CN117384273A - 一种聚乙二醇修饰的il-2衍生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇修饰的IL‑2衍生物及其应用。通过在野生型IL‑2的第19位氨基酸引入突变、在第125位引入突变和在末端融合一段亲水短肽，降低其疏水性，使IL‑2在生产过程中全程使用水相纯化，减少环境污染，降低成本，增加蛋白稳定性；同时通过在第65位氨基酸上进行不同的突变，可以调节IL‑2与CD25的结合活性，进而得到最优的CD25结合强度；进一步的改造，通过在末端融合的亲水短肽中引入一个半胱氨酸突变，进行PEG修饰后延长其半衰期。经过改造后的PEG分子在动物实验中展现出较低的毒性和良好的抗肿瘤效果。

Description

一种聚乙二醇修饰的IL-2衍生物及其应用
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰的IL-2衍生物及其应用。
背景技术
白介素-2(IL-2，Interleukin-2)于1976年被发现，当时被称为T细胞生长因子(T-cell growth factor，TCGF)，是一种在维持T淋巴细胞和NK细胞的正常功能中起着重要作用的球状糖蛋白。天然IL-2是一个具有133个氨基酸残基组成的多肽(SEQ ID NO：1)，分子量大约15kD。IL-2有三个半胱氨酸残基，分别位于第58、105和125位，其中第125位的半胱氨酸不与其它半胱氨酸形成二硫键，故在重组表达时通常突变为其它氨基酸，例如Ala或Ser等。翻译后修饰包括第3位的苏氨酸糖基化，第58位和105位半胱氨酸残基形成二硫键，并形成其功能必不可少的主要由4个α螺旋以及一些连接序列(loop)组成的高级结构(Bazan等，Science 257,410-413(1992))。IL-2主要由活化的T细胞生成，它能促进T细胞的增殖和分化，维持T细胞活性；刺激天然杀伤(NK)细胞的生成、增殖和活化，并诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生成以及诱导和激活淋巴因子激活的杀细胞(LAK)及肿瘤浸润淋巴细胞；促进T细胞表达细胞因子和细胞溶解分子，促进B细胞的增殖(Waldmann等,Nat Rev Immunol,595-601(2009))等，这些细胞都有直接或间接有杀伤外源微生物感染细胞以及癌变细胞的作用，因此IL-2有很好的抗病毒、抗癌作用和广泛的临床应用潜力。IL-2通过结合IL-2受体(IL-2receptors，IL-2R)来介导其作用，IL-2受体由3个亚基组成，分别为α(即CD25)、β(即CD122)和γ(即CD132)受体亚基，其中α受体在抑制性T细胞(Treg)表面高表达，一些内皮细胞(endothelial cells)表面也有α受体表达，而β和γ受体亚基则高表达于效应性T细胞(Teff)和NK细胞。α(CD25)、β(CD122)和γ(CD132)受体亚基可以形成αβγ异源三聚体，也可以形成βγ异源二聚体。IL-2对不同受体亚基的复合物形式的亲和力是不同的，IL-2对αβγ三聚体受体的亲和力是最高的，对由β和γ形成的二聚体受体的亲和力则为中等(约降低100倍)，而IL-2与两种形式的受体亚基组合结合后均能传递胞内信号，发挥细胞免疫功能(Minami等，Annu Rev Immunol 11，245-268(1993))。目前在临床应用中，主要利用高剂量的IL-2可以有效激活效应T细胞和NK细胞，进而对肿瘤产生杀伤作用。阿地白介素(HUMANALDESLEUKIN)，一种重组的人野生型IL-2，于1992年被FDA批准治疗转移性肾癌，1998年，该药又被批准用于治疗转移性黑色素瘤。然而，野生型IL-2会通过优先结合Treg表面的αβγ三聚体受体而激活大量Treg细胞，从而中和部分效应T细胞和NK细胞对肿瘤杀伤的效果。同时，野生型IL-2结合内皮细胞表面的α受体会引起诸如血管渗漏综合征等副作用，因此，IL-2分子改造的关键之一是减弱或消除野生型IL-2对α受体的结合作用。同时，最近的研究表明，CD8+杀伤性T细胞表面也会表达少量的α受体，且该受体对于维持CD8+杀伤性T细胞的活力起到重要作用，因此，完全消除IL-2对α受体的结合会导致其抗肿瘤活性的下降。如何平衡IL-2分子对α受体的结合活力也是IL-2分子改造的关键之一。
另外，野生型IL-2本身的半衰期较短，在体内很快会被代谢或者清除，如何延长IL-2的半衰期也是IL-2分子改造的方向之一。目前在研的IL-2中，Nektar Therapeutics公司开发的NKTR-214是进展比较快的分子,它在IL-2与CD25结合的界面附近平均偶联了6个PEG链。这种PEG修饰方式有效地阻断了它与高亲和力IL-2R受体的结合，让NKTR-214更倾向于激活CD8阳性记忆T细胞和NK细胞。赛诺菲公司的SAR444245则通过在IL-2蛋白与CD25结合的界面上引入非天然氨基酸，将PEG链精准连接在IL-2表面，阻断IL-2与CD25的结合。然而，尽管众多制药公司或科研机构对IL-2分子做了大量的改造与设计，目前在研的IL-2类药物仍然存在着毒性较强和活性不高的问题，例如Nektar Therapeutics公司开发的NKTR-214在临床III期实验中，给药剂量为50μg/kg，仅略高于野生型IL-2的35μg/kg的给药剂量，表明其毒性仍然较强，后期临床结果分析也发现NKTR-214的临床治疗表现也不尽如意。同时，野生型IL-2在中性水溶液中水溶性很低，商业化生产时通常需要引入诸如乙腈等有机溶剂和SDS(十二烷基硫酸钠)等有毒物质，这些都限制了IL-2的规模化制备和药物制剂开发。
因此，现有技术缺乏能够同时对CD25的结合活性进行差别化调节、亲水性高、低毒性、循环半衰期长的IL-2突变体或衍生物衍生物。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的现状及存在的不足，提供一种IL-2衍生物，在保留原有IL-2良好的活性下，通过在野生型IL-2中引入特定位点的突变、在第125位引入一个突变和在末端融合一段亲水短肽，降低其疏水性，增强亲水特性，使IL-2在生产过程中全程使用水相纯化，减少环境污染，降低成本，增加蛋白稳定性；同时通过在另外一个位点上进行不同氨基酸的突变，可以调节IL-2同CD25的结合活性，进而得到最优的CD25结合强度；进一步的改造，通过在末端融合的亲水短肽中引入一个半胱氨酸突变，进行PEG修饰后延长其半衰期。PEG修饰后的分子，在动物实验中表现出较低的毒性和良好的抗肿瘤活性。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案施行：
