KR102393715B1 - 연골세포 계통 세포 및/또는 연골 유사 조직 생성을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

연골세포 계통 세포 및/또는 연골 유사 조직 생성을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

a. 원시선-유사 중배엽 집단, 임의적으로, CD56+, PDGFR알파+ KDR- 원시선-유사 중배엽 집단을 i. FGF 효능제; ii. BMP 억제제; 임의적으로 노긴, LDN-193189, 도소모르핀; 및 iii. 임의적으로, TGF베타 억제제, 임의적으로 SB431524; 및 Wnt 억제제, 임의적으로 DKK1, IWP2, 또는 XAV939 중 하나 이상의 것을 포함하는, 축주위 중배엽 특정화 칵테일과 함께 배양하여 세포 표면 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 집단을 특정화하는 단계; b. i. 임의적으로 무혈청 또는 혈청 함유 배지 중에서 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 집단을 고세포 밀도로 배양하고; ii. 무혈청 배지 중에서 고세포 밀도의 CD73+, CD105+ 및/또는 PDGFR베타+ 축주위 중배엽 집단을 TGF베타3 효능제와 함께 배양하여 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 제조하는 것을 포함하는, 연골세포 전구체 집단을 생성하는 단계; 및 c. i. 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGF베타3 효능제와 함께 배양하여 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하거나; 또는 ii. 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 BMP4 효능제와 함께 배양하여 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하는 단계를 포함하는, 연골세포 및/또는 연골, 임의적으로 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직 및/또는 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 생성하는 방법.

Description

연골세포 계통 세포 및/또는 연골 유사 조직 생성을 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENERATING CHONDROCYTE LINEAGE CELLS AND/OR CARTILAGE LIKE TISSUE}
본 출원은 2013년 4월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/809,050의 우선권에 기초하여 35 U.S.C. § 119의 이점을 주장하는 특허 협력 조약 출원이고, 상기 가특허 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 연골세포 및 연골 및 특히 관절 연골세포 및 관절 연골 유사 조직 뿐만 아니라, 인간 만능 줄기 세포로부터의, 비대성 연골세포 및 성장판 연골을 닮은 조직을 제조하는 방법에 관한 것이다.
시험관내에서 만능 줄기 세포로부터 분화된 세포 유형을 효율적으로 및 재현가능하게 생성할 수 있는 능력이 광범위한 퇴행성 질환 및 심신을 쇠약하게 만드는 질환의 치료를 위한 세포 기반 요법의 개발을 위한 문을 열어 주었다. 골관절염 (OA)의 경우, 10명의 성인 중 적어도 1명은 걸리고 (Lawrence, Felson et al. 2008), 이에 의해 관절 운동과 관련된 통증에 기인하여 환자의 삶의 질은 낮아져, 상기 요법에 대한 후보가 된다. OA의 병원성 특징으로는 하부 연골 하골의 비대 및 골극 (골 돌기) 형성과 함께 관절을 가득 채우는 관절 연골의 세포외 기질 (ECM)의 퇴행을 포함한다. 관절 연골은 발생 조기에 특정화되고, 성인 일생 동안에 걸쳐 지속되는, 관절 연골세포 (AC)로서 공지된 연골세포의 상이한 하위집단에 의해 생성된다. AC는 일반 환경하에서는 관절 연골의 완전성을 유지시키는 기능을 하는 반면, 손상 또는 질환에 의해 손상된 연골을 수복시킬 수 있는 능력은 거의 보이지 않는다. 결과적으로, 질환이 진행됨에 따라, 연골 손상은 매우 확장성을 띠며, 이로써, 환자의 삶의 질 개선을 위해서는 대개 외과 처치, 예컨대, 관절 대체가 요구된다. AC는, 1차 기능이 연골내 골화 과정을 거쳐 골을 형성하는 것인 성장판 연골세포 (GPC)와는 다른 것이다 (Colnot, 2005). 흥미롭게도, OA 발병시 AC는 비대를 비롯한, GPC의 일부 특징을 획득한 것으로 보였고, 이는 상기 질환의 발병 기전에 기여할 수 있다.
연골세포 및 연골 대체는 어떤 점에서는 기계 장치의 필요성을 현저히 감소시킬 수 있는, OA에 대한 잠재적인 신규 요법을 나타낸다. 그러나, 이러한 유형의 요법은 적절한 조직에의 접근, 및 충분한 개수의 고도로 풍부화된 AC에 의존한다. 성인의 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 시험관내에서 연골세포로 분화될 수 있다는 것이 잘 확립되어 있지만, 그로부터 생성된 연골-유사 조직이 조기에 비대화됨에 따라 AC를 생성하게 될 수 있는지 여부는 불분명하다 (Pelttari, Winter et al. 2006, Steinert, Ghivizzani et al. 2007, Pelttari, Steck et al. 2008). 대안적으로, AC는 환자로부터 직접 수거되었고, 비록 그의 증식 능력은 제한되어 있음에도 불구하고, 생체외에서의 조직 생성을 위해 사용되었다. 계대된 연골세포에 의해 생성된 조직은 섬유연골 특징을 보이며, 이는 단기간 동안은 환자의 삶의 질을 개선시킬 수는 있지만, 충분한 체중 부하 능력이 부족하기 때문에 결국에는 분해된다 (Tins, McCall et al. 2005, LaPrade, Bursch et al. 2008). 만능 줄기 세포 (PSC), 예컨대, 배아 및 유도성 만능 줄기 세포 (ESC, iPSC)는 시험관내 적절한 조건하에서 광범위한 세포 유형을 생성할 수 있으므로, 이들 세포는 치료 적용을 위한 연골세포 및 조직의 신규하고, 잠재적으로 무제한적인 공급원을 나타낼 수 있다.
연골세포는 조혈 및 심혈관 계통을 생성하도록 운명이 정해진 측판 중배엽 (LPM) 생성 이후 조직화된 시간적 패턴으로 조기 배아에서 유도되는 축주위 중배엽으로부터 발생한다 (Lawson, Meneses et al. 1991, Kinder, Tsang et al. 1999). 유도 후, 축주위 중배엽의 스트립은 체절로 분할된다 (Tarn and Tan 1992, Kulesa and Fraser 2002). 체절 발생은 부분적으로는, 그의 발현이 축주위 중배엽 유도와 동시에 일어나는 전사 인자 파락시스(transcription factors paraxis: TCF15) 및 TBX18에 의해 조절된다 (Burgess, Rawls et al. 1996, Bussen, Petry et al. 2004, Singh, Petry et al. 2005). 이어서, 개별 체절들은, 연골 및 척추를 비롯한 축 골격을 형성하는 배쪽 경절, 및 골격근 및 등 피부로 발생하는 등쪽 피부근육분절로 패턴화된다 (Hirsinger, Jouve et al. 2000). 경절의 특정화는 두 전사 인자, MeoxI (Mankoo, Skuntz et al. 2003) 및 Nkx3.2 (BapxI)의 발현을 특징으로 한다. 연골발생 잠재능이 있는 콜라겐 2 (Col2a1) 양성 중간엽 세포 집단은 마우스 발생 중 E12.5의 경절 유래 세포로부터 발생한다 (Akiyama, Chaboissier et al. 2002, Dao, Jonason et al. 2012).
전구 세포를 연골발생 계통으로 분화시키는 방법은 확립되어 있지만, AC, 및 궁극적으로 비-비대성 연골세포를 함유하는 안정한 연골 조직을 특정화시킬 수 있는 능력에 대한 이해는 여전히 불충분한 상태이다. AC는 Wnt9a/14, 및 TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원인 성장 및 분화 인자 5 (GDF5/BMP14)의 상향조절을 특징으로 하는, 추후 활막 관절 부위에서 형성되는 섬유성 세포 집단인 구역간 세포로부터 유래된다 (Archer, Dowthwaite et al. 2003, Pacifici, Koyama et al. 2006). 계통 추적 연구 결과, GDF5 발현 구역간 세포가 AC를 비롯한 수개의 관절 조직을 생성하지만, GPC 집단에는 기여하지 않는 것으로 나타났다 (Koyama, Shibukawa et al. 2008). 대조적으로, GPC는 풍부화 연골발생 중간엽으로부터 발생하고, BMP 2, 4 및 7 뿐만 아니라, 콜라겐 10을 비롯한, 비대 관련 유전자를 발현한다. 다른 영역의 AC 및 GPC는 2차 골화 중심이 형성되기 시작할 때인 생후 7-8일째인 조기 시점에 관찰된다 (Murakami, Balmes et al. 2004, Blumer, Longato et al. 2007). 이러한 관찰 결과는 AC 및 GPC가 발생 동안 별개의 전조 집단으로부터 생성되고, 따라서, 상이한 계통을 나타낼 수 있다는 것을 제안한다.
다수의 연구를 통해 시험관내에서 마우스 (m) 및 인간 ESC 및 iPSC로부터 연골세포를 유도할 수 있다는 것이 입증되었다. 그러나, 대개는 조기의 분화 단계를 입증하기 위해 혈청 기반 배지를 사용함에 따라 혼합형 계통 말기 배양물이 생성되었다 (Kramer, Hegert et al. 2000, zur Nieden, Kempka et al. 2005, Hwang, Kim et al. 2006, Hwang, Varghese et al. 2008, Jukes, Both et al. 2008, Yamashita, Krawetz et al. 2008). 최근 연구에서는 분화를 지정하기 위하여 특이적인 경로 효능제 및 길항제를 포함하는 정의된 배양 배지를 사용하는 것이 보고되었다 (Nakayama, Duryea et al. 2003, Darabi, Gehlbach et al. 2008, Tanaka, Jokubaitis et al. 2009). 타나카(Tanaka) 등 (Tanaka et al. (2009))은 mESC에서 BMP 억제와 함께 Wnt 신호전달을 조합한 결과, PDGFR알파의 발현 및 Flk-1의 발현 결여에 의해 확인된 바와 같이, 연골발생 잠재능을 가진 축주위 중배엽이 생성되었다는 것을 밝혀내었다. 상기 중배엽은 또한 일부 심장 잠재능도 보이지만, 조혈 세포를 생성하는 능력은 전혀 나타내지 않았으며, 이는 BMP 신호전달에의 의존성에 따라 상이한 유형의 중배엽이 구별된다는 것을 시사한다.
올더쇼(Oldershaw) 등 (Oldershaw, Baxter et al. 2010)은 무혈청 프로토콜을 사용하였다. 올더쇼의 방법을 이용하는 경우에는 시험관내 또는 생체내에서 어떤 조직도 수득되지 않았다.
우메다(Umeda) 등 (Umeda, Zhao et al. 2012)은 Runx2 발현 세포를 포함하는 소절을 생산한 PDGF 자극을 사용하는 방법을 사용하였다.
골관절염은 주로 관절의 관절-표면 관절 연골을 이환시키는 퇴행성 질환이다. 관절 연골은 손상시 그 스스로 재생할 수 있는 능력은 극히 제한되어 있으며, 따라서, 세포 및 조직 대체 전략법은 상기 조직을 효과적으로 대체할 수 있는 유일한 수단이다. 관절 질환, 예컨대, 골관절염을 앓는 환자에서는 신약 개발 및 연골 대체 전략법을 위해 상기 조직이 크게 요구되고 있음에도 불구하고 현재 만능 줄기 세포로부터 인간 연골을 생산하는 방법은 부족하다.
