JP2018513108A - Tlr5アゴニストタンパク質の生産方法 - Google Patents
Tlr5アゴニストタンパク質の生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018513108A JP2018513108A JP2017542423A JP2017542423A JP2018513108A JP 2018513108 A JP2018513108 A JP 2018513108A JP 2017542423 A JP2017542423 A JP 2017542423A JP 2017542423 A JP2017542423 A JP 2017542423A JP 2018513108 A JP2018513108 A JP 2018513108A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ubiquitin
- fusion protein
- tlr5 agonist
- acid sequence
- producing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 60
- 239000000556 agonist Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 101000669460 Homo sapiens Toll-like receptor 5 Proteins 0.000 title claims abstract 24
- 102100039357 Toll-like receptor 5 Human genes 0.000 title claims abstract 24
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 24
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 59
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 59
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 52
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 52
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 37
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 34
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 23
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 15
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 abstract description 2
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 abstract 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract 1
- 102000008234 Toll-like receptor 5 Human genes 0.000 description 36
- 108010060812 Toll-like receptor 5 Proteins 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 108700010160 KMRC011 Proteins 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 8
- 102000018390 Ubiquitin-Specific Proteases Human genes 0.000 description 6
- 108010066496 Ubiquitin-Specific Proteases Proteins 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 5
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 4
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 206010073306 Exposure to radiation Diseases 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 108010079458 CBLB502 Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000809243 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000939517 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000748141 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 32 Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010005656 Ubiquitin Thiolesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000005918 Ubiquitin Thiolesterase Human genes 0.000 description 1
- 102100038426 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 10 Human genes 0.000 description 1
- 102100029643 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 2 Human genes 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229950009493 entolimod Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical class [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
- G01N33/538—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by sorbent column, particles or resin strip, i.e. sorbent materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本発明は、TLR5アゴニストタンパク質の生産方法に関し、本発明による場合、TLR5アゴニストタンパク質を生物工学的に生産した後、容易に分離及び精製することができる。特に、分離及び精製のために用いられた融合パートナーを効果的に除去することで、融合パートナーによる免疫反応誘発及びTLR5との結合阻害可能性を最小化させることができる。
