CN110559424B

CN110559424B - 一种外膜蛋白在制备恶性肿瘤免疫治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN110559424B
Application number: CN201910791274.XA
Authority: CN
Inventors: 刘智; 杨祥良; 石林林
Original assignee: Junwei'an Wuhan Life Technology Co ltd
Current assignee: Junwei'an (Wuhan) Life Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-08-26
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2039-08-26
Also published as: CN110559424A

Abstract

本发明公开一种外膜蛋白在制备恶性肿瘤免疫治疗药物中的应用，所述外膜蛋白为阿克曼氏菌外膜蛋白，本申请提供的外膜蛋白能够降低肿瘤负荷、抑制肿瘤生长，激活T细胞相关抗肿瘤免疫应答，可应用于多种恶性肿瘤免疫治疗药物的制备。

Description

一种外膜蛋白在制备恶性肿瘤免疫治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，尤其涉及一种外膜蛋白在制备恶性肿瘤免疫治疗药物中的应用。

背景技术

免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗之后的新兴肿瘤疗法，逐渐展现出其不可替代的优势。肿瘤发生通常伴随机体免疫系统的耗竭，免疫疗法的宗旨在于降低机体的耗竭水平，重塑免疫系统，帮助机体清除肿瘤细胞。由炎性细胞及介质(细胞因子、趋化因子等) 形成的炎症微环境是肿瘤微环境的重要组成成分，与肿瘤的免疫监视及免疫逃逸密切相关，参与肿瘤的发生、发展、侵袭及转移等各个过程。肿瘤微环境中多种炎性细胞、炎性介质以及炎症信号通路中的重要蛋白已经作为肿瘤治疗的药物靶点，在肿瘤治疗临床试验中广泛应用并取得备受瞩目的肿瘤治疗效果。

免疫识别是诱导和触发免疫应答或免疫耐受的重要起始环节，其中天然免疫识别主要指天然免疫细胞( 树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、粒细胞等)对于外界病原体或内源性刺激物的识别及随后触发的免疫与炎症过程，天然免疫细胞对肿瘤的免疫监视以及免疫耐受的形成具有双向功能。Toll样受体是一类可以识别外源性高度保守病原相关分子模式以及内源性应激损伤信号分子模式的天然识别受体。作为一种重要的模式识别受体，Toll样受体通过识别病原相关分子模式，在抗感染、介导炎症和抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用。相关研究表明，Toll样受体激动剂不仅参与固有免疫应答，而且还直接介导适应性免疫应答，在多种病理状态下发挥相应的功能，这其中就包括恶性肿瘤。

申请号为CN008050937的专利公开与抗原相结合的肠细菌OmpA蛋白用于产生抗病毒、抗奇生虫、或抗肿瘤的细胞毒性应答的用途，其将肺炎克雷伯氏菌膜蛋白与肿瘤对应抗原相结合制备组合药物来治疗肿瘤，申请号为2010105017674的专利公开SJ16蛋白在制备免疫抑制药物中的应用，其以SJ16蛋白制备免疫抑制药物，通过免疫耐受机制及诱导，在较大程度上避免毒副作用，虽然能够抑制肿瘤细胞的转化和增殖，但是并未揭示对于肿瘤细胞免疫治疗中的微环境效应T淋巴细胞的影响，其对于肿瘤免疫治疗的微环境调节存在较大不足之处。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种外膜蛋白在制备恶性肿瘤免疫治疗药物中的应用，所述外膜蛋白为阿克曼氏菌外膜蛋白。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种外膜蛋白在制备恶性肿瘤免疫治疗药物中的应用，所述药物包括阿克曼氏菌的外膜蛋白。

进一步的，所述外膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述恶性肿瘤为黑色素瘤、结直肠癌、肺癌或乳腺癌。

进一步的，所述外膜蛋白在恶性肿瘤免疫治疗药物中的用量为0.05mg/kg-5mg/kg。

本发明提供了上述外膜蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）蛋白表达：

a．异源表达，利用大肠杆菌工程菌BL21菌株进行异源表达，高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的质粒的基因，LB+KanR抗性的平板上过夜培养，挑选单克隆抗体，转接100ml LB+KanR抗性液体培养基中，诱导过夜，离心，弃上清，菌体沉淀-20℃保存；

