KR101672785B1

KR101672785B1 - Sirt1 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 지방세포로의 분화 조절 방법

Info

Publication number: KR101672785B1
Application number: KR1020150012049A
Authority: KR
Inventors: 김원; 한명관; 강경표; 정유진; 박성광
Original assignee: 전북대학교산학협력단; 전북대학교병원
Priority date: 2015-01-26
Filing date: 2015-01-26
Publication date: 2016-11-04
Also published as: KR20160091664A

Abstract

본 발명은 SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1) 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 지방세포의 분화 조절 방법에 관한 것으로, 본 발명의 SIRT1 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 지방세포의 분화 조절방법은 SIRT1 발현 억제제 처리 시기에 따라 지방세포의 분화 억제 또는 촉진을 조절할 수 있는 있으므로, 배아에서 SIRT1 발현 억제 시기에 따른 소아비만 등의 비만 연구모델로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, SIRT1 억제 물질을 선별하여 비만, 비만과 동반된 당뇨병, 그리고 대사질환의 억제제 또는 치료제 등으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

SIRT1 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 지방세포로의 분화 조절 방법{Methods for Regulating Differentiation of Adipose Stem Cells from Embryonic Stem Cells Through modulation of SIRT1 expression}

본 발명은 SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1) 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 지방세포의 분화 조절 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 배아줄기세포의 SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1) 발현을 억제시키는 단계를 포함하는 배아줄기세포로부터 지방세포로의 분화 억제 방법에 관한 것이다.

SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1)은 NAD+ 의존적 탈아세틸효소로써 여러 단백질의 리신 잔기를 탈아세틸화하여 단백질의 기능을 조절하는 효소로 알려져 있으며(Ageing Res, Vol.1 페이지 313-326, 2002), NAD+ 의존적 class Ⅲ 히스톤 탈아세틸 활성을 가진 효모의 Sir2와 가장 유사하다. 특히, Nuclear factor-kB, p53 등의 전사인자에 붙어 있는 아세틸기를 잘라내어 이들의 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다 (Cancer Res, Vol.64 페이지 7513-7525, 2004; Cell, Vol.107, 페이지 149-159, 2001; Trends Endocrinol Metab, Vol.17 페이지 186-191, 2006).

SIRT1은 유전자 발현억제와 관련 있는 크로마틴 재구성, DNA 손상 반응, 식이 제한에 동반된 수명연장 등에 관여한다(Chen et al ., Science , 310:1641, 2005). 즉, SIRT1은 효모의 Sir2 처럼 히스톤 탈아세틸화를 통해 크로마틴을 재구성하고 유전자의 발현을 억제하며, 히스톤 단백질 외에도 세포성장, 스트레스 반응, 내분비조절 등에 관련된 다양한 전사인자의 탈아세틸화를 유도한다. 또한, 최근 연구에 따르면 상기 SIRT1의 탈아세틸화 활성을 증가시켜 당뇨, 비만, 신경퇴행성질병 또는 노화관련질병 등에 적용하는 기술이 보고되었고, SIRT1가 PPAR-γ의 발현을 억제하여 지방세포로 분화를 억제시킨다는 연구결과가 보고되었으나(Frederic Picard et al ., Nature , 429:771, 2004) , 배아줄기세포에서 SIRT1의 발현 조절에 따른 지방세포로의 분화조절에 대한 연구는 이루어진바 없다.

이에, 본 발명자들은 배아줄기세포에서 SIRT1의 발현 조절에 따른 지방세포로의 분화조절 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1)가 배아줄기세포의 지방세포로의 분화에 관여하며, SIRT1 발현 억제 시기에 따라 지방세포로의 분화가 억제 또는 촉진되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명은 SIRT1 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 지방세포로의 분화 억제 또는 촉진 방법을 제공하는데 있다.