在第一方面，本发明提供一种IL-2突变体或衍生物，所述IL-2突变体或衍生物相对于野生型IL-2的氨基酸序列SEQ ID NO：1的第19位Leu发生第一氨基酸突变、第65位Pro发生第二氨基酸突变、第125位Cys被Ala取代，并在C末端引入一条酸性的亲水多肽IST。
在优选的实施方式中，所述第一氨基酸突变选自下组的氨基酸取代L19A或L19H。
在优选的实施方式中，所述第二氨基酸突变选自下组的氨基酸取代：P65A、P65T、P65S、P65E或P65Q。
在优选的实施方式中，所述亲水多肽IST的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体为SEPATSGSETPGSEPATSGSETPG。
在优选的实施方式中，所述IL-2突变体或衍生物的氨基酸序列如SEQ ID NO：11-15任一项所示。
在第二方面，本发明提供一种IL-2衍生物，所述IL-2衍生物在第一方面所述的IL-2突变体或衍生物的C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变，与IST的氨基酸序列SEQ IDNO:2相比，所述第四氨基酸突变选自以下取代：G19C、G12C或G7C(编号从SEQ ID NO：2中第一个氨基酸开始)；所述IL-2衍生物还具有连接至C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变的位点的半胱氨酸的聚乙二醇部分，其中所述聚乙二醇部分具有10～40kDa之间的分子量。
在优选的实施方式中，所述IL-2衍生物的聚乙二醇部分具有20kDa的分子量。
在优选的实施方式中，所述IL-2衍生物的氨基酸序列如SEQ ID NO：16-21任一项所示。
在第三方面，本发明提供一种增加第一方面所述的IL-2突变体或衍生物的循环半衰期的方法，所述方法包括：(1)在第一方面所述的IL-2突变体或衍生物的C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变，与IST的氨基酸序列SEQ ID NO:2相比，所述第四氨基酸突变选自以下取代：G19C、G12C或G7C(编号从SEQ ID NO：2中第一个氨基酸开始)；(2)将聚乙二醇部分连接至C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变的位点的半胱氨酸残基。
在优选的实施方式中，其中所述IL-2衍生物的聚乙二醇部分具有10～40kDa之间的分子量。
进一步优选地，所述IL-2衍生物的聚乙二醇部分具有20kDa的分子量。
在优选的实施方式中，步骤(1)获得的IL-2衍生物的氨基酸序列如SEQ ID NO：16-21任一项所示。
在第四方面，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面或第二方面所述的IL-2突变体或衍生物的氨基酸序列。
在第五方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含第四方面所述的多核苷酸。
在第六方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含第五方面所述的表达载体，或者所述宿主细胞的基因组整合有第四方面所述的多核苷酸。
在第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面或第二方面所述的IL-2突变体或衍生物与药学上可接受的辅料。
在第八方面，本发明提供第一方面所述的IL-2突变体或衍生物、第二方面所述的IL-2衍生物和第七方面所述的药物组合物在制备应用IL-2作免疫治疗的疾病药物中的应用。
在优选的实施方式中，所述疾病是癌症、免疫疾病、人类免疫缺陷病毒HIV感染、丙型肝炎病毒HCV感染、风湿性关节炎，特应性皮炎和系统性红斑狼疮等。
在优选的实施方式中，所述癌症是通过刺激免疫系统或通过增殖免疫细胞来治疗的癌症。
本发明中除有特殊说明以外，所有氨基酸编号均以天然IL-2(SEQ ID NO：1)为准。
本发明的有益效果：
1、本发明通过引入一个特定的点突变Leu19并在末端引入一个亲水性多肽IST，在不影响分子活性的情况下大幅度提高了IL-2突变体或衍生物的亲水性，在中性水溶液中溶解度相对野生型IL-2提高超过10倍以上。改造后的IL-2在整个纯化过程中不需要引入反相层析，大大节约了生产成本且保护环境。
2、本发明改造后的IL-2分子，因为亲水性的提高，在中性水环境中可溶性显著提高，有利于药物的制剂配方。
3、本发明中改造后的IL-2分子对CD25的亲和力随突变位点P65的不同氨基酸侧链的长短而改变，侧链长的氨基酸突变体亲和力弱，侧链短的氨基酸突变体亲和力强。因此属于可以根据要求而调节亲和力大小的一类IL-2突变体或衍生物。本发明中还发现当P65位突变为T(苏氨酸)时，同时具备最优的抗肿瘤活性和较低的毒性。
4、本发明在增加IL-2亲水性的基础上，在C末端亲水多肽IST引入一个半胱氨酸突变，进行PEG修饰后延长了其半衰期。PEG修饰后的IL-2衍生物具备较低的毒性和良好的抗肿瘤活性。
附图说明
图1.部分IL-2突变体使用大肠杆菌表达后的SDS-PAGE胶分析图；
图2.部分IL-2突变体经过复性以后的SDS-PAGE胶分析图；
图3.部分IL-2突变体或衍生物最终纯化后样品的SDS-PAGE分析图；
图4.IL-2突变体及野生型IL-2在CTLL2上细胞增殖实验；
图5.偶联PEG的IL-2衍生物小鼠脾脏细胞活性实验；
图6.IL-2衍生物1351-PEG对小鼠体重的影响(3mg/kg,一周两次)；
图7.偶联PEG的IL-2衍生物对带有CT-26肿瘤细胞模型小鼠的抑瘤效果；
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
定义与说明：
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
“白介素-2”或“IL-2”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然的IL-2。该术语涵盖未加工的IL-2以及源自细胞中的加工的任何形式的IL-2。该术语还涵盖天然存在的IL-2变体，例如剪接变体或等位变体。示例性野生型人IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