具体的，在异源表达时，挑选单克隆抗体后，按照1：100比例转接入200ml LB+KanR抗性液体培养基，37℃培养2-3小时，使得OD=0.6，加入IPTG（1M）至终浓度为2 mM，28℃诱导过夜，取出1mL菌液于1.5mL小离心管中，8000r/min，离心5min，弃上清，菌体沉淀-20℃保存；包含该外膜蛋白基因的质粒为现有技术获得，其通过基因工程技术将外膜蛋白的基因插入含有噬菌体T7启动子的PET 28a质粒中即得含有该外膜蛋白的质粒PET 28a-Amuc。

b．收集诱导过后的菌液离心，弃上清，收集沉淀，称取湿重，按照每克湿重加入4ml 非变性裂解液，吹打混匀，再加入溶菌酶，混匀，冰上放置，裂解超声破碎至溶液彻底清亮；

c.破碎完菌体澄清后，离心，收集剩下的细菌裂解上清液并放在冰上，即得Amuc蛋白；

（2）蛋白纯化：采用His-tag Protein Purification Kit纯化Amuc蛋白，具体步骤包括装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、纯化柱的洗涤与回收；其中，洗涤步骤中用WashingBuffer洗涤液洗涤，每次1.5ml，重复3-5次；洗脱步骤中用低到高浓度的Elution Buffer洗脱液依次洗脱，每次1.5ml，重复3-5次；

其中，平衡步骤中先通过蒸馏水、Elution Buffer洗涤液洗涤，再用BindingBuffer平衡，Binding Buffer的配制方法为：50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，10 mMimidazole ，加入NaOH调节pH至8.0；

具体的纯化的步骤为：

1)装柱：向蛋白纯化柱中加入3mL的BeyoGold™ His-tag Purification Resin填充料。4℃正立静置过夜，以填充料沉积的高度为1柱体积；

2)平衡：打开蛋白纯化柱，使柱内液体自然流出，然后加入10柱体积的蒸馏水洗涤。再加入20柱体积预冷Elution Buffer洗涤，最后加入10柱体积预冷Binding Buffer平衡。

3)上样：将冰上放置的破碎后的上清分次缓慢加至纯化柱中；

4)洗涤：加入20柱体积预冷Binding Buffer平衡，再加入20柱体积的预冷WashingBuffer洗去杂蛋白，每次1.5 mL，共计3次；

5)洗脱：分次加入预冷Elution Buffer洗脱目的蛋白，每次1.5 mL，重复5次；用1.5mL离心管接取样品，取适当体积用于SDS-PAGE检测以及蛋白浓度的测定，剩余样品-80℃保存。

6)纯化柱的洗涤与回收：向纯化柱中加入20柱体积Elution Buffer洗涤，然后加入20柱体积Binding Buffer平衡，再加入20柱体积单蒸水洗涤，最后加满20%的无水乙醇，4℃保存。

（3）目的蛋白浓缩：收取步骤（2）纯化所得的蛋白洗脱液，离心，加入PBS清洗液，离心，BCA蛋白定量浓缩后的蛋白浓度。

进一步的，所述步骤（1）b中裂解超声方法为：功率200-300w，变幅杆直径为6，工作2s，间隔3s，超声60 - 90min。

进一步的，所述步骤（2）中Washing Buffer洗涤液配制方法为：50 mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20 mM imidazole，加入NaOH调节pH至8.0。

进一步的，所述步骤（2）中Elution Buffer洗脱液配制方法为：50 mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，40-250 mM imidazole，加入NaOH调节pH至8.0。

进一步的，所述Elution Buffer洗脱液中imidazole的浓度梯度为40 mM，80 mM，160 mM，250 mM。

优选的，Elution Buffer中选用imidazole浓度梯度为40 mM，80 mM，160 mM，250mM的Elution Buffer洗脱液洗脱；四个浓度梯度的洗脱次数及体积分别为：40 mM, 1次，每次1.5ml；80 mM，1次，每次1.5ml；160 mM，3次，每次1.5ml；250 mM, 1次，每次1.5ml；共计洗脱6次。

细菌脂蛋白作为细菌细胞壁中的主要成分之一，是一组具有多种功能的外膜蛋白。研究表明细菌脂蛋白可作为Toll样受体的激动剂，能有效增强T细胞抗肿瘤免疫应答，并显著削弱肿瘤介导的免疫抑制，本申请的外膜蛋白可直接作为药物注射，或者搭配药理学上可接受的盐或者载体，盐或者载体的本身不影响外膜蛋白的药物治疗作用，主要起到增加药物溶解性以及稳定性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的外膜蛋白能够降低肿瘤负荷、抑制肿瘤生长，激活T 细胞相关抗肿瘤免疫应答，可应用于多种恶性肿瘤免疫治疗药物的制备。

