KR20120089996A

KR20120089996A - 페리오스틴의 신규한 용도

Info

Publication number: KR20120089996A
Application number: KR1020110137189A
Authority: KR
Inventors: 이명애; 전정용
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2010-12-20
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2012-08-16
Also published as: US20120156175A1; US9028810B2; KR101339489B1

Abstract

본 발명은 페리오스틴(periostin)의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 페리오스틴(periostin)이 신경줄기세포의 이동을 유도한다는 새로운 기능을 이용한 페리오스틴의 신규한 용도에 관한 것이다.
본 발명은 신경줄기세포를 이용한 암질환의 치료, 신경세포의 재생촉진, 또는 뇌질환 및 신경질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 신경줄기세포를 기반으로 하는 다양한 응용분야에 널리 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 암치료와 관련하여 자살유전자를 발현하는 신경줄기세포를 뇌종양 부위까지 효과적으로 표적화시켜 이동시킴으로써 암재발과 관련된 침윤성 종양세포를 완전히 제거하여 암재발의 가능성을 낮출 수 있는 새로운 치료방법을 제시할 수 있다.

Description

페리오스틴의 신규한 용도 {New use of periostin}

본 발명은 페리오스틴(periostin)의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 페리오스틴(periostin)이 신경줄기세포의 이동을 유도한다는 새로운 기능을 이용한 페리오스틴의 신규한 용도에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 신경줄기세포의 이동을 유도하는 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포를 이용하여 신경질환 및/또는 뇌질환을 치료 및 예방하는 조성물 및 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 신경줄기세포의 이동을 유도하는 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포, 자살유전자를 발현하는 신경줄기세포 및 항암제 전구물질을 포함하는 암치료용 키트, 예를 들어 뇌암 치료용 키트에 관한 것이다.

뇌는 신경줄기세포(neuronal stem cell)의 분열 및 분화, 생존 및 사멸, 그리고 시냅스 형성 등 일련의 과정을 거쳐 체계적인 신경회로망(neural network)을 형성함으로써 복잡한 기능을 수행할 수 있게 된다. 뇌는 다른 장기보다 재생능력이 적어 한 번 손상되면 그 후유증이 매우 심각한 부분이다.

뇌종양을 비롯한 뇌관련 질환이 발생하는 경우 뇌에 큰 손상을 일으키고 재생이 어려워 다른 질환에 비해 환자의 생존율이 매우 낮은 것이 특징이다. 예를 들어, 뇌종양에 대한 기존의 치료법으로는 외과적인 수술에 의한 적출이 가장 효과적이었지만 뇌종양의 종류 및 발생부위에 따라 수술이 불가한 경우가 있으며 완전 적출 시 수술 후 합병증의 위험성이 큰 것으로 나타났다. 또한, 항암제를 이용한 화학요법의 경우에는 뇌혈류 장벽(brain blood barrier)의 존재로 인해 고농도의 항암제 투여가 요구됨에 따라, 심각한 부작용이 유발되는 문제점이 있었다.

이러한 수술적출법이나 화학요법에 대한 대안으로서 유전자 치료법이 제안되고 있다. 유전자 치료법에서는 암세포의 증식을 억제하는 유전자를 암세포에 직접 도입하기 위하여 바이러스 벡터를 사용해야 하지만 모든 암세포에 바이러스 벡터를 도입하는 것은 현실적으로 불가능하여 암재발율이 높은 문제점이 있었고 바이러스 면역독성에 따른 문제점도 제기되었다.

이와 관련하여 최근에는 뇌종양에 대한 친화성이 신경줄기세포 및 중간엽 줄기세포에서 확인되면서 줄기세포를 유전자 전달매체로 사용하는 가능성이 제기되었다 (Aboody et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12846, 2000; Brown et al., Human Gene Therapy, 14:1777, 2003; Tang et al., Human Gene Therapy, 14:1247, 2003; Zhang et al., NeuroImage, 23:281, 2004; Nakamura et al., Gene Therapy, 11:1155, 2004). 이러한 줄기세포를 이용한 뇌종양의 치료방법으로 대장균의 자살유전자인 사이토신 데아미네이즈(CD)를 발현하는 신경줄기세포를 이용하여 신경교종으로 표적화시켰을 때 항암효과가 우수함이 보고되었다(Aboody et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12846, 2000; Brown et al., Human Gene Therapy, 14:1777, 2003). 또한, 대한민국 공개특허 제10-2007-0036289호에서는 자살 유전자를 발현하는 중간엽 줄기세포를 이용한 암 치료용 조성물을 개시하고 있다.

그러나, 전술한 종래의 방법들은 암세포에 대한 표적율이 낮아 암 치료에 한계가 있다는 단점이 있었으며, 특히 암재발과 관련된 침윤성 종양세포(infiltrating tumor cell)에 대한 치료효과는 만족스럽지 못해 암의 재발을 효과적으로 방지하지 못하는 단점이 있었다. 또한, 전술한 종래 기술들은 단순히 줄기세포의 뇌종양에 대한 친화성만을 확인한 것으로서, 줄기세포를 뇌종양 부위까지 효과적으로 표적화시켜 이동시키기 위한 표적화 물질을 구체적으로 제안한 것은 아니었다.

한편, 페리오스틴은 OSF-2라고도 불리는데, 원래 골아세포로부터 분리된 단백질로, 골아세포 보충, 부착 및 퍼짐(spreading)에 관여하는 것으로 알려져 있으며(국제공개공보 제WO/2005/062055호), 성숙된 심근세포로 하여금 세포분열을 일으켜 새로운 심근세포의 생산을 유도하며, 분리된 페리오스틴은 뼈막과 치주인대에 조직 특이적으로 발현되며 그 발현이 TGF-베타에 의해 조절된다고 알려져 있다(Johnson & Lancero, 1999).

또한, 페리오스틴의 암전이 바이오마커로서의 가능성이 보고되고 있다 (Wei Wan & Rong Shao, J. Biol. Chem., 281(28):19700, 2006). 페리오스틴은 여러 암 세포에서 분비되는 단백질로 알려져 있다. 즉, 소결장 암 (Bao et al., 2004), 유방암 (Shao et al., 2004), 폐암 (Sasaki et al., 2001), 췌장암 (Baril et al., 2007) 및 난소암 (Gillan et al., 2002)에서 분비되는 것이 보고된 바가 있다. 또한, 손상된 심장 조직에서 내피 세포의 분화 및 손상부위로의 이동을 촉진시키기 위해 페리오스틴의 발현 정도가 높아진 것이 보고된 바가 있으며 (Lindner et al., 2005) 암의 전이, 침윤, 전파 및 생존에 관여한다는 것 또한 보고된 바가 있다 (Kanno et al., 2008). 그러나, 페리오스틴이 신경줄기세포의 이동을 유도하는 기능을 가지고 있다는 것은 아직 보고된 바가 없다.

본 발명자들은 신경줄기세포의 이동유도물질을 규명하여 다양한 분야의 신경줄기세포 연구에 적용될 뿐만 아니라 효율성이 증대된 신경질환, 뇌질환, 뇌암 등의 치료제에 응용될 수 있는 신경줄기세포의 이동유도 물질을 제공하고자 예의 노력한 결과, 종양조직으로부터 페리오스틴을 분리하고 페리오스틴의 신경줄기세포 이동 유도능을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

대한민국 공개특허공보 제10-2007-0036289호 (2007.04.03)

Aboody et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12846, 2000 Brown et al., Human Gene Therapy, 14:1777, 2003 Tang et al., Human Gene Therapy, 14:1247, 2003 Zhang et al., NeuroImage, 23:281, 2004 Nakamura et al., Gene Therapy, 11:1155, 2004 Wei Wan & Rong Shao, J. Biol. Chem., 281(28):19700, 2006

본 발명은 페리오스틴(periostin)이 신경줄기세포의 이동을 유도한다는 새로운 기능을 이용하여 페리오스틴의 신규한 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.

구체적으로, 본 발명은 신경줄기세포의 이동을 유도하는 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포를 이용하여 신경질환 및/또는 뇌질환을 치료 및 예방하는 조성물 및 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 신경줄기세포의 이동을 유도하는 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포, 자살유전자를 발현하는 신경줄기세포 및 항암제 전구물질을 포함하는 암치료용 키트, 예를 들어 뇌암 치료용 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.

다른 방법으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

한편, 본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"줄기세포(stem cells)"란 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 예를 들어 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.

"신경줄기세포(neural stem cells)"란 신경세포와 관련한 뉴런, 희돌기세포, 성상세포로 분화할 수 있는 능력을 가지는 동시에 자체재생능력(self-renewal)을 갖는 줄기세포를 말한다. 이러한 신경줄기세포는 in vitro 시험에서 뉴로스피어(neurosphere)라고 불리는 특징적 소견을 나타내는데, 이는 신경줄기세포의 표지인 네스틴(nestin)에 반응함으로써 형성되는 신경줄기세포 덩어리이다(Gage, F.H., Science, 287:1433, 2000).

"자살 유전자"는 인체에 무해한 전구약물(prodrug)을 악성종양세포에 대한 독성을 지닌 항암물질로 전환하는 기능을 가진 유전자로서, 자살유전자를 가지고 있는 줄기세포를 암세포로 표적화하면 암세포를 사멸시키는 것이 가능하게 한다. 이때 암세포에 대해서만 표적화되고 자살유전자를 가지고 있는 줄기세포는 암세포에서만 전구약물을 항암물질로 변환시키기 때문에 정상 세포에는 무해하고 암세포만 파괴하여 암 치료에 효율적으로 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예의 암치료용 키트는 신경줄기세포의 이동을 유도하는 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포와, 자살유전자 또는 암억제 유전자를 발현하는 신경줄기세포를 포함한다.

본 발명의 일실시예의 암치료용 키트는 상기 자살유전자에 의해 항암물질로 전환되는 항암제 전구물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 페리오스틴은 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 종양세포에서 분비되는 것을 특징으로 할 수 있다. 페리오스틴은 OSF-2라고도 불리는데, 원래 골아세포로부터 분리된 단백질로서, 골아세포 보충, 부착 및 퍼짐(spreading)에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 페리오스틴은 폐암, 난소암, 유방암 등 종양조직에서 과발현되는 단백질 중 하나로 알려져 있고, 본 발명에서는 뇌종양조직에서 페리오스틴이 과발현된 것을 확인하였다.

페리오스틴은 정상 뇌조직과 대비하여, 뇌종양 조직에서만 발현되는 것으로 확인되었으며, 특히 정상 뇌조직으로의 침투율 및 뇌암 제거 수술 이후 뇌암의 재발율을 증가시키는 악성 종양에서만 과발현되는 것을 확인하였다. 본 발명은 이러한 페리오스틴의 특성을 역발상으로 이용한 것으로서, 페리오스틴을 과발현하는 세포주를 제작하고 이를 이용하여 자살 유전자 또는 암억제 유전자를 발현하는 신경줄기세포가 암세포로 많이 이동하게 함으로써 뇌암과 같은 암조직으로의 효과적인 표적화를 통해 암재발과 관련된 침윤성 종양세포(infiltrating tumor cell)를 완전히 제거하여 암재발의 가능성을 낮출 수 있는 새로운 치료방법을 제시할 수 있다.

예를 들어, 페리오스틴을 분비하는 세포는 자연 상태에서 페리오스틴을 분비하는 세포, 즉 골아세포 등일 수 있으며, 바람직하게는 일반 세포에 페리오스틴 유전자를 도입한 재조합 세포일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 293T 세포에 pCL-Ampho 벡터 및 페리오스틴 유전자를 코딩하는 pCXbsr-POSTN 벡터 (Shiga University, Dr. Inoue 제공)를 이용하여 페리오스틴 유전자가 도입된 세포주를 제작하였다.

본 발명의 일실시예의 암치료용 키트는 뇌종양, 폐암, 유방암 및 난소암 등 각종 암질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예의 암치료용 키트에 있어서, 상기 자살 유전자로는 HSV-TK(Herpes simplex virus-thymidine kinase), 사이토신 데아미네이즈(cytosine deaminase, CD) 등을 사용할 수 있다.

