TW202019947A - 能夠刺激細胞激素釋放的新穎胜肽及其衍生物 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及可以刺激細胞激素釋放的新穎胜肽，以及該胜肽作為一藥物之用途。

Description

能夠刺激細胞激素釋放的新穎胜肽及其衍生物
本發明涉及能夠刺激細胞激素釋放的新穎胜肽，以及該胜肽作為藥物之用途。
細胞激素在免疫反應的調節中具有關鍵作用。從先天免疫細胞釋放的這些細胞間傳訊者允許對病原體及損傷的協調、穩健以及自我限制反應。然而，在過去的二十年中，人們對細胞激素在癌症免疫療法中的作用越來越感興趣。
細胞激素直接刺激腫瘤部位的免疫效應細胞以及基質細胞，因此可以透過細胞毒性效應細胞增強腫瘤細胞的識別。許多動物腫瘤模型研究顯示，細胞激素具有廣泛的抗腫瘤活性，這已被轉化為許多基於細胞激素的癌症治療方法(Lee & Margolin，2011年)。這些細胞激素直接在該癌細胞上或透過與免疫細胞群的相互作用間接地顯示出抗腫瘤的作用。儘管在一系列癌症動物模型中具有有前景的抗腫瘤作用，但仍有許多這樣的機制尚未鑑定出。
例如，介白素-2 (interleukin-2, IL-2)最初被發現為“T細胞生長因子”，並且已被核准用於治療多種癌症，包括黑色素瘤以及腎細胞癌，由於其驅動T細胞增殖的能力，因此增強了抗腫瘤的免疫反應(Jiang等人，2016年)。除了用於上述癌症的臨床核可外，由於其具有活化免疫系統的能力，特別是與其他抗癌免疫療法相結合時，因此在文獻中被認為是“首選”的癌症免疫療法(Jiang等人，2016年)。實際上，它被認為是“人類癌症的第一種有效免疫療法”，並且可能適用於所有類型的癌症(Rosenberg，2014年)。
此外，介白素-4 (interleukin-4, IL-4)最初被描述為“B細胞生長因子”，同樣也會增強抗腫瘤免疫反應，但也直接驅動癌細胞，包括乳腺癌細胞凋亡(Nagai與Toi，2000年)。IL-4在腫瘤免疫學中的作用有些自相矛盾，但已經顯示在許多癌症的預防及治療模型中，IL-4是幾種細胞激素中可以誘導出最有效的免疫反應的細胞激素(Li等人，2009年)。
介白素-12 (interleukin-12, IL-12)通常被認為是人類腫瘤免疫治療最有希望的候選者之一，因為它可以活化先天性(自然殺手(natural killer, NK)細胞)以及適應性(細胞毒性T淋巴細胞)免疫反應(Lasek等人，2014年)。基於IL-12的療法已經在多種癌症類型中得到成功的結果，包括乳腺癌、胰臟腺、子宮頸癌、直腸癌、淋巴癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、腎臟癌、肉瘤，肝癌(Lasek等人，2014年)，許多最近的臨床試驗證實了這種療效(Lasek與Zagozdzon，2016年)。
干擾素γ (IFN-γ)，也稱為第II型干擾素(IFN)，亦可透過多種機制調節抗腫瘤免疫作用，包括增加免疫細胞的活化及存活、增強免疫效應功能、降低調節性T細胞免疫抑制，以及增加細胞毒性功能(Parker等人，2016年)。此外，IFN-γ已被證實可調節腫瘤血管生成的抑制作用，這是一種驅動所有人類癌症的腫瘤惡化、生長，以及轉移性擴散的過程(Hayakawa等人，2002年)。
鑑於上述情況，很明顯地，IL-2、IL-4、IL-12，以及IFN-γ都是人類癌症惡化、生長，以及傳播的重要細胞激素，因此在所有類型的癌症中調節這些細胞激素是有意義的。在癌症免疫療法的臨床前開發中存在許多細胞激素。然而，治療性細胞激素的遞送可能是有問題的，而且研究人員一直在開發替代策略，包括遞送細胞激素基因的重組病毒載體以及細胞激素蛋白的聚乙二醇化以改善在宿主中的動力學(Lee與Margolin，2011年)。因此，需要尋找新的方法來增加這些細胞激素的釋放，包括，但不限於，從宿主細胞釋放IL-2、IL-4、IL-12，以及IFN-γ，並因此促進抗腫瘤免疫作用。本發明解決了這種需要。
於本發明之一方面，提供了一種分離的多胜肽，包含下列胺基酸序列： X1 X2 X3 AX4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 ； 其中 X1 係選自PyroQ以及A； X2 係選自由D、E，以及A所組成之群組； X3 係選自由T、A，以及S所組成之群組； X4 係選自由V、A、I、L，以及M所組成之群組； X5 係選自由T以及S所組成之群組； X6 係選自由T、A，以及S所組成之群組； X7 係選自由H、K、Q，以及R所組成之群組； X8 係選自由E、A、N，以及Q所組成之群組； X9 係選自由D、N、Q，以及A所組成之群組； X10 係選自由N、D，以及A所組成之群組；或其一片段或其一功能變體。
於一具體實施例中，X1 為PyroQ。於另一具體實施例中，X1 為A。於一第二具體實施例中，X2 為E。於一第三具體實施例中，X3 為T。於一第四具體實施例中，X4 為V。於一第五具體實施例中，X5 為S。於一第六具體實施例中，X6 為S。於一第七具體實施例中，X7 為H。於一第八具體實施例中，X8 為E。於一第九具體實施例中，X9 為Q。於一第十具體實施例中，X10 為D。
於一具體實施例中，提供了一種分離的多胜肽，包含如SEQ ID NOs: 1至47任一所定義之胺基酸序列，或其一片段或其一功能變體之胺基酸序列。
於本發明之另一方面，提供了一種分離的多核苷酸，其中該分離的多核苷酸包含 (a) 編碼如SEQ ID NOs: 1-47中任一所定義之多胜肽或其一變體或其一片段的核苷酸序列，如上所定義；或者 (b) 與(a)互補的核苷酸序列。
