WO2016208942A1 - Tlr5 아고니스트 단백질의 생산방법 - Google Patents

Tlr5 아고니스트 단백질의 생산방법 Download PDF

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WO2016208942A1
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protein
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tlr5 agonist
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이우종
김성건
이동목
안희경
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한국생산기술연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a TLR5 agonist protein, and more particularly, after the production through a biological process, can be easily separated and purified, furthermore, a method for producing a TLR5 agonist protein can be effectively removed fusion partner. It is about.
  • Entolimod is a radiation exposure treatment drug developed by Cleveland Biolabs with the support of the US Department of Defense.
  • 'entolimod KMRC011
  • TLR5 agonist To produce a TLR5 agonist.
  • Entholimod was derived from the flagellin protein of Salmonella enterica and was found to prevent cell death due to radiation exposure through binding and activation with TLR5 (Toll-like receptor-5). In fact, firefighters in the Chernobyl nuclear accident site exposed to monkeys about the same radiation dose as exposed to entolimod, and about 67% survived. It is reported that it stopped.
  • Entholimod consists only of the D0 domain and the D1 domain, which directly binds to TLR5, among the flagellin proteins of Salmonella enterica consisting of a total of four domains (D0, D1, D2, D3), 6-histidine for purification and cleavage 34 amino acid residues (MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPM), including the tag and enterokinase recognition sequence, are included at the amino terminus.
  • the existing entolimod needs to be removed because the 34 amino acid residues bound to the amino terminal may induce an immune response and inhibit binding with TLR5.
  • entolimod has a structure in which the internal amino acid sequence is vulnerable to a protease, when the enterokinase, a kind of protease, is treated, the structure may be destroyed.
  • Korean Patent Registration No. 10-1287905 (Registration date July 15, 2013), a method of protecting against radiation using flagellin, a pharmaceutically acceptable amount of a reagent that causes NF-kB in patients
  • a method of protecting a patient from one or more treatments that cause apoptosis comprising administering a composition comprising a composition is described.
  • Korean Patent Publication No. 10-2012-0104177 discloses a TLR5 agonist such as flagellin as a use of TLR5 and agonists for treating cancer. Methods and methods for treating infectious diseases are described.
  • the present invention is to solve the above problems, it is easy to separate and purify, by effectively removing the fusion partner used for separation and purification, thereby minimizing the possibility of inducing an immune response by the fusion partner and inhibition of binding with TLR5
  • the present invention provides a method for producing a TLR5 agonist protein.
  • the present invention provides a fusion protein characterized in that ubiquitin is bound to a TLR5 agonist protein formed by combining a polypeptide having an amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 2 and a polypeptide having an amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 4. to provide.
  • the TLR5 agonist of the present invention specifically controls the cellular damage caused by radiation exposure by specifically binding to TLR5, a cell receptor, to activate innate immunity.
  • TLR5 agonist protein In order to produce TLR5 agonist protein in a biological process using microorganisms, consideration should be given to separating and purifying the produced TLR5 agonist protein. Because of this need, Cleveland Biolabs uses a 6-histidine tag and enterokinase recognition sequence for purification and cleavage in the D0 and D1 domains that directly bind to TLR5 in the flagellin protein of Salmonella enterica. Entomod has been produced by adding 34 amino acid residues (MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPM).
  • the 34 amino acid sequences bound by the fusion partner are preferably removed because of the possibility of inducing an immune response and inhibiting the binding of TLR5.
  • the D0 and D1 domains are structurally vulnerable to protease, so the enterokinase recognition sequence In spite of this, it is used without being able to remove the fusion partner (34 amino acid sequence) by processing it.
  • the ubiquitin used as a fusion partner in the present invention is cleaved by ubiquitin cleavage enzyme (eg, USP (ubiquitin-specific protease) or UCH (ubiquitin C-terminal hydrolase)
  • ubiquitin cleavage enzymes eg, USP (ubiquitin-specific protease) or UCH (ubiquitin C-terminal hydrolase)
  • USP ubiquitin-specific protease
  • UCH ubiquitin C-terminal hydrolase
  • the present invention uses the characteristics of the ubiquitin as described above, to produce a TLR5 agonist protein (hereinafter referred to as 'improved entolimod') in which the fusion partners are neatly removed, thereby completing the present invention.
  • a TLR5 agonist protein hereinafter referred to as 'improved entolimod'
  • Ubiquitin is a protein known as an expression derivative that helps the expression of the protein of interest, and may be cleaved and removed by ubiquitin cleavage enzyme (eg, USP or UCH) during the purification process.
  • ubiquitin may use only a partial sequence in addition to the entire sequence.
  • the TLR5 agonist protein for example, a polypeptide having an amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 2 and a polypeptide having an amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 4 is linked through a linker as set forth in SEQ ID NO: 6 It may have been.
  • the polypeptides set forth in SEQ ID NO: 2 and the polypeptides set forth in SEQ ID NO: 4 are folded by their bonds to form D0 domains and D1 domains capable of directly binding to TLR5.
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 2 and the polypeptide of SEQ ID NO: 4 may be linked by a linker, and the linker may be, for example, a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the ubiquitin is preferably fused to the amino terminus of the TLR5 agonist protein.
  • the ubiquitin preferably contains an amino acid sequence cleaved by the ubiquitin cleavage enzyme, and if the ubiquitin has an amino acid sequence cleaved by the ubiquitin cleavage enzyme, It can be used in the present invention.
  • ubiquitin cleavage enzymes for example, may be USP or UCH.
  • the fusion protein of the present invention is further bound to an amino terminus of ubiquitin, but when the fusion tag is bound, there is an advantage of facilitating separation and purification.
  • the tablet tag may use various tablet tags known in the art, but as an example, a lysine tag formed by combining six histidine tags or lysines may be used.
