CN111808881A - 一种高效表达afp3-pten融合蛋白的方法 - Google Patents

一种高效表达afp3-pten融合蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效表达AFP3‑PTEN融合蛋白的方法，属于生物技术领域，本发明把HBx基因克隆到构建的表达载体中，把构建的载体转染人肝癌细胞，肝癌细胞内表达HBx蛋白后，把AFP第3个结构域和全长PTEN基因连接到表达载体，并转染到表达HBx蛋白的人肝癌细胞中，肝癌细胞内表达HBx蛋白，HBx蛋白促进人类AFP3‑PTEN融合蛋白的高效分泌表达，浓缩纯化培养基获得AFP3‑PTEN融合蛋白。本发明肝癌细胞表达的AFP3‑PTEN融合蛋白能抑制细胞增殖，它们使NIH 3T3细胞增殖能力下降了15％～60％。而对照蛋白AFP却使细胞增殖能力明显提高22～125％。血清白蛋白却没有显著促进NIH 3T3细胞增殖能力。本发明获得的AFP3‑PTEN融合蛋白可以用于肿瘤治疗的研究。

Description

一种高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因工程及蛋白质工程，尤其涉及AFP(人类甲胎蛋白)第3个结构域和PTEN(人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因)融合表达与纯化的方法。
背景技术
甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)基因在胎儿发育过程开放表达，而在人出生两年后基本处于关闭状态，但是成人发生肝癌时，AFP的基因重新被激活而大量表达，因而AFP被用作诊断肝癌的标准，AFP可以通过其受体进入癌细胞。因此AFP也可以作为靶向药物的载体，携带抗癌药物等进入癌细胞，从而杀死癌细胞。
PTEN蛋白可通过拮抗酪氨酸激酶等的活性而抑制肿瘤的进展。AFP3-PTEN融合蛋白表达的目是通过AFP第3个结构域把PTEN蛋白带入癌细胞，有助于靶向抑制癌细胞活性。
目前，经检索尚未见关于利用肝癌细胞高效表达与纯化融合蛋白AFP3-PTEN方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种利用肝癌细胞高效表达与纯化AFP3-PTEN融合蛋白的方法，该表达的蛋白活性较好，可以用于癌症治疗的研究。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法，其中：把HBx基因克隆到构建的表达载体中，把构建的载体转染人肝癌细胞，肝癌细胞内表达HBx蛋白后，把AFP第3个结构域和全长PTEN基因连接到表达载体，并转染到表达HBx蛋白的人肝癌细胞中，肝癌细胞内表达HBx蛋白，HBx蛋白促进人类AFP3-PTEN融合蛋白的高效分泌表达，浓缩纯化培养基获得AFP3-PTEN融合蛋白。
进一步地，本发明高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法，具体包括以下步骤：
(1)表达载体的构建
a、表达HBx肝癌细胞系的建立
根据人类HBx基因序列(NCBI登录号为AB210819)，把合成基因用Xba I和Xho I双酶切，用T4连接酶连接到表达载体PTT5(Invitrogen)，转化DH5α细胞后提取质粒，得到PTT5-HBx表达载体，把PTT5-HBx转染肝癌细胞系48h后，得到表达HBx的肝细胞系；
b、把AFP基因(Gen Bank:NM_001134的第3个结构域，第401～610个残基的基因，具体合成的基因序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)和PTEN全长基因(NP_000305.2，具体合成的基因序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)连接起来，并在其C端加上6×His标签；把合成基因用Xba I和Xho I双酶切，用T4DNA连接酶连接到哺乳动物表达载体PTT5(Invitrogen)，转化DH5α细胞后提取质粒，得到PTT5-AFP3-PTEN质粒；
c、将HBx全长基因克隆到表达载体PTT5载体中，转化DH5α细胞后提取质粒，得到PTT5-HBx质粒；
(2)把表达载体转染人肝癌细胞
把PTT5-HBx质粒转染人肝癌细胞48小时后，再转染PTT5-AFP3-PTEN质粒，48～96小时后收集培养基；
(3)AFP3-PTEN融合蛋白的纯化
将以上收集培养基加入HBS(10mM Hepes，pH 7.2，150mM NaCl)溶液，通过滤膜浓缩，把浓缩溶液吸附到镍柱上，然后用洗脱液洗脱，把洗脱液通过凝胶柱纯化，再进一步通过滤膜浓缩及冷冻干燥，得到AFP3-PTEN融合蛋白。
进一步地，所述AFP3-PTEN融合蛋白分子量为68～72KD；它功能与AFP不同，AFP促进细胞增殖，而AFP3-PTEN融合蛋白却抑制细胞增殖。
进一步地，所述肝癌细胞系是用于实验、未有传染相关报道的HLE、HepG2或Bel-7402肝癌细胞。
进一步地，所述肝癌细胞是转染了HBx的表达载体，并表达HBx蛋白的肝癌细胞。
