CN104193826B - 一种融合多肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合多肽，是由多肽Ⅰ和多肽Ⅱ构成的融合多肽，其中，多肽Ⅰ为一段NFAT2上的特异性氨基酸序列，选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的序列之一或其组合；多肽Ⅱ为HIV‑TAT蛋白转导域，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的融合多肽，为针对于DYRK1A磷酸化的NFAT2的竞争性抑制剂，体外试验表明该融合多肽可以使肿瘤细胞中NFAT2蛋白水平下降，从而抑制肿瘤细胞的迁移。本发明为抗肿瘤新药的设计提供了新的靶点，为肿瘤多药耐药的逆转提供了新的思路。

Description

一种融合多肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种能抑制DYRK1A对T细胞核因子（nuclear factor of activatedT cell, NAFT）蛋白表达和转录活性的作用的融合多肽，及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

肿瘤是危害人类健康的头号杀手。恶性肿瘤细胞的快速生长和向周围组织器官的侵润及远处转移是肿瘤导致病人死亡的主要原因。抑癌基因所编码的蛋白具有抑制肿瘤生长和抑制肿瘤侵袭转移的功能，成为抗肿瘤药物的候选药物。多肽药物由于分子小、易合成、构效关系研究较容易、易被改造以及针对性强和疗效明显等优势，得到了广泛的关注。近年来，随着生物技术及多肽合成技术的不断改进,多肽药物的纯度高、毒副作用低、几乎没有免疫原性且合成成本较低，产业化开发优势明显，故多肽药物的适应症广泛且疗效显著, 有广泛的应用市场。目前，世界范围内已有超过60 多种多肽药物被批准上市, 另外有大量的多肽药物已进入或是完成临床研究。多肽药物市场发展迅速, 年增长率达20%，为制药企业带来了丰厚利润， 这预示着未来治疗类多肽药物的市场供求会有巨大的提升。

活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cell, NFAT）是一类与转录密切相关的因子，普遍表达在多种哺乳动物细胞和组织内，能够参与调控淋巴细胞的发育和活化、心肌细胞的分化等过程中重要基因的表达。NFAT家族作为细胞内多信号转导通路的基础分子，在调节肿瘤细胞转化和生长、肿瘤血管生成、肿瘤转移等方面也发挥着重要的作用。

NFAT家族包括5名成员：NFAT1 (NFATc2, NFATp), NFAT2 (NFATc1, NFATc),NFAT3 (NFATc4), NFAT4 (NFATc3, NFATx) 和 NFAT5 (TonEBP, OREBP)。NFAT信号活化的方式主要表现为核转位以及与DNA结合，通过与其他结合分子相互协同，调节多种目的基因的表达。NFAT作为细胞信号转导中一种重要的中间途径因子，其活化状态对于成纤维细胞增殖和存活、肿瘤上皮细胞浸润和迁移、内皮细胞生长和血管生成都非常重要，针对NFAT的干预有可能成为人类肿瘤临床治疗的重要途径之一。中国专利CN102805867A公布了转录因子NFATc3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。实验结果表明，NFATc3 抑制剂（CFK-506 、CyclosporinA 、VIVIT) 对肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用，且上述抑制剂本身在使用剂量范围内毒副作用很小。

双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A（DYRK1A），位于HSA21q22.2中，是果蝇minibrain基因在哺乳动物中的同源基因。DYRK1A包括转录因子（FKHR / FoxO1，STAT3，CREB1），剪接子（CyclinL2，3B1，SF2/ASF），蛋白质合成起始因子eIF2B和参与染色体结合功能的蛋白质如动力蛋白、两性蛋白、突触伸蛋白和突触核蛋白。研究证明DYRK1A降低NFAT1、NFAT3和NFAT4的转录活性（21号染色体上DSCR1和DYRK1A剂量增加引起NFAT调节异常.自然(2006)441: 595-600（Arron JR, Winslow MM, Polleri A, Chang CP, Wu H, Gao X,Neilson JR, Chen L, Heit JJ, Kim SK, Yamasaki N, Miyakawa T, Francke U, GraefIA, Crabtree GR (2006) NFAT dysregulation by increased dosage of DSCR1 andDYRK1A on chromosome 21. Nature 441: 595-600）；果蝇全基因组RNAi扫描确定NFAT的调节子DYRK激酶家族. 自然(2006)441: 646-650）。NFAT2具有致癌活性(NFAT转录因子作为致癌基因和抑癌基因的双重角色.分子细胞生物学 (2006)28: 7168-7181) Gwack Y,Sharma S, Nardone J, Tanasa B, Iuga A, Srikanth S, Okamura H, Bolton D, FeskeS, Hogan PG, Rao A (2006) A genome-wide Drosophila RNAi screen identifiesDYRK-family kinases as regulators of NFAT. Nature 441: 646-650）。在某些肿瘤如伯基特淋巴瘤和胰腺癌中可观察到NFAT2的激活。目前尚无文献报道DYRK1A是否磷酸化NFAT2或者影响后者的活性。