현재 자살 유전자를 이용하여 종양세포를 파괴함으로써 암을 치료하는 방법의 일환으로서, 다양한 자살 유전자와 전구물질의 조합 시스템이 보고되어 있는데, 가장 많이 사용되고 있는 방법은 HSV-TK 자살 유전자와 GCV(ganciclovir, 9-[(1,3-dihydroxy-2-propoxy)methyl]guanine)를 이용하는 방법이다. 상기 HSV-TK/GCV 시스템은 종양세포에 HSV-TK 유전자를 도입하고 GCV를 처리하면, 발현된 HSV-TK에 의하여 GCV가 종양세포의 DNA 중합효소의 기능을 저해하거나, 종양세포의 DNA 내로 삽입되어 DNA 복제를 방해함으로써 종양세포 사멸을 유도하게 된다(Frank et al., J. Biol. Chem., 259:1566, 1984).

또한, 사이토신 데아미네이즈는 5-FC(5-fluorocytosine)를 세포 독성이 큰 항암제인 5-FU(5-fluorouracil)로 전환시키는 기능이 있는데, 5-FU는 전신 투여시 세포 독성이 매우 커서 부작용이 크지만 자살 유전자와 5-FC를 이용하면 자살 유전자가 있는 근처에서만 5-FU의 농도가 높아지며, 그 결과 5-FU의 항암 효과가 암세포 주변에서 국소적으로 나타나게 된다 (Bourbeau et al., J. Gene Med., 6:1320, 2004).

한편, 본 발명의 일실시예의 암치료용 키트에 있어서, 상기 암억제 유전자는 암세포의 성장을 억제하는 것으로 알려진 유전자라면 모두 사용가능하며, 예를 들어 PEX, Trail, IFN-β등을 사용할 수 있다.

자살 유전자 또는 암억제 유전자는 이를 포함하는 바이러스 벡터, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 이용하여 당해 기술분야에서 알려진 유전자 도입 기술에 따라 신경줄기세포에 도입할 수 있다. 자살 유전자 또는 암억제 유전자를 레트로바이러스 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제작한 후 상기 벡터를 포장(packaging) 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하고, 상기 형질전환체를 배양한 다음 여과하여 수득한 레트로바이러스 용액을 이용하여 신경줄기세포를 감염시킴으로써 신경줄기세포에 자살 유전자 또는 암억제 유전자를 도입할 수 있다. 이후, 상기 레트로바이러스 벡터에 포함된 선별 마커를 이용하여 자살 유전자 또는 암억제 유전자를 지속적으로 발현하는 신경줄기세포를 수득할 수 있다.

본 발명의 일실시예의 신경질환 또는 뇌질환을 치료 및 예방하는 조성물은 신경줄기세포의 이동을 유도하는 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포와, 신경줄기세포를 포함한다.

본 발명의 일실시예의 신경질환 또는 뇌질환을 치료 및 예방하는 조성물에 있어서, 상기 신경질환은 신경손상을 포함하는 개념으로서, 신경질환으로는 뇌질환, 말초신경손상, 근위축성 축색 경화증 및 말초신경질환 등을 예시할 수 있다. 또한, 상기 뇌질환은 뇌종양, 뇌손상을 포함하는 개념으로서, 치매, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 간질, 중풍, 뇌졸증, 허혈성 뇌질환, 뇌종양 및 퇴행성 뇌질환 등을 예시할 수 있다.

줄기세포가 성체의 뇌에서 발생분화하는 과정은 바로 재생(regeneration)과정이라 할 수 있는데, 신경줄기세포는 분열하여 과립세포로 되며 이 세포들이 분화하여 기능을 가질 수 있다고 알려져 있다. 신경줄기세포의 발생과 분화를 증진하여 신경재생을 촉진하기 위한 연구가 다수 이루어져 왔으며, 신경성장인자를 과발현시켜 신경줄기세포의 분화를 촉진하는 방법, 우고닌 등 기타 신경줄기세포 분화 촉진 물질을 포함하여 투여하는 방법 (대한민국공개특허 제10-2004-0013997호 등) 및 신경줄기세포의 재생 및 분화를 촉진하는 유전자가 도입된 신경줄기세포를 이용하는 방법(대한민국공개특허 제10-2006-0093269호 등) 등이 신경세포의 재생을 촉진하기 위한 방안으로서 당업계에 알려져 있다.

따라서, 신경줄기세포, 더욱 바람직하게는 신경줄기세포의 발생 및 분화를 촉진하기 위한 유전자 등을 포함한 신경줄기세포를 본 발명의 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포와 함께 투입하는 경우 타겟목적성이 향상되어 조직특이적으로 신경세포의 재생을 촉진할 수 있게 된다. 즉, 순차적으로 또는 동시에 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포를 신경줄기세포의 재생이 요구되는 위치에 주입한 후 신경줄기세포를 체내에 투입하는 경우, 신경줄기세포가 페리오스틴을 향해 표적화되어 이동하여 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포가 주입된 부위에서 신경세포의 재생이 촉진될 수 있다. 더욱 바람직하게는 페리오스틴이 일정한 기간 동안 지속적으로 분비되도록 오스모틱 펌프(osmotic pump) 등을 이용하여 환부에 주입할 경우, 신경줄기세포가 페리오스틴 부위로 이동하여 그 부위에서의 신경세포의 재생이 촉진되도록 할 수 있다.

한편, 신경질환의 경우 치료 및 회복이 매우 어려운 것으로 알려져 있어, 주로 신경이식이 질환치료와 손상된 신경 조직의 복구 및 기능 회복을 위해 사용되어 왔다(Bjorklund, Nature, 362:414, 1993; Olson, Nature Med., 3:1329, 1997; Spencer et al., N. Engl. J. Med., 327:1541, 1992: Freed et al., N. Engl. J. Med., 327:1549, 1992; Kordower et al., N. Engl. J. Med., 332:1118, 1995; Defer et al., Brain, 119:41, 1996; Lopez-Lozano et al., Transp. Proc., 29:977, 1997; Rosenstein, Exp. Neurol., 33:106, 1995; Turner et al., Neurosurg., 33:1031, 1993; Kang et al., J. Neurosci., 13:5203, 1993; Andersson et al., Int. J. Dev. Neurosci., 11:555, 1993; Sanberg et al., Nature Med., 3:1129, 1997). 일례로, 파킨슨씨병을 가진 일련의 인간 환자들이, 인간 태아의 6주 내지 9주 낙태아로부터 수득한 중뇌 세포의 신경이식에 의해 치료되어 왔다 (Spencer et al., N. Engl. J. Med., 327:1541, 1992: Freed et al., N. Engl. J. Med., 327:1549, 1992; Kordower et al., N. Engl. J. Med., 332:1118, 1995; Defer et al., Brain 119:41, 1996; Lopez- Lozano et al., Transp. Proc., 29:977, 1997). 이와 관련하여 전술한 바와 같은 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포와 신경줄기세포를 환부에 주입할 경우 신경줄기세포가 페리오스틴 분비부위로 이동하여 그 부위에서의 신경세포의 재생이 촉진되도록 할 수 있으므로 이러한 신경세포의 재생 촉진능이 신경질환의 치료에 보다 효율적으로 응용될 수 있다.

본 발명의 페리오스틴을 분비하는 세포와 신경줄기세포을 포함하는 조성물은 통상의 줄기세포 치료제 투여방법을 이용하여 투여될 수 있고, 바람직하게는 주사용 제제로서 제조하여 투여할 수 있다.

본 발명의 페리오스틴을 분비하는 세포와 신경줄기세포를 포함하는 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 500mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 250mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 가장 바람직한 투여 양태는 암 종양 제거 수술 이후에 수술부위에 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포를 투여하여 신경줄기세포의 이동성을 유도하여 남아있는 암세포들의 효율적인 제거를 꾀하는 투여 방법일 것이다.

본 발명의 페리오스틴을 분비하는 세포와 신경줄기세포를 포함하는 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 직장 내 투여, 자궁 내 경막 투여 또는 뇌혈관 내 투여 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 후술하는 실시예에서는 신경줄기세포주로서 HB1.F3, HB1.F5만을 예시하였으나, 기타 다른 신경줄기세포를 사용할 수 있음은 물론이다.

본 발명에 따르면 페리오스틴(periostin)이 신경줄기세포의 이동을 유도한다는 새로운 기능을 이용하여 다양한 페리오스틴의 신규한 용도를 제공할 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 신경줄기세포의 이동을 유도하는 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포를 이용하여 신경질환 및/또는 뇌질환을 치료 및 예방하는 조성물 및 키트를 제공할 수 있으며, 또한 신경줄기세포의 이동을 유도하는 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포, 자살유전자를 발현하는 신경줄기세포 및 항암제 전구물질을 포함하는 암치료용 키트, 예를 들어 뇌암 치료용 키트를 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명은 신경줄기세포를 이용한 암질환의 치료, 신경세포의 재생촉진, 또는 뇌질환 및 신경질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 신경줄기세포를 기반으로 하는 다양한 응용분야에 널리 사용될 수 있다.

특히, 본 발명은 암치료와 관련하여 자살유전자를 발현하는 신경줄기세포를 뇌종양 부위까지 효과적으로 표적화시켜 이동시킴으로써 암재발과 관련된 침윤성 종양세포(infiltrating tumor cell)를 완전히 제거하여 암재발의 가능성을 낮출 수 있는 새로운 치료방법을 제시할 수 있다.

도 1은 종양세포에서 과발현되는 14개의 신경줄기세포 이동유도물질 후보에 대한 mRNA 정량 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 정상 뇌조직 및 뇌종양조직에서의 페리오스틴의 발현여부를 확인하기 위해 면역염색 후 광학현미경으로 촬영한 사진이다.
도 3은 페리오스틴(POSTN) 또는 VEGF에 의한 신경줄기세포 이동수 증가를 농도에 따라 측정한 그래프이다.
도 4는 페리오스틴에 의해 이동된 신경줄기세포를 시간의 경과에 따라 현미경으로 촬영한 사진(A, C)과 페리오스틴에 의한 신경줄기세포 이동수 증가를 시간의 경과에 따라 측정한 그래프(B, D)이다.
도 5는 신경줄기세포에서 인테그린 서브유닛이 발현되는 것을 확인 및 정량한 결과를 도시한 도면이다.
도 6은 페리오스틴이 신경줄기세포의 이동을 유도하는데 있어서, PI3K 신호 경로에 의해 매개되는지를 검증하기 위해서 수행한 각 단계에 대한 웨스턴 블롯 (western blot) 결과를 도시한 도면이다.
도 7A는 MEK/ERK 저해제 또는 CDK5 저해제의 처리시 세포 이동수를 측정하여 도시한 그래프이고, 도 7B는 대조군, VEGF, 페리오스틴, 페리오스틴 및 저해제 처리시 세포 내의 DCX와 ERK의 위치 및 발현량의 변화를 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 8A 및 도 8B는 페리오스틴 과발현 세포주 제작 방법과 제한효소를 이용한 벡터의 확인 결과를 도시하고 있고, 도 8C는 ELISA 어세이 결과를 도시한 그래프이며, 도 8D는 웨스턴 블로팅 결과 사진이다.
도 9는 형광물질이 표지된 신경줄기세포(F3)를 동측(ipsi-lateral)으로 이식한 후 시간경과에 따라 신경줄기세포가 페리오스틴 발현 세포(POSTN-NIH3T3) 방향으로 이동하는 현상을 공초점 레이저 주사 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 10은 형광물질이 표지된 신경줄기세포(F3)를 반대측(contra-lateral)으로 이식한 후 시간경과에 따라 신경줄기세포가 페리오스틴 발현 세포(POSTN-NIH3T3) 방향으로 이동하는 현상을 공초점 레이저 주사 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 11A는 F3 세포와 F3-CD 세포에서 CD 유전자의 발현여부를 확인한 웨스턴 블롯팅 사진이고, 도 11B 내지 도 11D는 F3 세포와 F3-CD 세포에서 5-FC가 5-FU로 전환되는 양을 HPLC 분석을 통하여 비교함으로써 CD 유전자 효소활성을 확인한 결과 그래프들이다.
도 12는 자살유전자(CD 유전자)를 발현하는 신경줄기세포 주위 세포의 사멸효과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 13은 동측(ipsi-lateral)으로 쥐의 뇌에 이식된 자살유전자 발현세포(F3-CD)가 페리오스틴 발현 세포(POSTN-NIH3T3) 방향으로 효과적으로 이동되어 세포를 사멸시키는 생체내(In vivo) 제3자 효과(bystander effect)를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 14는 C6 쥐 신경교종 모델에서 쥐의 뇌에 이식된 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD)가 페리오스틴 발현 세포(POSTN-NIH3T3) 방향으로 효과적으로 이동되어 신경교종세포(C6)를 사멸시키는 치료효과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 15는 페리오스틴 발현 세포(P-NIH3T3)가 이식된 C6 쥐 신경교종 모델에 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD)를 추가로 이식한 후 5-FC로 처리할 경우 암 세포의 침윤이 억제되는 것을 근접 촬영한 사진으로, 도 15A는 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD) 이식 후 7일이 경과한 시점으로부터 2주 간 5-FC를 처리한 경우의 사진이고, 도 15B는 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD) 이식 후 10일이 경과한 시점으로부터 2주 간 5-FC를 처리한 경우의 사진이다.
도 16은 C6 쥐 신경교종 모델을 5개 그룹(A, B, C, D, E)으로 나누고 각 그룹별로 측정한 생존 그래프이다. 그룹 A는 HBSS 및 증류수를 투여한 그룹이고, 그룹 B는 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD) 및 증류수를 투여한 그룹이며, 그룹 C는 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD) 및 5-FC를 투여한 그룹이며, 그룹 D는 페리오스틴 발현 세포(P-NIH3T3)(0.5×), 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD) 및 5-FC를 투여한 그룹이고, 그룹 E는 페리오스틴 발현 세포(P-NIH3T3)(2×), 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD) 및 5-FC를 투여한 그룹이다.
도 17은 C6 쥐 신경교종 모델 그룹 A, 그룹 B, 그룹 C, 그룹 D 및 그룹 E에 대해 시간의 경과에 따른 종양 부피 변화를 나타내는 그래프이다.
도 18은 C6 쥐 신경교종 모델 그룹 A, 그룹 C 및 그룹 E에 대해 시간의 경과에 따라 촬영한 PET 사진이다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.