如本文所用，术语“IL-2突变体”、“IL-2衍生物”、“IL-2衍生物蛋白”、“改造后的IL-2分子”可互换使用，指在本发明第一方面中所述的一种IL-2衍生物，与野生型IL-2SEQID NO：1相比，这些IL-2衍生物可能会在C末端引入一条亲水多肽，或所述IL-2衍生物在SEQID NO：1所示的氨基酸序列的第19位Leu发生或者不发生第一氨基酸突变，或第65位Pro发生或者不发生第二氨基酸突变、在第125位发生或者不发生C125A突变，或在第一方面所述的IL-2衍生物的C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变，与IST的氨基酸序列SEQ ID NO:2相比，所述第四氨基酸突变选自以下取代：G19C、G12C或G7C。
“衍生物”旨在被广义地解释，包括任意IL-2相关的产品。包括但不限于人和非人的IL-2同系物、片段或截短体、融合蛋白(如与信号肽融合或其他活性、非活性成份融合，活性成份例如抗体或其抗原结合片段)、修饰形式(如PEG化、糖基化、白蛋白缀合/融合、Fc缀和/融合、羟乙基化等)、和保守修饰的蛋白等。
如本文所用，术语“IL-2wt(C125A)”指含有突变C125A的IL-2，其氨基酸序列如SEQID NO：8所示。
如本文中使用的，术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任意组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的特性。优选的氨基酸突变是氨基酸取代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。优选的氨基酸取代包括一些亲水的带电或者不带有电荷的氨基酸，如Ser，Thr，Ala，Gly，Glu，Arg，His和Lys。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变、PCR、基因合成等。
当提及来自野生型蛋白的变体时，提及氨基酸取代诸如“L19H”是指原始残基亮氨酸(L)的位置数目(19)，随后是取代的残基组氨酸(H)。
本文所用的术语“融合蛋白”为将所述突变体蛋白与亲水性多肽融合得到的蛋白质。亲水性多肽位于突变体蛋白的C端或者N端。
如本文中使用的，术语“亲水性多肽”是指由一些亲水氨基酸组成的随机的多肽序列，该多肽序列可由如下氨基酸随机组合而成：Arg，His，Lys，Asp，Glu，Gly，Pro，Ala，Ser，Thr，Asn，Gln，优选的氨基酸包括Asp，Glu，Gly，Pro，Ala，Ser，Thr，Asn，Gln。
一般方法
通常，本发明的IL-2衍生物的制备可由本文公开的程序和由公认的重组DNA技术实现，所述公认的重组DNA技术包括例如，聚合酶链式反应(PCR)、质粒DNA的制备、用限制性酶裂解DNA、寡核苷酸的制备、DNA的连接、mRNA的分离、将DNA引入适当的细胞、转化或转染宿主、宿主的培养。另外，可以使用离液剂和熟知的电泳、离心和色谱方法分离和纯化融合分子。关于这些方法的公开内容一般参见，Sam brook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第二版(1989)；和Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York(1989)。
编码本发明变体蛋白的基因包括限制性酶消化和连接作为用于产生编码所需融合物的DNA的基本步骤。DNA片段的末端可需要在连接之前修饰，且这可通过用填充突出端、核酸酶(例如，ExoIII)缺失片段的末端部分、定点诱变或通过PCR添加新的碱基对来实现。
可使用多连接子和衔接子来促进所选片段的连接。表达构建体通常以使用数轮限制性酶切、连接和大肠杆菌转化的阶段组装。适合于构建表达构建体的许多克隆载体是本领域已知的(lambda.ZAP，Agilent；pET，EMD Millipore)并且特定的选择对于本发明不是关键的。
克隆载体的选择将受被选择用于将表达构建体引入宿主细胞中的基因转移系统的影响。在每个阶段结束时，可通过限制性酶切、DNA测序、杂交和PCR分析来分析所得的构建体。
定点诱变通常用于通过本领域已知的方法将特定突变引入编码本发明的IL-2衍生物的基因中。参见例如，美国专利申请公布2004/0171154；Storici等人，2001，NatureBiotechnology 19:773-776；Kren等人，1998，Nat.Med.4:285-290；和Calissano和Macino，1996，Fungal Genet.Newslett.43:15-16。可在本发明中使用任何定点诱变程序。存在许多可用于制备本发明的变体的商业试剂盒。
可以根据本发明使用各种启动子(转录起始调节区)。合适的启动子的选择取决于所提议的表达宿主。可以使用来自异源来源的启动子，只要它们在所选宿主中有功能。
IL-2突变体可在无信号肽序列的大肠杆菌(E.coli)中表达，且蛋白从包涵体中回收并重折叠成活性形式。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义并指用于导入与其可操作联合的特定基因并指导其在靶细胞中表达的DNA分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到其所导入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达盒允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在靶细胞内，就通过细胞转录和/或翻译体系生成基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含表达盒，其包含编码本发明的IL-2衍生物的多核苷酸序列。
本文中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有与原始转化细胞中所筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变后代。
本文的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
如本文中使用的，术语“高亲和力IL-2受体”指IL-2受体的异型三聚体形式，其由受体γ亚基(也称为通用细胞因子受体γ亚基、γc或CD132)、受体β亚基(也称为CD122或p70)和受体α亚基(也称为CD25或p55)组成。比较而言，术语“中等亲和力IL-2受体”指仅包含γ亚基和β亚基而无α亚基的IL-2受体(参见例如Olejniczak和Kasprzak,Med Sci Monit14,RA179-189(2008))。
“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如受体和配体)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量，包括本文中描述的那些方法。