상술한 본 발명의 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 배아줄기세포의 SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1) 발현을 억제시키는 단계를 포함하는 배아줄기세포의 지방세포 분화 억제 방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 배아줄기세포의 지방세포 분화억제 방법은 배아줄기세포를 배양하여 형성시킨 배상체에 SIRT1 발현억제 물질을 처리하여 지방세포로의 분화를 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, SIRT1 발현억제 물질은 배상체 배양 0 내지 5일 동안 처리하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 SIRT1 발현억제제는 서티놀(Sirtinol; 2-[(2-Hydroxynaphthalen-1-ylmethylene)amino]-N-(1-phenethyl)benzamide) 또는 EX527(6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-1H-Carbazole-1-carboxamide)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, SIRT1은 배아줄기세포 내 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptors-γ), C/EBP α(CCAAT/enhancer-binding protein-α) 및 FABP4(fatty acid binding protein 4)의 mRNA 발현량을 감소시켜 지방세포로의 분화를 억제하는 것일 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 배아줄기세포를 배양하여 배상체(embryoid body)를 형성시키는 단계; 및

(b) SIRT1 발현 억제 물질이 포함된 배지에서 상기 배상체를 배양하여 지방세포로 분화를 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 지방세포 분화 촉진 방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (b) 단계에서 SIRT1 발현억제 물질은 분화유도 7 내지 21일 동안 처리하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 SIRT1 발현억제제는 서티놀(Sirtinol; 2-[(2-Hydroxynaphthalen-1-ylmethylene)amino]-N-(1-phenethyl)benzamide) 또는 EX527(6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-1H-Carbazole-1-carboxamide)일 수 있으며, SIRT1 발현 억제 물질은 배지에 5 ~ 500 μM 농도로 첨가할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 (b) 단계의 배지는 지방세포 분화 유도용 배지이며, 인슐린(insulin), 트리아이오딘티로닌(Triiodothyronine) 및 로시글리타존(rosiglitazone)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 SIRT1 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 지방세포의 분화 조절방법은 SIRT1 발현 억제제 처리 시기에 따라 지방세포의 분화 억제 또는 촉진을 조절할 수 있는 있으므로, 배아에서 SIRT1 발현 억제 시기에 따른 소아비만 등의 비만 연구모델로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, SIRT1 억제 물질을 선별하여 비만, 비만과 동반된 당뇨병, 그리고 대사질환의 억제제 또는 치료제 등으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 배아줄기세포에서 지방세포로 분화하기 위한 배양 프로토콜을 나타낸 모식도이다.
도 2는 SIRT1 발현 유무에 따른 배아줄기세포의 지방세포로의 분화 정도를 확인한 데이터이다 (A: Oil red O 염색을 통해 지방세포 내 형성된 지질방울 (lipid drop)을 관찰한 사진, B: 염색된 Oil red O 시료를 추출하여 흡광도를 측정한 데이터).
도 3은 배아줄기세포의 지방줄기세포로의 분화 유도시 SIRT1 발현 유무에 따른 PPAR, C/EBPα 및 FABP4의 mRNA 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 4는 SIRT1 발현 억제제 처리 시기에 따른 배아줄기세포의 지방세포 분화 정도를 확인한 데이터이다 (A: Oil red O 염색을 통해 지방세포 내 형성된 지질방울 (lipid drop)을 관찰한 사진, B: 염색된 Oil red O 시료를 추출하여 흡광도를 측정한 데이터).

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, SIRT1 유전자의 기능에 대해 다양한 연구가 이루어지고 있으며, SIRT1 발현이 증가하면 PPAR-γ의 발현이 억제되어 지방세포로 분화를 억제시킨다는 연구결과가 보고되었으나, 배아줄기세포에서 SIRT1의 발현 조절에 따른 지방세포로의 분화조절에 대한 연구는 이루어진바 없다.

본 발명은 SIRT1의 발현을 조절하여 배아줄기세포의 지방세포 분화 조절 방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 이를 통해, SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1)가 배아줄기세포의 지방세포로의 분화에 관여하며, 기존에 알려진 것과 달리, SIRT1 발현 억제 시기에 따라 지방세포로의 분화가 억제 또는 촉진되는 것을 확인하였으며, 상기 배아줄기세포의 지방세포 분화조절 방법을 통해 배아에서 SIRT1 발현 조절에 따른 소아비만 연구모델로 사용할 수 있는 효과가 있다.