실시예 1: 페리오스틴의 분리 및 종양조직 특이적 발현 확인

실시예 1-1: 페리오스틴의 분리

아주대학교 병원에서 입수(M.D. K. Cho 제공)한 하기 표 1의 3명의 환자 뇌종양조직에 Trizol 시약 (Invitrogen)을 처리하여 총 RNA를 추출해 RNA 샘플을 준비하였다. Trizol 시약을 처리한 후, 각 조직으로부터 RNA 샘플을 추출한 다음 인간 U 133 플러스 2.0 유전자칩 올리고 마이크로어레이(human U 133 Plus 2.0 GeneChip Oligo Microarrays, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 높게 발현되는 분비 유전자들을 조사하였다.

Tumor	Gender	Age	Histology	Up-regulated gene number	Down-regulated gene number
1	M	32	신경교종(Glioma)	4491	3758
2	F	50	신경초종(Schwanoma)	4775	5087
3	M	63	뇌실막세포종(Ependyroma)	6119	6824

조사 결과 총 14개의 후보군(CXCL10, CYR61, FN1, GLIPR1, GPX3, HLA-DQB1, POSTN, PROS1, SFRP4, TIMP1, TIMP2, TNC, TNFRSF1A 및 TNFSF13B)이 정상 조직에 비하여 종양조직에서 2배이상 과발현되고 종양발생과정과 관련이 있는 유전자들임을 확인하였다 (표 2 참조).

Probe ID	Gene symbol	유전자 기능	Fold change
Probe ID	Gene symbol	유전자 기능	Tumor 1	Tumor 2	Tumor 3
Hs.413924	CXCL10	lymphocyte trafficking	3.76	3.16	4.27
Hs.8867	CYR61	cell proliferation, angiogenic factor	2.08	3.23	6.43
Hs.553516	GLIPR1	cell proliferation, invasion, antiapoptic effect	1.53	3.25	5.16
Hs.386793	GPX3	antioxidative function	3.16	2.97	5.20
Hs.409934	HLA-DQB1	immune response	2.08	6.51	6.96
Hs.438102	IGFBP2	regulation of tumor growth and invasion	5.04	1.66	6.07
Hs.136348	POSTN	induce cell migration and angiogenesis	4.19	4.13	7.79
Hs.64016	PROS1	Anti-coagulation	3.84	2.19	8.00
Hs.105700	SFRP4	inhibit cell proliferation	2.74	3.37	4.83
Hs.522632	TIMP1	Anti-apoptosis, induce cell growth	2.25	2.26	4.38
Hs.104839	TIMP2	Anti-angiogenesis	2.32	2.07	3.38
Hs.143250	TNC	cell proliferation, migration	2.15	7.21	3.87
Hs.279594	TNFRSF1A	Apoptosis	2.80	2.32	2.68
Hs.525157	TNFSF13B	related with tumor genesis gene	2.69	5.13	3.09

상기한 바와 같은 결과로부터 얻어진 과발현 유전자 후보군에 대해 정량 리얼타임(Real-Time) PCR을 수행하였다. 전체 RNA (50ng)에 대해 Taqman 리버스 시약 (Taqman Reverse Reagent)(Applied Biosystems, Foster City, CA, US)을 사용하여 cDNA를 제조하였다. Taqman 유니버설 PCR 마스터 믹스(Taqman Universal PCR Master Mix)와, 14개 과발현 유전자 후보군 및 양성 대조군 GAPDH의 프라이머(Applied Biosystems, US : Probe ID는 아래 표 3 참조)를 함유한 PCR 반응물에 대해 PCR 과정을 진행하고 Taqman 유전자 발현 분석법(Taqman Gene Expression assay)으로 PCR 결과물을 분석하였다.

PCR은 다음과 같은 사이클로 수행하였다: 50℃에서 2분간 인큐베이션; 95℃에서 10분간 AmpliTaq 증폭한 후, 95℃에서 15초간 단일가닥으로 분리하고, 60℃에서 1분간 어닐링하는 사이클 40회 반복. 각 주형에 대한 PCR 반응은 1 유전자 프라이머 쌍에 대해 하나의 96웰 디쉬(dish)를 사용하여 수행되었다. 과발현 유전자 후보군 각각의 발현량은 상대적 C_T법 (Livak and Schmittgen, 2001)을 사용하여 정량하였으며, 과발현 유전자 후보군의 정량을 위해 아주대학교 병원에서 입수한(M.D. K. Cho 제공) 하기 표 4와 같은 환자의 뇌종양 조직이 사용되었다.

유전자명	Probe ID
CXCL10	Hs 00171042. m1
CYR61	Hs 00155479. m1
FN1	Hs 00415006. m1
GLIPR1	Hs 00199268. m1
GPX3	Hs 00173566. m1
HLA-DQB1	Hs 00109790. m1
POSTN	Hs 00170815. m1
PROS1	Hs 00165590. m1
SFRP4	Hs 00180066. m1
TIMP1	Hs 00171558. m1
TIMP2	Hs 00234278. m1
TNC	Hs 00233648. m1
TNFRSF1A	Hs 00533568. g1
TNFSF13B	Hs 00198106. m1

Tumor	Gender	Age	Histology
Tumor1	F	59	Adenoma
Tumor2	F	56	Adenoma
Tumor3	F	36	Choroidplexuspapilloma
Tumor4	M	36	Meningotheliomatousmeningioma
Tumor5	F	48	Meningioma
Tumor6	M	45	Fibroblasticmeningioma
Tumor7	F	46	Fibroblasticmeningioma
Tumor8	F	56	Meningioma
Tumor9	M	63	Schwannoma
Tumor10	M	45	Anaplasticoligodendroglioma
Tumor11	M	33	Glioblastoma

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 양성 대조군으로 사용한 GAPDH에 비해 악성종양조직 특이적으로 높게(약 4배 이상) 발현되는 단백질로서 페리오스틴(POSTN)이 확인되었다.

한편, NCBI Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)에서 과발현된 단백질인 페리오스틴의 유전자 정보를 이용하여 아미노산 서열을 확인하였으며( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10631), 총 4개의 이소폼(isoform)을 가지고 있는 페리오스틴의 아미노산 서열은 첨부된 서열목록의 서열번호 1 내지 서열번호 4와 같다.

실시예 1-2: 페리오스틴의 종양조직 특이적 발현 확인

실시예 1-1과 같이 분리된 페리오스틴이 정상 뇌조직과 대비하여 뇌종양조직 특이적으로 발현되는지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

아주대학교 병원에서 입수된 환자의 뇌종양 조직과 정상 뇌조직을 0.1M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)에 녹인 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정한 후, 0.1M 포스페이트 버퍼에 녹인 30% 수크로오스에 침지하여 4℃에서 하룻밤 동안 놓아둔 다음, OCT 화합물로 동결시켰다. 크라이오스탯(cryostat)(KORF Instrum 900)에서 상기 동결된 샘플을 30㎛의 두께로 절단하였다. 상기 절단된 샘플을 PBS로 세척한 후, PBS에 녹인 0.5% 염소 혈청(goat serum) 및 0.5% triton X-100 용액으로 30분 동안 블로킹(blocking)한 다음, 15분 동안 PBS에 녹인 0.5% BSA(bovine serum albumin)로 2회 세척하였다. 이후, 1:100으로 희석한 토끼의 다클론성 인간 페리오스틴(rabbit polyclonal human Periostin) 항체(BioVender)를 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 비오틴이 결합된 2차 항체를 상온에서 2시간 동안 1차 항체와 결합시키고 ABC 키트(Vector사)와 디아민벤지딘 퍼옥시데이즈(diaminbenzidin peroxidase, DAB) 키트를 이용하여 페리오스틴을 면역염색하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 페리오스틴은 정상 뇌조직에서는 발현되지 않으나, 뇌종양조직에서는 특이적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 뇌종양 중 양성종양에서는 페리오스틴의 발현 수준이 낮은 반면에 악성종양에서는 페리오스틴의 발현이 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 도 1의 리얼타임 PCR 결과와 일치하는 것이었다. 도 2 중 도 2A 및 도 2B는 정상 뇌조직을 관찰한 결과를 나타내고, 도 2C 내지 도 2E는 악성뇌종양을 관찰한 결과를 나타내며, 도 2F의 사진 결과는 양성뇌종양조직을 관찰한 결과를 나타낸다.

실시예 2: 시험관내( in vitro) 에서 페리오스틴에 의한 신경줄기세포의 이동능 확인

실시예 2-1: 페리오스틴 처리 농도에 따른 신경줄기세포의 이동능 확인

페리오스틴이 신경줄기세포의 이동에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 본 발명자의 실험실에서 보유하고 있는 인간 신경줄기세포주 2개주 (HB1.F3, HB1.F5)를 이용한 보이덴 챔버 어세이(Boyden Chamber Assay)를 수행하여 시험관내(in vitro)에서 인간 신경줄기세포가 페리오스틴에 반응하여 이동하는지 여부를 확인하였다. VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)를 양성 대조군으로 사용하였고, FBS-DMEM 배지를 음성 대조군으로 사용하였다.

배양된 신경줄기세포를 0.05% 트립신으로 분리한 후 DMEM 배지로 세척하였고, DMEM 배지에 재현탁시킨 후, 5×10⁴ 개의 세포를 10% FBS를 포함한 200㎕ DMEM 배지에서 상부 챔버 (Costar Transwell)로 접종하였다. 하루 후, 하부 챔버에 각각 페리오스틴 또는 VEGF를 농도 별로 처리하였다. 페리오스틴의 농도는 5, 10, 20 ㎍/㎖로 준비하였고, VEGF의 농도는 5, 10, 20 ng/㎖로 준비하였다. 10% FBS-DMEM 배지를 음성대조군으로 사용하였다. 그리고 하부 챔버의 자극에 반응하여 상부 챔버에서 8 ㎛ 공극폴리카보네이트 막을 가로질러 막의 하부로 이동한 세포의 수를 비교하기 위하여, 12시간 후, 이동한 신경줄기세포를 헤마토실린으로 염색하였고 그 수를 계수하였다.

