KR20110062997A - 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 막 투과 도메인 및 생물학적 활성분자를 포함하는 융합 단백질 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질 전환된 세포, 및 상기 융합 단백질을 이용한 생물학적 활성분자의 세포 내 전달 방법을 제공한다.

유비퀴틴, 막 투과 도메인, 단백질 카고, 생물학적 활성분자, 세포내 전달

Description

유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 막 투과 도메인 및 생물학적 활성분자를 포함하는 융합 단백질 및 그의 용도{Fusion protein comprising ubiquitin or ubiquitin-like protein, membrane transfer domain and biologically active molecule and uses thereof}

유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질 전환된 세포, 및 상기 융합 단백질을 이용한 생물학적 활성분자의 세포 내 전달 방법에 관한 것이다.

인체의 다양한 질병은 많은 경우 세포 내 단백질의 비정상적 활성에 기인한다는 사실이 알려짐에 따라, 전세계적으로 이러한 단백질의 비정상적 활성을 조절함으로써 여러 가지 인체 질환을 치료할 수 있는 신약 개발이 시도되고 있다. 특히, 생리 활성을 특이적으로 조절할 수 있는 효소-단백질 또는 단백질-단백질 상호 작용에 기초한 펩티드 및 펩티드성 또는 단백질 형태의 물질이 빠르게 개발되고 있 다. 그러나, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 다른 화합물에 비해 생리적인 선택성 및 효능이 탁월함에도 불구하고 그 크기나 여러 생화학적 특성으로 인하여 세포막을 통과하기 어렵다. 이처럼 세포 내부로 직접 전달될 수 없는 약점 때문에 효과적인 치료제 및 연구 수단으로서의 실용화가 현실적으로 어려운 실정이다.

펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 세포 내로 전달하기 위해서 지금까지 많은 방법이 시도되어 왔다. 최근에는 세포막 투과의 특성을 갖는 펩티드를 이용하는 방법이 새롭게 시도되고 있다. 1988년 처음으로 HIV-1의 Tat 단백질을 세포 배양액에 첨가시켜 주었을 때 능동적으로 세포 내로 수송되는 현상이 밝혀진 이후, 세포 내로 단백질이 투과되는 기전에 대한 연구가 집중되었다. 그 후 초파리의 Antp 단백질과 HSV의 VP22 단백질, FGF (Fibroblast Growth Factor)에 존재하는 시그널 서열(막 투과 서열) 또는 세포질 침투 서열 등 세포막을 투과하는 다양한 펩티드에 대한 연구가 진행되었다.

이 중 최근에 연구되고 있는 막 투과 도메인(membrane transfer domain, MTD)의 경우 다른 세포막 투과 펩티드(cell penetrating peptide, CPP)와는 달리 수용체/운반체(receptor/transporter)를 이용하지 않고 직접 세포막을 투과하여, 수용체/운반체의 발현에 비의존적이다. 또한, 엔도시토시스(endocytosis)를 거치지 않고 이송이 가능하므로, 효율이 높을 뿐만 아니라 다른 세포막 투과 펩티드와는 달리 세포간(cell-to-cell)의 이동이 가능하여 주목받고 있다.

그러나 상기 장점에도 불구하고 MTD가 갖는 소수성의 특성으로 인해 실제 동물 실험에 적용되기 어려운 측면이 있었다. 예를 들면, MTD를 포함하는 융합 단백 질이 재조합 세포 내에서 발현되는 경우, 봉입체(inclusion body)의 형태로 얻어져 단백질의 안정성이 떨어지고, 이종(heterogenous) 형태의 시료로 얻어지며, 봉입체를 활성화시키는 과정의 적용이 안 되는 경우가 빈번하다.

따라서, 종래 기술에 의하더라도, 세포 내로 물질을 안정하게 전달할 수 있는 막 투과 도메인을 포함하는 융합 단백질의 개발이 여전히 요구되고 있다.

일 양상은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질 전환된 세포, 및 상기 융합 단백질을 이용한 생물학적 활성분자의 세포 내 전달 방법을 제공한다.

일 양상은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질을 제공한다.