HIV-TAT蛋白转导域为一些具有细胞穿透功能的氨基酸序列,长度为几个至几十个氨基酸不等,多数小于20个氨基酸,被命名细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)。细胞穿膜肽也被称之为蛋白转导域(protein transduction domain,PTD),或Trojan horse peptides,可以有效地将蛋白、多肽、核酸片段通过无受体介导、无耗能的方式,导入多种哺乳动物细胞,且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。细胞穿膜肽有天然存在和人工合成两大类,细胞穿膜肽的研究始于1988年,Green和Frankel分别证实HIV-1的反式激活蛋白Tat能跨膜转移入细胞质和细胞核内。1997年,Vives等发现HIV-TAT中一个富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽片断与蛋白转导功能密切相关天然存在的CPPs。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种融合多肽，其能抑制DYRK1A对NAFT2蛋白表达和转录活性，从而可达到抗肿瘤的目的。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种融合多肽，是由多肽Ⅰ和多肽Ⅱ构成的融合多肽，其中，多肽Ⅰ为一段NFAT2上的特异性氨基酸序列，其作用为：进入细胞内部后，选择性与DYRK1A结合，与NFAT2蛋白竞争DYRK1A，从而降低DYRK1A对NFAT2的磷酸化作用，降低DYRK1A促进NFAT2的作用，而NFAT2可促进肿瘤细胞增长，降低NFAT2的磷酸化后，可抑制肿瘤细胞的迁移；多肽Ⅱ为HIV-TAT蛋白转导域，其序列如SEQ ID NO.1所示，其作用为：跨膜传递。多肽Ⅰ的N-末端与多肽Ⅱ的C-末端的氨基酸缩合形成肽键。

所述NFAT2上的特异性氨基酸序列，选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示的序列之一或其组合。相对应地，融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7所示（对应于NFAT2上的特异性氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示的序列）。

SEQ ID NO:1（HIV-TAT蛋白转导域序列）：

三字符缩写：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg；

单字符缩写：YGRKKRRQRRR。

SEQ ID NO：2（NFAT2-1）：

三字符缩写：Ala-Arg-Ser-Ser-Arg-Pro-Ala-Ser-Pro-Cys-Asn-Lys-Arg-Lys-Tyr；

单字符缩写：ARSSRPASPCNKRKY。

SEQ ID NO：3（NFAT2-2）：

三字符缩写：Asn-Gly-Arg-Gln-Pro-Pro-Tyr-Ser-Pro-His-His-Ser-Pro-Thr-Pro；

单字符缩写：NGRQPPYSPHHSPTP。

SEQ ID NO：4（NFAT2-3）：

三字符缩写：Pro-Lys-Pro-Leu-Ser-Pro-Thr-Ser-Tyr-Met-Ser-Pro-Thr-Leu；

单字符缩写：PKPLSPTSYMSPTL。

SEQ ID NO：5（融合多肽TAT-NFAT2-1）：

三字符缩写：

Tyr-Gly-Ar-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ser-Ser-Arg-Pro-Ala-Ser-Pro-Cys-Asn-Lys-Arg-Lys-Tyr；

单字符缩写：YGRKKRRQRRRARSSRPASPCNKRKY。

SEQ ID NO：6（融合多肽TAT-NFAT2-2）：

三字符缩写：

Tyr-Gly-Ar-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Asn-Gly-Arg-Gln-Pro-Pro-Tyr-Ser-Pro-His-His-Ser-Pro-Thr-Pro；