그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이 2종류의 신경줄기세포주(HB1.F3, HB1.F5) 모두 페리오스틴에 반응하여 신경줄기세포들이 막의 하부로 이동한 것을 관찰할 수 있었다. 도 3A에 나타난 바와 같이, HB1.F3 세포의 경우 신경줄기세포의 이동 유도능력이 페리오스틴을 처리하지 않는 경우에 비해 100% 가량 증가됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 페리오스틴에 의한 신경줄기세포의 이동 유도능력 증가율(100%)이 VEGF에 의한 이동 유도능력 증가율 (25%) 보다 4배 가량 높은 결과임을 나타내므로, 이로부터 양성대조군으로 사용한 VEGF 보다 페리오스틴이 우수한 신경줄기세포의 이동 유도능력을 나타내는 물질임을 확인할 수 있었다.

또한, VEGF는 농도가 5ng/ml일 때 이동 유도능력이 가장 높았으며, 페리오스틴은 농도가 10㎍/㎖일 때, 이동 유도능력이 가장 높은 것을 확인하였다. 한편, HB1.F5 세포의 경우, VEGF와 페리오스틴에 의한 이동 유도능력 증가율이 비슷하게 나타났으나, 페리오스틴을 처리하였을 때 이동 유도능력 증가율이 약간 높은 것으로 확인되었다(도 3B 참조).

따라서, 시험관내(in vitro)에서 보이덴 챔버 분석(Boyden Chamber Assay)을 수행한 결과 페리오스틴은 신경줄기세포의 이동을 유도하는 물질임이 확인되었다. 페리오스틴은 이동 유도능력이 뛰어나며, 특히 기존에 알려진 줄기세포 이동유도 물질인 VEGF 보다 신경줄기세포의 이동 유도능력 증가율이 높은 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 페리오스틴은 줄기세포의 이동 유도에 있어서 중요한 인자임을 확인할 수 있었다. 또한, 페리오스틴은 농도가 10㎍/ml일 때 신경줄기세포의 이동 유도능력이 가장 높았고, 시간이 경과하여도 신경줄기세포의 이동성을 유지시켰다.

실시예 2-2: 페리오스틴 처리 후 시간 경과에 따른 신경줄기세포의 이동능력 확인

페리오스틴 처리 후 시간 경과에 따른 신경줄기세포의 이동수 비교를 통한 이동능을 확인하기 위하여, 전술한 바와 같은 2종류의 신경줄기세포주에 대해 배양된 신경줄기세포를 0.05% 트립신으로 분리한 후 DMEM 배지로 세척하였고, DMEM 배지에 재현탁시킨 후, 5×10⁴ 개의 세포를 10% FBS를 포함한 200㎕ DMEM 배지에서 상부 챔버 (Costar Transwell)로 접종하였다. 하루가 경과한 후, 하부 챔버를 10㎍/㎖의 페리오스틴으로 처리하였고, 그 후 4시간, 8시간, 12시간, 24시간이 경과한 시점에 이동한 세포들을 H&E(헤마토실린&에오신)로 염색하여 세포의 수를 계수하였으며, 사진을 찍어 확인하였다(Olympus BX51, Japan).

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 시간의 경과에 따라 2종류의 신경줄기세포주 모두 동일한 이동 패턴을 나타냈으며, 시간의 경과에 따라 이동능이 증가함을 확인할 수 있었다. 도 4A와 도 4C의 염색된 사진에서도 시간의 경과에 따라 이동한 세포가 늘어나는 것이 확연히 관찰되었고, 이동한 세포들을 염색하여 계수한 결과 또한 현미경 사진과 일치함을 확인할 수 있었다(도 4B 및 도 4D 참조).

따라서, 페리오스틴의 처리 후 시간이 경과함에 따라 더 많은 수의 줄기세포들이 이동하였는데, 이는 페리오스틴이 줄기세포를 강하게 이동을 유도할 수 있는 유용한 물질임을 증명한다고 할 수 있다.

실시예 3: 페리오스틴에 의한 신경줄기세포의 이동능 활성 대사경로 확인

실시예 3-1: 페리오스틴 인식 수용체의 확인

페리오스틴은 인테그린 알파와 인테그린 베타로 이루어진 복합체에 결합하는 것이 알려져 있으며, 세포 이동과 관련하여 인테그린 알파V베타3, 알파V베타5, 알파6베타4 복합체가 수용체로 작용한다고 알려져 있다. 따라서, HB1.F3 신경줄기세포에서 어떠한 복합체가 페리오스틴 수용체로 기능하는지를 역전사 PCR (RT-PCR)과 마이크로어레이 칩을 통하여 확인하였다.

RT-PCR 과정은 다음과 같이 수행하였다. 우선, F3 신경줄기세포에서 Trizol 시약(Invitrogen)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였고, 이러한 전체 RNA, 슈퍼스크립트II(SuperscriptII)(Invitrogen) 및 12-18mer 올리고 dT가 포함된 반응 혼합용액을 42℃에서 50분간 인큐베이션하고 72℃에서 15분간 인큐베이션한 후 당업계에 알려진 방법을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 그리고 나서, 5㎕ 10X PCR 버퍼, 1.5mM MgCl₂, 0.2mM 데옥시리보뉴클레오시드-트리포스페이트, 50pmol 프라이머, 1U Tag DAN 폴리머라아제(Invirogen) 및 150ng의 cDNA(주형)을 포함하는 50㎕의 PCR 반응용액을 준비하였다. PCR 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 45초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초의 사이클 25~30회 반복; 72℃에서 10분 동안 최종 연장. 각각의 인테그린 서브유닛 증폭을 위한 프라이머 서열은 하기 표 5에 표시된 바와 같다.

유전자	프라이머 서열	F/B	서열번호
인간인테그린αV	5'-ACT GGG AGC ACA AGG AGA ACC-3'	Forward	서열번호5
인간인테그린αV	5'-CCG CTT AGT GAT GAG ATG GTC-3'	Backward	서열번호6
인간인테그린β1	5'-CTG CAA GAA CGG GGT GAA TG-3'	Forward	서열번호7
인간인테그린β1	5'-CAC AAT GTC TAC CAA GCC C-3'	Backward	서열번호8
인간인테그린β2	5'-CAA GCT GGC TGA AAA CAA CA-3'	Forward	서열번호9
인간인테그린β2	5'-ACT GCT CCT GGA TGC ACT CT-3'	Backward	서열번호10
인간인테그린β3	5'-AGA TGC GAA AGC TCA CCA GT-3'	Forward	서열번호11
인간인테그린β3	5'-CCG TCA TTA GGC TGG ACA AT-3'	Backward	서열번호12
인간인테그린β4	5'-GCC TTC ACT TTG AGC ACT CC-3'	Forward	서열번호13
인간인테그린β4	5'-CTG CTG TAC TCG CTT TGC AG-3'	Backward	서열번호14
인간인테그린β5	5'-AGC AGC TTC CAT GTC CTG AG-3'	Forward	서열번호15
인간인테그린β5	5'-GAA GTT GCT GGT GAG CTT CC-3'	Backward	서열번호16
인간인테그린β6	5'-GAC TCC GGA AAC ATT CTC CA-3'	Forward	서열번호17
인간인테그린β6	5'-CTG ACA GTC GCA GTT GCA TT-3'	Backward	서열번호18
인간인테그린β7	5'-AGC AAT GGC CTC TAC AGT CGC AGC-3'	Forward	서열번호19
인간인테그린β7	5'-GCT TGG AGA GAA ACC CAG AAA GTC-3'	Backward	서열번호20
인간인테그린β8	5'-TTC ATC ATT TTC ATA GTT ACA TTC-3'	Forward	서열번호21
인간인테그린β8	5'-CAT TAA GTG TTT AAA AAT CTT TTT-3'	Backward	서열번호22

증폭된 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에 로딩한 후 전기영동하여 밴드가 나타나는 것을 확인하였다.

또한, Trizol 시약을 이용하여 추출한 RNA에 대해 각각의 인테그린 서브유닛의 프로브가 집적된 마이크로어레이 칩을 이용한 실험을 실시하였다. 신경줄기세포에 Trizol 시약 (Invitrogen)을 처리하여 전체 RNA를 추출하여 RNA 샘플을 준비하였다. RNA 샘플을 추출한 다음 인간 U 133 플러스 2.0 유전자칩 올리고 마이크로어레이 (human U 133 Plus 2.0 GeneChip Oligo Microarrays, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 인테그린 서브유닛들의 발현정도를 조사하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 인테그린 서브유닛 중 인테그린 알파V 및 베타1, 베타5가 높게 발현되는 것이 확인되었고, RT-PCR 결과도 마이크로어레이 칩을 이용한 실험과 동일하였다. 이로부터 신경줄기세포의 이동에 관여하는 수용체는 알파V베타5일 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다. 즉, 페리오스틴의 수용체는 인테그린 알파V베타3, 알파V베타5, 알파6베타4의 세가지 타입이 있는데, 이중 베타3와 베타4는 존재하지 않으므로 페리오스틴의 수용체로서 가능한 것은 알파V베타5라고 판단할 수 있다.

따라서, 본 실시예의 실험들을 통해 신경줄기세포가 αvβ5 인테그린 수용체를 갖는 것을 확인하였으며, 신경줄기세포의 종양조직으로의 이동은 인테그린 αvβ5에 의해 매개되는 것을 확인하였다. 이는 인테그린 αvβ5가 신경줄기세포에 있어서 페리오스틴에 대한 일차적인 수용체이고, 페리오스틴이 신경줄기세포의 종양조직으로의 이동활성을 나타내는데 있어 중요한 리간드임을 제시하는 것이다.

실시예 3-2: PI3 키나아제 신호전달 경로 관여 여부 확인

FAK 신호전달 경로는 그 하위경로로 많은 키나아제와 연결되어 신호를 전달하게 되어 있다. 세포 이동과 관련해서는 PI3K/AKT 신호전달경로(PI3K-AKT-mTOR-CDK5-Nudel1, PAK1)가 FAK의 하위경로로 주로 사용되는 것이 알려져 있는 것을 감안하여 페리오스틴의 키나아제 활성화 경로를 파악하기 위한 아래의 실험을 수행하였다.

먼저, 페리오스틴이 처리된 신경줄기세포를 PBS로 세척한 후, RIPA 버퍼 (0.5% 소디움 데옥시콜레이트, 0.1% 소디움 도데실 설페이트, 1% NP-40, PBS)에서 PMSF와 프로테아제 억제제를 이용하여 해체하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad-DC 분석 (Bio-Rad, Hercules, CA, US)을 이용하여 평가하였다. 샘플들을 동일한 단백질 농도로 조정한 후, 각 단백질의 30㎍씩을 SDS-PAGE 겔에서 분리하였다. 그런 다음, 단백질 샘플들을 이모빌론-P 막 (Millipore Corp., MA, US)에 옮겼다. 단백질 검출을 위하여, 막을 TBS-T 버퍼 및 5% 탈지유(skim milk)에서 30분간 상온에서 인큐베이션한 후, TBS-T 버퍼로 5분간 세척을 3회 수행하였다. 그리고, 막을 FAK, pFAK, PAK, pPAK (1:1000 희석, Epitomics) 1차 항체와 함께 하룻밤 동안 4℃에서 5% BSA-TBS-T 버퍼에서 인큐베이션하였고, TBS-T 버퍼로 15분간 세척을 3회 수행하였다. 그리고 나서, 2차 항-토끼 항체 (1:2000 희석, Zymed, CA, USA)와 함께 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 TBS-T 버퍼로 3회 세척한 후, 항체 결합 단백질에 대한 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 용액(Amersham Pharmacia Biotechnology, buckinghamahire, UK)을 1분간 첨가한 후, 막을 코닥 X-레이 필름에 노출시켜 현상하였다. 또한, 0시간~12시간 동안 페리오스틴으로 처리한 신경줄기세포에 대해 각 처리 시점별로 분석하였다.

