KR101954777B1 - Chip를 유효성분으로 포함하는 oct4의 발현을 억제하거나 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 생물학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CHIP를 이용하여 OCT4의 활성 또는 발현을 조절할 수 있고, 구체적으로 CHIP를 유효성분으로 포함하여 암 줄기세포의 줄기세포성을 유지하는데 중요한 역할을 담당하고 있는 OCT4 단백질과 이의 mRNA의 발현을 억제하거나, 이의 유비퀴틴화를 촉진하는 효과를 달성할 수 있다.

Description

CHIP를 유효성분으로 포함하는 OCT4의 발현을 억제하거나 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 생물학적 조성물{OCT4 expression or ubiquitination regulating composition comprising CHIP}
본 발명은 CHIP를 유효성분으로 포함하는 OCT4의 발현 또는 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 생물학적 조성물에 관한 것이다.
최근 암세포 내에 암을 일으키는 세포가 따로 존재하고, 이 세포들은 줄기세포의 특성을 가지고 있으며, 이와 같은 세포들이 암을 발생시키고 있다는 연구결과가 보고된 바 있다. 이러한 세포들은 암세포에서 줄기세포와 비슷한 성질을 가지고 있는 종양세포라 하여 "암 줄기 유사 세포(SC-like cancer cell;CSC)" 또는 "암 줄기세포"라고 명명하였다.
암 줄기세포는 무제한 재생능력을 가진 암세포로, 급성골수성 백혈병(leukemia)에서 처음 증명되었고, 최근에는 유방암을 포함한 일반 고형암에서도 확인된 바 있다. 종양 내에서 암줄기세포는 그들의 특성을 유지시켜 줄수 있는 미세환경(niche)에 의해 존재하게 되며, 다양한 면역세포, 기질세포, 암세포, 세포외 기질을 포함하는 이 미세환경은 암줄기세포가 아닌 세포에 암줄기세포의 특성을 부여하기도 한다. 암 줄기세포는 다른 암세포와는 달리 휴지기 상태에 머물러 있으며, 전이암세포에 비해 공격성이 적은 형태를 보이고 있다. 따라서 항암제의 공격에서 배제되어 살아남게 되고 소수로 종양내에 존재하던 암줄기세포가 염증이나 독성물질 등의 외부공격으로 인해 활성화되면 빠른 속도로 세포주기로 들어가 증식할 수 있는 능력을 갖게 된다.
상기 암 줄기세포에서, OCT4 단백질은 줄기세포의 다능성(pluripotent) 특성과 관련이 있는 인자로, 핵심전사조절자이며, DNA 결합부위를 가지고 있고, 비정형화된 구조를 가지는 전사활성부위(transactivation domain)를 가지고 있다고만 알려져 있을 뿐, CHIP와의 상호결합 관계에 대해서는 아직까지 밝혀진 바가 없다.
이에 본 발명에서 CHIP가 OCT4와 직접적인 상호작용을 형성하고, OCT4 단백질 안정성을 감소시켜, 유방암의 암줄기세포 특성을 조절하는 것을 밝혀냄으로써, CHIP를 유효성분으로 포함하여 OCT4의 활성 또는 발현을 조절하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
특허문헌 1. 대한민국 공개특허 제10-2014-0061277호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 이루어진 CHIP를 유효성분으로 포함하여 OCT4의 발현을 억제하거나 OCT4의 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 생물학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 CHIP를 과발현시킴으로써 OCT4의 발현을 억제하거나 OCT4의 유비퀴틴화를 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, CHIP를 유효성분으로 포함하여 OCT4의 발현을 억제하거나 OCT4의 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 생물학적 조성물을 제공한다.
상기 생물학적 조성물은 생체 외(in vitro) 유방암 줄기세포를 대상으로 하는 것을 특징으로 한다.
상기 CHIP는 서열번호 1로 이루어진 것이고, 상기 OCT4는 서열번호 2로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 인간을 제외한 포유동물의 CHIP을 과발현 시킴으로써 OCT4의 발현을 억제하거나 OCT4의 유비퀴틴화를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 서열번호 2로 이루어진 OCT4의 284번째 잔기가 라이신에서 아르기닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 돌연변이 OCT4 단백질을 제공한다.
상기 OCT4 돌연변이체는 서열번호 3으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
상기 OCT4는 유방암 줄기세포 유래 OCT4인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 돌연변이 OCT4 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명은 CHIP를 이용하여 OCT4의 활성 또는 발현을 조절할 수 있고, 구체적으로 CHIP를 유효성분으로 포함하여 암 줄기세포의 줄기세포성을 유지하는데 중요한 역할을 담당하고 있는 OCT4 단백질과 이의 mRNA의 발현을 억제하거나, 이의 유비퀴틴화를 촉진하는 효과를 달성할 수 있다.
아울러, 본 발명은 OCT4에 있어서, CHIP E3 리가아제 결합 부위인 284 번째 잔기를 돌연변이 시킴으로써, CHIP E3 리가아제에 대한 안정성이 개선된 돌연변이 OCT4 단백질을 개발하였다. 구체적으로 OCT4 단백질의 284 번째 잔기인 라이신을 아르기닌으로 치환한 돌연변이 OCT4 단백질은, CHIP E3 리가아제와 결합하는 능력을 억제시킴으로써 단백질 안정성이 개선되어 유비퀴틴화가 유도되지 않으므로, 효율적으로 암 줄기세포를 증식 및 전이시킬 수 있다.
도 1은 일반적인 배양조건과 비교하여, 맘모스피어 배양중인 MDA-MB-231과 MCF7 유방암 세포주 각각을 마이크로어레이 분석을 통해 다양한 E3 리가아제의 발현을 측정하여 나타낸 결과이다.
도 2는 부착 배양된 유방암 세포주(MCF7, MDA-MB-231)와 맘모스피어 배양된 유방암 세포주(MCF7, MDA-MB-231) 및 재부착 배양된 유방암 세포주에서 CHIP의 발현 수준을 분석한 RT-PCR(상단), 웨스턴 블롯(WB)(하단)의 결과이다. GARDH는 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 3은 MDA-MB-231, MCF7 유방암 세포주에 바이러스 시스템(viral system)을 통해 CHIP 과발현 안정세포주(CHIPOVER)와 CHIP-shRNA를 형질주입된 CHIP 결핍 안정세포주(CHIPKD)(shCHIP_#1, shCHIP_#2, shCHIP_#3)를 제조하고, 각 세포주를 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 이때 WT는 와일드형 세포주이다.
도 4는 CHIP 과발현 안정세포주(CHIPOVER)와 CHIP-shRNA 형질주입된 CHIP 결핍 안정세포주(CHIPKD)(shCHIP_#1, shCHIP_#2, shCHIP_#3)에서 맘모스피어 형성능을 측정하기 위하여, 상기 각 세포주를 15일 동안 맘모스피어 배양한 후 생성된 맘모스피어를 촬영한 사진이다.
도 5는 CHIP 과발현 안정세포주(CHIPOVER)와 CHIP-shRNA 형질주입된 CHIP 결핍 안정세포주(CHIPKD)(shCHIP_#1, shCHIP_#2, shCHIP_#3)에서 맘모스피어 형성능을 측정하기 위하여, 상기 각 세포주를 15일 동안 맘모스피어 배양한 후, 1000 개의 세포 중에서 생성된 맘모스피어의 수를 정량적으로 분석하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 ± 표준편차(SD)(n=3)
도 6은 mouse IgG(Santa Cruz, sc-3877), anti-FLAG(Sigma, F1804) 항체를 이용한 면역침강법으로, CHIP 복합체를 MDA-MB-231 세포주로부터 친화도를 이용해 정제분리(affinity-purificated)하고, 이를 SDS-PAGE 겔상에 펼친 후, 상기 항체로 이용한 웨스턴 블럿팅으로 서로 동일한 분자량의 단백질 밴드가 나타나는지를 확인한 결과이다(시료 1은 면역침강법에 사용된 MDA-MB-231 세포주로부터 정제분리한 CHIP 복합체이고, 시료 2는 mouse IgG 항체를 접합한 레진으로 면역침강한 분획이고, 시료 3은 anti-FLAG 항체를 접합한 레진으로 면역침강한 분획이다). 도 6의 우측에 위치한 반다이그램(Venn diagram)은 면역침감법의 확인된 단백질 사이 관계를 정리한 것이다.
도 7은 Ingenuity Pathway 분석(IPA)를 통해 CHIP와 Oct4의 분자 상호작용 네트워크를 분석한 것이다.
도 8은 CHIP siRNA(siRNA#1, siRNA#2, siRNA#3)로 형질주입된 MDA-MB-231와 MCF7 세포에서, 특정 유전자(Oct4, Nanog, Sox2, GAPDH) mRNA와 특정 단백질(CHIP, OCT4, NANOG, SOX2, GAPDH) 발현수준을 RT-PCR(상단)과 웨스턴 블롯(하단)으로 측정한 결과이다. 이때, 대조군인 scRNA는 무작위 siRNA(scrambled siRNA)로 형질주입된 MDA-MB-231와 MCF7을 의미한다.
