽提RNA，反转录获得cDNA文库，为CD40突变蛋白基因克隆提供模板。

2.2RKO细胞RNA抽提

抽提RKO细胞RNA采取的方法是实验室常用的Trizol法。

2.3mRNA反转录成cDNA：

将2.2中的RNA经过Nanodrop测量过浓度之后，反转录成cDNA，实验室用的方法是使用Transcript First Strand Synthesis Supermix(TransGene Biotech)。反转录产物cDNA用于PCR和或置于-80℃储存。

2.4突变蛋白基因引物设计：

第一个位点突变(AACGTTAGT)引物：

5’→3’

N-G1F：GTTGGCTTTTTCTCT

GTTAGTTCTGCCTTC(SEQ ID NO:10)；

N-G1R：GAAGGCAGAACTAACCTCAGAGAAAAAGGCCAA(SEQ ID NO:11)；

第二个位点突变引物：

5’→3’

N-G2F：CAGCAAGCTGGAACC

AAAACAGACGTGGTT(SEQ ID NO:12)

N-G2R：AACCACGTCTGTTTTCTCGGTTCCAGCTTGCTG(SEQ ID NO:13)

2.5PCR克隆获得CD40-N基因

(1)反应体系：

(2)反应程序：

2.6PCR产物回收

PCR产物先用1％的琼脂糖凝胶电泳(100V)约25min，检测是否有目的条带，然后在紫外下用刀片切下带有目的片段的琼脂糖凝胶并称重，之后的产物回收是依据PCR产物回收试剂盒(Axygen公司)进行。

2.7PCR回收产物、载体pPIC9K用XhoⅠ、NotⅠ进行双酶切

2.8双酶切产物胶回收

将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(100V)约25min，查看是否有目的条带(突变体CD40-2约560bp，pPIC9K约9000bp)以证明酶切成功，然后在紫外下用刀片切下带有目的片段的琼脂糖凝胶并称重，凝胶产物回收依据的是Axygen公司提供的试剂盒，以回收目的条带。

2.9胶回收连接

酶切后的CD40-2以及酶切后的pPIC9K，利用T4DNA连接酶进行连接，获得连接产物。该连接产物为质粒pPIC9K-CD40-N。

2.10转化

将2.9的连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞。

2.11质粒抽提

质粒抽提是依据质粒抽提试剂盒(Axygen公司)。

2.12鉴定

质粒抽提后的DNA用XhoⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定。

3.pPIC9K-CD40-N电转化巴斯德毕赤酵母GS115并筛选获得稳转株

3.1质粒抽提，获得pPIC9K-CD40-N质粒

3.2利用SalⅠ酶切，对pPIC9K-CD40-N进行线性化。

3.3以线性化的pPIC9K-CD40-N电转化毕赤酵母GS115。

3.4筛选G418抗性菌株。

3.5筛选获得的菌株，利用甲醇诱导表达。

3.6表达获得的蛋白，进行免疫蛋白印迹(Western Blot)鉴定，以鉴定该稳转株能表达获得符合预期的突变蛋白。

4.pPIC9K-CD40(P)-N突变菌株高密度发酵

蛋白发酵纯化过程如下：

4.1前期准备阶段：

A.G50柱子：

(1)20％～70％的酒精浸泡填料→水洗两次→装柱。(2)加盖。(3)验漏。(4)测流速。

B.菌液准备：

第一天将菌种在YPD培养基中划线培养，30℃培养箱中静置培养；

第二天挑取YPD培养基中单克隆于50ml离心管中培养，管中约10mlYPD液体培养基，振荡培养：220rpm/min，30℃，培养过夜，记为一级种子液；

第三天取一级种子液5ml于200mlYPD培养基中，振荡培养：220rpm/min，30℃，培养过夜，记为二级种子液。

C.发酵罐

(1)试剂准备：

准备BSM培养基3L；

500×PTM1不少于10ml(用0.22um滤器过滤除菌)；

50％甘油灭菌不少于200ml；

消泡剂不少于100ml；

BSM无机盐培养基(1L)：

补水至1L，121℃1.5kg/cm2高温灭菌20分钟

500×PTM1溶液(1L)

