JP6516724B2 - 軟骨細胞系統細胞及び/又は軟骨様組織を作製するための方法及び組成物 - Google Patents
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Description
(a)原始線条様中胚葉細胞集団(例えば、ステージ2)、任意選択で、CD56+、PDGFRα+原始線条様中胚葉細胞集団を、
(i)FGFアゴニストと、
(ii)BMP阻害剤、任意選択で、ノギン、LDN−193189及び/又はドルソモルフィンと、
(iii)任意選択で、1種又は複数のTGFβ阻害剤、任意選択で、SB431542及びWnt阻害剤、任意選択で、IWP2(N−(6−メチル−2−ベンゾチアゾリル)−2−[(3,4,6,7−テトラヒドロ−4−オキソ−3−フェニルチエノ[3,2−d]ピリミジン−2−イル)チオ]−アセトアミド;Sigma)、Dickkopf関連タンパク質1(DKK1;R&D Systems)及び/又はXAV939(3,5,7,8−テトラヒドロ−2−[4−(トリフルオロメチル)フェニル]−4H−チオピラノ[4,3−d]ピリミジン−4−オン;Sigma)と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面CD73、CD105及び/又はPDGFR−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を特定化するステップと、
(b)細胞表面CD73、CD105及び/又はPDGFR−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団から軟骨細胞前駆体集団を作製するステップとを含み、前記の軟骨細胞前駆体集団を作製するステップが、
(i)細胞表面CD73、CD105及び/又はPDGFR−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
(ii)高細胞密度CD73+、CD105+及び/又はPDGFRβ+沿軸中胚葉細胞集団を、血清不含培地中でTGFβアゴニスト、任意選択で、TGFB1、TGFB2及び/又はTGFB3とともに培養して、高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団(例えば、ステージ3)を製造するステップと
を含み、
(c)(i)高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、TGFβアゴニスト(任意選択で、TGFβ1、TGFβ2及び/又はTGFβ3)とともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップか、又は
(ii)高細胞密度Sox9+コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、BMP4アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織(例えば、ステージ4)を製造するステップのいずれか
を含む。
(a)多能性幹細胞の出発集団を、
CD56及び/又はPDGFR−αを発現する原始線条様中胚葉細胞集団(例えば、ステージ1)を誘導するための原始線条誘導カクテルとともに培養するステップと、
(b)CD56及びPDGFR−αを発現する原始線条様中胚葉細胞集団を、
(i)FGFアゴニストと、
(ii)BMP阻害剤、任意選択で、ノギン、LDN−193189及び/又はドルソモルフィンと、
(iii)1種又は複数のTGFβ阻害剤、任意選択で、SB431524及びWnt阻害剤、任意選択で、DKK1、IWP2及び/又はXAV939と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面CD73、CD105及びPDGFR−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を特定化するステップと
(c)細胞表面CD73、CD105及び/又はPDGFR−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団から、軟骨細胞前駆体集団を作製するステップとを含み、前記の軟骨細胞前駆体集団を作製するステップが、
(i)CD73、CD105及び/又はPDGFR−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
(ii)高細胞密度CD73+、CD105+及びPDGFRβ+沿軸中胚葉細胞集団を、血清不含培地中でTGFβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと、
(d)(i)高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、TGFβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップか、又は
(ii)高細胞密度Sox9+コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、BMP4アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップと
を含む。
(a)軟骨細胞前駆体細胞を、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
(b)高細胞密度軟骨細胞前駆体細胞を、血清不含培地中でTGFβアゴニストとともに培養するステップと、
(c)(i)軟骨細胞前駆体細胞を、TGFβアゴニストとともに長期間培養して、関節軟骨様軟骨細胞を製造するステップか、又は
(ii)軟骨細胞前駆体細胞を、BMP4アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞系統細胞及び/若しくは軟骨様組織を製造するステップのいずれかと
を含む方法。
