KR102247136B1 - 클로날 줄기세포를 포함하는 췌장염 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

클로날 줄기세포를 포함하는 췌장염 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개선된 줄기세포의 층분리 배양을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는 췌장염 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 개선된 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법에 따르면, 단일 클로날 줄기세포의 빠른 증식을 통해 단시간에 원하는 단일 클로날 줄기세포의 대량 수득이 가능하고, 이를 통해 수득되는 단일 클로날 중간엽 줄기세포는 췌장염 치료 효과가 증대된 줄기세포인 바, 췌장염 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

클로날 줄기세포를 포함하는 췌장염 치료용 약학적 조성물 {Composition for treating pancreatitis comprising clonal stem cell}
본 발명은 개선된 줄기세포의 층분리 배양을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는 췌장염 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
췌장염(pancreatitis)은 췌장(pancreas)에 염증이 발생하여 생기는 질병으로 급성 췌장염(acute pancreatitis) 및 만성 췌장염(chronic pancreatitis)이 있다. 췌장염은 과음(alcohol abuse), 담석(gallstones) 등에 의해서 이자액이 원활하게 흐르지 않아 이자액에 포함되어 있는 효소들이 췌장의 자가분해를 유발하여 발생한다. 췌장염은 크게 두 가지 유형으로 나누어 볼 수 있는데, 간질성 부종(interstitial edema)과 췌장주변의 지방성 괴사(peripancreatic fat necrosis)가 발견되는 경증(mild type)의 췌장염, 췌장 주변(peripancreatic) 및 췌장 내부(intrapancreatic)의 광범위한 지방성 괴사, 췌장의 유조직 궤사(pancreatic parenchymal necrosis), 출혈을 동반하는 중증(severe type)의 췌장염이 있다.
췌장염은 아직 정확한 병태 생리기전이 알려져 있지 않으나 대표적인 증상으로 나타나는 것은 단백분해효소 전구물이 췌장 내에서 조기 활성화됨으로써 일어나는 자가소화의 과정이다. 즉, 췌장샘 꽈리세포(pancreas acinar cell)내에서 소화효소가 비정상적으로 조기 활성화되면, 췌장의 세엽 자신을 소화해 버리고 이어서 염증이 발생하여 조직의 탈락, 괴사가 발생한다. 최근에는 췌장 선방세포의 손상 후 췌장 내로 유입되는 활성화된 대식세포가 조직손상에 대한 반응으로 전염증성 사이토카인 인터루킨(interleukin)-1β 를 분비해 염증세포의 순환, 췌장 부종 및 췌장 실질 파괴에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다.
췌장염의 중증도를 경감시키고 다양한 장기의 합병증 발생을 억제할 수 있는 여러 실험적 치료법이 제시되고 있으나 실험적 치료법을 정작 사람에게 적용할 경우 매우 미약한 효과를 보여 아직까지 췌장염의 예방 및 치료와 관련하여 효과적으로 널리 사용되고 있는 치료제는 없는 실정이다.
최근 다양한 염증성 질환의 치료에 줄기세포를 이용하고자 하는 시도들이 진행되고 있다. 줄기세포는 우리 몸의 210여개 모든 기관의 조직으로 성장할 수 있는 잠재적 능력을 갖고 있고, 무한히 분열할 수 있으며 적절한 조작을 통해 원하는 장기로 분화할 수 있다.　이와 같은 줄기세포의 특성 때문에 줄기세포는 새로운 치료제로 각광받고 있으며, 줄기세포를 이용한 난치병의 치료 가능성은 대단히 높아 백혈병, 골다공증, 간염, 파킨슨씨병, 노인성 치매, 화상 등 수많은 질병 치료가 가능할 것으로 기대되고 있다.
그러나 줄기세포의 경우, 이를 대량으로 수득하기 어렵다는 점에서 여전히 많은 제약사항이 있다. 줄기세포를 수득하는 방법으로 냉동 배아세포에서 얻는 방법이 효율적이라고 할 수 있지만 윤리적인 면에서 아직도 많은 논란이 있다. 이와 같은 문제점을 해소하기 위하여 체세포 핵 이식 방법이나 성체 줄기세포를 이용하여 줄기세포를 수득하는 방법 역시 많은 연구가 진행되었다. 배아줄기세포에 대한 연구보다 활발히 행해지는 분야는 성체줄기세포 연구이다.　성체줄기세포는 중추신경계나 골수 등 각종 장기에 남아 성장기의 장기발달과 손상시의 재생에 참여하는 세포로 각종 장기에 존재하기 때문에 골수, 비장, 지방세포 등을 포함한 여러 부위에서 얻을 수 있으나 골수에서 얻는 방법이 가장 흔히 시행된다.　그러나 많은 여러 종류의 골수세포들 중에서 중간엽 줄기세포들을 분리, 배양하는 데 있어 항상 균일한 형태의 세포를 얻는 데는 어려움이 있어 이러한 문제점들을 보완하기 위한 연구가 행해지고 있다.
본 발명자는 신규한 층분리 배양법이라고 명명된 줄기세포의 분리방법을 발명한 바 있으며, 대한민국 특허출원 KR 10-2006-0075676 호를 통해 특허 출원하고 이를 등록받았다. 상기 층분리 배양법은 다른 방법에 비해 적은 비용으로 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 오염 문제가 없으며 타 줄기세포가 섞일 염려 없이 클로날 중간엽 줄기세포(cMSC)를 효과적으로 얻을 수 있다는 점에 있어서 다른 줄기세포 수득 방법에 비해 탁월한 우수성을 가지고 있다. 그러나 상기 방법의 우수성에도 불구하고, 층분리 배양법은 중간엽 줄기세포를 대량 생산하여 최종 산물로 사용하기 위해서는 워킹 셀 뱅크를 제조하고, 이를 통해 최종 산물을 수득하는 공정을 거쳐야 충분한 양의 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있으며 최소 10 계대(Passage) 이상의 배양이 필요하다는 점에서 빠른 단일 클로날 중간엽 줄기세포 집단 수득이 어려운 한계점이 있었다.
한편 염증성 질환, 특히 췌장염을 치료하기 위하여 줄기세포를 이용하는 것은 아직까지 다양한 한계점을 가지고 있으며, 효과적으로 췌장염을 치료하기 위한 줄기세포 제조법 및 이를 이용한 췌장염 치료 방법에 대해서는 아직까지 알려진 바 없다
본 발명자들은 상기와 같은 층분리 배양법의 개선을 통해 줄기세포의 빠른 증식을 유도하기 위한 연구를 하던 중, 배양 세포 밀도를 낮게 조절하고 항산화제를 첨가하여 배양하는 개선된 층분리 배양법을 이용하는 경우, 적은 계대 배양만으로도 효과적인 세포 증식률 증가를 유도할 수 있고, 이를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포가 종래 층분리 배양 방법의 줄기세포 대비 매우 현저한 췌장염 치료 효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 기존의 층분리 배양법을 개선한 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는 췌장염 예방, 치료 및 개선용 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 췌장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포를 수득하는 단계; 를 포함하는, 췌장염 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 췌장염 예방, 개선 또는 치료용 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 개선된 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법에 따르면, 단일 클로날 줄기세포의 빠른 증식을 통해 단시간에 원하는 단일 클로날 줄기세포의 대량 수득이 가능하고, 이를 통해 수득되는 단일 클로날 중간엽 줄기세포는 췌장염 치료 효과가 증대된 줄기세포인 바, 췌장염 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 골수로부터 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 분리하는 종래 층분리 배양법을 나타낸 도이다.
도 2는 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화를 현미경 관찰을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 세포 크기 및 입도(granularity)의 변화를 유세포 분석기(Flow cytometry; FACS) 분석을 통해 전방산란(forward scatter; FSC) (A) 및 측방산란(side scatter; SSC) (B)광의 평균값으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 4는 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양을 달리한 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 베타 갈락토시다아제 (베타 gal)의 활성도를 염색을 통해 세포의 노화 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 계대 15 (Passage 15; P15)의 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 세포 배양 밀도를 달리하여 배양한 후 노화 관련 유전자인 p15, p16 및 증식 마커인 PCNA를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 증식능을 세포군 배가 시간(Population Doubling Time; PDT) 및 세포수 증식 수준(population Doubling Level; PDL)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 7은 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 분화능력을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005). 도 7의 A는 세포 배양 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 Oil red O 조직학적 염색을 통하여 확인한 결과이며 도 7의 B는 A의 조직학적 염색 정도를 정량화하여 나타낸 도이다. 도 7의 C는 세포배양 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 골화 세포로의 분화능을 Alizarin red S 조직학적 염색을 통하여 확인한 결과이며, 도 7의 D는 C의 조직학적 염색 정도를 정량화하여 나타낸 도이다.
도 8은 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따라 단일 클로날 중간엽 줄기세포에서 생산되는 총 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 생산 (A) 및 이에 따른 DNA 손상을 comet assay를 통해 확인 (B) 한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 9는 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따라 생산되는 활성산소종에 의한 DNA 손상 정도를 확인하기 위하여 8-옥소-데옥시구아노신(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine; 8-OHdG) 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 10은 계대 11(P11) 내지 15(P15)의 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 고밀도 조건 단독(HD) 또는 고밀도 조건+ 아스코르브산(항산화제의 일종) 추가(HD+AA)를 통해 배양한 후 세포 증식능의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 계대 15(P15)의 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 고밀도 조건 단독(HD) 또는 고밀도 조건+ 아스코르브산 추가(HD+AA)로 배양한 후, 생산되는 활성산소종 수준을 비교한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 12a 는 종래 층분리 배양법 및 개선된 층분리 배양법 실험 방법을 비교하여 나타낸 도이다.
도 12b 는 개선된 층분리 배양법의 모식도로, 종래 층분리 배양법과 상이한 계대 2 이후에 해당하는 저밀도 배양을 나타낸 모식도이다.