单字符缩写：YGRKKRRQRRR NGRQPPYSPHHSPTP。

SEQ ID NO：7（融合多肽TAT-NFAT2-3）：

三字符缩写：

Tyr-Gly-Ar-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ser-Pro-Thr-Ser-Tyr-Met-Ser-Pro-Thr-Leu；

单字符缩写：YGRKKRRQRRR PKPLSPTSYMSPTL。

所述融合多肽，制备时，常规方法人工合成，或使用重组表达系统的合成方法合成即可。均为现有技术中的成熟技术。如采用固相合成方法，所述融合多肽的合成可以使用用于有机合成的设备来进行。该方法为Merrifield 的固相合成方法(J.Am.Chem.Soc.85，2149-21，54，1963)，在该方法中，使用半自动肽合成仪(Peti-Syzer Model PSS-510)通过使位于C-末端和N-末端的氨基酸发生缩合来合成所述融合多肽。

具体的，所述固相合成是从多肽的羧基末端开始的，通过将一个α氨基被保护的氨基酸偶联到适当的树脂上。本文中，所述α氨基被保护的氨基酸通过酯键被偶联到羟甲基树脂或者氯甲基树脂上。使用Fmoc(9-芴甲氧羰基)作为α氨基的保护基团，并且Fmoc-保护的氨基酸可以从Beadtec Company商购获得。例如，精氨酸的氨基是有活性的。使用被适当的基团如叔丁基(t-Bu) 或者2，2，5，7，8- 五甲基二氢吡喃-6(pentamethylchroman-6，Pmc-6)保护的Fmoc-氨基酸，作为甘氨酸、赖氨酸或者谷氨酰胺的活性残基。在肽的这种合成方法中，将用于连接到固体支持物树脂上的肽链的氨基末端的保护基团，随后用试剂——例如，三氯乙酸（TFA）或者酚除去。所述肽可以用二乙醚在TFA 溶液中进行萃取并被分离出来，并且可以通过高效液相色谱(HPLC)来纯化。

使用生物方法来制备融合多肽的方法步骤如下：(a)将所述融合多肽的基因克隆到能够表达特定肽的表达载体pPET中，以制备能够表达所述融合多肽的重组载体；使用所述的pPET-PTD-SBS(VBD)表达载体在大肠杆菌中表达大量的重组转运蛋白-PTD-SBS(VBD)肽，然后分离和纯化表达的肽。在这一点上，编码所述融合多肽的用于制备重组载体的碱基序列可以容易地由本领域的技术人员从本文公开的氨基酸序列中推导出来。此外，用于插入所述碱基序列的克隆载体的选择方法和一般的技术详细资料、使用克隆技术制备的重组表达载体、使用重组载体进行转化以表达靶融合多肽的宿主细胞、用重组载体对所述宿主细胞进行转化的方法、在转化的宿主细胞中表达所述靶融合多肽的方法、以及从得到的产品中收集所述靶融合多肽的方法，对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

本发明还提供了上述融合多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，所述肿瘤可以是淋巴瘤、神经胶质瘤等肿瘤，最优选神经胶质瘤。

本发明还提供了一种包含上述融合多肽的药物组合物，该药物组合物除含有上述融合多肽外，还进一步地包括药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。

上述融合多肽、药物组合物在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的应用。具体应用时，上述融合多肽注射到肿瘤局部或通过系统给药到达肿瘤部位后，可发挥抗肿瘤效应。

本发明的融合多肽具有抗肿瘤活性的作用原理为：在HIV-TAT的作用下，融合多肽被带入细胞内部，然后NFAT2上的特异性氨基酸序列与NFAT2蛋白竞争DYRK1A，降低DYRK1A对NFAT2的磷酸化作用，进而降低DYRK1A促进NFAT2的作用，而NFAT2能够促进肿瘤细胞的增长，降低NFAT2的磷酸化后，可抑制肿瘤细胞的迁移。本发明的融合多肽作为针对于DYRK1A磷酸化的NFAT2的竞争性抑制剂，体外试验表明该融合多肽可以使肿瘤细胞中NFAT2蛋白水平下降。本发明为抗肿瘤新药的设计提供了新的靶点，为肿瘤多药耐药的逆转提供了新的思路。

