TWI438275B - 促進幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法 - Google Patents

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Description

促進幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法
本案係關於一種促進人類幹細胞分化的方法，尤指一種促進人類間葉幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法。
對於第一型糖尿病的病患而言，胰島的移植是一種極具潛力的療法，但是這種療法一直以來卻由於可移植之胰島細胞的短缺而受到限制。這種器官或組織移植的另一個選擇則是移植具有再生能力的胰島素製造細胞(insulin-producing cells,IPCs)，而幹細胞具有增殖並分化成各種細胞的潛力，因此可以作為移植之用，來治療第一型糖尿病。
在人體中，胰島是生產胰島素的主要來源，而胰島細胞與神經元細胞具有部分的相同特徵，在一些無脊椎動物的物種中，例如果蠅，腦神經元細胞甚至是其胰島素的主要生產來源；因此，諸如此類的研究讓人聯想到可分化為神經元的細胞可能也可分化為胰島細胞。多元性間葉幹細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可分離自骨髓或臍帶血並經由培養而增殖，進而可分化成各種間葉細胞，例如軟骨、硬骨以及脂肪組織；在適當的實驗條件下，例如提供生長因子、神經營養因子或一些化學物質如維化命A酸 (retinoic acid)或3-異丁基-1甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)時，其可展現神經元細胞的特性。應用上述研究的發現，目前雖然已有使胚胎幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法，但是這些分化方法的效率仍不甚理想，目前亦不清楚這些方法是否也可使間葉幹細胞分化為胰島素製造細胞，或者是否仍需要上述之外的其他條件才可使間葉幹細胞分化為胰島素製造細胞。
綜上所述，既然胚胎幹細胞的取得不易，並仍存有許多道德上的爭議，且更有研究發現胚胎幹細胞所分化出的胰島素製造細胞在移植後可能會導致畸胎瘤，故業界亟需一種促進人類間葉幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法，以提供另一種移植用胰島細胞的來源，而使第一型糖尿病的病患可得到更有效的治療。
爰是之故，申請人有鑑於習知技術之缺失，發明出本案「促進幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法」，用以改善上述習用手段之不足。
本案之主要目的係提供一種促進幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法，用以提供較容易取得且充足的移植用胰島的來源，並提高分化的效率，進而使第一型糖尿病的病患可得到更有效的治療。
根據本發明之構想，本案係提供一種促進幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法，該方法的步驟依序包含將該幹細胞懸浮於一第一培養基中，聚集(aggregate)該幹細胞以形成一細胞團塊(pellet)，以及於一第二培養基中培養該細胞團塊(pellet)，使該幹細胞分化為該胰島素製造細胞。
如所述之方法，其中該幹細胞選自胚胎幹細胞、成體幹細胞及其組合其中之一。
如所述之方法，其中該胚胎幹細胞包含胚胎生殖細胞以及經轉化的胚胎幹細胞。
如所述之方法，其中該成體幹細胞包含間葉幹細胞、造血幹細胞以及神經幹細胞。
如所述之方法，其中該幹細胞包含2.5×105個細胞。
如所述之方法，其中該第一培養基為一完全培養基，該完全培養基包含低葡萄糖DMEM、10%胎牛血清、100U/mL盤尼西林以及10μg/mL鏈黴素。