도 13 내지 도 20 은 층분리 배양법을 통해 수득된 SCM01 내지 SCM08 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 1000 또는 4000 세포/cm2 (cells/cm2) 밀도로 접종하고 항산화제 첨가 유무를 달리한 LG-DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, low glucose), α-MEM(Minimum Essential Medium α) 배양 배지를 이용하여 배양한 세포의 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 각 도의 A는 각 실험군의 계대 1(P1) 내지 계대 5(P5)에 따른 세포 수의 변화를, 각 도의 B는 각 실험군의 세포군 배가 시간(PDT) 및 세포수 증식 수준(PDL) 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 항산화제가 첨가되지 않은 LG-DMEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm2 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 세포 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 항산화제가 첨가되지 않은 LG-DMEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm2 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 세포군 배가 시간(PDT) 및 세포수 증식 수준(PDL)을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 항산화제가 첨가된 α-MEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm2 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 세포 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 항산화제가 첨가된 α-MEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm2 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 PDT 및 PDL을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 세포 밀도를 1000 세포/cm2 밀도로 고정하고, 배양 배지를 LG-DMEM 또는 α-MEM으로 달리한 실험군에서의 세포 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 세포 밀도를 1000 세포/cm2 밀도로 고정하고, 배양 배지를 LG-DMEM 또는 α-MEM로 달리한 실험군에서의 PDT 및 PDL을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 27은 급성췌장염 동물 모델 구축 및 본 발명의 cMSC1, 2 처리 프로토콜의 모식도이다.
도 28은 급성췌장염 동물 모델에서 본 발명의 cMSC1, 2 처리에 따른 알파-아밀라아제(a-amylase) 및 리파아제(lipase) 효소의 활성 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (All values are presented as means with standard error of mean (SEM) P value = *, <0.05; **, <0.01; ***, <0.001 vs. SAP group and ###, <0.001 vs. control group).
도 29는 급성췌장염 동물 모델에서 cMSC1, 2 처리에 따른 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase; MPO) 활성 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (All values are presented as means with standard error of mean (SEM) P value = *, <0.05; **, <0.01; ***, <0.001 vs. SAP group and ###, <0.001 vs. control group).
도 30는 급성췌장염 동물 모델에서 cMSC1, 2 처리에 따른 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, IFN-γ 변화 및 항염증성 사이토카인 IL-10 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (All values are presented as means with standard error of mean (SEM) P value = *, <0.05; **, <0.01; ***, <0.001 vs. SAP group and ###, <0.001 vs. control group).
도 31은 급성췌장염 동물 모델에서 cMSC1, 2 처리에 따른 조직 병리학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 32는 급성췌장염 동물 모델에서 cMSC1, 2 처리에 따른 조직병리학 스코어 (histopathologic score), 부종, 괴사, 출혈, 염증 침윤 스코어를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (All values are presented as means with standard error of mean (SEM) P value = *, <0.05; **, <0.01; ***, <0.001 vs. SAP group and ###, <0.001 vs. control group).
도 33은 개선된 방법으로 배양한 cMSC1 및 기존방법으로 배양한 cMSC2의 세포 사이즈를 Nucleo Counter NC-250 기기를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 34는 유세포 분석기를 이용하여 cMSC1 및 cMSC2의 세포 크기 분포를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 35는 cMSC1및 cMSC2의 면역세포 억제능력을 혼합 림프구 반응 (mixed lymphocyte reaction, MLR) 방법으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (PBMC; peripheral blood mononuclear cell).
도 36은 cMSC1및 cMSC2의 배양액의 hTGF-β1과 hsTNF-R1 (Soluble tumor necrosis factor receptor 1) 의 분비량을 확인한 결과를 나타낸 도이다
도 37은 cMSC1및 cMSC2에서 발현하는 면역 관련 마커 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase), ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand)의 발현 변화를 WI38 세포 기준으로 비교한 결과를 나타낸 표이다.
도 38은 면역세포와 cMSC1및 cMSC2를 공배양한 배양액에서 분비된 IFN-γ, IL-17, IL-10을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 개선된 층분리 배양 및 증식 방법을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는 췌장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 상기 단일 클로날 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 췌장염 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 중간엽 줄기세포의 개선된 층분리 배양 및 증식 방법을 통해 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 를 포함하는 췌장염 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 유효성분인 단일 클로날 줄기세포는 줄기세포를 빠르고 오염없이 수득할 수 있는 층분리 배양법의 장점에 더하여, 단일 클로날 줄기세포, 바람직하게는 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 빠른 증식을 통해 WCB (Working Cell Bank) 제조 단계 없이도 단시간에 원하는 단일 클로날 줄기세포를 대량 수득할 수 있는 개선된 층분리 배양방법을 통해 수득되는 줄기세포이다. 상기의 방법을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포는 종래 층분리 배양방법을 통해 수득되는 줄기세포와 비교하여 췌장염 치료 효과가 증대된 줄기세포이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 췌장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 2) 및 3) 단계의 배양은 30 내지 40℃에서 4시간 이하, 바람직하게는 1시간 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분 배양하고, 반복 배양은 30 내지 40℃에서 4시간 이하, 바람직하게는 1시간 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분 배양 후, 30 내지 40℃에서 12 내지 36시간, 바람직하게는 18 시간 내지 30시간 배양을 2 내지 3회 반복하고, 이어서 30 내지 40℃에서 24 내지 72시간, 36시간 내지 60시간, 바람직하게는 36시간 내지 60시간으로 배양하며, 매번 상층액을 새로운 배양용기로 이동시켜 수행할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 분리한 방법을 간단히 요약하면 다음과 같다.　
Figure 112019125377706-pat00001
배양한 세포들은 단일 클로날 세포군을 형성하는데, 이 단일 클로날 세포군들을 분리한 후 계대 배양을 수행할 수 있으며 본 발명은 종래 층분리 배양 방법에 더하여 5) 단계의 계대 배양 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어, "층분리 배양" 은 줄기세포를 비중에 따라 분리하는 방법을 의미하며, 먼저 사람 골수를 추출하여 세포 배양액에 배양한 후, 상층액만 수득하여 이를 코팅제가 처리되거나 처리되지 않은 배양용기로 옮겨 배양한 후, 동일 과정을 몇 차례 반복하는 공정을 말한다. 이와 같은 층분리 배양은 원심분리 과정 없이 상층액을 반복적으로 수득하여 배양하는 공정을 반복하는 것을 특징으로 하며, 최종적으로 다른 세포의 오염없이 단일 클로날 줄기세포, 바람직하게는 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 상기 1) 내지 5) 단계 중 1) 내지 4) 단계는 KR 10-2006-0075676호, US 12/982738 또는 KR10-2013-7020033호에 기재된 층분리 배양 방법과 동일 또는 동등하게 수행될 수 있고, KR 10-2006-0075676호는 본 발명에 전체로서 참고될 수 있다.
또한 종래 KR10-2013-7020033및 US12/982738호에서는 췌장염 치료와 관련하여 세포를 얻는 방법으로 (i) 뼈 골수, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 또는 사이토카인-활성화된 말초 혈액의 생체 샘플을 수득하는 단계; (ii) 상기 뼈 골수, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 또는 사이토카인-활성화된 말초 혈액의 생체 샘플을, 용기 내에 침전시키는 단계; (iii) 상기 용기로부터 다른 세포에 비해 비교적 덜 밀집된 세포를 함유하는 상청액을 2회 이상 연속적인 방식으로 다른 용기에 전달하는 단계; (iv) 상기 상청액으로부터의 덜 밀집된 세포를 격리시키는 단계; (v) 단계(iv)에서 수득된 세포를 췌장염을 앓는 대상에게 투여하되, 여기서 상기 뼈 골수, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 또는 사이토카인-활성화된 말초 혈액은 단계 (i) 내지 (iii)에서 1,000 rpm 초과의 원심분리를 겪지 않은 단계를 개시한다. 상기 방법은 원심분리 없이 밀도차이만으로 단일 클로날 줄기세포를 수득하는 방법이라는 점에서 KR 10-2006-0075676호의 종래 층분리 배양방법을 이용한다.
그러나, 상기 US 12/982738, KR 10-2006-0075676호 및 KR10-2013-7020033호의 층분리 배양 방법은, 단일 클로날 줄기세포를 낮은 계대에서 효과적으로 수득하고, 이를 통해 췌장염 치료 효과가 현저하게 개선된 단일 클로날 줄기세포를 얻기 위한 방법을 개시하고 있지 않다.
종래 층분리 배양방법은 도 1에서 확인되는 바와 같이 단일 콜로니로부터 얻어진 모든 세포를 6웰로 이동시켜 80-90% 컨플루언시 (confluency) 로 증식시킨 후, 증식된 상태의 계대 1(P1) 세포들을 seed cell 로 하여 밀도 조절에 대한 인식 없이 많은 세포를 수득하기 위하여 4000 세포/cm2 (cells/cm2) 로 고밀도 배양을 수행한다.
반면 본 발명은 계대 2 이후의 배양에서 세포 밀도를 조절함으로써 췌장염 예방, 치료, 개선 효과가 우수한 줄기세포를 효과적으로 수득할 수 있음을 기초로 한 “개선된 층분리 배양 방법”에 관한 것이며, 종래 층분리 배양방법과 seed cell 이후 배양 단계를 달리하는 것을 특징으로 한다. 예컨대 구체적으로 '5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계'를 포함한다. 개선된 층분리 배양 방법은 종래 층분리 배양 방법 대비 빠른 단일 클로날 줄기세포의 증식을 유도할 수 있으므로, 최종 산물을 빠르게 수득할 수 있으며, 바람직하게는 P2 내지 P8 과 같은 계대 10 미만의 배양만으로도 MCB (Master Cell Bank) 를 제조하고, 우수한 췌장염 예방 또는 치료 효과를 나타내는 단일 클로날 줄기세포를 수득할 수 있다.