可以依照实施例中提出的方法通过表面等离子共振(SPR)，使用标准仪器如BIAcore仪(GE Healthcare)和受体亚基(如可以通过重组表达获得的)来测定突变的或野生型IL-2多肽对IL-2受体的各种形式的亲和力(参见例如Shanafelt等NatureBiotechnol18,1197-1202(2000))。或者，可以评估IL-2突变体对IL-2受体的不同形式的亲和力，其使用已知表达一种或另一种这类受体形式的细胞系。用于测量结合亲和力的特定的说明性和例示性实施方案在下文中描述。
药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化所必需的量。药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良效果。
术语“药物组合物”指其形式使得其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受该组合物施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所用的术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
本文所用的“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
本文所用的“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
本公开中，“IL-2”可以与“IL2”互换使用。
本发明中的实施例1-3，对野生型IL-2进行突变，将SEQ ID NO.1的第19位从L突变为R，Q，E，A，H，在第125位从C突变为A,以及在C末端添加一段亲水性多肽(SEQ ID NO.2)，得到一系列的IL-2突变体，分别对应IL-2突变体1258(SEQ ID NO.3)、IL-2突变体1259(SEQID NO.4)、IL-2突变体1260(SEQ ID NO.5)、IL-2突变体1261(SEQ ID NO.6)、IL-2突变体1193(SEQ ID NO.7)。或者，将SEQ ID NO.1的第125位从C突变为A,得到类野生型IL-2wt(C125A)(SEQ ID NO.8)，以及将SEQ ID NO.1的第125位从C突变为A,并在C末端添加一段亲水性多肽，得到IL-2衍生物1191(SEQ ID NO.9)，将SEQ ID NO.1的第19位从L突变为H，第125位从C突变为A，得到IL-2突变体1280(SEQ ID NO.10)，其中，本发明所述的氨基酸位置序号均以野生型IL-2(SEQ ID NO.1)为准。
另外，本发明中“亲水性多肽”或者“IST”均指一段亲水性强的多肽分子，如无特殊说明，其具体序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例1：质粒构建及表达
1、表达质粒构建
委托北京擎科生物科技有限公司合成带有类野生型IL-2wt(C125A)、IL-2突变体1280、及IL-2衍生物1258的基因。按照《分子克隆》中的操作方法，进行重叠PCR得到目的片段。然后进行片段和通用载体pET41a的重组连接、转化、测序和保菌，从而得到能够表达IL-2wt(C125A)和其余IL-2突变体或衍生物的质粒。
2、质粒提取
按照《Qiagen Mini-prep Kit》中的操作方法，进行IL-2wt(C125A)、IL-2突变体及IL-2衍生物质粒制备。
3、大肠杆菌对IL-2wt(C125A)，IL-2突变体和IL-2衍生物的表达
将上述构建成功的质粒转化如大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，挑取单克隆进行过夜培养，作为种子，将该种子按1:50的体积比转接到含Kana抗性的500mL TB培养基的三角瓶中，初始OD600大约为0.1，37℃，220rpm，培养至OD600为2.0，加入IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，37℃、220rpm、4h培养后收菌。
使用SDS-PAGE分析表达结果，如图1所示，蛋白以包涵体(inclusion body，IB)的形式成功表达。其中M为Marker，T为全菌裂解液，S为菌体裂解液上清，P为菌体裂解液沉淀。
实施例2.蛋白复性、纯化、样品的制备过程
本发明中所有IL-2wt(C125A)，IL-2突变体1280和IL-2突变体1258质粒转化至大肠杆菌宿主工程菌中进行表达，表达产生不可溶性包涵体。经菌体高压破碎，两次洗涤后，回收包涵体，为后期蛋白复性做准备。
1、蛋白复性
由于野生型IL-2其水溶性差，pI接近中性，导致其在复性工艺中往往需要加入大量的辅助剂帮助其复性，如在US20120264817A1，CN111018961A，EP0268110B1均提到添加Tween20，SDS等辅助剂帮助提高溶解度。而在本发明中的IL-2分子进行改造后，疏水性和pI都有所降低，因此在复性的过程中可以不再添加SDS，tween20一类的去垢剂，仍能都到很好的复性效率。
上述IL-2突变体(1258、1259、1260、1261、1193)，经过破碎洗涤后的包涵体，使用10倍V/W体积的变性液(8M Urea,20mM Tris,pH8.5)在室温下溶解20分钟后补入10mM DTT，继续溶解30分钟。将变性液滴入含有20mM半胱氨酸的40倍复性液中(50mM glycine，2Murea，pH8.5)，继续在室温下搅拌过夜。类野生型IL-2wt(C125A)和IL-2突变体1280变性方法同上，但在复性液中需添加0.5％SDS，确保其复性成功且有较好的复性效率。
2、蛋白复性结果
结果如图2所示，表明所有IL-2wt(C125A)，IL-2突变体1280和IL-2突变体1258，在上述条件下都复性成功，其复性率高。对比复性过程的操作以及对比复性结果，在IL-2的C末端添加一段酸性的亲水性多肽，且对Leu19位突变，突变为H，R，Q，E，A后，能有效的改善IL-2的亲水性，从而蛋白的复性液中不需要添加tween20，蛋白依然复性很好，蛋白复性率较高。而对比类野生型IL-2wt(C125A)及在C末端没有添加亲水性多肽但对Leu19位突变的IL-2突变体1280(SEQ ID NO:10)，以及在C末端添加亲水性多肽但19号位没有突变的IL-2衍生物1191(SEQ ID NO:9)，则需要添加tween20来帮助其复性，得到较高的复性率。
3、蛋白纯化