如所述之方法，其中該聚集步驟係將該幹細胞以200-600g離心5-15分鐘而形成該細胞團塊(pellet)。。
如所述之方法，其中於該培養步驟前更包含一預培養步驟，用以預培養該細胞團塊(pellet)於該第一培養基中一晚。
如所述之方法，其中該第二培養基包含纖維結合蛋白、層粘蛋白及其組合之其中之一。
如所述之方法，其中該培養步驟包含於第一期培養兩天，於第二期培養一天，於第三期培養四天，以及於第四期培養三天。
如所述之方法，其中，於該第一期時，該第二培養基為一完全培養基；於該第二期時，該第二培養基為一第一DMEM/F-12培養基，其內含25mM葡萄糖、ITS-A以及0.45mM的IBMX；於該第三期時，該第二培養基為一第二DMEM/F-12培養基，其內含5.56mM葡萄糖、10mM菸鹼胺、N2補充以及B27補充；以及於該第四期時，該第二培養基為一第三DMEM/F-12培養基，其內含25mM葡萄糖、10mM菸鹼胺、N2補充以及B27補充。
如所述之方法，其中該胰島素製造細胞係受到葡萄糖的誘導而釋放胰島素。
如所述之方法，其中該葡萄糖濃度為5-25mM。
如所述之方法，其中該胰島素製造細胞之胰島素的釋放可被cAMP磷酸二酯酶的抑制劑影響而增強。
如所述之方法，其中該胰島素製造細胞之胰島素的釋放可被鈣離子通道的阻斷劑影響而抑制。
根據本發明之構想，本案另提供一種分化自幹細胞的胰島素製造細胞，該幹細胞係於聚集(aggregate)成一細胞團塊(pellet)後，經培養而分化為該胰島素製造細胞。
如所述之胰島素製造細胞，其中該幹細胞選自胚 胎幹細胞、成體幹細胞及其組合其中之一。
如所述之胰島素製造細胞，其中該胚胎幹細胞包含胚胎生殖細胞以及經轉化的胚胎幹細胞。
如所述之胰島素製造細胞，其中該成體幹細胞包含間葉幹細胞、造血幹細胞以及神經幹細胞。
如所述之胰島素製造細胞，其分化自該幹細胞的過程可受纖維結合蛋白、層粘蛋白及其組合之其中之一的誘導而促進分化。
如所述之胰島素製造細胞，其係受到葡萄糖的誘導而釋放胰島素。
如所述之胰島素製造細胞，其中該葡萄糖濃度為5-25mM。
如所述之胰島素製造細胞，其胰島素的釋放可被cAMP磷酸二酯酶的抑制劑影響而增強。
如所述之胰島素製造細胞，其胰島素的釋放可被鈣離子通道的阻斷劑影響而抑制。
以下針對本案之促進幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法的較佳實施例及實驗結果進行描述，請參考附圖，但實際之配置及所採行的方法並不必須完全符合所描述的內容，熟習本技藝者當能在不脫離本案之實際精神及範圍的情況下，做出種種變化及修改。
於下列促進間葉幹細胞分化為胰島素製造細胞 的方法中，培養的環境均為37℃含5%二氧化碳的培養箱，各實施例及實驗對照組所使用的培養基主要有兩種，一種為完整培養基(complete culture medium,CCM)，其成分為：低葡萄糖DMEM(EMEM-LG)添加10%胎牛血清(FBS)、100U/mL盤尼西林(penicillin)以及10μg/mL鏈黴素(streptomycin)；另一種為DMEM/F-12培養基。根據所培養的天數以及所使用的培養基與其他額外添加物成分的不同，各實施例及對照組的培養時期大致上可分為五期(第零期至第四期)，分述如下：
實施例一：細胞團塊懸浮(pellet suspension)培養
第零期：將2.5×105個未分化的間葉幹細胞以CCM懸浮後置於15mL的圓錐形離心管，以200-600g離心5-15分鐘，培養一晚(overnight)。
第一期：將培養基替換成CCM外加5μg/mL纖維結合蛋白(fibronectin)，培養兩天。
第二期：將細胞移至1：1混合的DMEM/F-12培養基，其內含25mM葡萄糖、胰島素-運鐵蛋白-硒-A(ITS-A)、0.45mM IBMX以及5μg/mL纖維結合蛋白，培養一天。
第三期：將細胞移至DMEM/F-12培養基，其內含5.56mM葡萄糖、10mM菸鹼胺(nicotinamide)、N2補充、B27補充以及5μg/mL纖維結合蛋白，培養四天。
第四期：將細胞移至與實施例一的第三期成份相同的培養基，但其中所含的葡萄糖濃度為25mM，培養三天。