도 6에 도시된 바와 같은 웨스턴 블롯팅 결과, FAK가 페리오스틴 처리 30분 후 시점부터 매우 활성화되어 있음을 확인할 수 있었다. 한편, 페리오스틴 처리 1시간 후에는 AKT, mTOR이 활성화되어 있었으며, 그 후, CDK5가 활성화되었고 페리오스틴 처리 12시간 시점까지 활성화가 유지됨을 확인하였다. 한편, 동시에 PAK1도 페리오스틴 처리 1시간 시점에 활성화되기 시작하여 6시간 시점까지 유지되었다. Nudel1은 PAK1 활성화 감소 시점에 활성화되어 12시간 동안 유지되었다. 이러한 결과로부터, 페리오스틴에 의해 유도된 세포이동 신호는 FAK 신호전달경로를 통해 이루어지며, AKT 신호전달경로 및 CDK 하위경로를 통해 일어나는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 본 실시예의 실험에서는 페리오스틴에 의한 신경줄기세포의 이동 유도에 있어서 신경줄기세포 내의 어떤 신호전달 체계가 관련되는지 살펴본 결과, 세포 이동에 영향을 미치는 신호전달 경로 중 PI3K 경로(PI3K-AKT-mTOR-CDK5-Nudel1, PAK1)의 활성화를 확인하였고, 그 결과 페리오스틴의 처리 시간에 따라 PI3K 신호전달체계의 하위 단계가 활성화되는 것을 확인하였다.

실시예 3-3: 페리오스틴에 의한 뉴클레오키네시스 (Nucleokinesis) 확인

DCX (Doublecortin)은 Nudel1과 PAK1과 함께, 액틴과 튜불린을 이용하여 세포이동을 조절하는 인자로 잘 알려져 있다. 특히, CDK5의 하위 신호전달 체계인 DCX는 뇌의 발달과정에 있어서 뇌의 대뇌피질을 형성하는데 필요한 신경줄기세포의 이동성을 조절(nucleokinesis)하는 인자로 알려져 있다. 중추신경계 발생에 있어서 신경줄기세포는 ERK(Extracellular signal regulated kinase)와 CDK5 신호전달경로를 이용하여 뇌실하영역(subventricular zone)으로부터 방사신경아교세포(radial glial cell)를 발판으로 삼아 대뇌 피질(cortex)로 이동하고, 신경계 이동에 있어서, 특히 DCX가 핵 전위, 이동에 관여되는 것이 보고되고 있다(Niethammer et al., 2000). 따라서, 페리오스틴에 의해 유도된 신경세포의 이동에 있어서, ERK, CDK5, 특히 DCX의 역할을 확인하기 위해 MEK/ERK 저해제인 PD98059 또는 CDK5 저해제인 로스코비틴을 처리하였고 아래와 같이 시험관내(in vitro) 이동분석 및 면역 조직화학적 실험을 수행하였다.

실시예 3-3-1: ERK 경로 저해제와 CDK5 경로 저해제를 이용한 시험관내 이동 분석 비교

배양된 신경줄기세포를 0.05% 트립신으로 분리한 후 DMEM 배지로 세척하였고, DMEM 배지에 재현탁시킨 후, 5×10⁴ 개의 신경줄기세포를 10% FBS를 포함한 200㎕ DMEM 배지에서 상부 챔버 (Costar Transwell)로 접종하였다. 하루 후, 하부 챔버에는 각 조건에 따른 페리오스틴 (R&D), VEGF, 20nM PD98059, 20nM 로스코비틴 (Calbiochem)의 혼합용액의 조합들을 각각 처리하였다. 12시간 후, 하부 챔버의 자극에 반응하여 상부 챔버에서 8 ㎛ 공극폴리카보네이트 막을 가로질러 하부 챔버로 이동한 세포의 수를 비교하기 위하여, 이동한 신경줄기세포를 헤마토실린으로 염색하고 에오신으로 대조염색을 한 후 이동한 신경줄기세포 수를 계수하였다.

그 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이, 로스코비틴 (94% 저해됨) 또는 PD98059 (40% 저해됨)는 페리오스틴에 의해 향상되는 신경줄기세포의 이동능력을 유의적으로 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 페리오스틴을 처리하지 않은 대조군에 대해서도 로스코비틴 또는 PD98059에 의해 신경줄기세포의 이동 수가 감소하였음을 확인할 수 있었고, 이로부터 페리오스틴에 의해 유도된 세포이동 신호는 ERK 경로 및 CDK5 경로를 경유함을 확인할 수 있었다.

즉, 본 실시예의 실험에서는 페리오스틴이 신경줄기세포 이동을 매개하는 CDK5 신호전달 체계 및 MEK/ERK 신호전달 체계와 관련되는지 살펴보기 위하여, 페리오스틴과 함께 MEK/ERK 저해제(MEK/ERK kinase inhibitor)로 작용하는 PD98059 또는 사이클린-의존적인 키나아제 저해제 (cyclin-dependent kinase inhibitor)로 작용하는 로스코비틴(roscovitine)을 처리하고 이들이 세포 이동에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과, 페리오스틴에 의한 세포 이동성 증가는 로스코비틴에 영향을 받는 것으로 나타났으며, 이로부터 페리오스틴에 의한 세포 이동은 CDK5 경로에 의한 것임을 판단할 수 있었다.

특히 ERK 억제제인 PD98059에 의한 신경줄기세포의 이동 유도 저해 효과는 DCX 억제제인 로스코비틴에 의한 저해 효과보다 작음을 알 수 있었다. 이는 페리오스틴에 의한 신경줄기세포의 이동 유도과정에 있어서 DCX 신호전달체계가 MEK/ERK 신호전달 체계 보다 중요하게 작용함을 의미한다.

실시예 3-3-2: ERK와 DCX의 면역 조직화학적 분석

이동한 세포의 ERK 및 DCX 영향을 분석하기 위하여, ERK 항체 및 DCX 항체 (Cell signaling tech., Danver, MA)를 이용하여 트랜스웰 멤브레인 면역염색(transwell membrane immunostain)을 수행하였다.

배양된 신경줄기세포를 0.05% 트립신으로 분리한 후 DMEM 배지로 세척하였고, DMEM 배지에 재현탁시킨 후, 5×10⁴ 개의 신경줄기세포를 10% FBS를 포함한 200㎕ DMEM 배지에서 상부 챔버 (Costar Transwell)로 접종하였다. 하루 후, 하부 챔버에는 VEGF (10ng/ml), 페리오스틴(10㎍/ml), 또는 페리오스틴과 저해제의 혼합용액을 각각 처리하였다. 12시간 후, 하부 챔버의 자극에 반응하여 상부 챔버에서 8 ㎛ 공극폴리카보네이트 막을 가로질러 막의 하부로 이동한 세포에서 DCX와 ERK의 위치변화를 확인하였다.

그리고 나서, 막을 PBS로 세척한 후, PBS에 녹인 0.5% 염소 혈청(goat serum) 및 0.5% triton X-100 용액으로 30분 동안 2회 블로킹(blocking)한 다음, 15분 동안 PBS에 녹인 0.5% BSA(bovine serum albumin)로 세척하였다. 이후, 1:500으로 희석한 염소의 다클론성 인간 DCX 항체 및 1:1000으로 희석된 토끼의 다클론성 인간 ERK 항체를 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, PBS로 15분 동안 2회 세척하였다. 그 후, 비오틴이 결합된 항-토끼 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 1차 항체와 결합시킨 후 PBS로 2회 세척한 다음, 아비딘-비오틴 키트(Avidin-biotin kit)(Vector)와 디아민벤지딘 퍼옥시다아제(diaminbenzidin peroxidase, DAB) 키트(Vector)를 이용하여 면역염색하고 관찰하였다.

그 결과, 도 7B에 나타난 바와 같이 페리오스틴과 VEGF는 세포 이동을 유도하였으며, 페리오스틴이 처리된 환경에서 DCX는 핵 주변에 모여드는 것이 관찰되었다(작은 박스 참조). CDK5 저해제를 첨가한 경우, 핵 주변에 모여드는 것이 저해되는 것이 관찰되었다.

즉, 본 실시예의 실험들에서는 페리오스틴에 의한 줄기세포의 이동 유도에 있어서도 동일한 신호전달 체계가 관여하는지 확인해 보기 위하여 페리오스틴을 신경줄기세포에 처리한 결과, DCX의 위치가 세포질에서 핵 주변 부위로 이동되는 것을 확인함으로써 DCX신호 전달 체계 역시 페리오스틴에 의한 줄기세포의 이동에 관여함을 확인할 수 있었다.

실시예 4 생체내( in vivo )에서 페리오스틴에 의한 신경줄기세포의 이동능력 확인

실시예 4-1: 페리오스틴을 과발현하는 NIH3T3 세포주의 제작

페리오스틴을 과발현하는 세포주를 제작하기 위하여, 293T 세포를 암포트로픽 엔벨로프(amphotropic envelope)를 발현하는 pCL-Ampho 벡터와, 블라스트시딘 S 저항 유전자 및 페리오스틴 유전자가 코딩된 pCXbsr 벡터(Shiga University, Dr. Inoue)를 사용하여 감염시켰다. 상기 벡터들에 대해서는 제한효소를 이용하여 암포트로픽 엔벨로프 유전자와 페리오스틴 유전자가 존재하는지 재확인하였다.

상기 2종류의 벡터를 리포펙타민 플러스 시약(lipofectamin plus agent)(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 제조자 프로토콜을 따라 293T 세포에 감염시켰다. 2일 경과 후 배양 배지를 수거하고, 5㎍/ml의 블라스트시딘 S (Invitrogen, Japan)를 1주간 처리하였다. 그리고 나서, 블라스트시딘 S가 없는 새로운 배지로 교환하여 3일간 배양한 후, 이 배지를 NIH3T3 세포와 함께 2일간 배양하였다. 그런 다음, 블라스트시딘 S를 함유한 배지를 첨가한 후 1-2주간 배양하여 상기 유전자들이 도입된 세포들(콜로니가 형성된 세포들)을 선별하였으며, 이와 같이 선별된 세포들은 96-웰 플레이트에 각각 배양하였다(도 8A 및 도 8B 참조).

그리고 재조합된 페리오스틴 과발현 세포주들에 대해, 분비된 페리오스틴의 양을 ELISA 분석 (도 8C) 및 웨스턴 블로팅 (도 8D)으로 확인하였고, 페리오스틴의 발현량이 가장 높은 세포주(1-8 세포주)를 선택하여 p-NIH3T3 세포주로 명명하였다.

실시예 4-2: 신경줄기세포 및 p-NIH3T3 세포의 동측(ipsi-lateral) 이식

DiI로 표지된 신경줄기세포(F3)를, 다이사이클 그린(Dyecycle Green)으로 표지된 페리오스틴 과발현 NIH3T3 세포(p-NIH3T3) 또는 일반 NIH3T3 세포가 이식된 같은 쪽의 뇌반구 피질에 이식하였다(동측 이식). 이식에 사용된 쥐는 SPF.VAF 이계 교배된 래트(계통명; Crl:CD, 입수처; ㈜오리엔트바이오)였고 이식방법으로는 당업계에 알려진 정위(定位) 이식방법(stereotaxic grafting)을 사용하였다. 구체적으로 이식방법을 설명하면 다음과 같다. 참고로, 이하의 설명에서 계속 사용되는 AP(Anterior-Posterior)는 브레그마로부터 전후방향 위치값이고, ML은 정중선(midline)으로부터 측방향 위치값이며, DV는 경막(dura)으로부터의 깊이값을 의미한다.