도 9는 empty(대조군) 또는 FLAG_CHIP 발현 벡터로 형질 주입한 MDA-MB-231와 MCF7 세포를 제조하고, 40 시간이 지난 후, 20 μM MG132로 8 시간 동안 처리하였다. 이들 세포에서 Oct4, GAPDH mRNA(RT-PCR 분석)와 CHIP, OCT4, GAPDH 단백질(웨스턴 블롯) 발현 수준을 측정한 결과이다. 이때, FLAG_CHIP 발현 벡터로 형질 주입한 세포는 도면의 상단 FLAG_CHIP 라인에 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였고, MG132로 처리한 세포는 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 10은 다양한 농도의 FLAG_CHIP 발현 벡터로 형질 주입한 MDA-MB-231와 MCF7 세포를 제조하고, 40 시간이 지난 후 20 μM CHX로 8 시간동안 처리하였다. 이들 세포에서 Oct4와 FLAG_CHIP의 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. GAPDH는 로딩 대조군으로 사용하였다. 이때, FLAG_CHIP 발현 벡터의 주입된 농도가 증가할수록 도면의 상단 FLAG_CHIP 라인에서의 바의 두께도 두꺼워지게 표기하였다. 또한 CHX로 처리한 세포는 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 11은 CHIP와 OCT4 사이 상호작용을 분석하기 위해, mouse IgG(Santa Cruz, sc-3877), FLAG_CHIP을 형질주입시킨 MDA-MB-231 세포를 anti-FLAG(Sigma, F1804) 항체를 이용한 면역침강법으로 검출한 결과이다. 이때 시료 1은 mouse IgG 항체를 접합한 레진으로 면역침강한 분획이고, 시료 2는 anti-FLAG 항체를 접합한 레진으로 면역침강한 분획이다.
도 12는 FLAG_CHIP WT로 형질주입된 HEK293 세포 또는 점돌연변이인 K30A와 H260Q 및 Oct4 발현 벡터와 동시에 형질주입된 HEK293 세포를 제조한 후, 40 시간이 지난 다음, 이를 anti-FLAG(Sigma, F1804) 항체를 이용한 면역침강법으로 검출한 결과이다.
도 13은 CHIP_WT, CHIP_K30A, CHIP_H260Q으로 형질주입된 MDA-MB-231과 MCF7를 제조한 후, 40 시간이 지난 다음 20 μM CHX로 8시간 동안 처리하였다. GADPH는 로딩 대조군으로 사용하였다. 이때, 해당하는 유전자를 형질 주입한 세포는 도면의 상단 해당하는 유전자 명칭 라인에 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였고, CHX로 처리한 세포는 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 14는 siRNA#1로 형질주입된 MDA-MB-231 세포(CHIP 결핍 세포; siRNA#1)를 제조하고, 40 시간이 지난 후 여기에 20 μM MG132를 8시간 처리하였다. 상기 형질주입된 세포의 용해는 denaturing 조건에서 수행되고, OCT4 항체를 사용하여 면역침강한 후, OCT4 폴리유비퀴틴화를 웨스턴 블롯으로 분석하여 나타낸 결과이다.
도 15는 FLAG_CHIP 과발현된 세포(MDA-MB-231)를 제조하고, 40 시간이 지난 후 여기에 20 μM MG132를 8시간 처리하였다. 상기 형질주입된 세포의 용해는 denaturing 조건에서 수행되고, OCT4 항체를 사용하여 면역침강한 후, OCT4 폴리유비퀴틴화를 웨스턴 블롯으로 분석하여 나타낸 결과이다.
도 16은 FLAG_CHIP 와일드형 또는 돌연변이형(FLAG_CHIP_K30A, FLAG_CHIP_H260Q))으로 형질주입된 MDA-MB-231 세포를 제조하고, 40 시간이 지난 후 여기에 20 μM MG132를 8시간 처리하였다. 상기 형질주입된 세포의 용해는 denaturing 조건에서 수행되고, OCT4 항체를 사용하여 면역침강한 후, OCT4 폴리유비퀴틴화를 웨스턴 블롯으로 분석하여 나타낸 결과이다.
도 17은 284번째에 디글리신기를 갖는 284번째 라이신기로 돌연변이된 OCT4를 측정한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 18은 48 시간동안 지적된 위치에 돌연변이를 형성하고, 이를 형질주입하여 제조된 MCF7_Oct4KD 세포에서, OCT4(와일드형 또는 돌연변이형)과 CHIP의 상호관계를 확인하기 위하여, 면역침강법으로 분석한 결과이다. 이때, 해당하는 유전자(FLAG_CHIP, Oct4, Oct4_K284R)를 형질 주입한 세포는 도면의 상단 해당하는 유전자 명칭 라인에 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 19는 다양한 농도의 FLAG_CHIP 또는 OCT4_K284R로 형질주입된 Oct4 결핍 안정세포주(MDA-MB-231_Oct4KD, MCF7_Oct4KD)를 제조하고 40 시간이 지난 후, 20 μM CHX 8 시간동안 처리한 다음, 각각의 세포에서 돌연변이된 OCT4, FLAG_CHIP의 단백질 발현수준을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다. 여기서 GAPDH는 로딩 대조군으로 사용하였다. 이때, FLAG_CHIP 발현 벡터의 주입된 농도가 증가할수록 도면의 상단 FLAG_CHIP 라인에서의 바의 두께도 두꺼워지게 표기하였다. 또한 Oct4_K284R 유전자를 형질 주입한 세포는 도면의 상단 Oct4_K284R 라인에 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였고, CHX로 처리한 세포는 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 20은 해당하는 유전자(Oct4_WT, Oct4_K284R, FLAG_CHIP) 중에서 어느 하나 이상으로 형질주입된 Oct4 결핍 안정세포주(MDA-MB-231_Oct4KD, MCF7_Oct4KD)를 제조하고 40시간이 지난 후, 20 μM MG132 8 시간동안 처리하였다. 상기 각각의 세포 용해물(cell lysates)를 denaturing 조건에서 제조하고 OCT4 항체를 이용하여 면역침강법을 수행한 결과이다. OCT4의 폴리-유비퀴틴화는 웨스턴 블롯으로 측정하여 관찰하였다.
이때, 해당하는 유전자를 형질 주입한 세포는 도면의 상단 해당하는 유전자 명칭 라인에 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였고, MG132로 처리한 세포는 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 21은 MCF7세포에서 리포터 분석을 통해 측정된 전사활성화(transcriptional activation)를 나타낸 그래프이다. 이때 세포는 48 시간동안 Oct4 리포터 벡터로 형질주입된 것이거나, CHIP siRNA 또는 FLAG_CHIP 발현 벡터로 동시에 형질주입된 것일 수 있다.
도 22 및 도 23은 48 시간동안 CHIP siRNA, CHIP siRNA와 Oct4 siRNA로 동시에 형질주입되거나, 또는 Oct4 siRNA로 형질주입된 유방암 세포(MDA_MB-231, MCF7)의 세포 독성을 WST 분석으로 측정하여 나타낸 그래프이다. 여기서 모든 데이터는 ± 표준편차(SD)(n=3)로 나타내었고, *는 P<0.05, **는 p<0.01이고, 통계분석은 Student's t-test를 사용하여 수행되었다.
도 24 및 도 25는 48 시간동안 Oct4_WT, Oct4_WT와 FLAG_CHIP로 동시에 형질주입되거나, Oct4_K284R로 형질주입되거나, 또는 Oct4_K284R, FLAG_CHIP로 동시에 형질주입된 유방암 세포(MDA_MB-231(a), MCF7(b))의 실험방법의 9) 측면개체군(side population) 분석에 따라 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 여기서 모든 데이터는 ± 표준편차(SD)(n=3)로 나타내었고, *는 P<0.05, **는 p<0.01이고, 통계분석은 Student's t-test를 사용하여 수행되었다.
도 26은 실험예 11로부터 제조된 각각의 동물모델로부터 분리한 종양 조직을 촬영한 사진이다.
도 27은 실험예 11로부터 제조된 각각의 동물모델로부터 분리한 종양 조직의 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 28은 실험예 11로부터 제조된 각각의 동물모델로부터 분리한 종양조직의 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 29는 실험예 11로부터 제조된 각각의 동물모델로부터 분리한 이종이식편 종양을 CHIP와 OCT4 항체를 사용하여 면역침강법으로 분석한 결과이다. 여기서 스케일바는 100 ㎛이다.
도 30은 누드 마우스에 다양한 유전자로 형질주입된 안정 세포주(MDA-MB-231 세포)(1 × 106)를 꼬리 정맥을 통해 주입하고 12주간 사육하여, 제조된 각각의 폐로 전이된 이종이식 동물모델 폐로부터 분리한 종양 조직에서 전이절의 수를 카운팅하여 기록한 그래프이다.
도 31은 무재발(relapse free), 원격 전이(distant metastasis)와 생존기간(progression survival)을 Kaplan-Meier 플롯 분석을 사용하여 CHIP 발현과 함께 분석한 결과이다. 데이터는 ± 표준편차(SD)(n=3)로 나타내었고, *는 P<0.05, **는 p<0.01이고, 통계분석은 Student's t-test를 사용하여 수행되었다.
도 32는 본 발명의 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머를 표기한 표이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명에서 용어 "줄기세포"는 (stem cell)는 어떤 조직으로든 발달할 수 있는 세포를 의미한다. 기본적인 특징으로는 두 가지가 있는데, 우선 반복 분열하여 자신을 만들어 내는 자기 재생산(self-renewal), 그리고 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는다.
또한 본 발명에서 용어 "암 줄기세포(CSC)"는 반복 분열하여 자신을 만들어 내는 자기재생산능 및 분화능력을 가지고 있는 암 세포로, 분화시 암세포로 분화하는 능력을 가진 미분화 세포를 의미한다.
본 발명에서 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체 발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포 또는 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부분 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.
"미분화성"이라는 용어는 줄기세포에서 적어도 1개 이상의 미분화 마커 또는 여러 가지 항원 분자의 발현에 의해 확인할 수 있는 미분화한 상태를 나타내는 성질을 의미한다. 줄기세포의 미분화한 상태는 줄기세포가 거의 영구적으로 또는 장기간 세포 증식 가능하고, 정상적인 핵(염색체)형을 나타내며, 적당한 조건에서 3 배엽의 모든 계보의 세포로 분화가능한 능력을 가진 상태를 의미한다.