實施例二：細胞團塊懸浮(pellet suspension)培養
第零期：將2.5×105個未分化的間葉幹細胞以CCM懸浮後置於15mL的圓錐形離心管，並以200-600g離心5-15分鐘，培養一晚。
第一期：替換新的CCM，培養兩天。
第二期：將細胞移至1：1混合的DMEM/F-12培養基，其內含25mM葡萄糖、ITS-A以及0.45mM IBMX，培養一天。
第三期：將細胞移至DMEM/F-12培養基，其內含5.56mM葡萄糖、10mM菸鹼胺、N2補充以及B27補充，培養四天。
第四期：將細胞移至與實施例二的第三期成份相同的培養基，但其中所含的葡萄糖濃度為25mM，培養三天。
實施例三：細胞團塊懸浮(pellet suspension)培養
第零期：將2.5×105個未分化的間葉幹細胞以CCM懸浮後置於15mL的圓錐形離心管，並以200-600g離心5-15分鐘，培養一晚。
第一期：將培養基替換成CCM外加5μg/mL層粘蛋白(Laminin)，培養兩天。
第二期：將細胞移至1：1混合的DMEM/F-12培 養基，其內含25mM葡萄糖、ITS-A、0.45mM IBMX以及5μg/mL層粘蛋白，培養一天。
第三期：將細胞移至DMEM/F-12培養基，其內含5.56mM葡萄糖、10mM菸鹼胺、N2補充、B27補充以及5μg/mL層粘蛋白，培養四天。
第四期：將細胞移至與實施例三的第三期成份相同的培養基，但其中所含的葡萄糖濃度為25mM，培養三天。
實施例四：細胞團塊懸浮(pellet suspension)培養
第零期：將2.5×105個未分化的間葉幹細胞以CCM懸浮後置於15mL的圓錐形離心管，並以200-600g離心5-15分鐘，培養一晚。
第一期：將培養基替換成CCM外加5μg/mL層粘蛋白以及5μg/mL纖維結合蛋白，培養兩天。
第二期：將細胞移至1：1混合的DMEM/F-12培養基，其內含25mM葡萄糖、ITS-A、0.45mM IBMX、5μg/mL層粘蛋白以及5μg/mL纖維結合蛋白，培養一天。
第三期：將細胞移至DMEM/F-12培養基，其內含5.56mM葡萄糖、10mM菸鹼胺、N2補充、B27補充、5μg/mL層粘蛋白以及5μg/mL纖維結合蛋白，培養四天。
第四期：將細胞移至與實施例四的第三期成份相同的培養基，但其中所含的葡萄糖濃度為25mM， 培養三天。
對照組一：細胞單層(monolayer)培養
第零期：將未分化的間葉幹細胞散布於培養皿中，以CCM進行單層的培養，培養一晚。
第一期：將培養基替換成CCM外加5μg/mL纖維結合蛋白(fibronectin)，培養兩天。
第二期：將細胞移至1：1混合的DMEM/F-12培養基，其內含25mM葡萄糖、ITS-A、0.45mM IBMX以及5μg/mL纖維結合蛋白，培養一天。
第三期：將細胞移至DMEM/F-12培養基，其內含5.56mM葡萄糖、10mM菸鹼胺、N2補充、B27補充以及5μg/mL纖維結合蛋白，培養四天。
第四期：將細胞移至與對照組一的第三期成份相同的培養基，但其中所含的葡萄糖濃度為25mM，培養三天。
對照組二：細胞單層(monolayer)培養
第零期：將未分化的間葉幹細胞散布於培養皿中，以CCM進行單層的培養，培養一晚。
第一期：替換新的CCM，培養兩天。
第二期：將細胞移至1：1混合的DMEM/F-12培養基，其內含25mM葡萄糖、ITS-A以及0.45mM IBMX，培養一天。
第三期：將細胞移至DMEM/F-12培養基，其內含5.56mM葡萄糖、10mM菸鹼胺、N2補充以及 B27補充，培養四天。
第四期：將細胞移至與對照組二的第三期成份相同的培養基，但其中所含的葡萄糖濃度為25mM，培養三天。
實驗結果
比較上述本案各實施例及對照組的培養條件可知，本案各實施例均以細胞團塊(pellet)懸浮方式進行培養，對照組則均以細胞單層方式進行培養。各實施例之間的差別僅在於第一期至第四期的培養基中有無添加纖維結合蛋白及/或層粘蛋白；其中實施例一添加纖維結合蛋白，實施例二無任何添加，實施例三添加層粘蛋白，實施例四則同時添加纖維結合蛋白及層粘蛋白。兩對照組之間的差別亦僅在於第一期至第四期的培養基中有無添加纖維結合蛋白；即對照組一有添加纖維結合蛋白，而對照組二沒有添加纖維結合蛋白。