0.22um滤器过滤除菌。

(2)洗罐：整个罐子需要用ddH₂O冲洗干净，每个管道需要利用注射器装满ddH₂O水冲洗4～5次，并要检查罐上转子可否转动。

(3)罐子验漏。

(4)灭菌：121℃，20min。

4.2发酵阶段

A.发酵

在发酵罐中装入3L的发酵液，将OD600值在2-8之间的二级种子液接种到发酵罐内。

①接种之后打开空气压缩机和O₂阀门，设置dO₂为35％；

②之后每隔4小时测量并记录一次OD600值；

③当OD值接近65时，半小时测一次OD600值，若OD600值波动平缓，补加50％甘油，速度调为20ml/min，模式调为Manual，补料约30min，测OD600值约100～110之间，停止补加甘油，继续培养；

④每半小时测一次OD600值，待甘油耗尽(OD600值约200左右，半小时内OD600值变化不明显)补加甲醇诱导(补加之前甲醇中加入1ml的PTM1)，记下诱导时的OD600值，并留样，记为0h；

⑤从补加甲醇开始的4小时内调节甲醇浓度，先以0.4ml/min的速度补加，每半小时调节1次，至4小时时达到4ml/min的速度，模式调为：Manual；

⑥待甲醇浓度调为4ml/min后，每隔4小时测一次OD600值，并留样，做好相应时间标记(n h，n＝4,8,12……)；

⑦当诱导时间达到约16-20小时后，下罐。

B.下罐

(1)离心机提前预冷，收集发酵液并记下体积，离心：4℃，400rpm/min，40min；

(2)收集上清并记下体积，留样，记为上清，超滤；

C.超滤

(1)超滤膜先前需放置在75％酒精中浸泡保存；

(2)机器装上滤膜后需先过ddH₂O 5L，调节ΔP为10，HIP为25，LOP为0，流速8-14％；

(3)开启流水阀门放出样品槽中剩余的水，放完水后关闭流水阀门，在样品槽中直接倒入样品(样品槽外周用冰袋裹住)；

(4)收样

①待样品液面低于警报值时，收集样品，记下体积；

收样方法：a.开启流水阀门，收集样品；

b.打开连接口管道，收集管道口中样品；

②留样：超滤滤出液和超滤后。

D.分子筛

(1)上机平衡分子筛柱子(Tris-Hcl PH7.4平衡缓冲液)，设置警报压力为0.95-1MPa，打开UV开关；

(2)待OD280稳定后UV调0，上样(注意上样置于冰上上样，流速根据警报压力调节)；

(3)上样结束后继续用Tris-Hcl PH7.4平衡缓冲液洗脱，待OD280≥50时开始收样(冰上收样)，直到OD280低于50时停止收样，记下体积并留样，记为分子筛后；

E.Q-Sephase离子交换柱：

(1)100％B泵bypass，过1M NaOH Tris-Hcl，10min，5ml、min；

(2)0％B泵Tris-Hcl PH7.4平衡缓冲液平衡Q-Sephase离子交换柱，当OD280稳定时UV调0，此时即可上样；

(3)上样结束后继续，当OD280稳定时开始洗脱；

洗脱方式OD2：①初始：Target：20％B，time：80min；②待80≥10且上升较快时，停在当前B泵离子强度A，time设为0，并收集当前流出样(冰上收集)，做好标记；③待OD280≤10时停止收样，继续增加离子强度，即Target：20％B，time＝80-4×A；重复步骤②③。

4.3CD40-N突变蛋白鉴定

整个发酵纯化过程得到的蛋白需要鉴定是否为所需要的蛋白，因此需要考马斯亮蓝染色和免疫蛋白印迹双向证明。

鉴定之前，需将之前收集的各个蛋白取80ul加上20ul 5×loading，做好EP管标记，然后在100℃恒温加热器煮10min；

(1)考马斯亮蓝染色

将煮好的蛋白各取15ul跑蛋白胶，然后用考马斯亮蓝染色，检测发酵各个阶段CD40-2蛋白的表达情况及其纯度问题。

(2)免疫蛋白印迹

(1)中已经初步证明本发明人所需蛋白表达情况和纯度，下一步用蛋白印迹再一次准确证明发酵纯化过程蛋白的表达量的情况。

4.4CD40-N突变蛋白功能验证

4.4.1Q-PCR体外功能验证

得到所需突变蛋白后，进行应用前首先体外验证蛋白功能。根据相关文献报道以及本实验室的前期工作基础，验证功能选择的是BJAB细胞系，然后用Q-PCR方式检测TNFa基因的表达情况。