"암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 본 발명에서 암은 유방암을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 일 측면은 CHIP를 유효성분으로 포함하여 OCT4의 발현을 억제하거나 OCT4의 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 생물학적 조성물에 관한 것으로, CHIP(carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein) 단백질이 OCT4의 발현을 억제하거나 OCT4의 유비퀴틴화를 촉진하는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
유방암 세포주인 MDA-MB-231, MCF7을 사용하여 암 줄기세포(stem cell-like cancer cells;CSCs)의 특성에 따른 맘모스피어 형성을 분석하고자 하였고, 상기 암 줄기세포는 전체 암세포 중에서 매우 소량 존재하기 때문에, 암 줄기세포의 분석을 위해서는 이를 대량으로 형성하고 증식시키는 것이 필요하다. 이를 위해 단순 생체 외 세포 배양기술(맘모스피어 배양)을 통해 암 세포의 벌크 증식함으로써, 암세포 중에서 고 위험성, 고발암성을 갖는 암 줄기세포를 배양할 수 있다. MDA-MB-231, MCF7 유방암 세포를 맘모스피어 배양한 후, 관찰한 결과 상기 두 세포주에서 CHIP E3 유비퀴틴 리가아제가 유의하게 하향 조절된 것은 확인하였으나, 아직까지 암 줄기세포에서의 CHIP에 대한 역할이 제대로 밝혀진 바는 없다.
한편, 암 줄기세포에서 OCT4의 발현은 줄기세포의 다능성(pluripotent) 특성과 관련이 있고, 포유류 배아 발생의 초기 단계를 제어할 수 있는 필수 인자이며, 핵심전사조절자로, DNA 결합부위를 가지고 있고, 비정형화된 구조를 가지는 전사활성부위(transactivation domain)를 가지고 있다고 알려져 있을 뿐, CHIP와의 상호결합 관계에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
이에 본 발명에서 CHIP가 OCT4와 직접적인 상호작용을 형성하고, OCT4 단백질 안정성을 감소시켜, 유방암의 암줄기세포 특성을 조절하는 것을 밝혀냄으로써, CHIP를 유효성분으로 포함하여 OCT4의 활성 또는 발현을 조절하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 CHIP와 OCT4의 상호작용 관계를 파악함으로써, CHIP를 통해 OCT4의 하향 또는 상향 조절 규명에 대한 기반 기술을 제공하는 것으로, 구체적으로 CHIP를 유효성분으로 포함하여 OCT4의 발현을 억제하거나 OCT4의 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 생물학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 상기 CHIP는 OCT4와 내인적 및 외인적으로 직접적 상호작용 또는 결합을 통해 OCT4에 작용함으로써, OCT4의 발현량을 억제하거나 유비퀴틴화를 촉진할 수 있다.
본 발명에 의하면 CHIP가 과발현된 환경에서는(예를 들어 CHIP 과발현 세포(CHIPover) OCT4 단백질 또는 Oct4 mRNA 발현 수준이 모두 저하되었다. 또한 CHIP가 제거된 환경에서는(예를 들어 CHIP 결핍 세포(CHIPKD)) OCT4 단백질 또는 Oct mRNA 발현 수준이 모두 증가하였다. 이는 CHIP가 OCT4 단백질 또는 Oct4 유전자에 직접적으로 관여하여 OCT4의 발현 또는 OCT4의 유비퀴틴화를 촉진한다.
본 발명에 의하면, 상기 CHIP를 유효성분으로 하는 조성물은 생체 외에서 CHIP를 유효성분으로 포함하여 OCT4의 발현을 억제하거나 OCT4의 유비퀴틴화를 촉진할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 CHIP는 E3 리가아제 활성을 이용한 번역 후 수정(post-translational modification)을 통해 OCT4의 유비퀴틴화를 조절 할 수 있다는 것을 확인하였다. 즉 생체 외 유방암 세포에서, CHIP의 고갈은 곧 OCT4의 단백질 양을 증가시키고, CHIP의 과발현은 OCT4 단백질 양을 감소시킨다. 이러한 CHIP에 의한 OCT4 단백질 양의 조절은 유비퀴틴화와 전사활성 기작을 통해 제어된다. 생체 외 CHIP 과발현된 세포는 OCT4 단백질과 Oct4 mRNA가 감소될 뿐만 아니라, OCT4의 유비퀴틴화를 촉진하는 것을 확인하였으며, 이러한 조절은 OCT4의 248번째 라이신(Lysine)에서 일어나는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통해 생체 외에서 CHIP가 OCT4의 기능을 유비퀴틴화 조절을 통해 억제한다는 것을 확인하였고, 유방암줄기세포에 대한 새로운 타겟으로 사용될 수 있는 가능성이 있다.
본 발명의 다른 측면은 CHIP(carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein)를 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 서열번호 1로 이루어진 CHIP 단백질은 유방암 줄기세포의 OCT4 단백질의 발현을 억제하거나 OCT4 단백질의 유비퀴틴화를 촉진함으로써, 유방암 줄기세포의 증식 또는 전이(폐로의 전이)를 억제하는 효과를 가지는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명에 따른 약학적 조성물을 통하여 유방암세포의 증식과 전이를 억제함으로써, 유방암 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "치료"란 약학적 조성물의 투여에 의해 유방암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명의 CHIP 단백질이 OCT4 단백질의 발현을 억제하거나 OCT4 단백질의 유비퀴틴화를 촉진하여 세포 내 OCT4의 생성을 억제하여, 인 비트로와 인 비보 상에서 유방암 세포 중에서 암 줄기세포의 증식과 전이를 방지하는 항암 효능을 확인하여 유방암 치료용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 측면은 인간을 제외한 포유동물의 CHIP을 과발현 시킴으로써 OCT4의 발현을 억제하거나 OCT4의 유비퀴틴화를 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 상기 CHIP는 유방암 줄기세포로부터 유래된 것으로, 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다. 상기 OCT4는 서열번호 2로 표시되는 것일 수 있다.
앞서 살펴본 바와 같이 생체 외 유방암 줄기세포에 있어서, OCT4의 유비퀴틴화에 관여하는 E3 리가아제는 CHIP가 있으며, 여타 다른 E3 리가아제(WWP2, Itch 등)는 관여하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호 2로 이루어진 OCT4의 284번째 잔기가 라이신에서 아르기닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 돌연변이 OCT4 단백질에 관한 것으로, 이는 CHIP로 유도되는 유비퀴틴화에 대하여 안정성이 개선되었다. 이는 유방암 줄기세포의 증식과 측면개체군을 증식시키는 활성을 갖는 것으로, CHIP 과발현에 따른 유비퀴틴화로 인해 단백질이 파괴되지 않는 안정성을 갖는다.
상기 OCT4는 유방암 줄기세포로부터 유래된 것이 바람직하나, 화학합성법이나 유전공학적인 방법에 의하여 제조된 OCT4도 본 발명의 보호범위에 포함된다. 상기 돌연변이 OCT4 단백질은 서열번호 3을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명에서 CHIP 유비퀴틴화에 안정성을 갖는 돌연변이 OCT4 단백질을 이용하여 안정성을 증가시킬 수 있었다. 이는 전체 유방암세포 중에서 소량 존재하는 유방암 줄기세포의 낮은 증식과 전이 문제점을 극복함으로써, 전체 유방암세포로부터 경제적인 유방암 줄기세포의 생산에 유용하게 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 효율적으로 이종이식 유방암 동물모델을 제조할 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
실시예
1) 마우스 및 식이
동물 실험에 대한 모든 사항은 연세대학교 동물실험위원회의 규정을 준수하였다. 상기 이종이식 마우스는 문헌 Lee HW, et al.(2014) Celastrol inhibits gastric cancer growth by induction of apoptosis and autophagy. BMB reports47(12):697-702를 참고하여 수행하였고, 폐로 전이된 마우스는 Wang YG, et al.(2012) Galectin-3 increases the motility of mouse melanoma cells by 22 regulating matrix metalloproteinase-1 expression. Experimental & molecular medicine44(6):387-393을 참고하여 제조하였다.
2) 세포 배양(adherent culture)('부착 배양이라고도 한다)
인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231과 MCF7을 ATCC로부터 얻었고, 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항체(Invitrogeln)이 함유된DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지를 사용하여 부착배양하였다. 세포 배양은 5% CO2, 가습된 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양하였다.
3) 형질주입( transfection )된 유방암 세포
CHIP의 형질주입(transfection)은 와일드형(Wild Type)와 돌이변이형을 사용하였고, 발현 벡터[Seo J, et al.(2016) CHIP controls necroptosis through ubiquitylation-and lysosome-dependent degradation of RIPK3. Nature cell biology18(3):291-302]와 Oct4 발현벡터는 [Cho Y, et al.(2015) Cleaved CD44 intracellular domain supports activation of stemness factors and promotes tumorigenesis of breast cancer. Oncotarget6(11):8709-8721.]을 사용하였다. CHIP와 Oct4 siRNA는 Lipofectamine 200과 Lipofectamine RNAiMAX 시약(Invitrogen)을 사용하였고, 시약의 매뉴얼에 따라 수행하였다.
하기 siRNA는 COSMOGENETECH에서 구입하였고, 실험에서 사용을위해 형질주입(transfection) 후에 세포를 회수하였다.
CHIP siRNA #1(서열번호 4)
5'-CCCAAGUUCUGCUGUUGGACU-3'
CHIP siRNA #2(서열번호 5)
5'-GAAGAGGAAGAAGCGAGACAU-3'
CHIP siRNA #3(서열번호 6)
5'-GCAGUCUGUGAAGGCGCACUU-3'
Oct4 siRNA(서열번호 7)
5'-UUAAGUUCUUCAUUCACUAAG-3'
4-1) 맘모스피어 배양( mammosphere culture)
각 세포주를 100 ㎜ 조직 배양 디쉬(tissue culture dish) 상에서 10 % FBS가 보충된 DMEM 중에서 단층으로 세포를 부착 배양하였다. 세포 배양은 5% CO2, 가습된 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양하였다. 80-90% 컨플루언시 되었을 때 세포를 스크래퍼(cell scraper)를 사용하여 떼어내고, 세척한 후 맘모스피어 배양용 배지에 재부유 시켰다.
