JP2022527697A

JP2022527697A - フラジェリンから誘導されたｔｌｒ５作用剤を有効成分として含む移植片対宿主疾患の予防または治療用組成物

Info

Publication number: JP2022527697A
Application number: JP2021556768A
Authority: JP
Inventors: チョ、ソック; イム、ゴニル; キム、ナヨン; チョン、ヨンウ; ナム、ヨンソン; ソン、ユンジン; イ、ジュンソク
Original assignee: ザカトリックユニバーシティオブコリアインダストリー－アカデミックコーオペレイションファウンデーション
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2022-06-03
Also published as: WO2020197296A1; KR20200115318A; KR20200117954A; JP2023156486A; KR102169663B1; CN113993538A; EP3964226A4; EP3964226A1; US20220218786A1

Abstract

本発明は、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む移植片対宿主疾患の予防または治療用組成物に関する。本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、優れた移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の治療効果を示すので、移植片対宿主疾患の治療、予防または改善用組成物の活性成分として開発できる。【選択図】図１

Description

本発明は、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む移植片対宿主疾患の予防または治療用組成物に関する。

ＴＬＲ５（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ５）は、ヒトにおけるＴＬＲ５遺伝子によって暗号化されたタンパク質であって（ＰＮＡＳ．９５（２）：５８８－９３）、ＴＬＲ（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーの一員である。ＴＬＲ５は、侵入する運動性バクテリアのフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を認識できることが知られている（ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２９（３）：２７５－８８）。ＴＬＲ５は、炎症性腸疾患を含めて多様な疾患の開始に関与することが知られている（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．６０Ｓｕｐｐｌ４：７１－５）。

フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）は、運動細胞小器官である、バクテリア鞭毛のフィラメントを構成する主要構造タンパク質である。数万個のフラジェリン分子が螺旋状に重合されて長い鞭形状のフラジェラフィラメントを形成する。フラジェリンは、Ｄ０ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ３ドメインを含み、そのうち、Ｄ０ドメインとＤ１ドメインのフィラメントの組立に必要である。フラジェリンのＤ０およびＤ１ドメインは、多様なバクテリア種にわたって構造および配列が高度に保存されており、宿主にバクテリア感染を知らせる、鞭毛を有するバクテリアの共通分子パターンとして機能をする。フラジェリンはＴＬＲ５によって認識されて、ＮＦ－κＢシグナル伝達メカニズムを活性化させて、先天性免疫刺激、細胞保護および放射線抵抗性を誘導すると知られている。

移植片対宿主疾患（Ｇｒａｆｔ－Ｖｅｒｓｕｓ－Ｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）は、白血病、骨髄腫、リンパ腫および再生不良性貧血のような血液癌の治療のために同種造血母細胞を移植する過程で発生するが、移植や輸血により輸血されたリンパ球が免疫機能の低下した宿主を攻撃しながら発生する。輸血されたリンパ球は一般的に宿主の免疫機序によって破壊されるが、宿主の免疫機能が低下した場合、宿主の免疫体系がかかる機能を行えないことからＧＶＨＤが発生する。一方、宿主の免疫抑制の程度が高いほど、ＧＶＨＤの可能性は高まるが、移植片対宿主疾患と抗腫瘍（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｔｕｍｏｒ、ＧＶＴ）効果は互いに密接に関連づけられており、移植後に免疫抑制の強度を高める場合、ＧＶＨＤの発生は減少するものの、ＧＶＴ効果も弱くなり、結局、白血病の再発が増加する。したがって、ＧＶＨＤを抑制しながらＧＶＴ効果は極大化できる新たな治療剤の開発が切実なのが現状である。

本明細書で言及された特許文献および参考文献は、それぞれの文献が参照により個別的かつ明確に特定されたものと同じ程度で本明細書に参照として取り込まれる。

Seminars in Immunopathology. 29 (3): 275－88 Journal of Physiology and Pharmacology. 60 Suppl 4: 71－5