(a)多能性幹細胞の出発集団を、原始線条誘導カクテルとともに培養して、CD56及びPDGFR−αを発現する原始線条様中胚葉細胞集団(例えば、ステージ0)を誘導するステップと、
(b)CD56及びPDGFR−αを発現する原始線条様中胚葉細胞集団を
(i)FGFアゴニストと、
(ii)BMP阻害剤、任意選択で、ノギン(Noggin)、LDN−193189、ドルソモルフィン(Dorsomorphin)と、そして
(iii)1種又は複数のTGFβ阻害剤、任意選択で、SB431524;及びWnt阻害剤、任意選択で、DKK1、IWP2、及び/又はXAV939と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面CD73、CD105及びPDGFR−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を特定化するステップと
を含む方法を含む。
ヒト多能性幹細胞(PSC)から沿軸/軟骨形成中胚葉細胞を製造する方法、in−vitroで、関節軟骨マーカーラブリシンを発現し、例えば、膝関節のヒト軟骨組織と組織学的に区別され得ない関節軟骨様組織を作製する方法並びにヒトにおいて見られる第2の種類の軟骨であり、肥大を受け、コラーゲン10を発現する性質のために長骨の成長に関与している軟骨である成長板様特性を有する軟骨様組織を作製する方法が、本明細書において記載される。本明細書に記載される方法を使用して調製された軟骨細胞は、安定であり、移植後にその関節軟骨様又は成長板軟骨様特性を維持するとさらに実証される。さらに、CD73細胞表面マーカーは、関節軟骨細胞によって発現されるとわかった。
(a)原始線条様中胚葉細胞集団、任意選択で、CD56+及び/又はPDGFRα+原始線条様中胚葉細胞集団を、
(i)FGFアゴニストと、
(ii)BMP阻害剤、任意選択で、ノギン、LDN−193189、ドルソモルフィンと、
(iii)任意選択で、1種又は複数のTGFβ阻害剤、任意選択で、SB431542;及びWnt阻害剤と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面CD73、CD105及び/又はPDGFR−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を特定化するステップと、
(b)(i)CD73、CD105及び/又はPDGFR−βを発現する沿軸中胚葉集団を、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
(ii)高細胞密度CD73+、CD105+及び/又はPDGFRβ+沿軸中胚葉集団を、血清不含培地中でTGFβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと
を含む、軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、
(c)(i)高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、TGFβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップか、又は
(ii)高細胞密度Sox9+コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、BMP4アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップのいずれか
を含む。
(a)多能性幹細胞の出発集団を、
CD56及び/又はPDGFR−αを発現する原始線条様中胚葉細胞集団を誘導するための原始線条誘導カクテルとともに培養するステップと、
(b)原始線条様中胚葉細胞集団を、
; (i)FGFアゴニストと、
(ii)BMP阻害剤、任意選択で、ノギン、LDN−193189、ドルソモルフィンと、
(iii)任意選択で、1種又は複数のTGFβ阻害剤、任意選択で、SB431524;及びWnt阻害剤と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面CD73、CD105及びPDGFR−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を特定化するステップと
(c)(i)細胞表面CD73、CD105及び/又はPDGFR−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を、任意選択で、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
(ii)高細胞密度CD73+、CD105+及びPDGFRβ+沿軸中胚葉細胞集団を、血清不含培地中でTGFβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと
を含む、軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、
(d)(i)高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、TGFβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップか、又は
(ii)高細胞密度Sox9+コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、BMP4アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップのいずれか
を含む。
ヒト原始線条中胚葉は、例えば、分化の1及び4日目に、及び/又は分化の1及び4日目の間に、多能性細胞を、原始線条誘導カクテルと、例えば、アクチビン、BMP4及び塩基性FGFと接触させるステップによって誘導される。いくつかの実施形態では、例えば、CD56+/PDGFRa+集団がより早く作製される場合には、接触させるステップは、1〜3日目の間である。内因性Wntシグナル伝達が存在しないか、低い細胞系統及び出発集団では、Wntアゴニストを添加するステップが、PSCからの原始線条形成の効率を改善し得、アンタゴニストを用いてWntシグナル伝達を遮断するステップが、原始線条形成を阻害する。内因性Wntシグナル伝達は、例えば、実施例に記載される細胞系統(例えば、HES2)では十分である。iPSC株を使用して、Wntアゴニストは、1日目〜3日目に添加される場合に、CD56+PDGFRa+原始線条様集団の発生を改善することがわかった。