맘모스피어 배양용 배지는 MEBM(Mammary Epithelium Basal Medium; Lonza)(B27(Gibco), 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF(PeproTech)) 배지를 사용하였고, 상기 재부유물을 ultralow attachment plated(corning)에 1000 cells/ml가 되도록 접종한 후, 24 시간 내지 3 주까지 배양하였다. 세포 배양은 5% CO2, 가습된 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양하였다. 일주일에 한번씩 세포 배양물을 원심분리하여 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척한 후 얻어진 세포 펠렛에 아쿠타제(accutase)(Invitrogen, Cat, A111050)을 1 ㎖ 첨가하고, 37 ℃에서 5 내지 10분간 인큐베이션하여 세포 덩어리를 단일 세포로 풀어준 후, 7 일 내지 10일 동안 배양하며 계대배양하였다. 계대배양한 수에 따라 sphere P#1, sphere P#2 ... sphere P#n으로 나타내었다.
맘모스피어를 15일 간 배양한 후, 직경>50 μm에서 맘모스피어의 수를 카운트하였다.
4-2) 재부착 배양(re-adherent culture)
상기 4-1) 맘모스피어 배양(sphere P#1 또는 sphere P#2 또는 ... sphere P#n)한 세포 배양물을 원심분리하여 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척한 후 얻어진 세포 펠렛에 아쿠타제(accutase)(Invitrogen, Cat, A111050)을 1 ㎖ 첨가하고, 37 ℃에서 5 내지 10분간 인큐베이션하여 세포 덩어리를 단일 세포로 풀어준 후, 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항체(Invitrogeln)이 함유된DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지를 사용하여 재부착 배양하였다. 세포 배양은 5% CO2, 가습된 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양하였다. 이후 7 일 내지 10일 동안 배양하고 계대배양하였다. 계대배양한 수에 따라 re-adherent P#1, re-adherent P#2 ... re-adherent P#n으로 나타내었다.
5) 돌연변이 유발( K284R )
라이신 284의 위치를 아르기닌으로 site-directed 돌연변이 유발을 통해 point mutant 시켰다(K284R). 이때 사용한 프라이머는 하기에 나타내었다.
[서열번호 8] 포워드 프라이머
AGCGAGGCAAGCGATCAAGCAG
[서열번호 9] 리버스 프라이머
GGCGCCGGTTACAGAACCACAC
6) CHIP 과발현 안정세포주( CHIP OVER )와 CHIP- shRNA 를 형질주입된시킨 CHIP 결핍 안정세포주( CHIP KD )( shCHIP _#1, shCHIP _#2, shCHIP _#3) 및 Oct4 - shRNA 를 형질주입된 Oct4 결핍 안정세포주( Oct4 KD )( shOct4 _#1)제조.
MDA-MB-231, MCF7 유방암 세포주에 바이러스 시스템을 사용하여, CHIP를 과발현하거나 결핍시킨 안정세포주를 제조하고자 하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
CHIP의 결핍 안정세포주(stable cell line) 및 Oct4 결핍 안정세포주를 제조하기 위해, 상기 CHIP-shRNA-발현 렌티바이러스(Lentiviral vector) 또는 Oct4-shRNA-발현 렌티바이러스인 CHIPKD와 Oct4KD는 세포에서 3'UTR을 타겟으로하고, 이는 Sigma로부터 구입하였다(shCHIP_#1:TRCN0000007525, shCHIP_#2:TRCN0000007526, shCHIP_#3:TRCN0000007527, shOct4_#1:TRCN0000235522). 렌티바이러스 벡터의 제조와 안정세포주의 형질전환 과정은 Kim SJ, et al.(2010) Galectin-3 increases gastric cancer cell motility by up-regulating fascin-1 expression. Gastroenterology138(3):1035-1045 e1031-1032를 참고하였다.
6) RNA 분리 및 실시간 RT- PCR 분석
RNA 분리는 TRIzolㄾ 시약(Invitrogen)을 사용하였다. RT-PCR 분석은 역상 transcription 시스템(TOYOBO)를 사용하여 수행하였고, 프라이머는 아래 표 1과 같다(도 32). 상기 PCR은 Ex-Taq(TaKaRa) 매뉴얼에 따라 수행하였다.
서열번호 프라이머 시퀀스(5'->3') 용도
서열번호 10 CHIP 포워드 프라이머 CGACTACCTGTGTGGCAAGA CHIP RT-PCR
서열번호 11 CHIP 리버스 프라이머 CAAGTTGGGGATGAGCTGTT
서열번호 12 Nanog 포워드 프라이머 ACCTTCCAATGTGGAGCAAC Nanog RT-PCR
서열번호 13 Nanog 리버스 프라이머 GAATTTGGCTGGAACTGCAT
서열번호 14 Sox2 포워드 프라이버 AAAACAGCCCGGACCGCGTC Sox2 RT-PCR
서열번호 15 Sox2 리버스 프라이버 CTCGTCGATGAACGGCCGCT
서열번호 16 Oct4 포워드 프라이버 CTCACCCTGGGGGTTCTATT Oct4 RT-PCR
서열번호 17 Oct4 리버스 프라이버 CTGGTTCGCTTTCTCTTTCG
서열번호 18 GAPDH 포워드 프라이버 GGCTGCTTTTAACTCTGGTA GAPDH RT-PCR
서열번호 19 GAPDH 리버스 프라이버 ACTTGATTTTGGAGGGATCT
서열번호 20 Oct4_K284R 포워드 프라이버 AGCGAGGCAAGCGATCAAGCAG Oct4 K284R mutagenesis RT-PCR
서열번호 21 Oct4_K284R 리버스 프라이버 GGCGCCGGTTACAGAACCACAC
7) 마이크로어레이 분석
상기 유전자 발현은20,889 성적증명서를 가지는 고밀도의 올리고뉴클레오타이드 마이크로 어레이(HG-U133 플러스 2.0, 어피 메트릭스, 산타 클라라, CA, USA)를 사용하여 세포주에서 분석하였다. Affymetrix GeneChip 발현 분석 매뉴얼(Affymetrix)에 따라 타겟을 제조하고, 마이크로어레이 처리 절차를 수행하였다. 유전자 칩 분석은 Microarray Analysis Suite 5.0, Data Mining Tool 2.0 및 Microarray Database software(Santa Clara, CA, USA)와 Affymetrix GeneChip 매뉴얼을 이용하여 실시하였다.
8) 루시퍼라아제 ( Lucifease ) 분석
Oct4 리포터 분석을 위해, Oct4 프로모터(phOct4-Luc(Takahashi K, et al.(2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell131(5):861-872))를 구축하고, MCF7 세포를 이용하여 CHIP 발현 벡터 또는 CHIP siRNA 및 β-galctosidase 발현 벡터를 형질주입(transfection)하였다. 48 시간 후 세포를 수확하였고, 루시퍼라제 활성은 루시페라제 에세이 분석 시스템(Promega)를 이용하여 측정하였다. 루시페라제 활성은 β-gal 효소 분석 시스템(Promega)을 사용하여 정규화하였다.
9) 측면개체군(side population) 분석
세포를 표시된 벡터 또는 siRNA로 형질주입하고, 48 시간 후에 수확하였다. 1 × 106 세포수를 1 ㎖ 현탁배양액(HBSS, 2% FBS, 10 mM HEPES with 5 ㎍/㎖ Hoechst 33342 dye(Thermo Fisher Scientific), 50 μM verapamil(Sigma))에서 37 ℃ 조건 하에서 60 분간 배양하였다. 세포를 차가운 현탁배양액으로 3 차례 세척하고 2 ㎍/㎖ PI 용액으로 처리하였다. 시료당 20,000 events의 최소한으로 FACSDiva와 Cell Quest Applications(BD Biosciences)를 사용하여 수집하였다.
10) 세포 생존력 분석
세포를 96-웰 배양 플레이트에서 배양하고, CHIP와 Oct siRNA를 동시에 형질주입하거나, CHIP, Oct4 WT 및 K284 돌연변이 발현 벡터로 형질주입하였다. 48 시간 후에, WST 용액(Daeil)을 각각의 웰에 첨가한 다음 1-3 시간이 지나고 나서, 450 ㎚의 파장에서 ELISA 리더기로 흡광도를 측정하였다.
11) 유비쿼틴화 ( ubiquitination ) 분석
유비퀴틴화 분석은 문헌 Lee EW, et al.(2009) Differential regulation of p53 and p21 by MKRN1 E3 ligase controls cell cycle arrest and apoptosis. The EMBO journal28(14):2100-2113을 참고하여 수행하였다.
12) 면역침강법
세포 용해물을 항체(mouse IgG(Santa Cruz, sc-3877), anti-FLAG(Sigma, F1804) 및 anti-Oct4(Santa Cruz, sc-5279))와 함께 배양하였다. 면역침강법은 문헌 Cho Y, et al.(2015) Cleaved CD44 intracellular domain supports activation of stemness factors and promotes tumorigenesis of breast cancer. Oncotarget6(11):8709-8721을 참고하여 수행하였다.
13) 웨스턴블롯
웨스턴블롯을 위해, 다음과 같은 항체들을 사용하였다. anti-GAPDH(sc-25778), anti-CHIP(sc-66830), anti-Nanog(sc-33759), anti-Sox2(sc-20088) 및 anti-Oct4는 Santa Cruz에서 구매하였다. anti-FLAG은 Sigma로부터 구매하였다. HRP conjugated anti-Ub(BML-PW0150)은 ENZO로부터 구매하였다.