對照組二所採用的培養程序即為先前技術中用以促進胚胎幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法。首先，為了確定先前技術的方法是否也可促進間葉幹細胞分化為胰島素製造細胞，將對照組二中各期的細胞收集後，利用免疫螢光染色法針對各期細胞中的各種蛋白質進行染色，包括胰島素蛋白、與細胞分裂有關之蛋白(如Ki67)以及與神經前驅細胞有關之神經標識(neural marker)，如Nestin和β-tubulin III等； 之後觀察染色後的細胞並計數所有細胞中表現為陽性(即有被染色的細胞)的細胞比例，進而決定各期細胞中的各種蛋白質的表現量，各期細胞的各種標識表現量之定量結果列於表1。
由表1結果可知，先前技術中用以促進胚胎幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法並無法促使間葉幹細胞分化為胰島素製造細胞。
由於胰島細胞為聚集的細胞，且其細胞間基質(extracellular matrix,ECM)包括纖維結合蛋白和層粘蛋白，故本案採用細胞團塊(pellet)懸浮培養的方式，並另外添加纖維結合蛋白或層粘蛋白以促進間葉幹細胞分化為胰島素製造細胞，再以反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)配合瓊膠電泳照相，並以β-Actin的表現量進行標準化，進而測定本案實施例與對照組的胰島素與第二亞型葡萄糖運送蛋白(glucose transporter 2,Glut2)的訊息核糖核酸(mRNA)之相 對表現量；測定結果請參閱第1圖，而RT-PCR所使用的引子序列則列於下表2。
由第1圖的結果可知，以傳統的細胞單層培養方式，無論是否有添加纖維結合蛋白，即在對照組一和對照組二中均未偵測到胰島素基因的表現。另一方面，在本案實施例二中，即以細胞團塊(pellet)懸浮培養但未添加纖維結合蛋白的方式，可偵測到些許的胰島素基因表現；而在本案實施例一中，以細胞團塊(pellet)懸浮培養並外加纖維結合蛋白的方式，則可測得大量的胰島素基因表現。另外，在對照組二中並無測得葡萄糖運送蛋白的表現，在對照組一以及實施例二中可測得些許的葡萄糖運送蛋白之表現，而在實施例一中則可測得大量的葡萄糖運送蛋白之表現。
此外，本案更利用雙硫腙(dithizone,DTZ)染 色法進一步評估本案實施例之間葉幹細胞的分化情況；雙硫腙可偵測鋅離子的存在，而鋅離子在細胞中會與六個分子的胰島素結合。經由雙硫腙染色後可發現，本案對照組一以及對照組二的間葉幹細胞並未被雙硫腙染色，實施例二具有些許的染色，而實施例一則明顯地被染色(圖未示)。因此，由上述結果可推知，本案以細胞團塊(pellet)懸浮培養的方法確實可促使間葉幹細胞分化為胰島素製造細胞，若於培養時再添加纖維結合蛋白，則可進一步使間葉幹細胞分化為胰島素製造細胞的情況更為明顯。
以實施例二為例，為了確認於本案實施例二中開始表現胰島素的時間，其利用RT-PCR配合瓊膠電泳照相進行測定，並以β-Actin的表現量進行標準化，結果請參閱第2A圖；如第2A圖所示，胰島素基因與葡萄糖運送蛋白基因係於第三期與第四期時表現。另外，利用免疫組織化學染色將細胞染色並觀察染色後的細胞，計數所有細胞中表現為陽性的細胞比例，而測得本案實施例二中各時期細胞的各種標識、前胰島素(proinsulin)以及胰島素之蛋白質表現及細胞分化的情況，其結果請參閱第2B及2C圖；其中，與細胞分裂有關之Ki67蛋白及與神經前驅細胞有關之Nestin蛋白主要於第一期與第二期表現，而前胰島素以及胰島素蛋白則主要在第四期表現，第三期之前則沒有表現。
由於胰島素是用來降低血糖的激素，而一般的胰島細胞會受到葡萄糖的刺激而釋放胰島素，為了確認本案實施例二中之胰島素製造細胞所釋放出的胰島素量，而利用酵素免疫分析法(ELISA)進行定量。