所述的获得AFP3-PTEN融合蛋白是AFP第3个结构域后面带有PTEN蛋白，因此通过AFP第3个结构域把PTEN蛋白带入到癌细胞中，从而抑制癌细胞增殖。
肝癌细胞表达的AFP3-PTEN融合蛋白能抑制细胞增殖，它们使NIH 3T3细胞增殖能力下降了15％～60％。而对照蛋白AFP却使细胞增殖能力明显提高22～125％。血清白蛋白却没有显著促进NIH 3T3细胞增殖能力。
本发明获得的AFP3-PTEN融合蛋白可以用于肿瘤治疗的研究。
附图说明
图1：AFP3-PTEN融合蛋白表达载体(PPT5-AFP3-PTEN)电泳图。1：Marker；2:重组质粒PPT5-AFP3-PTEN；重组质粒PPT5-AFP3-PTEN用Xba I和Xho I双酶切验证，2000bp处有AFP3-PTEN大小的片段，说明连接正确。
图2：肝癌细胞表达的AFP3-PTEN融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。1：protein Marker；2～4：不同时间表达的AFP3-PTEN融合蛋白。
图3：[3H]掺入法测定AFP、HSA(血清白蛋白)、AFP3-PTEN融合蛋白对NIH 3T3的增殖能力的影响。用一定量的(0～80mg/L)AFP处理NIH 3T3细胞24h，细胞增殖能力明显提高22～125％。而HLE、Hepg2或Bel-7402肝细胞表达的AFP3-PTEN融合蛋白却抑制细胞增殖，它们使NIH 3T3细胞增殖能力下降了15％～60％。血清白蛋白却没有显著促进NIH 3T3细胞增殖能力。
具体实施方式
实施例一利用HLE细胞高效表达与纯化AFP3-PTEN融合蛋白的方法
1、表达HBx的HLE细胞的建立
根据人类HBx基因序列(NCBI登录号为AB210819)，把合成基因用Xba I和Xho I双酶切，用T4连接酶连接到表达载体PTT5(Invitrogen)，转化DH5α细胞后提取质粒，然后转染HLE细胞，培养48小时后检测HBx蛋白的表达。
2、将含有PTT5-AFP3-PTEN质粒转染到表达HBx的HLE细胞中，培养48h后，收集培养基。
3、AFP3-PTEN融合蛋白分离纯化和鉴定。由于蛋白为分泌表达，所以将培养基与细胞混合物8000r/min离心5min后，取上清通过切向流膜浓缩切换溶液，溶液为HBS buffer(10mM Hepes，pH 7.2，150mM NaCl)。然后挂镍柱，用300mmol/L的咪唑冲洗。然后再继续用凝胶色谱(AKAT，spudex200柱)纯化，流动相为HBS(10mM Hepes，pH 7.2，150mM NaCl)。表达融合蛋白的分子量约68～72KD。
4、HLE表达的AFP3-PTEN融合蛋白能抑制癌细胞生长。
[3H]掺入法测定AFP、HSA(血清白蛋白)、AFP3-PTEN融合蛋白对NIH 3T3的增殖能力的影响。用一定量的(0-80mg/L)AFP处理NIH 3T3细胞24h，细胞增殖能力明显提高22～125％。而HLE肝细胞表达的AFP3-PTEN融合蛋白却抑制细胞增殖，它们使NIH 3T3细胞增殖能力下降了14％～57％。血清白蛋白却没有显著促进NIH 3T3细胞增殖能力(如图3所示)。
实施例二利用HepG2细胞高效表达与纯化AFP3-PTEN融合蛋白的方法
1、表达HBx的HepG2细胞的建立
根据人类HBx基因序列(NCBI登录号为AB210819)，把合成基因用Xba I和Xho I双酶切，用T4连接酶连接到表达载体PTT5(Invitrogen)，转化DH5α细胞后提取质粒，然后转染HepG2细胞，培养48小时后检测HBx蛋白的表达。
2、将含有PTT5-AFP3-PTEN质粒转染到表达HBx的HepG2细胞中，培养96h后，收集培养基。
3、重组蛋白分离纯化和鉴定。将培养基与细胞混合物8000r/min离心5min后，取上清通过切向流膜浓缩切换溶液，溶液为HBS buffer(10mM Hepes，pH 7.2，150mM NaCl)。然后挂镍柱，用300mmol/L的咪唑冲洗。然后再继续用凝胶色谱(AKAT，spudex200柱)纯化，流动相为HBS buffer(10mM Hepes，pH 7.2，150mM NaCl)。表达融合蛋白的分子量约68～72KD。
4、HepG2表达的AFP3-PTEN融合蛋白能抑制癌细胞生长。
[3H]掺入法测定AFP、HSA(血清白蛋白)、AFP3-PTEN融合蛋白对NIH 3T3的增殖能力的影响。用一定量的(0～80mg/L)AFP处理NIH 3T3细胞24h，细胞增殖能力明显提高22～125％。而HepG2肝细胞表达的AFP3-PTEN融合蛋白却抑制细胞增殖，它们使NIH 3T3细胞增殖能力下降了15％～55％。血清白蛋白却没有显著促进NIH 3T3细胞增殖能力(如图3所示)。
实施例三利用Bel-7402细胞高效表达与纯化AFP3-PTEN融合蛋白的方法
1、表达HBx的Bel-7402细胞的建立
根据人类HBx基因序列(NCBI登录号为AB210819)，把合成基因用Xba I和Xho I双酶切，用T4连接酶连接到表达载体PTT5(Invitrogen)，转化DH5α细胞后提取质粒，然后转染Bel-7402细胞，培养72小时后检测HBx蛋白的表达。