於本發明之另一方面，提供了一種核酸構築體，包含至少一種核酸序列，該至少一種核酸序列編碼至少一種如SEQ ID NO: 1至47中任一所定義之多胜肽或其一功能變體或其一同源物，其中較佳為至少一個該序列與一調節序列可操作地連接。於一具體實施例中，該調節序列為組成型或強啟動子。
於本發明之另一方面，提供了一種載體，包含至少一種上述之多核苷酸。
於本發明之另一方面，提供了一種宿主細胞，包含至少一種上述之核酸構築體。
於本發明之另一方面，提供了一種如本文所述之分離的多胜肽、多核苷酸、核酸構築體或宿主細胞用於作為一藥物之用途。
於本發明之另一方面，本發明提供一種治療方法，包括對一有此需要的個體或患者施用如本文所述之分離的多胜肽、多核苷酸或核酸構築體的至少一種。
於本發明之另一方面，提供了如本文所述之分離的多胜肽、多核苷酸、核酸構築體或宿主細胞的至少一種用於治療癌症之用途。
於本發明之另一方面，提供了一種治療癌症之方法，該方法 包括對一有此需要的個體或患者施用如本文所述之分離的多胜肽、多核苷酸、核酸構築體或宿主細胞的至少一種。
於一實施例中，該癌症可選自以下之一：胰臟癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、支氣管癌、直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經系統癌、周圍神經系統癌、食道癌、子宮頸癌、子宮或子宮內膜癌、口腔癌或咽喉癌、肝癌、腎臟癌、睪丸癌、膽道癌、小腸或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、血液組織癌、神經膠質瘤、淋巴瘤等。於一具體實施例中，該癌症為肝癌。
於本發明之另一方面，提供了一種藥物組合物，包含如本文所述之分離的多胜肽、多核苷酸、核酸構築體或宿主細胞的至少一種，以及一藥學上可接受之載劑。
於本發明之另一方面，提供了一種提高細胞激素含量之方法，該方法包括將如本文所述之分離的多胜肽，多核苷酸，核酸構築體或宿主細胞的至少一種施用於一目標細胞或患者。
於本發明之最後一個方面，提供了至少一種分離的多胜肽、多核苷酸、核酸構築體或宿主細胞用於增加或刺激細胞激素釋放之用途。
於一具體實施例中，該細胞激素為IL-2、IL-4、IL-12，以及IFN-γ中的至少一種。
現將進一步描述本發明。在以下段落中，更詳細地定義了本發明的不同方面。除非明確地指出，否則如此定義的每個方面可與任何其他方面組合。特別地，任何被指示為較佳或有利的特徵可與被指示為較佳或有利的任何其他特徵組合。
術語“多胜肽”及“蛋白質”在本文中可互換使用，係指透過胜肽鍵連接在一起的任何長度的聚合形式的胺基酸。
如本文所用，詞語“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”目的在於包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如，mRNA)，天然存在的、突變的、合成的DNA或RNA分子，以及使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA的類似物。其可為單鏈或雙鏈。此類核酸或多核苷酸包括，但不限於，結構基因的編碼序列、反義序列，以及不編碼mRNA或蛋白質產物的非編碼調節序列。這些術語也包括基因。術語“基因”或“基因序列”廣泛用於指與一生物學功能相關的DNA核酸。因此，基因可包括基因組序列中的內含子及外顯子，或者可以僅包含cDNA中的編碼序列，及/或可包括與調節序列組合的cDNA。
我們已經分離了許多胜肽，其對應於兔α-1-抗蛋白酶的修飾片段，具有以下共同序列 X1 X2 X3 AX4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 ； 其中 X1 係選自PyroQ以及A； X2 係選自由D、E，以及A所組成之群組； X3 係選自由T、A，以及S所組成之群組； X4 係選自由V、A、I、L，以及M所組成之群組； X5 係選自由T以及S所組成之群組； X6 係選自由T、A，以及S所組成之群組； X7 係選自由H、K、Q，以及R所組成之群組； X8 係選自由E、A、N，以及Q所組成之群組； X9 係選自由D、N、Q，以及A所組成之群組； X10 係選自由N、D，以及A所組成之群組；或其一片段或其一功能變體； 其可增加或刺激先天免疫細胞釋放細胞激素。
於本發明之一具體實施例中，提供了一種分離的多胜肽，其包含下列胺基酸序列： X1 X2 X3 AX4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 其中 X1 為PyroQ； X2 係選自由D、E，以及A所組成之群組； X3 係選自由T、A，以及S所組成之群組； X4 係選自由V、A、I、L，以及M所組成之群組； X5 係選自由T以及S所組成之群組； X6 係選自由T、A，以及S所組成之群組； X7 係選自由H、K、Q，以及R所組成之群組； X8 係選自由E、A、N，以及Q所組成之群組； X9 係選自由D、N、Q，以及A所組成之群組； X10 係選自由N、D，以及A所組成之群組。
於一具體實施例中，X2 為E。於一第二具體實施例中，X3 為T。於一第三具體實施例中，X4 為V。於一第四具體實施例中，X5 為S。於一第五具體實施例中，X6 為S。於一第六具體實施例中，X7 為H。於一第七具體實施例中，X8 為E。於一第八具體實施例中，X9 為Q。於一第九具體實施例中，X10 為D。
於一特別較佳的具體實施例中，該胜肽包含序列PyroQETAVSSHEQD (SEQ ID NO: 1 或SEQ ID NO: 25)或一其功能變體。該胜肽在本文中可稱為胜肽1。