Description
本発明は、TLR5アゴニストタンパク質の生産方法に関し、さらに詳細には、生物工程を通して生産された後、容易に分離精製が可能であり、さらに融合パートナーが効果的に除去され得るTLR5アゴニストタンパク質の生産方法に関する。
エントリモド(entolimod)は、アメリカ国防総省の支援を受けてクリーブランド・バイオラボ(Cleveland Biolabs)で開発された放射線被ばく治療剤である。本発明においては、既に開発されたエントリモドを一部変更した「改良型エントリモド(KMRC011)」をTLR5アゴニストとして生産しようとするものである。
エントリモドは、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)のフラジェリン(flagellin)タンパク質に由来し、TLR5(Toll−like receptor−5)との結合及び活性化を通して放射能暴露による細胞死を止めることが確認されている。実際、チェルノブイリ原子力発電所事故現場に投入された消防士がさらされた放射線量と近似した程度をサルにさらした後、エントリモドを投与した結果、約67%が生存し、物質を投与していないサルの生存率は、約25%に留まったという報告もある。
エントリモドは、計4個のドメイン(D0、D1、D2、D3)で構成されたサルモネラ・エンテリカのフラジェリンタンパク質のうち、TLR5と直接的に結合するD0ドメイン及びD1ドメインのみから構成されており、精製及び切断のための6−ヒスチジンタグ及びエンテロキナーゼ認識配列を含む34個のアミノ酸残基(MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPM)がアミノ末端に含まれている。
ところが、既存のエントリモドは、アミノ末端に結合された前記34個のアミノ酸残基により免疫反応の誘発及びTLR5との結合阻害可能性があるので、除去される必要がある。
しかし、エントリモドは、内部アミノ酸配列がプロテアーゼに脆弱な構造を有するため、プロテアーゼの一種であるエンテロキナーゼを処理する場合、その構造が破壊される問題が伴い得る。
従って、新たな概念のエントリモド及びその生産方法が開発される必要がある。
従って、新たな概念のエントリモド及びその生産方法が開発される必要がある。
一方、大韓民国特許登録番号第10−1287905号(登録日:2013年07月15日)には、フラジェリンを用いた放射線からの保護方法であって、患者にNF−kBを誘発する試薬の薬学的に受容可能な量を含有する組成物を投与することを含む、アポトーシスを誘発する一つ以上の治療から患者を保護する方法が記載されている。
また、大韓民国特許公開番号第10−2012−0104177号(公開日:2012年09月20日)には、ガンを治療するためのTLR5及び効能剤の用途であって、フラジェリンのようなTLR5効能剤を提供し、ガンと感染性疾患を治療する方法と薬剤に関するものが記載されている。
本発明は、前記のような問題点を解決しようとするものであって、分離及び精製が容易であり、分離及び精製のために用いられた融合パートナーを効果的に除去することで、融合パートナーによる免疫反応誘発及びTLR5との結合阻害可能性を最小化させたTLR5アゴニストタンパク質の生産方法を提供しようとする。
本発明は、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたTLR5アゴニスト(agonist)タンパク質にユビキチンが結合されていることを特徴とする融合タンパク質を提供する。
本発明のTLR5アゴニストは、細胞の受容体であるTLR5と特異的に結合して細胞内先天免疫を活性化させる作用をすることで、放射線被ばくによる細胞損傷を制御することができる。
微生物を用いた生物工程でTLR5アゴニストタンパク質を生産するためには、「生産されたTLR5アゴニストタンパク質」を分離精製するための考慮をしなければならない。このような必要によりクリーブランド・バイオラボ(Cleveland Biolabs)では、サルモネラ・エンテリカのフラジェリンタンパク質のうち、TLR5と直接的に結合するD0ドメイン及びD1ドメインに、精製及び切断のための6−ヒスチジンタグ及びエンテロキナーゼ認識配列を含む34個のアミノ酸残基(MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPM)を付加させてエントリモドを生産したことがある。
ところが、融合パートナーで結合された前記34個のアミノ酸配列は、免疫反応誘発及びTLR5との結合阻害可能性があるため、除去されることが好ましいが、D0ドメイン及びD1ドメインが構造的にプロテアーゼに脆弱な特性があり、エンテロキナーゼ認識配列があるにもかかわらず、これを処理して前記融合パートナー(34個のアミノ酸配列)を除去できていないまま用いているのが実情である。
本発明においては、このような問題点を解決しようと案出されたものであって、本発明において融合パートナーとして用いたユビキチンは、ユビキチン切断酵素(一例として、USP(ubiquitin−specific protease)またはUCH(ubiquitin C−terminal hydrolase))により切断され得るが、ユビキチン切断酵素は、基質特異性(specificity)が非常に高く、タンパク質(エントリモド)内の他の部位は切断せず、ユビキチンが結合された部位だけを選択的に切断できる長所がある。本発明は、前記のようなユビキチンの特性を利用して、融合パートナーがきれいに除去されたTLR5アゴニスト(agonist)タンパク質(以下、「改良型エントリモド」ともいう)を生産し、本発明を完成したものである。
ユビキチンは、目的タンパク質の発現を助ける発現誘導体として知られているタンパク質であり、精製工程中、ユビキチン切断酵素(一例として、USPまたはUCH)により切断されて除去され得る。本発明において、ユビキチンは、全体シーケンスの他に一部のシーケンスだけを用いることもできる。
本発明の融合タンパク質において、前記TLR5アゴニストタンパク質は、一例として、配列番号2に記載のアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが配列番号6に記載のリンカーを媒介として結合されたものであってよい。配列番号2に記載のポリペプチド及び配列番号4に記載のポリペプチドは、その結合により折りたたまれることで、TLR5と直接的に結合できるD0ドメイン及びD1ドメインが形成される。このとき、配列番号2に記載のポリペプチドと配列番号4に記載のポリペプチドとは、リンカーにより結合され得るが、そのリンカーは、一例として、配列番号6に記載のアミノ酸配列のポリペプチドであってよい。
本発明の融合タンパク質において、前記ユビキチンは、好ましくは、TLR5アゴニストタンパク質のアミノ末端に結合されていることが良い。
本発明の融合タンパク質において、前記ユビキチンは、好ましくは、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることが良い。ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を有していれば、ユビキチン全体ではなく、一部であるとしても本発明において用いることができる。