용어 "막 투과성"은 인 비트로(in vitro) 및/또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상의 생물학적 활성분자를 세포 내 또는 핵 내로 운반할 수 있는 능력을 의미한다. 또한, "막 투과 도메인(membrane transfer domain, MTD)"은 그 자체로 인지질 이중막의 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 막 투과 도메인은 그 N-말단에 단일 소수성 영역(single hydrophobic region)을 가지고, 헬릭스 구조(helix structure)를 형성하며, 유연성을 나타내고, 상대적으로 짧은 길이의 아미노산(7개 내지 17개 아미노산)을 갖는 것을 특징으로 한다. 따라서, 상기 막 투과 도메인의 물성은 소수성을 나타낸다.

한편, 유비퀴틴(ubiquitin, Ub)은 자연계에서 발견되는 가장 보존적인 단백질로 76개의 아미노산 서열로 이루어져 있으며, 곤충, 송어 및 인간처럼 진화적으로 다양한 종들간의 완벽한 상동성을 보이는 수용성 단백질이다. 또한, 유비퀴틴은 pH의 변화에 대해 안정하고, 고온에서도 쉽게 변성되지 않으며, 프로테아제에 대해서도 안정성이 있는 단백질로 알려져 있다. 따라서, 유비퀴틴을 상기 막 투과 도메인에 융합하면, 상기 막 투과 도메인의 불용성을 개선할 수 있다.

상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질(ubiquitin-like protein, Ubl)은 야생형 유비퀴틴, 야생형 유비퀴틴-유사 단백질, 돌연변이 유비퀴틴 및 돌연변이 유비퀴틴-유사 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 돌연변이 유비퀴틴은 야생형 유비퀴틴의 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 바꾼 것을 의미하며, 예를 들면, 야생형 유비퀴틴의 Lys을 Arg으로 치환한 유비퀴틴, 야생형 유비퀴틴 C-말단 RGG를 RGA로 변경시킨 유비퀴틴을 포함한다. 상기 야생형 유비퀴틴의 Lys을 Arg으로 치환한 돌연변이형 유비퀴틴에서, 상기 치환은 야생형 유비퀴틴의 6, 11, 27, 29, 33, 48 및 63번째에 존재하는 Lys에서 이루어질 수 있으며, 치환은 상기 Lys의 위치에서 독립적으로 또는 조합하여 이루어질 수 있다.

상기 유비퀴틴-유사 단백질은 유비퀴틴과 그 특성이 유사한 단백질로, 예를 들어, Nedd8, SUMO-1, SUMO-2, NUB1, PIC1, UBL3, UBL5 및 ISG15 등을 포함할 수 있다.

상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질은 C-말단에 프로테아제에 의해 절 단 가능한 아미노산 서열 또는 프로테아제에 의해 절단되지 않는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열은 당업계에 공지된 검색 데이터베이스를 통해 확인할 수 있다. 예를 들어, http://www.expasy.org/tools/peptidecutter/peptidecutter_enzymes.html에서 검색되는 프로테아제 및 그의 절단 가능한 아미노산 서열을 이용할 수 있다. 상기 절단 가능한 아미노산 서열이 포함되는 경우, 상기 융합 단백질이 세포 내로 투과된 다음, 세포 내의 프로테아제에 의해 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질은 절단이 되어, 생물학적 활성분자가 세포 내에서 그 기능을 할 수 있게 된다. 상기 절단 후, 생물학적 활성분자에는 막 투과 도메인이 포함되어 있지만, 막 투과 도메인의 폴리펩티드의 길이가 매우 짧으므로, 생물학적 활성분자의 기능에는 영향을 미치지 않는다. 세포 내의 프로테아제에 의해 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질이 절단되지 않더라고 생물학적 활성분자가 세포 내에서 그 기능을 할 수 있게 되기도 한다.

또한, 상기 막 투과 도메인은 그 자체로 인지질 이중막의 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이면 모두 가능하고 특별히 한정되지 않으나, 서열 번호 1에서 서열 번호 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

용어, "생물학적 활성분자(biologically active molecule)"는 상기 막 투과 도메인에 결합하여 세포 내로 운반될 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다.