  • the present invention is a gene encoding a ubiquitin to a gene encoding a TLR5 agonist protein formed by combining a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (A) manufacturing a vector comprising a fusion gene which is combined and is formed by binding a gene encoding a purification tag to the ubiquitin coding gene; (B) producing a fusion protein by transforming the host with the prepared vector, and expressing the fusion gene; (C) recovering the fusion protein by binding the fusion protein produced above to a column to which a purification tag fused to the fusion protein binds; And (d) recovering the TLR5 agonist protein after cleaving the site where the ubiquitin is bound by treating the fusion protein recovered by the ubiquitin cleavage enzyme. It provides a method for producing a TLR5 agonist protein comprising a.
  • a gene encoding a ubiquitin binds to a gene encoding a TLR5 agonist protein formed by combining a polypeptide having an amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 2 and a polypeptide having an amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 4. And, it is a step of preparing a vector comprising a fusion gene formed by combining a gene encoding a purification tag to the ubiquitin coding gene. Since gene binding and vector production may use techniques well known in the art, specific description thereof will be omitted.
  • the TLR5 agonist protein for example, a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 via a linker described in SEQ ID NO: 6 It may be combined.
  • the gene encoding the ubiquitin is preferably bound to the 5 'end of the gene encoding the TLR5 agonist protein, the gene encoding the purification tag is preferably 5 of the gene encoding the ubiquitin 'It is good to bind to the end.
  • the fusion gene may be, for example, having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO.
  • the ubiquitin preferably comprises an amino acid sequence cleaved by the ubiquitin cleavage enzyme, but if it contains an amino acid sequence cleaved by the ubiquitin cleavage enzyme, a part of the ubiquitin may be used.
  • the tablet tag can use a variety of tablet tags, for example, a histidine tag (His-tag) or lysine (lysine) can be used by lysine tag formed by combining six consecutive.
  • His-tag histidine tag
  • lysine lysine
  • This step is a step of producing a fusion protein by transforming the host with the vector prepared above, expressing the fusion gene.
  • the host is a host in which the vector constructed in the previous step is introduced and the gene introduced into the vector can be expressed, that is, a host in which a host-vector system is constructed genetically. Any may be used, for example, the most widely known E. coli can be used. In this case, when a vector using an inducible promoter is used, an inducer may be used for expression of the fusion protein.
  • This step is a step of recovering the fusion protein by binding the fusion protein produced above to the column to which the purification tag fused to the fusion protein binds.
  • the fusion protein produced above may be present in or secreted out of the host. In any case, a process for separating the fusion protein from intracellular / extracellular proteins or other substances is required.
  • separation and purification may be performed using a purification tag fused to a fusion protein.
  • a column (resin) to which a purification tag binds may be used to bind only a desired fusion protein, and the remaining materials may be eluted. Separate purification is possible.
  • this step is preferably unfolded (fusion) of the produced fusion protein, it is possible to recover the fusion protein by binding to the column and refolding (refolding).
  • this step may unfold the produced fusion protein, refold it, and then bind to a column to recover the fusion protein.
  • This step is a step of recovering the TLR5 agonist protein after cleaving the ubiquitin-binding site by treating the recovered fusion protein with ubiquitin cleavage enzyme.
  • the treatment of the ubiquitin cleavage enzyme may be performed, for example, in the state in which the fusion protein is bound to the column, and may also be treated after eluting the fusion protein from the column.
  • ubiquitin cleavage enzymes for example, may be USP or UCH.
  • TLR5 agonist protein after biotechnological production of TLR5 agonist protein, it can be easily isolated and purified, particularly by effectively removing the fusion partner used for separation and purification, thereby inducing an immune response by the fusion partner. And the possibility of inhibiting binding with TLR5.
  • 1 is a schematic diagram of the gene sequence of K6UbKMRC011.
  • 2 is a nucleotide sequence of the K6UbKMRC011 gene.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of the pAP-K6UbKMRC011 plasmid.
  • a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1) and a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3) include an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 After binding via a polypeptide (linker) having (encoded by SEQ ID NO: 5), when folded, it forms a D0 domain and a D1 domain capable of binding to TLR5.
  • the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 are lysine ("TLR5 agonist protein (KMRC011) coding gene" formed through the nucleic acid sequence (linker) of SEQ ID NO: 5).
  • lysine was synthesized by combining the gene encoding the lysine tag (K6) and the ubiquitin (Ub) encoding six consecutively combined fusion genes, 'K6UbKMRC011', K6Ub portion using the first polymerase chain reaction And KMRC011 portions were divided and amplified, and the entire gene of K6UbKMRC011 was synthesized by connecting the K6Ub portion and the KMRC011 portion through a secondary polymerase chain reaction (see FIG. 1).
  • the K6Ub portion was amplified using the primers K6Ub-NdeI-F and plasmid pUC18-K6Ub containing KMRC011-R2 and K6Ub genes, and the KMRC011 portion was primers KMRC011-F2 and KMRC011-BamHI-R2 and SEQ ID NOs: 1,
  • the plasmid pUC57-KMRC011 containing the genes of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5 was amplified using the template (see Table 1 below).
  • K6UbKMRC011 Nucleotide Sequences of Primers Used in Polymerase Chain Reaction for Synthesis of K6UbKMRC011 Gene number Primer name Primer sequence One K6Ub-NdeI-F aatcatatgaagaaaaaaagaaaaagcagattttcgtcaagact 2 KMRC011-R2 tgttgataacctgcgccatgccacctcttagccttagc 3 KMRC011-F2 gctaaggctaagaggtggcgcgcaggttatcaaca 4 KMRC011-BamHI-R2 attggatccttagcgcagcaggctcag
  • the entire gene of K6UbKMRC011 was synthesized by overlap-extension PCR using primers K6Ub-NdeI-F and KMRC011-BamHI-R as products of the K6Ub and KMRC011 products of the first polymerase chain reaction.
  • the nucleic acid sequences and amino acid sequences inferred from the nucleic acid sequences of the synthesized K6UbKMRC011 gene are shown in FIGS. 2 (SEQ ID NO: 7) and 3 (SEQ ID NO: 8), respectively.