本発明者らは、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を効果的に抑制しながら同時に抗腫瘍（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｔｕｍｏｒ、ＧＶＴ）効果は極大化できる治療剤物質を開発するために研究努力した。その結果、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ５）の新規なペプチド作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）を開発し、このＴＬＲ５作用剤が移植片対宿主疾患を効果的に抑制することを実験的に確認して、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤の治療学的有効量；および薬学的に許容される担体を含む、移植片対宿主疾患の治療または予防用薬学的組成物を提供することである。

また、本発明の他の目的は、前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む、移植片対宿主疾患の改善用機能性食品組成物を提供することである。

本発明の他の目的および技術的特徴は以下の発明の詳細な説明、特許請求の範囲および図面によってより具体的に提示される。

本発明の一態様によれば、（ｉ）フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）の治療学的有効量；および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、移植片対宿主疾患の治療または予防用薬学的組成物を提供する。
本発明で使われる用語「フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤」は、バクテリアのフラジェリンタンパク質に由来するか、これを変形させたものであって、ＴＬＲ５（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ５）によるシグナル伝達を活性化させる活性を有するタンパク質またはポリペプチドをすべて含む意味である。

本発明で使われる用語「フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）」は、バクテリア鞭毛のフィラメントを構成する主要タンパク質を指す。フラジェリンは、Ｄ０ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ３ドメインを含んでなる。フラジェリンはＴＬＲ５によって認識されて、ＮＦ－κＢシグナル伝達メカニズムを活性化させて、先天性免疫刺激、細胞保護および放射線抵抗性を誘導することが知られている。

本発明の一実施形態によれば、前記「フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤」は、ペプチド物質としてフラジェリンのＤ０ドメインおよびフラジェリンのＤ１ドメインを含むことができる。

本発明の他の実施形態によれば、前記「フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤」は、フラジェリンのＤ０ドメイン、フラジェリンのＤ１ドメイン、およびリンカーペプチドを含むことができる。

本発明の他の実施形態によれば、前記リンカーペプチドは、Ｄ１ドメインの内部に含まれる。
本発明の他の実施形態によれば、前記リンカーペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる。

本発明のさらに他の実施形態によれば、前記「フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤」は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

本発明において、治療対象疾患である「移植片対宿主疾患（Ｇｒａｆｔ－Ｖｅｒｓｕｓ－Ｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）」は、輸血されたリンパ球が免疫機能の低下した宿主を攻撃して現れる全身性疾患であって、供与者（ｄｏｎｏｒ）のＴ細胞が宿主（ｈｏｓｔ）の臓器、例えば、肝、小腸、大腸、皮膚などを損傷させる。輸血されたリンパ球は一般的に宿主の免疫機序によって破壊されるが、宿主の免疫機能が低下した場合、宿主の免疫体系がかかる機能を行えないことから発生する。免疫抑制を多くするほど、輸血による移植片対宿主疾患の可能性が高まる。悪性血液癌（急性白血病やホジキン病など）や先天性免疫欠乏症により不可避に造血母細胞の移植を受けなければならない患者に現れ、合併症免疫抑制を多くするほど、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の可能性は高まる。骨髄移植後に発生する移植片対宿主疾患は急性と慢性の２種類があり、輸血後に発生する移植片対宿主疾患は急性の形態で発生する。症状は、発熱、発疹、かゆみ症、黄疸、肝機能異常、下痢、出血、汎血球減少症（白血球、赤血球、血小板がすべて減少した状態）などであり、輸血後４～３０日の間に発生する。

一方、移植片対腫瘍（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｔｕｍｏｒ）は、移植された骨髄や組織に存在する供与者の免疫細胞が、授与者の持っている癌組織に起こす免疫反応である。骨髄移植などでは供与者と授与者の相性が合わない場合、移植した白血球が授与者の正常体細胞を攻撃し、これによって移植片対宿主疾患をもたらす。免疫異常である移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の抑制のために免疫抑制剤を投与するが、癌細胞を攻撃する移植片対腫瘍効果（ＧＶＴ効果）まで必然的に低下させて、白血病の再発の原因になりうる。したがって、移植片対宿主疾患と移植片対腫瘍（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｔｕｍｏｒ、ＧＶＴ）効果は互いに密接に関連づけられているといえる。

本明細書の実施例で実験結果として立証されているように、本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、ＧＶＨＤ誘導された動物モデルにおいて優れたＧＶＨＤ治療効果を示した。