附图说明

图1：NFAT2上的DYRK1A作用位点；其中，(A)：NFAT2的RPX(S/T)P结构域和截短片段，AD：激活域；SRR：丝氨酸丰富序列；SP：丝氨酸-脯氨酸重复序列；SPRIEIT：钙结合序列；NLS：核定位序列。(B)：NFAT2的截短片段和pCMV-DYRK1A共转染HEK293细胞，M2抗体免疫杂交检测NFAT2蛋白；DY1A代表DYRK1A。(C)：免疫沉淀实验研究NFAT2的截短片段和DYRK1A的相互作用。(D)：NFAT2截短片段的丝氨酸突变体与pCMV-DYRK1A共转染HEK293细胞，M2抗体免疫杂交检测NFAT2截短片段的丝氨酸突变体。

图2：DYRK1A在HEK293细胞中增加NFAT2蛋白质的表达；其中，(A)： p-NFAT2mycflag与pCMV-DYRK1A或pGFP-V-RS-shDYRK1A共转染HEK293细胞，M2抗体免疫杂交检测NFAT2蛋白。柱形图为电泳图量化结果。(B)： pCMV-DYRK1A转染HEK293细胞，anti-NFAT2抗体免疫杂交检测内源性NFAT2蛋白。柱形图为电泳图量化结果。

图3：DYRK1A通过磷酸化作用影响NFAT2的泛素化和稳定性；蛋白酶抑制剂乳胞素(lactacystin, lac)作用于转染p-NFAT2mycflag的HEK293细胞，NFAT2的表达同乳胞素之间的时间依赖(A)及剂量依赖(B)。(C)免疫共沉淀实验研究NFAT2和泛素（ubiquitin, ubi）的相互作用。(D)免疫沉淀实验研究DYRK1A与NFAT2的相互作用。(E)免疫沉淀实验研究DYRK1A和NFAT2的磷酸化水平。柱形图为电泳图量化结果。(F)免疫沉淀实验研究DYRK1A和NFAT2的泛素化水平。柱形图为电泳图量化结果。

图4：DYRK1A增加NFAT2转录活性；p-NFAT2mycflag和pCMV-DYRK1A(A)或者pGFP-V-RS-shDYRK1A (B)共转染HEK293细胞，RT-PCR检测FasL，IL-2和TNFα靶基因的表达。图(A)中的柱形图为电泳图量化结果。图(B)中的柱形图为电泳图量化结果。(C)p-NFAT2mycflag，pIL2-luc和pCMV-DYRK1A共转染HEK293细胞。转染48h后，双荧光素酶检测。NF2代表NFAT2。DY1A 代表DYRK1A，shDY1A代表shDYRK1A。

图5：DYRK1A高表达促进肿瘤细胞迁移，融合多肽TAN-NFAT2在肿瘤细胞中抑制DYRK1A对NFAT2的作用。p-NFAT2mycflag和pCMV-DYRK1A(A)或者pGFP-V-RS-shDYRK1A (B)共转染HEK293细胞，transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力。 p-NFAT2mycflag 和pCMV-DYRK1A共转染HEK293细胞，转染后24小时加入TAT-NF2-1(C) 、TAT-NF2-2(D)和TAT-NF2-3(E)融合多肽（20μM），M2抗体检测NFAT2蛋白。图(C)中的柱形图为电泳图量化结果。图(D)中的柱形图为电泳图量化结果。图(E)中的柱形图为电泳图量化结果。p-NFAT2mycflag和pCMV-DYRK1A(F)共转染HEK293细胞，转染后24小时加入TAT-NF2-1、TAT-NF2-2和TAT-NF2-3融合多肽（20μM）,transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：融合多肽TAT-NFAT2的制备及纯化

（一）确定NFAT2上DYRK1A作用位点

1、DYRK1A作用底物（底物指DYRK1A可以磷酸化的蛋白，也就是靶蛋白）包含一个保守的RPX(S/T)P结构域（即精氨酸-脯氨酸-任意氨基酸-丝氨酸或苏氨酸-脯氨酸的氨基酸序列）。如图1A所示，ClustalW2软件对NFAT2蛋白的序列分析显示其有三个类似的RPX(S/T)P结构域。为确定NFAT2上DYRK1A的作用位点或者叫靶点，构建NFAT2载体（序列如SEQ IDNO.27所示）和NFAT2缺失载体1-272aa(序列如SEQ ID NO.28所示)、1-308aa(序列如SEQ IDNO.29所示)、1-433aa(序列如SEQ ID NO.30所示)、307-716aa(序列如SEQ ID NO.31所示)和424-716aa(序列如SEQ ID NO.32所示)。