  • the amplified K6UbKMRC011 gene was controlled by IPTG and inserted into the NdeI and BamHI restriction enzyme sites of the pAP (AP Technology) expression plasmid containing the tac promoter to prepare the pAP-K6UbKMRC011 plasmid (see FIG. 4). .
  • pAP-K6UbKMRC011 plasmid from Escherichia coli TG1 ( Escherichia coli TG1) and transformed into E. coli TG1 / pAP-K6UbKMRC011 expressing K6UbKMRC011 ( Escherichia coli TG1 / pAP-K6UbKMRC011) was finally produced.
  • Example 2 Production of K6UbKMRC011 using the recombinant Escherichia coli prepared in Example 1]
  • E. coli TG1 / pAP-K6UbKMRC011 was to determine the production capacity of K6UbKMRC011.
  • yeast extract 5g / L, tryptone 10g / L, sodium chloride 10g / L composition medium was used for culture.
  • 600nm absorbance of 600nm was obtained at 37 ° C and 200rpm until 200 ⁇ 1.0, and then, IPTG was added to 1 mM to induce expression at K6UbKMRC011 for 4 hours. .
  • E. coli expressing K6UbKMRC011 corrected to absorbance 15 at 600 nm was crushed using an ultrasonic crusher, and then divided into soluble and insoluble fractions under centrifugation at 12,000 rpm for 20 minutes, followed by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). The analysis confirmed the expression level and solubility of K6UbKMRC011.
  • Intracellular expression level of expressed K6UbKMRC011 was confirmed to be about 21% by densitometer analysis (see FIG. 5). Most of K6UbKMRC011 was observed in insoluble fraction, and it was found that K6UbKMRC011 expressed in E. coli was an insoluble inclusion body.
  • Example 3 Solid phase refolding method of K6UbKMRC011 produced in Example 2]
  • K6UbKMRC011 expressed in E. coli was expressed as an insoluble inclusion body, solid-phase refolding was performed to restore biological activity.
  • Buffer A pH 7.0, 50 mM Sodium phosphate, 8 M urea
  • Buffer A SP Sepharose FF GE Healthcare
  • Buffer B pH 7.0, 50 mM Sodium phosphate
  • Buffer C pH 7.0, 50 mM Sodium phosphate, 1 M NaCl
  • SDS-PAGE SDS-PAGE
  • the eluted refolded K6UbKMRC011 was found to be all in soluble form and USP1 was added to the eluted refolded K6UbKMRC011 to 10 mg / L to confirm the cleavage by ubiquitin-specific protease 1 (USP1) at 12. It was reacted for hours.
  • USP1 ubiquitin-specific protease 1
  • the enzyme used for removal should not affect the structure of the protein of interest. It is confirmed that the ubiquitin cleavage enzyme of the present invention does not affect the structure of the protein KMRC011 at all.
  • Example 4 Example 3 in solid phase Refolded From K6UbKMRC011 KMRC011 Separation and purification-on column cleavage
  • the separated purified KMRC011 was identified as AQVINTNSLS in amino-terminal sequencing, and it was confirmed that only KMRC011 cut after K6Ub of K6UbKMRC011 was correctly purified by USP1.
  • FIG. 9 is a result of cleavage analysis of K6UbKMRC011 according to the application of various ubiquitin cleavage enzymes
  • lane 1 Protein Mw size marker in FIG. K6UbKMRC011 + USP10
  • lane 6 K6UbKMRC011 + UCH-L3
  • lane 7 K6UbKMRC011 + UCH-L5 / UCH37.
  • the result of SDS-PAGE analysis the refolded K6UbKMRC011 was cleaved by the ubiquitin cleavage enzyme described in Table 2, and it was confirmed that K6Ub and KMRC011 were correctly separated. At this time, it was also confirmed that the internal structure of the KMRC011 protein was not degraded by the treatment of these enzymes.
  • K6Ub is isolated while the N-terminal amino acid sequence 'AQVI-N' of KMRC011 protein is maintained intact. It was confirmed that the fall.

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Abstract

본 발명은 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 의할 경우, TLR5 아고니스트 단백질을 생물공학적으로 생산한 후, 용이하게 분리 및 정제할 수 있는데, 특히 분리 및 정제를 위해 사용된 퓨전 파트너를 효과적으로 제거함으로써, 퓨전 파트너에 의한 면역반응 유발 및 TLR5와의 결합 저해 가능성을 최소화시킬 수 있다.

Description

TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법
본 발명은 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생물공정을 통해 생산된 후, 용이하게 분리 정제가 가능하며, 더욱이 융합 파트너가 효과적으로 제거될 수 있는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법에 관한 것이다.
엔톨리모드(entolimod)는 미 국방부의 지원을 받아 클리블랜드 바이오랩스 (Cleveland Biolabs) 사에서 개발한 방사선 피폭 치료제로서, 본 발명에서는 기 개발된 엔톨리모드를 일부 변경한 '개량형 엔톨리모드 (KMRC011)'를 TLR5 아고니스트로 생산하고자 한다.
엔톨리모드는 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica)의 플라젤린(flagellin) 단백질에서 유래하였고, TLR5(Toll-like receptor-5)와의 결합 및 활성화를 통해 방사능 노출로 인한 세포사를 막아주는 것으로 확인되었다. 실제로 체르노빌 원전 사고현장에 투입된 소방관들이 노출된 방사선량과 비슷한 정도를 원숭이에 노출시킨 후 엔톨리모드를 투여한 결과, 약 67%가 생존했으며, 물질을 투여하지 않은 원숭이의 생존율은 약 25%에 그쳤다는 보고도 있다.
엔톨리모드는 총 4개의 도메인(D0, D1, D2, D3) 구성된 살모넬라 엔테리카의 플라젤린 단백질 중 TLR5와 직접적으로 결합하는 D0 도메인 및 D1 도메인으로만 구성되어 있고, 정제 및 절단을 위한 6-히스티딘 태그 및 엔테로키나아제 인식 서열을 포함한 34개의 아미노산 잔기(MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPM)가 아미노 말단에 포함되어 있다.