また、本明細書の実施例で他の実験結果として立証されているように、本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、宿主由来のＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）－２２およびＩＬ－２３の生産を促進させる効果を示した。したがって、本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、前記宿主由来のＩＬ－２２およびＩＬ－２３の生産を促進させることにより、移植片対宿主疾患を有する宿主において腸幹細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）が減少することを抑制することができる。

本明細書の実施例で実験結果として立証されているように、本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、ＧＶＨＤおよびＧＶＴ誘導された動物モデルにおいて優れた移植片対腫瘍効果の増加を示した。

本発明の組成物は、（ｉ）フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤の治療学的有効量；および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物の形態で提供される。

本明細書において、用語「治療学的有効量」は、有効成分である「フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤」を対象患者に投与して移植片対宿主疾患を治療または予防するのに適した量を意味し、具体的には、前記「治療学的有効量」は、治療される疾患または状態の１つ以上の症状をある程度緩和させる、投与される薬剤または化合物の十分な量を意味する。

前記（ｉ）フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤の治療学的有効量；および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物の好ましい投与量は、適宜調節可能である。前記組成物は、好ましくは、１日投与量を基準として２５～１００ｕｇ／ｋｇであってもよい。

本発明の薬学的組成物は、有効成分である「フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤」のほかに、薬学的に許容される担体を含むことができ、このような担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、メントールおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の薬学的組成物は、前記成分のほかに、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含むことができる。好適な薬学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。

本発明の薬学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方可能である。

本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与することができ、非経口投与される場合、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。

一方、本発明の薬学的組成物が移植片対宿主疾患の治療または予防のために適用される点を勘案すれば、本発明の薬学的組成物の投与は、経口または非経口の多様な経路で投与可能である。
本発明の薬学的組成物に含まれる有効成分の濃度は、治療目的、患者の状態、必要期間などを考慮して決定することができ、特定範囲の濃度に限定されない。

本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量形態で製造されるか、または多用量容器内に入れて製造されてもよい。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよいし、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。

本発明の他の態様によれば、本発明は、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む、移植片対宿主疾患の改善用機能性食品組成物を提供する。

本発明の機能性食品組成物は、食品の製造時に通常添加される成分を含み、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素および調味剤を含む。例えば、有効成分としてのフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤のほかに、香味剤または天然炭水化物を追加成分として含むことができる。例えば、天然炭水化物は、モノサッカライド（例えば、グルコース、フルクトースなど）；ジサッカライド（例えば、マルトース、スクロースなど）；オリゴ糖；ポリサッカライド（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなど）；および糖アルコール（例えば、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなど）を含む。香味剤として、天然香味剤（例えば、タウマチン、ステビア抽出物など）および合成香味剤（例えば、サッカリン、アスパルテームなど）を用いることができる。

本発明の利点をまとめると、次の通りである：
（ｉ）本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、優れた移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の治療効果を示す。
（ｉｉ）本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、移植片対宿主疾患の治療、予防または改善用組成物の活性成分として開発できる。

本発明は、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む移植片対宿主疾患の予防または治療用組成物に関する。本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、優れた移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の治療効果を示すので、移植片対宿主疾患の治療、予防または改善用組成物の活性成分として開発できる。