본 발명의 단일 클로날 줄기세포는 기존의 공정과 같이 4000 세포/cm2의 고밀도로 배양되는 경우 세포 증식능이 현저하게 감소하고 중간엽 줄기세포의 마커가 변화되고, 줄기세포의 분화능이 상실될 수 있다. 따라서 개선된 층분리 배양법을 통해 수득된 단일 클로날 줄기세포는 저밀도 내지 중간 정도의 밀도, 4000 세포/cm2 (cells/cm2) 미만의 낮은 세포 밀도, 예컨대 3000 세포/cm2 이하, 바람직하게는 2000 세포/cm2 이하, 더욱 바람직하게는 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 세포 밀도로 배양된 것을 의미할 수 있다.
1000 세포/cm2 (cells/cm2) 이하의 세포 밀도로 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 배양하는 경우, 세포의 증식능은 4000 세포/cm2같이 고밀도로 배양된 중간엽 줄기세포와 비교하여 장기간의 배양기간 내내 현저히 높게 유지되므로, 많은 계대를 반복하지 않아도 원하는 양의 대량 단일 클로날 세포를 빠르게 수득할 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 개선된 층분리 배양방법은 seed cell 이후의 계대 배양 단계를 계대 10 미만, 바람직하게는 계대 8 이하로만 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 종래 층분리 배양방법이 충분한 수의 세포를 확보하기 위해 최대 25계대까지 배양해야 했었던 것과 비교하여 적은 계대 배양만으로도 단일 클로날 줄기세포의 대량 생산이 가능한 장점이 있다.
또한 상기 세포 밀도로 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 배양하는 경우 해당 세포는 DNA 손상이 적으며, 노화가 억제되어 줄기세포의 분화능을 효과적으로 유지할 수 있는 장점이 있어 빠르고 신속하게 우수한 줄기세포 특성을 갖는 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있다.
또한 본 발명의 방법에 따라 수득되는 단일 클로날 줄기세포는 4000 세포/cm2같이 고밀도로 배양된 단일 클로날 줄기세포와 비교하여 우수한 췌장염 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낸다.
본 발명에 사용되는 배지는 항산화제를 포함하지 않는 배지, 상기 배지에 항산화제가 추가된 배지 또는 항산화제를 포함하는 배지를 모두 포함할 수 있다.
항산화제를 포함하지 않는 배지로는 이에 제한되는 것은 아니나 DMEM 배지를 사용할 수 있으며, 필요에 따라 상기 배지에 항산화제를 더 추가하여 배양을 수행할 수 있다. 또한 필요에 따라 항산화제가 포함된 α-MEM 배지를 이용하여 배양을 수행할 수 있다.
본 발명의 항산화제는 세포 배양에 사용될 수 있는 항산화제를 제한 없이 포함할 수 있으며, 글루타리온(Glutathione ), 시스테인(Cysteine), 시스테아민(Cysteamine), 유비퀴놀(Ubiquinol), 베타-머캅토에탄올(b-mercaptoethanol) 및 아스코르브산(Ascorbic acid; AA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 항산화제가 배지에 추가되는 경우, 상기 항산화제는 10 내지 50, 바람직하게는 10 내지 30, 더욱 바람직하게는 25μg/ml의 농도로 추가될 수 있다.
본 발명의 일 예에서는 항산화제를 포함하지 않는 배지로 DMEM, 더욱 바람직하게는 LG-DMEM 배지를 사용하며, 항산화제로 아스코르브산을 포함하는 배지로 α-MEM 배지를 사용한다.
한편 본 발명의 방법에 따르면 단일 클로날 줄기세포를 매우 효과적으로 증식할 수 있으므로, MCB를 이용하여 WCB (Working Cell Bank)를 제조하는 공정이 생략될 수 있다. 이는 기존의 층분리 배양법이 MCB 제조 후 WCB를 제조하는 공정을 수반해야 하는 것과 비교하여 공정을 단순화한 것이다.
본 발명의 배양 배지로 항산화제를 포함하는 배지를 이용하는 경우, 상기 배양 배지에는 항생제로 젠타마이신이 추가될 수 있다.
본 발명의 방법을 통해 수득된 중간엽 줄기세포는 최종적으로 바람직하게는 P2 내지 P10 미만의 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 P2 내지 P8의 중간엽 줄기세포, 더욱 더 바람직하게는 P2 내지 P6의 중간엽 줄기세포일 수 있다. 이는 최소 P10 내지 P12의 중간엽 줄기세포가 최종 산물로 수득되는 기존의 공정 대비 더 낮은 계대에서 수득되는 줄기세포이며, 세포 접종 밀도 조절을 통해 낮은 계대에서 빠르게 증식된 중간엽 줄기세포를 손쉽게 대량 수득할 수 있음을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기와 같은 개선된 층분리 배양법, 바람직하게는 2000 세포/cm2 이하, 더욱 바람직하게는 1000 세포/cm2 이하의 저밀도 및 항산화 조건의 개선된 층분리 배양법 방법으로 수득된 단일 클로날 줄기세포 (이하, 'cMSC1' 으로 표기) 는 종래 층분리 배양법으로 수득되는 단일 클로날 줄기세포 (이하 'cMSC2' 로 표기)와 비교하여, 세포 크기가 더 작고 균질하게 형성될 수 있으며, 경증뿐만 아니라 중증 급성 췌장염의 생존율을 높이고, 부종으로 인한 췌장의 무게 증가를 완화시키며, 급성 췌장염으로 인해 증가되는 소화 효소들의 증가와 염증 관련 효소의 증가를 효과적으로 감소시킬 수 있다.
본 발명에 있어 “췌장염” 이란 췌장 효소에 의해 췌장 분비샘의 파괴 및 췌장에 전반적으로 염증이 발생하는 것을 말하며, 만성 췌장염 및 급성 췌장염을 모두 포함하나, 급성 췌장염일 수 있고, 경증 및 중증 급성 췌장염을 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 개선된 층분리 배양방법에 의해 얻어진 단일 클로날 줄기세포는 췌장염뿐만 아니라, 췌장염으로부터 기인한 질환, 예컨대 폐손상, 패혈증, 신부전, 늑막 삼출액, 다발성 장기 부전 및 다발성 장기손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질환 역시 효과적으로 예방, 치료 또는 개선할 수 있다.
본 발명의 방법을 통해 얻어지는 단일 클로날 줄기세포는 췌장 세포의 생존률을 증진시킬 수 있으며, 알파-아밀라아제 또는 리파아제 활성의 감소, 미엘로퍼옥시다제 (Myeloperoxidase; MPO) 활성 감소, 호중구 침윤 및 염증 개선, 염증성 사이토카인 분비 감소, 및 항염증성 사이토카인 분비 증대로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 활성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명의 방법을 통해 얻어지는 단일 클로날 줄기세포는 부종, 괴사, 출혈 및 염증 침윤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 췌장염 병리학적 상태를 개선시킬 수 있다.
또한 본 발명의 방법을 통해 얻어지는 단일 클로날 줄기세포는 줄기세포는 TGF-β1 분비능, sTNF-R1 (Soluble tumor necrosis factor receptor 1) 분비능, IDO 발현능, ICOSL 발현능으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 능력이 증대된 단일 클로날 줄기세포 일 수 있다.
따라서 본 발명의 개선된 층분리 방법을 통해 얻어지는 단일 클로날 줄기세포인 cMSC1은 종래 층분리 배양법에 의해 수득되는 cMSC2와 비교하여 췌장 세포의 생존률 증진, 알파-아밀라아제 또는 리파아제 활성의 감소, 미엘로퍼옥시다제 (Myeloperoxidase; MPO) 활성 감소, 호중구 침윤 및 염증 개선, 염증성 사이토카인 분비 감소, 항염증성 사이토카인 분비 증대 활성이 모두 현저히 우수하며, 부종, 괴사, 출혈 및 염증 침윤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 췌장염 병리학적 상태를 개선하는 효과가 탁월하다. 이러한 췌장염 치료 효과의 차이는 개선된 층분리 배양법에 의해 수득되는 본 발명의 단일 클로날 줄기세포만의 현저한 효과이며, 종래 방법으로 수득된 cMSC2 대비 TGF-β1 분비능, sTNF-R1 분비능, IDO 발현능, ICOSL 발현능으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 능력이 증대된 것에 기인할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이식에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 1일 1 mg/kg 내지 1,000 mg/kg일 수 있으나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 상기 비경구 투여 방식으로는 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등이 포함되며, 상기 약학적 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포 수득하는 단계; 및 6) 상기 단일 클로날 줄기세포를 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 췌장염 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어, 상기 '개체'는 췌장염 예방 또는 치료가 필요한 개체를 포함하며, 포유류 또는 인간을 제외한 포유류일 수 있다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 췌장염 예방, 개선 또는 치료용 줄기세포를 제공한다.
또한 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포를 수득하는 단계; 를 포함하는, 췌장염 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 종래 층분리 배양법으로 수득되는 단일 클로날 줄기세포와 비교하여 탁월한 췌장염 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타내는 단일 클로날 줄기세포를 WCB 제조없이 빠르고 손쉽게 수득할 수 있으며, 상기 조성물은 약학, 식품, 의약외품, 및 화장료 조성물을 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 1000 세포/cm2 (cells/cm2 ) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 5) 단계의 배지는 항산화제가 추가된 배지인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 치료방법 및 제조방법에 있어, 상기에서 조성물에서 기술된 내용이 동일하게 적용될 수 있으며, 중복되는 내용은 명세서 기재의 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 본 발명의 내용이 하기 실시예로 한정되지는 않는다.
< 실시예 1> 개선된 층분리 배양법의 확립
보다 췌장염에 우수한 효과를 나타내는 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 제조하기 위하여 개선된 중간엽 줄기세포 층분리 배양법 및 증식 방법을 이용하였다. 개선된 중간엽 줄기세포 층분리 배양법 및 증식 방법은 국내특허출원 10-2006-0075676 호에 기재된 층분리 배양법의 배양 조건 중 세포 밀도 및 배양 배지를 변경한 것을 특징으로 한다. 이하 실험에서는 층분리 배양법을 통해 수득된 단일 클로날 중간엽 줄기세포 (cMSC)의 세포 배양 밀도를 각각 50 세포/cm2(cells/cm2) (저밀도), 1000 세포/cm2(중간 밀도), 4,000 세포/cm2 (고밀도)로 달리하고 그에 따른 세포의 특성을 분석하였다.