그런데, 기존의 엔톨리모드는 아미노 말단에 결합된 상기 34개 아미노산 잔기에 의해 면역반응의 유발 및 TLR5와의 결합저해 가능성이 있으므로 제거될 필요가 있다.
하지만, 엔톨리모드는 내부 아미노산 서열이 프로테아제에 취약한 구조를 갖기 때문에, 프로테아제의 일종인 엔테로키나아제를 처리할 경우, 그 구조가 파괴되는 문제가 수반될 수 있다.
따라서, 새로운 개념의 엔톨리모드 및 그 생산방법이 개발되어야 할 필요가 있는 것이다.
한편, 대한민국 특허등록번호 제10-1287905호 (등록일자 2013년 07월 15일)에는, 플라젤린을 이용한 방사선으로부터의 보호방법으로, 환자에게 NF-kB를 유발하는 시약의 약학적으로 수용가능한 양을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 아폽토시스를 유발하는 하나 이상의 치료로부터 환자를 보호하는 방법이 기재되어 있다.
또한, 대한민국 특허공개번호 제10-2012-0104177호 (공개일자 2012년 09월 20일)에는, 암을 치료하기 위한 TLR5 및 효능제의 용도로서, 플라젤린과 같은 TLR5 효능제를 제공하여 암과 감염성 질병들을 치료하는 방법들과 약제에 관한 것이 기재되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 하는 것으로, 분리 및 정제가 용이하고, 분리 및 정제를 위해 사용된 퓨전 파트너를 효과적으로 제거함으로써, 퓨전 파트너에 의한 면역반응 유발 및 TLR5와의 결합 저해 가능성을 최소화시킨 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 결합되어 형성된 TLR5 아고니스트(agonist) 단백질에 유비퀴틴이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 TLR5 아고니스트는 세포의 수용체인 TLR5와 특이적으로 결합하여 세포 내 선천면역을 활성화시키는 작용을 함으로써, 방사선 피폭에 따른 세포 손상을 제어할 수 있다.
미생물을 이용한 생물공정으로 TLR5 아고니스트 단백질을 생산하기 위해서는 '생산된 TLR5 아고니스트 단백질'을 분리 정제하기 위한 고려를 해야 한다. 이와 같은 필요에 의해 클리블랜드 바이오랩스 (Cleveland Biolabs) 사에서는 살모넬라 엔테리카의 플라젤린 단백질 중 TLR5와 직접적으로 결합하는 D0 도메인 및 D1 도메인에, 정제 및 절단을 위한 6-히스티딘 태그 및 엔테로키나아제 인식 서열을 포함한 34개의 아미노산 잔기(MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPM)를 부가시켜 엔톨리모드를 생산한 바가 있다.
그런데, 융합파트너로 결합된 상기의 34개 아미노산 서열은 면역반응 유발 및 TLR5와의 결합 저해 가능성이 있기 때문에 제거되는 것이 바람직한데, D0 도메인 및 D1 도메인이 구조적으로 프로테아제에 취약한 특성이 있어 엔테로키나아제 인식 서열이 있음에도 불구하고, 이를 처리하여 상기 융합파트너(34개 아미노산 서열)를 제거하지 못한 채 사용하고 있는 실정이다.
본 발명에서는 이와 같은 문제점을 해결하고자 안출된 것으로, 본 발명에서 융합파트너로 사용한 유비퀴틴은, 유비퀴틴 절단 효소 (일 예로, USP(ubiquitin-specific protease) 또는 UCH(ubiquitin C-terminal hydrolase))에 의해 절단될 수 있는데, 유비퀴틴 절단 효소는 기질 특이성 (specificity)이 매우 높아, 단백질(엔톨리모드) 내 다른 부위는 절단하지 않고, 유비퀴틴이 결합된 부위만을 선택적으로 자를 수 있는 장점이 있다. 본 발명은 상기와 같은 유비퀴틴의 특성을 이용하여, 융합파트너들이 깔끔히 제거된 TLR5 아고니스트(agonist) 단백질 (이하, '개량형 엔톨리모드'라고도 함)을 생산하고, 본 발명을 완성한 것이다.
유비퀴틴은 목적단백질의 발현을 도와주는 발현유도체로 알려져 있는 단백질인데, 정제공정 중 유비퀴틴 절단효소(일 예로, USP 또는 UCH)에 의하여 절단되어 제거될 수 있다. 본 발명에서 유비퀴틴은 전체 시퀀스 외에 일부 시퀀스만을 사용할 수도 있다.
본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 TLR5 아고니스트 단백질은 일 예로 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 폴리펩타이드와 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 서열번호 6에 기재된 링커를 매개로 하여 결합된 것일 수 있다. 서열번호 2에 기재된 폴리펩타이드 및 서열번호 4에 기재된 폴리펩타이드는 그 결합에 의해 접힘으로써, TLR5와 직접적으로 결합할 수 있는 D0 도메인 및 D1 도메인이 형성된다. 이때, 서열번호 2에 기재된 폴리펩타이드와 서열번호 4에 기재된 폴리펩타이드는 링커에 의해 결합될 수 있는데, 그 링커는 일 예로 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열의 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 유비퀴틴은 바람직하게 TLR5 아고니스트 단백질의 아미노 말단에 융합되어 있는 것이 좋다.
본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 유비퀴틴은, 바람직하게 유비퀴틴 절단 효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 포함하고 있는 것이 좋고, 유비퀴틴 절단 효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 가지고 있다면, 유비퀴틴 전체가 아닌 일부라 하더라도 본 발명에서 사용할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 유비퀴틴 절단 효소는 다양한 것들이 있는데, 일 예로 USP 또는 UCH일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 융합 단백질은, 바람직하게 유비퀴틴의 아미노 말단에 정제용 태그가 더 결합되어 있는 것이 좋은데, 정제용 태그가 결합되어 있을 경우, 분리 정제를 용이하게 할 수 있는 장점이 있다. 이때, 상기 정제용 태그는 당업계에 알려진 다양한 정제용 태그를 사용할 수 있으나, 일 예로는 히스티딘 태그 (His-tag) 도는 라이신(lysine)이 6개 연속적으로 결합하여 형성된 라이신 태그를 사용할 수 있다.