4.4.1.1BJAB细胞验证实验系统条件优化

(1)CD40蛋白激动剂：G28-5

在进行蛋白功能验证之前，本发明人优化了前期实验室用的系统条件：依据单一变量实验原则，本发明人摸索出了最适的激动剂的终浓度为：1.0ug/ml；刺激的最优时间为：0.5h；BJAB细胞数为：1～2×10⁶/ml适宜的CD40-N蛋白终浓度为：≥0.4ug/ml。

(2)CD40蛋白激动剂：CD40ligand

同样的，本发明人需要摸索CD40-CD40ligand反应的最优条件，以证明签署发酵纯化蛋白的功能。由于体内是没有G28-5，后者是体外功能验证CD40蛋白激动剂替代物的，因此如果需要验证蛋白功能需要证明CD40-CD40ligand之间有作用的。

具体的摸索过程同上述(1)，也是通过遵循单一变量原则，最终的优化条件为：CD40ligand终浓度为：1.0ug/ml；刺激的最优时间为：0.5h；BJAB细胞数为：1～2×10⁶/ml，适宜的CD40-N蛋白终浓度为：≥0.4ug/ml。

4.4.1.2CD40-N突变蛋白功能验证

在4.4.1.1中优化的条件下，进行功能验证工作，分为Q-PCR实验和流式分析，具体过程如下：

4.4.1.2.1Q-PCR水平验证

A.BJAB细胞系RNA抽提：

(1)将复苏后并且状态好的BJAB细胞系进行计数并铺板：12孔板，每孔1ml，BJAB细胞数为1～2×10⁶/m，轻轻摇荡混匀置于37℃恒温细胞培养箱中培养；

(2)12h后加刺激：

Con	CD40L	G28-5
			CD40L+P1	CD40L+P2	CD40L+P3
G28-5+P1	G28-5+P2	G28-5+P3

注：CD40L：CD40ligand；P1、P2、P3代表发酵时各个峰的蛋白。

(3)0.5h后收细胞：将各个孔的细胞转移到相应标记的EP管中；

(4)离心：500g，5min，4℃；

(5)弃上清，各个管中分别加入预冷的1×PBS洗一遍，离心：500g，5min，4℃；

(6)弃上清，空离：500g，2min，4℃；

(7)小心弃去上清，各管分别加入1ml Trizol，并吹匀；

(8)各管分别加入200ml三氯甲烷，Vortex振荡混匀，室温静置5min；

(9)离心：12000g，15min，4℃；

(10)小心吸取上层液体约600ul转移到新的相应标记的EP管中，并加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min；

(11)离心：12000g，10min，4℃；

(12)弃去上清，加入1ml预冷的DEPC-75％乙醇；

(13)离心：7600g，5min，4℃；

(14)弃去上清，置于已灭菌的超净台风干10min；

(15)加入适量的DEPC水(约50-60ul)，混匀并用Nanodrop测定浓度。

B.反转录

将A中抽提的RNA进行反转录，使用的方法是去除g-DNA法，具体过程如下：

(1)去除g-DNA：

反应体系：

处理：42℃水浴锅加热5min。

(2)反转录：

反应体系：

温度设置：

C.Q-PCR

将反转录cDNA稀释10倍(加180ul ddH₂O)，Q-PCR用96孔板，反应体系如下：

Q-PCR程序：

4.4.1.2.2流式分析

流式分析结果建立于弥漫性大B淋巴瘤细胞(DLBCL PDX)和小鼠骨髓来源干细胞(BMSC)共培养结果。在取瘤子前三天需要在24孔板一定孔内铺好BMSC细胞；取瘤内淋巴细胞后三天收细胞，并做流式检测分析，具体布局如下：

共培养体系：(CO：Co-culture；P：蛋白样品)