附图说明

图1为本发明实施例1中质粒PET 28a-Amuc的图谱；

图2为实施例1中制备的蛋白电泳检测图，图中M1-3代表用Washing Buffer连续3次洗涤目标样本中的杂蛋白，分别在洗涤第1次、第2次、第3次取样进行电泳检测，E1-E6代表分别在用不同imidazole浓度梯度的Elution Buffer洗脱条件下对应得到的目的蛋白样品，其中imidazole浓度梯度依次为40 mM（1次），80 mM（1次），160 mM（3次），250 mM（1次），每次1.5ml，共计洗脱6次；

图3为对比例2中蛋白电泳检测图，图中M1-3代表用Washing Buffer连续3次洗涤目标样本中的杂蛋白，分别在洗涤第1次、第2次、第3次取样进行电泳检测，E1-E6代表用相同的imidazole浓度的Elution Buffer洗脱条件下洗脱六次对应得到的目的蛋白样品；

图4 为不同组别药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤体积生长曲线的影响；

图5为不同组别药物对B16F10荷瘤小鼠体重变化的影响；

图6为不同组别药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤微环境效应T淋巴细胞的影响；

图7为不同组别药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤微环境调节性T淋巴细胞的影响；

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：材料与方法

一、外膜蛋白表达

1、利用大肠杆菌工程菌BL21菌株进行异源表达，高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因，本实验所用的质粒PET 28a-Amuc，图谱如附图1，将Amuc蛋白基因通过基因工程导入PET 28a，构建含有Amuc蛋白基因的质粒PET 28a-Amuc，构建质粒的方法为常规基因工程技术，此处不再赘述。在LB+KanR抗性的平板上过夜培养，挑选单克隆抗体，转接100 ml LB+KanR抗性液体培养基中，过夜，按照1：100比例转接入200mlLB+KanR抗性液体培养基，37℃培养2-3小时，使得OD=0.6，8000r/min，离心5min，弃上清，菌体沉淀-20℃保存；本发明中蛋白选自阿克曼氏菌（ATCC BAA-835）的外膜蛋白（即最终制备的Amuc蛋白）。

2. 待OD=0.6 之后，在锥形瓶中加入IPTG（1M）至终浓度为2 mM，28℃诱导过夜，取出1mL菌液于1.5mL小离心管中，8000r/min，离心5min，弃上清，菌体沉淀保存在-20℃冰箱中；

3. 收集诱导过后的菌液至50 ml的离心管，4℃，9000 g/min 离心10min，弃上清，收集沉淀，称取湿重，按照每克湿重加入4 ml 非变性裂解液，吹打混匀，再加入溶菌酶，混匀，冰上放置30 min；

4. 冰上裂解超声，功率200-300w，变幅杆直径为6，工作2s，间隔3s，超声60 -90min 至溶液彻底清亮。

5. 破碎完菌体澄清后，4℃，10000g/min离心15min，收集剩下的细菌裂解上清液并放在冰上（此处留样为：诱导后裂解对照CL: cell lysate）。

二、外膜蛋白纯化-Ni柱纯化

将250 ml细菌裂解上清液，用His-tag Protein Purification Kit纯化Amuc蛋白，纯化流程如下：

1)装柱：向蛋白纯化柱中加入3mL的BeyoGold™ His-tag Purification Resin填充料。4℃正立静置过夜，以填充料沉积的高度为1柱体积。

3)上样：将冰上放置的破碎后的上清分次缓慢加至蛋白纯化柱中。

4)洗涤：加入20柱体积预冷Binding Buffer平衡，再加入20柱体积的预冷WashingBuffer洗去杂蛋白，每次1.5 mL，共计3次；Binding Buffer配制方法为：50 mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10 mM imidazole ，加入NaOH调节pH至8.0；Washing Buffer配制方法为：50 mMNaH₂PO₄，300 mM NaCl，20 mM imidazole，加入NaOH调节pH至8.0。（imidazole即为咪唑）。

5)洗脱：分次加入预冷的不同浓度的Elution Buffer洗脱目的蛋白，每次1.5 mL，共计洗脱6次；Elution Buffer配制方法为：50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，40-250 mMimidazole，加入NaOH调节pH至8.0。用1.5mL离心管接取样品，取适当体积用于SDS-PAGE检测以及蛋白浓度的测定，剩余样品置于-80℃保存；其中，Elution Buffer中优选的imidazole浓度梯度为40 mM，80 mM，160 mM，250 mM；四个浓度梯度的洗脱次数及体积分别为：40 mM, 1次，每次1.5ml；80 mM，1次，每次1.5ml；160 mM，3次，每次1.5ml；250 mM, 1次，每次1.5ml；共计洗脱6次。