2、将含有PTT5-AFP3-PTEN质粒转染到表达HBx的Bel-7402细胞中，培养85h后，收集培养基。
3、重组蛋白分离纯化和鉴定。由于蛋白为分泌表达，所以将培养基与细胞混合物8000r/min离心5min后，取上清冷冻干燥后换溶液，溶液为HBS(10mM Hepes，pH 7.2，150mMNaCl)。然后挂镍柱，用300mmol/L的咪唑冲洗。然后继续用凝胶色谱(AKAT，spudex200柱)纯化，流动相为HBS buffer(10mM Hepes，pH 7.2，150mM NaCl)，然后继续通过切向流膜浓缩，表达融合蛋白的分子量约68～72KD。
4、Bel-7402表达的AFP3-PTEN融合蛋白能抑制癌细胞生长。
[3H]掺入法测定AFP、HSA(血清白蛋白)、AFP3-PTEN融合蛋白对NIH 3T3的增殖能力的影响。用一定量的(0～80mg/L)AFP处理NIH 3T3细胞24h，细胞增殖能力明显提高22～125％。而Bel-7402肝细胞表达的AFP3-PTEN融合蛋白却抑制细胞增殖，它们使NIH 3T3细胞增殖能力下降了14％～60％。血清白蛋白却没有显著促进NIH 3T3细胞增殖能力(如图3所示)。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
序列表
<110>海南医学院
<120>一种高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法
<160>4
<210>1
<211>630
<212>DNA
<213>人（homo sapiens）
<400>1
ttacagaaat acatccagga gagccaagca ttggcaaagc gaagctgcgg cctcttccag 60
aaactaggag aatattactt acaaaatgcg tttctcgttg cttacacaaa gaaagccccc 120
cagctgacct cgtcggagct gatggccatc accagaaaaa tggcagccac agcagccact 180
tgttgccaac tcagtgagga caaactattg gcctgtggcg agggagcggc tgacattatt 240
atcggacact tatgtatcag acatgaaatg actccagtaa accctggtgt tggccagtgc 300
tgcacttctt catatgccaa caggaggcca tgcttcagca gcttggtggt ggatgaaaca 360
tatgtccctc ctgcattctc tgatgacaag ttcattttcc ataaggatct gtgccaagct 420
cagggtgtag cgctgcaaac gatgaagcaa gagtttctca ttaaccttgt gaagcaaaag 480
ccacaaataa cagaggaaca acttgaggct gtcattgcag atttctcagg cctgttggag 540
aaatgctgcc aaggccagga acaggaagtc tgctttgctg aagagggaca aaaactgatt 600
tcaaaaactc gtgctgcttt gggagtttaa 630
<210>2
<211>209
<212>PRT
<213>人（homo sapiens）
<400>2
Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser
1 5 10 15
Cys Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala
20 25 30
Phe Leu Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser
35 40 45
Glu Leu Met Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr
50 55 60
Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly
65 70 75
Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met
80 85 90
Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr
95 100 105
Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr
110 115 120
Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys
125 130 135
Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln
140 145 150
Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr Glu
155 160 165
Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu
170 175 180
Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu
185 190 195
Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val
200 205 209
<210>3
<211>1230
<212>DNA
<213>人（homo sapiens）
<400>3
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tttaattgca gagttgcaca atatcctttt gaagaccata acccaccaca gctagaactt 300
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catcggggca aatttttaaa ggcacaagag gccctagatt tctatgggga agtaaggacc 480
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tttaaggtga agctgtactt cacaaaaaca gtagaggagc cgtcaaatcc agaggctagc 1080
agttcaactt ctgtaacacc agatgttagt gacaatgaac ctgatcatta tagatattct 1140
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140 145 150
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170 175 180
Leu Leu Lys Asn His Leu Asp Tyr Arg Pro Val Ala Leu Leu Phe
185 190 195
His Lys Met Met Phe Glu Thr Ile Pro Met Phe Ser Gly Gly Thr
200 205 210
Cys Asn Pro Gln Phe Val Val Cys Gln Leu Lys Val Lys Ile Tyr
215 220 225
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230 235 240
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245 250 255
Glu Phe Phe His Lys Gln Asn Lys Met Leu Lys Lys Asp Lys Met
260 265 270
Phe His Phe Trp Val Asn Thr Phe Phe Ile Pro Gly Pro Glu Glu
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Asp Ser Ile Cys Ser Ile Glu Arg Ala Asp Asn Asp Lys Glu Tyr
305 310 315
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320 325 330
Asp Lys Ala Asn Arg Tyr Phe Ser Pro Asn Phe Lys Val Lys Leu
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365 370 375
His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp Ser Asp Pro Glu Asn Glu
380 385 390
Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln Ile Thr Lys Val His His
395 400 405
His His His His
409

Claims (4)

1.一种高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法，其特征在于：把HBx基因克隆到构建的表达载体中，把构建的载体转染人肝癌细胞，肝癌细胞内表达HBx蛋白后，把AFP第3个结构域和全长PTEN基因连接到表达载体，并转染到表达HBx蛋白的人肝癌细胞中，肝癌细胞内表达HBx蛋白，HBx蛋白促进人类AFP3-PTEN融合蛋白的高效分泌表达，浓缩纯化培养基获得AFP3-PTEN融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)表达载体的构建
a、把AFP第3个结构域基因和PTEN全长基因克隆到表达载体PTT5载体中，其C端加上6个组氨酸序列，转化DH5α细胞后提取质粒，得到PTT5-AFP3-PTEN质粒；
b、将HBx全长基因克隆到表达载体PTT5载体中，转化DH5α细胞后提取质粒，得到PTT5-HBx质粒；
(2)把表达载体转染人肝癌细胞