1.1 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화 확인
먼저 장기간 배양에서 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 배양 조건의 변화를 주기 위하여 계대 5(P5), 계대 10(P10), 계대 15(P15)의 중간엽 줄기세포를 이용하였으며, 각각 저밀도, 중간밀도, 고밀도의 조건으로 LG-DMEM 배지에 접종하였다. 이 후 세포의 형태학적 변화를 현미경을 통해 관찰하여 줄기세포의 노화여부를 판단하였으며 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 계대 5(P5) 및 계대 10(P10)에서는 세포 밀도에 따라 세포 크기와 형태학적 패턴에서 차이를 나타냈으며, 특히 P15의 경우 고밀도 배양 조건에서 편평하며 커진 형태의 중간엽 줄기세포가 관찰되었다. 이와 같은 형태는 전형적인 중간엽 줄기세포의 노화를 나타내는 것으로, 장기간 배양에서 세포의 밀도 조절이 중간엽 줄기세포의 노화를 조절할 수 있음을 확인하였다.
1.2 세포 밀도에 따른 MSC 세포 크기 및 입도 확인
세포 밀도에 따른 줄기세포의 변화를 추가적으로 확인하기 위하여, 노화된 세포에서 증가하는 것으로 알려져 있는 세포 크기 및 세포의 입도(granularity)를 유세포 분석기를 통해 정략 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포의 크기는 P5에서는 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, P10 및 P15인 경우 세포 밀도에 따라 유의적인 차이를 나타냄을 확인하였다. 특히 P10 및 P15에서는 높은 세포 밀도의 배양 조건에서 세포의 크기가 유의적으로 증가하여 세포 노화가 더욱 촉진됨을 확인할 수 있었다. 이와 동일하게 세포의 입도 역시 모든 계대(Passage)에서 세포의 밀도가 높아질수록 유의적으로 증가하는 결과를 나타내었다. 따라서 중간엽 줄기세포의 장기간 배양에 있어 세포의 밀도 조절이 세포 노화를 조절하는 인자가 될 수 있음을 확인하였으며, 세포 배양 밀도를 낮춤으로써 후기 계대에서 나타나는 형태학적 변화를 개선할 수 있음을 확인하였다.
1.3 배양 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 노화 확인
실시예 1.1 및 1.2에서 확인된 형태학적 변화가 실제로 중간엽 줄기세포의 노화 의존적 (age-dependent) 현상인지를 확인하기 위하여, 노화 세포를 선택적으로 염색할 수 있는 베타 갈락토시다아제를 이용한 염색분석법을 수행하고, 노화 관련 유전자인 p15, p16 및 증식 마커인 PCNA 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 비교하였다. 그 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 계대 5(P5) 및 계대 10(P10)에서는 모든 세포 밀도에서 노화된 세포의 염색을 확인할 수 없었으나, 계대 15(P15)에서는 세포 밀도가 높아질수록 노화된 세포의 염색이 뚜렷하게 증가하는 것을 확인하였다. 또한 도 5에 나타낸 바와 같이, 계대 15(P15)에서는 세포의 배양 밀도가 증가할수록 노화관련 유전자인 CDK 억제제 p15 및 p16의 유전자 발현이 증가하였으며, 증식 마커인 PCNA는 감소하였다.
이러한 결과는 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화가 중간엽 줄기세포의 노화와 관련 있음을 나타내는 결과이며, 계대 배양시 세포 배양 밀도의 조절이 중간엽 줄기세포의 노화를 조절할 수 있음을 나타내는 결과이다.
1.4 배양 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 증식능 변화 확인
중간엽 줄기세포의 증식 능력은 계대가 진행되고, 세포의 노화가 진행됨에 따라 점차적으로 감소하는 것으로 알려져 있다. 따라서 증식능은 중간엽 줄기세포의 노화를 확인할 수 있는 기준으로 사용될 수 있으며, 장기간 세포 배양 시 세포 배양 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 증식능 비교를 수행하였다. 각 세포의 증식능은 초기 접종 세포 수와 배양이 끝난 후 얻어지는 세포의 수를 통해 각 계대에 따른 증식률을 계산하여 확인하였고, 그 결과를 표 1 및 도 6에 나타내었다.
증가 배수(Fold Increase)
(cell/ cm 2 ) P5 P10 P15
50 88.4±6.5 34.3±5.0 16.4±1.3
1000 8.5±0.3 4.9±0.5 3.1±0.4
4000 3.0±0.1 1.9±0.1 1.1±0.1
표 1에 나타낸 바와 같이, 저밀도로 배양된 중간엽 줄기세포(MSC)의 경우 계대 5(P5), 계대 10(P10), 계대 15(P15)에서 증가 배수 (fold increase) 가 88.4, 34.3, 16.4 인 반면, 중간 밀도로 배양된 중간엽 줄기세포는 8.5, 4.9, 3.1, 고밀도로 배양된 중간엽 줄기세포는 3.0, 1.9, 1.1 인 것을 확인하였다. 또한 도 6에 나타낸 바와 같이, 세포군 배가 시간(PDT) 및 세포수 증식 수준(PDL)도 증가 배수와 같은 패턴으로 나타남을 확인하였다. 이러한 결과는 장기간의 중간엽 줄기세포 배양에서 세포 밀도를 낮춤으로써 중간엽 줄기세포의 증식능을 유지시킬 수 있음을 보여주는 결과이며, 동일한 계대 배양을 수행하더라도, 중간엽 줄기세포의 노화를 억제시키고 수명을 연장시킬 수 있음을 나타낸다.
1.5 배양 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포( MSC )의 분화능 변화 확인
세포 배양 밀도가 줄기세포능에 영향을 주는지 확인하기 위하여, P5 내지 P15 배양에 따른 분화능을 비교하였다. 줄기세포능으로 지방세포 분화능 및 골세포 분화능을 확인하였으며, 각각의 계대 및 밀도에서 정상, 정량 분석을 수행하였다. 구체적으로 지방세포 분화 배양액은 High Glusose DMEM 배양액에 NCS (Newborn Calf Serum) (Gibco), 10-7mol 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma), 0.5mM IBMX(Sigma), 10μg/ml 인슐린(insulin)(Sigma), 100μM 인도메타신(indomethacin) (Sigma)을 첨가한 배지를 만들어 실험하였으며, 7일 분화 후에 Oil red O 조직화학 염색을 통하여 확인하였다. 또한 Oil red O 조직화학 염색 후, 이소프로필 알코올로 용출시켰으며, 500nm에서 측정 후 정량 분석하여 확인하였다.
골세포 분화 배양액은 α-MEM 배양액에 FBS(Gibco), 50 μg/ml ascorbic 2 phosphate (sigma), 10-8mol 덱사메타손(Sigma), 10mM 베타글리세로포스페이트 (β-glycerophosphate) (sigma)를 첨가한 배지를 사용하였으며, 21일 분화 후에 Alizarin red S 조직화학염색을 통하여 확인하였다. 또한 Alizarin red S 조직화학 염색 후, 10% 아세트산으로 용출시켰으며, 405nm에서 측정하고 정량 분석하여 확인하였다. 상기와 같은 방법으로 지방세포 분화능 및 골세포 분화능을 확인한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 지방세포 분화능은 계대가 진행됨에 따라 전체적으로 감소하였으나, 밀도에 의한 차이가 뚜렷하게 나타나지 않은 반면, 골세포 분화능의 경우 고밀도 조건의 계대 15(P15) 배양군에서 유의하게 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 중간엽 줄기세포의 골세포 분화능은 낮은 세포 밀도로 배양하는 경우 더욱 잘 유지될 수 있음을 확인하였다.
1.6 배양 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 항원 프로파일 분석
세포 배양 밀도가 줄기세포의 항원 발현에도 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였으며, 각 계대 및 배양 밀도에 따른 양성 및 음성 항원 발현의 변화를 유세포 분석기로 확인하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure 112019125377706-pat00002
표 2에 나타낸 바와 같이, 음성 마커 발현의 변화는 뚜렷하게 확인되지 않았으나, 일부 양성 마커의 경우 같은 계대에서도 세포 배양 밀도에 따라 발현양의 변화가 나타남을 확인하였다.
특히 계대 15(P15)에서는 높은 밀도로 세포를 배양하는 경우 대부분의 양성 마커들의 발현 양이 현저하게 감소하였을 뿐만 아니라, CD73, CD105는 음성 발현을 보여 세포 밀도를 낮게 유지하여 세포 배양을 수행하는 것이 매우 중요한 인자가 될 수 있음을 확인하였다.
1.7 배양 세포 밀도에 따른 활성산소종 ( ROS ) 생산 및 DNA 손상 비교
중간엽 줄기세포의 기능의 감소와 DNA 손상은 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 활성산소종인 ROS에 의해 유도되는 DNA 손상은 중간엽 줄기세포(MSC)의 노화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 배양 밀도에 따라 총 활성산소종(ROS) 생산 및 이에 따른 DNA 손상이 상이하게 나타나는지 여부를 확인하기 위하여, 계대 및 세포 배양 밀도에 따른 총 세포성 활성산소종(ROS)양을 형광 강도 분석을 통해 비교하고, comet 분석을 통해 DNA 손상 정도를 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 총 ROS 생산은 모든 계대에서 세포 배양 밀도가 증가할수록 증가되는 경향을 확인하였고, 특히 계대 10(P10)과 계대 15(P15)에서는 유의적으로 ROS 생산이 증가됨을 확인하였다 (A). comet 분석에서는 DNA 손상이 가장 약한 CC1부터 손상이 가장 심한 CC5로 분류하여 데이터를 분석하였으며, 손상이 가장 심한 CC5의 경우 세포 배양 밀도가 높아질수록 유의적으로 증가함을 확인하였다. 반면, CC1은 세포 밀도가 높아질수록 유의적으로 낮아지는 경향을 보였다 (B).