상기 생물학적 활성분자는 2 이상의 잔기로 구성되는 아미노산의 중합체로 펩티드 및 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 예를 들어, SV40 라지 T 항원 및 텔로머라아제와 같은 세포 불멸에 관여하는 단백질, 돌연변이 p53 및 BclxL과 같은 항-아폽토틱 단백질, 항체, ras, myc, HPV E6/E7 및 아데노바이러스 Ela와 같은 암유전자, 사이클린 및 사이클린 의존성 키나아제와 같은 세포 주기 조절 단백질 또는 녹색 형광 단백질, 베타-갈락토시다아제 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제와 같은 효소가 될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

또한, 상기 융합 단백질에 포함될 수 있는 생물학적 활성분자는 그 특성이 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어, 친수성 단백질일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 활성분자는 예를 들어, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호 전달 단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄 항체, 결합 단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착 단백질, 구조 단백질, 조절 단백질, 독소 단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 백신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

예를 들어, 상기 융합 단백질에 포함되는 생물학적 활성분자는 p53, p18, p53-p18, p21, p25, p57, p16, p15, NIP71, 뉴로레귤린 1(neuroregulin 1), PTEN 종양억제인자(tumor suppressor), ARF 종양억제인자, APC, CD95, 폴리큘린(Folliculin), MEN1, BRCA1, Von Hippel-Lindau 종양억제인자, RKIP, nm23, 엔도스타틴, 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리트로포이에틴, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH (adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRH-II(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20 (enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 또는 지코노타이드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 막 투과성 융합 단백질은 생물학적 활성분자를 핵 내로 이송시켜야 하는 경우 핵 위치신호 도메인을 더 포함할 수 있다.

용어, "핵 위치신호 도메인(nucleus localization signal domain , NLS)"은 세포질에서 핵으로 수송되는 단백질들이 특징적으로 가지고 있는데, 핵막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미하고 이의 아미노산 서열이 특별히 한정되지는 않는다. 상기 핵 위치신호 도메인으로 사용될 수 있는 폴리펩티드는 예를 들어, KKKRK(서열 번호 26), PKKKRKV(서열 번호 27), KRPAATKKAGQAKKKK(서열 번호 28) 등일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 핵 위치신호 도메인은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단, 막 투과 도메인의 C-말단, 생물학적 활성 분자의 C-말단 중 어느 한 곳에 위치할 수 있다.

또 다른 양상은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성 분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

용어 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.

한편, 상기 융합 단백질에 포함된 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 뉴클레오티드 서열은 포유 동물로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어, 인간으로부터 유래될 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 뉴클레오티드 서열 검색 데이터베이스, 예컨대, NCBI Entrez(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) 또는 EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)을 통해 검색되는 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 뉴클레오티드를 모두 사용할 수 있다.

다른 양상은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성 분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 “작동적으로 연결된(operatively linked)”은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

상기 재조합 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있 다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, p_L ^λ 프로모터 trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

또 다른 양상은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 제공한다. 상기 유비 퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성 분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 것인 세포일 수 있다.

즉, 상기 세포는 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성 분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 숙주 세포의 게놈 상에 포함하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된 재조합 벡터를 포함하는 것이다.

상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예 를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

다른 양상은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성분자 를 포함하는 막 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 배양하는 단계 및 배양물로부터 발현된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.

형질 전환된 세포의 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 형질 전환된 세포를 YT 액상 배지에 접종하여 배양을 실시한 다음, 세포 밀도가 일정 수준에 도달한 시점에서 IPTG를 배지에 첨가하여 lacZ 프로모터에 의한 단백질 발현을 유도하고 배양함으로써, 세포 내 또는 배지로 분비된 단백질을 얻을 수 있다.

세포 내 또는 배지로 분비된 단백질은 당업계에 공지된 다양한 정제 방법에 따라 정제된 형태로 얻을 수 있다. 예를 들어, 암모늄 설페이트에 의한 용해도 분획화(solubility fractionation), 크기 분별 여과 및 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 정제 방법을 통하여 정제된 형태로 단백질을 얻을 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질이 GST에 융합된 경우에는 글루타티온이 결합된 레진 칼럼, 6x His에 융합된 경우에는 Ni²⁺-NTA His-결합 레진 칼럼을 이용하여 원하는 단백질을 용이하게 얻을 수 있다.

또 다른 양상은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성 분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질의 세포 내 전달 방법을 제공한다.

상기 방법은, 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성 분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질을 세포와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 접촉은 인 비트로 또는 인 비보로 수행될 수 있으며, 인 비보로 접촉하는 경우, 상기 막 투과성 융합 단백질을 대상에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 대상은 세포, 조직, 기관 또는 개체일 수 있다. 또한, 상기 투여는 상 기 융합 단백질을 적절한 완충액에 용해하여 세포, 조직 또는 기관에 직접 접촉시키거나, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 개체에 비경구 투여를 할 수 있다. 상기 투여가 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 상기 투여된 융합 단백질은 막 투과 도메인을 포함하고 있으므로, 상기 방법에 따라 투여되는 부위의 세포 내에 생물학적 활성 분자를 전달할 수 있다.