NFAT2载体构建如下，引物对（上游引物：5’-cgcggatccgccaccATGCCAAGCACCAGCTTT-3’和下游引物5’-ccgctcgag GAAAAAGCACCCCACGC -3’， 其序列如SEQ ID NO.8、9所示）以人源cDNA（货号4352575；公司名称：ABI）为模板进行PCR扩增，扩增产物经BamH I和Hind III酶切、电泳和回收后连接入经BamH I和Hind III酶切、电泳和回收后的pCMV6-mycflag载体，命名为p-NFAT2mycflag。

NFAT2缺失载体1-272aa、1-308aa和1-433aa构建如下，引物T7 (5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’， 其序列如SEQ ID NO.10所示)分别与引物1-272（5’-ccgctcgagCTGCACCTCAATCCGAAG-3’， 其序列如SEQ ID NO.11所示）, 引物1-308（5’-ccgctcgag GGTGTACTGGGTGGTGTT-3’， 其序列如SEQ ID NO.12所示）, 引物1-433（5’-ccgctcgag GCCGTTGAGGCTGTACTT-3’， 其序列如SEQ ID NO.13所示）成对，以p-NFAT2mycflag质粒为模板进行PCR扩增，扩增产物经BamH I和Hind III酶切、电泳和回收后连接入经BamH I和Hind III酶切、电泳和回收后的p-NFAT2mycflag载体，分别命名为pNFAT2-1-272mycflag、pNFAT2-1-308mycflag，pNFAT2-1-433mycflag。

NFAT2缺失载体307-716aa和424-716aa构建如下，引物307-716（5’-cgcggatccgccaccatgCCGTATGAGCTTCGGATT-3’， 其序列如SEQ ID NO.14所示）和引物424-716（5’-cgcggatccgccaccatg TACACCAGCTCGGCCAT -3’， 其序列如SEQ ID NO.15所示）分别与XL39引物（ 5’-ATTAGGACAAGGCTGGTGGG-3’，其序列如SEQ ID NO.16所示）成对，以p-NFAT2mycflag质粒为模板进行PCR扩增，扩增产物经BamH I和Hind III酶切、电泳和回收后连接入经BamH I和Hind III酶切、电泳和回收后的p-NFAT2mycflag载体，分别命名为pNFAT2-307-716mycflag、pNFAT2-424-716mycflag。

pCMV-DYRK1A（这是一个DYRK1A的表达载体，目的是让DYRK1A在细胞里面高表达）由本实验室构建(参见文献Lu, M., Zheng, L., Han, B., Wang, L., Wang, P., Liu,H., and Sun, X. (2011) The Journal of biological chemistry 286, 10755-10763（REST负反馈环路调控DYRK1A. 生物化学杂志(2011)286, 10755-10763)）。

pCMV-DYRK1A与NFAT2缺失载体共转染HEK293细胞，37℃、5% CO₂环境下培养48小时，提取总蛋白。通过M2抗体免疫印迹分析，β-actin作为内参。通过M2抗体和anti-DYRK1A抗体免疫沉淀检测DYRK1A和NFAT2缺失片段之间的相互作用（抗体与抗原之间的免疫结合）。如图1B和1C显示，预测的三个结构域与DYRK1A的作用有关。

2、为确定NFAT2上DYRK1A的作用位点或者叫靶点，构建NFAT2突变体和缺失突变体载体S261A(序列如SEQ ID NO.33所示)、S261/403A(序列如SEQ ID NO.34所示)、1-272aa-S261A(序列如SEQ ID NO.35所示)、1-308aa-S261A(序列如SEQ ID NO.36所示)、1-308aa-S278A(序列如SEQ ID NO.37所示)、307-716aa-S403A(序列如SEQ ID NO.38所示)和307-716aa-S409A(序列如SEQ ID NO.39所示)。