次のステージは、転写因子Meox1及びNkx3.2の発現を特徴とする沿軸中胚葉の作製である。原始線条(PS)様細胞が、例えば、単層培養で沿軸運命に特定化され得、このステージの間(例えば、4〜6日目)に、BMPシグナル伝達は、ドルソモルフィンなどの小分子を使用して阻害され得、TGFbシグナル伝達は、SB431542などの小分子を使用して阻害され得る。ヒト沿軸中胚葉は、FGF(bFGFなど)の添加を必要とし、例えば、単層培養の4〜15日目の間に、培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、wntアンタゴニストもまた、添加される。ヒト沿軸中胚葉の出現は、CD73、CD105及びPDGFRβを含めた細胞表面マーカーの発現によって示される。
例えば、15日目から得られた沿軸中胚葉は、マイクロマス又はフィルター培養などの高細胞密度軟骨組織形成アッセイ中に直接プレーティングされ得る。軟骨形成は、一実施形態では、TGFbアゴニストを用いて、例えば、TGFb3とともに約10日〜約2週間培養するステップによって誘導され、Sox9及びコラーゲン2の発現を特徴とする。BMP4などのBMP4アゴニスト又はGDFを含有する培地への切り替えが、肥大軟骨細胞表現型を誘導する。任意選択で、TGFb1又はTGFb3を用いるhESC由来軟骨細胞及び軟骨組織において、長期のTGFbアゴニスト処理が、関節軟骨細胞様表現型を誘導し、GDF5もまた、肥大表現型を誘導する。
(a)軟骨細胞前駆体細胞を、血清不含又は血清含有培地において高細胞密度で培養するステップと、
(b)高細胞密度軟骨細胞前駆体細胞を、血清不含培地中でTGFβアゴニストとともに培養するステップと、
(c)(i)軟骨細胞前駆体細胞を、TGFβアゴニストとともに長期間培養して、関節軟骨様軟骨細胞集団を製造するステップか、又は
(ii)軟骨細胞前駆体細胞を、BMP4アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞集団及び/若しくは軟骨様組織を製造するステップのいずれかと
を含む、軟骨細胞様細胞を作製する方法を含む。
(a)多能性幹細胞の出発集団を、原始線条誘導カクテルとともに培養して、CD56及びPDGFR−αを発現する原始線条様中胚葉集団を誘導するステップと、
(b)原始線条様中胚葉集団を
(i)FGFアゴニストと、
(ii)BMP阻害剤、任意選択で、ノギン、LDN−193189又はドルソモルフィンと、
(iii)任意選択で1種又は複数のTGFβ阻害剤、任意選択で、SB431524及び/又はWnt阻害剤、任意選択で、DKK1、IWP2又はXAV939と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面CD73、CD105及びPDGFR−βを発現する沿軸中胚葉集団を特定化するステップと
を含む。
(a)試験物質を、軟骨細胞前駆体系統細胞集団と接触させるステップであって、試験物質は、軟骨細胞前駆体系統細胞集団と、本明細書に記載される方法において任意のステップで接触されるステップと、
(b)試験物質の不在下で作製された対照集団と比較した、軟骨細胞増殖、維持及び/又は分化に対する試験物質の効果を評価するステップと、
(c)試験物質が、対照と比較して、増殖を増大又は減少させるか、及び/又は軟骨細胞維持若しくは分化に影響を及ぼす場合に、試験物質を候補軟骨形成調節物質と同定するステップと
を含む。
(a)本明細書に記載される方法に従って作製された関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織を得るステップと、
(b)関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織を、試験物質とともに培養するステップと、
(c)関節様非肥大軟骨細胞様細胞増殖を測定するステップと、
(d)試験物質の不在下で培養された関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織と比較した、増殖の増大を検出し、試験物質が、候補関節軟骨細胞増殖インデューサーであることを示すステップと
を含む、候補関節軟骨細胞増殖インデューサーを評価する方法を含む。
(a)本明細書に記載される方法に従って作製された肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を得るステップと、
(b)肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を、試験物質とともに培養するステップと、
(c)肥大軟骨細胞、細胞増殖を測定するステップと、
(d)試験物質の不在下で培養された肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織と比較した、増殖の増大を検出し、試験物質が、候補肥大軟骨細胞増殖インデューサーであることを示すステップと
を含む、候補肥大軟骨細胞増殖インデューサーを評価する方法を含む。
(a)本明細書に記載される方法に従って、関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織及び/又はGPC様細胞及び/又は成長板軟骨を作製するステップと
(b)関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織及び/又はGPC細胞を、試験物質とともに培養するステップと、
(c)試験物質の細胞毒性及び/又は細胞保護活性を測定するステップと、