상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성 분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질 및 이를 이용한 생물학적 활성 분자의 세포 내 전달 방법에 의하면, 소수성인 막 투과 도메인을 포함하는 융합 단백질을 효율적으로 분리하여, 생물학적 활성 분자를 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 유비퀴틴 , 핵 위치신호 도메인, 막 투과 도메인 및 p53 - p18 이 융합된 융합 단백질의 발현 벡터의 제조

본 실시예에서는 친수성 폴리펩티드의 한 종류인 유비퀴틴, 핵 위치신호 도 메인(NLS: nuclear localization signal domain), 막 투과 도메인 및 p53-p18의 순서로 연결된 세포막 투과성 융합 단백질을 생산하기 위한 상기 융합 단백질 발현 벡터를 제조하였다.

상기 융합 단백질을 생산하기 위하여 먼저, 핵 위치신호 도메인 폴리펩티드(KKKRK; 서열 번호 26)와 막 투과 도메인으로 알려진 kFGF4 성장인자의 리더 서열 (AAVALLPAVLLALLAP; 서열 번호 1) 및 p53 폴리펩티드의 N-말단 단편(mdm2 결합 도메인)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 pET-NLS-kFGF4-p53 발현 벡터를 제작한다. 상기 발현 벡터는 NLS-kFGF4-p53 폴리펩티드를 코딩하는 센스 및 안티센스 가닥의 올리고뉴클레오티드(센스 가닥: 5'ttgaattcaaaaagaagagaaaggccgcggtagcgctgctcccggcggtcctgctggccttgctggcgcccgaaacattttcagacctatggaaactacttcctgaaaacaagcttaa3'; 서열 번호 16, 안티센스 가닥: 5' ttaagcttgttttcaggaagtagtttccataggtctgaaaatgtttcgggcgccagcaaggccagcaggaccgccgggagcagcgctaccgcggcctttctcttctttttgaattcaa3'; 서열 번호 17)를 어닐링(annealing)한 다음, EcoRI/HindⅢ 제한 효소로 절단하여, 동일한 제한 효소로 절단한 pET22b에 삽입하여 제조하였다.

이후, 공지의 인간 유비퀴틴의 cDNA 서열, 공지의 인간 p18의 cDNA 서열을 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 각각의 폴리뉴클레오티드 단편을 합성하였다. 인간 유비퀴틴의 폴리뉴클레오티드 단편을 합성하기 위한 정방향 프라이머는 5'ttggatccggtagtggaagcatgcagattttcgtgaaa3'(서열 번호 18), 역방향 프라이 머는 5'ttgaattcaccacgaagtctcaacacaa3'(서열 번호 19)이며, 각각 BamHI/EcoRI의 제한 효소 절단 부위를 포함하였다. 또한, 인간 p18의 폴리뉴클레오티드 단편을 합성하기 위한 정방향 프라이머는 5' ttaagcttatggccgagccttgggggaacgagttgg3'(서열 번호 20), 역방향 프라이머는 5' ttctcgagttattgaagattttgtggctcc3'(서열 번호 21)이며, 각각 HindⅢ/XhoI의 제한 효소 절단 부위를 포함하였다. 이후, p18의 친수성을 높이기 위한 부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 수행하기 위해 정방향 프라이머 5'cttagaggtgctaatcccgatttg3'(서열 번호 22), 역방향 프라이머 5'gtctttcaaatcgggattagcacc3'(서열 번호 23)을 이용하여 71번째 아미노산 페닐알라닌(F)을 아스파라긴(N)으로 치환하였다. 이를 "p18(F71N)"로 명명하였다.

상기 PCR 반응은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해, GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)를 사용하여 수행하였으며, 상기 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 제조사의 프로토콜에 따라 QIAquick Multiwell PCR Purification kit(Qiagen)으로 세정한 다음, 상기 수득한 PCR 결과물들을 pGEM-T Easy 벡터(Promega)에 각각 클로닝하였다. 이후, 상기 벡터를 컴피턴트 세포(E. Coli DH5α)에 형질 전환시키고, QIAprep Spin Miniprep kit(Qiagen社)를 사용하여 형질 전환된 세포로부터 플라스미드를 분리하였다.