CO-PDX	CO-PDC+P	PDX	PDC+P
				CO-PDX	CO-PDC+P	PDX	PDC+P
CO-PDX	CO-PDC+P	PDX	PDC+P

其中每孔终体积为1ml，PDX数量：3×10⁵；细胞数量比BMSC：PDC＝1：5。

4.4.1.3蛋白冻干

根据4.4.1.2中的检测结果，得知哪些峰的蛋白具有功能，下一步就是体内功能验证。但是体内用的蛋白较多，而且要求浓度较高。因此需要将具有功能的蛋白进行冷真空冻干，之后溶解再做实验。冻干程序遵循冻干机上指示操作。

4.4.1.4冻干蛋白功能验证

为检测冻干对蛋白的功能是否有影响，在进行体内功能验证之前需再次做一次Q-PCR进行验证。因为体内实验对照组用的是1×PBS，所以冻干的蛋白需用1×PBS溶解，功能验证具体过程同4.4.1.2。

4.4.1.5蛋白测定浓度

蛋白体内实验需要定量，因此冻干蛋白稀释后需要测定浓度，常用方法就是BCA法，具体过程如下：

(1)制BCA工作液：先将BCA摇晃混匀，根据样品数量和标准品数量，按照BCA：CuSO₄约50:1的比例制成BCA工作液；

(2)稀释标准品：实验室用的标准品BSA(10mg/ml，-20℃保存)取5ul用PBS稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml；

(3)加标准品：将配好的标准品(0.5mg/ml)按照0ul、2ul、4ul、6ul、8ul、12ul、16ul、20ul分别加到96孔平底板中，然后将每个加有标准品的孔内加PBS补足至20ul；

(4)加样品：加适当体积样品到96孔板中的样品孔中，并用PBS补足至20ul(即：将蛋白样品做适当稀释，多做几个梯度，如做2、4、8倍等稀释)；

(5)在各个加油样品和标准品的孔内加入200ul BCA标准工作液，然后将96孔板置于37℃恒温箱中保温20-25min；

(6)将保温后的96孔板拿出，待液体降至室温后，在酶标仪上测定A562nm波长的吸光值，最后根据标准曲线计算出蛋白浓度，即为样品蛋白定量。

II.实施例

实施例1、CD40-1蛋白的纯化表达分析

根据结果，本发明人得知CD40-1蛋白大小约为25KD。之后对所获得的相关表达菌株进行摇瓶纯化。经过挑菌划平板得到一级种子液。之后按照一级种子液：BMGY培养基(1.8L)约为1:500的比例接菌培养(30℃，220rpm)进行甘油诱导。待OD值介于2-6时，将BMGY培养基换成等体积的BMMY培养基，加甲醇诱导培养(甲醇浓度为1％)，每24h加一次甲醇(1％)，并留样备用。甲醇诱导96小时后，收集菌液并离心(4℃，8000rpm，30min)，然后收集上清。收集上清后使用3KD超滤膜进行超滤，收集超滤后截留的液体并用AKTA系统进行Sephadex G-50凝胶层析(图1，A)，收集各紫外吸收峰下的样品约1L(图1，A)并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后进行考马斯亮蓝染色查看分析各个峰下蛋白的表达情况(图1，D)。由1D结果显示，第5号峰下收的蛋白即为所需要的CD40-1蛋白。然后将含有目的蛋白的样品进行Q-Sepharose-FF阴离子交换柱纯化，0-1.0M NaCl线性洗脱，目的蛋白组分在在第5个峰处被收集获得(图1，A)，共5管，每管约50ml，共约300ml。离子交换后得到的蛋白样品需在1×PBS中进行透析(4℃)，4小时换液一次，收集透析后的蛋白。分子筛、离子交换以及透析后获得的蛋白样品进行SDS-PAGE考马斯亮蓝染色观察蛋白的表达情况和纯度(图1，B-D)。从结果来看，离子交换的第5号峰内是含目的蛋白的收集峰(图1，B、D)，而且第5号峰内，收集的第2、3管内蛋白浓度较高，纯度较高(图1，C、D)。