三、目的蛋白浓缩：

使用Milipore 10000 KD 超滤管，将纯化所得的洗脱液加入超滤管上方，4000rpm 离心30 min；当目的蛋白液面降低至超滤膜上方时，加入3倍体积的PBS清洗液，离心，共计使用30 ml PBS；当液面低于2 ml左右，轻轻吸出浓缩液，BCA蛋白定量浓缩后的Amuc蛋白浓度，最终Amuc蛋白浓度为3mg/ml，所述Amuc蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

四、目的蛋白胶上样：

电泳条件 (以一块胶计算) ：开始16mA恒流，1h左右，观察到Maker分开后，改用18mA恒流，电泳40min左右，考马斯亮蓝染色30min，7%的乙酸过夜脱色。然后用纯水清洗一下，进行扫描观察。电泳结果如图2，可观察到相应的目的蛋白条带。图2中M1-3代表用Washing Buffer连续3次洗涤目标样本中的杂蛋白，分别在洗涤第1次、第2次、第3次取样进行电泳检测，E1-E6代表分别在用不同imidazole浓度梯度的Elution Buffer洗脱条件下得到的目的蛋白样品，其中imidazole浓度梯度依次为40 mM（1次），80 mM（1次），160 mM（3次），250 mM（1次），每次1.5ml，共计洗脱6次。

对比例1：

与实施例1不同之处在于，冰上裂解超声，功率200-300w，变幅杆直径为6，工作2s，间隔3s，超声30 min；该条件下超声时间不够，导致菌体裂解不充分，测得该方法下的裂解上清浓度太低，无法进行后续纯化。

对比例2：

与实施例1不同之处在于，蛋白纯化-Ni柱纯化中，Elution Buffer配制方法为：50mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，40mM imidazole，加入NaOH调节pH至8.0；每次1.5ml，共计洗脱6次。该洗脱条件下imidazole的浓度梯度没有优化，杂质比较多，无法有效洗脱目的蛋白。蛋白的电泳检测结果如图3，由图3可知，目的蛋白并没有被洗脱出来。

应用例：不同组别药物的药理学试验

一、建立试验模型

试验动物

动物：C57BL/6J小鼠，雌性，6 ~ 8周龄，18 ± 2 g。

模型建立

取生长状态良好，对数生长期的B16F10黑色素瘤细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，经PBS洗涤两次后，通过细胞计数法，用生理盐水调整细胞浓度为2×10⁶cell/ml，每只健康C57BL/6J雌性小鼠右侧腰背处皮下接种0.1 ml（含2×10⁵个活细胞），在饲养过程中，各组小鼠均同等饮食，动物房内保持相对湿度20~30 %。

分组及给药

分组详情，表1：试验组及对照组的给药情况

其中，Amuc的给药方式为每三天腹腔注射一次，共5次；

以申请号为2005800456672的专利中的鞭毛蛋白作为阳性对照组。

二、检测指标

1、肿瘤体积生长曲线

当试验各组小鼠皮下瘤体积长至时80 mm³时，各组小鼠开始给药。开始给药后，每隔2天测量肿瘤的长径和短径，同时按下面的公式计算肿瘤体积，并绘制肿瘤体积随时间变化的趋势图，即肿瘤体积生长曲线；瘤体积(mm³)=（a×b²）/ 2，a为肿瘤最长径，b为肿瘤最短径。不同组别药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤体积生长曲线的影响如图4所示，注射本发明的外膜蛋白Amuc对小鼠的肿瘤体积生长具有抑制作用，且外膜蛋白Amuc在0.5mg/kg和25mg/kg的剂量下使用时，对小鼠肿瘤体积的抑制效果更好，与阳性对照组相比（20天时肿瘤体积高于1000 mm³，25天肿瘤体积将近2000 mm³，具体见申请号2005800456672的专利中的附图2），本申请的Amuc蛋白对于小鼠肿瘤体积的抑制效果更为明显。

2、荷瘤小鼠的体重变化

开始给药后，每隔2天测量试验各组荷瘤小鼠的体重，绘制体重随时间变化曲线，评价给药后各组荷瘤小鼠的体重变化。不同组别药物对B16F10荷瘤小鼠体重变化的影响如图5所示，本发明的外膜蛋白对小鼠能够较好的降低肿瘤负荷，D组用药情况下小鼠体重减小明显优于B组和C组。