본 출원의 한 측면은
(a) 원시선-유사 중배엽 세포 집단 (예컨대, 2 단계), 임의적으로, CD56+, PDGFR알파+ 원시선-유사 중배엽 세포 집단을,
(i) FGF 효능제;
(ii) BMP 억제제, 임의적으로 노긴(Noggin), LDN-193189, 및/또는 도소모르핀; 및
(iii) 임의적으로 TGF베타 억제제, 임의적으로 SB431542; 및 Wnt 억제제, 임의적으로 IWP2 (N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드; 시그마(Sigma)); Dickkopf-관련 단백질 1 (DKK1; R & D 시스템즈(R & D Systems)), 및/또는 XAV939 (3,5,7,8-테트라히드로-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-온; 시그마) 중 하나 이상의 것을 포함하는, 축주위 중배엽 특정화 칵테일과 함께 배양하여 세포 표면 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단을 특정화하는 단계;
(b) (i) 무혈청 또는 혈청 함유 배지 중에서 세포 표면 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단을 고세포 밀도로 배양하고;
(ii) 무혈청 배지 중에서 고세포 밀도의 CD73+, CD105+ 및/또는 PDGFR베타+ 축주위 중배엽 세포 집단을 TGF베타 효능제, 임의적으로 TGFB1, TGFB2 및/또는 TGFB3과 함께 배양하여 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단 (예컨대, 3 단계)을 고세포 밀도로 제조하는 것을 포함하는, 세포 표면 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단으로부터 연골세포 전구체 집단을 생성하는 단계; 및
(c) (i) 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGF베타 효능제 (임의적으로 TGF베타1, TGF베타2 및/또는 TGF베타3)와 함께 배양하여 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하거나; 또는
(ii) 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 BMP4 효능제와 함께 배양하여 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직 (예컨대, 4 단계)을 제조하는 단계를 포함하는, 연골세포 계통 세포 및/또는 연골 유사 조직, 임의적으로 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직 및/또는 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 생성하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면은
(a) 만능 줄기 세포의 출발 집단을 원시선 유도 칵테일과 함께 배양하여 CD56 및/또는 PDGFR-알파를 발현하는 원시선-유사 중배엽 세포 집단 (예컨대, 1 단계)을 유도하는 단계;
(b) CD56 및 PDGFR-알파를 발현하는 원시선-유사 중배엽 세포 집단을,
(i) FGF 효능제;
(ii) BMP 억제제, 임의적으로 노긴, LDN-193189, 및/또는 도소모르핀; 및
(iii) TGF베타 억제제, 임의적으로 SB431524; 및 Wnt 억제제, 임의적으로 DKK1, IWP2 및/또는 XAV939 중 하나 이상의 것을 포함하는 축주위 중배엽 특정화 칵테일과 함께 배양하여 세포 표면 CD73, CD105 및 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단을 특정화하는 단계;
(c) (i) 무혈청 또는 혈청 함유 배지 중에서 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단을 고세포 밀도로 배양하고;
(ii) 무혈청 배지 중에서 고세포 밀도의 CD73+, CD105+ 및 PDGFR베타+ 축주위 중배엽 세포 집단을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 고세포 밀도로 제조하는 것을 포함하는, 세포 표면 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단으로부터 연골세포 전구체 집단을 생성하는 단계; 및
(d) (i) 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하거나; 또는
(ii) 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 BMP4 효능제와 함께 배양하여 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하는 단계를 포함하는, 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직, 임의적으로 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직 및/또는 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 생성하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 방법은 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 생성하기 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 생성하기 위한 것이다.
한 실시양태에서, 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 TGF 베타 효능제와 함께 배양하는 장기간이라는 시간은 예를 들어, 루브리신 및 CILP2를 발현하는 비-비대성 연골세포 유사 및/또는 연골 유사 조직을 생성하기 위한 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 10주 이상, 11주 이상, 12주 이상 또는 그 초과인 시간이다.
한 실시양태에서, 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 BMP4 효능제와 함께 배양하는 장기간이라는 시간은 콜라겐 2를 발현하는 연골 유사 조직, 또는 콜라겐 10을 발현하는 비대성 연골 세포를 생성하기 위한 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 10주 이상, 11주 이상, 12주 이상 또는 그 초과인 시간이다.
연골세포 유사 세포를 생성하는 방법은
(a) 무혈청 또는 혈청 함유 배지 중에서 연골세포 전구체 세포를 고세포 밀도로 배양하는 단계;
(b) 무혈청 배지 중에서 고세포 밀도의 연골세포 전구체 세포를 TGF베타 효능제와 함께 배양하는 단계; 및
(c) (i) 장기간 동안 연골세포 전구체 세포를 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 관절 연골 유사 연골세포인 세포를 제조하거나; 또는
(ii) 장기간 동안 연골세포 전구체 세포를 BMP4 효능제와 함께 배양하여 비대성 연골세포 계통 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 연골세포 전구체 세포는 일차 태아 연골세포 또는 계대된 태아 연골세포이다.
한 실시양태에서, 생성된 세포 및/또는 조직이 대상체에게 투여된다.
또 다른 실시양태에서는 또한 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직 및/또는 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직의 단리된 집단을 제공한다.
추가 측면으로는 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직 및/또는 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직의 집단, 담체, 임의적으로 PEG, 히드로겔, 골 스캐폴딩재, 골 대체용 스캐폴딩재 및/또는 마트리겔을 포함하는 조성물을 포함한다. 한 실시양태에서, 담체는 제약 등급인 것이다.
한 실시양태에서, 단리된 집단은 희석제 또는 담체, 임의적으로, 제약 희석제를 포함하는 조성물 중에 포함된다. 한 실시양태에서, 희석제는 임의적으로 냉동 보존제, 예컨대, 글리세롤 및/또는 DMSO, 혈청 및 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민을 포함하는 배양 배지이다.
추가 측면은 본원에 기술된 세포 또는 조성물, 및 스캐폴드를 포함하는 연골 및/또는 골 조직 제품을 포함한다.
또 다른 측면은 본원에 기술된 방법을 사용하여 생성된 세포 및/또는 조직을 투여하는 단계, 및/또는 본원에 기술된 연골 및/또는 골 조직 제품을 이식시키는 단계를 포함하는, 증상 완화 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체의 증상을 완화시키고/거나 상기 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
또 다른 측면에서는 또한 증상 완화 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체의 증상을 완화시키고/거나 상기 대상체를 치료하기 위한, 본원에 기술된 방법을 사용하여 생성된 세포 및/또는 조직, 및/또는 상기 세포 및/또는 조직을 포함하는 연골 및/또는 골 조직 제품의 용도를 제공한다.
추가 측면은
(a) 만능 줄기 세포의 출발 집단을 원시선 유도 칵테일과 함께 배양하여 CD56 및 PDGFR-알파를 발현하는 원시선-유사 중배엽 세포 집단 (예컨대, 0 단계)을 유도하는 단계;
(b) CD56 및 PDGFR-알파를 발현하는 원시선-유사 중배엽 세포 집단을,
(i) FGF 효능제; 및
(ii) BMP 억제제, 임의적으로 노긴, LDN-193189, 도소모르핀; 및
(iii) TGF베타 억제제, 임의적으로 SB431524; 및 Wnt 억제제, 임의적으로 DKK1, IWP2, 및/또는 XAV939 중 하나 이상의 것을 포함하는 축주위 중배엽 특정화 칵테일과 함께 배양하여 세포 표면 CD73, CD105 및 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단을 특정화하는 단계를 포함하는, 축주위 중배엽 세포 집단을 생성하는 방법을 포함한다.
세포를 단리하는 방법 및 스크리닝 검정 또한 제공한다.
본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 본 개시내용의 정신 및 범주 내에 포함된 다양한 변형 및 수정은 본 상세한 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백해질 것이며, 상세한 설명 및 구체적인 일례는 본 개시내용의 바람직한 실시양태를 제시하지만, 이는 단지 예시로 제공되는 것임을 이해하여야 한다.
이제 본 개시내용의 실시양태는 도면과 관련하여 설명될 것이다:
도 1. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터의 축주위 중배엽, 연골세포 전조체, 및 연골 조직의 무혈청 분화. (a) hPSC는 분화 1일째 내지 4일째 배아체로서, 액티빈 A, BMP4 및 염기성 (b) FGF를 이용한 원시선-유사 중배엽 집단의 유도 (1 단계)를 비롯한, 4개의 단계로 분화된다. 4일째 (T4), 중배엽 집단을 유동 세포측정법에 의해 세포 표면 상의 CD56 및 PDGFRa 발현에 대해 모니터링한다 (b). 4일째 내지 6일째 도소모르핀, BMP 억제제, TGF베타 억제제 SB431542, 및 bFGF 처리에 의해, 및 4일째 내지 15일째 bFGF 처리에 의해 4일째, 중배엽 세포는 단층 배양물 중에서 축주위 중배엽 운명으로 특정화된다 (2 단계). 대략 10일 동안 마이크로매스로 명명되는 고밀도 '스폿'에 플레이팅하거나, 또는 TGFB3의 존재하에서 콜라겐으로 코팅된 막 필터 (제시하지 않음) 상에 플레이팅함으로써, 15일째, 축주위 중배엽 세포는 연골세포 전조체를 생성할 수 있다 (3 단계). 예를 들어, 12주 동안 TGFB3 (관절) 또는 BMP3 (성장판-유사)으로 장기간 자극함으로써 연골세포 전조체는 분화 4 단계 동안 연골 조직 포맷으로 관절 연골세포 또는 성장판-유사 연골세포로 특정화될 수 있다. 조직을 7개월 이상 배양물 중에 유지시켰다. 분화 3일째 유동 세포측정법에 의한 CD56 및 PDGFRa의 발현에 의해 hESC (c) 및 hIPSC (d, e) 로부터의 원시선-유사 집단의 효율적인 유도를 확인하였다. 하기 시토카인: 액티빈 A (2 ng/ml), BMP4 (3 ng/ml) 및 염기성 (b) FGF (5 ng/ml)를 이용하여 원시선 집단을 생성하도록 hESC를 유도하였다. 배아체로서 분화 1일 내지 3일째에 Wnt 경로 효능제 CHIR99061 (1 μM)의 존재 (c) 또는 부재 (d)하에서 액티빈 A (3 ng/ml), BMP4 (1 ng/ml), bFGF (5 ng/ml)를 이용하여 원시선-유사 중배엽 집단 (1 단계)을 생성하도록 hiPSC를 유도하였다.
도 2. hPSC로부터 유래된 축주위 중배엽의 특징 규명. 추가 인자로 처리되지 않은 것 (0 DM, FGF 비처리), FGF, 4 μM DM, 또는 4 μM DM+FGF로 처리된 5일째의 중배엽의 유동 세포측정법에 의한 분석. 5일째 프로파일은 KDR 및 PDGFRa 발현을 도시하고, 이중-양성 집단 (개폐형)은 심장 잠재능을 가진 중배엽을 나타낸다 (20). FGF로 처리한 결과, 5일째 PDGFRa 발현은 감소되었다. (b) 분화 15일째 중배엽 집단 상에서의 세포 표면 마커 CD73, CD105, 및 PDGFR-베타의 발현. (c) Wnt 억제 또한 CD73 및 CD105 발현율을 개선시킬 수 있다. 4일째 내지 6일째 실험 세포 처리는 wnt 경로 억제제 IWP2의 존재 또는 부재하에서의 도소모르핀, bFGF, TGF베타 억제제 (SB431542)의 조합을 포함한다. 명시된 바와 같이 유래된 15일째 중배엽 집단에 대한 CD73 및 CD105의 유동 세포측정법에 의한 분석. (d) 명시된 인자에서 유래된 15일째 중배엽 집단의 유전자 발현 분석. Nkx2.5는 심장 전사 인자이고, MeoxI 및 Nkx3.2는 축주위 중배엽 및 체절 전사 인자이다. (e) 15일째 중배엽 집단으로부터 유래된 1일된 마이크로매스 및 1주된 마이크로매스를 도시한 현미경 사진은 명시된 바와 같다. (f) 15일째 중배엽 집단으로부터 유래된 1주된 마이크로매스에서의 심장 트로포닌 T (cTnT) 발현에 대한 유세포 분석에 의한 분석은 명시된 바와 같다. (g) DM+FGF-처리 축주위 중배엽으로부터 유래된 4주된 마이크로매스는 연골 조직을 생성하였지만, FGF 단독으로 특정화된 중배엽은 연골-유사 조직을 생성하지 않았다 (비-부착성 응집체 참조).
도 3. CD73+CD105+P베타+ 세포는 연골세포 잠재능, 및 시험관내에서 연골-유사 조직을 생성할 수 있는 잠재능을 함유한다. (a) 12일 및 15일째 DM+FGF-처리 축주위 중배엽에 대한 유세포 분석에 의한 분석. 이중-양성 (CD73+CD105+ 및 CD73+P베타+) 집단을 세포 분류에 의해 이중 음성 집단으로부터 단리하고, 마이크로매스 배양물 중에 플레이팅하였다. (b) 배양 10일 후의 마이크로매스 배양물. (c) 배양 2주 후의 마이크로매스 배양물. (d) 배양 5주 후, 분류된 집단으로부터 유래된 연골 조직의 사진.