따라서, 본 발명은 배아줄기세포에서 SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1) 발현을 억제시키는 단계를 포함하는 배아줄기세포의 지방세포 분화 조절방법을 포함하며, 구체적으로, 배아줄기세포를 배양하여 형성시킨 배상체(embryoid body)에 SIRT1 발현억제 물질을 처리하여 지방세포로의 분화를 억제하는 방법을 포함한다.

본 발명의 "줄기세포"는 각종 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있으며 자가증식 능력을 갖추고 있는 세포를 말하며, 초기 배아에서 분리한 배아 줄기세포(embryonic stem cell, ES 세포), 배아기의 원시생식세포에서 분리한 배아 생식세포(embryonic germ cell. EG 세포), 및 성체의 골수에서 분리한 다능성 성체줄기세포(multipotent adult progenitor cell, MAPC 세포)의 3종이 가장 잘 알려져 있다.

본 발명에서는 배아줄기세포로 마우스 유래 배아줄기세포를 사용하였으나, 이에 한정되지 않으며, 마우스 유래 배아 줄기세포의 구체적인 예로는, EB3 세포, E14 세포, D3 세포, CCE 세포, R1 세포, 129SV 세포 및 J1 세포 등을 들 수 있다. 또한, 배아 줄기세포, 배아 생식세포 및 다능성 성체줄기세포의 제조, 계대 및 보존에 대해서는 이미 확립되어 있는 표준적인 프로토콜(Matsui et al ., Cell , 70: 841, 1992; Shamblott et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 95: 13726, 1998; 미국특허 제 6,090,622호; Jiang et al ., Nature, 418: 41, 2002; 국제공개특허 01/11011)을 참조하여 이들 줄기세포를 용이하게 사용할 수 있으며, 이미 공지되어 있는 다양한 피더세포 및 배아줄기세포 배지를 사용하여 배양할 수 있다.

본 발명에서 이용 가능한 세포는 배아줄기세포로 한정되지 않으며, 포유동물의 배아나 배아 줄기세포와 유사한 형질을 가지는 줄기세포를 포함한다. 이 경우 용어, "배아 줄기세포와 유사한 형질"이란, 배아줄기세포에 특이적인 표면(항원) 마커가 존재하거나, 배아 줄기세포 특이적인 유전자를 발현하거나, 또는 테라토마(teratoma) 형성 기능을 가지거나, 또는 키메라 마우스 형성능이 있는 등의 배아 줄기세포에 특이적인 세포생물학적 성질로 정의할 수 있다.

상기 SIRT1 발현억제 물질은 배상체 배양 0 내지 5일 동안 처리할 수 있으며, SIRT1 발현억제 물질은 서티놀(Sirtinol; 2-[(2-Hydroxynaphthalen-1-ylmethylene)amino]-N-(1-phenethyl)benzamide) 또는 EX527(6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-1H-Carbazole-1-carboxamide)일 수 있다.

본 발명에서는 바람직하게 EX527을 사용하였으나, SIRT1 발현을 억제할 수 있는 공지된 SIRT1 발현 억제제를 제한 없이 사용할 수 있으며, SIRT1의 단백질 합성을 저해시키는 siRNA 등 SIRT1에 대한 특이적인 서열을 합성하여 사용할 수도 있다.

SIRT1 발현 억제 물질은 배지에 5 ~ 500 μM 농도로, 바람직하게는 10 ~ 100 μM 농도로 첨가될 수 있으며, 5 μM 이하의 농도로 첨가될 경우 지방세포로의 분화 억제 효과가 없을 수 있으며, 500 μM 이상의 농도로 첨가될 경우 세포 독성이 나타나거나 농도 증가로 인한 효능의 향상이 적어 효율이 떨어지는 문제점이 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 마우스 배아줄기세포인 R1 세포를 사용하였으며, SIRT1 단백질의 발현 유무에 따라 배아줄기세포의 지방세포로 분화가 영향을 미치는지 확인하기 위해, SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포(SIRT1 +/+; WT)인 대조군과 SIRT1 유전자가 결여된 마우스 배아줄기세포(SIRT1 -/-; KO)를 준비하였으며, SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포에 SIRT1 억제제인 EX527을 처리하여 SIRT1 억제에 따른 지방분화 정도를 확인하였다.