以上复性好的IL-2突变体1193，1258，1259，1260，1261，直接通过GE公司的HitrapQFF离子交换柱层析进行捕获。
操作如下：纯化前用5倍柱体积的平衡液(0.02M Tris,pH8.0)平衡填料柱；将收集的上清通过柱子，再用2倍柱体积的平衡液清洗填料柱，去除非特异性结合蛋白；用15倍柱体积的洗脱缓冲液(0.02M Tris,0.7M NaCl,pH8.0)梯度冲洗填料，收集含目标蛋白的洗脱液。
在收集好的含目标蛋白洗脱液中，除IL-2wt(C125A)和IL-2突变体1280和IL-2衍生物1191外，其他蛋白可边搅拌边加入1.2M NaCl,彻底溶解后，通过Phenyl HS FF(GE)进一步纯化，以去除样品中的DNA,HCP，内毒素等。其操作如下：纯化前用5倍柱体积的平衡液(0.02M Tris,1.5M NaCl,pH7.5)平衡填料柱；将收集的上清通过柱子，再用5倍柱体积的20％的洗脱液(0.02M Tris,pH7.5)清洗填料柱，去除一些结合较弱的杂蛋白；用5倍柱体积的98％洗脱缓冲液(0.02M Tris,pH7.5)梯度冲洗填料，收集98％洗脱液中的目标蛋白。如有些突变体纯度仍有待提高，则进一步通过分子筛，在PBS条件下进行进一步精纯。
IL-2wt(C125A),以及IL-2突变体1280和IL-2衍生物1191，则需要传统的工艺手段，引入有机试剂及反向填料，才能获得较好的纯度及产量。比如第一步的离子交换，需要使用60％的酒精进行洗脱，同时需要使用反向填料C8进行精纯，获得高纯度蛋白。
提取所有IL-2wt(C125A)，IL-2突变体和IL-2衍生物最终样品各2.5μg，按照《分子克隆》描述的方法进行SDS-PAGE分析。
4、蛋白纯化结果
结果如图3所示，所有IL-2wt(C125A)，IL-2突变体和IL-2衍生物，在上述条件下都能纯化，其蛋白为正确分子量，同时在纯化的过程中，发现经本专利发明改造后的IL-2蛋白，在IL-2的C末端添加一段酸性的亲水性多肽，且对Leu19位突变，突变为H，R，Q，E，A后，能有效的改善IL-2的亲水性，其疏水性降低，亲水性增强，因而蛋白的纯化过程中不再需要添加有机试剂，也不需要使用反向柱。反之，IL-2wt(C125A)以及没有在C末端添加亲水性多肽的IL-2突变体1280或者Leu19位没有突变的IL-2衍生物1191，其纯化需要采用传统工艺手段，使用大量的有机试剂，即增加成本，也污染环境。
实施例3.蛋白浓缩及稳定性测试
1、蛋白浓缩操作
将实施例2获得的蛋白，通过透析方式，将样品中的缓冲液都置换到相同的PBS下，同时对这些蛋白进行浓缩实验，观察它们溶解度变化。具体操作如下：
所有IL-2衍生物使用Amicon Ultra-15离心式过滤器(截留分子量为10kDa)在4000g、8℃下摆桶转子中15mL初始体积，每次旋转时间10min，取出将浓缩液上下混匀，观察蛋白变化，经过多次反复离心浓缩后，检测蛋白浓度，及通过SEC-HPLC对蛋白稳定性的监测。
SEC-HPLC检测使用的仪器为Waters Acquity UPLC H-Class，色谱柱为AdvanceBio SEC 200A，1.9μm，4.6mm X 150mm，流动相为1x PBS，5％IPA，在室温下监测UV280读数。
通过对浓缩后样品的UV280及稳定性的检测，各IL-2衍生物经浓缩后，经SEC-HPLC对其稳定性检测，其结果如表1。
表1：IL-2wt(C125A)、IL-2突变体和IL-2衍生物最大浓缩浓度及纯度测定
2、浓缩及稳定性结果分析
结果如表1所示，IL-2wt(C125A)和经本发明改造后的IL-2突变体或者衍生物，在相同条件下进行浓缩实验，经本发明改造后的蛋白，在Leu19位点突变、且C末端添加一段亲水性多肽后，其疏水性降低，水溶性增加，在相同的缓冲液PBS条件下，蛋白度均能提升到8mg/ml以上，为野生型IL-2的近20倍以上。SEC-HPLC检测蛋白依旧稳定，能够保持80％以上的纯度，没有产生多聚现象。而反观IL-2wt(C125A),C末端不添加亲水性多肽的IL-2突变体1280，Leu19位点不突变的IL-2衍生物1191，在相同的PBS缓冲液里，其蛋白浓度经浓缩，其浓度都要小于<3mg/ml，说明本发明中Leu19位突变和末端亲水性多肽在改善IL-2的水溶性上起到了正协同作用，有利于IL-2水溶性增加，为今后的IL-2药物生产的制剂制备打下良好的基础。
实施例4.IL-2突变体或衍生物的活性测试
本发明改造后的IL-2是在其Leu19位突变和C末端添加亲水性多肽，该实验是测定这些改造是否对IL-2受体的结合产生影响。对改造后的蛋白通过Biacore SPR 8K仪器，测定IL-2衍生物与IL-2β、γ-Fc receptor的结合。以及通过CTLL2细胞活性检测，观察IL-2衍生物在细胞水平上的生物活性
1、IL-2突变体或衍生物的体外活性检测
我们使用Biacore SPR-8K测试了不同Leu19突变体对IL-2β、γ-Fc receptor的结合强度，具体如表2所示。突变的引入并没有影响IL-2对受体的结合强度。具体方法如下：
1)使用Protein-A芯片(GE healthcare)将带有Fc标签的β、γ-Receptor固定在芯片表面，固定量为1000RU，使用的流动性为含有0.05％Tween20的PBS缓冲液。
2)流过不同浓度的IL-2衍生物并检测其响应值，使用的浓度范围包括0～50nM。
3)实验结束后，使用Biacore SPR 8K自带的数据处理软件分析数据，结果采用动力学拟合方法进行，具体数据见表2。
表2：IL-2突变体或衍生物对受体β、γ-Receptor结合活性实验
蛋白编号 突变位点 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
SEQ ID NO.9 C125A+亲水性多肽 6.71E+05 1.40E-04 2.09E-10
SEQ ID NO.7 L19H,C125A+亲水性多肽 6.03E+05 1.71E-04 2.83E-10
SEQ ID NO.3 L19R,C125A+亲水性多肽 1.06E+06 2.16E-04 2.03E-10
SEQ ID NO.4 L19Q,C125A+亲水性多肽 1.19E+06 2.36E-04 1.99E-10
SEQ ID NO.5 L19E,C125A+亲水性多肽 1.88E+06 7.13E-04 3.79E-10
SEQ ID NO.6 L19A,C125A+亲水性多肽 8.99E+05 3.15E-04 3.51E-10
2、IL-2突变体或衍生物的CTLL2细胞活性检测
本实验通过测定IL-2突变体或衍生物同野生型IL-2在CTLL2细胞系上的活性来比较其活性，实验步骤如下：
1)取对数生长期的CTLL2细胞，200g离心5分钟后，使用PBS重悬细胞，200g离心5分钟，去上清。