於另一具體實施例中，該胜肽包含選自SEQ ID NOs: 2至24或SEQ ID NOs: 26至47中任一之序列或由其所組成。
本文提及之PyroQ也稱為焦麩醯胺(pyroglutamine)。PyroQ在其自由鹼(free base form)，即吡咯烷酮羧酸 (pyrrolidone carboxylic acid)， 的情況下的結構如下：
Figure 02_image001
為避免產生疑義，PyroQ也可稱為PyroE、PyroGln、PyroGlu、焦麩胺酸 (pyroglutamate) 或吡咯烷酮羧酸鹽 (pyrrolidone carboxylate)。 這些術語在本文中可互換使用。 因此，PyroQ和PyroE在結構上是相同的。當PyroQ連接至胜肽的N-末端時，它的結構如下所示，波浪線表示連接點：
Figure 02_image003
PyroQ可以根據如下的（R）或（S）鏡像異構物形式存在於多胜肽中：
Figure 02_image005
Figure 02_image007
於本發明之另一方面，提供了一種分離的多胜肽，其包含選自SEQ ID NO: 1至47中任一之胺基酸序列或其一片段或其一功能變體。
如本文中參考SEQ ID NOs: 1至47中任一所用之術語“變體”或“功能變體”係指保留完整非變體序列的生物學功能的變體序列或該序列的一部分。一功能變體還包含一變體，其具有不影響功能的序列改變，例如在非保守殘基中。還包括基本相同的變體，即僅具有一些序列變異並且具有生物學活性。導致在給定的位點產生不同的胺基酸，而不影響編碼多胜肽的功能特性的核酸或胺基酸序列中的改變為本領域熟知的。例如，胺基酸丙胺酸的密碼子、疏水性胺基酸，可以編碼另一種疏水性較小的殘基的密碼子取代，如甘胺酸，或更疏水的殘留物，如纈胺酸、白胺酸，或異白胺酸。類似地，導致一個帶負電的殘基替換為另一個的變化，例如以天門冬胺酸替換谷胺酸，或另一個帶正電的殘留物，如以離胺酸替換精胺酸，也可預期產生功能相當的產物。所提出的每一種修飾都在本領域的常規技術範圍內，如同確定編碼產物的生物活性的保留一樣。
如本文所述之本發明的任何方面中所用，“變體”或“功能變體”具有至少與非變體胺基酸序列的總體序列25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或至少99%的同一性。
如果兩個序列中的核苷酸或胺基酸殘基的序列在如下所述進行最大對應性比對時為相同的，則稱兩個核酸序列或多胜肽為“相同的”。在兩個或更多個核酸或多胜肽序列的背景下，術語“相同”或“同一性”百分比係指兩個或更多個相同或具有指定百分比的胺基酸殘基或核苷酸的序列或子序列，當比較並對齊以在比較窗口上進行最大程度的對應時，使用以下序列比較演算法之一或透過手動對準及目視檢查來測量。當使用序列同一性百分比參考蛋白質或胜肽時，認識到不相同的殘基位置通常因保守胺基酸取代而不同，其中胺基酸殘基取代具有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)的其他胺基酸殘基，因此不改變分子的功能特性。當序列在保守取代方面不同時，可以向上調整序列同一性百分比以校正取代的保守性質。進行這種調節的方法為本領域技術人員所熟知的。對於序列比較，通常一個序列做為參考序列，以比較測試序列。當使用序列比較演算法時，將測試及參考序列輸入電腦，如果需要，指定子序列坐標，並指定序列演算法程序參數。可以使用內設的程序參數，也可指定替代參數。然後，序列比較演算法基於程序參數計算測試序列相對於參考序列的序列同一性百分比。適用於確定序列同一性百分比及序列相似性的演算法的非限制性實例為BLAST以及BLAST 2.0演算法。
本發明之多胜肽可以包括額外的胺基酸，例如，可用於純化多胜肽的N端添加物，例如結合標籤及切割識別位點。
於一實施例中，該結合標籤結合了麩胱甘肽；該標籤可為麩胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase, GST)。於另一實施例中，該標籤可為生物素。結合標籤目標較佳固定於一固體支撐物上；這使得結合的多胜肽易於與未結合的產物分離。可以使用固定在類似固體支撐物上的其他合適的結合標籤。
於另一實施例中，切割識別位點包含識別凝血酶、腸激酶，或因子Xa等的序列。較佳地，該位點在該結合標籤內或附近。
還可以修飾本發明之多胜肽。修飾的實例包括任何轉譯後修飾，例如，但不限於，糖基化、烷基化(例如，甲基化)、乙醯化、醯胺化、羥基化、泛素化、硫酸化，以及磷酸化，任何化學修飾或任何包含與另一蛋白或胜肽的非共價及共價連接的修飾。
本發明之另一方面提供了產生或純化此類多胜肽之方法，該方法包括在宿主細胞中表現包含編碼SEQ ID NOs: 1至47中任一個的核苷酸序列的載體，其中該載體較佳包含如本文所述之調節序列，另外，該載體另外較佳含有編碼一結合標籤的一核苷酸序列；使表現的多胜肽與該結合標籤的目標結合；並使該結合的多胜肽從該目標釋放。該宿主細胞可為真核細胞，例如一哺乳動物、其他脊椎動物或無脊椎動物、昆蟲、真菌或植物細胞；或者可為原核的，例如，細菌；並可使用細菌、酵母、其他真核生物、其他非真核或病毒序列來源的載體。該方法然後可以包括在識別位點切割該多胜肽之步驟。
可以透過技術人員已知的任何方法產生或合成該多胜肽，例如，於一具體實施例中，使用化學合成產生該多胜肽。實施例2中提供了合成本發明之多胜肽的方法的一個實施例。