상기 단백질은 LAS-300(Fujifilm) 검출기와 ECL 용액(Amersham Life Science)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다.
14) 면역세포화학
이종이식 암 조직을 얻은 후, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde(BIOSESANG))으로 고정하였다. 상기 고정된 암 조직을 파라핀 블록에 봉입시키고, 0.4 ㎛ 크기로 잘라 절편을 제조하였다. 이종이식 암 조직에서 CHIP와 Oct4을 위한 면역세포화학 분석은 Vectastain ABC 키트와 DAB substrate 키트(Vextor Laboratories)를 사용하여, 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
15) 통계 분석
생존 그래프의 Kaplan-Meier 평가는 온라인 자료(http://kmplot.com/analysis)를 사용하여 이루어졌고, 유방암 환자에서의 두 유전자 심볼, STUB1(Affy ID : 217934_x_at)과 POU5F1(Affy ID : 208286_x_at)를 사용하였다.
각 마우스모델 당 암조직 두 개를 얻고, 마우스모델 당 암조직의 부피를 측정하여 분석하였다. 독립 표본 t-검정(Unpaired t-tests)은 이종이식된 마우스 모델의 측정된 암부피를 평가하기 위해 사용되었다.
통계분석은 Student's t-test를 사용하여 수행되었고, 상기 데이터는 P-수치가 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 간주하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism software(version 6; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)을 사용하여 수행되었다.
실험예 1. 맘모스피어 배양중인 유방암 세포주에서 하향 조절된 E3 리가아제의 선별
일반적인 배양조건에서의 유방암 세포주와 비교하여, 맘모스피어 배양중인 MDA-MB-231과 MCF7의 유방암 세포주에서의 E3 리가아제 발현을 확인하였다. 이때, DNA 마이크로 어레이 분석을 통해 수행하였고 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 일반적인 배양조건과 비교하여, 맘모스피어 배양중인 MDA-MB-231과 MCF7 유방암 세포주 각각을 마이크로어레이 분석을 통해 다양한 E3 리가아제의 발현을 측정하여 나타낸 결과이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 몇몇 E3 리가아제는 맘모스피어에서 상향 조절되거나 하향 조절되고 있음을 확인하였다. 허나 본 발명에서는 종양유전자로 조작된 단백질(oncoprotein) 분해와 관련된 E3 리가아제를 선택하고자 하는 것이므로, 상기 도 1 중에서 하향 조절된 E3 리가아제를 선별하였다.
실험예 2. 부착 배양된 유방암 세포주와 맘모스피어 배양된 유방암 세포주에서 CHIP의 발현양상
도 2는 부착 배양된 유방암 세포주(MCF7, MDA-MB-231)와 맘모스피어 배양된 유방암 세포주(MCF7, MDA-MB-231) 및 재부착 배양된 유방암 세포주에서 CHIP의 발현 수준을 분석한 RT-PCR(상단), 웨스턴 블롯(WB)(하단)의 결과이다. GARDH는 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 맘모스피어의 반복 계대 배양된 유방암 세포주 모두에서, CHIP의 발현이 하향 조절되고 있음을 확인하였다. 이후, 이를 다시 재부착배양할 경우 CHIP의 발현 수준이 다시 회복되고 있음을 확인하였다.
실험예 3. CHIP 과발현 안정세포주( CHIP OVER )와 CHIP- shRNA 를 형질주입된 CHIP 결핍 안정세포주( CHIP KD )( shCHIP _#1, shCHIP _#2, shCHIP _#3)
도 3은 MDA-MB-231, MCF7 유방암 세포주에 바이러스 시스템(viral system)을 통해 CHIP 과발현 안정세포주(CHIPOVER)와 CHIP-shRNA를 형질주입된 CHIP 결핍 안정세포주(CHIPKD)(shCHIP_#1, shCHIP_#2, shCHIP_#3)를 제조하고, 각 세포주를 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 이때 WT는 와일드형 세포주이다.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 제조방법을 통해 CHIP 과발현 안정세포주(CHIPOVER)와 CHIP-shRNA를 형질주입된 CHIP 결핍 안정세포주(CHIPKD)(shCHIP_#1, shCHIP_#2, shCHIP_#3)가 제조되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 4. CHIP 과발현 안정세포주( CHIP OVER )와 CHIP- shRNA 형질주입된 CHIP 결핍 안정세포주( CHIP KD )의 맘모스피어 형성능 (forming ability)
도 4는 CHIP 과발현 안정세포주(CHIPOVER)와 CHIP-shRNA 형질주입된 CHIP 결핍 안정세포주(CHIPKD)(shCHIP_#1, shCHIP_#2, shCHIP_#3)에서 맘모스피어 형성능을 측정하기 위하여, 상기 각 세포주를 15일 동안 맘모스피어 배양한 후 생성된 맘모스피어를 촬영한 사진이다.
도 5는 CHIP 과발현 안정세포주(CHIPOVER)와 CHIP-shRNA 형질주입된 CHIP 결핍 안정세포주(CHIPKD)(shCHIP_#1, shCHIP_#2, shCHIP_#3)에서 맘모스피어 형성능을 측정하기 위하여, 상기 각 세포주를 15일 동안 맘모스피어 배양한 후, 1000 개의 세포 중에서 생성된 맘모스피어의 수를 정량적으로 분석하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 ± 표준편차(SD)(n=3)
도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, CHIP 과발현 안정세포주에서 모두 맘모스피어의 크기와 수가 현저히 감소하고 있음을 확인하였다. 이와 대조적으로 CHIP 결핍 안정세포주에서는 모두 맘모스피어의 크기와 수가 현저히 증가하고 있음을 확인하였다.
실험예 5. E3 리가아제 , CHIP는 프로테아좀 ( proteosomal ) 감소를 통해 Oct4 단백질 안정성을 조절
도 6은 mouse IgG(Santa Cruz, sc-3877), anti-FLAG(Sigma, F1804) 항체를 이용한 면역침강법으로, CHIP 복합체를 MDA-MB-231 세포주로부터 친화도를 이용해 정제분리(affinity-purificated)하고, 이를 SDS-PAGE 겔상에 펼친 후, 상기 항체로 이용한 웨스턴 블럿팅으로 서로 동일한 분자량의 단백질 밴드가 나타나는지를 확인한 결과이다(시료 1은 면역침강법에 사용된 MDA-MB-231 세포주로부터 정제분리한 CHIP 복합체이고, 시료 2는 mouse IgG 항체를 접합한 레진으로 면역침강한 분획이고, 시료 3은 anti-FLAG 항체를 접합한 레진으로 면역침강한 분획이다). 도 6의 우측에 위치한 반다이그램(Venn diagram)은 면역침감법의 확인된 단백질 사이 관계를 정리한 것이다.
도 7은 Ingenuity Pathway 분석(IPA)를 통해 CHIP와 Oct4의 분자 상호작용 네트워크를 분석한 것이다.
도 6에 나타난 바와 같이, MDA-MB-231 세포주에서 CHIP와 상호작용하는 단백질들을 확인하였고, IgG 단백질과 케라틴 단백질에 대해 특이적인 단백질을 제외하고 CHIP 특이적 단백질을 선별하였다. 그 결과 CHIP와 줄기세포성(stemness)에 핵심적인 역할을 하는 Oct4가 서로 관련이 있음을 확인하였고, 이를 도 7을 통해 다시금 확인하였다.
도 6의 결과를 다시금 확인하기 위하여, 도 8은 CHIP siRNA(siRNA#1, siRNA#2, siRNA#3)로 형질주입된 MDA-MB-231와 MCF7 세포에서, 특정 유전자(Oct4, Nanog, Sox2, GAPDH) mRNA와 특정 단백질(CHIP, OCT4, NANOG, SOX2, GAPDH) 발현수준을 RT-PCR(상단)과 웨스턴 블롯(하단)으로 측정한 결과이다. 이때, 대조군인 scRNA는 무작위 siRNA(scrambled siRNA)로 형질주입된 MDA-MB-231와 MCF7을 의미한다.
OCT4의 안정성을 CHIP가 조절할 수 있는지를 확인하기 위하여 도 8을 분석한 결과, CHIP가 존재하지 않는 경우에 CHIP가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. scRNA 형질주입된 대조군과 비교하였을 때, CHIP siRNA(siRNA#1, siRNA#2, siRNA#3)로 형질주입된 MDA-MB-231와 MCF7 세포에서 OCT4 수준이 상향 조절 되었음을 확인할 수 있다.
도 9는 empty(대조군) 또는 FLAG_CHIP 발현 벡터로 형질 주입한 MDA-MB-231와 MCF7 세포를 제조하고, 40 시간이 지난 후, 20 μM MG132로 8 시간 동안 처리하였다. 이들 세포에서 Oct4, GAPDH mRNA(RT-PCR 분석)와 CHIP, OCT4, GAPDH 단백질(웨스턴 블롯) 발현 수준을 측정한 결과이다. 이때, FLAG_CHIP 발현 벡터로 형질 주입한 세포는 도면의 상단 FLAG_CHIP 라인에 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였고, MG132로 처리한 세포는 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, CHIP가 과발현된 세포인 MDA-MB-231(FLAG_CHIP/MG132 +/-, +/+)와 MCF7(FLAG_CHIP/MG132 +/-, +/+)에서 Oct4 mRNA와 OCT4 단백질 발현 수준 모두 현저히 저하된 것을 확인하였다.