2)使用培养基重悬细胞，进行细胞计数。将细胞数调整为2×105细胞每毫升，50μl每孔加入到96孔平底板中。待测样品使用培养基稀释到起始浓度30nM，然后进行2倍系列稀释，10个点。将稀释好的样品50μl每孔加入到96孔平底板中。
3)将96孔板置于37℃，5％CO2孵育3天。孵育完成后，在96孔板中每孔加入100μlcell titer glo(产品货号G9243，Promega)检测试剂，混匀后置于水平摇床550rpm震荡3分钟。室温静置10分钟后使用酶标仪检测化学发光值。
通过表3中IL-2突变体或衍生物和野生型IL-2对CTLL2细胞激活EC50可以看出，IL-2衍生物中含有的Leu19位的突变，C125A突变和C末端亲水性多肽均对其细胞活性没有影响，有部分IL-2突变体甚至表现出比野生型IL-2更好的生物活性。具体结果见图4和表3。
表3：野生型IL-2及IL-2衍生物在CTLL2细胞实验上的活性实验结果
3、活性检测结果
从以上数据可知，经过本发明专利改造的IL-2突变体或衍生物具备同野生型IL-2类似的受体结合能力和生物学活性。
以下实施例5-11中涉及的IL-2突变体是在实施例1-3获得的IL-2衍生物的基础上，继续在其第65位Pro发生第二氨基酸突变，同时在实施例1-3获得的IL-2衍生物的C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变，与IST的氨基酸序列SEQ ID NO:2相比，所述第四氨基酸突变选自以下取代：G19C、G12C或G7C(编号从SEQ ID NO：2中第一个氨基酸开始)；其中所述IL-2衍生物还具有连接至C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变的位点的半胱氨酸的聚乙二醇部分。
实施例5：IL-2突变体表达质粒构建、蛋白表达与制备
1.表达质粒构建
委托北京擎科生物科技有限公司合成类野生型IL-2wt(C125A)以及IL-2突变体1193(L19H,C125A，IST)、1267(L19H,P65E,C125A，IST)、1268(L19H,P65Q,C125A，IST)、1269(L19H,P65S,C125A,IST)、1301(L19H,P65A,C125A,IST)、1302(L19H,P65T,C125A,IST)、1270(L19H,P65E,C125A,IST-G19C)、1293(L19H,P65E,C125A,IST-G12C)、1294(L19H,P65E,C125A,IST-G7C)、1348(L19A,C125A，IST-G12C)、1349(L19A,P65T,C125A，IST-G12C)、1350(L19A,P65S,C125A，IST-G12C)、1351(L19A,P65Q,C125A，IST-G12C)的基因。按照《分子克隆》中的操作方法，进行重叠PCR得到目的片段。然后进行片段和通用载体pET41a的重组连接、转化、测序和保菌，从而得到能够表达相应蛋白质粒。按照《Qiagen Mini-prep Kit》中的操作方法，对IL-2野生型和IL-2的突变体进行质粒制备。
2.大肠杆菌的表达
将上述构建成功的质粒转化如大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，挑取单克隆进行过夜培养，作为种子，将该种子按1:50的体积比转接到含Kana抗性的500mL TB培养基的三角瓶中，初始OD600大约为0.1，37℃，220rpm，培养至OD600为2.0，加入IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，37℃、220rpm、4h培养后收菌。使用SDS-PAGE分析蛋白表达情况，所有蛋白均以包涵体(inclusion body，IB)的形式成功表达，且表达量较高。
3.包涵体破碎洗涤
本发明中所有的野生型和突变体的质粒转化至大肠杆菌宿主工程菌中进行表达，表达产生不可溶性包涵体。经菌体高压破碎，洗涤后，回收包涵体。
4.蛋白制备
取相同量的上述IL-2突变体的包涵体，溶解在8M尿素溶液中，加入终浓度为10mM的DTT，变性1小时后，稀释到复性液中(20mM Tris-Cl，pH 8.0)，室温过夜，抽取样品进行检测，纯化使用阴离子交换层析Q-FF和凝胶过滤层析superdex-200进行。其中类野生型IL-2wt(C125A)需要额外使用C8反相柱纯化，流动性为含有10％～80％的乙腈水溶液，本实施例中其它分子均不需要C8反相柱纯化。经过纯化后，类野生型IL-2wt(C125A)以及IL-2突变体使用SDS-PAGE分析时，纯度均能达到90％以上且较为稳定，可以用于进一步分析(具体信息如表4所示)。
表4：本发明中使用的蛋白信息
实施例6.蛋白浓缩及稳定性测试
1、蛋白浓缩操作
将实施例5获得的蛋白，通过透析方式，将样品中的缓冲液都置换到相同的PBS下，同时对这些蛋白进行浓缩实验，观察它们溶解度变化。具体操作如下：
所有IL-2突变体使用Amicon Ultra-15离心式过滤器(截留分子量为10kDa)在4000g、8℃下摆桶转子中浓缩，每次旋转时间10min，取出将浓缩液上下混匀，观察蛋白变化，经过多次反复离心浓缩后，检测蛋白浓度，直到蛋白浓度达到或超过5mg/ml为止。。
通过对浓缩后样品的UV280及稳定性的检测，各IL-2衍生物经浓缩后，其结果如表5。
表5：IL-2wt(C125A)和IL-2突变体最大浓缩浓度及纯度测定
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2、浓缩及稳定性结果分析
结果如表5所示，IL-2wt(C125A)和经本发明改造后的IL-2突变体，在相同条件下进行浓缩实验，经本发明改造后的蛋白，在Leu19位点突变、且C末端添加一段亲水性多肽后，其疏水性降低，水溶性增加，在相同的缓冲液PBS条件下，蛋白浓度均能提升到5mg/ml以上，为类野生型IL-2的10倍以上。而反观IL-2wt(C125A),C末端不添加亲水性多肽，在相同的PBS缓冲液里，其蛋白浓度经浓缩，其浓度大约在0.53mg/ml，说明本实施例中Leu19位突变和末端亲水性多肽和上述实施例1-3中的IL-2衍生物中的作用一样，也改善了IL-2的水溶性，有利于IL-2水溶性增加，为今后的IL-2药物生产的制剂制备打下良好的基础。同时，较好的蛋白可溶性有利于下一步蛋白的PEG修饰。
实施例7.含有不同P65位IL-2突变体对CD25受体体外结合活性实验
本发明改造后的IL-2是在其P65位突变，以影响IL-2突变体对CD25结合能力。该实验是测定这些改造对IL-2对CD25受体的结合产生影响。对改造后的蛋白通过Biacore SPR8K仪器，测定IL-2突变体与IL-2CD25的结合。