NFAT2突变体S261A的构建如下，参考《分子克隆实验指南（第三版）》的实验方案（第1109-1103页）：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引物，FM为5’-CTCCAGACCCGCGGCCCTTGCAACAAG-3’，RM为5’-CTTGTTGCAAGGGGCCGCGGGTCTGGAG-3’， 其序列如SEQ ID NO.17、18所示，模板为p-NFAT2mycflag，构建的载体命名为p-NFAT2-S261Amycflag。

NFAT2突变体S261/403A的构建如下，参考《分子克隆实验指南（第三版）》的实验方案（第1109-1103页）：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引物，FM为5’-AGCCCAAGCCCCTGGCCCCTACGTCCTACATG-3’，RM为5’-CATGTAGGACGTAGGGGCCAGGGGCTTGGGCT-3’， 其序列如SEQ ID NO.19、20所示，模板为p-NFAT2-S261Amycflag，构建的载体命名为p-NFAT2-S261/403Amycflag。

NFAT2缺失突变体1-272aa-S261A的构建如下，参考《分子克隆实验指南（第三版）》的实验方案：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引物，FM为5’-CTCCAGACCCGCGGCCCTTGCAACAAG-3’，RM为5’-CTTGTTGCAAGGGGCCGCGGGTCTGGAG-3’， 其序列如SEQ ID NO.17、18所示，模板为p-NFAT2-1-272mycflag，构建的载体命名为p-NFAT2-1-272-S261A mycflag。

NFAT2缺失突变体1-308aa-S261A的构建如下，参考《分子克隆实验指南（第三版）》的实验方案：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引物，FM为5’-CTCCAGACCCGCGGCCCTTGCAACAAG-3’，RM为5’-CTTGTTGCAAGGGGCCGCGGGTCTGGAG-3’， 其序列如SEQ ID NO.17、18所示，模板为pNFAT2-1-308mycflag，构建的载体命名为p-NFAT2-1-308-S261A mycflag。

NFAT2缺失突变体1-308aa-S278A的构建如下，参考《分子克隆实验指南（第三版）》的实验方案：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引物，FM为5’-CAGCCGCCCTACGCACCCCACCACTC-3’，RM为5’-GAGTGGTGGGGTGCGTAGGGCGGCTG-3’， 其序列如SEQ ID NO.21、22所示，模板为pNFAT2-1-308mycflag，构建的载体命名为p-NFAT2-1-308-S278A mycflag。

NFAT2缺失突变体307-716aa-S403A的构建如下，参考《分子克隆实验指南（第三版）》的实验方案：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引物，FM为5’-AGCCCAAGCCCCTGGCCCCTACGTCCTACATG-3’，RM为5’-CATGTAGGACGTAGGGGCCAGGGGCTTGGGCT-3’， 其序列如SEQ ID NO.23、24所示，模板为pNFAT2-307-716mycflag，构建的载体命名为p-NFAT2-307-716-S403A mycflag。

NFAT2缺失突变体307-716aa-S409A的构建如下，参考《分子克隆实验指南（第三版）》的实验方案：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引物，FM为5’-ACGTCCTACATGGCCCCGACCCTGCCCGCCCTGG-3’，RM为5’-CCAGGGCGGGCAGGGTCGGGGCCATGTAGGACGT-3’， 其序列如SEQ ID NO.25、26所示，模板为pNFAT2-307-716mycflag，构建的载体命名为p-NFAT2-307-716-S409A mycflag。

pCMV-DYRK1A与上述NFAT2突变体和缺失突变体载体共转染HEK293细胞，37℃、5%CO₂环境下培养48小时，提取总蛋白。通过M2抗体免疫印迹分析，β-actin作为内参。如图1D显示，预测的三个结构域都与DYRK1A有关，而S261、S278、S403和S409是NFAT2上DYRK1A的作用位点。

（二）制备并纯化融合多肽TAT-NFAT2

本实施例采用固相合成方法，所述融合多肽的合成可以使用用于有机合成的设备来进行。该方法为Merrifield 的固相合成方法(J.Am.Chem.Soc.85，2149-21，54，1963)，在该方法中，使用半自动肽合成仪(Peti-Syzer Model PSS-510)通过使位于C-末端和N-末端的氨基酸发生缩合来合成所述融合多肽。