또한 MG132는 프로테아좀 억제제로, FLAG_CHIP 발현 벡터로 형질 주입한 세포에 MG132를 처리한 MDA-MB-231(FLAG_CHIP/MG132 +/+)와 MCF7(FLAG_CHIP/MG132 +/+) 세포에서는 OCT4 단백질 발현 수준이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
도 10은 다양한 농도의 FLAG_CHIP 발현 벡터로 형질 주입한 MDA-MB-231와 MCF7 세포를 제조하고, 40 시간이 지난 후 20 μM CHX로 8 시간동안 처리하였다. 이들 세포에서 Oct4와 FLAG_CHIP의 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. GAPDH는 로딩 대조군으로 사용하였다. 이때, FLAG_CHIP 발현 벡터의 주입된 농도가 증가할수록 도면의 상단 FLAG_CHIP 라인에서의 바의 두께도 두꺼워지게 표기하였다. 또한 CHX로 처리한 세포는 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 다양한 농도의 FLAG_CHIP 발현 벡터로 형질주입된 MDA-MB-231와 MCF7 세포에서, 단백질 합성 억제제(cycloheximide, CHX)가 처리된 경우에는 OCT4 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 즉, OCT4는 세포에 형질주입된 CHIP 양과 역비례관계를 가지고 있음을 확인하였다.
상기 실험예 5의 실험결과들을 종합하면 프로테아좀 감소를 통해 OCT4 안정성을 CHIP가 조절하고 있음을 시사한다. CHIP E3 리가아제는 OCT4와 상호작용하고, 샤페론 의존적이며, 이러한 법칙들을 통해 세포 내에서 OCT4를 조절할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 6. E3 리가아제 , CHIP와 OCT4 의 상호작용 및 OCT4 의 poly - 유비퀴틴 유도과정
도 11은 CHIP와 OCT4 사이 상호작용을 분석하기 위해, mouse IgG(Santa Cruz, sc-3877), FLAG_CHIP을 형질주입시킨 MDA-MB-231 세포를 anti-FLAG(Sigma, F1804) 항체를 이용한 면역침강법으로 검출한 결과이다. 이때 시료 1은 mouse IgG 항체를 접합한 레진으로 면역침강한 분획이고, 시료 2는 anti-FLAG 항체를 접합한 레진으로 면역침강한 분획이다.
도 11을 통해서 MEDA-MB-231 세포에서 CHIP와 OCT4가 서로 상호작용하고 있음을 확인하였다.
도 12는 FLAG_CHIP WT로 형질주입된 HEK293 세포 또는 점돌연변이인 K30A와 H260Q 및 Oct4 발현 벡터와 동시에 형질주입된 HEK293 세포를 제조한 후, 40 시간이 지난 다음, 이를 anti-FLAG(Sigma, F1804) 항체를 이용한 면역침강법으로 검출한 결과이다.
도 12는 OCT4와 와일드형 CHIP(WT) 또는 돌연변이형 CHIP와의 상호작용을 확인하기 위한 것으로, 도 12에 나타난 바와 같이 와일드형 CHIP와 OCT4 및 E3 리가아제의 기능이 감소된 돌연변이인 H260Q 사이에 상호작용이 있음은 확인되었으나, Oct4와 테트라트리코펩타이드 반복(TPR), 도메인 돌연변이된 CHIP, K30A 사이의 상호작용은 관찰되지 않았다.
도 13은 CHIP_WT, CHIP_K30A, CHIP_H260Q으로 형질주입된 MDA-MB-231과 MCF7를 제조한 후, 40 시간이 지난 다음 20 μM CHX로 8시간 동안 처리하였다. GADPH는 로딩 대조군으로 사용하였다. 이때, 해당하는 유전자를 형질 주입한 세포는 도면의 상단 해당하는 유전자 명칭 라인에 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였고, CHX로 처리한 세포는 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 13에 나타난 바와 같이 와일드형 CHIP 과발현된 세포에서만 OCT4 발현수준이 감소하는 것을 확인하였고, 이러한 결과 mRNA의 수치와는 독립적이였다.
돌연변이 CHIP K30A와 OCT4 사이에 상호작용이 관찰되지 않았기 때문에 도면으로 도시하지 않았으나 HSP90 저해제 17-AAG를 처리한 세포에서, OCT4 발현수준을 관찰하였다. 그 결과 CHIP는 TPR 도메인에서 E3 리가아제와 상호작용하는 HSP70과 HSP90 복합체이라 할 수 있다. 상기 Oct4 단백질 수준은 17-AAG 처리된 세포에서 현저히 감소하였다. 그리고 CHIP 감소 세포에서 Oct4 단백질 수준이 회복되었다.
여기서 흥미 있는 것은 CHIP 수정된 OCT4 하향 조절은 17-AAG이 존재할때와 존재하지 않을 때 모두에서 관찰되지 않았다. 이러한 결과를 통해 CHIP E3 리가아제는 샤페론 의존 또는 독립적으로 OCT4의 안정성을 조절할 수 있음을 확인하였다.
실험예 7. CHIP E3 리가아제의 OCT4 유비퀴틴화 유도
도 14 내지 도 16은 siRNA#1로 형질주입된 MDA-MB-231 세포(CHIP 결핍 세포; siRNA#1), FLAG_CHIP 과발현된 세포(MDA-MB-231), FLAG_CHIP 와일드형 또는 돌연변이형(FLAG_CHIP_K30A, FLAG_CHIP_H260Q))으로 형질주입된 MDA-MB-231 세포를 제조하고, 40 시간이 지난 후 여기에 20 μM MG132를 8시간 처리하였다. 상기 형질주입된 세포의 용해는 denaturing 조건에서 수행되고, OCT4 항체를 사용하여 면역침강한 후, OCT4 폴리유비퀴틴화를 웨스턴 블롯으로 분석하여 나타낸 결과이다. 이때, 형질주입한 세포는 도면의 상단 siCHIP, FLAG_CHIP, FLAG_CHIP_WT, FLAG_CHIP_K30R, FLAG_CHIP_H260Q 라인 중 해당되는 유전자에 '+'를 표기하였고, 해당하지 않는 유전자에는 '-'를 표기하였다. MG132로 처리한 세포는 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 14 내지 도 15에 나타난 바와 같이 CHIP 과발현된 세포에서 OCT4 발현 수준이 감소하였으므로, 본 실험에서 유비퀴틴화 분석은 denaturing 조건에서 수행하였다. CHIP 결핍 세포에서 상기 폴리-유비퀴틴화된 OCT4가 감소하였고, 상기 폴리-유비퀴틴화된 OCT4의 증가는 CHIP 과발현된 세포에서 관찰되었다. 게다가 폴리-유비퀴틴화된 OCT4는 CHIP 돌연변이형인 K30A, H260Q, 과발현된 세포에서는 증가하지 않음을 확인하였다.
실험예 8. OCT4 의 284번째 라이신 잔기의 역할 분석
도 17은 284번째에 디글리신기를 갖는 284번째 라이신기로 돌연변이된 OCT4를 측정한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 17에 나타난 바와 같이 온라인 소스를 사용하여 OCT4 유비퀴틴화의 예상 사이트를 찾아내었다. 그리고 MS/MS 스펙트럼을 통해 OCT4의 디글리신을 갖는 라이신 284(K284)이 유비퀴틴화임을 확인하였다.
도 18은 48 시간동안 지적된 위치에 돌연변이를 형성하고, 이를 형질주입하여 제조된 MCF7_Oct4KD 세포에서, OCT4(와일드형 또는 돌연변이형)과 CHIP의 상호관계를 확인하기 위하여, 면역침강법으로 분석한 결과이다. 이때, 해당하는 유전자(FLAG_CHIP, Oct4, Oct4_K284R)를 형질 주입한 세포는 도면의 상단 해당하는 유전자 명칭 라인에 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 18에 나타난 바와 같이 Oct4 결핍 안정세포주인 OCT4KD 세포에서 OCT4의 K284 돌연변이인, K284R와 CHIP 사이의 상호관계가 관찰되었다.
도 19는 다양한 농도의 FLAG_CHIP 또는 OCT4_K284R로 형질주입된 Oct4 결핍 안정세포주(MDA-MB-231_Oct4KD, MCF7_Oct4KD)를 제조하고 40 시간이 지난 후, 20 μM CHX 8 시간동안 처리한 다음, 각각의 세포에서 돌연변이된 OCT4, FLAG_CHIP의 단백질 발현수준을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다. 여기서 GAPDH는 로딩 대조군으로 사용하였다. 이때, FLAG_CHIP 발현 벡터의 주입된 농도가 증가할수록 도면의 상단 FLAG_CHIP 라인에서의 바의 두께도 두꺼워지게 표기하였다. 또한 Oct4_K284R 유전자를 형질 주입한 세포는 도면의 상단 Oct4_K284R 라인에 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였고, CHX로 처리한 세포는 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 19에 나타난 바와 같이 CHX가 처리되고, 상기 CHIP 농도가 증가한 세포에서는 OCT4_K284R의 감소를 관찰할 수 없었다.
도 20은 해당하는 유전자(Oct4_WT, Oct4_K284R, FLAG_CHIP) 중에서 어느 하나 이상으로 형질주입된 Oct4 결핍 안정세포주(MDA-MB-231_Oct4KD, MCF7_Oct4KD)를 제조하고 40시간이 지난 후, 20 μM MG132 8 시간동안 처리하였다. 상기 각각의 세포 용해물(cell lysates)를 denaturing 조건에서 제조하고 OCT4 항체를 이용하여 면역침강법을 수행한 결과이다. OCT4의 폴리-유비퀴틴화는 웨스턴 블롯으로 측정하여 관찰하였다.
이때, 해당하는 유전자를 형질 주입한 세포는 도면의 상단 해당하는 유전자 명칭 라인에 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였고, MG132로 처리한 세포는 '+', 안한 세포는 '-'로 표기하였다.