使用Biacore SPR-8K测试了不同P65突变体对IL-2的CD25受体的结合强度，具体如表1所示。具体方法如下：
1)使用Protein-A芯片(GE healthcare)将带有Fc标签的CD25固定在芯片表面，固定量为1000RU，使用的流动性为含有0.05％Tween20的PBS缓冲液。
2)流过不同浓度的IL-2突变体并检测其响应值，使用的浓度包括100nM。
3)实验结束后，通过对比不含有P65位突变的对照分子1193(L19H,C125A,IST)的响应值，估算IL-2突变体对CD25的结合能力，具体数据见表6。
表6：野生型IL-2及不同突变体对受体CD25结合活性实验
在不含有P65位突变的对照分子1193(L19H,C125A,IST)及不同P65位突变体体外结合CD25活性实验中，发现IL-2不同突变体同CD25的结合强度受到第65位氨基酸侧链大小的调节：当第65位为Pro或者Ala无侧链或者小侧链氨基酸时，IL-2突变体能够保持接近100％的CD25结合活性；当第65位为Ser或者Thr等中等大小侧链氨基酸时，IL-2对CD25结合活性显著降低，仅能保持大约20％左右的结合活性；当第65位为Glu或者Gln等较大侧链氨基酸时，IL-2突变体对CD25的结合活性几乎完全丧失。该发明通过对P65位单一氨基酸突变，实现了对IL-2突变同CD25结合活性的连续调节，相对已报道的突变方式，具备突变位点少且能够连续调节的优势。
实施例8.含有PEG修饰的IL-2衍生物制备及对CD25和CD122受体体外结合活性实验
为了进一步延长IL-2突变体的半衰期，本发明通过使用PEG修饰的方法对部分含有游离半胱氨酸的分子(1270,1293,1294,1348,1349,1350,1351)进行PEG化修饰，具体方法如下：
将含有游离半胱氨酸的IL-2衍生物进行浓缩或稀释，使蛋白浓度控制在0.4-1.0mg/ml之间，溶于20mM Hepes，100mM NaCl缓冲液中，调节pH值至7.0-7.5之间。溶解分子量为20KDa的mPEG-MAL(委托厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司合成)，称量溶解于50mM磷酸氢二钠溶液，pH值7.0，配制为100mg/ml溶液。配制10mM浓度的TCEP溶液，溶解于超纯水中。
用氢氧化钠溶液调节纯化后IL-2突变体溶液的pH值至7.0-7.5之间，向其中加入10mM的TCEP溶液，对IL-2突变体的被保护半胱氨酸进行还原反应，使还原体系中的TCEP终浓度至0.05-0.1mM之间，还原反应室温静置进行16-20h。添加PEG前进行质谱分析，确定骨架蛋白的内部二硫键没有被打开，只有C末端突变点的二硫键被打开。向还原后的IL-2突变体溶液中添加100mg/ml的PEG溶液，使IL-2与PEG的摩尔浓度比为1:10。搅拌均匀，室温静置反应30-60min后样品可以进行纯化，去除杂质和游离的PEG。
偶联后产物纯化，使用阴离子交换层析或阳离子交换层析或采用凝胶过滤层析，去除游离的PEG，获得目的蛋白，最终使蛋白纯度达到基本均一。在经过纯化后，得到已经偶联上PEG的新型IL-2衍生物(1270-PEG,1293-PEG,1294-PEG,1348-PEG,1349-PEG,1350-PEG,1351-PEG)。所有PEG修饰的IL-2分子经碘染的SDS-PAGE分析，纯度均在90％以上。
为了进一步验证不同PEG修饰位点对蛋白活性的影响，本发明对PEG修饰后的蛋白1270-PEG,1293-PEG和1294-PEG进行了基于SPR的CD122受体结合活性测试，具体方法如下：使用Protein-A芯片(GE healthcare)将带有Fc标签的CD122受体固定在芯片表面，固定量为1000RU，使用的流动性为含有0.05％Tween20的PBS缓冲液。流过浓度为50nM的1193和IL-2衍生物1270-PEG,1293-PEG，1294-PEG并检测其响应值。实验结束后，使用Biacore SPR 8K自带的数据处理软件分析数据，具体结果如下表7所示。不同PEG修饰后的IL-2衍生物同未有PEG修饰的对照分子1193相比，对CD122受体的亲和力均略有下降，下降倍数均在3倍以内。基于1293-PEG分子，我们构建了同时含有P65位突变和PEG修饰的分子1348-PEG(L19A,C125A，IST-G12C)，1349-PEG(L19A,P65T,C125A，IST-G12C)，1350-PEG(L19A,P65S,C125A，IST-G12C)和1351-PEG(L19A,P65Q,C125A，IST-G12C)，其制备过程在实施例5和本实施例中均有描述。
表7：野生型IL-2及不同PEG修饰突变体对受体CD122结合活性实验
实施例9.含有PEG修饰的IL-2衍生物对小鼠脾脏中免疫细胞激活实验
为了进一步筛选和验证本发明中所设计的IL-2突变的活性，本发明采用6～8周龄C57小鼠脾脏细胞刺激实验测试了IL-2突变体1348-PEG，1349-PEG，1350-PEG，1351-PEG和对照分子1193对CD8+的T细胞及Treg细胞的增殖作用，具体操作如下：使用PBS清洗获得的C57小鼠脾脏，调整细胞数至2×106cell/mL，1.5mL/孔铺于6孔板中。待测样品稀释到起始浓度1000nM，然后进行倍比系列稀释共计8个浓度，1.5mL/孔加入铺好的细胞中，将小鼠脾脏细胞与待测样品在37℃，5％CO2培养箱中共孵育7天。
每个样品取1.5x106的细胞，300g离心5min弃上清，加入1mL洗液，300g离心5min弃上清。使用100μL staining buffer重悬细胞，每管加入(CD3、CD4、CD8、CD56、CD127、CD25)混合抗体。混匀，4℃避光孵育30min，加入1mL staining buffer，300g离心5min弃上清。每管加入400μL staining buffer重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测。
在小鼠脾脏细胞刺激实验中，如图5所示，发现PEG修饰后的分子相对没有PEG修饰的对照分子1193，其刺激免疫细胞增殖的能力均有不同程度下降，表明PEG修饰后的IL-2分子更温和，临床上可能获得更好的给药窗口。同时，相对于没有P65位突变的1348-PEG，有P65位突变的1349-PEG，1350-PEG和1351-PEG能够获得更高的CD8+/Treg的比例(例如在300nM时)，预示着这些分子具备更好的药效和更低的Treg增殖活性。
实施例10：含有PEG修饰的IL-2衍生物1351-PEG在小鼠中的毒性实验