首先，將第四期的細胞以磷酸緩衝液(PBS)以及Krebs-Ringer碳酸氫(KRB)緩衝液沖洗兩次，並以含有5mM葡萄糖的KRB緩衝液預培養一個小時，之後再分別以含有5mM、10mM、15mM或20mM葡萄糖之新鮮配製的KRB緩衝液培養一個小時，而後再以ELISA進行培養液中胰島素的定量。以未分化的細胞作為對照組，本案胰島素製造細胞所釋放出的胰島素量之定量結果請參閱第3A圖；其中圖中的星號表示與5mM濃度葡萄糖濃度相比時，student’s t test的p值小於0.05，而圖中的井號表示於10mM濃度葡萄糖濃度相比時，student’st test的p值小於0.05。如第3A圖所示，當葡萄糖濃度為10mM時，其所釋放出的胰島素量最高，每2.5×105個胰島素製造細胞每小時釋放達1.1ng的胰島素量，高於先前研究中以嚙齒動物骨髓幹細胞所分化出胰島素製造細胞可釋出的胰島素量。
另外，為了確認利用本發明之方法所分化出的胰島素製造細胞是否會利用生理的訊息傳遞路徑以調節胰島素的釋放，於上述分別以含有5mM、10mM、15mM或20mM葡萄糖之新鮮配製的KRB緩衝液培 養一個小時的步驟中，另外分別加入100μM的IBMX或50μM的硝苯地平(nifedipine)進行測試；其中IBMX是cAMP磷酸二酯酶的抑制劑，而硝苯地平則是L型鈣離子通道的阻斷劑。如第3B圖所示，在較低(5mM)的葡萄糖濃度時，IBMX會刺激胰島素的釋放，相反地，在較高(10mM)葡萄糖濃度時，硝苯地平則會抑制胰島素的釋放；其中圖中的星號表示其兩兩相比時，student’s t test的p值小於0.05。由此可知，利用本發明之方法所分化出的胰島素製造細胞確實會利用生理的訊息傳遞路徑以調節胰島素的釋放。
此外，為了進一步比較在細胞團塊(pellet)懸浮培養時，不同的細胞間基質對於幹細胞分化為胰島素製造細胞的影響，本案更於細胞團塊(pellet)懸浮培養時添加不同的細胞間基質，即纖維結合蛋白、層粘蛋白及其組合，以進行測試。
首先，收集培養至第四期的細胞，再同樣以RT-PCR配合瓊膠電泳照相，並以GAPDH的表現量進行標準化，進而測定本案各實施例之間的胰島素與第二亞型葡萄糖運送蛋白(Glut2)的mRNA相對表現量；測定結果請參閱第4A及4B圖。由第4A與4B圖的結果可知，相較於未添加細胞間基質而僅進行細胞團塊(pellet)懸浮培養的方法，無論添加何種細胞間基質，均可大幅增加胰島素與第二亞型葡萄糖運 送蛋白之基因表現；此外，在本案實施例三和實施例四中，即以細胞團塊(pellet)懸浮培養並外加層粘蛋白的方式，其增加胰島素與第二亞型葡萄糖運送蛋白之基因表現的效果顯然優於僅添加纖維結合蛋白的實施例二，其中實施例三(僅添加層粘蛋白)的表現量又明顯高於實施例四(同時添加纖維結合蛋白及層粘蛋白)。
過去在培養間葉幹細胞時，其特性是會附著並散布在塑膠培養皿上；然而，相較於間葉幹細胞，胚胎幹細胞特性則與胰島細胞較為相似，其均為懸浮的細胞，且於培養時會自動聚集(aggregate)而形成團塊(pellet)。由於間葉幹細胞與胚胎幹細胞於培養時所表現的特性不同，先前技術中用於使胚胎幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法並不適用於間葉幹細胞上。
綜上所述，本案之幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法提供了不同於先前技術的培養方式，將間葉幹細胞先聚集(aggregate)為團塊(pellet)而促使其分化為胰島素製造細胞，並可另外添加添加纖維結合蛋白或層粘蛋白，而進一步使間葉幹細胞分化為胰島素製造細胞的情況更為明顯，且利用本發明之方法所分化出的胰島素製造細胞，其釋出的胰島素量高於先前研究中以嚙齒動物骨髓幹細胞所分化出胰島素製造細胞可釋出的胰島素量。是以，本案顯然較目前存在之各種習知技術為優，殊為一極具產業價值之發明。