实施例2、CD40-2蛋白的纯化表达分析

从CD40-N胞外段蛋白糖基化突变结果，本发明人得知CD40-2蛋白大小约为25KD。之后对所获得的相关表达菌株进行摇瓶纯化。此次比CD40-1多诱导24h，即共诱导120h，而且随着诱导时间的增加蛋白表达越多，但是96h后杂蛋白也表达的多(图2，B)，因此摇瓶纯化最好不要超过96小时。在纯化过程中，即样品经过分子筛和离子交换柱的过程，本发明人得到6个收集峰样品(图2，A)，而且也是第5个收集峰中含有目的蛋白(图2，B)。另外，经过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和蛋白免疫印迹实验，本发明人知道第5个收集峰内，本发明人收集的第2、3管内蛋白浓度较高，第2管收集的蛋白纯度最高(图2，B、C)。

实施例3、发酵的优化

1、发酵罐水平的甲醇诱导时间

以CD40-(1+2)蛋白为例，当甘油耗尽、补加甲醇诱导时，采用：先以0.4ml/min的速度补加，每半小时调节1次，至4小时时达到4ml/min的速度，保持该速度不变，在不同的时间点，检测蛋白表达情况。

结果如图6所示。从图可以看出：甲醇诱导16-20h时，蛋白表达达到相对很大，约20小时蛋白表达最大。鉴于甲醇的积累会对菌体造成影响，因此为杜绝菌体突变和节约时间，本发明人将发酵中甲醇诱导时间优化为16-20h。

与CD40-(1+2)的诱导表达方式类似，CD40-2蛋白的最佳诱导时间亦是16-20h。

可见，与以往的发酵相比，由于密码子优化以及甲醇诱导的优化，发酵时间大大缩短。

2、摇瓶纯化过程中的甲醇诱导时间优化

以CD40-2蛋白为例，本发明人设置一系列甲醇浓度梯度，测定摇瓶纯化过程中的甲醇诱导时间对于发酵产物的影响。

SDS-PAGE考马斯亮蓝染色实验的结果如图7。本发明人发现，随着甲醇浓度的升高，蛋白表达的纯度也就越差。随着甲醇诱导时间的推进，CD40-2蛋白表达的也越多。但是随着甲醇的累积对菌体的伸张繁殖都会造成影响，因此从防止菌体变异造成影响和节约时间成本的角度分析，即摇瓶时甲醇诱导的时间为96-120h。

3、摇瓶发酵过程中的诱导所用的最适甲醇浓度确定

通过设置一系列甲醇浓度梯度，进行摇瓶纯化过程中的诱导所用的最适甲醇浓度确定。

如图8，通过设置一系列甲醇浓度梯度，可以发现随着浓度的升高和时间的推进，1.0％-2％的甲醇可以诱导CD40-2蛋白的表达，在诱导的96h-120h，蛋白表达升高，而这结果再次验证图2中的结果，即摇瓶纯化时间为96-120h。甲醇浓度为1.25％和1.75％时，蛋白表达的较高，而且是随着时间的推进有所升高。但是鉴于甲醇浓度越高，甲醇积累也就越多，而这对菌体生长繁殖有很大影响，甚至会影响蛋白表达和最终纯度，因此，摇瓶过程中甲醇的最适浓度定为1.25％。

实施例3、CD40-G28-5以及CD40-CD40Ligand间亲和力作用系统优化

G28-5蛋白是CD40单克隆抗体，可以与CD40-N蛋白的结合位点特异性结合，特异性激活CD40-N，从而提高TNFα基因的表达。CD40Ligand是CD40-N特异性配体，可以与CD40亲和力结合，从而引发下游信号通路。CD40-CD40L的结合也可以促进下游TNFα基因的表达。

体外实验中，本发明人发现，CD40及其突变蛋白CD40-1及CD40-2可以与体内的CD40进行竞争结合其配体，从而可以在疾病治疗上起到作用。另外，CD40糖基化位点突变蛋白的与G28-5及与CD40Ligand的结合能够不会受到影响(图3)。