본 발명에서는 배아줄기세포를 배양하여 배상체(embryoid body)를 형성하기 위해 바람직하게는 현적배양(hanging-drop culture) 방법을 사용하였으며, 이에 한정되지 않고 당업계에 공지된 배상체(embryoid body) 형성 방법을 제한 없이 사용할 수 있다.

도 1은 배아줄기세포에서 지방세포로 분화하기 위한 배양 프로토콜을 나타낸 모식도로, 본 발명의 일실시예에서는 현적배양 방법으로 형성된 배상체에 레티노산(Retinoic acid)을 처리하여 배양한 다음, 인슐린(insulin), 트리아이오딘티로닌(Triiodothyronine) 및 로시글리타존(rosiglitazone)이 포함된 지방세포 분화용 배지에서 14일 동안 배양하여 지방세포의 분화를 유도하였다.

배아줄기세포의 지방세포로의 분화 유도는 상기에서 설명한 것처럼, SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포(SIRT1 +/+; WT) 그룹, SIRT1 유전자가 결여된 마우스 배아줄기세포(SIRT1 -/-; KO) 그룹 및 SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포에 SIRT1 억제제인 EX527를 처리한 그룹(EX 0-5)으로 나누어 지방세포로의 분화에 SIRT1가 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

도 2는 SIRT1 발현 유무에 따른 배아줄기세포의 지방세포로의 분화 정도를 확인한 것으로, 도 2A에 나타난 바와 같이, SIRT1 +/+ 세포는 배아줄기세포가 지방세포로 분화하여 세포 내 지질방울(lipid drop)가 많이 형성된 것을 확인한 반면, SIRT1 -/- 세포는 지방세포로의 분화가 거의 이루어지지 않은 것을 확인하였다. 또한, SIRT1 +/+ 세포에 SIRT1 억제제인 EX527를 처리한 경우, 부분적으로 지질방울이 관찰되었으나, SIRT1 +/+ 세포에 비해 현저하게 낮은 수준으로 지방세포의 분화가 이루어진 것을 확인하였다. 즉, SIRT1 발현 억제로 인해 지방세포로의 분화가 억제되는 것을 확인하였다.

도 2B는 세포의 지질방울에 염색된 Oil red O 시료를 추출하여 500 nm에서 흡광도를 측정한 데이터로, SIRT1 -/- 세포는 SIRT1 +/+ 세포에 비해 지방세포로의 분화가 약 40% 정도 감소된 것을 확인하였으며, SIRT1 억제제인 EX527를 처리한 경우 약 38% 정도 지방세포의 분화가 감소된 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, SIRT1 발현 억제에 의해 배아줄기세포 내 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptors-γ), C/EBP α(CCAAT/enhancer-binding protein-α) 및 FABP4(fatty acid binding protein 4)의 mRNA 발현이 억제될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, SIRT1의 지방분화 촉진 기전을 조사하기 위하여, 지방세포 내 PPAR γ, C/EBP α 및 FABP4의 mRNA 발현량을 PCR 방법으로 측정하였였으며, 도 3은 배아줄기세포의 지방줄기세포로의 분화 유도시 SIRT1 발현 유무에 따른 PPAR, C/EBPα 및 FABP4의 mRNA 발현정도를 확인한 데이터로, SIRT1 +/+ 세포에서는 지방세포로의 분화 유도 후, PPAR γ, C/EBP α 및 FABP4의 mRNA 발현이 증가한 것을 확인한 반면, SIRT1 -/- 세포 및 SIRT1 억제제인 EX527를 처리한 경우 PPAR γ, C/EBP α 및 FABP4의 mRNA 발현 현저히 감소하는 것을 확인하였다.

즉, SIRT1가 PPAR-γ의 발현을 억제하여 지방세포로 분화를 억제시킨다는 기존의 연구결과(Frederic Picard et al ., Nature , 429:771, 2004)와는 달리, 배아줄기세포로부터 형성시킨 배상체 배양 초기에는 SIRT1 발현 억제에 의해 PPAR γ mRNA 발현이 감소하는 것을 확인하였다.