(d)試験物質の不在下で培養された、関節様非肥大軟骨細胞及び/又はGPC細胞及び/又は組織と比較した、細胞毒性の増大を検出し、試験物質が、関節軟骨細胞及び/又はGPC細胞に対して毒性であることを示すステップか、又は試験物質の不在下で培養された、関節様非肥大軟骨細胞及び/又はGPC細胞及び/又は組織と比較した、保護活性の増大(例えば、細胞毒性の減少)を検出し、試験物質が保護的であることを示すステップと
を含む、試験化合物のAC細胞及び/又はGPC細胞毒性又は保護活性を評価する方法を含む。
結果
in vitroでの軟骨細胞形成は、胚様体(ステージ1)、単層培養での沿軸中胚葉の特定化(ステージ2)、高細胞密度マイクロマス培養での、又はコラーゲンコーティングされた膜フィルター上での軟骨細胞前駆体の作製(ステージ3)及びマイクロマス又はフィルター培養での関節及び成長板軟骨細胞及び軟骨組織の特定化(ステージ4)としての原始線条様(PS)集団の誘導を含む(図1A)。
CD73+細胞は、関節非肥大軟骨細胞に相当し、CD73陽性の欠如は、成長板様肥大軟骨細胞を同定し得る。
薬物毒性学スクリーニングのためのhESC由来軟骨細胞又は軟骨の使用
本明細書に、例えば、例1に記載された方法を使用して得られたHESC由来軟骨細胞は、予測薬物毒性学スクリーニング並びに創薬のために使用され得る。例えば、軟骨組織及び/又は成長板様軟骨組織系統並びにその前駆体に特有の肥大軟骨細胞は、試験物質と接触され得、細胞死などの1種又は複数の生物学的エンドポイントが測定される。例えば、細胞死は、例えば、トリパンブルーアッセイなどの生存細胞色素排除アッセイを使用して測定され得る。例えば、試験物質(薬物)に曝露されるAC様軟骨細胞は、トリパンブルー色素に対して透過性である細胞をカウントすることによって、所望の時点後に細胞毒性についてモニタリングされ得る。その他のアッセイとして、テトラゾリウム(tetrazolim)塩変換アッセイが挙げられる。このようなアッセイの例として、MTTアッセイ並びにWST−1アッセイが挙げられる。アッセイは、ハイスループットスクリーニングのために自動化され得る。
試験物質によって誘導されるような細胞増殖の試験におけるhESC由来軟骨細胞又は軟骨の使用
hESC由来軟骨細胞の使用の別の例は、細胞分化又は増殖に対して効果を有する薬物の試験である。特に対象とするものは、AC様の運命を示すCD73マーカーの使用によってモニタリングされるような、初代関節軟骨細胞の関節軟骨組織への増殖に影響を及ぼし得る薬物の試験であろう。種々の細胞増殖アッセイが、利用可能であり、対象の試験物質に対する反応をモニタリングできる。例えば、3Hチミジン取り込みアッセイは、試験物質又は増殖因子を用いる処理後の細胞の増殖をモニタリングする。このような処理の後、細胞を3H−チミジンとともに16〜24時間インキュベートする。代替アッセイとして、5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)取り込みアッセイがある。さらに別の代替法として、プロピジウムヨウ素試験の使用の使用がある。蛍光は、サンプル中のDNA含量に対して直接比例する。細胞増殖をモニタリングするこの方法は、単層で増殖される細胞を用いて使用され得るので、hESC由来軟骨細胞との関連で特に有用であり得る。
細胞系統を区別する方法としての軟骨細胞の大きさ及び粒度の使用
本開示は、異なる系統の軟骨細胞、より詳しくは、AC様軟骨細胞、同様に成長板様軟骨細胞を作製する方法を記載する。これらの系統は、例えば、大きさに基づいて区別され得る。例えば、hESC由来軟骨細胞の前方散乱(FSC−A)及び側方散乱(SSC−A)を使用して、生細胞のフローサイトメトリー解析の際に観察される抗体ベースの染色の不在下で使用され得る。TGFB3処理AC様細胞集団は、全般的に均一な大きさ及び粒度を有する堅固な細胞の集団として示し、一方で、BMP4処理肥大軟骨細胞は、全般的により大きいFSC−A及びSSC−A特性を有する不均一な細胞集団を示す。したがって、生細胞のFSC−A及びSSC−A特性は、軟骨細胞肥大を誘導又は阻害する因子が試験されている実験における有用な読み出し情報であり得る。
リポーター遺伝子アッセイを使用する細胞発生及び細胞系統のモニタリング
ラブリシン又はコラーゲン10などの成熟した軟骨遺伝子を含めた軟骨細胞特異的遺伝子の発現を維持又は変更する因子及び物質を同定するために、リポーター遺伝子アッセイが本明細書に記載される方法とともに使用され得る。例えば、ラブリシンプロモーター−RFP(赤色蛍光タンパク質)によって標的とされるhESC株が、ラブリシンプロモーター活性を誘導する試験物質のスクリーニング及び蛍光顕微鏡によって検出可能なRFPの発現のために使用され得る。ラブリシンプロモーターRFP+発現、蛍光の増大又はラブリシンプロモーターRFP+を発現する細胞のパーセンテージの増大が、非肥大関節様軟骨細胞特徴を示した細胞のパーセンテージの増大を示す。対照的に、ラブリシンプロモーターRFP+の喪失は、これらの細胞及び/又は関節軟骨細胞様特徴の喪失を示し得る。
本明細書において参照される参照文献に関する引用
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Claims (68)
- 関節様非肥大軟骨細胞及び/若しくは軟骨様組織及び/又は肥大軟骨細胞様細胞及び/若しくは軟骨様組織を含む軟骨細胞及び/又は軟骨を作製するための方法であって、
a.CD56+及びPDGFRα+原始線条様中胚葉集団を含む原始線条様中胚葉細胞集団を、
i.FGFアゴニスト、及び
ii.BMP阻害剤
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面CD73、CD105及び/又はPDGFRβを発現する沿軸中胚葉集団を特定化するステップと、
b.i.CD73、CD105及び/又はPDGFRβを発現する沿軸中胚葉集団を、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
ii.高細胞密度CD73+、CD105+及び/又はPDGFRβ+沿軸中胚葉集団を、血清不含培地中でTGFβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと
を含む軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、そして
c.i.高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、TGFβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップか、又は
ii.高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、BMP4アゴニストとともに3週間超えの長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップのいずれか
を含む、上記方法。 - 沿軸中胚葉特定化カクテルが、1種又は複数のTGFβ阻害剤、及びWnt阻害剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ステップc)が、高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、TGFβアゴニストとともに少なくとも3週間超培養して、関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップを含む、関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織を作製するための請求項1に記載の方法。
- ステップc)が、高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、BMP4アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップを含む、肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を作製するための請求項1に記載の方法。
- 沿軸中胚葉集団が、胚様体、単層培養及び/又はそれらの組合せ中に含まれる、請求項1〜請求項4までのいずれか一項に記載の方法。
- a.多能性幹細胞の出発集団を、原始線条誘導カクテルとともに培養して、CD56及びPDGFR−αを発現する原始線条様中胚葉集団を誘導するステップと、
b.原始線条様中胚葉細胞集団を
i.FGFアゴニスト、
ii.BMP阻害剤、並びに
iii.1種又は複数のTGFβ阻害剤及びWnt阻害剤
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面CD73、CD105及びPDGFRβを発現する沿軸中胚葉集団を特定化するステップと、
c.i.CD73、CD105及び/又はPDGFRβを発現する沿軸中胚葉集団を、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
ii.高細胞密度CD73+、CD105+及びPDGFRβ+沿軸中胚葉集団を、血清不含培地中でTGFβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと
を含む、軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、
d.高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、TGFβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップと
を含む、関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織を作製するための、請求項1に記載の方法。 - a.多能性幹細胞の出発集団を、原始線条誘導カクテルとともに培養して、CD56及びPDGFR−αを発現する原始線条様中胚葉集団を誘導するステップと、
b.原始線条様中胚葉細胞集団を
i.FGFアゴニスト、
ii.BMP阻害剤、並びに
iii.1種又は複数のTGFβ阻害剤;及びWnt阻害剤
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面CD73、CD105及びPDGFRβを発現する沿軸中胚葉集団を特定化するステップと、
c.i.CD73、CD105及び/又はPDGFRβを発現する沿軸中胚葉集団を、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
ii.高細胞密度CD73+、CD105+及びPDGFRβ+沿軸中胚葉集団を、血清不含培地中でTGFβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと
を含む、軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、そして
d.高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、BPM4アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップと
を含む、肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を作製するための、請求項1に記載の方法。 - a.多能性幹細胞の出発集団を、原始線条誘導カクテルとともに培養して、CD56及びPDGFR−αを発現する原始線条様中胚葉集団を誘導するステップと、
b.原始線条様中胚葉細胞集団を
i.FGFアゴニスト、
ii.BMP阻害剤、並びに、
iii.1種又は複数のTGFβ阻害剤及びWnt阻害剤
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面CD73、CD105及びPDGFRβを発現する沿軸中胚葉集団を特定化するステップと、
c.i.細胞表面CD73、CD105及び/又はPDGFRβを発現する沿軸中胚葉集団を、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