추가적으로 DNA 손상이 ROS에 의해 유발된 것인지 확인하기 위하여, ROS에 의한 DNA 손상을 확인하는 8-OHdG의 농도를 확인하는 실험을 수행하였다. 8-OHdG 분석방법은 다음과 같다. 각각의 세포로부터 얻은 DNA 시료 50μl를 8-OHdG 가 결합된 플레이트(8-OHdG conjugate coated plate)에 넣어준 후, 상온에서 10분간 배양하였다. 그 후, 항-8-OHdG 항체(anti-8-OHdG antibody)를 추가로 넣어 상온에서 한 시간 배양하였으며, 3회 세척 후, secondary antibody enzyme conjugate를 각 웰(well)에 넣어 준 후, 다시 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 이 후 다시 3회 세척 후, 기질 용액(substrate solution)을 넣어 상온에서 30분간 배양하였다. 마지막으로 정지 용액(Stop solution)을 넣어 준 후, 450nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, DNA 손상이 가장 심한 것으로 나타난 계대 15(P15) 군에서는 세포 배양 밀도가 높아질수록 8-OHdG의 농도가 유의적으로 증가함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 고밀도 배양 조건에서 생산되는 ROS에 의해 DNA 손상이 증가하는 것이며, 이에 의해 중간엽 줄기세포의 노화가 촉진된다는 것을 나타낸다.
이러한 결과는 세포 배양 밀도를 낮게 조절하는 것이 중간엽 줄기세포의 ROS 생산 증가에 의한 DNA 손상으로부터 중간엽 줄기세포를 보호하는 역할을 할 수 있음을 보여주는 결과이다.
1.8 항산화제 처리에 따른 중간엽 줄기세포( MSC ) 증식 및 활성산소종 ( ROS ) 생산능 확인
중간엽 줄기세포의 증식이 고밀도 배양 조건에서 생산되는 ROS에 의해서 영향을 받는지 여부를 확인하기 위하여, ROS 소거 실험을 수행하였다. 계대 11(P11) 내지 계대 15(P15)에서 고밀도 배양 조건 및 고밀도 배양 조건에 항산화제인 아스코르브산 25μg/ml을 배지에 첨가하여 배양한 후 두 그룹 간의 증식률의 증가 배수(Fold)를 비교하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 고밀도 배양 조건에서 증가 배수가 P11 내지 P15에서 각각 2.6, 1.9, 1.6으로, 계대수가 증가할수록 증식능이 감소하면서 노화가 나타나기 시작했으나, 항산화제를 처리한 경우 모든 계대에서 약 50% 정도 증식능이 높게 유지되는 것을 확인하였다. 또한 항산화제 처리군에서 성장 증가 배수 (growth fold increase)는 P11 내지 P15에서 각각 3.8. 2.9, 2.5로 P15까지도 증식능이 높게 유지되었다.
마지막 시점(Endpoint)인 P15에서 고밀도 배양 조건 단독 및 고밀도 배양 조건+항산화제 처리 두 그룹 간의 ROS 수준을 확인한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 항산화제인 아스코르브산을 처리하여 증식이 증가한 조건에서는 ROS 수준 역시 감소되어 있음을 확인하였다. 따라서 MSC 배양은 고밀도가 아닌 낮은 세포 밀도에서 수행하는 것이 바람직하며, 고밀도 세포 배양에서 유도되는 ROS 생산을 항산화제로 소거하는 경우 중간엽 줄기세포의 증식능을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 즉 고밀도 조건은 ROS으로 인해 중간엽 줄기세포의 증식능이 억제되며, 세포 밀도가 낮아질수록 ROS가 감소하여 중간엽 줄기세포 증식능이 촉진될 수 있다.
이러한 결과를 종합하면, 층분리 배양을 통해 얻어진 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 증식, 배양 및 줄기세포능을 유지하기 위해서는 배양 조건 중 세포 밀도를 1000 세포/cm2 이하의 밀도로 조절하는 것이 중요하며, 항산화제를 첨가하여 배양하는 경우 세포 배양에서 유발될 수 있는 산화 스트레스를 억제하여 중간엽 줄기세포 증식을 효과적으로 촉진할 수 있음을 확인하였다. 또한 동일한 낮은 세포 밀도 조건 배양을 비교하면, P15와 같은 계대 10 이상인 줄기세포는 계대 5와 같은 계대 10 미만의 줄기세포와 비교하였을 때 세포의 형태학적 변화가 두드러지고 줄기세포의 노화 촉진, 분화능 감소와 같은 결과가 확인되므로, 1000 세포/cm2 이하의 밀도로 계대 10 미만의 낮은 계대 수로 배양하는 것이 가장 효과적임을 확인하였다.
< 실시예 2> 개선된 층분리 배양법의 검증
상기 실시예 1 을 통해, 층분리 배양법으로 수득한 중간엽 줄기세포 배양에 있어서 세포 밀도의 조절, 계대 조절, 및 항산화제의 첨가가 중요한 인자가 될 수 있음을 확인하였으므로, 국내특허출원 10-2006-0075676 호에 기재된 층분리 배양법의 기존 공정으로 수득한 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 세포 배양 밀도를 달리하고, 항산화제인 아스코르브산이 첨가된 배지로 배지를 달리하면서 계대 배양을 수행하여 단일 콜로니 MSC 의 증식능 및 이에 따른 세포 수득 효과를 비교하였다.
이전 국내특허출원 10-2006-0075676호 의 실시예 1에서는 도 1과 같은 층분리 배양 방법을 통해 골수에서 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법을 개시하고 있으며, 층분리 단계를 거쳐 수득되는 단일성 세포군인 콜로니들을 웰당 100 내지 600의 세포수로 배양 용기로 이동에서 한다는 사실을 개시한다.
또한 국내특허출원 10-2013-0106432 및 미국특허출원 2012-0171168 호는 층분리 배양법을 이용하여 골수 유래 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법을 개시하고, 콜로니를 50 내지 100 세포/cm2 으로 도말한다는 사실을 개시하고 있다.
그러나 국내특허출원 10-2006-0075676호, 10-2013-0106432호 및 미국특허출원 US2012-0171168호는 층분리 배양법에 의해 수득된 단일성 세포군 콜로니를 계수하여 6 웰 플레이트로 이동시켜 배양하는 구성, 즉 계대 1에 해당하는 콜로니 배양의 조건을 개시하고 있을 뿐, 계대 2 이후의 콜로니가 아닌 개별 세포들의 반복적인 배양 밀도 조절에 대한 구성 및 이에 따른 효과는 전혀 개시하고 있지 않다. 상기 출원에 기재된 종래 층분리 배양법에 따르면 충분한 양의 췌장염 예방, 치료, 개선 효과가 있는 단일 클로날 줄기세포를 얻기 위하여 최소 10계대 이상의 배양을 수행해야 한다. 반면, 본 발명의 개선된 층분리 배양 방법에서는 계대 2 이후 낮은 세포 밀도 조건, 최대 8 계대 이하의 적은 계대 배양 수를 통해 효과적으로 목적하는 췌장염 치료에 효과가 있는 단일 클로날 줄기세포를 대량 수득할 수 있다.
구체적으로 본 개선 방법에서는 층분리 배양 방법을 통해 수득된 계대 1(P1)의 콜로니를 배양한 후, 계대 2(P2) 이후 계대 배양에서는 낮은 밀도인 1000 세포/cm2 이하로 세포를 분주하고 이를 4000 세포/cm2 세포 배양의 효과와 비교하였다. 또한 세포 배양 배지를 항산화제가 포함된 α-MEM 배지와 항산화제가 미 포함된 LG-DMEM 배지로 달리하고 이에 따른 세포 증식 효과를 비교하였다.
개선된 층분리 배양법의 효과를 확인하기 위한 실험군을 하기 표 3에, 종래 층분리 배양법 대비 개선된 층분리 배양방법의 공정 개선 부분을 도 12a 및 도 12b에 모식화하여 나타내었다.
도 12a 에 나타낸 바와 같이, 계대 1을 수득하는 공정까지는 종래 층분리 배양법과 개선된 층분리 배양법이 공정을 동일하게 진행하나, 개선된 층분리 배양법은 확장된 계대 1 세포를 seed cell 로 이용하여 배양하는 단계 이후의 계대 배양 공정이 종래 층분리 배양법과 상이하다. 기존 층분리 배양법은 밀도 조건에 대한 인식 없이 많은 세포를 수득하기 위한 목적으로 4000 세포/cm2 이상의 고밀도 계대 배양을 수행하나, 개선된 층분리 배양법은 계대 배양의 밀도를 낮은 밀도인 1000 세포/cm2 이하로 조절함으로써, 계대 2 이후 최대 계대 8 이하의 배양만으로도 최종 산물을 수득할 수 있다. 계대 2 이후의 배양 공정을 도 12b에 상세하게 나타내었다.
Figure 112019125377706-pat00003
상기 표 3의 세포주들은 층분리 배양 방법에 의해 분리된 세포주이며 SCM01 내지 SCM08로 각각 명명하였다.
2.1 세포주 밀도 및 배지에 따른 증식 효과 확인
상기 SCM01 내지 08 세포주를 이용하여 배양을 수행하고, 계대 10 미만인 계대 5 까지의 계대 배양에 따른 세포 증식 효과를 세포 수, 세포군 배가 시간(PDT; Population Doubling Time), 세포수 증식 수준(PDL; Population Doubling Level) 로 각각 비교하였으며, 이를 도 13 내지 도 20에 나타내었다.
도 13 내지 도 20에서 확인한 바와 같이, cm2 당 1000개의 세포 밀도로 접종하여 배양된 모든 실험군에서 cm2 당 4000개의 세포 밀도로 접종하여 배양한 실험군보다 우수한 세포 증식 효과를 나타내었다. 또한, 동일한 1000개의 세포 밀도군이라도, 항산화제인 아스코르브산이 포함된 α-MEM 배지에서 배양된 1000alpha 실험군에서 더욱 현저한 세포 증식 효과를 확인하였다.