본 발명의 배아줄기세포의 지방세포 분화 조절방법은 또한, (a) 배아줄기세포를 배양하여 배상체(embryoid body)를 형성시키는 단계; 및

(b) SIRT1 발현조절 물질이 포함된 배지에서 상기 배상체를 배양하여 지방세포로 분화를 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포로부터 지방세포로의 분화 촉진 방법을 포함하며, 상기 (b) 단계에서 SIRT1 발현조절 물질은 SIRT1 발현억제이며, 분화유도 7 내지 21일 동안 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, SIRT1 발현 억제 시기에 따른 지방세포의 분화에 미치는 영향을 확인한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 분화 초반에만 SIRT1 억제제를 처리한 그룹은 억제제를 처리한 그룹에 비해 지방세포로의 분화가 감소하는 것을 확인한 반면, 분화 전체 시기 동안 SIRT1 억제제를 처리한 그룹은 억제제를 처리하지 않은 그룹과 별반 차이가 없었고 분화 후반인 7-21일 동안 억제제를 처리한 그룹은 억제제를 처리하지 않은 그룹보다 지방세포로의 분화가 더 진행되는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 본 발명의 배아줄기세포의 지방세로 분화 조절방법은 SIRT1 발현 억제 시기에 따라 지방세포의 분화 억제 또는 촉진을 유도할 수 있는 것을 확인하였으며, 배아줄기세포로부터 형성된 배상체 배양 초기에 SIRT1 발현을 억제시키면 기존에 알려진 것과 달리 SIRT1 억제에 의해 지방세포로의 분화가 억제되는 것을 확인하였으며, 배상체의 지방세포로 분화유도 7 내지 21일 동안에 SIRT1 발현을 억제하면 상기 결과와는 달리 지방세포로의 분화가 촉진되는 것을 확인하였다.

따라서, 기존 연구결과와 상이한 본 발명의 SIRT1 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 지방세포의 분화 조절방법은 SIRT1 발현 억제제 처리 시기에 따라 지방세포의 분화 억제 또는 촉진을 조절할 수 있는 있으므로, 배아에서 SIRT1 발현 억제 시기에 따른 소아비만 등의 비만 연구모델로 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 배아줄기세포로부터 지방세포로로의 분화를 촉진하기 위해, 상기 (b) 단계에서 SIRT1 억제 물질 대신에 SIRT1 발현 유도 물질을 분화유도 0 내지 5일 동안 처리할 수 있으며, 상기 SIRT1 발현 유도 물질은 인터페론 베타-1a(interferon beta-1a), 인터페론 베타-1b(interferon beta-1b), cGMP(cyclic guanosine monophosphate), 아디포넥틴(adiponectin), 피루베이트(pyruvate), 2-데옥시글루코오스(2-deoxyglucose) 및 레스베라트롤(resveratrol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, SIRT1 발현을 촉진 또는 유도할 수 있는 것으로 당업계에 알려진 물질을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 지방세포 분화 촉진 방법으로 제조된 지방세포 및 상기 지방세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물을 포함한다.

본 발명의 배아줄기세포에서 유도된 지방세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물은 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해 제제화할 수 있고, 구조체 자체 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합하여 통상의 약학적 제제, 예를 들면 액제, 연고, 에멀젼, 겔, 크림제, 페이스트제 등의 다양한 제형으로 제제화할 수 있다. 본 발명 조직 재생용 치료제의 투여량에 특별한 제한은 없으나, 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병이나 상태의 정도, 약물형태 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 치료제는 통상 1일 상처당 25 내지 100μM, 바람직하게는 45 내지 65μM으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 내지 수회 나누어 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

마우스 배아줄기세포 분비 및 배양

본 발명에서는 마우스 배아줄기세포인 R1 세포를 ATCC (American Type Culture Collection; ATCC SCRC-1011)로부터 구입하여 사용하였으며, SIRT1 단백질의 발현 유무에 따라 배아줄기세포의 지방세포로 분화가 영향을 미치는지 확인하기 위해, SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포(SIRT1 +/+; WT)인 대조군과 SIRT1 유전자가 결여된 마우스 배아줄기세포(SIRT1 -/-; KO)를 준비하였다 (Han　MK et al., Cell　Stem　Cell.,　Mar 6;2(3):241, 2008).