幹細胞主要可區分為胚胎幹細胞及成體幹細胞，其中廣義的胚胎幹細胞又包括胚胎生殖細胞以及由成體細胞轉化而成的胚胎幹細胞；而成體幹細胞則包括來自人體各部位的幹細胞，如間葉幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞等。雖然本案所發明之方法僅測試於間葉幹細胞，但鑑於過去研究結果得知，多數的分化方法適用於大部分的幹細胞。因此，本發明方法也應該適用於包括胚胎幹細胞、胚胎生殖細胞、造血幹細胞、神經幹細胞，或其他成體幹細胞及其組合之其中之一的胰島素製造細胞的分化。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例，其得由熟悉本技藝之人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
第1圖：係比較先前技術與本案之促進幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法所得到與胰島素製造細胞相關之mRNA表現量的關係圖。
第2A圖：係本案一較佳實施例之四期培養中所得到與胰島素製造細胞相關之mRNA表現量的關係圖。
第2B圖：係本案一較佳實施例之四期培養中所得到的細胞分裂相關蛋白Ki67表現為陽性之細胞百分比的關係圖。
第2C圖：係本案一較佳實施例之四期培養中所得到 的神經標識及胰島素蛋白之陽性面積比例的關係圖。
第3A圖：係比較一對照組與本案一較佳實施例之胰島素釋放量的關係圖。
第3B圖：係本案一較佳實施例經拮抗劑調節後之胰島素釋放量的關係圖。
第4A圖：係比較本案所有實施例之二亞型葡萄糖運送蛋白mRNA表現量的關係圖。
第4B圖：係比較本案所有實施例之胰島素mRNA表現量的關係圖。

Claims (13)

  1. 一種促進幹細胞分化為胰島素製造細胞的方法，其步驟依序包含：懸浮該幹細胞於一第一培養基中；聚集(aggregate)該幹細胞成一細胞團塊(pellet)；以及培養該細胞團塊於一第二培養基中，使該幹細胞分化為該胰島素製造細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該幹細胞選自胚胎幹細胞、成體幹細胞及其組合其中之一。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該胚胎幹細胞包含胚胎生殖細胞以及經轉化的胚胎幹細胞。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該成體幹細胞包含間葉幹細胞、造血幹細胞以及神經幹細胞。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該幹細胞包含2.5×105個細胞。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一培養基為一完全培養基，該完全培養基包含低葡萄糖DMEM、10%FBS、100U/mL盤尼西林以及10μg/mL鏈黴素。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該聚 集步驟係將該幹細胞以200-600g離心5-15分鐘而形成該細胞團塊。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中於該培養步驟前更包含一預培養步驟，用以預培養該細胞團塊於該第一培養基中一晚。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第二培養基包含纖維結合蛋白、層粘蛋白及其組合之其中之一。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該胰島素製造細胞係受到葡萄糖的誘導而釋放胰島素。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該葡萄糖濃度為5-25mM。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該胰島素製造細胞之胰島素的釋放可被cAMP磷酸二酯酶的抑制劑影響而增強。
  13. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該胰島素製造細胞之胰島素的釋放可被鈣離子通道的阻斷劑影響而抑制。
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