於本發明之另一方面，提供了一種分離的多核苷酸，其中該分離的多核苷酸包含 (a) 一核苷酸序列，其編碼選自SEQ ID NOs: 1至47中任一之多胜肽或其一變體或其一片段，或 (b) 一與(a)互補的核苷酸序列； (c) 一核酸序列，其與(a)或(b)的總體序列具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或至少99%的同一性；或 (d) 一核酸序列，其編碼一選自SEQ ID NOs: 1至47中任一之多胜肽，其能夠在如本文所定義之嚴格條件下與(a)至(c)中任一之核酸序列雜交。
這些序列的雜交可以在嚴格條件下進行。“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”係指一探針與其目標序列雜交的可檢測程度大於其他序列(例如，至少比背景高2倍)的條件。嚴格條件依賴於序列，並且在不同情況下會有所不同。透過控制雜交及/或洗滌條件的嚴格性，可以鑑定與探針100%互補的目標序列(同源探測)。或者，可以調節嚴格條件以允許序列中的一些錯配，進而檢測到較低程度的相似性(異源探測)。通常，探針長度小於約1000個核苷酸，較佳長度小於500個核苷酸。
通常，嚴格條件為鹽類濃度小於約1.5 M鈉離子，通常約0.01至1.0 M鈉離子濃度(或其它鹽類)，於pH 7.0至8.3之間，且針對短探針(例如，10至50個核苷酸)溫度至少約30°C，以及針對長探針(例如，大於50個核苷酸)溫度至少約60°C。雜交持續時間通常小於約24小時，通常為約4至12小時。加入去穩定劑如甲醯胺也可達到嚴格的條件。
於本發明之另一方面，提供了一種核酸構築體或載體，其包含一核酸序列，該核酸序列編碼選自SEQ ID NO: 1至47中任一之多胜肽或其一功能變體或其一同源物，其中較佳地，該序列與一調節序列可操作地連接。該調節序列可為任何形式或啟動子，例如一組成型、強性、調節型，或誘導型啟動子，其在一目標或宿主細胞中表現時導致該核酸的表現。實施例包括，但不限於，病毒啟動子細胞巨大病毒(cytomegalovirus, CMV)啟動子以及SV40 (猿猴空泡病毒40)以及非病毒啟動子例如延伸因子(elongation factor, EF)-1以及肌動蛋白。
術語“啟動子”通常係指位於基因轉錄起始上游的核酸控制序列，其參與RNA聚合酶以及其他蛋白質的結合，從而指導可操作連接的核酸之轉錄。由前述術語包括的是衍生自經典真核基因組基因的轉錄調節序列(包括準確轉錄啟動所需的TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)以及其他調節要件(亦即，上游活化序列、增強子以及沈默子)其改變基因表現以反應發育及/或外部刺激，或為組織特異性的方式。該術語還包括經典原核基因的轉錄調控序列，在此情況下，其可包括-35盒序列及/或-10盒轉錄調控序列。
如本文所用之術語“可操作地連接”係指啟動子序列以及目標基因之間的功能性連接，使得該啟動子序列能夠啟動該目標基因的轉錄。
於本發明之另一方面，提供了一種包含上述多核苷酸之載體。載體可包括細菌或酵母質體、黏接質體、噬菌體、人工染色體或植物或哺乳動物病毒。較佳地，該載體為一表現載體，也稱為一表現構築體。於一具體實施例中，該表現載體可包含一起點或複製，至少一個可選擇的標記以及多選殖位點適於插入待表現的核酸序列。表現載體可透過本領域技術人員已知的許多技術中的任何一種產生。
於本發明之另一方面，提供了一種包含該核酸構築體的宿主細胞。該宿主細胞可為原核細胞或真核細胞，並且可包括細菌細胞、真菌細胞如酵母菌、植物細胞、昆蟲細胞，或哺乳動物細胞。僅作為一實施例，該哺乳動物宿主細胞可選自中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)細胞、COS、HEK，或HeLa細胞。或者，該宿主細胞可為一免疫細胞，例如一淋巴細胞(B淋巴細胞或T淋巴細胞)、巨噬細胞或肥大細胞，或肝臟或脾細胞、內皮細胞、纖維母細胞，或基質細胞。還提供了一種包含根據本發明上述方面的外源多核苷酸之宿主細胞。較佳地，該宿主細胞表現該多核苷酸。
於本發明之另一方面，提供了產生如本文所述之多胜肽之方法，該方法包括將如上所述之核酸構築體導入並表現到一宿主細胞中並分離該多胜肽。
透過稱為轉化或轉染的過程將該核酸構築體引入該宿主細胞中。本文提及之術語“引入”或“轉化”或“轉染”包括將外源多核苷酸轉移至宿主細胞中，而不管所用之轉移的方法為何。該多核苷酸可瞬間或穩定地引入該宿主細胞中並可以保持非整合的，例如，作為質體。或者，其可整合到該宿主的基因組中。
轉化現為許多物種的常規技術。有利地，可以使用幾種轉化方法中的任何一種將目標基因引入合適的祖先細胞中。轉化方法包括使用脂質體、電穿孔、增加游離DNA攝取的化學物質、將DNA直接注入宿主細胞、粒子槍轟擊、使用病毒或花粉進行轉化，以及微噴射。
於本發明之另一方面，提供了一種提高細胞激素含量之方法，該方法包括將如本文所述之分離的多胜肽或多核苷酸或核酸構築體的至少一種或任何組合給予一有此需要的目標細胞或患者。
於一具體實施例中，該細胞激素為IL-2、IL-4、IL-12以及IFN-γ中的至少一種。
於另一具體實施例中，相較於對照組細胞中的含量，細胞激素的釋放增加10至200%，更佳為10至150%。於一具體實施例中，該對照組細胞為未受刺激的(亦即沒有施用胜肽)細胞。
於一具體實施例中，相較於一對照組中的含量，IL-2的含量增加5%至150%，更佳為至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%或更高。於一具體實施例中，該胜肽為SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 25，且增加的含量為5至40%，更佳為5至15%。