比较CD40-N蛋白与其糖基化位点突变蛋白的功能作用，可以在蛋白量一定的情况下，通过实时定量PCR实验比较TNFα基因的表达量进行比较。在进行比较之前，本发明人优化了实验系统，如图3所示。CD40-G28-5体外实验最适条件是：G28-5终浓度为1ug/ml；反应最佳时间是0.5h；CD40蛋白的浓度不低于0.4ug/ml的终浓度最佳(图3，A)。CD40-CD40L优化后的体外实验条件是：CD40Ligand终浓度是1ug/ml；反应的最佳时间亦是0.5h；但是CD40蛋白的终浓度不低于4ug/ml(图3，B)。实验条件优化后，将蛋白浓度调齐，比较蛋白间的作用。

实施例4、CD40-N及其糖基化位点突变蛋白功能比较分析

本实施例中，比较CD40及其糖基化位点突变蛋白间的功能。首先通过SDS-PAGE考马斯亮蓝和蛋白免疫印迹实验结合条带灰度值调节将CD40蛋白及其糖基化位点突变蛋白调齐(图4，A、B)。蛋白调齐之后，通过优化的实验条件比较蛋白功能(图4，C)。

结果显示，本发明纯化的蛋白能够与细胞体内的CD40蛋白发生竞争性结合作用，影响CD40-CD40L及CD40-G28-5间的亲和力，并显著影响下游TNFα基因的表达(图4，C)。

热效应能够反映与配体的结合能力强弱，产热相对多的蛋白，说明其与配体的结合能力强，结合效果更好。在控制蛋白量一致性的条件下，本发明人进行了Octet实验，运用热效应来对上述几种蛋白进行比较(图4，D)。从结果来看，在控制蛋白量一致的情况下，结合解离常数(KD)值与其他研究报道一致，都达到10^-7。而且，在控制蛋白量一致情况下，尽管这几种蛋白间KD差异性不显著，但是它们之间的热效应是不同的，CD40-2产热更多，因而相比其他蛋白，作用力更强(图4，D)。因此，在体内实验中，CD40-2蛋白的作用效果相对其他蛋白更好。

实施例5、CD40-N及其糖基化位点突变蛋白在PDX中的治疗应用

制备好CD40糖基化位点突变蛋白并且确定蛋白功效后，接下来本发明人确定这些蛋白在DLBCL中的治疗应用。在实验之前，提前铺板，即在24孔板内铺骨髓基质细胞，三天后PDX模型的小鼠体内取出人源化的肿瘤，分离得到淋巴细胞后进行铺板。根据不同指标确定好加入的蛋白浓度进行试验(如图5)：CO-Culture表示的是CXR细胞和骨髓基质细胞共培养，CXR表示的是该人源化肿瘤细胞单独培养。CD40-N及其突变蛋白CD40-1、CD40-2、CD40-(1+2)相应加入的浓度分别是20ug/ml、27ug/ml。根据实验结果，可以得知共培养的细胞相对单独培养的CXR细胞存活更多。根据之前摸索的条件，本发明体外制备的突变蛋白会与瘤细胞CD40-N竞争CD40L，影响瘤内CD40-CD40L的下游信号通路，所以会影响淋巴细胞的存活。

从结果所示，本发明体外制备的CD40突变蛋白会与瘤内CD40产生竞争关系，影响瘤内淋巴细胞的存活。因此本发明制备的CD40-1、CD40-2及CD40-(1+2)可以在体外DLBCL的治疗中产生疗效，在临床治疗中也能起到疗效。

综上，突变体CD40-1、CD40-2和CD40-(1+2)蛋白与CD40蛋白相比具有优势，尤其是CD40-2蛋白。而且糖基化作用影响受体和配体间的结合力和亲和力作用，进而会影响到体内的免疫作用，本发明的突变体排除了这一影响。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> CD40突变体及其在弥漫性大B淋巴瘤的治疗中的应用