本発明の融合タンパク質において、前記ユビキチン切断酵素は、様々なものがあるが、一例として、USPまたはUCHであってよい。
本発明の融合タンパク質において、前記融合タンパク質は、好ましくは、ユビキチンのアミノ末端に精製用タグがさらに結合されていることが良いが、精製用タグが結合されている場合、分離精製を容易にできる長所がある。このとき、前記精製用タグは、当業界に知られている様々な精製用タグを用いることができるが、一例としては、ヒスチジンタグ(His−tag)またはリシン(lysine)が6個連続的に結合して形成されたリシンタグを用いることができる。
一方、本発明は、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたTLR5アゴニスト(agonist)タンパク質を暗号化する遺伝子に、ユビキチンを暗号化する遺伝子が結合されており、前記ユビキチン暗号化遺伝子に精製用タグを暗号化する遺伝子が結合されて形成された融合遺伝子を含むベクターを製造するステップ(a);前記製造したベクターでホストを形質転換した後、前記融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を生産するステップ(b);前記融合タンパク質に融合されている精製用タグが結合するカラムに、前記で生産された融合タンパク質を結合させて融合タンパク質を回収するステップ(c);及び、前記回収した融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理してユビキチンが結合した部位を切断した後、TLR5アゴニスト(agonist)タンパク質を回収するステップ(d);を含むことを特徴とするTLR5アゴニストタンパク質の生産方法を提供する。以下、下記においては、前記各ステップを細分化してさらに具体的に説明する。
<ステップ(a):融合遺伝子を含むベクターの製造>
本ステップは、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたTLR5アゴニスト(agonist)タンパク質を暗号化する遺伝子に、ユビキチンを暗号化する遺伝子が結合されており、前記ユビキチン暗号化遺伝子に精製用タグを暗号化する遺伝子が結合されて形成された融合遺伝子を含むベクターを製造するステップである。遺伝子の結合及びベクター製造などは、当業界に広く知られている技術が利用できるので、これについての具体的な記載は省略する。
本ステップは、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたTLR5アゴニスト(agonist)タンパク質を暗号化する遺伝子に、ユビキチンを暗号化する遺伝子が結合されており、前記ユビキチン暗号化遺伝子に精製用タグを暗号化する遺伝子が結合されて形成された融合遺伝子を含むベクターを製造するステップである。遺伝子の結合及びベクター製造などは、当業界に広く知られている技術が利用できるので、これについての具体的な記載は省略する。
本ステップにおいて、前記TLR5アゴニスト(agonist)タンパク質は、一例として、配列番号2に記載のアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが配列番号6に記載のリンカーを媒介として結合されたものであってよい。
本ステップにおいて、前記ユビキチンを暗号化する遺伝子は、好ましくは、TLR5アゴニストタンパク質を暗号化する遺伝子の5’末端に結合し、前記精製用タグを暗号化する遺伝子は、好ましくは、前記ユビキチンを暗号化する遺伝子の5’末端に結合することが良い。
本ステップにおいて、前記融合遺伝子は、一例として、配列番号7の核酸配列を有するものであってよい。
本ステップにおいて、前記融合遺伝子は、一例として、配列番号7の核酸配列を有するものであってよい。
本ステップにおいて、前記ユビキチンは、好ましくは、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることが良いが、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいるものであれば、ユビキチンの一部分も使用可能である。
本ステップにおいて、前記精製用タグは、様々な精製用タグを用いることができ、一例としては、ヒスチジンタグ(His−tag)またはリシン(lysine)が6個連続的に結合して形成されたリシンタグを用いることができる。
本ステップにおいて、前記精製用タグは、様々な精製用タグを用いることができ、一例としては、ヒスチジンタグ(His−tag)またはリシン(lysine)が6個連続的に結合して形成されたリシンタグを用いることができる。
<ステップ(b):融合タンパク質の生産>
本ステップは、前記で製造したベクターでホストを形質転換した後、前記融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を生産するステップである。
本ステップは、前記で製造したベクターでホストを形質転換した後、前記融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を生産するステップである。
本ステップにおいて、前記ホストは、前ステップで構築したベクターが導入され、ベクター中に導入された遺伝子が発現され得るホスト、即ち、遺伝工学的にホスト−ベクターシステム(host−vector system)が構築されているホストであれば、いずれも用いることができるが、一例としては、最も広く知られている大腸菌を用いることができる。このとき、誘導プロモーター(inducible promoter)を用いるベクターを利用する場合、融合タンパク質の発現のために誘導物質を用いることもできる。
<ステップ(c):融合タンパク質の回収>
本ステップは、融合タンパク質に融合されている精製用タグが結合するカラムに、前記で生産された融合タンパク質を結合させて融合タンパク質を回収するステップである。
本ステップは、融合タンパク質に融合されている精製用タグが結合するカラムに、前記で生産された融合タンパク質を結合させて融合タンパク質を回収するステップである。
前記で生産された融合タンパク質は、ホスト内に存在するか、またはホストの外部に分泌され得るが、いずれの場合であっても融合タンパク質を細胞内/外のタンパク質またはその他の物質から分離する工程が要求される。
本ステップにおいては、融合タンパク質の融合されている精製用タグを利用して分離精製を遂行することができるが、精製用タグが結合するカラム(レジン)を用いて目的とする融合タンパク質だけを結合させ、残りの物質は溶出させて分離精製が可能なものである。
本ステップにおいては、融合タンパク質の融合されている精製用タグを利用して分離精製を遂行することができるが、精製用タグが結合するカラム(レジン)を用いて目的とする融合タンパク質だけを結合させ、残りの物質は溶出させて分離精製が可能なものである。
一方、本ステップは、好ましくは、生産された融合タンパク質をアンフォールディング(unfolding)した後、カラムに結合させてリフォールディング(refolding)することで融合タンパク質を回収することができる。また、本ステップは、生産された融合タンパク質をアンフォールディングし、リフォールディングした後、カラムに結合させて融合タンパク質を回収することができる。