於另一具體實施例中，相較於一對照組中的含量，IL-4的含量增加5%至100%，更佳為至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100% 或更高。於一具體實施例中，該胜肽是SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 25，且相較於一對照組中的含量，增加的含量為5至40%，更佳為10至20%。
於另一具體實施例中，相較於一對照組中的含量，IFN-γ的含量增加2%至100%，更佳為至少2%、5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更高。於一具體實施例中，該胜肽為SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 25，且相較於一對照組中的含量，增加的含量為25-60%，更佳為30-40%。
於另一具體實施例中，相較於一對照組中的含量，IL-12的含量增加10至400%，更佳為至少10%、50%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%或更高。於一具體實施例中，該胜肽為SEQ ID No. 1或SEQ ID NO. 25，且相較於一對照組中的含量，增加的含量為150-250%，更佳為180-220%。
於本發明之另一方面，提供了如本文所述之分離的多胜肽或多核苷酸的至少一種或任何組合，以作為藥物之用途。
於本發明之另一方面，提供了一種治療方法，包括對一有需要的個體或患者施用本文所述之分離的多胜肽或多核苷酸或核酸構築體的至少一種或任何組合。
於本發明之另一方面，提供了如本文所述之分離的多胜肽、多核苷酸或核酸構築體中的至少一種或任何組合，用於治療癌症之用途。
於本發明之另一方面，提供了一種治療癌症之方法，該方法包括對一有此需要的患者施用如本文所述之分離的多胜肽、多核苷酸或核酸構築體中的至少一種或任何組合。
於本發明之另一個方面，提供了如本文所述之分離的多胜肽或多核苷酸或核酸構築體的至少一種或任何組合於製備用於治療癌症之藥物中的用途。
於一實施例中，該癌症可選自以下之一：胰臟癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、支氣管癌、直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經系統癌、周圍神經系統癌、食道癌、子宮頸癌、子宮或子宮內膜癌、口腔癌或咽喉癌、肝癌、腎臟癌、睪丸癌、膽道癌、小腸或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、血液組織癌、神經膠質瘤、淋巴瘤等。於一具體實施例中，該癌症為肝癌。
於本發明之另一個方面，提供了一種減少腫瘤細胞增殖之方法，該方法包括：對一有此需要的目標細胞或患者施用如本文所述之分離的多胜肽或多核苷酸或核酸構築體中的至少一種。於一具體實施例中，相較於一對照組中的含量，降低的含量為10至60%，更佳為至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或更高。於一具體實施例中，該胜肽為SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 25，且相較於一對照組中的含量，降低的含量為5-20%，更佳為10-15%。
如本文所用，一對照組可為未以至少一種本發明之多胜肽治療的個體、患者或細胞。
於本發明之另一方面，提供了一種藥物組合物，其包含本文所述之胜肽、多核苷酸、載體或構築體中的任何一種或至少一種以及一藥學上可接受之載劑。通常在給予患者之前使用熟知的方法配製該組合物。
施用本發明之多胜肽或藥物組合物可以口服或胃腸外的方式完成。腸胃外給藥的方法包括局部給藥、動脈內、肌肉內、皮下、髓內、鞘內、心室內、靜脈注射、腹腔注射、黏膜或鼻內給藥。除了活性成分之外，此類組合物還可包含合適的藥學上可接受之載劑，其包含賦形劑以及其他組成分，這有助於將活性化合物加工成適於藥物給藥之製劑。
用於口服給藥之藥物組合物可使用本領域已知的藥學上可接受之載劑以適於口服給藥的劑量配製。這些載劑使該組合物能夠配製成片劑、藥丸、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等適合於受試者攝取的劑型。
口服使用的藥物製劑可透過將活性化合物與一固體賦形劑組合，任選地研磨所得混合物，並在需要時加入合適的額外的化合物以加工顆粒混合物以獲得片劑或糖衣錠核心。合適的賦形劑包括碳水化合物或蛋白質填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇；來自玉米、小麥、水稻、馬鈴薯或其他植物的澱粉；纖維素如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；以及樹膠，包括阿拉伯膠以及黃蓍膠；以及明膠與膠原蛋白等蛋白質。如果需要，可以加入崩解劑或增溶劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸，或其鹽類。
糖衣錠核心可提供合適的塗層，如濃縮糖溶液，其中也可能含有阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇、二氧化鈦、漆溶液，以及合適的有機溶劑或溶劑混合物。可以將染料或顏料加入片劑或糖衣錠塗層中以區分產品或標示活性化合物的量。