한편, 본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 결합되어 형성된 TLR5 아고니스트(agonist) 단백질을 암호화하는 유전자에, 유비퀴틴을 암호화하는 유전자가 결합되어 있고, 상기 유비퀴틴 암호화 유전자에 정제용 태그를 암호화하는 유전자가 결합되어 형성된 융합 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계 (a); 상기에서 제조한 벡터로 호스트를 형질전환시킨 후, 상기 융합 유전자를 발현시켜 융합 단백질을 생산하는 단계 (b); 상기 융합 단백질에 융합되어 있는 정제용 태그가 결합하는 컬럼에, 상기에서 생산된 융합 단백질을 결합시켜 융합 단백질을 회수하는 단계 (c); 및 상기에서 회수한 융합 단백질에 유비퀴틴 절단 효소를 처리하여 유비퀴틴이 결합한 부위를 절단한 후, TLR5 아고니스트(agonist) 단백질을 회수하는 단계 (d); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법을 제공한다. 이하, 하기에서는 상기 각 단계를 세분화하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다.
<단계 (a): 융합 유전자를 포함하는 벡터의 제조>
본 단계는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 결합되어 형성된 TLR5 아고니스트(agonist) 단백질을 암호화하는 유전자에, 유비퀴틴을 암호화하는 유전자가 결합되어 있고, 상기 유비퀴틴 암호화 유전자에 정제용 태그를 암호화하는 유전자가 결합되어 형성된 융합 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계이다. 유전자의 결합 및 벡터 제조 등은 당업계에 널리 알려진 기술을 이용할 수 있으므로, 이에 관한 구체적인 기재는 생략하기로 한다.
본 단계에 있어서, 상기 TLR5 아고니스트(agonist) 단백질은, 일 예로 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 폴리펩타이드와 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 서열번호 6에 기재된 링커를 매개로 하여 결합된 것일 수 있다.
본 단계에 있어서, 상기 유비퀴틴을 암호화하는 유전자는 바람직하게 TLR5 아고니스트 단백질을 암호화하는 유전자의 5' 말단에 결합하고, 상기 정제용 태그를 암호화하는 유전자는, 바람직하게 상기 유비퀴틴을 암호화하는 유전자의 5' 말단에 결합하는 것이 좋다.
본 단계에 있어서, 상기 융합 유전자는 일 예로, 서열번호 7의 핵산 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 단계에 있어서, 상기 유비퀴틴은 바람직하게 유비퀴틴 절단효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 포함하고 있는 것이 좋은데, 유비퀴틴 절단효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 포함하고 있는 것이라면, 유비퀴틴의 일부분도 사용 가능하다.
본 단계에 있어서, 상기 정제용 태그는 다양한 정제용 태그를 사용할 수 있고, 일 예로는 히스티딘 태그 (His-tag) 또는 라이신(lysine)이 6개 연속적으로 결합하여 형성된 라이신 태그를 사용할 수 있다.
<단계 (b): 융합 단백질의 생산>
본 단계는 상기에서 제조한 벡터로 호스트를 형질전환시킨 후, 상기 융합 유전자를 발현시켜 융합 단백질을 생산하는 단계이다.
본 단계에 있어서, 상기 호스트는 전 단계에서 구축한 벡터가 도입되어 벡터 내부에 도입된 유전자가 발현될 수 있는 호스트, 즉 유전공학적으로 호스트-벡터 시스템(host-vector system)이 구축되어 있는 호스트라면 어느 것이나 사용할 수 있는데, 일 예로는 가장 널리 알려진 대장균을 사용할 수 있다. 이때, 유도 프로모터 (inducible promoter)를 사용하는 벡터를 이용할 경우, 융합 단백질의 발현을 위해 유도물질을 사용할 수도 있다.
<단계 (c): 융합 단백질의 회수>
본 단계는 융합 단백질에 융합되어 있는 정제용 태그가 결합하는 컬럼에, 상기에서 생산된 융합 단백질을 결합시켜 융합 단백질을 회수하는 단계이다.
상기에서 생산된 융합 단백질은 호스트 내에 존재하거나 호스트 외부로 분비될 수 있는데, 어느 경우라 하더라도 융합 단백질을 세포 내/외 단백질 또는 기타의 물질들로부터 분리하는 공정이 요구된다.
본 단계에서는 융합 단백질에 융합되어 있는 정제용 태그를 이용하여 분리 정제를 수행할 수 있는데, 정제용 태그가 결합하는 컬럼(레진)을 사용하여 목적으로 하는 융합 단백질만 결합시키고, 나머지 물질들은 용출시켜 분리 정제가 가능한 것이다.
한편, 본 단계는 바람직하게 생산된 융합 단백질을 언폴딩(unfolding)한 후, 컬럼에 결합시켜 재접힘(refolding)함으로써 융합 단백질을 회수할 수 있다. 또한, 본 단계는 생산된 융합 단백질을 언폴딩하고, 재접힘한 후, 컬럼에 결합시켜 융합 단백질을 회수할 수 있다.
생산된 융합 단백질이 내포체 형태 (inclusion body)로 발현되는 경우, 이 형태로는 생물학적 활성을 기대하기 힘들기 때문에, 고유의 형태(form)로 되돌리기 위한 공정이 요구되는데, 이것을 언폴딩 및 재접힘 과정이라 한다. 언폴딩 및 재접힘 과정은 공지의 기술을 사용하여 수행 가능하기 때문에 이에 관한 구체적 기재는 생략하기로 한다.
<단계 (d): TLR5 아고니스트 단백질의 회수>
본 단계는 상기에서 회수한 융합 단백질에 유비퀴틴 절단효소를 처리하여 유비퀴틴이 결합한 부위를 절단한 후, TLR5 아고니스트 단백질을 회수하는 단계이다.