마우스배아줄기세포는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에 2 mM GlutaMAX™(Gibco, 미국), 비필수 아미노산(1X Non-essential amino acid, 1X NEAA; Gibco, 미국), 0.1 mM 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol; Invitrogen, 미국) 및 10³unit/㎖ 백혈병억제인자(Leukemia Inhibitory Factor, LIF; Milipore, 미국)를 넣어 배양하였다.

마우스 배아줄기세포의 지방세포로의 분화 유도

본 발명에서는 SIRT1 단백질의 발현 유무에 따라 배아줄기세포의 지방세포로 분화가 영향을 미치는지 확인하기 위해, 실시예 1에서 준비한 SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포(SIRT1 +/+; WT) 및 SIRT1 유전자가 결여된 마우스 배아줄기세포(SIRT1 -/-; KO)의 지방세포로의 분화정도를 확인하였으며, SIRT1 +/+ 배아줄기세포에 SIRT1 억제제인 EX527(10μM, Tocris, 영국)을 처리하였을 때, SITRT1 억제에 따른 지방분화 정도를 확인하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이 배아줄기세포에서 지방세포로 분화하기 위한 배양 프로토콜에 따라 실험을 수행하였으며, 먼저 현적배양(hanging-drop culture) 방법을 사용하여 배상체(embryoid body)를 형성한 후, 레티노산(Retinoic acid)을 처리하여 3일 동안 처리하였으며, 지방세포로의 분화를 유도하기 위한 배지에서 14일 동안 배양하였다. 상기 현적배양은 1000개의 배아줄기세포를 20 ㎕에 넣어 하나의 배상체를 만들었으며, 지방세포로 유도하는 과정은 6-웰 플레이트(6-well plate)를 사용하여 각 웰에 15개의 배양체를 접종하여 배양하였다.

상기 지방세포분화를 위한 배지는 DMEM 배지에 85nM 인슐린(insulin; sigma, 미국), 2nM 트리아이오딘티로닌(Triiodothyronine; sigma, 미국) 및 2μM로시글리타존(rosiglitazone; sigma, 미국)을 첨가하여 배상체(embryoid body)를 배양하였으며, 배기교환은 매일 수행하였다.

또한, SIRT1 억제제 EX527는 지방세포로의 분화 초반인 5일까지 SIRT1 +/+ 배아줄기세포에 첨가하여 배양하였다.

Oil Red O 염색법을 통한 배아줄기세포의 지방세로포의 분화 확인

실시예 2에서 21일 동안 분화시킨 마우스 배아줄기 세포는 지방세포로의 분화가 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여 Oil Red O 염색을 수행하였다.

먼저, SIRT1 +/+ 세포와 SIRT1 -/- 세포, 그리고 SIRT1 +/+ 세포에 SIRT1 억제제를 처리하여 분화시킨 세포에 10% 포름알데하이드(formaldehyde)를 처리하여 세포를 고정시킨 다음, 포름알데하이드를 인산완충식염수로 3번 씻어낸 후, 60% 이소프로판올(isopropanol)을 처리하였다. 그 후, Oil Red O 염색액을 2 ㎖씩 넣고 상온에서 어두운 상태로 30분간 염색한 후 인산완충식염수로 3번 세척하였다.

염색이 된 세포는 현미경으로 관찰하였으며, 분화된 지방세포 내에 존재하는 지질방울(lipid drop)에 Oil Red O가 염색되어 염색 후 현미경을 이용하여 관찰하면 붉은색으로 염색된 지방세포를 확인할 수 있다.

관찰이 완료되면, 웰당 1 ㎖의 이소프로판올로 지방세포 내 염색된 염색약을 추출하여 ELISA reader로 500 ㎚에서 광학밀도값(OD값; optical density)을 측정하였다. 상기 Oil Red O 염색액은 Oil Red O 염색약(sigma, 미국) 500 ㎎을 이소프로판올 100 ㎖에 녹인 용액을 증류수와 6:4의 비율로 섞은 후 0.45 ㎛ 필터(filter)로 여과한 용액이다.