인간 유비퀴틴의 cDNA가 포함된 pGEM-T Easy 벡터를 BamHI과 EcoRI으로 절단하고, 인간 p18(F71N)의 cDNA가 포함된 pGEM-T Easy 벡터를 HindⅢ와 XhoI으로 절단한 다음, 상기 pET-NLS-kFGF4-p53 발현 벡터에 삽입하였다. 상기 과정을 통해 제조된 인간 유비퀴틴-핵 위치신호 도메인-막 투과 도메인-p53-p18(F71N)의 융합 단 백질을 발현시킬 수 있는 벡터를 pET-Ub-NLS-kFGF4-p53-p18(F71N)로 명명하였다. 한편, 상기 pET 벡터에 삽입된 인간 유비퀴틴-핵 위치신호 도메인-막 투과 도메인-p53-p18 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열을 각각 서열 번호 24 및 서열 번호 25에 개시하였다.

서열 번호 24에서 1 내지 228번째 염기 서열은 인간 유비퀴틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 235 내지 249번째 염기 서열은 핵 위치 신호 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 250 내지 297번째 염기 서열은 kFGF4 리더 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 298 내지 336번째 염기 서열은 p53을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 343 내지 849번째 염기 서열은 p18을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 서열 번호 25의 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 상기 각각의 폴리펩티드의 위치는 상기 서열 번호 24의 염기 서열로부터 유추 가능하다.

상기 방법과 동일한 방법으로, 서열의 변형을 통해 kFGF4와 p53사이에 NLS를 위치시키거나, 유비퀴틴의 C-말단의 RGG를 RGA로 변경시키거나, 유비퀴틴의 Lys 7개를 Arg으로 치환하여 총 7종의 융합단백질 발현벡터를 제조하였다.

실시예 2: 융합 단백질의 발현 및 정제

상기 실시예 1에서 제조한 벡터 pET-Ub-NLS-kFGF4-p53-p18(F71N)를 이용하여 융합 단백질을 과발현시키기 위해, 상기 벡터로 형질 전환된 E. coli BL21(DE3)에서 발현시켰다. 이때, 배양액으로 YT 배지를 사용하였으며, 흡광도 600 nm에서 O.D.값이 0.5일 때 0.5 mM의 IPTG를 넣고 18 ℃에서 16시간 동안 더 배양하였다. 상기 배양하여 얻은 세포를, 5% 글리세롤, 5 mM β-머캅토에탄올, 0.2% Triton X-100 및 0.2 M NaCl을 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 하에서 초음파로 분쇄한 후, 원심분리기(10,000 g)를 이용하여 상층액을 얻었다다. 상기 상층액을 상기 완충액으로 평형화된 Ni^{2 +}-NTA superflow 칼럼(Qiagen)에 적용하고, 컬럼 부피의 5배에 해당하는 세척 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5% 글리세롤, 5mM β- 머캅토에탄올, 0.2% Triton X-100 및 1 M NaCl)로 세척한 다음, 용출 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5% 글리세롤, 5 mM β-머캅토에탄올, 0.2% Triton X-100 및 0.2 M NaCl)으로 상기 융합 단백질을 용출하였다. 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter(Milipore)를 이용하여 분획 중에 포함된 염을 제거하고 농축하였다. 정제된 단백질 농도는 BSA를 표준 물질로 사용하여 측정하였다.

표 1에서 정제된 상기 융합 단백질과 유비퀴틴이 없는 융합 단백질(대조군)의 실험실 테스트(in vitro test) 물성을 비교한 결과를 나타내었다. 일 구체예에 따른 유비퀴틴이 있는 융합단백질은 발현량뿐만 아니라, 수용성, 정제수율, 농축 및 순도의 물성이 우수함을 확인할 수 있다.

	유비퀴틴을 포함하지 않는 융합 단백질(대조군)	유비퀴틴을 포함하는 융합 단백질
발현 정도	50 mg/ℓ	300 mg/ℓ
발현 상태	봉입체(inclusion body) 형성	수용성
정제 수율	20 mg/ℓ	200 mg/ℓ
농축	1.2 mg/㎖	14 mg/㎖
순도	80%	95%

실시예 3: 융합 단백질의 세포 투과성 및 안정성 확인

실시예 2에서 제조한 융합 단백질의 세포 투과성을 확인하기 위하여, 동물 모델을 이용하여 검증하였다.