면역반응 유발 및 TLR5와의 결합 저해 가능성을 최소화시키기 위해서는 융합 단백질에 결합한 융합 파트너를 제거해야 하는데, 본 단계에서는 유비퀴틴 절단효소를 사용하여 융합 파트너를 제거하는 것이다.
본 단계에 있어서, 상기 유비퀴틴 절단효소의 처리는 일 예로 융합 단백질을 컬럼에 결합시킨 상태에서 처리할 수 있고, 또한, 융합 단백질을 컬럼으로부터 용리(elution)시킨 후, 처리할 수도 있다.
본 단계에 있어서, 상기 유비퀴틴 절단 효소는 다양한 것들이 있는데, 일 예로 USP 또는 UCH일 수 있다.
본 발명에 의할 경우, TLR5 아고니스트 단백질을 생물공학적으로 생산한 후, 용이하게 분리 및 정제할 수 있는데, 특히 분리 및 정제를 위해 사용된 퓨전 파트너를 효과적으로 제거함으로써, 퓨전 파트너에 의한 면역반응 유발 및 TLR5와의 결합 저해 가능성을 최소화시킬 수 있다.
도 1은 K6UbKMRC011의 유전자 배열 모식도이다.
도 2는 K6UbKMRC011 유전자의 염기서열이다.
도 3은 K6UbKMRC011의 아미노산 서열이다.
도 4는 pAP-K6UbKMRC011 플라스미드 모식도이다.
도 5는 대장균에서 발현된 K6UbKMRC011의 발현 수준 및 용해도 분석 결과이다.
도 6은 고체상 재접힘된 K6UbKMRC011의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 7은 고체상 재접힘된 K6UbKMRC011의 USP1에 의한 절단 분석 결과이다.
도 8은 컬럼상(on column) 절단을 통한 TLR5 아고니스트 단백질의 분리 및 정제 결과이다.
도 9는 다양한 유비퀴틴 절단 효소 적용에 따른 K6UbKMRC011의 절단 분석 결과이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: K6UbKMRC011 발현 대장균의 제작]
(1) K6UbKMRC011의 유전자 합성
서열번호 2의 아미노산 서열 (서열번호 1의 핵산 서열에 의해 암호화)을 갖는 폴리펩타이드와 서열번호 4의 아미노산 서열 (서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화)을 갖는 폴리펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열(서열번호 5에 의해 암호화)을 갖는 폴리펩타이드(링커)를 매개로 하여 결합된 후, 접히게 되면 TLR5에 결합할 수 있는 D0 도메인 및 D1 도메인을 형성하게 된다.
본 실시예에서는 서열번호 1에 기재된 핵산서열 및 서열번호 3에 기재된 핵산서열이 서열번호 5에 기재된 핵산서열 (링커)을 매개로 하여 형성된 소위 'TLR5 아고니스트 단백질(KMRC011) 암호화 유전자'에 라이신(lysine) 6개가 연속적으로 결합된 라이신 태그(K6)를 암호화하는 유전자 및 유비퀴틴(Ub)을 암호화하는 유전자를 결합시켜 융합 유전자, 'K6UbKMRC011'를 합성하고자 하였는데, 1차 중합효소연쇄반응을 이용해 K6Ub 부분과 KMRC011 부분을 나누어 증폭하고, 2차 중합효소연쇄반응을 통해 K6Ub 부분과 KMRC011 부분을 연결하여 K6UbKMRC011의 전체 유전자를 합성하였다 (도 1 참조 요망).
K6Ub 부분은 프라이머 K6Ub-NdeI-F 및 KMRC011-R2와 K6Ub 유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pUC18-K6Ub을 주형으로 이용하여 증폭하였고, KMRC011 부분은 프라이머 KMRC011-F2 및 KMRC011-BamHI-R2와 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pUC57-KMRC011를 주형으로 이용하여 증폭하였다 (하기 표 1 참조 요망).
K6UbKMRC011 유전자 합성을 위해 중합효소연쇄반응에서 사용된 프라이머의 염기서열
번호 프라이머 이름 프라이머 서열
1 K6Ub-NdeI-F aatcatatgaagaaaaaaaagaaaaagcagattttcgtcaagact
2 KMRC011-R2 tgttgataacctgcgccatgccacctcttagccttagc
3 KMRC011-F2 gctaaggctaagaggtggcgcgcaggttatcaaca
4 KMRC011-BamHI-R2 attggatccttagcgcagcaggctcag
K6UbKMRC011의 전체 유전자는 프라이머 K6Ub-NdeI-F 및 KMRC011-BamHI-R와 1차 중합효소연쇄반응의 K6Ub 및 KMRC011 산물들을 주형으로 하여 오버랩-익스텐션(overlap-extension) PCR을 통해 합성하였다. 합성된 K6UbKMRC011 유전자의 핵산 서열 및 핵산 서열로부터 유추된 아미노산 서열은 각각 하기 도 2 (서열번호 7)와 도 3 (서열번호 8)에 나타내었다.
(2) K6UbKMRC011 발현 플라스미드의 제작
증폭된 K6UbKMRC011 유전자는 IPTG에 의해 발현 조절이 되고 tac 프로모터를 함유하고 있는 pAP(AP Technology 사 보유) 발현 플라스미드의 NdeI과 BamHI 제한효소 자리에 삽입하여 pAP-K6UbKMRC011 플라스미드를 제작하였다(도 4 참조 요망).
(3) K6UbKMRC011의 발현 대장균 제작
pAP-K6UbKMRC011 플라스미드를 대장균 TG1 (Escherichia coli TG1)에 형질전환하여 K6UbKMRC011을 발현하는 대장균 TG1/pAP-K6UbKMRC011 (Escherichia coli TG1/pAP-K6UbKMRC011) 최종적으로 제작하였다.