다이사이클 그린으로 표지된 p-NIH3T3 세포 1×10⁶ 개를 오른쪽 선조체(striatum)에 이식하였다. 이식 위치는 브레그마를 기준으로 AP +0.4, ML -2.3, DV -4.5 위치(단위:mm)였다. 5일 후, 각 실험그룹 마다 DiI로 표지된 1×10⁶개의 신경줄기세포를 같은 쪽의 뇌반구 피질에 이식하였으며, 이식 위치는 브레그마를 기준으로 AP +0.4, ML -2.3, DV -2.0 위치(단위:mm)였다.

대조군으로 3㎕의 HBSS (Hanks' balanced salt soution) 또는 다이사이클 그린으로 표지된 NIH3T3 세포 1×10⁶ 개를 오른쪽 선조체(striatum)에 이식하였다. 이식 위치는 AP +0.4, ML -2.3, DV -4.5 위치(mm)였다. 5일 후, 각 실험그룹 마다 DiI로 표지된 1×10⁶개의 신경줄기세포를 같은 쪽의 뇌반구 피질에 이식하였으며, 이식 위치는 브레그마를 기준으로 AP +0.4, ML -2.3, DV -2.0 위치(단위:mm)였다.

정위 이식방법의 수행을 위해, 자동화된 마이크로인젝터(microinjector) (KD scientific INC, MA, US)가 부착된 26-게이지 해밀턴 주사기(26-gauge Hamilton) (Hamilton, Nevada, US)를 사용하여 전술한 세포들과 HBSS를 0.2㎕/분의 속도로 이식하였다.

이식 후, 바늘을 15분간 이식 위치에 유지시켰으며, 이후 천천히 빼냈다. 2-4주 후, 쥐의 뇌를 수거하여 매우 차가운 0.1M 포스페이트 버퍼 내의 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 4시간 후, 고정된 뇌를 0.1M 포스페이트 버퍼 내의 30% 슈크로스에 침지시키고 4℃에서 하룻밤 동안 두었다. 그런 다음, 뇌를 OCT 화합물을 이용하여 얼린 후, 크라이오스탯(cryostat)을 이용하여 30㎛ 두께로 세절하였다. 절단된 슬라이스는 벡타쉴드^® 하드 세트^TM (Vectashield^® Hard Set^TM) 마운팅 배지 (Vector, CA, US)를 이용하여 마운팅하였으며, Olympus IX71 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 절단된 슬라이스를 관찰하였다.

도 9에 도시된 바와 같이, DiI로 표지된 신경줄기세포는 이식 후 2주가 경과할 때까지 일반 NIH3T3 세포에 대하여 굴성을 보이지 않았다. 그러나, 페리오스틴을 지속적으로 발현하는 p-NIH3T3 세포에 대해서는 신경줄기세포가 뇌량(corpus callosum)을 통과하여 다이사이클 그린이 표지된 부분에서 적색 표지로서 확인되었다(도 9B). 또한, 신경줄기세포 이식 후 2주가 경과된 시점에서 신경줄기세포는 선조체(striatum) 조직 근처에 이식된 p-NIH3T3 세포 전반에 걸쳐 분산되었으며, 서로 섞이게 됨을 확인하였다(도 9D). 그리고 신경줄기세포 이식 후 4주가 경과된 시점에서도 p-NIH3T3 세포는 계속하여 페리오스틴을 발현하였으며, 신경줄기세포 이동능력을 발휘하는 것을 확인하였다(도 9C 및 도 9E).

실시예 4-3: 신경줄기세포 및 NIH3T3 세포의 반대측(Contra-lateral) 이식

DiI로 표지된 신경줄기세포(F3)를, 페리오스틴 과발현 NIH3T3 세포(p-NIH3T3)가 이식된 뇌반구의 반대쪽의 뇌반구 피질에 이식하였다. 이식 방법은 실시예 4-2와 같고, 다만 신경줄기세포의 이식 위치가 AP +0.4, ML +2.3, DV -2.0 위치(mm)인 점만이 다르다.

실시예 4-2에서 설명된 바와 같은 과정을 따라 실험을 수행한 결과, 이식된 2종류의 세포 간의 거리가 상당함에도 불구하고, 신경줄기세포는 뇌량(corpus callosum)을 따라(도 10C) p-NIH3T3 세포를 둘러싸는 것을 확인할 수 있었다(도 10A 및 도 10B). 또한, 신경줄기세포 이식 후 2주가 경과된 시점에서도 신경줄기세포가 뇌량을 통하여 p-NIH3T3 세포로 이동하는 것을 관찰할 수 있었다(도 10F 내지 도 10H).

한편, 페리오스틴의 생체내(in vivo) 발현은 DAB 키트(Vecter)를 이용한 면역 조직화학적 분석을 통해 관찰하였다. 실시예 4-2와 같은 방법에 의해 절단된 슬라이스를 PBS로 3회 세척한 후, PBS에 0.5% triton X-100 및 5% BSA (Bovine Serum Albumin)를 첨가하여 30분간 블로킹하였다. 그런 다음, 슬라이스를 0.5% BSA로 15분간 세척하였고, 토끼의 다클론성 인간 페리오스틴 항체(1:500, abcam, Cambridge, UK)와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 슬라이스를 3회에 걸쳐 각각 15분씩 PBS로 세척하였고, 항-토끼 2차 항체 (1:1000, Vector, CA, US)와 함께 1시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 그리고 나서, 페리오스틴은 DAB 키트로 검출하거나(도 10D 및 도 10I) 형광 염색을 이용하여 검출하였다(도 10E 및 도 10J).

도 10D 및 도 10I 그리고 형광 염색결과인 도 10E 및 도 10J에 도시된 바와 같이, p-NIH3T3은 뇌에 이식한 후 1~2주간 계속하여 페리오스틴을 분비하였음을 확인할 수 있었다. 도 10의 사진들에서 붉은색은 신경줄기세포를 나타내고, 녹색은 p-NIH3T3 세포를 나타낸다.

실시예 5: 쥐 신경교종 모델에서 페리오스틴 발현 세포(p-NIH3T3) 및 자살유전자 발현세포(F3-CD)를 이용한 치료효과 확인

실시예 5-1: F3-CD 세포의 세포 독성 효과 확인

실시예 5-1-1: F3-CD 세포의 CD 생성 여부 및 활성 확인

자살유전자를 발현하는 신경줄기세포가 종양세포에 미치는 제3자 효과(bystander effect)를 검증하기 위하여, 사이토신 데이미네이즈(CD)를 발현하는 F3-CD 세포주를 당업계에 알려진 방법에 따라 제작하였고(Cancer Gene Ther. 2010 May;17(5):299-306. Epub 2009 Nov 6.), CD 유전자 및 단백질 발현여부를 검증하였다. 이를 위해 CD 유전자의 경우 아래와 같은 프라이머를 사용하였다.

서열번호 23: 5'-GAGTCACCGCCAGCCACACCACGGC-3': 포워드(Forward)프라이머

서열번호 24: 5'-GTTTGTAATCGATGGCTTCTGGCTGC-3': 백워드(Backward)프라이머

F3 신경줄기세포에서 Trizol 시약(Invitrogen)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였고, 이러한 전체 RNA, 슈퍼스크립트II(SuperscriptII)(Invitrogen) 및 12-18mer 올리고 dT가 포함된 반응 혼합용액을 42℃에서 50분간 인큐베이션하고 72℃에서 15분간 인큐베이션한 후 당업계에 알려진 방법을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 그리고 나서, 5㎕ 10X PCR 버퍼, 1.5mM MgCl₂, 0.2mM 데옥시리보뉴클레오시드-트리포스페이트, 50pmol 프라이머, 1U Tag DAN 폴리머라아제(Invirogen) 및 150ng의 cDNA(주형)을 포함하는 50㎕의 PCR 반응용액을 준비하였다. PCR 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 5초, 60℃에서 60초, 72℃에서 90초의 사이클 25~30회 반복; 72℃에서 10분 동안 최종 연장.

상기와 같은 RT-PCR을 수행한 후 전기영동을 하여 밴드가 나타나는지 여부를 확인한 결과, 대조군인 F3 세포에서는 CD 유전자가 발현되지 않지만, F3-CD 세포에서는 CD 유전자가 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 11A).

실시예 5-1-2: CD 단백질 HPLC 분석

효소 활성 분석 및 HPLC 분석을 통하여 CD 단백질의 활성을 검증하였다. CD 단백질은 5-FC (5-fluorocytosine)를 세포 독성이 큰 항암제인 5-FU (5-flurouracil)로 전환시키는 활성이 있다. HPLC 실험을 위하여, F3-CD 세포 2×10⁵ 개를 12-웰 플레이트에 각각 분주하고 48시간 동안 1ml 배지에서 1mM 5-FC와 함께 배양하였다. 배양배지 50㎕에 대해 500㎕의 에틸 아세테이트:이소프로판올:아세트산 (84:15:1 [v:v:v])을 처리하여 추출과정을 수행한 후, 유기 분획을 500㎕의 물:메탄올 (4:1 [v:v])에 재현탁시켰다.

HPLC 분석은 크로마실(Kromasil) 100-5C-19 컬럼 (Kromasil, Bohus, Sweden)을 이용하여 분석파장 270nm에서 수행하였다. 5-FC와 5-FU는 1ml/분 유속으로 용리되는데, 10% KOH에 의해 pH 7.0으로 조정된 40mM KH₂PO₄를 포함하는 등용매 이동상(isocratic mobile phase)에서 분리되었다. 정체 시간은 5-FC의 경우 3.4분, 5-FU의 경우 3.9분, 5-브로모우라실(Sigma)의 경우 8.9분이었으며, 5-FC와 5-FU의 정량분석은 5-브로모우라실을 정규화 기준으로 이용하여 수행하였다.

한편, F3 세포 또는 F3-CD 세포 용해물(lysate)에서 얻은 50㎍의 단백질을 1mM 5-FC의 존재 하에서 37℃에서 8시간 동안 인큐베이션한 후, 상기와 같은 방법으로 HPLC 분석을 수행하였다.

그 결과, F3-CD 세포 용해물의 CD에 의하여 2.9μg의 5-FU가 생산된 것이 확인되었으며, 대조군인 F3 세포에서는 5-FU의 생산이 확인되지 않았다(도 11B). 또한, 5-FC와 함께 배양한 F3-CD 세포의 상층액의 경우, 270nm UV 흡광도에서 각각 5-FC와 5-FU를 나타내는 2개의 피크를 보였다(도 11C). 또한, HPLC의 정량화 결과, F3-CD 세포의 경우 5-FU의 농도가 93μM로 산출되어 F3-CD 세포는 5-FC를 5-FU로 전환시키는 것을 재차 확인할 수 있었다 (도 11D). 따라서 CD 유전자를 코딩하는 F3-CD 세포는 정상적인 효소활성을 가지는 CD를 생산할 수 있으며, 이러한 CD에 의해 전환된 5-FU는 계속하여 F3-CD 세포 배지에 축적되는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 분비된 5-FU는 주위의 세포들에게 제3자 효과(bystander effect)를 발휘하는데 중요한 역할을 하게 된다.

실시예 5-1-3: 시험관내에서 C6 신경교종세포에 대한 F3- CD 세포의 세포 독성 효과 확인

5-FC 존재 하에서 쥐의 신경교종세포인 C6 세포(Rat glioma cell line; ATCC CCL-107^TM)와 F3-CD 세포(실시예 5-1-1에 따라 제작한 것)의 공동배양을 통하여, F3-CD 세포의 C6 세포에 대한 세포 독성효과를 시험관내에서 확인하기 위해서 아래와 같은 실험을 수행하였다.

다양한 비율, 즉 C6 세포:F3-CD 세포 = 100:5~200의 비율로 C6 세포를 F3-CD 세포와 함께 96-웰 플레이트에 분주하여 1일간 배양한 후, 5-FC가 포함된 배지 (100㎍/ml, Sigma)로 교체하여 배양하였다. 3일 후에 각 웰을 PBS로 세척한 후, MTT 용액 (0.5mg/ml, Sigma)을 첨가하였다. 4시간 후, MTT를 200㎕ DMSO로 교체하였고, 1시간 더 배양하였다.