도 4. TGFB3 및 BMP4는 관절 연골 및 성장판 연골 표현형을 가진 연골세포 및 연골-유사 조직을 특정화한다. (a) TGFB3 또는 BMP4로 유도된 5주된 마이크로매스의 현미경 사진 (확대 배율 20x). (b) TGFB3 또는 BMP4로 유도된 13주된 연골 조직의 (톨루이딘 블루로 염색된) 조직의 조직학적 성질. 연골 조직이 이염성으로 톨루이딘 블루로 염색되고, 상기 조직 절편은 분홍색/보라색을 띠는데, 이는 연골 조직이 존재한다는 것을 나타낸다. (c) 3주 및 5주된 마이크로매스의 전방 및 측방 세포 산란 파라미터에 관한 유세포 분석에 의한 분석. 측방 산란은 세포 입도를 나타내고, 전방 세포 산란은 세포 크기를 나타낸다. (d) hPSC-유래된 마이크로매스 조직과 태아 일차 연골세포 유래 마이크로매스 조직 및 발생 인간 태아 대퇴골 연골 비교. 관절 연골 영역은 확대된 (비대성) 것으로 보이는 세포를 함유하는 성장판 유사 영역과 비교하여 크기가 더 작은 세포를 가지는 것으로 보인다. 마이크로매스 뿐만 아니라, 태아 대퇴골 중의 연골 조직은 톨루이딘 블루 염료로 균일하게 염색된다 (영상은 분홍색/보라색을 띠고, 이는 연골 단백질이 존재한다는 것을 나타낸다). BMP4-처리 마이크로매스 조직은 성장판 연골을 나타내는 태아 연골의 하부 패널과 유사한 다수의 비대성 세포를 포함한다. TGFB3 처리된 마이크로매스 배양물은 존재하는 경우에도 더욱 극소수의 비대성 연골세포를 함유하고, 관절 연골 부위인 태아 연골의 상부 패널과 유사한 것으로 보인다. (e) BMP4 대신 GDF5를 사용하였을 때, 비대성 연골세포가 생성되는 것인 현미경 사진. (f) 12주 후 톨루이딘 블루로 염색된, hiPSC로부터 유래된 연골 조직에 관한 조직학적 분석. (g, h) II형 콜라겐 (g, 8주 조직), 및 루브리신 (h, 12주 조직)에 대한 hESC-유래된 연골 조직의 면역조직화학적 염색.
도 5. 각각 분화 3 단계 및 4 단계 동안 TGFB3 또는 BMP4의 존재하에서 연골세포 특정화의 유전자 발현 분석. 일반적인 연골세포 유전자 Sox9 (a) 및 콜라겐 2 (b), 비대성 유전자 콜라겐 10 (c), Runx2 (d), 오스테릭스 (e) 및 알칼리성 포스파타제 (f), 관절 연골 관련 유전자 루브리신 (g) 및 연골 중간층 단백질 2 (CILP2) (h), 구역간-관련 (관절 전조체) 유전자 GDF5 (i), ERG (j) 및 Wnt9a (k). 발현은 TBP에 대해 상대적인 카피수이고 (n = 3 내지 8개의 생물학적 복제물), 일차 태아 연골세포 (16 내지 19주된 것, n = 4), 일차 건강한 성인 관절 연골세포 (n = 2), 및 성인의 장골 능선으로부터 단리된 성장판-유사 연골세포 (n = 1). T15 중배엽은 15일째의 hESC-유래된 축주위 중배엽 (DM+FGF-처리)을 나타낸다. 오차 막대는 s.e.m.을 나타낸다.
도 6. CD73은 관절 연골세포에 의해 발현된다. 일차 연골세포인, (a) 건강한 성인 관절 연골세포 및 장골 능선 GPC-유사 연골세포, (b) 일차 태아 연골세포, TGFB3 또는 BMP4의 존재하에서의 마이크로매스 배양 9 내지 10주 후의 일차 (c) 또는 계대된 (계대 (P)2, d) 태아 연골세포, 및 (e, f) TGFB3 또는 BMP4의 존재하에서 유래된 11주 후의 hPSC-유래된 연골세포에 대한 유동 세포측정법에 의한 분석. (g) 3일, 10일, 및 2주 후의 TGFβ3로 처리된 T12 및 T15 축주위 중배엽 집단, 및 마이크로매스 배양물 상에서의 시간 경과에 따른 CD73 및 PDGFR-베타 세포 표면 발현. (h) 3일, 7일, 10일, 및 2 내지 5주 후의 TGFβ3-처리 마이크로매스 상에서의 시간 경과에 따른 CD73 발현.
도 7. hPSC-유래된 연골세포는 생체내에서 각각 관절 또는 비대성 연골세포 표현형을 유지한다. TGFβ3 또는 BMP4로 처리된 (8-12주된) 마이크로매스 조직을 콜라게나제로 처리하여 해리시키고, 연골세포를 12주 동안 면역결핍 마우스 내로 피하 주사하였다. 12주 후 이식편을 수거하고, 조직학적으로 분석하였다. 프로테오글리칸의 존재를 나타내기 위해 톨루이딘 블루로 (a, c), 및 무기질화 부위를 확인하기 위해 본 코사 (b)로 절편을 염색하였다. II형 (d) 및 X형 콜라겐 (e)을 면역조직화학적으로 검출하였다. 생체내에서 12주 후, TGFβ3-처리 연골세포-유래된 이식편은 II형 콜라겐에 대하여 양성으로 염색되었고 (d), 톨루이딘 블루로 이염성으로 염색되었고 (a, c), 본 코사 (b) 또는 X형 콜라겐 양성 (e) 부위는 관찰되지 않았다. 무기질화 부위 (b) (본 코사 양성, 검은색)는 12주 후 BMP4-처리 연골세포로부터 유래된 이식편에서 확인되었지만, 상기 부위는 프로테오글리칸은 거의 함유하지 않았고 (a, c), II형 (d) 및 X형 콜라겐 (e)에 대해 양성으로 염색되었으며, 이는 석회화된 연골이 발생되었음을 나타낸다.
도 8. TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3은 hPSC-유래된 축주위 중배엽으로부터 관절 연골세포를 생성하였다. 명시된 바와 같은 TGFβ 효능제 (10 ng/ml)의 존재하에 12주간의 마이크로매스 배양 후 COL2A1, 루브리신, 및 CILP2 유전자 발현. 값은 TBP에 대해 상대적인 mRNA 카피수를 나타낸다. 오차 막대는 s.e.m.을 나타낸다.
도 9. hPSC-유래된 관절-유사 연골은 염증유발성 분자 IL1β에 대하여 적절하게 반응한다. (a) 실험 계획이 도시되어 있다. TGFβ3의 존재하에서 10주 동안 hPSC로부터 관절 연골 조직이 유래되도록 하였다. 연골 조직 (마이크로매스)을 2주 동안 (10-12주째) 명시된 바와 같이 TGFβ3 또는 IL1β (10 ng/ml)로 처리하였다. 연골 조직을 조직학적으로 분석하거나, 유전자 발현 분석을 위해 해리시켰다. hPSC-유래된 관절 연골세포는 외인성 IL1β에 대한 반응으로 MMP13 (b), MMP2 (c), ADAMTS4 (d) 및 ADAMTS5 (e)의 발현을 유의적으로 상향조절하였다. (f, g) 세포외 기질 성분을 코딩하는 유전자인 COL2A1 및 ACAN은 IL1β에 대한 반응으로 유의적으로 하향조절된다. (h, i) 표재 영역 연골세포 유전자인 PRG4 (루브리신) 및 CILP2의 발현은 IL1β의 존재하에서 하향조절되었다. (j) VEGF는 IL1β의 존재하에서 상향조절되었다. 값은 TBP에 대해 상대적인 mRNA 카피수를 나타낸다 (n=7). 오차 막대는 s.e.m.을 나타낸다. (k) 명시된 바와 같이 처리한 후 12주째 조직에 대한 조직학적 분석. 이염성 톨루이딘 블루 염색은 프로테오글리칸을 나타낸다.
1. 정의
본원에 사용되는 바와 같이, "원시선-유사 중배엽 세포 집단"이라는 용어는 브라키우리(Brachyury) 및 세포 표면 마커인 CD56 및 PDGFR알파를 발현하는 중배엽 세포 집단을 의미한다. 예를 들어, 원시선-유사 중배엽 세포 집단은 CD56 및 PDGFR알파를 발현하는 세포를 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 약 90%로 포함할 수 있다. 연골 분화는 예를 들어, 50% CD56/PDGFR알파+ 세포를 사용하여 본원에 개시된 방법을 이용함으로써 수득되었다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포 표면 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단"이라는 용어는 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타 및 축주위 중배엽 전사 인자 MeoxI을 발현하는 중배엽 세포를 의미한다. 예를 들어, 축주위 중배엽 세포 집단은 MeoxI, CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 세포를 70% 이상으로 포함한다. 도 2d에 제시된 바와 같이, MeoxI 발현은 FGF 및 도소모르핀으로 처리되지 않은 세포와 비교하여 FGF 및 도소모르핀으로 처리된 세포에서 증가되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "발현하다"라는 용어는, 분자 수준이 상기 분자를 발현하지 않는 세포에서의 것보다 분자를 발현하는 세포에서 측정가능하게 더 높은 것이 되도록 하는, 세포 내에서의 폴리뉴클레오티드의 전사, 또는 폴리펩티드의 번역을 의미한다. 분자 발현 측정 방법은 통상의 기술자에게 주지되어 있고, 제한 없이, 노던 블롯팅, RT-PCR, 계내 하이브리드화, 웨스턴 블롯팅, 및 면역염색법, 예컨대, FACS를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 세포 단백질 수준과 관련하여 "+"로도 또한 표시되는 "발현하는"이라는 용어는 예를 들어, FACS 분석에 의해 측정시에, 단백질을 발현하지 않는 세포와 비교하여 검출가능한 단백질 발현을 의미한다. FACS 분석을 사용하였을 때, 신호의 평균 형광이 항체로 염색되지 않은 세포 (비염색 대조군) 또는 항체로 염색은 되었지만, 세포 표면 상에 단백질을 발현하지 않는 세포보다 더 밝을 경우, 세포는 세포 표면 상에 단백질을 양성으로 발현하는 것으로 간주된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 세포 집단과 관련하여, "발현하는"이라는 것은 세포 집단 중 50% 이상의 세포가 마커를 발현한다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 70%, 80, 90% 또는 그 초과의 세포가 양성이고, 마커를 발현하는 것이 발현하는 세포, 예를 들어, CD73 또는 다른 마커를 발현하는 세포로 분류된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 세포 단백질 수준과 관련하여 "-"로도 또한 표시되는 "발현 결여"라는 용어는 예를 들어, FACS 분석에 의해 측정시에, 단백질을 발현하는 세포와 비교하여 검출불가능한 단백질 발현을 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 세포 집단과 관련하여, "발현 결여"라는 것은 세포 집단 중 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만의 세포가가 마커를 발현한다는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "배양하는"이라는 용어는 부착성, 현탁 또는 3D 배양으로 세포를 인큐베이션시키고/거나, 계대하는 것을 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "부착성 배양"이라는 용어는 세포를 고체 표면 상에서 배양하게 하는 세포 배양 시스템으로서, 상기 고체 표면은 결국에는 불용성 기판으로 코팅될 수 있고, 이는 결국에는 기판의 또 다른 표면 코팅제, 예컨대, 하기 열거되는 것, 또는 세포를 배양물 중에서 증식 또는 안정화시킬 수 있는 임의의 다른 화학적 또는 생물학적 물질로 코팅될 수 있는 것을 의미한다. 세포는 고체 표면에 또는 기판에 단단히 부착될 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있다. 부착 배양용 기판은 조직 배양물 처리된 플리스틱, 폴리오르니틴, 라미닌, 폴리-리신, 정제된 콜라겐, 젤라틴, 피브로넥틴, 테나신, 비트로넥틴, 엔탁틴, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸, 폴리글리콜산 (PGA), 폴리락트산 (PLA), 및 폴리락트산-폴리글리콜산 (PLGA) 중 어느 하나, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는 마트리겔(MATRIGEL)®-코팅된 플레이트 상에 플레이팅된다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 섬유넥틴-코팅된 플레이트 상에 플레이팅된다. 세포는 필터 배양물 및 마이크로매스 배양물 중에서 배양될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는 막 필터 상에, 임의적으로 트랜스웰 시스템 (밀리포어(Millipore), 알바텍스(alvatex), 두 브랜드 존재)의 일부로서 조직 배양 디쉬 내로 배치된 것 상에 플레이팅된다. 기판은 또한 골 스캐폴드 대체물, 예컨대, CPP (칼슘 폴리포스페이트) 또는 다른 제약상 이용가능한, 이용가능한 스캐폴드일 수 있다. 마이크로매스 배양물은 시판의 작은 면적에 부착되도록 허용된 고밀도 세포 현탁액으로 구성된다 (예컨대, 200,000-500,000개의 세포는 기판 중 직경이 0.2-1 cm인 원형 면적에 부착된다). 임의 형상 또는 크기의 기판이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 3D 프린팅에 의해 제조될 수 있다. 세포 배양법과 관련하여 사용되는, "현탁"이라는 용어는 관련 기술분야에서 사용되는 것처럼 사용된다. 즉, 세포 배양물 현탁은 세포가 표면에 부착되지 않는 세포 배양 환경이다. 