CN102212140A

CN102212140A - 一种vegf165类似物的制备

Info

Publication number: CN102212140A
Application number: CN2011100813037A
Authority: CN
Inventors: 辛鑫; 臧娴; 周晓晶; 陈蓉; 李琪; 金坚; 储敏; 朱瑞宇
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2011-10-12

Abstract

人血管内皮生长因子165(hVEGF165)突变体与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白及其制备技术的发明属于长效重组融合蛋白技术领域。本发明的融合蛋白包括与人血管内皮生长因子165至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区。利用重叠PCR的方法获得VEGF165的突变体，利用限制性酶切连接的方法将hVEGF165与HSA拼接，中间不加入任何连接肽。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入，它们在保留了hVEGF165活性的基础上，可望显著延长在体内的半衰期，是药学领域中，能够替代hVEGF165的，有良好前景的药用融合蛋白。

Description

一种VEGF165类似物的制备

技术领域

人血管内皮生长因子165突变体与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备属于长效重组融合蛋白药物技术领域：涉及DNA重组技术，药物蛋白与HSA的融合使得药物成为长效药物。

背景技术

血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor，VEGF)是血管内皮细胞的特异丝裂原，1989年由Ferrara等在牛垂体滤泡星形胶质细胞体外培养液中分离纯化出来的，具有细胞质的钙聚集作用，促进血管内皮细胞增殖，诱导血管生成，增加血管通透性，血管保护等生物学作用。

人的VEGF基因位于染色体的6p21.3，编码VEGF的基因长14kb，由8个外显子和7个内含子交替组成，分子量35～45kD。VEGF根据VEGFmRNA剪接方式不同分为多个变构体，有VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189和VEGF206。VEGF165以同源二聚体的形式存在，糖基化的VEGF165二聚体相对分子质量约为45000，非糖基化的相对分子质量约为43000。血管内皮生长因子165(VEGF165)是目前发现的最重要的肿瘤血管形成促进剂之一，具有促血管形成和增加血管通透性的双重功能，在肿瘤的发展和转移中起着重要作用。

VEGF165在体内的半衰期比较短，大约为90分钟。容易受到体内纤溶酶和其他蛋白酶的作用而降解。VEGF165在血管内皮细胞培养、相关科学研究有着广泛的应用，并且在伤口愈合及冠心病的治疗上显示了广阔的前景。

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，它除了具有维持血浆渗透压功能以外，还能担当许多内源因子和外源药物的载体，从而调节激素活性，所载物质的毒性，以及药物的利用度。成熟的HSA有585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa，如此大的分子量减小了它在内循环时经肾排泄的量，再正常情况下，不易被肾小球虑过，血浆半衰期在20天左右。同时，HSA在人体内没有酶学和免疫学活性，是一种理想的生物活性蛋白载体。

针对VEGF165的缺陷和HSA的优点，我们通过对VEGF165的结构特征分析，设计了高活性且稳定的VEGF165类似物，实现了在毕赤酵母中分泌表达和制备。结合白蛋白融合技术，获得高度稳定的VEGF165类似物。

发明内容

本发明的一个内容是提供hVEGF165突变体与HSA生理特性于一体的人血管内皮生长因子165与人血清白蛋白的融合蛋白，该融合蛋白在保持了人血管内皮生长因子165生理特性的基础上，增加了作用位点，延长了体内半衰期，改善了溶解度，具有优良的药学特性。

本发明的技术方案：在前期的研究中本实验室保藏了重组质粒PIC9K-hVEGF165以及pBluescript-HSA质粒。我们对VEGF165的纤溶酶位点进行突变，这样使得VEGF165的体内的稳定性大大增加。再利用HSA高度稳定的特性，将突变的VEGF165与白蛋白进行融合，得到的VEGF165与白蛋白的融合分子在保持VEGF165生物学活性的同时具有高度的稳定性。这将使得该产品在细胞培养以及冠心病药物的开发上具有目前市场产品不可比拟的优越性。

本发明hVEGF165和HSA之间不加任何连接肽，可以避免因连接肽的加入而带来的融合蛋白稳定性和免疫源性方面的问题。

本发明的第二个内容是提供表达该融合蛋白编码区的宿主和携带该融合蛋白编码区的重组表达载体。

表达融合蛋白的宿主可以是细菌、酵母、动物细胞或植物细胞。表达出来的融合蛋白可以存在于宿主细胞内，也可以从宿主细胞中分泌出来；分泌所用的信号肽可以是大然的人血清白蛋白的信号肽，也可以是酿酒酵母阿尔法交配因子的信号肽，或者这两种信号肽的类似物；目的基因可以被整合到宿主的染色体中，也可以插入到质粒中。本发明优选的宿主系统是酵母表达系统，优选的酵母表达系统是毕赤酵母表达系统，优选的毕赤酵母表达系统是GS115和X33。这种表达系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。

与宿主对应的表达载体大多可以购买商品化的，如毕赤酵母表达系统对应的载体，分泌型的有pPIC9K、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P6，胞内型有pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ、pGAPZα等。优选的是毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，它是酵母整合载体，带有纤氨酸缺陷型的选择性标记基因HIS4、AOX1启动子、MFα分泌信号肽和G418抗性基因等元件。AOX1(醇氧化酶操纵子)5’序列、3’序列用于方便编码基因整合至酵母基因组和控制编码基因的表达。