그 후, 각 웰의 상층액을 수거하였고 새로운 96 웰 플레이트로 옮긴 후, 550nm 및 630nm 파장의 레퍼런스 필터(reference filter)를 사용하여 마이크로플레이트 분광 광도계(microplate spectrophotometer)(Bio Tek instrument Inc.)에 의해 C6 세포의 숫자를 계수하였다.

그 결과, 도 12에 도시된 바와 같이, C6 세포에 비해 많은 F3-CD 세포가 공동배양될수록 세포 독성 효과는 더욱 증가하였는데, C6 세포에 대한 F3-CD 세포의 비율이 10%인 경우, C6 세포가 사멸하기 시작하였음을 확인할 수 있었고, C6 세포에 대한 F3-CD 세포의 비율이 50%인 경우 80%의 C6 세포가 사멸유도되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 5-2: 생체내에서 p- NIH3T3 세포에 대한 F3- CD 세포의 세포 독성 효과 확인

생체내 조건 하에서 p-NIH3T3 세포(실시예 4-1에 따라 제작)에 대한 F3-CD 세포(실시예 5-1-1에 따라 제작)에 의한 제3자 효과 분석을 위해 아래와 같은 실험을 수행하였다.

다이사이클 그린으로 표지된 p-NIH3T3 세포 0.5 ~ 2×10⁶개를 쥐의 오른쪽 선조체(striatum)에 이식하였다. 5일 후, 각 실험그룹 마다 DiI로 표지된 1×10⁶개의 신경줄기세포(F3-CD 세포 또는 F3 세포)를 오른쪽 뇌반구 피질에 이식하였다. 이식 후, 바늘은 15분간 방치되었으며, 그 후 천천히 제거하였다. 그리고, 다시 7~10일이 경과된 시점에서 5-FC를 각기 다른 농도 (250/500/1000 ㎍/kg)로 상기 세포들이 이식된 쥐에 복강 내 주사를 통하여 2주간 매일 투여하였다.

그 후, 쥐에서 뇌를 수거하여 매우 차가운 0.1M 포스페이트 버퍼 내의 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 4시간 후, 고정된 뇌를 0.1M 포스페이트 버퍼 내의 30% 슈크로스에 침지시키고 4℃에서 하룻밤 동안 두었다. 그런 다음, 뇌를 OCT 화합물을 이용하여 얼린 후, 크라이오스탯(cryostat)을 이용하여 30㎛ 두께로 세절하였다. 슬라이스는 겔 마운트(Gel mount)(Biomeda corp, Foster City, CA)를 이용하여 마운트하였다. 페리오스틴을 과발현하는 p-NIH3T3 세포들의 크기 및 생존율은 BMF 스테레오 인베스티게이터 프로그램(BMF stereo investigator program)(MicroBrightField Inc., Williston, USA)을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 13에 도시된 바와 같이 F3-CD 세포가 이식된 쥐에 5-FC를 고농도로 투여한 경우, 대조군인 F3 세포가 이식된 쥐에 비하여 p-NIH3T3 세포의 생존율이 유의적으로 감소함을 알 수 있었다(44%, 도 13B). 도 13B의 그래프는 F3 세포가 이식된 쥐와 F3-CD 세포가 이식된 쥐에 5-FC를 투여한 경우, 5-FC 농도별 p-NIH3T3 세포의 생존율을 스테레오 인베스티게이터 프로그램을 사용하여 정량한 결과를 보여준다.

도 13B를 살펴보면, 생체내에서 F3-CD의 제3자 효과는 특히 500㎍/kg 이상의 농도로 5-FC가 투여된 실험 그룹에서 심각하게 나타난다. 또한, 도 13A의 사진을 살펴보면, F3-CD 세포 및 페리오스틴 과발현 p-NIH3T3 세포는 각기 다른 부위에 이식되더라도, F3-CD 세포는 페리오스틴에 의해 유도되어 원래 이식된 부위로부터 p-NIH3T3 세포 이식 부위로 이동함으로써, 페리오스틴 과발현 p-NIH3T3 세포에 대하여 생체 내에서 충분한 세포독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5-3: 쥐 신경교종 모델에서의 페리오스틴 과발현 세포(p- NIH3T3 ) 및 자살유전자 발현세포(F3- CD )를 이용한 암치료효과 확인

쥐 신경교종 모델에서, 페리오스틴 과발현 세포(p-NIH3T3) 및 자살유전자 발현세포(F3-CD)를 이용하여 페리오스틴 과발현 세포 주위의 암세포들에 대해 제3자 효과에 의한 세포사멸을 일으킴으로써 실제로 종양의 크기를 줄여 치료효과를 얻을 수 있는지를 확인하기 위하여 아래의 실험을 수행하였다.

대조군으로 쥐의 신경교종세포인 C6 신경교종세포(Rat glioma cell line; ATCC CCL-107^TM)만, 또는 C6 신경교종세포와 p-NIH3T3 세포(실시예 4-1에 따라 제작)를 함께 쥐 뇌의 오른쪽 선조체에 이식하고, DiI로 표지한 F3-CD 세포(실시예 5-1-1에 따라 제작)를 반대측(contra-lateral)으로 이식한 후, 2주 동안 5-FC를 처리하였다. 각 세포를 이식하는 방법은 실시예 4-2 및 실시예 4-3과 같으며, 쥐의 뇌를 수거한 시점은 5-FC 처리가 끝나는 시점이었다.

그 결과, 도 14에 도시된 바와 같이, p-NIH3T3 세포의 도입에 의해 F3-CD 세포의 이동방향이 조절되는 것을 관찰할 수 있었으며(도 14A 내지 도 14C), p-NIH3T3 세포 수에 의존적으로 F3-CD 세포에 대한 유도력이 향상되어 F3-CD 세포가 C6 신경교종세포 위치로 이동하여 가는 것을 확인할 수 있었다.

또한, p-NIH3T3 세포 및 F3-CD 세포가 이식된 신경교종 모델의 경우, C6 세포만 이식된 신경교종모델의 종양 크기의 40%에 해당하는 종양 크기를 나타내어 뇌 종양 성장이 상당히 억제되는 것을 확인하였다(도 14D). 또한, 종양의 크기는 F3-CD 세포를 종양 덩어리(tumor mass)로 유도하는 p-NIH3T3 세포 수에 비례하여 감소하였다(도 14D).

한편, 같은 개수의 p-NIH3T3 세포를 이식한 신경교종모델의 경우, 시간이 경과할 수록 종양 크기가 유의적으로 감소하였다(60%, 도 14B 및 도 14C). 감소된 종양의 크기는 C6 신경교종세포의 침윤을 억제한 결과에 기인한 것으로 판단된다.

즉, C6 신경교종세포만 이식한 그룹의 경우, C6 신경교종세포의 침윤이 일어나 원래 이식된 자리에서 종양이 널리 전파되는 것을 관찰할 수 있는 반면에, p-NIH3T3 세포 및 F3-CD 세포를 이식한 그룹의 경우 넓게 전파된 C6 신경교종세포, 즉 C6 신경교종세포의 침윤이 관찰되지 않았다.

특히, 도 15에 도시된 바와 같이, H&E 염색결과는 p-NIH3T3 세포 및 F3-CD 세포를 이식한 신경교종모델의 경우 C6 쥐 신경교종세포 침윤이 억제되고 있는 것을 확인시켜 준다. 도 15A는 2주간의 5-FC 처리과정에서 7일 차의 신경교종모델 뇌의 슬라이스 사진이고, 도 15B는 2주간의 5-FC 처리과정에서 10일 차의 신경교종모델 뇌의 슬라이스 사진이다.

따라서, C6 신경교종세포의 침윤 억제는 p-NIH3T3 세포 수의 증가 및 F3-CD 세포 이동 기간의 증가에 의하여 강화된다고 할 수 있다. 이러한 결과는 p-NIH3T3 세포로부터 분비되는 페리오스틴의 양이 증가함에 따라 자살유전자를 코딩하는 F3-CD 세포의 암세포 표적화를 강화시켜 암세포 성장을 유의하게 억제할 수 있음을 보여준다. 또한, 뇌암의 재발에 있어서 중요한 요인인 암세포의 정상조직으로의 침윤을 페리오스틴의 양이 증가함에 따라 효과적으로 억제함으로써 종양의 치료효과를 극대화시킬 수 있음을 시사한다.

실시예 6: 쥐의 C6 신경교종모델의 생존율 확인을 통한 페리오스틴 과발현 세포(p- NIH3T3 ) 및 자살유전자 발현세포(F3- CD )를 이용한 암치료효과 확인

본 실시예에서는 쥐 신경교종 모델에서, 페리오스틴 과발현 세포(p-NIH3T3) 및 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD)를 이용하여 페리오스틴 과발현 세포 주위의 암세포들에 대해 제3자 효과에 의한 세포사멸을 일으킴으로써 실제로 종양의 크기를 감소시키는 동시에 신경교종모델의 생존율이 증가하는지를 확인하였다.

일반적으로 C6 신경교종세포는 동물에 뇌종양을 생성시키는데 자주 사용되는 종양세포주로서, 본 발명의 실시예들과 같이 1×10⁶개의 C6 신경교종세포를 쥐의 뇌에 이식하면 대략 1개월이 경과한 시점에서 대부분의 쥐가 뇌종양으로 체중감소를 동반하고, 뇌암이 진행되어 죽게 된다.

따라서, 페리오스틴 과발현 세포(p-NIH3T3) 및 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD)를 이용한 제3자 효과에 의해 암치료 효과를 얻을 수 있다는 점을 보다 명확하게 하기 위해 쥐의 C6 신경교종모델을 5개 그룹으로 나누어 아래와 같이 실험하였다.

우선, 그룹 A는 HBSS 및 증류수를 투여한 그룹이고, 그룹 B는 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD) 및 증류수를 투여한 그룹이며, 그룹 C는 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD) 및 5-FC를 투여한 그룹이며, 그룹 D는 페리오스틴 발현 세포(P-NIH3T3)(0.5×)(C6 신경교종세포가 1×10⁶개일 때 0.5×10⁶개 세포 의미), 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD) 및 5-FC를 투여한 그룹이고, 그룹 E는 페리오스틴 발현 세포(P-NIH3T3)(2×)(C6 신경교종세포가 1×10⁶개일 때 2×10⁶개 세포 의미), 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD) 및 5-FC를 투여한 그룹이다.

상기 5개의 C6 신경교종모델 그룹에 대해 C6 신경교종세포(Rat glioma cell line; ATCC CCL-107^TM), p-NIH3T3 세포(실시예 4-1에 따라 제작), F3-CD 세포(실시예 5-1-1에 따라 제작)를 실시예 4-2, 실시예 4-3 및 실시예 5-3에 예시된 방법에 따라 이식하였다.

구체적으로, 그룹 A, 그룹 B 및 그룹 C의 C6 신경교종모델의 경우에는 C6 신경교종세포(Rat glioma cell line; ATCC CCL-107^TM) 1×10⁶개를 실시예 4-2 및 실시예 5-3의 방법에 따라 쥐(계통명; Crl:CD, 입수처; ㈜오리엔트바이오)의 오른쪽 선조체(striatum)에 이식하여 쥐의 C6 신경교종모델을 확립하였다. 이때, 이식 위치는 브레그마를 기준으로 AP +0.4, ML -3.1, DV -5.0 위치(단위:mm)였다.

또한, 그룹 D의 C6 신경교종모델의 경우에는 별개로 배양된 C6 신경교종세포 1×10⁶개와 p-NIH3T3 세포 0.5×10⁶개를 이식 전에 섞은 후 실시예 4-2 및 실시예 5-3의 방법에 따라 쥐의 오른쪽 선조체(striatum)에 이식하여 쥐의 C6 신경교종모델을 확립하였다. 그리고, 그룹 E의 C6 신경교종모델의 경우에는 별개로 배양된 C6 신경교종세포 1×10⁶개와 p-NIH3T3 세포 2×10⁶개를 이식 전에 섞은 후 실시예 4-2 및 실시예 5-3의 방법에 따라 쥐의 오른쪽 선조체(striatum)에 이식하여 쥐의 C6 신경교종모델을 확립하였다. 이식 위치는 브레그마를 기준으로 AP +0.4, ML -3.1, DV -5.0 위치(단위:mm)였다.