본 실시예에서는 동물 모델로 주조직 적합 복합체(major histocompatibility complex, MHC)에 대한 돌연변이로 면역력이 결핍된 7주령의 누드마우스(Balb/c 마우스, 오리엔트바이오, 한국)를 사용하였다. 상기 마우스의 각 그룹당 3마리씩 총 4 그룹으로 나누어 실험하였다. 1 ㎍/㎕ 농도의 유비퀴틴을 포함하지 않는 융합 단백질 NLS-kFGF4-p53-p18(F71N)(그룹 2) 및 유비퀴틴을 포함하는 융합 단백질 Ub-NLS-kFGF4-p53-p18(F71N)(그룹 3)을 각각 600 ㎍씩 복강 주사(intraperitoneal injection)하였다. 대조군으로 p53-p18(F71N)의 융합 단백질(그룹 1), FITC을 포함하는 Tris 완충액(이하 "FITC"으로 표기)을 각각 600 ㎕씩 동일하게 복강 주사하였다. 이후 각각 1시간, 2시간 및 3시간 후에 상기 마우스의 간, 비장 및 폐의 세포를 얻었다. 세포를 2회 세척한 다음 0.1% 소혈청 알부민 및 0.05% 소듐 아자이드를 포함하는 PBS 완충액에서 희석된 마우스 단일클론 항-p18 항체(1:100 부피비, Thermo Scientific Pierce, 미국)로 4℃에서 1시간 동안 염색하였다. 이후, 세포를 다시 2회 세척한 다음, 0.1% 소혈청 알부민을 포함하는 PBS에 희석된 FITC-결합 이차 염소 항-마우스 면역글로불린(goat anti-mouse IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, 미국)과 세포를 4℃에서 30분 동안 반응시키고, 2회 세척한 다음, 인 비보 조직 분포를 형광현미경(fluorescence microscope, Nikon, Japan)을 이용하여 분석하였다.

도 2에서 나타난 바와 같이, 상기 동일한 조건에서 유비퀴틴을 포함하지 않는 융합 단백질에 비해 유비퀴틴을 포함하는 융합 단백질은 세포 내에서 다량 발견됨을 확인할 수 있었다. 이는 상기 제조한 유비퀴틴을 포함하는 융합 단백질이 세포 내로 투과되었음을 의미한다. 또한, 유비퀴틴을 포함하는 융합 단백질은 유비퀴틴을 포함하지 않는 융합 단백질에 비해, 3시간 경과한 시점에서도 단백질의 양이 줄어들지 않는 것으로 보아, 오랜 시간 동안 세포 내에서 안정하게 존재함을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 암세포 동물 모델을 이용한 융합 단백질의 세포 내 투과 효과 확인

실시예 2에서 제조한 융합 단백질의 세포 내 투과 효과를 확인하기 위하여 대장암 세포주(Wild-type p53-positive HCT116, 한국세포주은행)를 투여한 이종 이식 마우스 동물 모델을 대상으로 생체 내에서 상기 융합 단백질의 투여에 의한 p53-p18 단백질의 효과가 나타나는지 여부를 확인하였다.

마우스 모델은 1×10⁷개의 대장암 세포주 HCT116 세포 50 ㎕를 6주령의 자성 BALB/c 누드 마우스에 피하 주사하여 4-5주 경과 후에 암이 발생되는 마우스를 버니어 캘리퍼(vernier caliper)를 이용하여 종양 크기(너비²×길이/2)가 80 ㎜³으로 측정된 날부터 1 ㎍/㎕ 농도의 대조군(유비퀴틴을 포함하지 않는 융합 단백질)과 유비퀴틴을 포함하는 융합 단백질을 각각 200 ㎍씩 16일 동안 각 그룹당 10마리씩 정맥주사(intravenous injection) 하였다.

도 3에서 나타낸 바와 같이 유비퀴틴을 포함하는 융합 단백질은 대조군에 비해 약 46%의 암 억제 효과가 나타남을 확인할 수 있었다.

도 1은 일 실시예에 따른 융합 단백질의 세포 내 및/또는 핵 내 이송과정을 나타내는 모식도이다.

도 2는 일 실시예에 따른 융합 단백질의 세포 내 투과 효과를 보여주는 형광 현미경 사진을 나타낸다.

도 3은 일 실시예에 따른 융합 단백질에 포함된 p53-p18의 항암효과를 나타내는 그래프이다.