ii.高細胞密度CD73+、CD105+及びPDGFRβ+沿軸中胚葉集団を、血清不含培地中でTGFβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと
を含む、軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、
d.i.高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、TGFβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップか、又は
ii.高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を、BMP4アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を製造するステップのいずれかと
を含む、軟骨細胞を作製するための、請求項1に記載の方法。 - 出発集団が、a)ヒト胚幹細胞集団(hESC)、b)人工多能性幹細胞集団(iPSC)、c)初代hESC、及びd)初代iPSCからなる群から選択される、請求項6〜8までのいずれか一項に記載の方法。
- hESC集団が、HES2 H1、H9及び任意のヒトiPS細胞系統からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 出発集団が、胚様体に凝集される、請求項6〜10までのいずれか一項に記載の方法。
- 出発集団が、原始線条誘導カクテルと、約1〜約5日間接触される、請求項6〜11までのいずれか一項に記載の方法。
- 原始線条誘導カクテルが、アクチビンアゴニスト、BMP4アゴニスト、及びFGFアゴニストを含む、請求項6〜12までのいずれか一項に記載の方法。
- 原始線条誘導カクテルが、GSK3b阻害剤から選択されるWntアゴニストをさらに含む、請求項6〜13までのいずれか一項に記載の方法。
- 沿軸中胚葉が、単層培養で特定化される、請求項1〜4及び6〜14までのいずれか一項に記載の方法。
- BMP阻害剤が、ドルソモルフィン(DM)、ノギン、コーディン、LDN−193189、可溶性BMPR1a、及び可溶性BMPR1bからなる群から選択される1型BMP受容体阻害剤、BMPリガンド及び/又は可溶性BMP受容体の少なくとも一つから選択される、請求項1〜15までのいずれか一項に記載の方法。
- 原始線条様中胚葉集団が、心筋細胞特定化を阻害するために、BMP阻害剤と、1、2、3又は4日接触される、請求項1〜16までのいずれか一項に記載の方法。
- 原始線条様中胚葉集団及び/又は沿軸中胚葉集団を特定化するためのFGFアゴニストが、FGF2、FGF4及びFGF9からなる群から選択される、請求項1〜17までのいずれか一項に記載の方法。
- 原始線条様中胚葉集団が、FGFアゴニストと、少なくとも5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日又はそれ以上の間、接触され、CD73及び/又はCD105を発現する細胞の割合を、FGFアゴニスト未処理細胞と比較して、少なくとも20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%又は65%増大させる、請求項1〜18までのいずれか一項に記載の方法。
- 沿軸中胚葉集団がまた、転写因子Meox1及びNkx3.2も発現し、Nkx2.5について陰性である、請求項1〜19までのいずれか一項に記載の方法。
- 沿軸中胚葉集団が、マイクロマス培養、ペレット培養又はフィルター培養で、又は高細胞密度形式でプレーティングされる、請求項1〜20までのいずれか一項に記載の方法。
- 沿軸中胚葉集団が、マイクロマス培養で、1000万個細胞/mlから2000万、3000万、4000万又は5000万個細胞/mlの間の細胞密度で、又は12mm径膜フィルター培養で、500,000から750,000個、100万個、125万個、150万個、175万個、又は200万個の間の細胞がプレーティングされる、請求項21に記載の方法。
- 集団が、インスリン、トランスフェリン及びセレンを含む血清不含基礎培地中で培養される、請求項1〜22までのいずれか一項に記載の方法。
- 基礎培地が、インスリン、トランスフェリン、セレンサプリメント、プロリン及びデキサメタゾンとともにDMEMを含む、請求項23に記載の方法。
- 沿軸中胚葉集団が、TGFβ3であるTGFβアゴニストの添加の前に、高細胞密度で、0、1、2、3又は4日間培養される、請求項1〜24までのいずれか一項に記載の方法。
- CD73+、CD105+及び/又はPDGFRβ+沿軸中胚葉集団が、血清不含培地中でTGFβアゴニストとともに少なくとも3日間、3日〜7日間、又は3日〜14日間培養されて、Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団を製造し、ここでTGFβアゴニストはTGFβ3である、請求項1〜25までのいずれか一項に記載の方法。
- Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団が、TGFβアゴニストとともに培養される長期間は、関節軟骨様組織を製造するためには、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、若しくは12週間又はそれ以上である、請求項2、及び5〜25までのいずれか一項に記載の方法。
- 軟骨細胞前駆体集団が、ラブリシン及び/又は軟骨中間体層タンパク質2(CILP2)が発現されるまでTGFβアゴニストとともに培養される、請求項27に記載の方法。
- 沿軸中胚葉集団及び/又はSox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団が、TGFβ3、TGFβ1及びTGFβ2からなる群の少なくとも一つから選択されるTGFβアゴニストとともに培養される、請求項1〜28までのいずれか一項に記載の方法。