具体合成步骤如下：

（1）合成顺序：从C端到N端。

（2）称取X mmol当量的树脂放入反应器中，加入DCM(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个氨基酸（X mmol），2X mmol的DIEA(二异丙基乙胺)，适量的DMF(二甲基甲酰胺)、DCM溶液（适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜），用氮气鼓泡反应60min。然后加入约5X mmol当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、甲醇洗净。

（3）加入适量哌啶去除Fmoc（9-芴甲氧羰基）保护基，洗净，茚三酮检测。

（4）往反应器中加入序列中第二个氨基酸（也为2X mmol），2X mmolHBTU（苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐）及DIEA，氮气鼓泡反应半小时，抽掉液体，用DMF,甲醇洗净，茚三酮检测。

（5）依步骤3、4的方式依次加入序列中氨基酸.抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测。

（6）将树脂用氮气吹干后，从反应柱中取下并称取重量，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量的95%TFA（三氟乙酸）切割液，震荡反应2 h，目的是将多肽从树脂载体上裂解下来并去除氨基酸的侧链保护基团。

（7）滤掉树脂，得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到该序列的粗产物。

（8）分析提纯和质谱检测：用ESI（电喷雾电离）离子源质谱仪检测该序列分子量的正确性，用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度。

（9）收集纯化好的目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。

合成的融合多肽有三种，其序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

实施例2：融合多肽TAT-NFAT2在肿瘤细胞中抑制DYRK1A对NFAT2的作用

（一）DYRK1A在肿瘤细胞HEK293中增加NFAT2蛋白质的表达

1、pGFP-V-RS-shDYRK1A（其为DYRK1A的敲除载体，此载体可以表达一段20个长度的核苷酸序列，此序列可以降解DYRK1A的mRNA，抑制DYRK1A的蛋白表达）由本实验室构建(EST负反馈环路调控DYRK1A. 生物化学杂志(2011)286, 10755-10763（参见文献Lu, M.,Zheng, L., Han, B., Wang, L., Wang, P., Liu, H., and Sun, X. (2011) The Journal of biological chemistry 286, 10755-10763)。

利用脂质体2000（11668-027；Invitrogen）将p-NFAT2mycflag分别与pCMV-DYRK1A、pGFP-V-RS-shDYRK1A共转染到HEK293细胞中，37℃，5% CO₂环境下培养48小时后收取细胞，用含有0.1%SDS的RIPA裂解液裂解细胞获得全蛋白。通过M2抗体免疫印迹（Westerblot）检测NFAT2的表达，β-actin作为内参，如图2A显示DYRK1A使NFAT2蛋白表达量增加。

2、同样方法将pCMV-DYRK1A转染至HEK293细胞，收取全蛋白及细胞核蛋白、细胞质蛋白后利用anti-NFAT2抗体检测内源性NFAT2蛋白，β-actin作为内参，如图2B显示，内源与外源性NFAT2在DYRK1A的作用下变化趋势一致。

上述载体构建方法、基因扩增方法、共转染方法、细胞培养方法、Westerblot免疫方法等实现本发明必须的试验方法，均为本领域通用的方法，例如，可以参见《分子克隆实验手册》，第三版，科学出版社。

（二）NFAT2通过泛素蛋白酶体途径进行降解

1、在转染了p-NFAT2mycflag的HEK293细胞中分别依照不同时间（0h、6h、12h、24h）与不同剂量（0μM、2.5μM、5μM）加入蛋白酶体抑制剂lactacystin，收取细胞经裂解获得全蛋白后，通过M2抗体免疫印迹分析，β-actin作为内参。如图3A、图3B显示，NFAT2蛋白量随着蛋白酶体抑制剂lactacystin处理时间增长与处理剂量增加而增加，NFAT2可以通过泛素蛋白酶体途径降解。

构建p-Ubiquitin质粒。将p-NFAT2mycflag和p-ubiquitin共转染HEK293细胞，5%CO₂环境下培养48小时，提取总蛋白，通过M2和anti-ubiquitin抗体免疫共沉淀检测NFAT2和ubiquitin之间的相互作用。如图3C显示，NFAT2与泛素共定位，NFAT2可以通过泛素蛋白酶体途径进行降解。