生産された融合タンパク質が内包体形態(inclusion body)で発現される場合、この形態では生物学的活性を期待するのは難しいため、固有の形態(form)に戻すための工程が要求されるが、これをアンフォールディング及びリフォールディング過程という。アンフォールディング及びリフォールディング過程は、公知の技術を用いて遂行可能であるため、これについての具体的な記載は省略する。
<ステップ(d):TLR5アゴニストタンパク質の回収>
本ステップは、前記で回収した融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理し、ユビキチンが結合した部位を切断した後、TLR5アゴニストタンパク質を回収するステップである。
本ステップは、前記で回収した融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理し、ユビキチンが結合した部位を切断した後、TLR5アゴニストタンパク質を回収するステップである。
免疫反応誘発及びTLR5との結合阻害可能性を最小化させるためには、融合タンパク質に結合した融合パートナーを除去しなければならない。本ステップは、ユビキチン切断酵素を用いて融合パートナーを除去するものである。
本ステップにおいて、前記ユビキチン切断酵素の処理は、一例として、融合タンパク質をカラムに結合させた状態で処理することができ、また、融合タンパク質をカラムから溶離(elution)させた後、処理することもできる。
本ステップにおいて、前記ユビキチン切断酵素は、様々なものがあるが、一例として、USPまたはUCHであってよい。
本ステップにおいて、前記ユビキチン切断酵素の処理は、一例として、融合タンパク質をカラムに結合させた状態で処理することができ、また、融合タンパク質をカラムから溶離(elution)させた後、処理することもできる。
本ステップにおいて、前記ユビキチン切断酵素は、様々なものがあるが、一例として、USPまたはUCHであってよい。
本発明による場合、TLR5アゴニストタンパク質を生物工学的に生産した後、容易に分離及び精製することができ、特に、分離及び精製のために用いられた融合パートナーを効果的に除去することで、融合パートナーによる免疫反応誘発及びTLR5との結合阻害可能性を最小化させることができる。
以下、本発明の内容を下記実施例及び実験例を通してさらに詳細に説明する。ただし、本発明の権利範囲は、下記実施例にのみ限定されるものではなく、それと等価の技術的思想の変形までを含む。
[実施例1:K6UbKMRC011発現大腸菌の作製]
(1)K6UbKMRC011の遺伝子合成
配列番号2のアミノ酸配列(配列番号1の核酸配列により暗号化)を有するポリペプチドと、配列番号4のアミノ酸配列(配列番号3の核酸配列により暗号化)を有するポリペプチドとは、配列番号6のアミノ酸配列(配列番号5により暗号化)を有するポリペプチド(リンカー)を媒介として結合された後、折りたたまれるようになると、TLR5に結合できるD0ドメイン及びD1ドメインを形成することとなる。
(1)K6UbKMRC011の遺伝子合成
配列番号2のアミノ酸配列(配列番号1の核酸配列により暗号化)を有するポリペプチドと、配列番号4のアミノ酸配列(配列番号3の核酸配列により暗号化)を有するポリペプチドとは、配列番号6のアミノ酸配列(配列番号5により暗号化)を有するポリペプチド(リンカー)を媒介として結合された後、折りたたまれるようになると、TLR5に結合できるD0ドメイン及びD1ドメインを形成することとなる。
本実施例においては、配列番号1に記載の核酸配列及び配列番号3に記載の核酸配列が配列番号5に記載の核酸配列(リンカー)を媒介として形成された、いわゆる「TLR5アゴニストタンパク質(KMRC011)暗号化遺伝子」にリシン(lysine)6個が連続的に結合されたリシンタグ(K6)を暗号化する遺伝子及びユビキチン(Ub)を暗号化する遺伝子を結合させて融合遺伝子、「K6UbKMRC011」を合成するために、1次重合酵素連鎖反応を利用してK6Ub部分とKMRC011部分を分けて増幅し、2次重合酵素連鎖反応を通してK6Ub部分とKMRC011部分を連結して、K6UbKMRC011の全体遺伝子を合成した(図1参照)。
K6Ub部分は、プライマーK6Ub−NdeI−F及びKMRC011−R2とK6Ub遺伝子を含有しているプラスミドpUC18−K6Ubを鋳型として利用して増幅し、KMRC011部分は、プライマーKMRC011−F2及びKMRC011−BamHI−R2と配列番号1、配列番号3及び配列番号5の遺伝子を含有しているプラスミドpUC57−KMRC011を鋳型として利用して増幅した(下記表1参照)。
K6UbKMRC011の全体遺伝子は、プライマーK6Ub−NdeI−F及びKMRC011−BamHI−Rと1次重合酵素連鎖反応のK6Ub及びKMRC011産物を鋳型としてオーバーラップ−エクステンション(overlap−extension)PCRを通して合成した。合成されたK6UbKMRC011遺伝子の核酸配列及び核酸配列から類推されたアミノ酸配列を、それぞれ下記図2(配列番号7)と図3(配列番号8)に示した。
(2)K6UbKMRC011発現プラスミドの作製
増幅されたK6UbKMRC011遺伝子を、IPTGにより発現調節され、tacプロモーターを含有しているpAP(AP Technology社保有)発現プラスミドのNdeIとBamHI制限酵素位置に挿入して、pAP−K6UbKMRC011プラスミドを作製した(図4参照)。
増幅されたK6UbKMRC011遺伝子を、IPTGにより発現調節され、tacプロモーターを含有しているpAP(AP Technology社保有)発現プラスミドのNdeIとBamHI制限酵素位置に挿入して、pAP−K6UbKMRC011プラスミドを作製した(図4参照)。
(3)K6UbKMRC011の発現大腸菌の作製
pAP−K6UbKMRC011プラスミドで大腸菌TG1(Escherichia coli TG1)を形質転換して、K6UbKMRC011を発現する大腸菌TG1/pAP−K6UbKMRC011(Escherichia coli TG1/pAP−K6UbKMRC011)を最終的に作製した。
pAP−K6UbKMRC011プラスミドで大腸菌TG1(Escherichia coli TG1)を形質転換して、K6UbKMRC011を発現する大腸菌TG1/pAP−K6UbKMRC011(Escherichia coli TG1/pAP−K6UbKMRC011)を最終的に作製した。
[実施例2:実施例1において作製した組換え大腸菌を利用したK6UbKMRC011の生産]
前記実施例において作製した大腸菌TG1/pAP−K6UbKMRC011を利用してK6UbKMRC011の生産能を確認することを試みた。培養のために、酵母抽出物5g/L、トリプトン10g/L、塩化ナトリウム10g/L組成の培地を利用した。500mLバッフル付きフラスコ(baffled flask)を利用して、37℃、200rpmで600nmの吸光度が0.5〜1.0になるまで培養した後、IPTGを1mMになるように添加してK6UbKMRC011の発現を誘導後、4時間培養した。