C6 신경교종세포 이식 후 5일이 경과한 시점에서 그룹 B 내지 그룹 E의 신경교종모델에 대해 DiI로 표지한 F3-CD 세포(실시예 5-1-1에 따라 제작)를 실시예 4-3 및 실시예 5-3의 방법에 따라 반대측(contra-lateral)으로 이식하였다. 이식 위치는 브레그마를 기준으로 AP +0.4, ML +3.1, DV -2.0 위치(단위:mm)였다.

자살 유전자인 CD 유전자를 과발현하는 신경줄기세포주인 F3-CD 세포 이식 후 10일 동안 F3-CD 세포가 페리오스틴에 의해 유도되는 이동기간을 주고, 그룹 C 내지 그룹 E의 신경교종모델에 대해 3주 동안 5-FC를 주사하였다. 이때 5일 동안은 5-FC를 주사하고 2일 동안은 주사하지 않는 방식의 사이클을 3회 반복하였고, 각각의 5-FC 주사 처리 사이클 전에 고해상도 익스플로어 비스타 PET 스캐너(high-resolution eXplore Vista PET scanner)(GE Healthcare, USA)를 사용하여 PET 사진을 촬영하였다.

우선, PET 스캐너를 이용한 PET 촬영을 위해 전날 오후부터 각 그룹에 대해 금식 후 아이소플루레인(isoflurane)(15 mg/kg)으로 마취시키고 ¹⁸F-FDG 63 MBq을 꼬리 정맥으로 투여한 후 1시간이 경과한 시점에서 아이소플루레인(isoflurane)(15 mg/kg)을 약하게 주면서 고해상도 익스플로어 비스타 PET 스캐너로 쥐의 뇌에 대한 PET 촬영을 수행하였다.

5-FC는 0.9% 생리적 식염수로 15mg/ml의 용액으로 만들고 500mg/kg의 용량으로 그룹 C 내지 그룹 E의 신경교종모델에 대해 복강 내 주사하였다. 5-FC는 1일 2회 투여로 오전 11시 및 오후 8시에 나누어 주사하였다. 예를 들어 신경교종모델 쥐의 체중이 270g인 경우 5-FC를 140mg 투여하여야 하므로 총 투여 용량 9ml를 2회에 걸쳐 각각 4.5ml씩 주사하였다.

그리고 C6 신경교종세포를 이식한 날을 기점으로 시간의 경과에 따라 그룹 A 내지 그룹 E의 신경교종모델에 대한 생존율 및 종양 크기를 측정?계산하였다.

그 결과, C6 쥐 신경교종 모델 5개 그룹(A, B, C, D, E)에 대한 생존 그래프가 얻어졌다(도 16). 생존율 분석은 캐플란 메이어 로그랭크 테스트(Kaplan Meier and log rank tests)를 이용하여 수행되었다. 도 16에 도시된 바와 같이, 그룹 E의 경우 생존율이 가장 높아 페리오스틴 과발현 세포(p-NIH3T3) 및 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD)를 이용하면 페리오스틴 과발현 세포 주위의 암세포들에 대해 제3자 효과에 의한 세포사멸을 일으킴으로써 신경교종모델의 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 각 실험 그룹은 10마리로 구성되었으나 PET 스캔과정에서 사망하는 쥐들이 있어 PET 스캔과정에서 스트레스로 사망한 쥐를 제외하면 최종적으로 그룹 A는 7마리 중 7마리 모두가 죽었고, 그룹 B는 8마리 중 8마리 모두 죽었으며, 그룹 C는 6마리 중 6마리 모두가 죽었고, 그룹 D는 10마리 중 10마리 모두가 죽은 반면에 그룹 E는 9마리 중 6마리가 죽어 3마리가 생존하였다. 따라서, 페리오스틴 과발현 세포(p-NIH3T3), 자살유전자 발현 신경줄기세포(F3-CD) 및 항암제 전구약물인 5-FC에 의한 제3자 효과가 페리오스틴에 의한 F3-CD 세포의 암조직으로의 표적 유도에 의해 촉진되고 이로써 암조직 주변의 침윤성 종양세포까지 사멸시킴으로써 암치료가 가능한 동시에 암 재발을 방지하고 생존기간을 연장할 수 있음을 동물실험에서 확인할 수 있었다.

한편, 그룹 E의 신경교종모델의 경우 도 17 및 도 18에 도시된 바와 같이 종양크기가 커지는 것이 가장 효과적으로 억제되는 것이 확인되었다. 각 그룹별 종양크기는 PET 촬영 후 당업계에서 널리 알려지고 무료로 입수할 수 있는 프로그램(예를 들어, AMIDE program)을 이용하여 종양 부위인 붉은색 부분을 3-D로 적분하여 계산하였다. 참고로, PET 촬영 결과는 ¹⁸F-FDG가 얼마나 섭취되었는지 그리고 그 섭취 정도에 따른 활성을 보여주는 것이고, 도 18에 도시된 색상은 붉은색-노란색-녹색 순으로 ¹⁸F-FDG 섭취가 일어난 정도를 나타낸다. 종양세포가 일반 세포보다 ¹⁸F-FDG를 섭취하는 양이 많기 때문에 도 18에서 붉은색 부분이 종양이고 붉은색 부분이 줄어드는 것은 종양 크기가 줄어드는 것으로 해석할 수 있다.

결국, 본 발명의 실시예 5 및 실시예 6에서 확인되는 바와 같이 쥐 뇌암 동물 모델에서 페리오스틴을 분비하는 세포를 뇌암 질환부에 이식한 후 자살 유전자가 도입된 신경줄기세포를 뇌에 도입하였을 경우, 전구약물에 의한 제3자 효과에 의해 쥐 뇌암 질환부가 감소함을 확인하였고, 특히 페리오스틴의 양이 증가할수록 뇌암크기가 감소하는 것을 확인하였다.

일반적으로, 외과적 수술 이후에도 현재의 방법으로는 찾아낼 수 없는 미세 악성종양 세포들에 의한 악성종양 재발에 의해 뇌암 환자의 경우 예후가 좋지 않아 1년 생존율이 매우 낮은 것으로 알려져 있는데, 본 발명에 따르면 페리오스틴의 양이 증가할수록 뇌암의 중심부위에서 정상 조직으로 퍼져나가는 침윤성 악성 종양 세포의 숫자가 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 페리오스틴의 신규한 용도를 활용하면, 자살유전자를 발현하는 신경줄기세포와 자살유전자에 의해 항암물질로 전환되는 항암제 전구물질에 의한 제3자 효과에 의해 악성종양을 치료할 수 있고 악성종양 세포의 정상 주변 조직으로의 침윤을 억제하여 악성 종양 재발의 방지가 가능하다.

또한, 페리오스틴이 일정 기간 동안 지속적으로 분비되도록 페리오스틴을 오스모틱 펌프(osmotic pump) 등을 이용하여 환부에 주입할 경우, 페리오스틴이 신경줄기세포의 이동을 유도하여 기존의 방법에 비하여 효율적으로 신경줄기세포가 종양조직으로 이동하여 자살 유전자를 발현시킴으로써 뇌종양, 폐암, 유방암 및 난소암 등 각종 암질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

또한, 본 발명에서는 페리오스틴의 신경줄기세포 유도능을 확인하였으며 본 발명이 속하는 기술분야에서의 신경줄기세포를 이용한 신경조직의 재생방법 및 이를 통한 신경질환의 치료방법 등이 개발된 점을 감안할 때, 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포와 신경줄기세포를 함께 투여하여 신경줄기세포를 신경조직 재생이 요구되는 부위로 유도함으로써 표적 특이적으로 신경조직의 재생이 촉진되도록 할 수 있다. 따라서, 이러한 페리오스틴의 신경줄기세포의 유도 특성과 신경줄기세포에 의한 신경 재생 촉진능은 신경질환의 치료에 보다 효율적으로 응용될 수 있다.

이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

<110> Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> New use of periostin <130> P11-0259KR <150> KR 10-2010-0130889 <151> 2010-12-20 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 836 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile Pro Phe Leu Pro Met Phe Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ile Val 1 5 10 15 Asn Pro Ile Asn Ala Asn Asn His Tyr Asp Lys Ile Leu Ala His Ser 20 25 30 Arg Ile Arg Gly Arg Asp Gln Gly Pro Asn Val Cys Ala Leu Gln Gln 35 40 45 Ile Leu Gly Thr Lys Lys Lys Tyr Phe Ser Thr Cys Lys Asn Trp Tyr 50 55 60 Lys Lys Ser Ile Cys Gly Gln Lys Thr Thr Val Leu Tyr Glu Cys Cys 65 70 75 80 Pro Gly Tyr Met Arg Met Glu Gly Met Lys Gly Cys Pro Ala Val Leu 85 90 95 Pro Ile Asp His Val Tyr Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Ala Thr Thr 100 105 110 Thr Gln Arg Tyr Ser Asp Ala Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile Glu Gly 115 120 125 Lys Gly Ser Phe Thr Tyr Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp Asp Asn 130 135 140 Leu Asp Ser Asp Ile Arg Arg Gly Leu Glu Ser Asn Val Asn Val Glu 145 150 155 160 Leu Leu Asn Ala 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Sequence <220> <223> primer <400> 10 actgctcctg gatgcactct 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agatgcgaaa gctcaccagt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ccgtcattag gctggacaat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gccttcactt tgagcactcc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ctgctgtact cgctttgcag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 agcagcttcc atgtcctgag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gaagttgctg gtgagcttcc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gactccggaa acattctcca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ctgacagtcg cagttgcatt 20 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 agcaatggcc tctacagtcg cagc 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gcttggagag aaacccagaa agtc 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ttcatcattt tcatagttac attc 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cattaagtgt ttaaaaatct tttt 24 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gagtcaccgc cagccacacc acggc 25 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gtttgtaatc gatggcttct ggctgc 26

Claims

신경줄기세포의 이동을 유도하는 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포와, 자살유전자 또는 암억제 유전자를 발현하는 신경줄기세포를 포함하는 암치료용 키트.
제1항에 있어서,
상기 자살유전자에 의해 항암물질로 전환되는 항암제 전구물질을 더 포함하는 암치료용 키트.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 페리오스틴은 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 암치료용 키트.
제1항 또는 제2항에 있어서,
뇌종양, 난소암, 폐암 및 유방암으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 암을 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 암치료용 키트.
제2항에 있어서,
상기 자살 유전자는 HSV-TK(Herpes simplex virus-thymidine kinase) 또는 사이토신 데아미네이즈(cytosine deaminase)인 것을 특징으로 하는 암치료용 키트.
제5항에 있어서,
상기 자살 유전자가 HSV-TK인 경우 상기 항암제 전구물질은 GCV(ganciclovir)이고, 상기 자살 유전자가 사이토신 데아미네이즈인 경우 상기 항암제 전구물질은 5-FC(5-fluorocytosine)인 것을 특징으로 하는 암치료용 키트.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 암억제 유전자는 PEX, Trail, 또는 IFN-β인 것을 특징으로 하는 암치료용 키트.
신경줄기세포의 이동을 유도하는 페리오스틴 또는 페리오스틴을 분비하는 세포와, 신경줄기세포를 포함하는 신경질환 또는 뇌질환을 치료 및 예방하는 조성물.
제8항에 있어서,
상기 신경질환은 뇌질환, 말초신경손상, 근위축성 축색 경화증 또는 말초신경질환이고, 상기 뇌질환은 치매, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 간질, 중풍, 뇌졸증, 허혈성 뇌질환, 뇌종양 또는 퇴행성 뇌질환인 것을 특징으로 하는 신경질환 또는 뇌질환을 치료 및 예방하는 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 페리오스틴은 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 신경질환 또는 뇌질환을 치료 및 예방하는 조성물.