可口服使用的藥物製劑包括由明膠製成的推入式膠囊，以及由明膠與塗層如甘油或山梨糖醇製成的柔軟、密封膠囊。推入式膠囊可含有與填充劑或黏合劑(如，乳糖或澱粉)混合的活性成分，潤滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂，以及任選的穩定劑。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮在合適的液體中，例如脂肪油、液體石蠟，或液體聚乙二醇，具有或不具有穩定劑。
用於腸胃外給藥的藥物製劑包括活性化合物的水溶液。針對注射，本發明之藥物組合物可配製於水溶液中，較佳為在生理上相容的緩衝液中，例如Hanks溶液、Ringer溶液或生理緩衝鹽水。水性懸浮液注射劑可含有增加懸浮液黏度的物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚醣。另外，活性化合物的懸浮液可製備成適當的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質體。任選地，懸浮液還可含有合適的穩定劑或增加化合物溶解度的試劑，以製備高濃度溶液。藥物組合物還可包含佐劑以增強或調節抗原性。
針對局部或鼻腔給藥，可在該製劑中使用適合於待滲透的特定屏障的滲透劑。
於本發明之另一方面，提供了本文所述之分離的多胜肽、多核苷酸、核酸構築體或宿主細胞作為一佐劑之用途。於一具體實施例中，該多胜肽、多核苷酸或核酸構築體可作為細胞佐劑或免疫治療劑，以化學吸引細胞以調節先天或適應性免疫並增加抗原性。於一具體實施例中，本發明之多胜肽、多核苷酸或核酸構築體與一抗原或另一種免疫治療劑共同施用。
雖然前述揭露內容提供了包含在本發明範圍內之主題的一般描述，包括製造及使用本發明之方法及其最佳模式，提供以下實施例以進一步使本領域技術人員能夠實施本發明並提供其完整的書面描述。然而，本領域技術人員將理解，這些實施例的細節不應被理解為對本發明的限制，本發明之範圍應當從申請專利範圍及其附加於本揭露的等同物中理解。鑑於本發明內容所揭露者，本發明的各種其他方面以及具體實施例對於本領域技術人員而言為顯而易見的。
如本文所用，“及/或”將被視為具有或不具有另一個的兩個指定特徵或組件中的每一個的具體揭露。例如，“A及/或B”將被視為(i) A、(ii) B，以及(iii) A及B中的每一個的具體揭露內容，如同每一個在本文中單獨列出一樣。
除非上下文另有規定，否則上述特徵之描述及定義不限於本發明之任何特定方面或實施例，且同樣適用於所描述的所有方面及實施例。
上述申請案，以及其中引用或在其申請期間引用的所有文件以及序列登錄號(“引用文件”)以及引用文獻中標註或引用的所有文獻，以及本文標註或引用的所有文獻(“此處引用之文件”)，本文引用文獻中標註或引用的所有文獻，以及本文提及的任何產品或透過引用併入本文的任何文獻的任何製造商的說明書、描述、產品說明書，以及產品手冊，均透過引用併入本文，並且可用於實施本發明。更具體地，所有參考文獻透過引用併入，其程度如同每個單獨的文件被具體且單獨地指出透過引用方式併入一樣。
現以下列非限制性實施例描述本發明。
實施例1
實驗大綱
我們透過增強免疫系統來評估該胜肽的抗腫瘤活性，透過三個獨立的實驗，其如下所述： 1.) 評估它們抑制人類腫瘤細胞增殖之能力。 2.) 它們以小鼠脾淋巴細胞處理後增加免疫細胞相關細胞激素分泌之能力。 3.) 最後，分離該胜肽處理後的小鼠脾淋巴細胞的血清，直接加入人類腫瘤細胞，於該人類腫瘤細胞中評估該血清對腫瘤細胞增殖的抑制作用。
實驗
1  - 胜肽對腫瘤細胞之細胞毒性 a) 細胞培養 -  HepG2細胞在DMEM高葡萄糖培養基(含10%體積的FBS)中生長，並於一5% CO2 培養箱中於37°C下培養。以胰蛋白酶消化，常規地進行細胞繼代。 b) CCK-8檢測細胞增殖 - 將對數生長期的HepG2細胞製成細胞懸浮液，並將5×103 個細胞接種於一96孔平底盤的每個孔中。過夜培養後，細胞在貼壁培養中生長，並以含有溶於PBS/DMSO中的不同濃度多胜肽的培養基替換。空白溶劑作為陰性對照組。每個樣品進行三重複並培養15小時。然後，加入cck-8 (10μl/孔)並培養1小時。在酵素聯結免疫吸附劑上測量波長450 nm處的吸光度A值。
該實驗之結果如第1圖所示。如第1圖所示，該胜肽本身對腫瘤細胞的增殖沒有影響，因此本身不具有細胞毒性。
2.候選胜肽的免疫活性之研究
製備小鼠脾淋巴細胞，並透過刺激實驗用的候選胜肽測試免疫活性。 a) 透過頸脫位犧牲雄性昆明(KM)小鼠，無菌解剖脾臟。然後將脾臟置於含有5 mL淋巴細胞分離液的培養皿中並研磨。透過以800 xg離心30分鐘收集細胞，並除去上清液。以10 mL RPMI 1640細胞培養基(1640)洗滌細胞，並透過以250 xg離心10分鐘分離。使用1640以及胎牛血清(FBS)重新懸浮細胞，並將淋巴細胞的濃度調整至5×106 個/mL。於一96孔盤中的每個孔中加入100 μL懸浮細胞，每樣品三重複加入不同濃度的候選多胜肽(溶於PBS/DMSO中)並培養24小時。ConA/LPS作為陽性對照組。 b) ELISA-培養後，將該樣品離心，分離上清液並根據ELISA套組的說明進行細胞激素濃度檢測。簡言之，於每個孔中加入50 μL RD-14，然後加入50 μL樣品(來自步驟A的標準品、對照組，以及分離的上清液)。混合後，將溶液在室溫下作用2小時。將樣品洗滌5次；加入100 μL結合液並於室溫下作用2小時。然後將樣品洗滌5次，加入100 μL基質溶液，於室溫下避光培養30分鐘，然後加入100 mL猝滅溶液，測量隨後的OD值(450 nm)。
該實驗之結果如第2圖所示。如第2圖所示，增加濃度的多胜肽導致IL-2、IL-4、IFN-γ，以及IL-12的含量分別增加。