转化带有融合cDNA的表达载体到宿主细胞中，可以用锂盐法、PEG法、原生质体法、电穿孔法或化学转化等方法。转化之后，可以用多种方法鉴定是否成功，如提取基因组DNA进行PCR鉴定，或者对细胞培养上清中的蛋白进行HSA抗体和hVEGF165多抗检测。

生产本发明的融合蛋白可以通过培养带有本发明构件的DNA的宿主系统来进行，具体的培养方法可以用摇瓶或生物反应器。培养分为两个阶段：宿主系统生长阶段和融合蛋白合成阶段。之后可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离纯化融合蛋白，包括盐析、沉淀、超滤、层析、制备电泳等技术及这些技术的组合。

附图说明

图1：重组质粒pPIC9K-HSA-hVEGF165物理图谱

图2：重叠PCR获得VEGF165的突变体

1：重叠PCR获得的VEGF165突变片段

图3：融合蛋白的SDS-PAGE分析

M：为低分子量蛋白质标准；1-12为GS115/pPIC9K-HSA-hVEGF165的发酵液上清

具体实施方法

一、实验材料：

JM109空菌、DH5α/pPIC9K、毕赤酵母GS115(his4Mut+)、PIC9K-hVEGF165以及pBluescript-HSA质粒为本实验室保藏；质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；pyrobest DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA Ladder Marker等购自宝生物工程(大连)有限公司；所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司代为合成；所有测序服务由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

二、实验方法：

实施例1：pPIC9K-HSA-VEGF165mut毕赤酵母表达质粒的构建。

以PIC9K-hVEGF165为模板，通过重叠PCR扩增出hVEGF165突变体基因(图2)，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，回收500bp左右的片断，用Bsu361I、NotI对回收片断和pBluescript-HSA质粒进行双酶切，连接再转化到新鲜制作的JM109感受态细胞。挑选阳性转化子进行酶切验证。阳性重组子提取质粒再通过EcoRI/NotI双酶切获得片断插入到pPIC9K对应的酶切位点，获得正确的pPIC9K-HSA-VEGF165mut毕赤酵母表达质粒(图1)，并通过EcoRI/NotI双酶切及测序进行验证。

实施例2：重组酵母表达系统构建及融合蛋白的表达；

活化并过夜培养JM109/pPIC9K-HSA-hVEGF165mut，提取的质粒，经SalI线性化，电击转化毕赤酵母GS115，转化物涂布与含0.25mg/ml G418的MD平板上，30℃培养72小时，挑取所有的长出的菌落到含0.5mg/ml G418的YPD平板上，30℃培养2-3大。挑取长势好的菌落到20ml液体YPD培养基中，30℃过夜培养，提取GS115全基因组DNA，PCR鉴定出阳性重组子，并把它保存在含20％甘油的YPD中，冻存于-80℃，命名为GS115/pPIC9K-HSA-hVEGF165。

将GS115/pPIC9K-HSA-hVEGF165mut接种到装有30ml BMGY(100mM磷酸钾，PH 6.0；1.34％YNB；4×10^-5％生物素；3％甘油)的250ml三角瓶中，215rpm，30C培养24-36小时，冷冻沉降菌体，弃去上清，加入25ml BMMY(100mM磷酸钾，PH 6.0；1.34％YNB；4×10^-5％生物素；2.5％甲醇)。每24小时补加一次甲醇，诱导3天。SDS-PAGE检测重组融合蛋白的表达情况：采用5％浓缩胶及12％分离胶的不连续垂直平板电泳，考马斯亮蓝R-250染色(图3)。挑选表达量较高的菌株扩大培养，收集离心得上清，上清液经10kDa分子截留量的膜超滤浓缩，再经Blue-Sepharose层析分离，1M精氨酸洗脱获得较纯的HSA-hVEGF165融合蛋白。

Claims

1.hVEGF165纤溶酶酶切位点突变体与人血清白蛋白的融合蛋白。

2.人血管内皮生长因子165突变体与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是：hVEGF165与人血清白蛋白融合基因，中间不加任何连接肽对应的核苷酸序列；得到的HSA-hVEGF165mut融合基因插入到克隆载体，转化到宿主系统中进行表达，融合基因被整合到宿主的染色体中。

3.权力要求1、2和3所述的人血管内皮生长因子165与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是：所述的融合蛋白包括与人血管内皮生长因子165至少95％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少95％序列同源的第二区。

4.权力要求1、2和3所述的人血管内皮生长因子165与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是：所述的融合蛋白包括与人血管内皮生长因子165氨基酸残基序列相同的第一区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第二区，或上述两区的功能等同物。

5.权力要求4所述的人血管内皮生长因子165与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是：所述的功能等同物是在不改变所述的融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白的个别氨基酸的残基的取代、缺失或加入得到的多肽。

6.权力要求1、2和3所述的人血管内皮生长因子165与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是：提供携带编码融合蛋白的基因序列的重组表达载体，pPIC9K-HSA-hVEGF165。

7.权力要求1、2和3所述的人血管内皮生长因子165与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是表达融合蛋白的宿主优选是酵母，酵母中优选毕赤酵母，毕赤酵母中优选是GS115，X-33。

8.权力要求1、2和3所述的人血管内皮生长因子165与人血清白蛋白的融合蛋白在替代hVEGF165的应用。