통상의 기술자는 현탁 배양 기법에 대해 잘 알고 있을 것이며, 그러한 기법으로는 필요에 따라 장치, 예컨대, 유동 후드, 인큐베이터 및/또는 세포를 일정한 운동 상태로 유지시키는 데 사용되는 장치, 예컨대, 회전자 플랫폼, 진탕기 등을 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"접촉시키는" 또는 "~와 배양하는"이라는 용어는 세포(들) 및 세포/조직을 함께 시험관내에서 인큐베이션시키는 것 (예컨대, 화합물을 배양물 중 세포에 첨가하는 것)을 포함하는 것으로 하며, "접촉시키는" 또는 "~와 배양하는" 단계는 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 부착성 배양으로, 또는 현탁 배양으로, 또는 3D 배양으로 처리될 수 있고; 성분은 시간상 실질적으로 동시에 (예컨대, 칵테일로 함께) 또는 순차적으로 (예컨대, 제1 성분 첨가로부터 1시간, 1일 또는 그 초과 이내에) 첨가될 수 있다. 세포는 또한 세포를 안정화시키기 위해, 또는 세포를 추가로 분화시키기 위해 또 다른 작용제, 예컨대, 성장 인자, 또는 다른 분화제 또는 환경과 접촉될 수 있고, 관련 기술분야에 공지된 조건하에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 1 단계는 예를 들어, 전형적으로 현탁 배양으로 실시된다. 2 단계는 한 실시양태에서, 현탁으로 수행된다. 3 단계 및/또는 4 단계는 예를 들어, 세포가 마이크로매스 또는 필터 포맷 대신 펠릿 포맷으로 응집된 경우, 예를 들어, 현탁 배양으로 수행될 수 있다. 펠릿 배양물은 튜브 중 현탁액 중 부유될 수 있는 고밀도의 세포 클러스터이다. 한 실시양태에서, 한 단계의 일부는 현탁 또는 혼합형 현탁 및 부착성, 임의적으로, 3D 배양으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 조직은 시간 경과에 따라 비-부착성이 되고, 따라서, 4 단계의 배양 기간 중 일부 기간 동안은 현탁액으로 존재한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "고세포 밀도"라는 용어는 약 0.2 cm - 약 2 cm 직경 표면적 (2D)당 약 200,000개의 세포 - 약 1,000,000개의 세포를 의미하거나, 또는 마이크로매스와 관련하여, 배지 약 20 ㎕당 약 100,000개 이상의 세포, 또는 예를 들어, 마이크로매스 '스폿'에 대해 허용되는 작은 표면적에 세포가 부착될 수 있도록 하는 배지 약 20 ㎕당 최대 약 2,000,000개의 세포인 것이다. 막 필터의 경우, 면적은 구입된, 상업적으로 이용가능한 막에 의존하는데, 예를 들어, 세포가 부착될 수 있도록 하는 약 1cm - 약 2 cm 실린더형 막 필터 함유 인서트 중 배지 약 200 ㎕ - 약 500 ㎕당 대략 400,000개의 세포- 약 2,000,000개의 세포가 플레이팅될 수 있다. 마이크로매스 및 막 필터 배양, 둘 모두에서, 세포는 약 1-5개의 세포 층에 부착되고, 조직은 부착 이후에 '더 두껍게' 성장하도록 허용된다. 골 대체물 스캐폴드, 예컨대, CPP 상에 시딩시키는 데 유사한 세포 밀도가 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "무혈청"이란 용액, 예컨대, 주어진 세포 집단을 배양하는 데 사용되는 배지 중 혈청이 존재하지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 무혈청 배지 또는 환경은 혈청을 4, 3, 2, 또는 1% 미만으로 함유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 무혈청 조성물은 혈청을 함유하지 않거나, 또는 정의된 배지에 첨가되는 성분의 단리로부터 미량의 혈청만을 함유한다 (예컨대, 첨가되는 혈청은 0%로 함유한다).
본원에 사용되는 바와 같이, "BMP 억제제"라는 용어는 BMP 신호전달의 임의의 억제제를 의미하고, 이는 임의적으로 도소모르핀 (DM), 노긴, 코르딘(Chordin), LDN-193189, 가용성 BMPRIa, 및/또는 가용성 BMPRIb로부터 선택되는, 예를 들어, 1형 BMP 수용체 억제제, BMP 리간드 및/또는 가용성 BMP 수용체를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "FGF 효능제"라는 용어는 분자, 예컨대, 시토카인, 예를 들어, FGF, 또는 FGF 신호전달 경로를 활성화시키는, 예컨대, FGF 수용체에 결합하고, 활성화시키는 소형 분자를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "FGF"라는 용어는 임의의 섬유모세포 성장 인자를 의미하고, 임의적으로 bFGF, FGF2, FGF4, FGF9 및/또는 임의적으로 FGF 19, 21, 3, 5, 6, 8a, 16-18, 20 및/또는 23, 예를 들어, 인간 FGF1 (유전자 ID: 2246), FGF2 (bFGF로도 공지; 유전자 ID: 2247), FGF3 (유전자 ID: 2248), FGF4 (유전자 ID: 2249), FGF5 (유전자 ID: 2250), FGF6 (유전자 ID: 2251), FGF7 (유전자 ID: 2252), FGF8 (유전자 ID: 2253), FGF9 (유전자 ID: 2254) 및 FGF10 (유전자 ID: 2255) (임의적으로, 자연적으로 발생된 그의 활성 접합체 및 단편을 비롯한, 그의 활성 접합체 및 단편 포함)을 포함한다. 특정 실시양태에서, FGF는 bFGF, FGF2, FGF4, 및/또는 FGF9이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "FGF의 활성 접합체 및 단편"으로는 FGF 수용체에 결합하고, 활성화시키고, 임의적으로, FGF 신호전달을 활성화시키는, 섬유모세포 성장 인자의 접합체 및 단편을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "TGF베타 효능제" 또는 TGFβ 효능제라는 용어는 TGF베타 신호전달을 촉진시키는 임의의 분자를 의미하고, 예를 들어, TGFbI, TGFb2 및/또는 TGFb3을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "TGF베타 억제제"라는 용어는 수용체 ALK4 및 ALK7 및/또는 TGF-βRI를 억제하는 임의의 분자를 의미하고, 예를 들어, SB431542 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich)) A83-01 (토크리스(Tocris), 2929), D 4476, GW 788388, LY 364947, RepSox, SB 505124, SB 525334 (시그마 알드리치), 및 SD 208을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "BMP4 효능제"라는 용어는 BMP4에 대한 수용체를 활성화시키는 임의의 분자, 임의적으로 임의의 BMP 또는 GDF를 의미하고, 예를 들어, GDF5, GDF6, GDF7, BMP4, BMP2, BMP6, BMP7 및/또는, BMP10을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "BMP4" (예를 들어, 유전자 ID: 652)라는 용어는 골 형태 형성 단백질 4, 예를 들어, 인간 BMP4 뿐만 아니라, 예를 들어, BMP4 수용체 신호전달을 활성화시킬 수 있는, 임의적으로, 자연적으로 발생된 그의 활성 접합체 및 단편을 비롯한, 그의 활성 접합체 및 단편을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "노들 효능제"라는 용어는 간세포 계통 세포에서 노들 신호 전달을 활성화시키는 임의의 분자, 예컨대, "노들" (예를 들어, 인간 노들, 예컨대, 유전자 ID: 4338) 또는 "액티빈"을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "액티빈" 또는 "ActA"라는 용어는 "액티빈 A" (예를 들어, 유전자 ID: 3624), 예를 들어, 인간 액티빈 뿐만 아니라, 예를 들어, 노들 신호 전달을 활성화시킬 수 있는, 임의적으로, 자연적으로 발생된 활성 접합체 및 단편을 비롯한, 그의 활성 접합체 및 단편 뿐만 아니라, 자연적으로 발생된 활성 접합체 및 단편을 비롯한, 그의 활성 접합체 및 단편을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "wnt 효능제"라는 용어는 연골세포 계통 세포에서 wnt/베타-카테닌 수용체 신호전달을 활성화시키는 임의의 분자를 의미하고, 예를 들어, Wnt3a 뿐만 아니라, GSK3 선택적 억제제, 예컨대, CHIR99021 (스테몰레큘(Stemolecule)™ CHIR99021 스템젠트(Stemgent)), 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (바이오(BIO)) (케이만 케미칼(Cayman Chemical) (cat:13123)), 또는 스템젠트로부터의 스테몰레큘™ 바이오 (cat:04003)를 포함한다. CHIR99021은 GSK3의 선택적 억제제이다. 고려되는 GSK3 선택적 억제제로는 예를 들어, Wnt 신호전달 경로에서 GSK-3α/β에 대한 선택적 억제제가 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "Wnt3a"라는 용어는 날개가 없는 유형의(wingless-type) MMTV 통합 부위 패닐리, 구성원 3A 인자 (예컨대, 유전자 ID: 89780), 예를 들어, 인간 Wnt3a 뿐만 아니라, 자연적으로 발생된 활성 접합체 및 단편을 비롯한, 그의 활성 접합체 및 단편을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "Wnt 길항제" 또는 "wnt 억제제"라는 용어는 연골세포 계통 세포에서 wnt/베타 칸테닌 수용체 신호전달을 억제하는 임의의 분자를 의미하고, 이는 예를 들어, IWP2 (N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드; 시그마); Dickkopf-관련 단백질 1 (DKK1; R & D 시스템즈), 및/또는 XAV939 (3,5,7,8-테트라히드로-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-온; 시그마)를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "효능제"라는 용어는 예를 들어, 신호전달 분자의 경로의 활성 인자를 의미한다. 분자의 효능제는 분자 (예컨대, 노들)의 생물학적 활성과 같은 것, 또는 그의 서브세트를 실질적으로 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 노들 효능제는 노들 신호전달을 선택적으로 활성화시키는 분자를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "억제제"라는 용어는 예를 들어, 신호전달 분자의 경로의 선택적 억제제를 의미한다. 분자의 억제제 또는 길항제 (예컨대, BMP4 억제제)는 자연적으로 발생된 형태인 분자의 활성 중 하나 이상의 것을 억제시킬 수 있다. 예를 들어, BMP4 억제제는 BMP4 신호전달을 선택적으로 억제하는 분자이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "선택적 억제제"라는 용어는 억제제가 관련된 분자보다 1.5X, 2X, 3X, 4X 또는 10X 이상 더 효율적으로 엔티티 또는 경로를 선택적으로 억제시킨다는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "특정화하는"이라는 용어는 세포 유형이 아직 결정되기 이전에 특정 세포 운명으로 세포를 위탁하는 과정을 의미하며, 특정 운명으로 편형된 세포의 임의의 편향성은 역전되거나, 또 다른 운명으로 변환될 수 있다. 특정화는 전형적인 조건하에서는 세포의 운명이 바뀔 수 없는 상태를 유도한다. 특정화가 분화의 제1 단계이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "줄기 세포"라는 용어는 증식가능하고, 자기 재생이 가능하며, 결국에는 분화된, 또는 분화가능한 딸세포를 생성할 수 있는 다수의 모체 세포를 생성할 수 있는 능력을 가지는 더 많은 전조 또는 전구체 세포를 생성할 수 있는 미분화된 세포를 의미한다. 또한 모체 발생 잠재능을 가진 하나 이상의 세포는 유지시키면서, 딸세포는 예를 들어, 증식하도록 및 자손 세포를 생산하도록, 이어서, 순차적으로, 하나 이상의 성숙한 세포 유형으로 분화되도록 유도될 수 있다. "줄기 세포"라는 용어는 배아 줄기 세포 및 만능 줄기 세포를 포함한다.
"배아 줄기 세포"라는 용어는 배아 포배의 내부 세포 매스의 만능 줄기 세포를 의미하는 것으로 사용된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,843,780, 6,200,806 참조). 상기 세포는 또한 체세포 핵 전달로부터 유도된 포배의 내부 세포 매스로부터 수득될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,945,577, 5,994,619, 6,235,970 참조).