ＧＶＨＤマウス動物モデルにおいて配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドであるＴＬＲ５作用剤（以下、配列番号２のＴＬＲ５作用剤を「ＫＭＲＣ０１１」と称して記載する）の投与によるＧＶＨＤの抑制効果を示す実験結果の写真である。ＧＶＨＤマウス動物モデルは、ＭＨＣクラス（ｃｌａｓｓ）が互いに異なるＣ５７ＢＬ／６（Ｈ－２ｋｂ）マウス（供与者）とＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２ｋｄ）マウス（授与者）を用いて供与者の骨髄細胞と脾臓細胞を授与者の静脈に移植することによって得た。ＧＶＨＤマウス動物モデルにおいてＫＭＲＣ０１１によるＧＶＨＤの抑制効果を示す実験結果である。グラフでは、ＧＶＨＤマウスモデルの生存率、体重およびＧＶＨＤ臨床評価指標を測定した結果を示す。ＧＶＨＤマウスモデルにおいてＫＭＲＣ０１１の投与によるＧＶＨＤの抑制効果を示す結果であって、免疫組織化学染色による組織学的相違を示す写真である。ＧＶＨＤマウスモデルにおいてＫＭＲＣ０１１によるＧＶＨＤの抑制効果を示す結果であって、ＫＭＲＣ０１１の投与によるＩＬ－２２とＩＬ－２３の発現増加および腸幹細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）の保護効果を示す。ＴＬＲ５遺伝子の形質感染によって生成されたＨＥＫ－Ｄｕａｌ細胞においてＫＭＲＣ０１１とフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）の生物学的活性度を測定した結果であって、ＩＬ－８反応を光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）で確認した結果を示す図である。ＴＬＲ５遺伝子の形質感染によって生成されたＨＥＫ－Ｄｕａｌ細胞においてＫＭＲＣ０１１とフラジェリンの生物学的活性度を測定した結果であって、ＮＦ－κＢ反応をアルカリンホスファターゼ活性（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ、ＡＰ）反応測定方法で確認した結果を示す図である。ＧＶＨＤおよびＧＶＴマウスモデルにおいてＫＭＲＣ０１１の投与によるＧＶＨＤの抑制効果を示す結果である。ＧＶＨＤおよびＧＶＴマウスモデルにおいてＫＭＲＣ０１１の投与によるＧＶＴの上昇効果を示す結果であって、生体内蛍光分光分析器（ＩＶＩＳＬｕｍｉｎａＸＲＭＳ）を用いて腫瘍を追跡、観察した結果である。

本明細書で説明された具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態または例示を代表する意味であり、これによって本発明の範囲が限定されない。本発明の変形と他の用途が本明細書の特許請求の範囲に記載された発明の範囲を逸脱しないことは当業者にとって自明である。

実験方法
１．マウスモデルの確立
（１）ＧＶＨＤマウスモデル
ＭＨＣクラス（ｃｌａｓｓ）が互いに異なるＣ５７ＢＬ／６（Ｈ－２ｋｂ）とＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２ｋｄ）マウス６－８週齢を用いて、授与者マウスであるＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２ｋｄ）は８００ｃＧｙで全身放射線を照射し、２４時間以内に供与者マウスであるＣ５７ＢＬ／６（Ｈ－２ｋｂ）の骨髄細胞（５×１０^６細胞）と脾臓細胞（５×１０^６細胞）を分離して、同種の授与者マウスの静脈に移植してＧＶＨＤ動物モデルを誘導した。次いで、ＧＶＨＤマウスは体重、姿勢、活動性、毛状態および皮膚密度を各２点ずつ計１０点満点のＧＶＨＤ臨床評価基準（下記表１参照）により１週間に２回ずつ観察および評価した。下記表１は、ＧＶＨＤマウスモデルの体重、姿勢、活動性、毛状態および皮膚密度の臨床評価基準を記載した。

（２）ＧＶＨＤおよびＧＶＴマウスモデル
分子映像手法を導入して腫瘍細胞の移動経路、生存率、増殖率および抗腫瘍効果にＫＭＲＣ０１１の作用の影響を確認することにより、腫瘍患者を対象にするＧＶＨＤ治療剤の有効性を同時に検証すべく、腫瘍を保有したマウスに同種造血母細胞の移植によるＧＶＨＤおよびＧＶＴ同時誘発モデルを確立した。
分子ラベリングにより腫瘍追跡が可能な癌細胞株（Ａ２０１ｘ１０６）をマウスに静脈注射し、７日後に放射線照射（８Ｇｙ）および同種移植を行ってＧＶＴモデルを確立した。ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを注入した動物のｗｈｏｌｅｂｏｄｙを生きている状態で生体内蛍光分光分析器（ＩＶＩＳＬｕｍｉｎａＸＲＭＳ）を用いてイメージングを実施し、ＧＶＨＤ評価を進行させた。