[실시예 2: 실시예 1에서 제작한 재조합 대장균을 이용한 K6UbKMRC011의 생산]
상기 실시예에서 제작한 대장균 TG1/pAP-K6UbKMRC011을 이용하여 K6UbKMRC011의 생산능을 확인하고자 하였다. 배양을 위해 효모추출물 5g/L, 트립톤 10g/L, 염화나트륨 10g/L 조성의 배지를 이용하였다. 500mL 배플드 플라스크 (baffled flask)를 이용하여, 37℃, 200rpm에서 600nm의 흡광도가 0.5~1.0이 될 때까지 배양한 후 IPTG를 1 mM이 되도록 첨가하여 K6UbKMRC011에서 발현을 유도 후 4시간 동안 배양하였다.
600nm의 흡광도 15로 보정된 상기 K6UbKMRC011이 발현된 대장균을 초음파 파쇄기를 이용하여 파쇄시킨 후 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 조건에서 가용성 및 비가용성 분획으로 나눈 후 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 분석을 통해 K6UbKMRC011의 발현수준 및 가용성을 확인하였다.
발현된 K6UbKMRC011의 세포 내 발현 수준은 덴시토미터(densitometer) 분석을 통해 약 21%로 확인되었다(도 5 참조 요망). K6UbKMRC011는 대부분 불용성 분획에서 관찰되어 대장균에서 발현된 K6UbKMRC011는 불용성 내포체임을 알 수 있었다.
[실시예 3: 실시예 2에서 생산한 K6UbKMRC011의 고체상 재접힘 방법]
대장균에서 발현된 K6UbKMRC011는 불용성 내포체로 발현되었으므로 생물학적 활성 회복을 위해 고체상 재접힘(solid-phase refolding)을 수행하였다. 초음파 파쇄기로 파쇄된 대장균을 원심분리 (12,000 rpm, 20 분) 후 얻어진 K6UbKMRC011의 내포체를 완충액 A (pH 7.0, 50 mM Sodium phosphate, 8 M urea)로 가용화시킨 후 완충액 A로 평형화된 양이온 교환수지 SP Sepharose FF (GE Healthcare)이 충진된 컬럼에 주입하여 가용화된 K6UbKMRC011가 정전기적인력에 의해 양이온 교환수지에 결합되도록 하였다. 완충액 B (pH 7.0, 50 mM Sodium phosphate)를 위 컬럼에 주입하여 요소(urea)를 제거함으로서 양이온 교환수지에 결합된 K6UbKMRC011의 재접힘을 유도하였다. 완충액 C (pH 7.0, 50 mM Sodium phosphate, 1 M NaCl)를 위 컬럼에 주입하여 재접힘 K6UbKMRC011이 양이온 교환수지로부터 용출될 수 있도록 하였고 각 분획들을 SDS-PAGE로 분석하였다(도 6 참조 요망).
용출된 재접힘 K6UbKMRC011은 모두 가용성 형태인 것으로 확인되었고, USP1(ubiquitin-specific protease 1)에 의한 절단 유무를 확인하기 위해 USP1을 10 mg/L이 되도록 용출된 재접힘 K6UbKMRC011에 첨가하여 37℃에서 12시간 동안 반응시켜 보았다.
SDS-PAGE로 분석 결과, 대부분의 재접힘된 K6UbKMRC011은 USP1에 의해 절단되어 K6Ub와 KMRC011로 분리되는 것을 확인하였다(도 7 참조 요망). 이때, USP1 처리에 의해 KMRC011 단백질의 내부 구조가 분해되지 않음을 확인할 수도 있었다.
또한, 분리된 KMRC011 단백질의 N-말단 서열을 'N-말단 시퀀싱'을 통해 확인한 결과, KMRC011 단백질의 N-말단 아미노산 서열 'A-Q-V-I-N'이 온전히 유지된 채로 K6Ub가 분리되어 떨어짐을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터, 유비퀴틴 절단 효소인 USP1의 처리에 의해, 본 발명 KMRC011 단백질이 분해되지 않고, 더욱이 N-말단이 온전히 유지된 채로, K6Ub가 분리됨을 확인할 수 있었다.
목적단백질로부터 융합파트너를 제거할 경우에는 제거에 사용된 효소가 목적단백질의 구조에 영향을 미치지 않아야 하는데, 본 발명의 유비퀴틴 절단 효소는 목적단백질인 KMRC011의 구조에 전혀 영향을 미치지 않음을 확인한 것이다.
[ 실시예 4: 실시예 3에서 고체상 재접힘된 K6UbKMRC011에서 KMRC011을 분리 정제하는 방법 - on column cleavage]
고체상 재접힘된 K6UbKMRC011을 용출하지 않고 양이온 교환수지에 정전기적 결합이 된 상태에서 USP1 용액 (10 mg/L)을 순환시킴으로서 KMRC011만 분리 및 정제하고자 하였다(도 8 참조 요망).
분리 정제된 KMRC011는 아미노말단 서열 분석에서 AQVINTNSLS로 확인되어 USP1에 의해 정확하게 K6UbKMRC011의 K6Ub 다음이 절단된 KMRC011만 분리 정제된 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 5: 다양한 유비퀴틴 분해효소 적용에 따른 K6UbKMRC011의 절단 분석 결과]
본 실시예에서는 상기 실시예 3에 기재된 USP1 외에 다양한 종류의 유비퀴틴 절단 효소를 K6UbKMRC011에 적용하여 목적단백질인 KMRC011이 온전하게 K6Ub로부터 분리되는지를 확인하고자 하였다.
실시예 3을 통해 수득된 가용성 형태의 재접힘 K6UbKMRC011에, 하기 표 2에 기재된 다양한 유비퀴틴 절단효소를 10 mg/L이 되도록 첨가하여 37℃에서 12시간 동안 반응시켜 보았다.