본원에 사용되는 바와 같이, "만능 줄기 세포"라는 용어는 상이한 조건하에서 1 초과의 분화된 세포 유형으로 분화될 수 있는 능력, 및 예를 들어, 3개의 생식 세포 층의 특징을 나타내는 세포 유형으로 분화될 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 만능 세포는 예를 들어, 누드 마우스 기형종 검정을 사용하여 1 초과의 세포 유형으로 분화될 수 있는 그의 능력을 특징으로 한다. 만능은 또한 배아 줄기 (ES) 세포 마커의 발현에 의해 입증된다. 만능 줄기 세포로는 유도성 만능 줄기 세포 (iPSC) 및 배아 줄기 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 체세포로부터 유래된 것이다. 한 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 인간 체세포로부터 유래된 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "iPSC" 및 "유도성 만능 줄기 세포"라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 예를 들어, 제한 없이, SOX2 (유전자 ID; 6657), KLF4 (유전자 ID; 9314), cMYC (유전자 ID; 4609), NANOG (유전자 ID; 79923), LIN28/LIN28A (유전자 ID; 79727)와 함께 조합된, POU4F1/OCT4 (유전자 ID; 5460)을 비롯한 하나 이상의 유전자의 발현을 유도함으로써 비-만능 세포, 전형적으로, 성인 체세포로부터 인공적으로 유래된 (예컨대, 유도된, 또는 완전한 역전에 의한) 만능 줄기 세포를 의미한다. 발현은 예를 들어, 강제 유전자 발현에 의해, 또는 소형 분자, 소형 RNA, 비-통합 유전자 발현 벡터, 또는 단백질을 사용하여 유도될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "연골세포 유사 세포"라는 용어는 연골세포인 세포, 및 세포 화학적으로 유사하고, 예를 들어, Sox9 및 콜라겐 2를 비롯한, 연골세포 마커를 발현하고, 연골세포인 세포와 같이 작용하는 세포를 의미한다. 연골세포인 세포는 관절 연골 유사 연골세포 또는 전구체, 비대 가능한 연골세포 (임의적으로 GPC 유사 세포로도 지칭된다) 또는 그의 전구체일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "연골 유사 조직"이라는 용어는 연골 조직, 및 조직학상 유사하고, 연골 마커, 예를 들어, 콜라겐 2 및 아그레칸을 발현하고, 연골과 같이 작용하는 조직 (관절 연골 조직 및/또는 성장판 연골 유사 조직 포함)을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "관절 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 조직"이라는 용어는 예를 들어, 관절 연골세포 유사 세포를 포함하는 연골 유사 조직을 비롯한, 관절 연골세포인 세포 및/또는 관절 연골세포 유사 세포를 포함하는, 임의적으로 풍부화 또는 혼합된 집단을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 조직" 또는 "GPC 유사 세포 및/또는 연골 조직"이라는 용어는 예를 들어, 비대성 연골세포 유사 세포를 포함하는 연골 유사 조직을 비롯한, 비대성 연골 세포 및/또는 비대성 연골세포 유사 세포 (예컨대, 장골 능선 연골세포)를 포함하는, 임의적으로 풍부화 또는 혼합된 집단을 의미한다.
"관절 연골 유사 조직" 또는 "연골 함유 비-비대성 연골세포-유사 세포"이라는 용어는 조직학상 유사하고, 관절 연골 마커, 예컨대, 루브리신 및/또는 CILP2를 발현하고, 관절 연골과 같이 작용한다. 예를 들어, 관절 연골은 생체내에서 안정적인 연골로 유지된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "성장판 연골 유사 조직"이라는 용어는 조직학상 유사하고, 콜라겐 X, RUNX2, SP7 및/또는 알칼리성 포스파타제를 비롯한, 성장판 연골 조직에서 발견되는 연골 마커를 발현하고, 성장판 연골과 같이 작용하는 연골 조직을 의미한다. 예를 들어, 성장판 연골은 생체내에서 새로운 골이 그 위에 형성되는 것인 스캐폴드를 제공하는 작용을 한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 단리된 세포 집단과 관련하여 "단리된 집단"이라는 용어는 혼합된 또는 이질성 세포 집단으로 제거 및 분리된 세포 집단을 의미한다. 일부 실시양태에서, 단리된 집단은 세포 단리 또는 풍부화의 근원이 되는 이질성 집단과 비교하여 실질적으로 순수한 세포 집단이다.
특정 세포 집단과 관련하여, "실질적으로 순수한"이라는 것은 전체 세포 집단을 구성하는 세포와 관련하여 세포 집단이 약 65% 이상, 바람직하게, 약 75% 이상, 약 85% 이상, 더욱 바람직하게, 약 90% 이상, 및 가장 바람직하게, 약 95% 이상 순수하다는 것을 의미한다.
"풍부화하는" 또는 "풍부화된"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 한 유형의 세포의 수율 (분율)이 출발 배양물 또는 제제 중 상기 유형의 세포의 분율에 비하여 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상 또는 약 60% 이상만큼 증가되었다는 것을 의미한다. 풍부화하는 것, 및 부분적으로 정제시키는 것은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
상이한 방법, 예컨대, 마커, 예컨대, 세포 표면 마커에 기초한 방법 (예컨대, FACS 분류 등)을 사용하여 세포 집단을 풍부화할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "대상체"라는 용어는 예컨대, 영장류, 예컨대, 인간, 원숭이, 또는 유인원, 개, 고양이, 소, 말, 염소, 돼지, 토끼, 양 또는 설치류, 예컨대, 래트, 또는 마우스를 비롯한, 포유동물을 포함하는 동물계의 모든 구성원을 포함하며, 적합하게는 인간을 의미한다.
단리된 세포에 적용되는 바와 같이, "처리하다," "처리하는," "처리"라는 용어 등은 세포를 임의 종류의 공정 또는 조건에 가하거나, 세포에 대하여 임의 종류의 조작 또는 절차를 수행하는 것을 포함한다. 대상체에게 적용되는 바와 같이, 상기 용어는 대상체에게 의학적 또는 외과적 처리, 돌봄, 또는 관리를 제공하는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 대상체에게 적용되는 바와 같이 "치료"라는 용어는 임상적 결과를 비롯한, 유익한 또는 원하는 결과를 얻고자 하는 접근법을 의미하며, 관절/골 장애 치료를 위한 예를 들어, 제약적 개입, 수술, 방사선 요법 및 자연 요법적 개입 뿐만 아니라, 검사 치료를 비롯한 의학적 시술 및 적용을 포함한다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과로는 검출가능한지 또는 검출불가능한지 여부와는 상관 없이, 하나 이상의 증상 또는 병증의 경감 또는 완화, 질환 정도 감소, 질화 상태 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질환 확산 예방, 질환 진행 속도 지연 또는 저속화, 질환 상태 완화 또는 일시적 완하, 및 (부분적인지 또는 전체적인지 상관 없이) 관해를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "투여하는," "임플란트하는," 및 "이식하는"이라는 용어는 결과적으로는 도입된 세포를 원하는 부위에 적어도 부분적으로 국재화시키는 방법 또는 경로에 의해 본원에 기술된 세포 조직 및/또는 생성물을 대상체 내로 전달하는 것과 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 세포는 관절로 직접 임플란트될 수 있거나, 또는 대안적으로, 임플란트된 세포 중 적어도 일부 또는 세포의 성분은 생존가능한 상태 그대로 남아있는 대상체 내의 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절하 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 개시내용의 범주를 이해할 때, 본원에 사용되는 바와 같이, "~을 포함하는(comprising)"이라는 용어 및 그의 파생어는 언급된 특징, 요소, 성분, 군, 정수, 및/또는 단계가 존재한다는 것을 명시하지만, 다른 언급되지 않은 특징, 요소, 성분, 군, 정수, 및/또는 단계의 존재도 배제시키지는 않는 것인 개방형 용어인 것으로 한다. 상기 용어는 또한 유사한 의미를 가지는 단어들, 예컨대, "~을 포함하는(including)," "가지는"이라는 용어 및 그의 파생어에도 적용된다. 마지막으로, 본원에 사용되는 바와 같이, 정도를 나타내는 용어, 예컨대, "실질적으로," "약" 및 "대략"이라는 용어는 최종 결과에는 유의적인 변화가 없도록 하는 수식된 용어의 합리적인 편차량을 의미한다. 이러한 정도를 나타내는 용어는 상기와 같은 편차가 수식되는 단어의 의미를 무효화하지 않는다면, 수식되는 용어의 ±5% 이상의 편차를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 개시내용의 범주를 이해할 때, 본원에 사용되는 바와 같이, "~으로 이루어진"이라는 용어 및 그의 파생어는 언급된 특징, 요소, 성분, 군, 정수, 및/또는 단계가 존재한다는 것을 명시하고, 다른 언급되지 않은 특징, 요소, 성분, 군, 정수, 및/또는 단계의 존재는 또한 배제시키는 것인 폐쇄형 용어인 것으로 한다.
본원에서 종점으로 수치 범위를 언급한 것은 그 범위 내에 포함된 모든 수치 및 분수값을 포함한다 (예컨대, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4, 및 5를 포함한다). 모든 수치 및 그의 분수값은 "약"이라는 용어로 수식되는 것으로 추정된다는 것도 이해하여야 한다. 추가로, "단수 형태"는 문맥상 달리 명백하게 명시되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. "약"이라는 용어는 언급된 수치의 ±0.1 내지 50%, 5-50%, 또는 10-40%, 바람직하게, 10-20%, 더욱 바람직하게, 10% 또는 15%를 의미한다.
추가로, 특정 섹션에서 기술된 정의 및 실시양태는 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 적합한 것으로 기술된 본원의 다른 실시양태에도 적용가능한 것으로 한다. 예를 들어, 하기 구절에서 본 발명의 상이한 측면이 더욱 상세하기 정의된다. 그렇게 정의된 각 측면은 달리 명백하게 명시되지 않는 한, 임의의 다른 측면 또는 측면들과 함께 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나, 또는 이로운 것으로 명시된 임의의 특징은 바람직하거나, 또는 이로운 것으로 명시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 함께 조합될 수 있다.
2. 방법 및 생성물
여기서는 인간 만능 줄기 세포 (PSC)로부터 축주위/연골발생 중배엽 세포를 제조하는 방법; 관절 연골 마커인 루브리신을 발현하고, 예를 들어, 조직학상 무릎 관절의 인간 연골 조직과 구별되지 못하는 관절 연골-유사 조직을 시험관내에서 생성하는 방법; 뿐만 아니라, 인간에서 발견되는 제2 유형의 연골이고, 비대화되는 그의 성향에 기인하여 장골의 성장을 담당하고, 콜라겐 10을 발현하는 연골인, 성장판-유사 특성을 가지는 연골-유사 조직을 제조하는 방법을 기술한다. 본원에 기술된 방법을 사용하여 제조된 연골세포인 세포는 이식 후 안정적이며, 그의 관절 연골 유사 또는 성장판 연골 유사 특성을 유지하는 것으로 추가로 입증된다. 추가로, CD73 세포 표면 마커는 관절 연골세포에 의해 발현되는 것으로 나타났다.
본원에서 CD73은 일차 성인 및 태아 건강한 연골세포 뿐만 아니라, hESC-유래된 관절-유사 연골세포에 의해 발현되지만, hESC로부터 유래된 성장판-유사 연골세포 상에서는 발현되지 않는 것으로 입증된다.
한 실시양태에서, 기술된 본 방법은 축주위/연골발생 중배엽 (CD73+CD105+PDGFR베타+) 뿐만 아니라, 예를 들어, 무릎의 인간 연골과 닮은 조직화된 연골-유사 조직을 생성하기 위해 무혈청 방법을 사용한다. 본원에 개시된 무혈청 방법은 세포 및 조직 기반 조작 전략법에 유용하고, 예를 들어, 관절 연골 대체를 위해 사용될 수 있다. 상기 세포는 또한 골관절염 환자에서 연골 분해에 관여할 수 있는 분자를 확인하는 데, 자가 연골세포 이식술에의 잠재적인 적용을 위해 상기 연골세포의 시험관내에서의 확장을 허용할 수 있는 분자를 확인하는 신약 개발 적용을 위해, 또는 골관절염을 약화시킬 수 있는 약물로 유용하다. 추가로, 만능 줄기 세포-유래된 관절 및 성장판-유사 연골 조직, 둘 모두에의 접근으로 골관절염 뿐만 아니라, 다른 관절 및 골 장애 치료를 위한 세포 및 조직 기반 요법을 개발할 수 있게 될 것이다.