前記実施例において作製した大腸菌TG1/pAP−K6UbKMRC011を利用してK6UbKMRC011の生産能を確認することを試みた。培養のために、酵母抽出物5g/L、トリプトン10g/L、塩化ナトリウム10g/L組成の培地を利用した。500mLバッフル付きフラスコ(baffled flask)を利用して、37℃、200rpmで600nmの吸光度が0.5〜1.0になるまで培養した後、IPTGを1mMになるように添加してK6UbKMRC011の発現を誘導後、4時間培養した。
600nmの吸光度15に補正された前記K6UbKMRC011が発現された大腸菌を超音波破砕機を利用して破砕した後、12,000rpmで20分間遠心分離の条件で可溶性及び非可溶性分画に分けた後、SDS−PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)分析を通してK6UbKMRC011の発現水準及び可溶性を確認した。
発現されたK6UbKMRC011の細胞内発現水準は、デンシトメータ(densitometer)分析を通して約21%と確認された(図5参照)。K6UbKMRC011は、ほとんど不溶性分画で観察され、大腸菌で発現されたK6UbKMRC011は、不溶性内包体であることが分かった。
[実施例3:実施例2において生産したK6UbKMRC011の固相リフォールディング方法]
大腸菌で発現されたK6UbKMRC011は、不溶性内包体で発現されたので、生物学的活性回復のために固相リフォールディング(solid−phase refolding)を遂行した。超音波破砕機で破砕された大腸菌を遠心分離(12,000rpm、20分)した後、得られたK6UbKMRC011の内包体を緩衝液A(pH7.0、50mM Sodium phosphate、8M urea)で可溶化させ、その後、緩衝液Aで平衡化されたカチオン交換樹脂SP Sepharose FF(GE Healthcare)が充填されたカラムに仕込んで、可溶化されたK6UbKMRC011が静電気的引力によりカチオン交換樹脂に結合されるようにした。緩衝液B(pH7.0、50mM Sodium phosphate)を前記カラムに仕込んで尿素(urea)を除去することにより、カチオン交換樹脂に結合されたK6UbKMRC011のリフォールディングを誘導した。緩衝液C(pH7.0、50mM Sodium phosphate、1M NaCl)を前記カラムに仕込んで、リフォールディングK6UbKMRC011がカチオン交換樹脂から溶出され得るようにし、各分画をSDS−PAGEで分析した(図6参照)。
大腸菌で発現されたK6UbKMRC011は、不溶性内包体で発現されたので、生物学的活性回復のために固相リフォールディング(solid−phase refolding)を遂行した。超音波破砕機で破砕された大腸菌を遠心分離(12,000rpm、20分)した後、得られたK6UbKMRC011の内包体を緩衝液A(pH7.0、50mM Sodium phosphate、8M urea)で可溶化させ、その後、緩衝液Aで平衡化されたカチオン交換樹脂SP Sepharose FF(GE Healthcare)が充填されたカラムに仕込んで、可溶化されたK6UbKMRC011が静電気的引力によりカチオン交換樹脂に結合されるようにした。緩衝液B(pH7.0、50mM Sodium phosphate)を前記カラムに仕込んで尿素(urea)を除去することにより、カチオン交換樹脂に結合されたK6UbKMRC011のリフォールディングを誘導した。緩衝液C(pH7.0、50mM Sodium phosphate、1M NaCl)を前記カラムに仕込んで、リフォールディングK6UbKMRC011がカチオン交換樹脂から溶出され得るようにし、各分画をSDS−PAGEで分析した(図6参照)。
溶出されたリフォールディングK6UbKMRC011は、全て可溶性形態であると確認され、USP1(ubiquitin−specific protease 1)による切断有無を確認するために、USP1を10mg/Lとなるように溶出されたリフォールディングK6UbKMRC011に添加し、37℃で12時間の間反応させた。
SDS−PAGEで分析の結果、ほとんどのリフォールディングされたK6UbKMRC011は、USP1により切断され、K6UbとKMRC011とに分離されることを確認した(図7参照)。このとき、USP1処理によりKMRC011タンパク質の内部構造が分解されないことを確認することもできた。
また、分離されたKMRC011タンパク質のN−末端配列を「N−末端シークエンシング」を通して確認した結果、KMRC011タンパク質のN−末端アミノ酸配列「A−Q−V−I−N」が完全に維持されたままK6Ubが分離されて離れることを確認することができた。
また、分離されたKMRC011タンパク質のN−末端配列を「N−末端シークエンシング」を通して確認した結果、KMRC011タンパク質のN−末端アミノ酸配列「A−Q−V−I−N」が完全に維持されたままK6Ubが分離されて離れることを確認することができた。
以上の結果から、ユビキチン切断酵素であるUSP1の処理により、本発明KMRC011タンパク質が分解されず、さらにN−末端が完全に維持されたまま、K6Ubが分離されることを確認することができた。
目的タンパク質から融合パートナーを除去する場合は、除去に用いられた酵素が目的タンパク質の構造に影響してはならないが、本発明においてユビキチン切断酵素は、目的タンパク質であるKMRC011の構造に全く影響を与えないことが確認された。
目的タンパク質から融合パートナーを除去する場合は、除去に用いられた酵素が目的タンパク質の構造に影響してはならないが、本発明においてユビキチン切断酵素は、目的タンパク質であるKMRC011の構造に全く影響を与えないことが確認された。
[実施例4:実施例3において固相リフォールディングされたK6UbKMRC011からKMRC011を分離精製する方法−on column cleavage]
固相リフォールディングされたK6UbKMRC011を溶出せず、カチオン交換樹脂に静電気的結合された状態でUSP1溶液(10mg/L)を循環させることで、KMRC011のみ分離及び精製することを試みた(図8参照)。
固相リフォールディングされたK6UbKMRC011を溶出せず、カチオン交換樹脂に静電気的結合された状態でUSP1溶液(10mg/L)を循環させることで、KMRC011のみ分離及び精製することを試みた(図8参照)。
分離精製されたKMRC011は、アミノ末端配列分析でAQVINTNSLSと確認され、USP1により正確にK6UbKMRC011のK6Ubの後ろが切断されたKMRC011のみ分離精製されたことを確認することができた。
[実施例5:様々なユビキチン分解酵素適用によるK6UbKMRC011の切断分析結果]
本実施例においては、前記実施例3に記載のUSP1の他に様々な種類のユビキチン切断酵素をK6UbKMRC011に適用し、目的タンパク質であるKMRC011が完全にK6Ubから分離されるかを確認することを試みた。
本実施例においては、前記実施例3に記載のUSP1の他に様々な種類のユビキチン切断酵素をK6UbKMRC011に適用し、目的タンパク質であるKMRC011が完全にK6Ubから分離されるかを確認することを試みた。
実施例3で得られた可溶性形態のリフォールディングK6UbKMRC011に、下記表2に記載の様々なユビキチン切断酵素を10mg/Lとなるように添加し、37℃で12時間反応させた。