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Fusion protein comprising ubiquitin or ubiquitin-like protein, membrane transfer domain and biologically active molecule and uses thereof <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 1 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 2 Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 3 Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 4 Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Ile Ser Ala Ala Pro 1 5 10 15 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 5 Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro Gly Ala Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 6 Leu Ile Ile Leu Leu Pro Val Val 1 5 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 7 Ala Ile Gly Leu Leu Trp Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ser Thr Ala Ala 1 5 10 15 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 8 Leu Leu Leu Pro Ile Leu Ser Ser Ala 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 9 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 10 Leu Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ala Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 11 Leu Leu Ser Val Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 12 Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Pro Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 13 Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ala Ser Leu Leu Leu Pro Gly Ser Ala Ala 1 5 10 15 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 14 Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Val Ala Val Ala Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Ala Ala Gly 20 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane transfer domain <400> 15 Gly Gly Gln Leu Pro Leu Leu Val Val 1 5 <210> 16 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of polynucleotide encoding NLS-kFGF4-p53 polypeptide <400> 16 ttgaattcaa aaagaagaga aaggccgcgg tagcgctgct cccggcggtc ctgctggcct 60 tgctggcgcc cgaaacattt tcagacctat ggaaactact tcctgaaaac aagcttaa 118 <210> 17 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of polynucleotide encoding NLS-kFGF4-p53 polypeptide <400> 17 ttaagcttgt tttcaggaag tagtttccat aggtctgaaa atgtttcggg cgccagcaag 60 gccagcagga ccgccgggag cagcgctacc gcggcctttc tcttcttttt gaattcaa 118 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for synthesis of polynucleotide encoding human ubiquitin <400> 18 ttggatccgg tagtggaagc atgcagattt tcgtgaaa 38 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for synthesis of polynucleotide encoding human ubiquitin <400> 19 ttgaattcac cacgaagtct caacacaa 28 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for synthesis of polynucleotide encoding human p18 <400> 20 ttaagcttat ggccgagcct tgggggaacg agttgg 36 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for synthesis of polynucleotide encoding human p18 <400> 21 ttctcgagtt attgaagatt ttgtggctcc 30 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for synthesis of polynucleotide encoding human p18 site-directed mutant <400> 22 cttagaggtg ctaatcccga tttg 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for synthesis of polynucleotide encoding human p18 site-directed mutant <400> 23 gtctttcaaa tcgggattag cacc 24 <210> 24 <211> 849 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding human ubiquitin-NLS-MTD-p53-p18 polypeptide <400> 24 atgcagattt tcgtgaaaac ccttacgggg aagaccatca ccctcgaggt tgaaccctcg 60 gatacgatag aaaatgtaaa ggccaagatc caggataagg aaggaatacc tcctgatcag 120 cagagactga tctttgctgg caagcagctg gaagatggac gtactttgtc tgactacaat 180 attcaaaagg agtctactct tcatcttgtg ttgagacttc gtggtggtga attcaaaaag 240 aagagaaagg ccgcggtagc gctgctcccg gcggtcctgc tggccttgct ggcgcccgaa 300 acattttcag acctatggaa actacttcct gaaaacaagc ttatggccga gccttggggg 360 aacgagttgg cgtccgcagc tgccaggggg gacctagagc aacttactag tttgttgcaa 420 aataatgtaa acgtcaatgc acaaaatgga tttggaagga ctgcgctgca ggttatgaaa 480 cttggaaatc ccgagattgc caggagactg ctacttagag gtgctaatcc cgatttgaaa 540 gaccgaactg gtaatgctgt cattcatgat gcggccagag caggtttcct ggacacttta 600 cagactttgc tggagtttca agctgatgtt aacatcgagg ataatgaagg gaacctgccc 660 ttgcacttgg ctgccaaaga aggccacctc cgggtggtgg agttcctggt gaagcacacg 720 gccagcaatg tggggcatcg gaaccataag ggggacaccg cctgtgattt ggccaggctc 780 tatgggagga atgaggttgt tagcctgatg caggcaaacg gggctggggg agccacaaat 840 cttcaataa 849 <210> 25 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human ubiquitin-NLS-MTD-p53-p18 polypeptide <400> 25 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 50 55 60 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Glu Phe Lys Lys 65 70 75 80 Lys Arg Lys Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ala Pro Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn 100 105 110 Lys Leu Met Ala Glu Pro Trp Gly Asn Glu Leu Ala Ser Ala Ala Ala 115 120 125 Arg Gly Asp Leu Glu Gln Leu Thr Ser Leu Leu Gln Asn Asn Val Asn 130 135 140 Val Asn Ala Gln Asn Gly Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val Met Lys 145 150 155 160 Leu Gly Asn Pro Glu Ile Ala Arg Arg Leu Leu Leu Arg Gly Ala Asn 165 170 175 Pro Asp Leu Lys Asp Arg Thr Gly Asn Ala Val Ile His Asp Ala Ala 180 185 190 Arg Ala Gly Phe Leu Asp Thr Leu Gln Thr Leu Leu Glu Phe Gln Ala 195 200 205 Asp Val Asn Ile Glu Asp Asn Glu Gly Asn Leu Pro Leu His Leu Ala 210 215 220 Ala Lys Glu Gly His Leu Arg Val Val Glu Phe Leu Val Lys His Thr 225 230 235 240 Ala Ser Asn Val Gly His Arg Asn His Lys Gly Asp Thr Ala Cys Asp 245 250 255 Leu Ala Arg Leu Tyr Gly Arg Asn Glu Val Val Ser Leu Met Gln Ala 260 265 270 Asn Gly Ala Gly Gly Ala Thr Asn Leu Gln 275 280 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleus localization signal domain <400> 26 Lys Lys Lys Arg Lys 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleus localization signal domain <400> 27 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleous localization signal domain <400> 28 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15