제품명 제조사 Catalog No. Lot No. 효소 일반명칭
UBP (주)에이피테크놀로지 - P3S021-04 USP1
Recombinant Human USP2 Catalytic Domain Boston Biochem, Inc. E-504 09341414A USP2
Recombinant Human His6 USP10 Boston Biochem, Inc. E-592 28570115A USP10
UCH-L3, human recombinant Boston Biochem, Inc. E-325 34709013 UCH-L3
Recombinant Human UCH-L5/UCH37 Boston Biochem, Inc. E-327 25967314A UCH-L5/UCH37
실험 결과는 도 9와 같이 나타났다. 도 9는 다양한 유비퀴틴 절단 효소 적용에 따른 K6UbKMRC011의 절단 분석 결과인데, 도 9에서 lane 1: Protein Mw size marker, lane 2: K6UbKMRC011, lane 3: K6UbKMRC011 + USP1, lane 4: K6UbKMRC011 + USP2, lane 5: K6UbKMRC011 + USP10, lane 6: K6UbKMRC011 + UCH-L3, lane 7: K6UbKMRC011 + UCH-L5/UCH37 이다.
SDS-PAGE 분석 결과인 도 9에서 보는 바와 같이, 재접힘된 K6UbKMRC011은 표 2에 기재된 유비퀴틴 절단 효소에 의해 절단되어 K6Ub와 KMRC011로 정확히 분리되는 것을 확인할 수 있었다. 이때, 이들 효소의 처리에 의해 KMRC011 단백질의 내부 구조가 분해되지 않는 것도 확인할 수도 있었다.
또한, 분리된 KMRC011 단백질의 N-말단 서열을 'N-말단 시퀀싱'을 통해 확인한 결과, 실시예 3과 마찬가지로, KMRC011 단백질의 N-말단 아미노산 서열 'A-Q-V-I-N'이 온전히 유지된 채로 K6Ub가 분리되어 떨어짐을 확인할 수 있었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 실험에 사용한 모든 유비퀴틴 절단 효소가 K6UbKMRC011의 K6Ub 다음을 정확하게 절단함을 확인할 수 있었으므로, 실시예 3의 USP1 뿐만 아니라 USP 계열 및 UCH 계열의 유비퀴틴 절단 효소도 K6UbKMRC011의 K6Ub 다음을 정확하게 절단하여 KMRC011을 손상하지 않고 분리해 낼 수 있는 것으로 확인하였다.
또한, 이상의 다양한 실험 결과로부터, 모든 계열의 유비퀴틴 절단 효소가 K6UbKMRC011의 K6Ub 다음을 정확하게 절단하여 KMRC011을 손상하지 않고 분리해 낼 수 있는 것으로 결론 내릴 수 있었다.

Claims (21)

  1. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 결합되어 형성된 TLR5 아고니스트(agonist) 단백질에 유비퀴틴이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TLR5 아고니스트(agonist) 단백질은,
    서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 폴리펩타이드와 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 서열번호 6에 기재된 링커를 매개로 하여 결합된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유비퀴틴은,
    TLR5 아고니스트(agonist) 단백질의 아미노 말단에 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유비퀴틴은,
    유비퀴틴 절단 효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유비퀴틴은,
    유비퀴틴의 일부분이되, 유비퀴틴 절단 효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 유비퀴틴 절단 효소는,
    USP 또는 UCH인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은,
    유비퀴틴의 아미노 말단에 정제용 태그가 더 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 정제용 태그는,
    히스티딘 태그 (His-tag) 또는 라이신(lysine)이 6개 연속적으로 결합하여 형성된 라이신 태그인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 결합되어 형성된 TLR5 아고니스트(agonist) 단백질을 암호화하는 유전자에, 유비퀴틴을 암호화하는 유전자가 결합되어 있고, 상기 유비퀴틴 암호화 유전자에 정제용 태그를 암호화하는 유전자가 결합되어 형성된 융합 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계 (a);
    상기에서 제조한 벡터로 호스트를 형질전환시킨 후, 상기 융합 유전자를 발현시켜 융합 단백질을 생산하는 단계 (b);
    상기 융합 단백질에 융합되어 있는 정제용 태그가 결합하는 컬럼에, 상기에서 생산된 융합 단백질을 결합시켜 융합 단백질을 회수하는 단계 (c); 및
    상기에서 회수한 융합 단백질에 유비퀴틴 절단 효소를 처리하여 유비퀴틴이 결합한 부위를 절단한 후, TLR5 아고니스트(agonist) 단백질을 회수하는 단계 (d); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 TLR5 아고니스트(agonist) 단백질은,
    서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 폴리펩타이드와 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 서열번호 6에 기재된 링커를 매개로 하여 결합된 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 유비퀴틴을 암호화하는 유전자는, TLR5 아고니스트(agonist) 단백질을 암호화하는 유전자의 5' 말단에 결합하고,
    상기 정제용 태그를 암호화하는 유전자는, 상기 유비퀴틴을 암호화하는 유전자의 5' 말단에 결합하는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 호스트는,
    대장균인 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 단계 (d)의 유비퀴틴 절단 효소의 처리는,
    융합 단백질을 컬럼에 결합시킨 상태에서 처리하는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 단계 (d)의 유비퀴틴 절단 효소의 처리는,
    융합 단백질을 컬럼으로부터 용리(elution)시킨 후, 처리하는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 융합 유전자는,
    서열번호 7의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
  16. 제9항에 있어서,
    상기 유비퀴틴은,
    유비퀴틴 절단효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
  17. 제9항에 있어서,
    상기 유비퀴틴은,
    유비퀴틴의 일부분이되, 유비퀴틴 절단효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
  18. 제9항에 있어서,
    상기 정제 태그는,
    히스티딘 태그 (His-tag) 또는 라이신(lysine)이 6개 연속적으로 결합한 라이신 태그인 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
  19. 제9항에 있어서,
    상기 단계 (c)는,
    생산된 융합 단백질을 언폴딩(unfolding)한 후, 컬럼에 결합시켜 재접힘(refolding)함으로써 융합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
  20. 제9항에 있어서,
    상기 단계 (c)는,
    생산된 융합 단백질을 언폴딩(unfolding)하고, 재접힘(refolding)한 후, 컬럼에 결합시켜 융합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
  21. 제9항에 있어서,
    상기 유비퀴틴 절단 효소는,
    USP 또는 UCH인 것을 특징으로 하는 TLR5 아고니스트 단백질의 생산방법.
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