実験結果は、図9のように示された。図9は、様々なユビキチン切断酵素適用によるK6UbKMRC011の切断分析結果である。図9において、lane 1:Protein Mw size marker、lane 2:K6UbKMRC011、lane 3:K6UbKMRC011+USP1、lane 4:K6UbKMRC011+USP2、lane 5:K6UbKMRC011+USP10、lane 6:K6UbKMRC011+UCH−L3、lane 7:K6UbKMRC011+UCH−L5/UCH37である。
SDS−PAGE分析結果である図9から見られるように、リフォールディングされたK6UbKMRC011は、表2に記載のユビキチン切断酵素により切断され、K6UbとKMRC011とに正確に分離されることを確認することができた。このとき、これらの酵素の処理によりKMRC011タンパク質の内部構造が分解されないことも確認することができた。
また、分離されたKMRC011タンパク質のN−末端配列を「N−末端シークエンシング」を通して確認した結果、実施例3と同様に、KMRC011タンパク質のN−末端アミノ酸配列「A−Q−V−I−N」が完全に維持されたままK6Ubが分離されて離れることを確認することができた。
上記で検討したように、本実験に用いた全てのユビキチン切断酵素が、K6UbKMRC011のK6Ubの後ろを正確に切断することを確認することができた。また、実施例3のUSP1だけでなく、USP系列及びUCH系列のユビキチン切断酵素もK6UbKMRC011のK6Ubの後ろを正確に切断し、KMRC011を損傷することなく分離できることを確認した。
また、以上の様々な実験結果から、全ての系列のユビキチン切断酵素がK6UbKMRC011のK6Ubの後ろを正確に切断し、KMRC011を損傷することなく分離できるものと結論付けることができた。
Claims (21)
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたTLR5アゴニスト(agonist)タンパク質にユビキチンが結合されていることを特徴とする、融合タンパク質。
- 前記TLR5アゴニスト(agonist)タンパク質は、
配列番号2に記載のアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが配列番号6に記載のリンカーを媒介として結合されたことを特徴とする、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記ユビキチンは、
TLR5アゴニスト(agonist)タンパク質のアミノ末端に結合されていることを特徴とする、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記ユビキチンは、
ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記ユビキチンは、
ユビキチンの一部分であり、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項4に記載の融合タンパク質。 - 前記ユビキチン切断酵素は、
USPまたはUCHであることを特徴とする、請求項4に記載の融合タンパク質。 - 前記融合タンパク質は、
ユビキチンのアミノ末端に精製用タグがさらに結合されていることを特徴とする、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記精製用タグは、
ヒスチジンタグ(His−tag)またはリシン(lysine)が6個連続的に結合して形成されたリシンタグであることを特徴とする、請求項7に記載の融合タンパク質。 - 配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたTLR5アゴニスト(agonist)タンパク質を暗号化する遺伝子に、ユビキチンを暗号化する遺伝子が結合されており、前記ユビキチン暗号化遺伝子に精製用タグを暗号化する遺伝子が結合されて形成された融合遺伝子を含むベクターを製造するステップ(a);
前記製造したベクターでホストを形質転換した後、前記融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を生産するステップ(b);
前記融合タンパク質に融合されている精製用タグが結合するカラムに、前記で生産された融合タンパク質を結合させて融合タンパク質を回収するステップ(c);及び
前記回収した融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理し、ユビキチンが結合した部位を切断した後、TLR5アゴニスト(agonist)タンパク質を回収するステップ(d);を含むことを特徴とする、TLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記TLR5アゴニスト(agonist)タンパク質は、
配列番号2に記載のアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが配列番号6に記載のリンカーを媒介として結合されたことを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ユビキチンを暗号化する遺伝子は、TLR5アゴニスト(agonist)タンパク質を暗号化する遺伝子の5’末端に結合し、
前記精製用タグを暗号化する遺伝子は、前記ユビキチンを暗号化する遺伝子の5’末端に結合することを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ホストは、
大腸菌であることを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ステップ(d)のユビキチン切断酵素の処理は、
融合タンパク質をカラムに結合させた状態で処理することを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ステップ(d)のユビキチン切断酵素の処理は、
融合タンパク質をカラムから溶離(elution)させた後、処理することを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記融合遺伝子は、
配列番号7の核酸配列を有することを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ユビキチンは、
ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ユビキチンは、
ユビキチンの一部分であり、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記精製タグは、
ヒスチジンタグ(His−tag)またはリシン(lysine)が6個連続的に結合したリシンタグであることを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ステップ(c)は、
生産された融合タンパク質をアンフォールディング(unfolding)した後、カラムに結合させてリフォールディング(refolding)することで融合タンパク質を回収することを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ステップ(c)は、