Claims (21)

1. 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질은 야생형 또는 돌연변이형인 것인 막 투과성 융합 단백질.
3. 제2항에 있어서, 상기 유비퀴틴 돌연변이형은 유비퀴틴 야생형 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 Lys을 Arg으로 치환한 것인 막 투과성 융합 단백질.
4. 제1항에 있어서, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질은 C-말단에 프로테아제에 의해 절단 가능한 프로테아제 인식 아미노산 서열 또는 프로테아제에 의해 절단되지 않는 아미노산 서열을 포함하는 것인 막 투과성 융합 단백질.
5. 제1항에 있어서, 상기 유비퀴틴-유사 단백질은 Nedd8, SUMO-1, SUMO-2, NUB1, PIC1, UBL3, UBL5 및 ISG15로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 막 투과성 융합 단백질.
6. 제1항에 있어서, 상기 막 투과 도메인은 서열 번호 1 내지 서열 번호 15의 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 막 투과성 융합 단백질.
7. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 활성분자는 뉴로레귤린 1(neuroregulin 1), PTEN 종양억제인자(tumor suppressor), ARF 종양억제인자, APC, CD95, 폴리큘린(Folliculin), MEN1, BRCA1, Von Hippel-Lindau 종양억제인자, RKIP, nm23, 엔도스타틴, 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리트로포이에틴, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH (adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRH-II(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레 린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20 (enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 및 지코노타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 막 투과성 융합 단백질.
8. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 핵 위치신호 도메인을 더 포함하는 것인 막 투과성 융합 단백질.
9. 제8항에 있어서, 상기 핵 위치신호 도메인은 서열 번호 26의 폴리펩티드인 막 투과성 융합 단백질.
10. 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
11. 제10항에 있어서, 상기 막 투과 도메인은 서열 번호 1 내지 서열 번호 15의 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
12. 제10항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 핵 위치신호 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
13. 제12항에 있어서, 상기 핵 위치신호 도메인은 서열 번호 26의 폴리펩티드인 것인 폴리뉴클레오티드.
14. 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질의 C-말단에 연결되어 있는 막 투과 도메인 및 상기 막 투과 도메인의 C-말단에 연결되어 있는 생물학적 활성분자를 포함하는 막 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
15. 제14항에 있어서, 상기 막 투과 도메인은 서열 번호 1 내지 서열 번호 15의 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 벡터.
16. 제14항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 핵 위치신호 도메인을 더 포함하는 것인 재조합 벡터.
17. 제16항에 있어서, 상기 핵 위치신호 도메인은 서열 번호 26의 폴리펩티드인 것인 재조합 벡터.
18. 제14항의 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
19. 제1항의 막 투과성 융합 단백질을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 막 투과성 융합 단백질의 세포 내 전달 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 접촉은 인 비트로 또는 인 비보로 접촉하는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 인 비보로 접촉하는 것은 상기 막 투과성 융합 단백질을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.

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