<130> 173420

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 173

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln

1 5 10 15

Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr

20 25 30

Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu

35 40 45

Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp

50 55 60

Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp

65 70 75 80

Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys

85 90 95

Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys

100 105 110

Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val

115 120 125

Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp

130 135 140

Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn

145 150 155 160

Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg

165 170

<210> 2

<211> 524

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

gagaaccacc cactgcatgc agagaaaaac agtacctaat aaacagtcag tgctgttctt 60

tgtgccagcc aggacagaaa ctggtgagtg actgcacaga gttcactgaa acggaatgcc 120

ttccttgcgg tgaaagcgaa ttcctagaca cctggaacag agagacacac tgccaccagc 180

acaaatactg cgaccccaac ctagggcttc gggtccagca gaagggcacc tcagaaacag 240

acaccatctg cacctgtgaa gaaggctggc actgtacgag tgaggcctgt gagagctgtg 300

tcctgcaccg ctcatgctcg cccggctttg gggtcaagca gattgctaca ggggtttctg 360

ataccatctg cgagccctgc ccagtcggct tcttctccaa tgtgtcatct gctttcgaaa 420

aatgtcaccc ttggacaagc tgtgagacca aagacctggt tgtgcaacag gcaggcacaa 480

acaagactga tgttgtctgt ggtccccagg atcggctgag ataa 524

<210> 3

<211> 524

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 密码子优化的CD40-N基因序列

<400> 3

gagagccacc cacagcttgc agagagaaac aatatctgat taactcccag tgttgctctc 60

tgtgccaacc aggtcagaaa ttggtgtctg attgcactga atttaccgag acagaatgcc 120

ttccatgcgg cgaatcagaa ttccttgata cctggaatcg tgaaactcac tgtcatcaac 180

ataagtactg tgatcctaac ttaggattga gggtacagca aaagggaact tccgaaaccg 240

acacaatctg tacttgtgag gagggttggc attgtacttc agaagcttgt gaaagttgtg 300

tcttgcacag atcctgttcc cctggttttg gtgtcaagca aattgcaacg ggtgtctctg 360

atactatatg tgaaccttgc cccgttggct ttttctctaa cgttagttct gccttcgaga 420

agtgtcaccc atggacttca tgtgagacga aagatttagt tgttcagcaa gctggaacca 480

ataaaacaga cgtggtttgt ggacctcaag acagactacg ataa 524

<210> 4

<211> 522

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> CD40-N突变蛋白的基因序列

<400> 4

gagccaccca cagcttgcag agagaaacaa tatctgatta actcccagtg ttgctctctg 60

tgccaaccag gtcagaaatt ggtgtctgat tgcactgaat ttaccgagac agaatgcctt 120

ccatgcggcg aatcagaatt ccttgatacc tggaatcgtg aaactcactg tcatcaacat 180

aagtactgtg atcctaactt aggattgagg gtacagcaaa agggaacttc cgaaaccgac 240

acaatctgta cttgtgagga gggttggcat tgtacttcag aagcttgtga aagttgtgtc 300

ttgcacagat cctgttcccc tggttttggt gtcaagcaaa ttgcaacggg tgtctctgat 360

actatatgtg aaccttgccc cgttggcttt ttctctgcgg ttagttctgc cttcgagaag 420

tgtcacccat ggacttcatg tgagacgaaa gatttagttg ttcagcaagc tggaaccaat 480

aaaacagacg tggtttgtgg acctcaagac agactacgat aa 522

<210> 5

<211> 173

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> CD40-N突变蛋白

<400> 5

Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln

1 5 10 15

Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr

20 25 30

Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu

35 40 45

Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp

50 55 60

Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp

65 70 75 80

Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys

85 90 95

Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys

100 105 110

Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val

115 120 125

Gly Phe Phe Ser Ala Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp

130 135 140

Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn

145 150 155 160

Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg

165 170

<210> 6

<211> 522

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> CD40-N突变蛋白的基因序列

<400> 6

gagccaccca cagcttgcag agagaaacaa tatctgatta actcccagtg ttgctctctg 60

tgccaaccag gtcagaaatt ggtgtctgat tgcactgaat ttaccgagac agaatgcctt 120

ccatgcggcg aatcagaatt ccttgatacc tggaatcgtg aaactcactg tcatcaacat 180

aagtactgtg atcctaactt aggattgagg gtacagcaaa agggaacttc cgaaaccgac 240

acaatctgta cttgtgagga gggttggcat tgtacttcag aagcttgtga aagttgtgtc 300

ttgcacagat cctgttcccc tggttttggt gtcaagcaaa ttgcaacggg tgtctctgat 360

actatatgtg aaccttgccc cgttggcttt ttctctaacg ttagttctgc cttcgagaag 420