生産された融合タンパク質をアンフォールディング(unfolding)し、リフォールディング(refolding)した後、カラムに結合させて融合タンパク質を回収することを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ユビキチン切断酵素は、
USPまたはUCHであることを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2015-0089284 | 2015-06-23 | ||
KR1020150089284A KR101634380B1 (ko) | 2015-06-23 | 2015-06-23 | Tlr5 아고니스트 단백질의 생산방법 |
PCT/KR2016/006581 WO2016208942A1 (ko) | 2015-06-23 | 2016-06-21 | Tlr5 아고니스트 단백질의 생산방법 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019088013A Division JP2019163283A (ja) | 2015-06-23 | 2019-05-08 | Tlr5アゴニストタンパク質の生産方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018513108A true JP2018513108A (ja) | 2018-05-24 |
Family
ID=56366419
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017542423A Pending JP2018513108A (ja) | 2015-06-23 | 2016-06-21 | Tlr5アゴニストタンパク質の生産方法 |
JP2019088013A Pending JP2019163283A (ja) | 2015-06-23 | 2019-05-08 | Tlr5アゴニストタンパク質の生産方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019088013A Pending JP2019163283A (ja) | 2015-06-23 | 2019-05-08 | Tlr5アゴニストタンパク質の生産方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10711049B2 (ja) |
JP (2) | JP2018513108A (ja) |
KR (1) | KR101634380B1 (ja) |
WO (1) | WO2016208942A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2022527697A (ja) * | 2019-03-28 | 2022-06-03 | ザ カトリック ユニバーシティ オブ コリア インダストリー-アカデミック コーオペレイション ファウンデーション | フラジェリンから誘導されたtlr5作用剤を有効成分として含む移植片対宿主疾患の予防または治療用組成物 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005506319A (ja) * | 2001-07-26 | 2005-03-03 | アドバンスド プロテイン テクノロジーズ コーポレイション | 融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法。 |
JP2008525472A (ja) * | 2004-12-22 | 2008-07-17 | クリーブランド クリニック ファウンデイション | フラゲリン関連ポリペプチドおよびその使用 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5563046A (en) * | 1993-08-02 | 1996-10-08 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Fusion polypeptides and proteins |
UA83272C2 (uk) | 2003-12-02 | 2008-06-25 | Клевеленд Клінік Фаундейшн | Спосіб захисту від ефектів іонізуючого випромінювання за допомогою флагеліну |
US8236327B2 (en) | 2007-02-09 | 2012-08-07 | Industry Foundation Of Chonnam National University | Modified flagellin improved toll-like receptor 5 stimulating activity |
KR100854594B1 (ko) * | 2007-02-09 | 2008-08-27 | 전남대학교산학협력단 | 톨-유사 수용체-5 자극 활성이 강화된 pas-플라젤린융합 단백질 |
KR100960611B1 (ko) * | 2008-02-04 | 2010-06-07 | 전남대학교산학협력단 | 톨-유사 수용체-5 자극 활성이 증가된 플라젤린 변형체 |
ES2457518T3 (es) | 2009-10-06 | 2014-04-28 | Panacela Labs, Inc. | Uso de receptores semejantes a Toll y agonista para tratar cáncer |
KR101643761B1 (ko) * | 2009-12-04 | 2016-07-29 | 삼성전자주식회사 | 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질, 막 투과 도메인 및 생물학적 활성분자를 포함하는 융합 단백질 및 그의 용도 |
US20140045211A1 (en) * | 2011-03-24 | 2014-02-13 | The Regents Of The University Of California | High level production of recombinant proteins |
WO2015080631A1 (en) * | 2013-11-27 | 2015-06-04 | Obschestvo S Ogranichennoy Otvetstvennost`Yu "Panacela Labs" | Improved expression vector for toll-like receptor and agonist and use for treating cancer |
-
2015
- 2015-06-23 KR KR1020150089284A patent/KR101634380B1/ko active IP Right Grant
-
2016
- 2016-06-21 JP JP2017542423A patent/JP2018513108A/ja active Pending