2.2 세포주 밀도에 따른 증식 효과 비교
배양 세포 수에 따른 증식률의 보다 정확한 비교를 위하여, 배양 배지를 각각 LG DMEM 또는 α-MEM 배지로 고정하고, cm2 당 1000 또는 4000개의 세포 접종 밀도의 계대 배양에 따른 세포 증식 효과를 비교하였으며, 그 결과를 도 21 내지 도 24 에 나타내었다.
도 21 에 나타낸 바와 같이, LG DMEM에서 배양된 SCM01 내지 SCM08 세포주의 계대2(P2) 내지 계대 5(P5)에서의 증식률이 cm2 당 4000 개의 세포수 접종군보다 1000 개의 세포수로 접종하여 배양하였을 때 현저하게 높은 것을 확인하였으며, 계대 5(P5) 에서 확인된 cm2 당 4000 개의 세포 접종 대비 1000개의 세포 접종군의 증식률은 최소 3.08 내지 최대 48.50 배인 것을 확인하였다.
또한 도 22에 나타낸 바와 같이, cm2 당 1000개의 세포 접종군의 PDT값도 모든 세포주에서 cm2 당 4000개 세포주 접종보다 낮거나 비슷한 수준으로 나타났으며, PDL값은 모든 세포주에서 cm2 당 4000개 세포 접종 대비 높은 값을 확인하였다.
또한 도 23에 나타낸 바와 같이, α-MEM 에서 배양된 SCM01 내지 SCM08 세포주 모두 1000 개의 세포수로 접종하여 배양하였을 때, DMEM 실험군과 같은 경향을 보였으며, 계대 5(P5)에서 확인된 cm2 당 4000 개의 세포주 접종 대비 cm2 당 1000개의 세포 접종군의 증식률은 최소 6.32 내지 최대 85.63배인 것을 확인하였다. 또한 도 24에 나타낸 바와 같이, cm2 당 1000개의 세포 접종군의 PDT 값도 모든 세포주에서 cm2 당 4000개 세포 접종보다 낮거나 비슷한 수준으로 나타났으며, PDL 값은 모든 세포주에서 cm2 당 4000개 세포 접종 대비 높은 값을 확인하였다.
이러한 결과는 cm2 당 4000개의 고밀도 세포 접종 배양에 비하여 cm2 당 1000개 이하의 세포 접종을 통해 빠른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 증식을 유도할 수 있음을 보여주는 결과이다.
2.3 배양 배지에 따른 증식 효과 비교
앞서 실시예 2.2 를 통해 1000 세포/cm2 배양이 4000 세포/cm2 배양 대비 우수한 증식 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였으므로, 세포수를 1000개로 고정하고, 배지를 변수로 변화시키면서 세포 증식 효과를 비교함으로써, 배양 배지 조건에 의한 증식 효과를 추가적으로 검증하였고 그 결과를 도 25 및 도 26에 나타내었다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 배양 배지를 α-MEM 및 DMEM으로 달리하며 세포 증식률을 비교한 결과 LG-DMEM 대비 α-MEM 배지를 이용한 실험군에서 최소 1.77 배 내지 6.39 배의 높은 세포 증식률을 확인하였다. 또한 도 26에 나타낸 바와 같이, PDT가 모든 α-MEM 실험군에서 낮게 나타났으며, PDL 은 증가된 것을 확인하였다.
이와 같은 실험 결과는 세포 접종 밀도를 cm2 당 1000개 이하의 세포로 조절하여 계대 2(P2) 내지 계대 5(P5)와 같은 계대 10 미만의 낮은 계대로 배양하는 것에 더하여 항산화제가 첨가된 배지를 이용하여 배양하는 경우 세포 증식 효율을 극대화할 수 있음을 나타낸다.
< 실시예 3> 개선 공정의 수립
상기 실시예들을 통해, 중간엽 줄기세포 배양에 있어서 세포 밀도의 조절 및 항산화제의 첨가가 중요한 인자가 될 수 있음을 확인하였으므로, 국내특허출원 10-2006-0075676호 및 10-2013-7020033에 기재된 층분리 배양법의 기존 공정에 더하여, 계대 배양 시 세포 배양 밀도 및 배지 조건을 달리하여 단일 콜로니의 중간엽 줄기세포를 계대 10 미만의 낮은 계대에서 효과적으로 수득할 수 있는 개선된 공정을 확립하였으며, 이를 종합적으로 하기 표 4 (DMEM 배지를 이용한 배양 조건) 및 표 5 (α-MEM 배지를 이용한 배양 조건)에 나타내었다.
Figure 112019125377706-pat00004
Figure 112019125377706-pat00005
보다 구체적으로 본 발명의 골수 유래 중간엽 줄기세포의 층분리 배양 공정 및 증식 배양을 다음과 같이 수행하였다.
골수제공자의 엉덩이부분을 국소마취제로 마취시킨 후, 엉덩이뼈에 주사바늘을 찔러 골수를 채취하였다.　100 mm 배양용기에 20% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 14 ml DMEM(Dulbecco`s modified Eagle`s Medium, GIBCO-BRL, Life-technologies, MD, USA), 사람 골수 1 ml를 넣어 37℃5% CO2 세포배양기에서 2시간 배양하였다.　배양 후, 배양용기를 한쪽으로 살짝 기울여 바닥에 붙은 세포들이 되도록 떨어지지 않도록 최대한 배양용기의 상층 배양액만 새로운 용기로 옮겼다.
동일한 과정을 한 번 더 반복한 후 수득한 배양액을 바닥에 교원질(collagen)이 코팅된 배양용기(Becton Dickinson)로 옮긴 후 37℃에서 2시간 배양하였다.　배양액을 다시 새로운 교원질이 코팅된 용기로 옮기고 24시간 후 다시 새로운 용기로 옮기고 24시간 후 또 새로운 용기로 옮겨주었다. 마지막으로 48시간 후 새로운 용기로 옮겨 준 후 남아있는 세포들이 배양용기 바닥에 붙어 자라는 것을 육안으로 확인하였다.　앞의 여러 층분리 단계들을 거쳐서 이 단계에까지 올 수 있는 세포들은 세포의 비중이 타 세포들보다 월등히 작은 세포들임을 짐작할 수 있다.　
약 10 내지 14일의 시간이 지나면 세포들이 단일 콜로니 (single colony)를 형성하는데, 이 단일 클로날 세포군들을 트립신을 처리하여 분리한 다음 6-웰 배양용기로 옮겼다. 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 4 내지 5일 배양한 후 약 80% 자랐을 때, 세포들을 0.05% trypsin/1mM EDTA(GIBCO-BRL)를 처리하여 수득한 후, T175 배양용기로 옮겨 낮은 세포 밀도로 계대 배양하였다.　
이와 같이 계대 10 미만, 바람직하게는 계대 8 이하의 계대 2(P2) 내지 계대 5(P5)에서 세포 밀도를 1000세포/cm2 수준으로 낮춰 배양하는 경우, 다른 공정은 모두 동일하게 조절하였음에도 중간엽 줄기세포의 증식능 및 줄기세포 특성이 우수하게 유지되어 동일한 계대에서도 증식이 효과적으로 유도됨을 확인하였다. 특히 세포 밀도를 낮춰 배양하는 경우, 기존 공정에서 필요로 했던, 중간엽 줄기세포에서 WCB(Working Cell Bank)를 제조하는 과정을 생략할 수 있어, 세포 제조 기간을 효과적으로 단축할 수 있다. 특히 계대를 적게 하면 노화가 비교적 덜 진행된 세포를 많은 양으로 수득할 수 있으며, 이와 같은 세포를 치료제로 이용하는 경우 치료 효능이 우수할 것으로 기대할 수 있다.
또한, 배양 배지로써 항산화제가 첨가된 α-MEM을 이용하는 경우, 높은 밀도의 세포 배양에서 유도되는 ROS 스트레스가 항산화제 처리에 의해 효과적으로 개선되고 중간엽 줄기세포의 세포 증식능이 회복될 수 있어, 기존의 공정 대비 세포의 계대를 현저히 단축하고, 중간엽 줄기세포의 특성을 유지하는 노화가 진행되지 않은 신선한 상태의 단일 콜로니 중간엽 줄기세포를 빠르고 안정적으로 수득할 수 있다는 특징이 있다.
상기와 같은 내용을 종합하면, 저밀도 세포 배양은, 단시간에 많은 세포를 얻을 수 있어 제조공정은 간소화시킬 뿐 아니라 장기간 배양(long-term culture)에서도, 중간엽 줄기세포의 특성을 온전히 유지하는 노화되지 않은 상태의 세포를 수득할 수 있으므로, 양질의 줄기세포 생산을 가능하게 함을 확인하였다.
이에 따라, 이하 췌장염 치료를 위한 실험에서 상기 실시예를 통해 구축한 개선 방법을 통해 얻어지는 줄기세포를 이용하였다.
< 실시예 4> 개선 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포의 췌장염 치료 효과 확인
4.1 cMSC1 , cMSC2 의 준비
실시예 3의 개선된 층분리 배양법에 따라, 계대 배양 시 세포 배양 밀도를 1000 세포/cm2 이하로 하고, 항산화제를 포함하는 a-MEM 배지를 이용하여 3회 계대하고 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득하였다. 항생제로는 젠타마이신이 추가되었으며, α-MEM 배양액으로 수행하였다(표 5 참조). 이하 1000 세포/cm2 이하의 저밀도 및 항산화 조건의 개선된 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포를 “cMSC1“로 명명하였다. 또한 개선된 층분리 배양법에 의해 수득된 줄기세포와 효과를 비교하기 위하여 계대 배양 시 4000 세포/cm2 이상의 밀도 및 항산화제 미첨가 조건의 배양 방법으로 배양하는 종래 층분리 배양법에 의해 수득하고 3 계대 배양된 줄기세포를 “cMSC2” 로 명명하였다.