3、肿瘤免疫微环境分析

试验终点，剥离各组小鼠皮下肿瘤组织，剪碎后在含有I型胶原酶的RPMI 1640培养基中孵育90分钟，过200目尼龙网筛，制得单细胞悬液；1500 rpm离心15分钟，弃上清，用PBS缓冲液（pH= 7.4）清洗2-3遍，1500 rpm离心15分钟；得到淋巴细胞后，每管吸取100 μL单细胞悬液，按照试剂盒 (FITC anti-mouse CD3，APC anti-mouse CD8，PE anti-mouseIFN-g，PC5.5 anti-mouse CD4，APC anti-mouse CD25，PE anti-mouse Foxp3，Biolegend)说明向各管中加入相应抗体，4℃避光孵育30分钟；结束后，每管加入1mL PBS重悬，1500rpm离心5分钟之后，加入300 μL PBS 重悬，用流式细胞仪进行检测。

不同组别药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤微环境效应T淋巴细胞的影响如图6所示，本发明中的膜蛋白所制备的药物对肿瘤微环境效应T淋巴细胞的分化有促进作用，尤其D组对于肿瘤微环境效应T淋巴细胞的分化促进作用优于阳性对照组以及C组；不同组别药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤微环境调节性T淋巴细胞的影响如图7所示，本发明中的膜蛋白制备的药物能够较好的调节肿瘤微环境，由上图6和图7可知，本发明的外膜蛋白能够促进肿瘤组织细胞毒性T细胞的浸润以及树突状细胞的成熟分化，改善肿瘤免疫微环境，尤其在D组用药条件下的调节改善作用更好。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中科技大学

<120> 一种外膜蛋白在制备恶性肿瘤免疫治疗药物中的应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ile Val Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys

20 25 30

Lys Ile Ser Ile Ala Ala Lys Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu

35 40 45

Ile Thr Pro Ser Arg Ser Ser Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn

50 55 60

Arg Tyr Ala Lys Ala Val Gly Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe

65 70 75 80

Leu Ala Ser Ser Ala Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn

85 90 95

Glu Leu Lys Thr Phe Arg Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys

100 105 110

Asn Ile Leu Ile Thr Asp Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr

115 120 125

Ser Thr Gln Ala Pro Ser Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu

130 135 140

Leu Lys Ala Ile Asn Ser Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu

145 150 155 160

Ser Lys Phe Ile Lys Val Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro

165 170 175

Ala Asn Asn Pro Glu Glu Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr

180 185 190

Pro Met Pro Leu Glu Ile Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu

195 200 205

Lys Ala Met Asn Ala Ile Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val

210 215 220

Asn Ser Ile Arg Ile Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala

225 230 235 240

Asn Pro Ala Ala Ala Lys Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala

245 250 255

Ala Ser Leu Thr Pro Ala Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala

260 265 270

Ile Gln Gln Val Ile Lys Pro Tyr Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val

275 280 285

Gln Val Ser Leu Asn Leu Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu

290 295 300

Pro Ser Glu Asp Leu Glu His His His His His His

305 310 315

Claims

1.一种外膜蛋白在制备恶性肿瘤免疫治疗药物中的应用，其特征在于，所述药物包括阿克曼氏菌的外膜蛋白；所述外膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述恶性肿瘤为黑色素瘤。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外膜蛋白在恶性肿瘤免疫治疗药物中的用量为0.05mg/kg-5mg/kg。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外膜蛋白的制备方法包括以下步骤：

（1）蛋白表达：

a．异源表达，利用大肠杆菌工程菌BL21菌株进行异源表达，高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的质粒的基因，LB+KanR抗性的平板上过夜培养，挑选单克隆抗体，转接LB+KanR抗性液体培养基中，诱导过夜，离心，弃上清，菌体沉淀-20℃保存；

b．收集诱导过后的菌液，离心，弃上清，收集沉淀，称取湿重，按照每克湿重加入4 ml非变性裂解液，吹打混匀，再加入溶菌酶，混匀，冰上放置，裂解超声破碎至溶液彻底清亮；

（2）蛋白纯化：采用His-tag Protein Purification Kit纯化Amuc蛋白，具体包括装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、纯化柱的洗涤与回收；其中，洗涤步骤中用Washing Buffer洗涤液洗涤，每次1.5ml，共计3次；洗脱步骤中用低到高浓度咪唑的Elution Buffer洗脱液依次洗脱，每次1.5ml，共计6次；

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）b中裂解超声的方法为：功率200-300w，变幅杆直径为6，工作2s，间隔3s，超声60- 90min。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中Washing Buffer洗涤液配制方法为：50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，20 mM imidazole，加入NaOH调节pH至8.0。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中Elution Buffer洗脱液配制方法为：50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，40-250 mM imidazole，加入NaOH调节pH至8.0。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述imidazole的浓度梯度为40 mM，80 mM，160 mM，250 mM。