- 肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織が、BMP4アゴニストとともに培養されて、コラーゲン10+及び/又はRunx2+肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を製造する、請求項1及び4〜28までのいずれか一項に記載の方法。
- 高細胞密度Sox9+、コラーゲン2+軟骨細胞前駆体集団がBMP4アゴニストとともに培養される長期間が、コラーゲン2を発現する軟骨組織又はコラーゲン10を発現する肥大軟骨細胞集団を作製するには、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、若しくは12週間又はそれ以上である、請求項1、4〜28、及び30のいずれか一項に記載の方法。
- CD73+CD105+細胞及び/又はCD73+PDGFRβ+細胞が、高細胞密度培養に先立って、細胞表面CD73、CD105及び/又はPDGFRβを発現する沿軸中胚葉集団からフローサイトメトリーによって単離される、請求項1〜31までのいずれか一項に記載の方法。
- 軟骨細胞前駆体が、軟骨組織形成を促進するTGFβアゴニスト又はBMP4アゴニストとともに培養される、請求項1〜32までのいずれか一項に記載の方法。
- ステップが、in vitroで実施される、請求項1〜33までのいずれか一項に記載の方法。
- 請求項28に記載の方法に従って作製された、関節様非肥大軟骨細胞及び/若しくは軟骨様組織の単離された細胞集団。
- 細胞集団が、対象に投与される、請求項35に記載の単離された細胞集団。
- 請求項35に記載の関節様非肥大軟骨細胞及び/若しくは軟骨様組織の単離された細胞集団、並びに、希釈剤又はPEG、ヒドロゲル、骨足場、骨代用品足場及びマトリゲル(登録商標)からなる群から選択される担体を含む組成物。
- 組成物が、細胞スラリーである、請求項37に記載の組成物。
- 請求項35又は36に記載の単離された細胞集団又は内皮細胞若しくは線維芽細胞をさらに含む、請求項37又は38に記載の組成物。
- 請求項35〜39までのいずれか一項に記載の細胞又は組成物と、足場とを含む、軟骨又は骨組織製品。
- 足場が、骨代用品である、請求項40に記載の骨組織製品。
- 組成物が変形性関節症、離断性骨軟骨炎、多発性軟骨炎及びその他の軟骨疾患又は軟骨に影響を及ぼす関節傷害などの関節状態を治療するための薬剤の製造に使用される、請求項35に記載の単離された細胞集団又は請求項40又は41に記載の軟骨又は骨組織製品を含む組成物。
- 組成物が、骨の骨折、骨の破損、又は悪性腫瘍、外傷、軟骨無形成症、骨形成不全、骨粗鬆症又はその他のオステオパシーによる骨量減少などの骨状態を治療するための薬剤の製造に使用される、請求項35に記載の単離された細胞集団又は請求項40又は41に記載の軟骨又は骨組織製品を含む組成物。
- 沿軸中胚葉細胞の集団を作製する方法であって、
a.多能性幹細胞の出発集団を、原始線条誘導カクテルとともに培養して、CD56及びPDGFRαを発現する原始線条様中胚葉集団を誘導するステップと、
b.原始線条様中胚葉集団を、
i.FGFアゴニスト、
ii.BMP阻害剤、並びに
iii.1種又は複数のTGFβ阻害剤及びWnt阻害剤
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面CD73、CD105及び/又はPDGFRβを発現する沿軸中胚葉集団を特定化するステップと
を含む、上記方法。 - CD73、CD105及び/又はPDGFRβを発現する細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項44に記載の方法。
- 沿軸軟骨形成中胚葉細胞の集団を単離する方法であって、
a.沿軸軟骨形成中胚葉を含む細胞の集団を、CD73特異的結合剤、CD105特異的結合剤及びPDGFRβ特異的結合剤を含むカクテルと接触させるステップと、
b.CD73+、CD105+及びPDGFRβ+細胞について濃縮するステップと
を含む、上記方法。 - 細胞が、フローサイトメトリーを使用して濃縮される、請求項45又は46に記載の方法。
- 候補軟骨形成調節物質を試験する方法であって、
a.試験物質を、軟骨細胞前駆体系統細胞集団と接触させるステップであって、試験物質は、軟骨細胞前駆体系統細胞集団と、請求項1〜34、44及び45のいずれか一項に記載の方法において任意のステップで接触されるステップと、
b.試験物質の不在下で作製された対照集団と比較した、軟骨細胞増殖、維持及び/又は分化に対する試験物質の効果を評価するステップと、そして
c.試験物質が、対照と比較して、増殖を増大又は減少させるか、及び/又は軟骨細胞維持若しくは分化に影響を及ぼす場合に、試験物質を候補軟骨形成調節物質と同定するステップと
を含む、上記方法。 - 候補軟骨形成調節物質が、罹患軟骨又は骨を有する対象から単離された因子である、請求項48に記載の方法。
- 因子が、関節炎及び/若しくは肥満を有する対象の関節中の脂肪パッドから、又は対照として健常な対象から単離される、請求項49に記載の方法。
- 試験物質が、BMP4アゴニストとともに添加され、試験物質が、試験物質の不在下で処理された対象と比較して、肥大を阻害するその能力について評価される、請求項48に記載の方法。
- 肥大が、フローサイトメトリーを使用して、前方及び側方散乱を評価することによって評価される、請求項51に記載の方法。
- 候補関節軟骨細胞増殖インデューサーを評価する方法であって、
a.請求項1、2、3、及び5〜34までのいずれか一項に記載の方法に従って作製された関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織を得るステップと、
b.関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織を、試験物質とともに培養するステップと、
c.関節様非肥大軟骨細胞様細胞増殖を測定するステップと、そして