2、p-NFAT2mycflag与pCMV-DYRK1A共转染HEK293细胞，37℃、5% CO₂环境下培养48小时，提取总蛋白，通过M2抗体和anti-DYRK1A抗体免疫沉淀检测DYRK1A和NFAT2之间的相互作用，结果如图3D，DYRK1A和NFAT2可以直接相互作用。

p-NFAT2mycflag与pCMV-DYRK1A共转染HEK293细胞，37℃、5% CO₂环境下培养48小时，提取总蛋白，通过Anti-Phosphoserine抗体免疫印迹检测NFAT2的磷酸化水平，M2抗体和anti-ubiquitin抗体免疫沉淀检测NFAT2蛋白的泛素化水平，结果如图3E和图3F，DYRK1A可以增加NFAT2的磷酸化水平，且降低NFAT2的泛素化水平。

图3D、图3E和图3F表明，DYRK1A通过磷酸化NFAT2影响其泛素，从而抑制其蛋白酶体降解。

（三）DYRK1A增加NFAT2的转录活性

1、p-NFAT2mycflag分别与pCMV-DYRK1A和pGFP-V-RS-shDYRK1A共转染HEK293细胞，37℃、5% CO₂环境下培养24小时后收集细胞，提取RNA并反转录为cDNA，PCR扩增NFAT2的靶基因FasL、IL2和TNF-α，琼脂糖凝胶电泳检测基因表达。如图4A和图4B显示，DYRK1A的高表达使NFAT2靶基因的表达增加，而DYRK1A的低表达使NFAT2靶基因的表达减少，表明DYRK1A可以促进NFAT2的转录活性。

2、构建含有NFAT2靶基因IL2启动子的双荧光素酶报告载体pIL2-luc。pIL2-lucand p-NFAT2mycflag共转染HEK293细胞，37℃、5% CO₂环境下培养24小时后收集细胞，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光强度。如图4C显示，DYRK1A可以增加NFAT2的转录活性。

（四）DYRK1A-NFAT2促进癌细胞迁移

p-NFAT2mycflag分别与pCMV-DYRK1A和pGFP-V-RS-shDYRK1A共转染HEK293细胞和小胶质瘤细胞BV2，37℃、5% CO₂环境下培养24小时后收集细胞，transwell肿瘤细胞迁移实验检测细胞的迁移能力。如图5A和图5B显示，DYRK1A的高表达促进了细胞的迁移，而DYRK1A的低表达抑制细胞迁移，说明DYRK1A促进NFAT2的转录活性而增加癌细胞的迁移。

（五）融合多肽TAT-NFAT2抑制DYRK1A对NFAT2的作用

p-NFAT2mycflag与pCMV-DYRK1A共转染小胶质瘤细胞BV2，37℃、5% CO₂环境下培养24小时后。分别加入融合多肽TAT-NFAT2-1(此部分就是前文图1里面标注的三个NFAT2上面DYRK1A作用的位点1)，TAT-NFAT2-2(此部分就是前文图1里面标注的三个NFAT2上面DYRK1A作用的位点2)和TAT-NFAT2-3(此部分就是前文图1里面标注的三个NFAT2上面DYRK1A作用的位点3)，终浓度为20uM，作用24小时。提取总蛋白，通过M2抗体免疫印迹分析，β-actin作为内参，如图5C、图5D和图5E显示，三种融合多肽都能抑制DYRK1A对NFAT2的作用。Transwell肿瘤细胞迁移实验检测细胞的迁移能力, 如图5F显示，DYRK1A促进NFAT2的转录活性而增加癌细胞的迁移，而三种融合多肽能抑制DYRK1A引起的癌细胞迁移能力的促进。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制与以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所做的均等同变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (4)

1.一种融合多肽，其特征在于：是由多肽Ⅰ和多肽Ⅱ构成的融合多肽，其中，多肽Ⅰ为一段NFAT2上的特异性氨基酸序列，选自SEQ ID NO.2所示的序列；多肽Ⅱ为HIV-TAT蛋白转导域，其序列如SEQ ID NO.1所示；所述融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；多肽Ⅰ的N-末端与多肽Ⅱ的C-末端的氨基酸缩合形成肽键。

2.权利要求1所述的融合多肽在制备治疗小胶质肿瘤细胞的药物中的应用。

3.一种包含权利要求1所述的融合多肽的药物组合物。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：该药物组合物除含有融合多肽外，还包括药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。