２．免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
パラフィンに包埋された組織から４μｍの連続切片を得て、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で３回処理してパラフィンを除去し、９５％、９０％、７０％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）で段階的に含水させた後、０．５％過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ）で内因性ペルオキシダーゼ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を除去した後、正常ヤギ血清（ｇｏａｔｓｅｒｕｍ）で３０分間処理し、一次抗体を３％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）が含まれたリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）で製造会社の指示通りに希釈して１時間反応させた。発現の差を示す遺伝子に対して発現蛋白に対する一次抗体の反応後、Ｔｒｉｓ－緩衝塩水（ＴＢＳ）で３回洗浄し、３％ＢＳＡで希釈した５μｇ／ｍｌｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ／ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧに３０分間反応させ、３回Ｔｒｉｓ－緩衝塩水で洗浄した後、３μｇ／ｍｌホースラディッシュペルオキシダーゼストレプトアビジン（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で３０分間放置させ、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と過酸化水素を用いて発色した後、Ｍｅｙｅｒ’ｓｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎや１％メチルグリーン（ｍｅｔｈｙｌｇｒｅｅｎ）で対照染色した。

３．ＨＥＫ－Ｄｕａｌ^ＴＭｈＴＬＲ５（ＮＦ／ＩＬ８）細胞培養
ＴＬＲ５作用剤としては、配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチド（「ＫＭＲＣ０１１」）を使用した。本発明のＫＭＲＣ０１１とフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）のＴＬＲ５に反応する生物学的活性を比較するために、ＨＥＫ－Ｄｕａｌ^ＴＭｈＴＬＲ５（ＮＦ／ＩＬ８）細胞を使用した。ＨＥＫ－Ｄｕａｌ^ＴＭ細胞は、ヒトＴＬＲ５（ｈＴＬＲ５）遺伝子の安定した形質注入とＴＬＲ３およびＴＮＦＲのノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）で他のＴＬＲおよびサイトカインＴＮＦ－αの干渉なしにｈＴＬＲ５シグナルのみを研究できる細胞であり、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから分譲を受けて使用した。この細胞は、ＴＬＲ５シグナルによるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１の誘導が可能なＳＥＡＰ（ｓｅｃｒｅｔｅｄｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）レポーター構造を安定的に発現し、内生ＩＬ－８プロモーターの制御下にあるルシアルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を発現する。細胞を１０％ＦＢＳと５０Ｕ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、１００μｇ／ｍｌノルモシン（Ｎｏｒｍｏｃｉｎ）^ＴＭ、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）ＢＧｏｌｄ、５０μｇ／ｍｌゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）^ＴＭが含まれたＤＭＥＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて５％ＣＯ_２および３７℃の条件下で培養した。本発明のＴＬＲ５作用剤（ＫＭＲＣ０１１）とフラジェリンを１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、０．０１ｎｇ／ｍｌで希釈して、フラットボトム９６ウェルプレート（ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）のウェル（ｗｅｌｌ）にそれぞれ２０μｌずつ添加した。他のウェル（ｗｅｌｌ）に陰性対照群である滅菌水を２０μｌ添加した。ＨＥＫ－Ｄｕａｌ^ＴＭｈＴＬＲ５（ＮＦ／ＩＬ８）細胞懸濁液を用意した後、フラットボトム９６ウェルプレート（ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）のウェル（ｗｅｌｌ）に細胞懸濁液１８０μｌ（１００００ｃｅｌｌｓ）をそれぞれ添加し、２０～２４時間５％ＣＯ_２および３７℃の条件下で培養した。

４．ＨＥＫ－Ｄｕａｌ^ＴＭｈＴＬＲ５細胞におけるＩＬ－８反応検出
ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ^ＴＭはルシフェラーゼ反応に必要な安定化された基質などのすべての構成要素を含んでいて、ルシアルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の活性を定量的に測定可能な分析試薬である。ルシフェラーゼ反応で生成された発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）は光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて定量化することができる。フラットボトム９６ウェルプレートのウェル（ｗｅｌｌ）あたりのＨＥＫ－Ｄｕａｌ^ＴＭｈＴＬＲ５（ＮＦ－κＢ／ＩＬ８）細胞培養上澄液を１０μｌずつそれぞれ分注した後、５０μｌのＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ^ＴＭを添加し、直ちに光度計を用いて発光を測定した。