d.試験物質の不在下で培養された関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織と比較した、増殖の増大を検出し、試験物質が、候補関節軟骨細胞増殖インデューサーであることを示すステップと
を含む、上記方法。 - 候補肥大軟骨細胞増殖インデューサーを評価する方法であって、
a.請求項1、及び4〜34までのいずれか一項に記載の方法に従って作製された肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を得るステップと、
b.肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織を、試験物質とともに培養するステップと、
c.肥大軟骨細胞増殖を測定するステップと、そして
d.試験物質の不在下で培養された肥大軟骨細胞様細胞及び/又は軟骨様組織と比較した、増殖の増大を検出し、試験物質が、候補肥大軟骨細胞増殖インデューサーであることを示すステップと
を含む、上記方法。 - 試験物質とともに培養するステップに先立って、CD73+関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織が単離され、ここでCD73+関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織がフローサイトメトリーによって単離される、請求項53に記載の方法。
- 関節様非肥大軟骨細胞及び肥大軟骨細胞様細胞が、関節軟骨細胞特異的プロモーター、又は肥大軟骨細胞特異的プロモーターに機能的に連結されたリポーター遺伝子を含み、ここで関節軟骨細胞分化が関節軟骨細胞リポーター遺伝子活性を測定することによって同定され、かつ肥大軟骨細胞分化が、肥大軟骨細胞リポーター遺伝子活性を測定することによって同定される、請求項53〜55までのいずれか一項に記載の方法。
- 増殖の増大が、以下の方法:3Hチミジン取り込みアッセイ、5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)取り込みアッセイ、プロピジウムヨウ素アッセイのうち1種又は複数を使用して測定される、請求項53〜56までのいずれか一項に記載の方法。
- 試験化合物のAC細胞及び/又はGPC細胞保護活性及び/又は毒性を評価する方法であって、
a.請求項1〜34までのいずれか一項に記載の方法に従って、関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織及び/又はGPC様細胞及び/又は成長板軟骨を作製するステップと、
b.関節様非肥大軟骨細胞及び/又は軟骨様組織及び/又はGPC細胞及び/又は軟骨様組織を、試験物質とともに培養するステップと、
c.試験物質の細胞/組織毒性又は軟骨細胞保護活性を測定するステップと、そして
d.試験物質の不在下で培養された、関節様非肥大軟骨細胞及び/又はGPC細胞及び/又は組織と比較した、細胞毒性の増大を検出し、試験物質が、関節軟骨細胞及び/又はGPC細胞に対して毒性であることを示すステップか、又は試験物質の不在下で培養された、関節様非肥大軟骨細胞及び/又はGPC細胞及び/又は組織と比較した、保護活性の増大(例えば、細胞毒性の減少)を検出し、試験物質が保護的であることを示すステップと
を含む、上記方法。 - 細胞毒性が、以下のアッセイ:トリパンブルー色素アッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、MTTアッセイ及びWST−1アッセイなどのテトラゾリウム(tetrazolim)塩変換アッセイのうち1種を使用して測定される、請求項58に記載の方法。
- 増殖、細胞毒性及び/又は保護活性が、以下の解析又はアッセイ:組織学的解析、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカンの製造を定量するものなどの生化学的アッセイ、遺伝子発現解析、顕微鏡又はフローサイトメトリーによるラブリシン又はコラーゲン10などの蛍光リポーターの獲得/喪失、CD73細胞表面受容体発現の獲得又は喪失、細胞死についてのアッセイ、軟骨細胞肥大を示し得る細胞の大きさについてのフローサイトメトリーのうち1種又は複数を使用して評価される、請求項53〜58までのいずれか一項に記載の方法。
- AC様軟骨細胞及び/若しくは軟骨様組織又は肥大様軟骨細胞及び/又は軟骨様組織が、試験物質とともに培養するステップに先立って疾患メディエーターと接触される、請求項53〜60までのいずれか一項に記載の方法。
- 疾患メディエーターが、IL−1β又は関節脂肪パッド成分である、請求項61に記載の方法。
- TGFβ阻害剤がSB431542である、請求項2、6〜8、及び44のいずれか一項に記載の方法。
- Wnt阻害剤がDKK1、IWP2、又はXAV939である、請求項2、6〜8、及び44のいずれか一項に記載の方法。
- BMP4アゴニストがBMP4、BMP2、BMP6、BMP7、又はBMP10である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- FGFアゴニストがFGF2、FGF4、FGF9、FGF19、FGF21、FGF3、FGF5、FGF6、FGF8a、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、又はFGF23である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- GSK3b阻害剤がCHIR−99021、6−ブロモインジルビン−3’−オキシム、又はStemolecule(商標)BIOである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- BMP4阻害剤がノギン、LDN−193189、ドルソモルフィン、コーディン(Chordin)、可溶性BMPR1a、又は可溶性BMPR1bである、請求項44に記載の方法。
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