도 20에 나타난 바와 같이, 폴리-유비퀴틴화된 OCT4_K284R은 OCT4_WT에 비해 상대적으로 CHIP 과발현에 의해 유의한 증가를 나타내지 않았다.
상술한 실험결과들을 통해서, CHIP E3 리가아제는 K284에서 OCT4를 폴리-유비퀴틴화를 유도하고 있음을 알 수 있다.
실험예 9. CHIP E3 리가아제 과발현에 따른 유방암 줄기세포 증식 억제 효과
도 21은 MCF7세포에서 리포터 분석을 통해 측정된 전사활성화(transcriptional activation)를 나타낸 그래프이다. 이때 세포는 48 시간동안 Oct4 리포터 벡터로 형질주입된 것이거나, CHIP siRNA 또는 FLAG_CHIP 발현 벡터로 동시에 형질주입된 것일 수 있다.
도 21에 나타난 바와 같이, CHIP가 OCT4의 전사활성화를 조절할 수 있는지를 확인하기 위하여 Oct4 프로모터의 전사활성화를 측정하였다. CHIP 결핍(siCHIP)에 의해 상기 활성정도가 향상되었고, CHIP 과발현(FLAG_CHIP)에 의해 전사활성화가 현저히 저하되었음을 확인할 수 있었다.
도 22 및 도 23은 48 시간동안 CHIP siRNA, CHIP siRNA와 Oct4 siRNA로 동시에 형질주입되거나, 또는 Oct4 siRNA로 형질주입된 유방암 세포(MDA_MB-231, MCF7)의 세포 독성을 WST 분석으로 측정하여 나타낸 그래프이다. 여기서 모든 데이터는 ± 표준편차(SD)(n=3)로 나타내었고, *는 P<0.05, **는 p<0.01이고, 통계분석은 Student's t-test를 사용하여 수행되었다.
도 22, 도 23에 나타난 바와 같이, CHIP가 결핍된 세포(NC/Oct4_WT, NC/Oct4_K284R)은 세포 생존율이 상승하였고, 추가로 OCT4가 결핍된 세포(CHIP/Oct4_K284R, CHIP/Oct4_WT)에서는 세포 생존율이 감소하였음을 확인하였다.
실험예 10. 유비퀴틴화 돌연변이 OCT4의 과발현에 따른 유방암 줄기세포 증식 향상 효과
도 24 및 도 25는 48 시간동안 Oct4_WT, Oct4_WT와 FLAG_CHIP로 동시에 형질주입되거나, Oct4_K284R로 형질주입되거나, 또는 Oct4_K284R, FLAG_CHIP로 동시에 형질주입된 유방암 세포(MDA_MB-231(a), MCF7(b))의 실험방법의 9) 측면개체군(side population) 분석에 따라 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 여기서 모든 데이터는 ± 표준편차(SD)(n=3)로 나타내었고, *는 P<0.05, **는 p<0.01이고, 통계분석은 Student's t-test를 사용하여 수행되었다.
도 24, 도 25에 나타난 바와 같이, Oct4는 CSC 마커이기 때문에, 줄기세포성(stemness) 기능 중 측면개체군을 확인하였다. 상기 측면개체군은 CHIP 결합세포에서 극적으로 상승하였으나, OCT4 결합 세포에서는 극적으로 감소하였음을 확인하였다. 흥미롭게도 상기 측면개체군은 CHIP와 Oct4가 동시에 결핍된 세포는 CHiP 결힙된 세포와 비교하여 감소된 수치를 가지지만, OCT4 결핍세포와 비교하면 증가된 수치임을 확인하였다.
또한, OCT4_K284R의 기능연구를 위하여, 결핍된 내인성 Oct4 안정 세포주인 Oct4KD를 생성하고, 이들 세포의 생존력을 측정한 결과, OCT4가 과발현되는 세포의 생존력이 상승되는 것을 확인하였으며, OCT4 와일드형보다 OCT4_K284R이 과발현되는 세포의 생존력이 더 우수한 것도 확인하였다.
흥미롭게도 OCT 와일드형이 과발현된 세포의 증가된 생존력은 CHIP 과발현에 의해 감소되었고, OCT4_K284R은 CHIP에 의해 영향을 받지 않았다.
다음으로 OCT4 와일드형과 OCT4_K284R 돌연변이형의 다른 안정성이 유방암세포의 줄기세포성에 영향을 미치는지 아닌지를 측면개체군을 통해 측정하였다. 그 결과 OCT4 과발현에 의해 측면개체군이 증가하였음을 확인하였고, OCT4 와일드형보다 OCT4_K284R 과발현에 의해 더 상승하고 있음을 알 수 있었다. 게다가 OCT4 와일드형이 과발현된 세포의 상승된 측면개체군이 CHIP 과발현에 의해 감소되고 있음을 확인하였다. 또한 OCT4 와일드형에서 보다 OCT4_K284R에서 더 적게 감소하였다. 줄기세포 인자로 알려진 OCT4의 기능에 CHIP E3 리가아제가 영향을 미치고 있음을 알 수 있다.
실험예 11. 유방암 이종이식 동물모델에서, OCT4 과발현에 의해 증가된 종양 조직과 전이에 대한 CHIP E3 리가아제의 영향
생체 내에서(in vivo), OCT4 과발현 세포로 유도된 종양과 전이절(metastatic node)이 CHIP 과발현에 의해 감소하는지 확인하기 위한 것이다. 다시 말해 유방 종양형성에 있어서 CHIP의 생체내 영향을 확인하고자 하였다. 이를 위해 우선 MDA-MB-231 세포를 사용하여 안정 세포주를 제조하고, 이로부터 배양된 맘모스피어를 이용하여 이종이식하였다.
피하 이종이식편(subcutaneous xenograft)을 형성하기 위해 누드 마우스에 다양한 유전자로 형질주입된 안정 세포주(MDA-MB-231 세포)(1 × 103)을 주입하고 12주간 사육하여, 이종이식 동물모델을 제조하였다. 도 26은 상기 각각의 동물모델로부터 분리한 종양 조직을 촬영한 사진이다. 도 27은 상기 각각의 동물모델로부터 분리한 종양 조직의 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 28은 상기 각각의 동물모델로부터 분리한 종양조직의 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 29는 상기 각각의 동물모델로부터 분리한 이종이식편 종양을 CHIP와 OCT4 항체를 사용하여 면역침강법으로 분석한 결과이다. 여기서 스케일바는 100 ㎛이다.
도 26 내지 도 28에 나타난 바와 같이, CHIP 과발현된 세포(CHIPover)를 주입한 동물모델에서는 WT 세포보다 작은 종양 조직이 관찰되거나, 아예 종양조직이 성장하지 못한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 CHIP 결핍된 세포(CHIPKD)를 주입한 동물모델에서는 가장 큰 종양조직이 자란 것을 확인하였다. OCT4 과발현된 세포(OCT4over)가 주입된 경우에는 CHIP 결핍된 세포(CHIPKD)와 동등하거나 더 큰 종양조직이 관찰되었다. 그런데 CHIP와 OCT4가 동시에 결핍된 세포(CHIPKD/OCTKD) 또는 CHIP와 OCT4가 동시에 과발현된 세포(CHIPover/OCTover)가 주입된 동물모델에서는 CHIP 과발현된 세포가 주입된 동물세포에서의 종양조직만큼 작은 크기의 종양조직이 관찰되거나 아예 관찰되지 않는 경우도 있었다.
도 29의 면연침강법을 통해 이종이식된 종양조직에서 OCT4와 CHIP의 발현을 관찰할 수 있었다.
본 실험예에는 미도시하였으나, 상기 각각의 세포를 1×104, 1×105세포수로 주입하여 동물모델을 제조할 경우, 상술한 결과와 동일한 경향을 갖는 것을 확인한 바 있다. 즉 동물모델을 제조함에 있어서 종양조직의 크기, 무게 등이 주입되는 세포수에 영향을 받지 않는다는 것을 확인한 것이다.
누드 마우스에 다양한 유전자로 형질주입된 안정 세포주(MDA-MB-231 세포)(1 × 106)를 꼬리 정맥을 통해 주입하고 12주간 사육하여, 폐로 전이된 이종이식 동물모델을 제조하였다. 도 30은 상기 각각의 동물모델의 폐로부터 분리한 종양 조직에서 전이절의 수를 카운팅하여 기록한 그래프이다.
도 30에 나타난 바와 같이 와일드형 세포(WT)과 CHIP 과발현된 세포(CHIPover)가 주입된 동물모델에서는 전이 종양이 매우 드물게 관찰되었고, CHIP 결핍 세포(CHIPKD)와 OCT4 과발현 세포(OCT4over)가 주입된 동물모델에서는 전이 종양세포가 상당량 관찰되었다. 그런데 CHIP와 OCT4가 동시에 결핍된 세포(CHIPKD/OCTKD) 또는 CHIP와 OCT4가 동시에 과발현된 세포(CHIPover/OCTover)가 주입된 동물모델에서는 매우 드물게 전이 종양이 관찰됨을 확인하였다. 결과적으로 CHIP는 종양의 생존의 속도와 전이를 생체 내에서 현저히 늦추는 것을 확인할 수 있고, 이는 생체 외(in vitro) 실험에서도 유사한 경향을 갖는다.
실험예 12. 유방암 환자에 있어서, CHIP E3 리가아제의 발현수준과 생존가능성의 관계
도 31은 무재발(relapse free), 원격 전이(distant metastasis)와 생존기간(progression survival)을 Kaplan-Meier 플롯 분석을 사용하여 CHIP 발현과 함께 분석한 결과이다. 데이터는 ± 표준편차(SD)(n=3)로 나타내었고, *는 P<0.05, **는 p<0.01이고, 통계분석은 Student's t-test를 사용하여 수행되었다.