- 2016-06-21 US US15/553,191 patent/US10711049B2/en active Active
- 2016-06-21 WO PCT/KR2016/006581 patent/WO2016208942A1/ko active Application Filing
-
2019
- 2019-05-08 JP JP2019088013A patent/JP2019163283A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005506319A (ja) * | 2001-07-26 | 2005-03-03 | アドバンスド プロテイン テクノロジーズ コーポレイション | 融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法。 |
JP2008525472A (ja) * | 2004-12-22 | 2008-07-17 | クリーブランド クリニック ファウンデイション | フラゲリン関連ポリペプチドおよびその使用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
別冊・医学のあゆみ ユビキチン研究の新展開, JPN6019000435, February 2006 (2006-02-01), pages 23 - 28, ISSN: 0003954984 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101634380B1 (ko) | 2016-06-28 |
US10711049B2 (en) | 2020-07-14 |
WO2016208942A1 (ko) | 2016-12-29 |
JP2019163283A (ja) | 2019-09-26 |
US20190127434A1 (en) | 2019-05-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2022069495A (ja) | Xten共役組成物およびそれを製造する方法 | |
Zhang et al. | Protein aggregation during overexpression limited by peptide extensions with large net negative charge | |
JP6656171B2 (ja) | 組換えボツリヌス菌神経毒の生産 | |
RU2528854C2 (ru) | Вакцины и компоненты вакцин для подавления микробных клеток | |
JPH02500876A (ja) | 組換えポリペプチドの製品およびその製造、単離および精製方法 | |
RU2194713C2 (ru) | Модифицированный c3 белок человека, фрагмент днк, конъюгат, фармацевтическая композиция, способ уменьшения количества белка | |
Carter et al. | A unique protein self‐assembling nanoparticle with significant advantages in vaccine development and production | |
JP2018537412A (ja) | クロストリジウム神経毒を精製するための方法 | |
ES2780525T3 (es) | Proteínas quiméricas basadas en cyaa que comprenden un polipéptido heterólogo y sus usos en la inducción de respuestas inmunes | |
TW200902049A (en) | Fusion protein | |
JP2019163283A (ja) | Tlr5アゴニストタンパク質の生産方法 | |
JP2005536514A (ja) | 神経再生のためにターゲティングされた薬剤 | |
JPS6011428A (ja) | 狂犬病ワクチン | |
EP2874657B1 (en) | Hpv/cyaa-based chimeric proteins and their uses in the induction of immune responses against hpv infection and hpv-induced disorders | |
US20160122793A1 (en) | Fusion Protease | |
KR101744297B1 (ko) | Tlr5 아고니스트 단백질의 생산방법 | |
Yuan et al. | Construction and preservation of a stable and highly expressed recombinant Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin A with apoptotic activity | |
Ahn et al. | Improved recombinant protein production using heat shock proteins in Escherichia coli | |
Karamitros et al. | Bacterial co-expression of the α and β protomers of human l-asparaginase-3: Achieving essential N-terminal exposure of a catalytically critical threonine located in the β-subunit | |
Wang et al. | Preparation of a peptide vaccine against GnRH by a bioprocess system based on asparaginase | |
KR19990087571A (ko) | 하향 조절 내성 c3 컨버타제 | |
JP2018515542A (ja) | 選択細胞への分子送達に適用する遺伝子操作したボツリヌス菌毒素 | |
CN108779152B (zh) | 包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法 | |
JP2024518565A (ja) | 組換え重複ペプチド及びネイティブタンパク質を含むワクチン製剤 | |
Chu-Dao et al. | Effect of Freeze-Thaw and Urea in Solubility of GPC3-Csub Protein Expressed in Escherichia coli |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180828 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181122 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20190115 |