５．ＨＥＫ－Ｄｕａｌ^ＴＭｈＴＬＲ５細胞におけるＮＦ－κＢ反応検出
ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ^ＴＭは、細胞培養上澄液のような生物学的サンプルでアルカリンホスファターゼ活性（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ、ＡＰ）を測定するために開発された比色酵素分析試薬であり、ＡＰがある場合、桃色から紫色－青色に変わる。フラットボトム９６ウェルプレートのウェル（ｗｅｌｌ）あたりのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ^ＴＭ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１８０μｌずつ分注した後、誘導されたＨＥＫ－Ｄｕａｌ^ＴＭｈＴＬＲ５（ＮＦ－κＢ／ＩＬ８）細胞培養上澄液を２０μｌずつそれぞれ添加した後、５－３０分間常温で反応させた後、６２０－６５５ｎｍで分光光度計を用いてＳＥＡＰレベルを測定した。

実験結果
１．ＧＶＨＤマウスモデルにおけるＴＬＲ５作用剤によるＧＶＨＤの抑制効果の検証
ＧＶＨＤマウスモデルを誘導した後、本発明のＴＬＲ５作用剤（「ＫＭＲＣ０１１」）によるＧＶＨＤの抑制効果を観察した。薬物の詳しい投与方法としては、授与者マウスにＫＭＲＣ０１１２５μｇ／ｋｇ（▽）、ＫＭＲＣ０１１５０μｇ／ｋｇ（◇）、ＫＭＲＣ０１１１００μｇ／ｋｇ（△）、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）（対照群；■）で前処理および２日間隔で計５回腹腔内注射した。

各グループのマウスは耳に標識を付けて、１週間に２回ずつ体重、姿勢、活動性、毛状態および皮膚密度を評価した。評価実験の結果、図１および図２に示されるように、ＧＶＨＤマウスモデルのうち、ビヒクルグループは、体重が減少し、背中が曲がり、活動性が低下し、毛の様相と皮膚強度に変化が生じた。これに対し、ＫＭＲＣ０１１投与グループでは、前記の症状が著しく減少することを確認することができた。また、ＫＭＲＣ０１１投与グループでは、ビヒクルグループに比べて生存率が大きく伸び、ＧＶＨＤ臨床評価指標において症状が著しく減少することを確認した。

２．ＧＶＨＤマウスモデルにおけるＴＬＲ５作用剤投与後の組織学的評価
ＧＶＨＤマウスモデルに、ＫＭＲＣ０１１を投与した後、動物モデルの腸、肝、皮膚、肺組織を得て、４％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）に固定した後、パラフィンブロックを作り、Ｈ＆Ｅ染色で組織学的所見を分析した。その結果、図３に示されるように、ビヒクルグループの腸では絨毛および粘膜が破壊され、肝および皮膚では炎症性細胞の浸潤所見が現れているのに対し、ＫＭＲＣ０１１を投与したグループでは、正常な組織学的所見と類似することが明らかになった。

３．ＧＶＨＤマウスモデルにおけるＴＬＲ５作用剤の投与によるＩＬ－２２とＩＬ－２３の発現増加および腸幹細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）の保護効果
ＧＶＨＤマウスモデルに、ＫＭＲＣ０１１を投与した後、ＩＬ－２２およびＩＬ－２３の発現レベルおよび腸幹細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）の保護効果を評価した。図４に示されるように、ＴＬＲ５の発現が脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）と皮膚より小腸（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）で最も高く現れ、ＧＶＨＤマウスモデルにＫＭＲＣ０１１を投与した場合、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）でのＩＬ－２２とＩＬ－２３の発現が大きく向上した。また、ＧＶＨＤ動物モデルでは、腸Ｌｇｒ５＋幹細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌＬｇｒ５＋ｓｔｅｍｃｅｌｌ）の減少が見られたが、ＧＶＨＤ動物モデルにＫＭＲＣ０１１を投与したグループでは、Ｌｇｒ５＋幹細胞を効果的に保護することが観察された（図４参照）。