为了进一步验证本发明中所设计的IL-2突变体具备较低的毒性，本实施例中使用的IL-2衍生物1351-PEG进行小鼠的毒性测试，在测试中，我们采用了较大的给药剂量3mg/kg，其具体方法为：选取6只6～8周龄的C57BL/6小鼠，随机分为2组，分别为试剂对照组(PBS)、和长效IL-2突变体1351-PEG组，每组2只小鼠。通过小鼠尾静脉注射，一周两次，每次3mg/kg。给药后观察药物对实验动物造成的影响，以及给药后小鼠的体重变化，在实验终点，进行解剖，检查脏器有无肉眼可见病变。其中体重检测实验结果如图6所示。
实施例11：含有PEG修饰的IL-2衍生物在小鼠中肿瘤生长抑制实验
本实施例中使用的IL-2衍生物的偶联物为实施例5或8中制备。6只6～8周龄的BALB/C雌性小鼠，随机分为6组，分别为试剂对照组(PBS)、对照分子IL-2组(1193)，长效IL-2(1348-PEG)组和长效IL-2衍生(1349-PEG)、(1351-PEG)组。本实施例中选取的分子主要用于验证不同CD25结合能力的分子对抗肿瘤效果的影响，其中1193与1348-PEG保留了100％CD25结合活性，1349-PEG保留少量CD25结合活性，而1351-PEG几乎没有CD25结合活性。该实验每组5只小鼠，在右侧肩部皮下按照5*10E5的细胞量接种CT-26肿瘤细胞。接种肿瘤细胞后，第二天开始通过小鼠尾静脉注射，一周两次，给药剂量每组均为每次3mg/kg。给药后观察药物对实验动物造成的影响，以及给药后小鼠的肿瘤体积变化，在实验终点，进行解剖，检查脏器有无肉眼可见病变。其中小鼠的肿瘤体积检测结果如图7所示。
由本次动物实验可知，在CT-26动物模型上，肿瘤抑制效果最好的为1348-PEG和1349-PEG，这两个分子分别保留了100％的CD25结合活性和少量的CD25结合活性，两者都实现了优异的抗肿瘤效果。但是，在实验中，注射1348-PEG的小鼠表现出的体重下降且精神萎靡的副作用症状，表明保留100％CD25结合活性虽然抗肿瘤效果优异，但副作用较强。1349-PEG组小鼠未观察体重下降等明显副作用。对照分子1193组和1351-PEG组也表现出较强的抗肿瘤活性，但相对1348-PEG和1349-PEG较弱，表明完全去除CD25结合活性并不利于IL-2抗肿瘤活性的发挥。详细的统计学分析如表8所示，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积TV(mm3)＝0.5×长径(mm)×短径(mm)2。瘤重抑制率TGI％＝(1－T/C)×100％，T/C＝治疗组瘤重均值/对照组瘤重均值。
表8不同IL-2分子在CT-26小鼠动物模型上抗肿瘤活性的统计学分析
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种IL-2突变体或衍生物，其特征在于，所述IL-2突变体或衍生物相对于野生型IL-2的氨基酸序列SEQ ID NO：1的第19位Leu发生第一氨基酸突变、第65位Pro发生第二氨基酸突变、第125位Cys被Ala取代，并在C末端引入一条酸性的亲水多肽IST；
优选的，所述第一氨基酸突变选自下组的氨基酸取代：L19A或L19H；
优选的，所述第二氨基酸突变选自下组的氨基酸取代：P65A、P65T、P65S、P65E或P65Q；
优选的，所述亲水多肽IST的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体为SEPATSGSETPGSEPATSGSETPG；
优选的，所述IL-2突变体或衍生物的氨基酸序列如SEQ ID NO：11-15任一项所示。
2.一种IL-2衍生物，其特征在于，所述IL-2衍生物在权利要求1所述的IL-2突变体或衍生物的C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变，与IST的氨基酸序列SEQ ID NO:2相比，所述第四氨基酸突变选自以下取代：G19C、G12C或G7C，所述氨基酸编号从SEQ ID NO：2中第一个氨基酸开始；其中所述IL-2衍生物还具有连接至C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变的位点的半胱氨酸的聚乙二醇部分，其中所述聚乙二醇部分具有10～40kDa之间的分子量；
优选的，所述IL-2衍生物的聚乙二醇部分具有20kDa的分子量；
进一步优选的，所述IL-2衍生物的氨基酸序列如SEQ ID NO：16-21任一项所示。
3.一种增加权利要求1所述的IL-2突变体或衍生物的循环半衰期的方法，所述方法包括：(1)在权利要求1所述的IL-2突变体或衍生物的C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变，与IST的氨基酸序列SEQ ID NO:2相比，所述第四氨基酸突变选自以下取代：G19C、G12C或G7C；(2)将聚乙二醇部分连接至C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变的位点的半胱氨酸残基；
优选的，其中所述IL-2衍生物的聚乙二醇部分具有10～40kDa之间的分子量；
进一步优选的，所述IL-2衍生物的聚乙二醇部分具有20kDa的分子量；
更进一步优选的，步骤(1)获得的IL-2衍生物的氨基酸序列如SEQ ID NO：16-21任一项所示。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1或权利要求2所述任一项IL-2突变体或衍生物的氨基酸序列。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求5所述的表达载体，或者所述宿主细胞的基因组整合有权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1或权利要求2所述的IL-2突变体或衍生物与药学上可接受的辅料。
8.权利要求1所述的IL-2突变体或衍生物、权利要求2所述的IL-2衍生物或权利要求7所述的药物组合物在制备应用IL-2作免疫治疗的疾病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病是癌症、免疫疾病、人类免疫缺陷病毒HIV感染、丙型肝炎病毒HCV感染、风湿性关节炎，特应性皮炎或系统性红斑狼疮。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症是通过刺激免疫系统或通过增殖免疫细胞来治疗的癌症。
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