4.2 cMSC1 투여에 따른 급성 췌장염 치료 효과 확인
4.2.1 급성 췌장염 동물 모델 구축 및 실험 방법
cMSC1 투여에 따른 급성 췌장염 치료 효과를 확인하기 위하여 급성 췌장염 동물 모델을 하기 표 6과 같이 설정하였다. 실험에 사용된 마우스는 SPF (Specific Pathogen Free) 랫트 ((주) 코아텍) 에서 구입하여 사용하였으며 각 그룹별 5주령 수컷 랫트 15 마리, 총 60 마리를 이하 실험에 사용하였다.
그룹 실험군
1 정상 대조군 (Control)
2 Vehicle (SAP)
3 cMSC1 (급성췌장염 유발 + cMSC1 투여군)
4 cMSC2 (급성췌장염 유발 + cMSC2 투여군)
급성 췌장염 동물 모델을 구축하기 위하여 수술 전, clipper를 이용하여 동물의 복부를 제모하였다. Zoletil 50 (VIRBAC, France) 및 xylazine (Rompun®Bayer AG, Germany)을 이용하여 마취를 실시하였으며, 필요 시 추가 마취를 실시하였다. 포비돈 및 70 % 알코올을 이용하여 절개할 부위를 넓게 소독한 다음, 복부 정중 절개를 실시하였다. 십이지장을 드러낸 후, 급성 췌장염 유발물질인 3 % 타우로콜산 나트륨 (sodium taurocholate) 를 1 mL/kg의 투여액량으로 췌장관 내 투여하여 급성 췌장염을 유도하였다.
동물 모델에서 췌장염을 유도하고 4 시간 후, cMSC1 및 cMSC2 를 2ⅹ106 cells 을 꼬리 정맥을 통해 단 회 200ul 투여하였으며 72시간 후 혈액 및 장기를 적출하여 분석을 수행하였다. 도 27 에 본 발명에 따른 급성 췌장염 동물 모델 구축의 모식도를 나타내었다.
4.2.2 cMSC1 및 cMSC2 처리에 따른 췌장 세포 생존률 확인
실시예 4.2.1에서 제조된 급성 췌장염 동물 모델에서 주입한 세포 생존률을 확인하였다. cMSC1 및 cMSC2 를 하기 표 7에 나타낸 세포 안정화제와 함께 동일한 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 투여하였다.
Figure 112019125377706-pat00006
상기 표 7에서 확인한 바와 같이, 시험물질인 cMSC1과 cMSC2의 주입 시 생존률을 측정한 결과 각각 91%, 87.7% 로 모두 85% 이상의 생존률을 확인하였고, 특히 cMSC1 투여군은 90% 이상의 생존률을 나타내어 췌장 세포 보호 효과가 더 탁월함을 확인하였다.
4.2.3 cMSC1 처리에 따른 혈액생화학적 효과
급성 췌장염이 유도된 실시예 4.2.1 의 랫트에서 cMSC 처리에 따른 혈액 생화학적 효과를 확인하기 위하여 췌장염 표지 마커 수준을 확인하였다. 구체적으로 시험 종료 시점인 cMSC1 또는 cMSC2 투여 72시간 후에 2개의 효소 알파-아밀라아제(a-amylase) 및 리파아제(lipase)를 혈액 생화학적 분석기 (7180 Hitachi, Japan) 를 이용하여 측정하였으며, 결과를 도 28에 나타내었다.
도 28에 나타낸 바와 같이, cMSC1, 2 투여 후 72 시간 째에 급성 췌장염 (SAP) 모델 에서의 알파-아밀라아제 및 리파아제 수준은 대조군에 비하여 유의하게 높은 것을 확인하였다. cMSC2 투여군은 SAP 모델 대비 알파-아밀라아제 수준에서는 효과를 나타내지 않았으나, 리파아제 증가는 약 13% 억제하는 것을 확인하였다. 한편 개선된 층분리 배양법을 통해 수득된 cMSC1 투여군에서는 SAP 대조군 대비 51% 의 아밀라아제 수준의 감소를 확인하였으며, 리파아제 역시 64% 의 유의한 수준 감소를 나타내었다.
즉, cMSC1을 주입하면 췌장염 표지 마커인 알파-아밀라아제와 리파아제가 모두 유의적으로 약 51 내지 64 % 감소함을 확인하였으며, 이러한 결과는 cMSC1이 혈청 내 알파-아밀라아제와 리파아제 활성을 매우 현저하게 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
4.2.4 cMSC1 처리에 따른 미엘로퍼옥시다제 ( Myeloperoxidase ; MPO ) 확인
미엘로퍼옥시다제 (Myeloperoxidase;MPO)는 호중성과립(neutrophil granulocytes)에 풍부하게 발현되는 효소로, 심근경색(myocardial infarction) 또는 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)의 예측인자로 사용되며 염증 정도를 나타내는 표지이다. 본 발명의 cMSC1 처리에 따라 췌장 조직 내 호중구의 침윤 정도 및 염증 정도가 개선되는지 여부를 확인하기 위하여, 미엘로퍼옥시다제 (150kDa)를 Myeloperoxidase activity assay kit (STA-803, Cell biolabs) 를 이용하여 제조사의 방법에 따라 측정하였고, 그 결과를 도 29에 나타내었다.
도 29에 나타낸 바와 같이 급성 췌장염을 유도한 그룹에서 대조군보다 약 12배 가량 미엘로퍼옥시다제 활성이 증가되었으나, 개선된 층분리 배양법에 의해 수득된 cMSC1 처리군에서는 유의적으로 65% 이상 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 cMSC1 이 종래 공정의 세포주 그룹 cMSC2의 8% 감소 효과와 비교하여 통계학적으로 유의미한 현저한 호중구 감소 효과를 나타냄을 보여주는 결과이다.
4.2.5 cMSC1 처리에 따른 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인 분석
급성 췌장염 동물 모델인 실시예 4.2.1 의 랫트에서 cMSC 처리에 따라 염증성 인자의 변화가 유도되는지 여부를 확인하기 위하여 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IFN-γ, IL-10 의 발현 변화를 하기 표 8의 분석 툴을 이용하여 제조사의 방법에 따라 측정하였으며, 그 결과를 도 30에 나타내었다.
Figure 112019125377706-pat00007
도 30에 나타낸 바와 같이, 급성 췌장염 동물 모델 (SAP) 에서는 TNF-α, IL-6, IFN-γ 의 수준이 대조군 대비 현저하게 증가하였으나, cMSC1 및 cMSC2 처리군에서는 대조군 대비 발현 수준의 확연한 감소를 확인하였다. 특히 cMSC1 처리군은 TNF-α, IL-6, IFN-γ 에서 각각 49%, 42%, 61% 의 대조군 대비 감소효과를 나타내어 현저히 우수한 염증성 사이토카인 억제 효과를 확인하였다. 또한 항염증성 사이토카인인 IL-10 은 대조군에 비하여 cMSC1 및 cMSC2 처리군에서 모두 증가하였으며, 특히 cMCS1 의 IL-10 수준은 대조군에 비하여 69% 증가하여 cMSC 처리에 의하여 항염증성 사이토카인의 발현의 증가가 유도될 수 있음을 확인하였다.
4.2.5 cMSC1 처리에 따른 조직 병리학적 분석
실시예 4.2.1 의 급성 췌장염 동물 모델의 장기를 적출하고, cMSC1 처리에 따른 부종 병변의 변화를 확인하기 위하여 조직 병리학적 분석을 수행하였다. 구체적으로, 시험물질 투여 후 72 시간째에 채혈한 다음 동물을 안락사시킨 후, 췌장을 적출하여 10 % 중성완충포르말린으로 고정하였다. 고정된 조직을 이용하여 삭정, 탈수, 파라핀 포매 및 박절 등 일반적인 조직처리 과정을 수행하고 조직병리학적 검사를 위한 검체를 제작하였다. Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 실시하고, 광학 현미경 (Olympus BX53, Japan)을 이용하여 조직병리학적 변화를 관찰하였다. 조직병리학적 평가는 Schmidt’s score (A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy, Schmidt J et al, 1992)를 이용하여 점수화하였다. 그 결과를 도 31 및 도 32 에 나타내었다.
도 31에 나타낸 바와 같이, 현미경 하에서 대조군 대비 SAP 에서 염증 소견이 확인되었으며, cMSC1 처리군에서 염증 정도가 가장 개선되어 있음을 확인하였다.
도 32에 나타낸 바와 같이, 급성 췌장염 동물 모델에서는 조직병리학 스코어, 부종, 괴사, 출혈, 염증 침윤 스코어가 모두 대조군 대비 급격하게 증가하였으며, 이러한 급격한 증가는 모두 cMSC1 및 cMSC2 처리에 의하여 완화되는 경향을 확인하였다. 특히 cMSC1 처리군은 대조군 대비 모든 평가 지표에서 약 27 내지 35%의 감소 효과를 나타내어, cMSC2 처리군 대비 약 2배의 효과를 나타냄을 확인하였다.
종합적으로, 개선된 층분리 배양법에 의해 수득된 cMSC1 의 경우 급성 췌장염에서 췌장 세포 생존율을 증가시키고, 혈액 생화학적, 조직 병리학적인 병변을 모두 효과적으로 개선시킬 수 있으므로, 급성 췌장염 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 또한, 이러한 cMSC1 의 급성 췌장염 치료에 대한 효과는 종래 층분리 배양법에 의해 수득되고 고밀도 계대 배양된 cMSC2 와 비교하더라도 현저히 우수함을 확인하였다.
< 실시예 5> 개선 층분리 배양법에 의해 수득된 줄기세포 특성 비교
5.1 cMSC1 및 cMSC2 세포 특성 비교
실시예 4에서 개선 층분리 배양법에 의해 수득된 줄기세포 cMSC1 이 종래 층분리 배양법으로 수득된 cMSC2 와 비교하여 현저히 우수한 급성 췌장염 치료 효과를 나타냄을 확인하였으므로, 이들 세포의 특성을 비교하기 위한 실험을 수행하였다.
실시예 4.1 의 방법과 동일한 방법으로 cMSC1 및 cMSC2 를 수득하였으며 이들을 배양하고 세포 크기를 확인하였다.