그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, SIRT1 +/+ 세포는 배아줄기세포가 지방세포로 분화하여 세포 내 지질방울(lipid drop)가 많이 형성된 것을 확인한 반면, SIRT1 -/- 세포는 지방세포로의 분화가 거의 이루어지지 않은 것을 확인하였다. 또한, SIRT1 +/+ 세포에 SIRT1 억제제인 EX527를 처리한 경우, 부분적으로 지질방울이 관찰되었으나, SIRT1 +/+ 세포에 비해 현저하게 낮은 수준으로 지방세포의 분화유도가 이루어진 것을 확인하였다.

SIRT1 에 의한 지방세포로의 분화 조절 기전 확인

본 발명에서는 SIRT1에 의한 배아줄기세포의 지방세포로의 분화 조절 기전 확인하기 위해, 지방세포로 분화시키는 단계에서 지방세포 내 PPAR γ (peroxisome proliferator-activated receptors-γ), C/ EBP α (CCAAT/enhancer-binding protein-α), FABP4 (fatty acid binding protein 4)의 mRNA 발현량을 PCR 방법으로 측정하였다. PCR 수행에 사용한 각 프라이머는 하기 표 1과 같으며, 바이오니아(한국)에 의뢰하여 제조하였다. GAPDH는 PCR의 신뢰성을 위한 대조군으로 사용하였다.

프라이머 염기서열

프라이머		염기서열(5' ->3')		Tm(℃)
PPAR γ	Forward	TGTGAGACCAACAGCCTGAC	서열번호 1	60
PPAR γ	Reverse	AGCTGATTCCGAAGTTGGTG	서열번호 2	60
C/ EBP α	Forward	TGGACAAGAACAGCAACGAG	서열번호 3	60
C/ EBP α	Reverse	AAACCATCCTCTGGGTCTCC	서열번호 4	60
FABP4	Forward	AATGTGTGATGCCTTTGTGG	서열번호 5	60
FABP4	Reverse	TCGACTTTCCATCCCACTTC	서열번호 6	60
GAPDH	Forward	AGGTCGGTGTGAACGGATTTG	서열번호 7	60
GAPDH	Reverse	GGGGTCGTTGATGGCAACA	서열번호 8	60

실시예 2와 동일한 방법으로 배아줄기세포에서 지방세포로의 분화를 유도하였으며, 지방분화 유도 7일 및 10일에 각 세포를 수득(harvest)한 다음, TRIzol reagent(제조사)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 cDNA 합성키트(roche, 독일)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 표 1의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

그 결과, SIRT1 +/+ 세포에서는 지방세포로의 분화 유도 후, PPAR γ, C/EBP α 및 FABP4의 mRNA 발현이 증가한 것을 확인한 반면, SIRT1 -/- 세포 및 SIRT1 억제제인 EX527를 처리한 경우 PPAR γ, C/EBP α 및 FABP4의 mRNA 발현 현저히 감소하는 것을 확인하였다.

즉, SIRT1의 발현을 억제하면 배아줄기세포에서 지방세포로의 분화 시, 세포내 PPAR γ, C/EBP α 및 FABP4의 mRNA 발현이 감소되어 지방세포로의 분화가 감소되는 것을 확인하였으며, 이는 SIRT1의 발현을 증가시키면, 배아줄기세포의 지방세포로의 분화가 촉진된다는 것을 의미한다.

SIRT1 발현 억제 시기에 따른 지방세포로의 분화 정도 확인

본 발명에서는 SIRT1 발현 억제 시기에 따른 배아줄기세포에서 지방세포로의 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해, SIRT1 억제제인 EX527 (10 μM)을 시기에 따라 처리하였다.