把PTT5-HBx质粒转染人肝癌细胞48小时后，再转染PTT5-AFP3-PTEN质粒，48～96小时后收集培养基；
(3)AFP3-PTEN融合蛋白的纯化
将以上收集培养基加入HBS溶液，通过滤膜浓缩，把浓缩溶液吸附到镍柱上，然后用洗脱液洗脱，把洗脱液通过凝胶柱纯化，再进一步通过滤膜浓缩及冷冻干燥，得到AFP3-PTEN融合蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法，其特征在于：所述AFP3-PTEN融合蛋白分子量为68～72KD。
4.根据权利要求1或2所述的高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法，其特征在于：所述肝癌细胞系是用于实验、未有传染相关报道的HLE、HepG2或Bel-7402肝癌细胞。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112522314A (zh) * 2020-12-11 2021-03-19 山东新医学中西医结合医学研究院有限公司 一种构建高表达pten载体的方法及其应用
CN116789840A (zh) * 2023-07-12 2023-09-22 北京川晋生物科技有限公司 一种干细胞来源的蛋白提取液及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1871252A (zh) * 2003-09-05 2006-11-29 Gtc生物治疗学公司 在转基因哺乳动物奶中生产融合蛋白的方法
CN102112622A (zh) * 2008-05-28 2011-06-29 拜耳医药保健有限公司 用于在表达HBx的哺乳动物细胞中生产重组蛋白的方法和组合物
CN103614414A (zh) * 2013-11-25 2014-03-05 河南省华隆生物技术有限公司 Afp和il-2双基因共表达重组载体及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1871252A (zh) * 2003-09-05 2006-11-29 Gtc生物治疗学公司 在转基因哺乳动物奶中生产融合蛋白的方法
CN102112622A (zh) * 2008-05-28 2011-06-29 拜耳医药保健有限公司 用于在表达HBx的哺乳动物细胞中生产重组蛋白的方法和组合物
CN103614414A (zh) * 2013-11-25 2014-03-05 河南省华隆生物技术有限公司 Afp和il-2双基因共表达重组载体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Homo sapiens phosphatase and tensin homolog(PTEN),transcript variant 1,mRNA" *
"Human mRNA encoding alpha-fetoprotein(AFP).AFP is a major serum protein(MG:70000)synthesized during fetal life" *
LIN BO等: "AFP-Inhibiting Fragments for Drug Delivery: The Promise and Challenges of taggeting therapeutics to cancers", 《FRONTIERS IN CELL AND DEVELOPMENTAL BIOLOGY》 *
POSYPANOVA等: "The receptor binding fragment of alpha-fetoprotein is a promising new vector for the selective delivery of antineoplastic agents", 《JOURNAL OF DRRUG TARGETING》 *
东楠等: "乙肝病毒X蛋白诱导肝癌细胞凋亡的信号转导途径", 《中国生物化学与分子生物学报》 *
喻备等: "真核重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN的构建及其在HEK 293-6E细胞中的表达", 《中国生物制品学杂志》 *
王珊珊等: "AFP截断体真核表达载体的构建及表达", 《北京医学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112522314A (zh) * 2020-12-11 2021-03-19 山东新医学中西医结合医学研究院有限公司 一种构建高表达pten载体的方法及其应用
CN116789840A (zh) * 2023-07-12 2023-09-22 北京川晋生物科技有限公司 一种干细胞来源的蛋白提取液及其制备方法
CN116789840B (zh) * 2023-07-12 2024-01-05 北广再生医学科技(广东)有限公司 一种干细胞来源的蛋白提取液及其制备方法

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