４．本発明のＴＬＲ５作用剤とフラジェリンのＴＬＲ５反応活性の比較結果
ＴＬＲ５遺伝子の形質感染によって生成されたＨＥＫ－Ｄｕａｌ細胞においてＫＭＲＣ０１１とフラジェリンのＴＬＲ５活性化効能を互いに比較した。ＨＥＫ－２９３レポーター細胞を活用して光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）でＩＬ－８反応を確認した。その結果、図５に示されるように、低い濃度で（０．００１～０．０１ｎｇ／ｍｌ）、フラジェリンよりＫＭＲＣ０１１の活性化反応がはるかに高く現れた。これに対し、陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ）であるＬＰＳを処理した場合は、ＴＬＲ５の生物学的活性が観察されなかった（図５）。また、同一の条件でアルカリンホスファターゼ活性（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ、ＡＰ）反応測定方法でＮＦ－κＢ反応を確認した。その結果、図６に示されるように、０．０１ｎｍ／ｍｌの濃度からフラジェリンよりＫＭＲＣ０１１の反応性がより高くなることを確認した。

５．ＧＶＨＤおよびＧＶＴマウスモデルにおけるＴＬＲ５作用剤によるＧＶＨＤの抑制およびＧＶＴの上昇効果の検証
ＫＭＲＣ０１１の投与によるＧＶＨＤの抑制と同時にＧＶＴの上昇効果の極大化効果を検証した。腫瘍を保有した動物モデルであるＧＶＨＤおよびＧＶＴマウスモデルに放射線照射３時間前にＫＭＲＣ０１１を１回腹腔内注射（５０ｕｇ／ｋｇ）した。ＫＭＲＣ０１１を投与しないグループ（ＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃＢＭＴグループ）は、体重が減少し、背中が曲がり、活動性が低下し、毛の様相と皮膚強度に変化が生じてＧＶＨＤが発生したのに対し、ＫＭＲＣ０１１を投与したグループ（ＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃＢＭＴ＋ＫＭＲＣ０１１グループ）では、前記の症状が著しく減少することを確認することができた（図７参照）。

追加的に、生体内蛍光分光分析器（ＩＶＩＳＬｕｍｉｎａＸＲＭＳ）を用いて腫瘍を追跡、観察した。ＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃＢＭＴグループでは、一部腫瘍が確認されたのに対し、ＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃＢＭＴ＋ＫＭＲＣ０１１グループでは、腫瘍が確認されなかった。ＫＭＲＣ０１１は、ＧＶＨＤを抑制すると同時にＧＶＴ効果を上昇させることができる画期的な治療剤であることを立証した（図８参照）。

本発明は、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む移植片対宿主疾患の予防または治療用組成物に関し、本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、優れた移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の治療効果を示す。

Claims

（ｉ）フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤の治療学的有効量；および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、移植片対宿主疾患の治療または予防用薬学的組成物。
前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、フラジェリンのＤ０ドメインおよびＤ１ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片対宿主疾患の治療または予防用薬学的組成物。
前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、Ｄ１ドメインの内部に配列番号１に開示されたアミノ酸配列のリンカーペプチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片対宿主疾患の治療または予防用薬学的組成物。
前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、配列番号２に開示されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片対宿主疾患の治療または予防用薬学的組成物。
前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、宿主由来のＩＬ－２２およびＩＬ－２３の生産を促進させることを特徴とする、請求項１に記載の移植片対宿主疾患の治療または予防用薬学的組成物。
前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、宿主の腸幹細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）の減少を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の移植片対宿主疾患の治療または予防用薬学的組成物。
前記組成物は、移植片対腫瘍効果を増加させることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む、移植片対宿主疾患の改善用機能性食品組成物。
前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、フラジェリンのＤ０ドメインおよびＤ１ドメインを含むことを特徴とする、請求項８に記載の移植片対宿主疾患の改善用機能性食品組成物。
前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、配列番号１に開示されたアミノ酸配列のリンカーペプチドを含むことを特徴とする、請求項８に記載の移植片対宿主疾患の改善用機能性食品組成物。
前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、配列番号２に開示されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載の移植片対宿主疾患の改善用機能性食品組成物。
前記組成物は、移植片対腫瘍効果を増加させることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。