상기 실시예 2의 방법과 동일한 방법으로 배아줄기세포에서 지방세포로 분화를 유도하였으며, SIRT1 억제제는 분화 초반인 0 ~ 5일 동안 처리한 그룹, 분화 후반인 7 ~ 21일 동안 처리한 그룹 및 분화 전체 시기인 0 ~ 21일 동안 처리한 그룹으로 나누어 처리하였다. 그 후에 실시예 3과 동일한 방법으로 Oil Red O 염색을 수행하여 지방세포로의 분화 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 분화 초반에만 SIRT1 억제제를 처리한 그룹은 억제제를 처리하지 않은 그룹에 비해 지방세포로의 분화가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 분화 전체 시기 동안 SIRT1 억제제를 처리한 그룹은 억제제를 처리하지 않은 그룹과 별반 차이가 없었고 분화 후반인 7-21일 동안 억제제를 처리한 그룹은 억제제를 처리하지 않은 그룹보다 지방세포로의 분화가 더 진행되는것을 확인하였다.

이는 SIRT1 발현 억제 시기에 따라 지방세포의 분화 억제 또는 촉진을 유도할 수 있는 것을 확인하였으며, 배아줄기세포로부터 형성된 배상체 배양 초기에 SIRT1 발현을 억제시키면 기존에 알려진 것과 달리 SIRT1 억제에 의해 지방세포로의 분화가 억제되는 것을 확인하였으며, 배상체의 지방세포로 분화유도 7 내지 21일 동안에 SIRT1 발현을 억제하면 지방세포로의 분화가 촉진되는 것을 확인하였다.

<110> CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Methods for Regulating Differentiation of Adipose Stem Cells from Embryonic Stem Cells Through modulation of SIRT1 expression <130> 1040829 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma forward primer <400> 1 tgtgagacca acagcctgac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma reverse primer <400> 2 agctgattcc gaagttggtg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBP alpha forward primer <400> 3 tggacaagaa cagcaacgag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBP alpha reverse primer <400> 4 aaaccatcct ctgggtctcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FABP4 forward primer <400> 5 aatgtgtgat gcctttgtgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FABP4 reverse primer <400> 6 tcgactttcc atcccacttc 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 7 aggtcggtgt gaacggattt g 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 8 ggggtcgttg atggcaaca 19

Claims

(a) 배아줄기세포를 배양하여 배상체(embryoid body)를 형성시키는 단계;
(b) 배아줄기세포의 SIRT1 발현억제제를 배상체 배양 초기인 0 내지 5일 동안 처리하는 단계; 를 포함하는 배아줄기세포의 지방세포 분화 억제 방법.
제1항에 있어서, 배아줄기세포를 배양하여 형성시킨 배상체에 SIRT1 발현억제제를 처리하여 지방세포로의 분화를 억제시키는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 지방세포 분화 억제 방법.
삭제
제2항에 있어서, 상기 SIRT1 발현억제제는 서티놀(Sirtinol; 2-[(2-Hydroxynaphthalen-1-ylmethylene)amino]-N-(1-phenethyl)benzamide) 또는 EX527(6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-1H-Carbazole-1-carboxamide)인 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 지방세포 분화 억제 방법.
제1항에 있어서, 상기 SIRT1 발현억제로 인해 배아줄기세포의 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptors-γ), C/EBP α(CCAAT/enhancer-binding protein-α) 및 FABP4(fatty acid binding protein 4)의 mRNA 발현량이 감소하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 지방세포 분화 억제 방법.
(a) 배아줄기세포를 배양하여 배상체(embryoid body)를 형성시키는 단계; 및
(b) SIRT1 발현 억제제가 포함된 배지에서 상기 배상체를 7 내지 21일 동안 배양하여 지방세포로 분화를 유도하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 지방세포 분화 촉진 방법.
삭제
제6항에 있어서, 상기 SIRT1 발현억제제는 서티놀(Sirtinol; 2-[(2-Hydroxynaphthalen-1-ylmethylene)amino]-N-(1-phenethyl)benzamide) 또는 EX527(6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-1H-Carbazole-1-carboxamide)인 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 지방세포 분화 촉진 방법.
제6항에 있어서, 상기 (b) 단계의 배지는 지방세포 분화 유도용 배지이며, 인슐린(insulin), 트리아이오딘티로닌(Triiodothyronine) 및 로시글리타존(rosiglitazone)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 지방세포 분화 촉진 방법.