tgtcacccat ggacttcatg tgagacgaaa gatttagttg ttcagcaagc tggaaccgcg 480

aaaacagacg tggtttgtgg acctcaagac agactacgat aa 522

<210> 7

<211> 173

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> CD40-N突变蛋白

<400> 7

Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln

1 5 10 15

Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr

20 25 30

Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu

35 40 45

Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp

50 55 60

Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp

65 70 75 80

Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys

85 90 95

Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys

100 105 110

Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val

115 120 125

Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp

130 135 140

Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Ala

145 150 155 160

Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg

165 170

<210> 8

<211> 522

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> CD40-N突变蛋白的基因序列

<400> 8

gagccaccca cagcttgcag agagaaacaa tatctgatta actcccagtg ttgctctctg 60

tgccaaccag gtcagaaatt ggtgtctgat tgcactgaat ttaccgagac agaatgcctt 120

ccatgcggcg aatcagaatt ccttgatacc tggaatcgtg aaactcactg tcatcaacat 180

aagtactgtg atcctaactt aggattgagg gtacagcaaa agggaacttc cgaaaccgac 240

acaatctgta cttgtgagga gggttggcat tgtacttcag aagcttgtga aagttgtgtc 300

ttgcacagat cctgttcccc tggttttggt gtcaagcaaa ttgcaacggg tgtctctgat 360

actatatgtg aaccttgccc cgttggcttt ttctctgcgg ttagttctgc cttcgagaag 420

tgtcacccat ggacttcatg tgagacgaaa gatttagttg ttcagcaagc tggaaccgcg 480

aaaacagacg tggtttgtgg acctcaagac agactacgat aa 522

<210> 9

<211> 173

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> CD40-N突变蛋白

<400> 9

Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln

1 5 10 15

Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr

20 25 30

Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu

35 40 45

Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp

50 55 60

Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp

65 70 75 80

Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys

85 90 95

Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys

100 105 110

Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val

115 120 125

Gly Phe Phe Ser Ala Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp

130 135 140

Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Ala

145 150 155 160

Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg

165 170

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 10

gttggctttt tctctgaggt tagttctgcc ttc 33

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 11

gaaggcagaa ctaacctcag agaaaaaggc caa 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 12

cagcaagctg gaaccgagaa aacagacgtg gtt 33

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 13

aaccacgtct gttttctcgg ttccagcttg ctg 33

Claims

1.人CD40蛋白突变体，其特征在于，所述蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.人CD40蛋白突变体，其特征在于，所述蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

3.人CD40蛋白突变体，其特征在于，所述蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

4.分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1-3任一所述的突变体。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO:4，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求4或5所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体，或基因组中整合有权利要求4或5所述的多核苷酸。

8.一种生产权利要求1所述的人CD40蛋白突变体的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)培养权利要求7所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离权利要求1所述的人CD40蛋白突变体。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是毕赤酵母细胞，在发酵罐规模发酵时，步骤(1)中，通过流加甘油补充碳源，待OD600值200±50时，停止补加甘油，待甘油耗净时，补加甲醇进行诱导表达，以初始发酵液1L计，先以0.133±0.6ml/min的速度补加，在3-5小时内逐渐提高补加速度至1.33±0.2ml/min的速度；诱导15-24小时。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，甲醇诱导表达时，先以0.133±0.6ml/min的速度补加，每半小时调节1次，至4小时时达到1.33±0.2ml/min的速度。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，补加甲醇进行诱导表达时，以初始发酵液3L计，先以0.4±0.2ml/min的速度补加，在3-5小时内逐渐提高补加速度至4±0.5ml/min的速度；诱导15-24小时。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，甲醇诱导表达时，先以0.4±0.2ml/min的速度补加，每半小时调节1次，至4小时时达到4±0.5ml/min的速度。

13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用超滤、分子筛和例子交换的方法进行纯化，分离获得权利要求1所述的人CD40蛋白突变体。

14.权利要求1-3任一所述的人CD40蛋白突变体的用途，用于制备缓解或治疗弥漫性大B淋巴瘤的组合物。

15.一种提高人CD40蛋白的表达水平以及提高人CD40蛋白与配体结合能力的方法，其特征在于，所述方法包括：将人CD40蛋白的氨基酸序列进行突变，突变为氨基酸序列如SEQID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示的突变体。