본원에서는 예를 들어, 단기간 (예컨대, 10일) 동안 TGFb3, TGFb2 또는 TGFbI을 함유하는 무혈청 배지 중에서 축주위 중배엽 집단의 고밀도 배양으로 달성될 수 있다는 것이 입증된다. 연속된 또는 장기간의 TGFβ 효능제 자극은 관절 연골 특징 (조직학적 성질 및 유전자 발현)을 가지는 연골 조직을 생성하는 반면, BMP4를 이용한 자극은 비대성 연골세포를 함유하는 성장판-유사 연골 조직을 유도한다.
예를 들어, 12주 동안에 걸쳐, 또는 더욱 장기간, 임의적으로 14주인 기간에 걸쳐 장기간 배양을 수행하였고, 그 기간 동안 조직의 루브리신+ 또는 콜라겐 10+ 연골 조직으로의 성숙화가 일어난 것으로 입증되었다.
본원에 기술된 방법을 사용하는 경우, 비록 일부 실시양태에서는 사용될 수도 있지만, 다른 세포와 공동 배양할 필요도 없고, 배지 또는 스캐폴드를 조절할 필요도 없다.
세포 표면 마커인 CD73 발현은 건강한 일차 성인 및 태아 관절 연골세포의 특징이 되는 것으로 입증되었지만, 이는 장골 능선의 성인 성장판 연골세포에서는 발현되지 않는다. 일차 건강한 관절 연골세포와 유사하게, hESC-유래된 관절-유사 연골세포 (TGFB3-처리)는 CD73을 발현한다. 반대로, hESC-유래된 성장판-유사 연골세포 (BMP4-처리)는 유의적으로 더 적은 CD73을 발현한다. 상기 마커는 상기 두 연골세포의 서브집단을 구별하는 데 사용될 수 있는데, CD73은 일차 및 hESC-유래된 관절 연골세포, 둘 모두에 의해 발현되지만, 성장판 유사 연골세포 상에서는 (실질적으로) 발현되지 않는다.
따라서, 개시된 한 측면은
(a) 원시선-유사 중배엽 세포 집단, 임의적으로, CD56+ 및/또는 PDGFR알파+ 원시선-유사 중배엽 집단을,
(i) FGF 효능제;
(ii) BMP 억제제, 임의적으로 노긴, LDN-193189, 도소모르핀; 및
(iii) 임의적으로 TGF베타 억제제, 임의적으로 SB431542; 및 wnt 억제제 중 하나 이상의 것을 포함하는, 축주위 중배엽 특정화 칵테일과 함께 배양하여 세포 표면 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단을 특정화하는 단계;
(b) (i) 무혈청 또는 혈청 함유 배지 중에서 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단을 고세포 밀도로 배양하고;
(ii) 무혈청 배지 중에서 고세포 밀도의 CD73+, CD105+ 및/또는 PDGFR베타+ 축주위 중배엽 집단을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 고세포 밀도로 제조하는 것을 포함하는, 연골세포 전구체 집단을 생성하는 단계;
(c) (i) 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하거나; 또는
(ii) 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 BMP4 효능제와 함께 배양하여 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하는 단계를 포함하는, 연골세포 및/또는 연골, 임의적으로 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직 및/또는 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 생성하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, TGF베타 효능제는 TGFbI, TGFb2, TGFb3 및/또는 그의 조합으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, TGF베타 효능제는 TGFbI이다.
본원에 기술된 방법에서, 효능제, 억제제 또는 성분은 특정 기간 동안 기간의 1일??에 첨가될 수 있거나, 또는 예를 들어, 배지 교체를 통해 일정 기간 동안 반복적으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, FGF는 예를 들어, 4일째에 요구되고, 이는 15일째까지 배양 배지 교체를 이용하여 첨가된다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 단계 또는 모든 단계에서 사용되는 배지는 무혈청 배지이다. wnt 길항제 (예컨대, wnt 경로 억제제)는 유도된 PSC로부터 유래된 원시선 중배엽 집단을 유도할 때, CD73 및 CD105 발현을 증가시킬 수 있는 것으로 입증된다.
한 실시양태에서, 본 방법은 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 생성하기 위한 것이고, 단계 c)는 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, BMP4 효능제는 BMP4이다.
또 다른 실시양태에서 본 방법은 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 생성하기 위한 것이고, 단계 c)는 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 BMP4 효능제와 함께 배양하여 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, TGF베타 억제제는 SB431542 A 83-01, D 4476, GW 788388, LY 364947, RepSox, SB 431542, SB 505124, SB 525334, SD 208 (예컨대, 수용체 ALK4 및 ALK7 및/또는 TGF-βRI의 임의의 억제제)로부터 선택된다.
중배엽 특정화 칵테일과 접촉시키는 원시선-유사 중배엽은 예를 들어, CD56+ 및 PDGFR알파+이지만, 이는 심장 근육 세포 특이적 전구체 분화 마커를 발현하지 않는다.
한 실시양태에서, 중배엽 특정화 칵테일은 TGF베타 억제제, 임의적으로 SB431524를 포함한다.
한 실시양태에서, 원시선-유사 중배엽 세포 집단을 2일 (임의적으로, T3-5), 3일 또는 4일 이상 동안 TGF베타 억제제와 함께 배양한다.
한 실시양태에서, 중배엽 특정화 칵테일은 Wnt 억제제, 임의적으로 DKK1, IWP2, 또는 XAV939를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, Wnt 억제제는 예를 들어, CD73 및 CD105 또는 PDGFR베타를 발현하는 세포의 비율이 70% 미만, 60%, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만 또는 20% 미만일 경우에 첨가된다.
CD73 및 CD105 또는 PDGFR베타를 발현하는 세포의 비율은, Wnt 길항제가 분화 2 단계 동안 약 2일 동안에 걸쳐 사용될 경우에 증가될 수 있다. 한 실시양태에서, 중배엽 특정화 칵테일은 임의적으로, 2일, 3일 또는 4일 동안 wnt 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, 출발 원시선-유사 중배엽 집단은 약 4일째까지 유도되고 (예컨대, KDR+/PDGFR알파+ 세포는 예를 들어, 5일째에 출현하고), 이는 예를 들어, CD73, CD105 및 PDGFR-베타 마커를 유도함에 따라 축주위 중배엽 특정화 기간 동안 BMP 억제 및 FGF에 대한 반응으로 상향조절된다.
한 실시양태에서, 축주위 중배엽 집단은 배아체, 단층 배양물 및/또는 그의 조합에 포함되어 있다.
축주위 중배엽 집단은 예를 들어, CD73 및 CD105 및/또는 PDGFR-베타를 비롯한, 세포 표면 마커의 발현에 기초하는 세포 분류 방법을 사용하여 비효율적인 분화로부터인 것을 포함하는, 임의의 배양물로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, CD73, CD105 및 PDGFR베타 세포를 풍부화함으로써 이루어진다. 축주위 중배엽 집단은 또한 대상체로부터 수득된 유도성 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 제조될 수 있다.
따라서, 추가의 측면은
(a) 만능 줄기 세포의 출발 집단을 원시선 유도 칵테일과 함께 배양하여 CD56 및/또는 PDGFR-알파를 발현하는 원시선-유사 중배엽 세포 집단을 유도하는 단계;
(b) 원시선-유사 중배엽 세포 집단을,
(i) FGF 효능제;
(ii) BMP 억제제; 임의적으로 노긴, LDN-193189, 도소모르핀; 및
(iii) 임의적으로, TGF베타 억제제, 임의적으로 SB431524; 및 wnt 억제제 중 하나 이상의 것을 포함하는 축주위 중배엽 특정화 칵테일과 함께 배양하여 세포 표면 CD73, CD105 및 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단을 특정화하는 단계;
(c) (i) 임의적으로 무혈청 또는 혈청 함유 배지 중에서 세포 표면 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단을 고세포 밀도로 배양하고;
(ii) 무혈청 배지 중에서 고세포 밀도의 CD73+, CD105+ 및/또는 PDGFR베타+ 축주위 중배엽 집단을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 고세포 밀도로 제조하는 것을 포함하는, 연골세포 전구체 집단을 생성하는 단계; 및
(d) (i) 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하거나; 또는
(ii) 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 BMP4 효능제와 함께 배양하여 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하는 단계를 포함하는, 연골세포 및/또는 연골, 임의적으로 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직 및/또는 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 생성하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 방법은 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 생성하기 위한 것이고, 단계 d)는 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGF베타 효능제, 임의적으로 TGF베타1, 2 및/또는 3과 함께 배양하여 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하는 것을 포함한다. 다른 단계에서 사용되는 TGF베타 효능제는 동일하거나, 또는 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 연골세포 전구체 집단을 생성하는 데 사용되는 TGF베타 효능제는 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하기 위해 장기간 동안 사용되는 것과 동일한 TGF베타 효능제이다. 또 다른 실시양태에서, 연골세포 전구체 집단을 생성하는 데 사용되는 TGF베타 효능제는 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하기 위해 장기간 동안 사용되는 것과 상이한 TGF베타 효능제이다.
또 다른 실시양태에서, 본 방법은 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 생성하기 위한 것이고, 장기간 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 BMP4 효능제와 함께 배양하여 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 원시선 유도 칵테일은 노들 효능제, 예컨대, 액티빈 A, BMP4 효능제, FGF 효능제 및 wnt 효능제를 포함한다.
본원에 개시된 방법에 따라, 출발 집단의 단계에 따라 연골세포 및/또는 관절 유사 연골 및 비대성 연골을 생성하는 데에는 전형적으로 4 "단계"까지 존재하고, 1. 원시선 유도; 2. 축주위 중배엽 특정화; 3. 연골세포 유사 세포 생성, 및 4. 연골 유사 조직 생성을 포함한다. 출발 집단에 따라, 본 방법은 또한 배양물 중에서 hPSC로부터 배아체를 제조하거나, 또는 자가 재생 배양 배지의 존재 또는 부재하에 배양물 중에서 hPSC로부터 단일 세포 현탁액을 생성함으로써 PSC의 응집을 생성하는, 체세포로부터 유도성 만능 줄기 세포를 생성하는 것을 포함하는 0 단계를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 인간 ESC 및 조직으로부터 연골세포 및 연골 조직을 생성하기 위한 것이다. 상기 단계를 포함하는 실시양태는 하기에서 추가로 상세하게 기술된다.
1 단계 - 원시선 유도
인간 원시선 중배엽은 예를 들어, 분화 1일째 및 4일째, 및/또는 1일 내지 4일째에 만능 세포를 원시선 유도 칵테일, 예를 들어, 액티빈, BMP4 및 염기성 FGF와 접촉시킴으로써 유도된다. 일부 실시양태에서, CD56+/PDGFRa+ 집단이 좀 더 빨리 생성되는 경우에는 1일째 내지 3일째 동안 접촉을 수행한다. 내인성 Wnt 신호전달이 없거나, 또는 낮은 세포주 및 출발 집단에서, Wnt 효능제를 첨가하면 PSC로부터의 원시선 형성률은 개선될 수 있고, Wnt 신호전달을 길항제로 차단시키면서, 원시선 형성을 억제된다. 내인성 Wnt 신호전달은 예를 들어, 실시예에 기술된 세포주 (예컨대, HES2)에서는 충분한다. iPSC 세포주를 사용한 경우, Wnt 효능제는 1일째 내지 3일째 첨가되었을 때, CD56+PDGFRa+ 원시선-유사 집단의 발생을 개선시킨 것으로 나타났다.
한 실시양태에서, wnt 효능제는 Wnt3a 또는 GSK-3 선택적 억제제, 예컨대, CHIR-99021 (스테몰레큘™ CHIR99021 스템젠트), 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (바이오) (케이만 케미칼 (cat:13123)), 또는 스템젠트로부터의 스테몰레큘™ 바이오 (cat:04003)이다.
브라키우리 발현은 또한 대략 2-3일째 유전자 발현에 의해 모니터링시에, 상기 시간 동안 유도되고, 세포 표면 마커 PDGFRa 및 CD56의 발현은 4일째까지 유도된다. 인간 PSC에서, PS-유사 중배엽 유도는 액티빈 및 wnt 신호전달에 의존하고 (예를 들어, 19 20 참조), 브라키우리 및 PDGFRa 발현에 의해 모니터링된다. CD56은 예를 들어, 인간 원시선 세포 형성을 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
2 단계 - 축주위 중배엽
다음 단계는 전사 인자 MeoxI 및 Nkx3.2의 발현을 특징으로 하는 축주위 중배엽 생성이다. 원시선 (PS)-유사 세포는 예를 들어, 상기 단계 동안 (예컨대, 4-6일째 동안) 단층 배양물 중에서 축주위 운명으로 특정화될 수 있고, BMP 신호전달은 소형 분자, 예컨대, 도소모르핀을 사용하여 억제될 수 있고, TGFb 신호전달은 소형 분자, 예컨대, SB431542를 사용하여 억제될 수 있다. 인간 축주위 중배엽은 FGF (예컨대, bFGF)의 첨가를 필요로 하고, 이는 예를 들어, 단층 배양 4일 내지 15일 사이에 배양 배지에 첨가된다. 일부 실시양태에서, wnt 길항제 또한 첨가된다. 인간 축주위 중배엽의 출현은 CD73, CD105, 및 PDGFR베타를 비롯한, 세포 표면 마커의 발현을 특징으로 한다.