3. 候選胜肽對腫瘤細胞的免疫活性
根據步驟(2a)刺激脾淋巴細胞，並透過離心獲得含有免疫細胞激素的上清液。將該上清液加入過夜培養的HepG2細胞中並且再培養24小時。使用(1)空白溶劑以及(2)溶解在PBS/DMSO中的多胜肽進行兩個陰性對照組。MTT法檢測細胞存活率，分析其對腫瘤細胞增殖之影響。該實驗之結果如第3圖所示。如圖中所示的“0.00”濃度代表未以胜肽攻擊的脾臟上清液。代號“(1.00)”係指直接給予HepG2細胞濃度為1 mg/mL的胜肽，因此不含任何細胞激素(類似於實驗1，如第1圖所示)。如第3圖所示，以各種濃度的目前請求保護的胜肽攻擊的脾臟上清液顯著降低了模型人類肝癌細胞(HepG2細胞)中的細胞增殖。
實施例2
用於製備胜肽之示例性方法
於一實施例中，可使用以下方法產生本發明之胜肽： a) 對一手動胜肽反應器中加入200 mg 2-氯三苯甲基樹脂(1.0 mmol/g)並以DCM溶脹30分鐘，然後乾燥。透過鼓泡N2 將相應的Fmoc保護的胺基酸(0.4 mmol，2當量)、DIEA (0.4 mmol，2當量)以及合適量的DMF及DCM混合1小時。 然後加入MeOH (1.0 mmol，5當量)以及DIEA (0.4 mmol，2當量)並反應30分鐘以封閉未反應的位點。 b) 以DMF (x5)洗滌樹脂，然後與在DMF溶液中的20%哌啶反應10分鐘以除去Fmoc基團。在DMF中重複加入20%哌啶兩次。以DMF洗滌所得樹脂，然後以氯醌試驗檢查。 c) 將下一個Fmoc胺基酸(0.4 mmol，2當量)、HBTU (0.4 mmol，2當量)，以及DIEA (0.4 mmol，2當量)的DMF/DCM溶液加到樹脂中，並透過鼓泡N2 混合1小時， 透過氯醌試驗檢查樹脂。如果偶聯不完全，加入另一部分Fmoc胺基酸以及偶聯試劑，再反應1小時。 d) 重複步驟(b)與(c)直到序列完成。 e) 除去最後一個Fmoc基團後，將樹脂轉移到單獨的玻璃小瓶中，然後於室溫下加入裂解混合物(95% TFA、2% EDT、2% TIS，以及1%水)並靜置3小時。將所得混合物過濾、濃縮，並轉移至冷乙醚中(10倍體積的濃縮混合物)。透過離心分離胜肽。將隨後的沉澱物真空乾燥，然後透過HPLC純化。
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序列表 SEQ ID NO: 1 = PyroQ-ETAVSSHEQD SEQ ID NO: 2 = AETAVSSHEQD SEQ ID NO: 3 = PyroQ-ATAVSSHEQD SEQ ID NO: 4 = PyroQ-EAAVSSHEQD SEQ ID NO: 5 = PyroQ-ETAASSHEQD SEQ ID NO: 6 = PyroQ -ETAVSAHEQD (7) SEQ ID NO: 7 = PyroQ -ETAVSSHAQD (9) SEQ ID NO: 8 = PyroQ -ETAVSSHEAD (10) SEQ ID NO: 9 = PyroQ -ETAVSSHEQA (11) SEQ ID NO: 10 = PyroQ -DTAVSSHEQD (12) SEQ ID NO: 11 = PyroQ -ESAVSSHEQD (15) SEQ ID NO: 12 = PyroQ -ETAISSHEQD (20) SEQ ID NO: 13 = PyroQ -ETALSSHEQD (21) SEQ ID NO: 14 = PyroQ -ETAMSSHEQD (22) SEQ ID NO: 15 = PyroQ -ETAVTSHEQD (23) SEQ ID NO: 16 = PyroQ -ETAVSTHEQD (24) SEQ ID NO: 17 = PyroQ -ETAVSSKEQD (25) SEQ ID NO: 18 = PyroQ -ETAVSSQEQD (27) SEQ ID NO: 19 = PyroQ -ETAVSSREQD (28) SEQ ID NO: 20 = PyroQ -ETAVSSHNQD (30) SEQ ID NO: 21 = PyroQ -ETAVSSHQQD (31) SEQ ID NO: 22 = PyroQ -ETAVSSHEDD (32) SEQ ID NO: 23 = PyroQ -ETAVSSHEND (34) SEQ ID NO: 24 = PyroQ -ETAVSSHEQN (36) SEQ ID NO: 25 = PyroE-ETAVSSHEQD SEQ ID NO: 26 = PyroE -ATAVSSHEQD SEQ ID NO: 27 = PyroE -EAAVSSHEQD SEQ ID NO: 28 = PyroE -ETAASSHEQD SEQ ID NO: 29 = PyroE -ETAVSAHEQD (7) SEQ ID NO: 30 = PyroE -ETAVSSHAQD (9) SEQ ID NO: 31 = PyroE -ETAVSSHEAD (10) SEQ ID NO: 32 = PyroE -ETAVSSHEQA (11) SEQ ID NO: 33 = PyroE -DTAVSSHEQD (12) SEQ ID NO: 34 = PyroE -ESAVSSHEQD (15) SEQ ID NO: 35 = PyroE -ETAISSHEQD (20) SEQ ID NO: 36 = PyroE -ETALSSHEQD (21) SEQ ID NO: 37 = PyroE -ETAMSSHEQD (22) SEQ ID NO: 38 = PyroE -ETAVTSHEQD (23) SEQ ID NO: 39 = PyroE -ETAVSTHEQD (24) SEQ ID NO: 40 = PyroE -ETAVSSKEQD (25) SEQ ID NO: 41 = PyroE -ETAVSSQEQD (27) SEQ ID NO: 42 = PyroE -ETAVSSREQD (28) SEQ ID NO: 43 = PyroE -ETAVSSHNQD (30) SEQ ID NO: 44 = PyroE -ETAVSSHQQD (31) SEQ ID NO: 45 = PyroE -ETAVSSHEDD (32) SEQ ID NO: 46 = PyroE -ETAVSSHEND (34) SEQ ID NO: 47 = PyroE -ETAVSSHEQN (36)
無。
於以下非限制性附圖中進一步描述本發明：第 1 圖 所示為當施用不同濃度時，本發明之多胜肽對HepG2 (人類肝癌細胞株)細胞的增殖缺乏毒性。第 2 圖 所示為施用該多胜肽對小鼠脾淋巴細胞分泌細胞激素(IL-2、IL-4、IFN-γ，以及IL-12)之影響。第 3 圖 所示為施用該多胜肽處理的小鼠脾淋巴細胞血清(含有細胞激素)對HepG2細胞增殖之影響。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
無。

Claims (24)

  1. 一種分離的多胜肽，其包含胺基酸序列 X1 X2 X3 AX4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 ； X1 係選自焦麩醯胺(PyroQ)以及A； X2 係選自由D、E，以及A所組成之群組； X3 係選自由T、A，以及S所組成之群組； X4 係選自由V、A、I、L，以及M所組成之群組； X5 係選自由T以及S所組成之群組； X6 係選自由T、A，以及S所組成之群組； X7 係選自由H、K、Q，以及R所組成之群組； X8 係選自由E、A、N，以及Q所組成之群組； X9 係選自由D、N、Q，以及A所組成之群組； X10 係選自由N、D，以及A所組成之群組； 或其功能變體之一片段。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之分離的多胜肽，其中X1 為PyroQ。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之分離的多胜肽，其中X2 為E。
  4. 如前述申請專利範圍中任一項所述之分離的多胜肽，其中X3 為T。
  5. 如前述申請專利範圍中任一項所述之分離的多胜肽，其中X4 為V。
  6. 如前述申請專利範圍中任一項所述之分離的多胜肽，其中X5 為S。
  7. 如前述申請專利範圍中任一項所述之分離的多胜肽，其中X6 為S。
  8. 如前述申請專利範圍中任一項所述之分離的多胜肽，其中X7 為H。
  9. 如前述申請專利範圍中任一項所述之分離的多胜肽，其中X8 為E。
  10. 如前述申請專利範圍中任一項所述之分離的多胜肽，其中X9 為Q。
  11. 如前述申請專利範圍中任一項所述之分離的多胜肽，其中X10 為D。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之分離的多胜肽，包含一選自由SEQ ID NO: 1-47或其一片段或其一功能變體所組成之群組的胺基酸序列。
  13. 一種分離的多核苷酸，其中該多核苷酸編碼如申請專利範圍第1項所述之多胜肽。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之分離的多核苷酸，其中該多核苷酸編碼一選自SEQ ID NOs: 1至47中任一之一多胜肽。
  15. 一種核酸構築體，包含至少一種如申請專利範圍第13項或第14項所述之分離的多核苷酸。
  16. 一種載體，包含如申請專利範圍第15項所述之核酸構築體。
  17. 一種宿主細胞，包含至少一種如申請專利範圍第16項所述之載體。
  18. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項所述之分離的多胜肽、多核苷酸、核酸構築體或宿主細胞作為一藥物之用途。
  19. 一種治療方法，包括對一有此需要的患者施用如申請專利範圍第1項至第17項任一項所述之分離的多胜肽、多核苷酸、核酸構築體或宿主細胞的至少一種。
  20. 一種增加細胞激素含量或刺激細胞激素釋放之方法，該方法包括對一目標細胞或患者施用如申請專利範圍第1項至第17項中任一項所述之分離的多胜肽、多核苷酸、核酸構築體或宿主細胞的至少一種。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之方法，其中該細胞激素為IL-2、IL-4、IFN-γ以及IL-12中的至少一種。
  22. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項所述之分離的多胜肽、多核苷酸、核酸構築體或宿主細胞用於治療癌症之用途。
  23. 一種治療癌症之方法，該方法包括對一有此需要的患者施用如申請專利範圍第1項至第17項中任一項所述之分離的多胜肽、多核苷酸、核酸構築體或宿主細胞的至少一種。
  24. 一種藥物組合物，包含如申請專利範圍第1項至第17項中任一項所述之分離的多胜肽、多核苷酸、核酸構築體或宿主細胞以及一藥學上可接受之載劑。
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