도 31에 나타난 바와 같이, 온라인 정보와 Kaplan-Meier plot 분석을 사용하여 CHIP 과발현 환자의 생존 가능성을 확인하였다. 그 결과 CHIP 과발현 유방암 환자들은 낮은 생존 가능성을 나타냈다. 즉 CHIP는 OCT4 조절을 통해 종양 형성과 전이와 관계가 있다는 것을 알 수 있다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> OCT4 expression or ubiquitination regulating composition comprising CHIP <130> HPC7215 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CHIP <400> 1 Met Lys Gly Lys Glu Glu Lys Glu Gly Gly Ala Arg Leu Gly Ala Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Pro Glu Lys Ser Pro Ser Ala Gln Glu Leu Lys Glu Gln 20 25 30 Gly Asn Arg Leu Phe Val Gly Arg Lys Tyr Pro Glu Ala Ala Ala Cys 35 40 45 Tyr Gly Arg Ala Ile Thr Arg Asn Pro Leu Val Ala Val Tyr Tyr Thr 50 55 60 Asn Arg Ala Leu Cys Tyr Leu Lys Met Gln Gln His Glu Gln Ala Leu 65 70 75 80 Ala Asp Cys Arg Arg Ala Leu Glu Leu Asp Gly Gln Ser Val Lys Ala 85 90 95 His Phe Phe Leu Gly Gln Cys Gln Leu Glu Met Glu Ser Tyr Asp Glu 100 105 110 Ala Ile Ala Asn Leu Gln Arg Ala Tyr Ser Leu Ala Lys Glu Gln Arg 115 120 125 Leu Asn Phe Gly Asp Asp Ile Pro Ser Ala Leu Arg Ile Ala Lys Lys 130 135 140 Lys Arg Trp Asn Ser Ile Glu Glu Arg Arg Ile His Gln Glu Ser Glu 145 150 155 160 Leu His Ser Tyr Leu Ser Arg Leu Ile Ala Ala Glu Arg Glu Arg Glu 165 170 175 Leu Glu Glu Cys Gln Arg Asn His Glu Gly Asp Glu Asp Asp Ser His 180 185 190 Val Arg Ala Gln Gln Ala Cys Ile Glu Ala Lys His Asp Lys Tyr Met 195 200 205 Ala Asp Met Asp Glu Leu Phe Ser Gln Val Asp Glu Lys Arg Lys Lys 210 215 220 Arg Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Cys Gly Lys Ile Ser Phe Glu Leu Met 225 230 235 240 Arg Glu Pro Cys Ile Thr Pro Ser Gly Ile Thr Tyr Asp Arg Lys Asp 245 250 255 Ile Glu Glu His Leu Gln Arg Val Gly His Phe Asp Pro Val Thr Arg 260 265 270 Ser Pro Leu Thr Gln Glu Gln Leu Ile Pro Asn Leu Ala Met Lys Glu 275 280 285 Val Ile Asp Ala Phe Ile Ser Glu Asn Gly Trp Val Glu Asp Tyr 290 295 300 <210> 2 <211> 360 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 <400> 2 Met Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly Gly Pro Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro 20 25 30 Arg Thr Trp Leu Ser Phe Gln Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly 35 40 45 Pro Gly Val Gly Pro Gly Ser Glu Val Trp Gly Ile Pro Pro Cys Pro 50 55 60 Pro Pro Tyr Glu Phe Cys Gly Gly Met Ala Tyr Cys Gly Pro Gln Val 65 70 75 80 Gly Val Gly Leu Val Pro Gln Gly Gly Leu Glu Thr Ser Gln Pro Glu 85 90 95 Gly Glu Ala Gly Val Gly Val Glu Ser Asn Ser Asp Gly Ala Ser Pro 100 105 110 Glu Pro Cys Thr Val Thr Pro Gly Ala Val Lys Leu Glu Lys Glu Lys 115 120 125 Leu Glu Gln Asn Pro Glu Glu Ser Gln Asp Ile Lys Ala Leu Gln Lys 130 135 140 Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys Leu Leu Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu 145 150 155 160 Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly 165 170 175 Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu 180 185 190 Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys Leu Arg Pro Leu Leu Gln Lys Trp Val 195 200 205 Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu Asn Leu Gln Glu Ile Cys Lys Ala Glu 210 215 220 Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys Arg Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg 225 230 235 240 Val Arg Gly Asn Leu Glu Asn Leu Phe Leu Gln Cys Pro Lys Pro Thr 245 250 255 Leu Gln Gln Ile Ser His Ile Ala Gln Gln Leu Gly Leu Glu Lys Asp 260 265 270 Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser 275 280 285 Ser Ser Asp Tyr Ala Gln Arg Glu Asp Phe Glu Ala Ala Gly Ser Pro 290 295 300 Phe Ser Gly Gly Pro Val Ser Phe Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Phe 305 310 315 320 Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro His Phe Thr Ala Leu Tyr Ser Ser 325 330 335 Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu Ala Phe Pro Pro Val Ser Val Thr Thr 340 345 350 Leu Gly Ser Pro Met His Ser Asn 355 360 <210> 3 <211> 360 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4_K284R mutant <400> 3 Met Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly Gly Pro Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro 20 25 30 Arg Thr Trp Leu Ser Phe Gln Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly 35 40 45 Pro Gly Val Gly Pro Gly Ser Glu Val Trp Gly Ile Pro Pro Cys Pro 50 55 60 Pro Pro Tyr Glu Phe Cys Gly Gly Met Ala Tyr Cys Gly Pro Gln Val 65 70 75 80 Gly Val Gly Leu Val Pro Gln Gly Gly Leu Glu Thr Ser Gln Pro Glu 85 90 95 Gly Glu Ala Gly Val Gly Val Glu Ser Asn Ser Asp Gly Ala Ser Pro 100 105 110 Glu Pro Cys Thr Val Thr Pro Gly Ala Val Lys Leu Glu Lys Glu Lys 115 120 125 Leu Glu Gln Asn Pro Glu Glu Ser Gln Asp Ile Lys Ala Leu Gln Lys 130 135 140 Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys Leu Leu Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu 145 150 155 160 Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly 165 170 175 Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu 180 185 190 Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys Leu Arg Pro Leu Leu Gln Lys Trp Val 195 200 205 Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu Asn Leu Gln Glu Ile Cys Lys Ala Glu 210 215 220 Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys Arg Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg 225 230 235 240 Val Arg Gly Asn Leu Glu Asn Leu Phe Leu Gln Cys Pro Lys Pro Thr 245 250 255 Leu Gln Gln Ile Ser His Ile Ala Gln Gln Leu Gly Leu Glu Lys Asp 260 265 270 Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg Arg Gln Arg Gly Lys Arg Ser 275 280 285 Ser Ser Asp Tyr Ala Gln Arg Glu Asp Phe Glu Ala Ala Gly Ser Pro 290 295 300 Phe Ser Gly Gly Pro Val Ser Phe Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Phe 305 310 315 320 Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro His Phe Thr Ala Leu Tyr Ser Ser 325 330 335 Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu Ala Phe Pro Pro Val Ser Val Thr Thr 340 345 350 Leu Gly Ser Pro Met His Ser Asn 355 360 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHIP siRNA <400> 4 cccaaguucu gcuguuggac u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHIP siRNA #2 <400> 5 gaagaggaag aagcgagaca u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHIP siRNA #3 <400> 6 gcagucugug aaggcgcacu u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4 siRNA <400> 7 uuaaguucuu cauucacuaa g 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Oct4_K284R forward primer <400> 8 agcgaggcaa gcgatcaagc ag 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Oct4_K284R reverse primer <400> 9 ggcgccggtt acagaaccac ac 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of CHIP forward primer <400> 10 cgactacctg tgtggcaaga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of CHIP reverse primer <400> 11 caagttgggg atgagctgtt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Nanog forward primer <400> 12 accttccaat gtggagcaac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Nanog reverse primer <400> 13 gaatttggct ggaactgcat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Sox2 forward primer <400> 14 aaaacagccc ggaccgcgtc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Sox2 reverse primer <400> 15 ctcgtcgatg aacggccgct 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Oct4 forward primer <400> 16 ctcaccctgg gggttctatt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Oct4 reverse primer <400> 17 ctggttcgct ttctctttcg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of GAPDH forward primer <400> 18 ggctgctttt aactctggta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of GAPDH reverse primer <400> 19 acttgatttt ggagggatct 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Oct4 K284R forward primer <400> 20 agcgaggcaa gcgatcaagc ag 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of Oct4 K284R reverse primer <400> 21 ggcgccggtt acagaaccac ac 22

Claims (9)

  1. 생체 외(in vitro)에서, CHIP(carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein)를 유효성분으로 포함하여 OCT4(octamer-binding transcription factor 4) 단백질의 발현을 억제하거나 OCT4 단백질의 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 생물학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 CHIP는 서열번호 1로 이루어진 것이고, 상기 OCT4는 서열번호 2로 이루어진 것을 특징으로 하는 생물학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 인간을 제외한 포유동물의 CHIP을 과발현 시킴으로써 OCT4의 발현을 억제하거나 OCT4의 유비퀴틴화를 촉진시키는 방법.
  6. 서열번호 2로 이루어진 OCT4의 284번째 잔기가 라이신에서 아르기닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 돌연변이 OCT4 단백질.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 돌연변이 OCT4 단백질은 서열번호 3으로 이루어진 것을 특징으로 하는 돌연변이 OCT4 단백질.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 서열번호 2의 OCT4는 유방암 줄기세포 유래 OCT4인 것을 특징으로 하는 돌연변이 OCT4 단백질.
  9. 제6항의 돌연변이 OCT4 단백질을 코딩하는 유전자.
KR1020170055214A 2017-04-28 2017-04-28 Chip를 유효성분으로 포함하는 oct4의 발현을 억제하거나 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 생물학적 조성물 KR101954777B1 (ko)

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