인간 축주위 중배엽은 예를 들어, 단층 배양 동안 분화 4 내지 15일째에 BMP 억제제 도소모르핀 (예컨대, 4-6일째) 및 bFGF로 특정화될 수 있다. 15일째에 인간 축주위 중배엽은 세포 표면 마커 CD73, CD105, PDGFR베타의 발현, 및 15일째에 MeoxI 및 Nkx3.2 유전자 발현을 특징으로 한다. 상기 마커의 발현은 예를 들어, 12일째에 시작되고, 예를 들여, 약 15일째에 최대가 된다.
3 단계 - 연골세포 생성 및 4 단계 - 조직 생성
예를 들어, 15일째부터 축주위 중배엽은 고세포 밀도 연골 조직 형성 검정, 예컨대, 마이크로매스 또는 필터 배양물로 직접 플레이팅될 수 있다. 한 실시양태에서, 연골형성은 TGFb 효능제로, 예를 들어, TGFb3과 함께 약 10일 내지 약 2주 동안 배양함으로써 유도되고, 이는 Sox9 및 콜라겐 2의 발현을 특징으로 한다. BMP4 효능제, 예컨대, BMP4 또는 GDF 함유 배지로 교체하면 비대성 연골세포 표현형이 유도된다. 임의적으로 TGFbI 또는 TGFb3을 이용하여 장기간 동안 TGFb 효능제로 처리하면, hESC-유래된 연골세포 및 연골 조직에서는 관절 연골세포 유사 표현형이 유도되고, GDF5로는 또한 비대성 표현형이 유도된다.
인간 축주위 중배엽으로부터의 연골세포는 15일째에 CD73+/CD105+ 또는 CD73+/PDGFR베타+ 세포를 고세포 밀도로 TGF 효능제, 예컨대, TGFbI 또는 TGFb3을 함유하는 무혈청 배지 중 마이크로매스 또는 필터 배양물에 직접 플레이팅함으로써 생성된다. 연골 조직은 TGFb 효능제 또는 BMP4 효능제로 장기간 처리함으로써 상기 고세포 밀도 배양 단계 동안에 생성된다.
임의의 인간 배아 줄기 세포 집단은 유도성 만능 줄기 세포 집단을 포함하는 출발 집단으로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 출발 집단은 인간 배아 줄기 세포 집단 (hESC) 또는 유도성 만능 줄기 세포 집단 (iPSC), 임의적으로 일차 hESC 및/또는 일차 iPSC이다. 다수의 인간 ESC 세포주는 상업적으로 이용가능하고, 예를 들어, NIH HESC 등록부에 열거되어 있다. 한 실시양태에서, 인간 ESC 집단은 임의적으로, HES2, H1, H9, 또는 임의의 NIH ESC 등록부로부터 이용가능한 hESC 세포주; 또는 임의의 인간 iPS 세포주, 예컨대, 임의의 상업적으로 이용가능하고 iPS 세포주, 예를 들어, 시스템 바이오사이언시즈(System Biosciences)로부터 이용가능한 것으로부터 선택되는 세포주이다.
한 실시양태에서, 출발 집단은 배아체로 응집된다. 또 다른 실시양태에서, 출발 집단은 단층으로 배양된다.
한 실시양태에서, 출발 집단을 심장 근육 세포 특정화 이전에 약 1 내지 약 5일 동안 원시선 유도 칵테일과 함께 접촉시킨다. 한 실시양태에서, 원시선 유도 칵테일은 액티빈 효능제, 임의적으로 액티빈 A 또는 노들, BMP4 효능제, 임의적으로 BMP4, BMP2, BMP6, BMP7 및/또는, BMP10, 및 FGF 효능제, 임의적으로 bFGF, FGF2, FGF4, FGF9 및/또는 임의적으로 FGF 19, 21, 3, 5, 6, 8a, 16-18, 20 및/또는 23을 포함한다. 한 실시양태에서, 원시선 유도 칵테일은 wnt 효능제, 임의적으로 Wnt3a 및 GSK3b 억제제, 예컨대, 예컨대, CHIR-99021 (스테몰레큘™ CHIR99021 스템젠트), 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (바이오) (케이만 케미칼 (cat:13123)), 및/또는 스템젠트로부터의 스테몰레큘™ 바이오 (cat:04003)로부터 선택되는 wnt 효능제를 추가로 포함한다.
원시선-유사 중배엽 집단은 예를 들어, 유동 세포측정법에 의해 측정되는 바와 같이 (도 1b), CD56 및 PDGFR알파, 둘 모두를 발현한다. 일부 세포주에서, 유도는 T1 (1일째) 내지 T4 (실시예에서 사용되는 HES2 hESC 세포주의 경우에서와 같이)가 소요된다. 예컨대, iPSC와 같은 다른 세포주에서, 예를 들어, 상기 유도에는 단지 2일이 소요될 수 있다 (T1-T3). 세포 표면 마커, 예컨대, CD56 및 PDGFR알파의 출현은 1 단계가 완료되고, 2 단계가 시작될 수 있음을 나타낸다.
도 1a에 제시된 프로토콜을 하기와 같이 변형시킴으로써 hiPSC를 분화시켰다; Wnt 경로 효능제 CHIR99061 (1 마이크로몰)을 1 단계 배양물에 첨가하고, 1 단계를 3일에서 2일로 단축시켰다. 3일째 내지 5일째에 도소모르핀 (DM) 및 SB431542로 처리하고, 3일째 내지 14일째에 FGF로 처리하여 단층 배양물 중에서 축주위 중배엽 운명을 특정화하였다 (2 단계).
한 실시양태에서, iPSC는 3일간 유도를 받고, 또 다른 실시양태에서, iPSC 집단은 2일간 유도를 받는다. 한 실시양태에서, hESC 집단은 2일간 유도를 받고, 또 다른 실시양태에서, hESC 집단은 3일간 유도를 받는다.
2 단계는 2개의 단계로 간주될 수 있는데, 이를 통해 CD73, CD105, 및/또는 PDGFR-베타 발현을 특징으로 하는 집단이 생성된다. 세포를 BMP 억제제 (예컨대, 예컨대, 도소모르핀) 및 FGF 효능제, 예컨대, 염기성 FGF의 존재하에서 단층 배양물 중에 플레이팅할 수 있다. 도소모르핀은 예를 들어, 4일째 내지 6일째인 창 (T4-T6)에서 심장 근육 세포 특정화를 억제하는 데 효과적이고, 도소모르핀으로 처리하는 것은 상기 2일간의 기간으로 제한될 수 있다. FGF 효능제, 임의적으로 염기성 FGF는 예를 들어, 단층 배양물 지속 기간 동안 중배엽 집단을 축주위 중배엽 운명으로 특정화시키는 데 요구된다.
따라서, 한 실시양태에서, 축주위 중배엽은 단층 배양물 중에서 특정화된다.
또 다른 실시양태에서, BMP 억제제는 임의적으로 도소모르핀 (DM), 노긴, 코르딘, LDN-193189, 가용성 BMPRIa, 및/또는 가용성 BMPRIb로부터 선택되는 1형 BMP 수용체 억제제 및/또는 가용성 BMP 수용체이다.
또 다른 실시양태에서, 원시선-유사 중배엽 집단을 약 1, 2, 3 또는 4일 동안 BMP 억제제와 접촉시켜 심장 근육 세포 특정화를 억제시킨다.
한 실시양태에서, 원시선-유사 중배엽 집단 및/또는 축주위 중배엽 집단을 특정화시키기 위한 FGF 효능제는 FGF2, bFGF, FGF4 및/또는 FGF9로부터 선택된다.
언급된 바와 같이, 상기 축주위 중배엽의 출현은 (예를 들어, 도 2b, 3a에 제시된 바와 같이, 유동 세포측정법에 의해 관찰되는) 세포 표면 상의 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타의 발현을 검출함으로써 모니터링될 수 있다. 상기 3개의 마커를 발현하는 중배엽 집단이 출현하였을 때 (15일째/T15까지), 상기 단계는 종료된다. 도 3a는 T12 내지 T15 사이에 상기 마커가 상향조절되어 있음을 보여주는 것이다. 이들 마커는 T4 내지 T10 사이에 세포 상당부에서는 발현되지 않는다. 단층 분화가 진행되는 동안 (예컨대, T4-T15), 축주위 중배엽 및 체절에서 발현되는 두 전사 인자인 MeoxI 및 Nkx3.2의 상향조절이 검출된다. 예를 들어, 15일째까지 배양물 중 상기 마커의 발현은 축주위 중배엽이 생성되었음을 나타낸다.
한 실시양태에서, 원시선-유사 중배엽 집단을 적어도 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일 또는 그 초과의 기간 동안 (예를 들어, T3-T14) FGF 효능제와 접촉시켜 CD73 및/또는 CD105를 발현하는 세포의 비율을 예를 들어, FGF 효능제 비처리 세포와 비교하여 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65% 이상만큼 증가시킨다.
한 실시양태에서, 축주위 중배엽 집단은 또한 전사 인자 MeoxI 및 Nkx3.2를 발현하고, Nkx2.5에 대해 음성이다.
예를 들어, 마이크로매스 배양물, 펠릿 배양물, 또는 필터 배양물을 비롯한, 임의의 고세포 밀도 포맷으로 축주위 중배엽 집단을 플레이팅할 수 있다. 예를 들어, 마이크로매스 조직을 생성하기 위해, 전형적으로는 약 200,000 내지 약 500,000개의 세포를 하나의 20 ㎕ 스폿에 플레이팅하여 조직 형성을 개시한다. 스폿 중 이용가능한 면적/조직 배양물 플라스틱 면적이 부족하기 때문에 임의의 더 많은 세포 및 그들은 부착되지 않을 것이며, 더 적은 세포 및 "스폿"은 세포로 컨플루언트되지 않을 것이다. 또 다른 일례로서, 막 필터 배양물 중 최소 플레이팅은 약 500,000개의 세포로 이루어지고, 최대는 직경이 12 mm인 필터당 약 2 x 106 개의 세포이다.
한 실시양태에서, 축주위 중배엽 집단은 예를 들어, 마이크로매스 배양물 중 10 x 106개의 세포/ml 내지 50 x 106개의 세포/ml, 임의적으로 적어도 1 ml당 10 x 106개의 세포, 20 x 106개의 세포/ml, 30 x 106개의 세포/ml, 40 x 106개의 세포/ml 또는 50 x 106개의 세포/ml인 세포 밀도로 플레이팅된다. 한 실시양태에서, 약 500,000 내지 2 x 106개의 세포, 임의적으로 약 500,000, 약 750,000, 약 1 x 106, 약 1.25 x 106, 약 1.5 x 106, 약 1.75 x 106, 약 2 x 106 세포는 직경이 12 mm인 막 필터 배양물 중에 플레이팅된다.
특정 실시양태에서, 예를 들어, bFGF 및 BMP 억제를 사용하여 원시선-유사 중배엽 집단으로부터 CD73+CD105+PDGFR베타+ 축주위 중배엽을 생성하는 데 무혈청 방법이 사용된다.
한 실시양태에서, 임의적으로 3 단계 및/또는 4 단계 동안 배지는 무혈청 배지이고, 이는 기초 배지, 임의적으로 고 글루코스 DMEM + 덱사메타손, 아스코르브산, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 및 프롤린을 포함한다. 기초 배지의 예는 예를 들어, 참고 문헌 18에 제공되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 기초 배지란, 정상 세포 대사에 필수적인 물 및 특정 벌크 무기 이온을 세포에 제공하고, 세포내 및 세포외 삼투압 균형을 유지시키고, 에너지원으로서 탄수화물을 제공하고, 완충 시스템을 제공하여 배지를 생리학적 pH 범위로 유지시키는 염 혼합물을 의미한다. 기초 배지의 예로는 둘베코스 변형 이글즈 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM), 최소 필수 배지 (Minimal Essential Medium: MEM), 기초 배지 이글 (Basal Medium Eagle: BME), RPMI 1640, 햄즈(Ham's) F-10, 햄즈 F-12, 알파-최소 필수 배지 (aMEM), 글래스고우 최소 필수 배지 (Glasgow's Minimal Essential Medium: O-MEM), 및 이스코브스 변형 둘베코스 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium: IMDM), 스템 프로(Stem Pro) 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한 특정 실시양태에서, 기초 염 영양액은 대략 50:50의 DMEM과 햄즈 F12의 혼합물이다. 한 실시양태에서, 기초 배지는 고글루코스 DMEM이다.