실험에 사용한 세포 및 방법을 하기 표 9에 나타내었다.
세포명 사용된 배지 면적당 배양된 세포수 배양 기간 특이사항
cMSC1 α-MEM 1000cells/cm2 7일 배지에 항산화제 첨가 1000a
cMSC2 DMEM 4000cells/cm2 3-4일 4000LG
cMSC1 와 cMSC2 의 세포 크기 차이를 검증하기 위하여, Nucleo Counter NC-250 기기를 이용하여 세포 크기를 확인하였으며 그 결과를 도 33 및 표 10에 나타내었다.
세포 명칭(Cell Name) cMSC1 cMSC2
추정 세포 지름
(Estimated Cell Diameter) (μm)		 18.0 18.9
세포 직경 표준 편차
(Cell Diameter Standard Deviation) (μm)		 10.5 12.6
표 10 및 도 33에 나타낸 바와 같이, 두 세포는 크기가 상이한 것을 확인하였고, 기기를 통해 세포 직경의 표준 편차를 확인한 결과, 개선된 층분리 배양법에 의해 수득된 cMSC1이 cMSC2보다 편차가 작은 것을 확인하였다.
추가적으로 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 전방산란/측방산란광(FSC/SSC) 값을 동일하게 지정하였을 때, 유세포 분석에서도 세포의 크기가 차이가 나는지 여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 34에 나타내었다.
도 34에 나타낸 바와 같이, cMSC2는 세포 크기가 커서 세포가 전반적으로 넓게 분포되어 있는 반면, cMSC1은 세포의 크기가 작고, 이에 따라 측방산란광 (SSC) 50K 내에 분포됨을 확인하였다.
상기와 같이, cMSC1이 세포 크기가 더 작고, 균질하게 형성됨에 따라 중간엽 줄기세포가 배양되면서 분비되는 사이토카인 양이 변화되어 cMSC1이 급성 췌장염 치료 효과가 더 강화되는 것으로 확인하였다.
5.2 cMSC1 및 cMSC2의 in vitro 효과 확인
급성 췌장염에 대하여 상이한 효과를 나타내는 cMSC1 및 cMSC2 를 배양한 후, in vitro 실험을 수행하여 세포별 활성을 비교하였다. 먼저 활성화된 T 세포의 억제율을 혼합 림프구 반응(Mixed lymphocyte reaction; MLR) 조건에서 확인하였다. 실험 방법은 다음과 같다. 두 명의 서로 다른 donor의 PBMC를 서로 섞어줌으로 항원에 의한 T세포의 활성을 유도한 다음 (allogeneic MLR), cMSC1 또는 cMSC2를 각각 넣어주어 T 세포의 활성을 억제하는지 확인하였다. 각각의 Dye (CFSE와 eFluor670)로 염색된 사람의 PBMC와 cMSC1 또는 cMSC2를 4:1 비율로 각각 공배양 한 후, 8일 동안 배양하였고, 분석은 FACS verse (BD Biosciences) 기기를 이용하는 유세포 분석법으로 측정하였다. 그 결과를 도 35에 나타내었다.
도 35에 나타낸 바와 같이, 활성화된 T 세포의 억제율을 혼합 림프구 반응 조건에서 확인한 결과 두 세포 모두 T cell: cMSC = 1 : 4 조건에서 50% 이상의 억제율을 보였으나, 개선된 공정의 세포주(cMSC1)는 79%, 이전 공정의 세포주(MSC2)는 53% 억제율로 약 26% 차이를 확인하였다.
In vitro에서 cMSC1 및 cMSC2 를 배양하고, 각 세포주의 배양액에서 TGF-β1, sTNF-R1 (Soluble tumor necrosis factor receptor 1), 및 면역관련 마커 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase), ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 의 발현량을 비교하였으며, 그 결과를 도 36 및 도 37 에 나타내었다.
도 36에 나타낸 바와 같이, 두 세포주를 배양한 배양액에서 TGF-β1과 sTNF-R1의 분비량을 확인한 결과 TGF-β1은 두 세포주간 큰차이가 나타나지 않았으나, sTNF-R1은 개선된 공정의 세포주인 cMSC1에서 28pg/ml 높게 분비됨을 확인하였다.
또한 도 37에 나타낸 바와 같이, 아무런 자극을 주지 않은 상태의 WI38 (Human Fibroblast)를 기준으로 IDO, ICOSL 의 발현량을 비교한 결과, 개선된 공정의 세포주인 cMSC1에서 두 유전자 발현량이 약 2배 높은 것을 확인하였다.
추가적으로 PHA (phytohemagglutinin) 자극조건에서 공배양한 후, 배양액으로 염증성 싸이토카인 (IFN-γ, IL-17) 및 항염증성 (IL-10) 싸이토카인의 변화를 확인하였다. IFN-γ, IL-17, IL-10의 분비량을 확인하기 위해, 1x106 cells/well 농도의 PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 24 well plate에 도말하고 1ug/㎖ PHA로 염증 반응을 유도하였다. 구체적으로, 상기 PHA 처리 유무 및 cMSC 처리 유무를 달리하여 각 실험군에서 IFN-γ, IL-17, IL-10의 농도를 측정하였고, 그 결과를 도 38에 나타내었다.
도 38에 나타낸 바와 같이, 개선된 공정의 세포주 cMSC1와 공배양한 결과 PHA 자극 조건 대비 IFN-γ는 74.3%, IL-17은 82.2% 억제되는 것을 확인하였고, 기존 공정에 의해 수득된 세포주 cMSC2에서는 IFN-γ가 55.4%, IL-17이 65.8% 억제되는 것을 확인하였다. 즉, 두 세포주간 염증성 싸이토카인의 억제율은 약 20% 정도 차이나는 것을 확인하였으며, 동일한 조건에서 항염증성 싸이토카인 IL-10의 분비량을 확인한 결과 개선된 공정의 세포주 cMSC1에서는 IL-10이 약 25% 증가한 반면 이전 공정의 세포주 cMSC2 에서는 7% 증가가 확인되어 cMSC1이 cMSC2보다 약 3 배 이상 항염증성 싸이토카인 분비를 더 증가시킴을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 종합하면, 개선된 공정을 통해 수득한 cMSC1을 이용하면 급성 췌장염으로 인해 증가되는 소화효소들의 증가와 염증 관련 효소의 증가를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다. 또한 염증성 사이토카인의 분비를 감소시키고 항염증 싸이토카인의 분비를 더욱 현저하게 증가시키는 것을 확인할 수 있었으며, 췌장의 조직학적 분석을 통해서도 유의미한 결과를 확인할 수 있었다. 특히 본 발명에 따른 cMSC1은 증식능 및 줄기세포 특성이 우수하게 유지되어 증식이 효과적으로 유지될 뿐만 아니라, cMSC1은 이전 공정으로 획득한 세포주 cMSC2와 비교하였을 때 면역조절능력, 면역 관련 유전자의 발현, 염증 및 항염증성 싸이토카인의 분비에 있어서 더 우수함으로 확인할 수 있었다. 따라서 개선된 공정으로 획득된 세포는 이전 공정으로 획득된 세포 대비 더욱 우수한 췌장염 예방, 치료가 가능함을 알 수 있다.

Claims (14)

1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계;
2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계;
3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계;
5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2)의 세포 밀도로 배지에 접종하여 계대 1 배양하는 단계; 및
6) 상기 5) 단계의 계대 배양된 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2)의 세포 밀도로 배지에 접종하여 계대 2 내지 계대 8로 배양하는 단계;를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하고,
상기 5) 및 6) 단계의 배지는 글루타티온(glutathione), 시스테인(cysteine), 시스테아민(cysteamine), 유비퀴놀(ubiquinol), 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 및 아스코르브산(ascorbic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항산화제가 추가된 배지인, 췌장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 5)단계 또는 6) 단계의 계대 배양은 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 췌장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 췌장염은 만성 췌장염 또는 급성 췌장염인, 췌장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일 클로날 줄기세포는 췌장 세포의 생존률을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 췌장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일 클로날 줄기세포는 알파-아밀라아제 또는 리파아제 활성의 감소, 미엘로퍼옥시다제 활성 감소, 호중구 침윤 및 염증 개선, 염증성 사이토카인 분비 감소 및 항염증성 사이토카인 분비 증대로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 췌장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일 클로날 줄기세포는 부종, 괴사, 출혈 및 염증 침윤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 췌장염 병리학적 상태를 개선시키는 것을 특징으로 하는, 췌장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일 클로날 줄기세포는 TGF-β1 분비능, sTNF-R1 (Soluble tumor necrosis factor receptor 1) 분비능, IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현능 및 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 발현능으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 능력이 증대된 단일 클로날 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 췌장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계;
2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계;
3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계;
5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 계대 1 배양하는 단계; 및
6) 상기 5) 단계의 계대 배양된 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2)의 세포 밀도로 배지에 접종하여 계대 2 내지 계대 8로 배양하는 단계;를 포함하고
상기 5) 및 6) 단계의 배지는 글루타티온(glutathione), 시스테인(cysteine), 시스테아민(cysteamine), 유비퀴놀(ubiquinol), 베타-머캅토에탄올(β-mecaptoethanol) 및 아스코르브산(ascorbic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항산화제가 추가된 배지인, 췌장염 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 5) 단계 또는 6) 단계 계대 배양은 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 췌장염 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.
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1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계;
2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계;
3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계;
5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2)의 세포 밀도로 배지에 접종하여 계대 1 배양하는 단계; 및
6) 상기 5) 단계의 계대 배양된 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2)의 세포 밀도로 배지에 접종하여 계대 2 내지 계대 8로 배양하는 단계;를 통해 수득되고,
상기 5) 및 6) 단계의 배지는 글루타티온(glutathione), 시스테인(cysteine), 시스테아민(cysteamine), 유비퀴놀(ubiquinol), 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 및 아스코르브산(ascorbic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항산화제가 추가된 배지인, 췌장염 예방, 개선 또는 치료용 줄기세포.
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