또 다른 실시양태에서, 배지는 DMEM, 스템 프로®, 메조페이트(Mesofate) (스템젠트), RMPI 1640 또는 IMDM과 함께 조합하여 인슐린, 트랜스페린 및 임의적으로 셀레늄을 포함하는 기초 배지를 포함한다.
배지 및/또는 조성물은 미량 원소를 추가로 포함할 수 있는 것이 고려된다. 미량 원소는 예를 들어, 미디어텍(Mediatech)으로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 미량 원소의 비제한적인 일례로 알루미늄, 염소, 술페이트, 철, 카드뮴, 코발트, 크롬, 게르마늄, 나트륨, 칼슘, 칼슘, 포스페이트, 및 마그네슘을 포함하는 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 미량 원소를 함유하는 화합물의 구체적인 예로는 AlCl3, AgNO3, Ba(C2H3O2)2, CdCl2, CdSO4, CoCl2, CrCl3, Cr2(SO4)3, CuSO4, 시트르산철, GeO2, KI, KBr, LI, 몰리브덴산, MnSO4, MnCl2, NaF, Na2SiO3, NaVO3, NH4VO3, (NH4)6Mo7O24, NiSO4, RbCl, 셀레늄, Na2SeO3, H2SeO3, 셀레나이트Na, 셀레노메티오논, SnCl2, ZnSO4, ZrOCl2, 및 그의 혼합물 및 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
아미노산이 정의된 배지 중에 첨가될 수 있다는 것도 고려된다. 상기 아미노산의 비제한적인 예로는 글리신, L-알라닌, L-알라닐-L-글루타민, L-글루타민/글루타맥스, L-아르기닌 히드로클로라이드, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신 히드로클로라이드, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-히드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린이 있다. 특정 실시양태에서, 아미노산은 L-이소류신, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-히드록시프롤린, L-발린, 및 그의 혼합물이다.
기초 배지가 아스코르브산을 포함할 수 있는 것 또한 고려된다.
추가로, 조성물 및 방법은 또한 다른 성분, 예컨대, 알부민, 트랜스페린, L-글루타민, 지질, 항생제, 베타머캅토에탄올, 비타민, 미네랄, ATP를 포함할 수 있고, 유사 성분이 존재할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 조성물 및 방법은 비타민 D3 및 ATP를 포함한다.
한 실시양태에서, 고세포 밀도 스폿은 약 0 내지 4일 동안 유지되고, 예를 들어, 축주위 중배엽 집단을 TGF베타3 효능제 첨가 이전에 약 0 내지 약 4일, 임의적으로 0, 1, 2, 3, 또는 4일 동안 고세포 밀도로 배양한다.
한 실시양태에서, CD73+, CD105+ 및/또는 PDGFR베타+ 축주위 중배엽 집단은 3일 이상, 또는 약 3일 내지 약 14일 동안, 임의적으로, 1주 이상 무혈청 배지 중에서 TGF베타 효능제와 함께 배양되고, 이로써, Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단이 제조된다.
본원에서 입증된 바와 같이, 장기간의 TGF베타 신호전달은 관절 유사 연골 조직을 생성할 수 있다. 한 실시양태에서, Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGF베타 효능제와 함께 배양하는 장기간은 적어도 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주 또는 그 초과이며, 이로써, 관절 연골 유사 조직이 제조된다. 한 실시양태에서, 연골세포 전구체 집단을 루브리신 및/또는 연골 중간층 단백질 2 (CILP2)가 발현될 때까지 TGFb 효능제와 함께 배양한다. 한 실시양태에서, 축주위 중배엽 집단 및/또는 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGFb3, TGFb2 및/또는 TGFbI로부터 선택되는 TGFb 효능제와 함께 배양한다.
TGFb 효능제를 포함하는 것으로부터 BMP 효능제를 포함하는 것으로 배양물을 교체하면, 성장판 유사인 비대성 연골세포 집단이 유도된다. 한 실시양태에서, 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 BMP4 효능제와 함께 배양함으로써 콜라겐 10+ 및/또는 Runx2+ 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 제조한다. 한 실시양태에서, 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 BMP4 효능제, 임의적으로 BMP4 또는 GDF5와 함께 배양하는 장기간은 적어도 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주 또는 그 초과이며, 이로써, 콜라겐 2를 발현하는 연골 조직 및/또는 콜라겐 10을 발현하는 비대성 연골세포 집단이 생성된다.
예를 들어, 3 단계는 2% 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지 중에서 수행될 수 있는 2-3일간의 '스폿팅" 단계를 포함할 수 있다. 이를 통해 고세포 밀도의 세포가 예를 들어, 조직 배양 디쉬 또는 막 필터의 소규모 면적에 부착될 수 있다. 임의적으로 3일 (+3일)의 상기 단계 종료시, 마이크로매스 중 대다수 및/또는 실질적으로 모든 세포는 CD73, CD105, 및 PDGFR베타를 발현한다. 한 실시양태에서, 상기 단계에 이어서, (예컨대, +10일째, 배양 25일째에) 임의적으로 최소 약 1주인 기간 동안 무혈청 배지 중에서 TGFb 효능제 처리가 수행된다. 약 2주째까지 (약 10 내지 약 14일째까지) 조기 연골세포 유전자, 예컨대, Sox9 및 콜라겐 2가 발현된다. 배양물을 TGFb 효능제, 예컨대, TGFb3 중에서 예를 들어, 수주 내지 수개월 동안에 걸쳐 유지시킴으로써 관절 연골 (AC) 유사 조직을 생성할 수 있다 (예컨대, 4 단계). 예를 들어, 약 5-10주의 마이크로매스 배양 후에 AC 유전자인 루브리신의 상향조절이 검출된다.
장기간 동안에 걸친 조직학적 분석을 통해 보다 장기간 배양할 경우, 예를 들어, 6주와 비교하여 12주 이후에 보다 고품질의 조직이 생성되는 것으로 나타났다.
비대성 성장판-유사 연골 조직의 생성은 TGFb 효능제를 함유하는 배지를 그를 대신하여 BMP4 효능제를 함유하는 배지로 교체함으로써 달성된다. BMP4 효능제 교체는 전형적으로 세포를 1주 이상 동안 TGFb 효능제, 예컨대, TGFb3으로 자극시킨 후 약 25일째에 이루어진다. 이러한 교체로 마이크로매스 세포는 성장판 분화와 관련된 유전자 (예컨대, 콜라겐 10 및 Runx2)를 발현하는 비대 세포인 비대성 연골세포 표현형으로 전환된다 (예컨대, 도 4c 참조).
(보통 TGFb3가 첨가되는 시점인) 마이크로매스 약 3일째에 BMP4로 즉시 자극시키면, 마이크로매스는 볼링 업되고/거나, 비부착성이 되고/거나, 살아남지 못하고/거나, 조직을 제조하지 못하는 것으로 나타났다. 어느 시점에든, 예를 들어, 3 단계 배양 중 약 10일 내지 6주째에 BMP4로 교체하면, TGFb 효능제로 처리된 마이크로매스 중에서 상기와 같은 비대성 반응을 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, BMP4 효능제, 임의적으로 BMP4로의 교체는 약 25일째에 이루어지며, 이로써 성장판 유사 연골이 생성된다.
성장판 비대성 연골세포를 나타내는 것인 콜라겐 10 발현은 예를 들어, 수주 이후에 (예컨대, 실시예 1에서는 세포주에서 9-12주 이후에) 발현되고; 이러한 타이밍은 TGFb 효능제로 처리된 마이크로매스에서의 루브리신과 유사한 방식으로 이루어진다. 따라서, 장기간 동안 BMP4 효능제로 처리하면 콜라겐 10을 발현하는 성장판-유사 연골 조직이 hPSC로부터 생성된다.
따라서, 한 실시양태에서, 연골세포 전구체는 연골 조직 형성을 위해 TGF베타 효능제 또는 BMP4 효능제 중에서 배양된다.
하나 이상의 단계의 원하는 집단을 풍부화할 수 있다. 예를 들어, CD73+ CD105+ 세포 및/또는 CD73+ PDGFR-베타+를 고세포 밀도 배양 이전에 세포 표면 CD73, CD105 및/또는 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 집단으로부터 임의적으로 유동 세포측정법에 의해 단리할 수 있다.
기술된 본 방법은 또한 예를 들어, 다른 방법을 사용하여 생성된, 및/또는 대상체로부터 단리된 연골세포 전구체 세포에 대해서도 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 개시내용은
(a) 무혈청 또는 혈청 함유 배지 중에서 연골세포 전구체 세포를 고세포 밀도로 배양하는 단계;
(b) 무혈청 배지 중에서 고세포 밀도의 연골세포 전구체 세포를 TGF베타 효능제와 함께 배양하는 단계; 및
(c) (i) 장기간 동안 연골세포 전구체 세포를 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 관절 연골 유사 연골세포 집단을 제조하거나; 또는
(ii) 장기간 동안 연골세포 전구체 세포를 BMP4 효능제와 함께 배양하여 세포 및/또는 연골 유사 조직의 비대성 연골세포 집단을 제조하는 단계를 포함하는, 연골세포 유사 세포를 생성하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 연골세포 전구체 세포는 일차 태아 연골세포 또는 계대된 태아 연골세포이다. 또 다른 실시양태에서, 연골세포 전구체 세포는 연골 또는 골 병증 또는 질환을 앓는 대상체로부터 수득된 일차 세포이다. 대상체로부터 수득된 세포를 본 방법에 이용함으로써 고세포 밀도 배양 이전에 만능을 유도할 수 있다. 예를 들어, 일차 연골세포는 환자로부터 단리될 수 있고, 마이크로매스 방법을 사용하여 직접 시험될 수 있거나, 환자로부터의 임의의 체세포는 환자 특이적 IPS 세포를 제조하는 데 사용될 수 있고, 이어서, 본원에 기술된 방법 중 4 단계를 사용하여 분화시킴으로써 연골 조직을 생성하게 될 것이다. 대상체로부터, 예를 들어, 질환 부위로부터 수득된 세포는 완화에 대하여 약물을 시험하는 데 사용될 수 있고/거나, 예를 들어, 대상체가 골관절염을 앓을 경우, 하나 이상의 증상을 증식시키고/거나, 완화시키는 성분을 확인하기 위한 시도로 활액 성분 또는 다른 시험 물질과 함께 배양될 수 있다. 세포 또는 활액 성분 또한 피험체로부터, 예를 들어, 비-질환 부위로부터 수득될 수 있고, 이는 예를 들어, 생성된 세포 및/또는 조직이 대상체에게 투여되는 것인 자가 연골세포 이식을 위한 세포 및/또는 조직을 생성하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는 동종 이식편 이식을 위해 사용된다.
본 단계는 시험관내에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 세포 및/또는 세포 또는 조직을 포함하는 조성물은 예를 들어, 전체 연골 유사 조직이 형성되기 이전에 대상체에게 투여될 수 있고, 생체내에서 연골 형성에 대해 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 세포는 본원에 기술된 방법을 사용하여 제조되고, 임의적으로 투여 이전에 해리될 수 있다.
본 방법은 또한 축주위 중배엽 세포 집단을 생성하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 방법은
(a) 만능 줄기 세포의 출발 집단을 원시선 유도 칵테일과 함께 배양하여 CD56 및 PDGFR-알파를 발현하는 원시선-유사 중배엽 세포 집단을 유도하는 단계;
(b) 원시선-유사 중배엽 집단을,
(i) FGF 효능제;
(ii) BMP 억제제; 임의적으로 노긴, LDN-193189, 또는 도소모르핀; 및
(iii) 임의적으로, TGF베타 억제제, 임의적으로 SB431524; 및/또는 Wnt 억제제, 임의적으로 DKK1, IWP2, 또는 XAV939 중 하나 이상의 것을 포함하는 축주위 중배엽 특정화 칵테일과 함께 배양하여 세포 표면 CD73, CD105 및 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 집단을 특정화하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 방법은 CD73, CD105 및/또는 PDGFR베타 발현 세포를 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 사용되는 성분 (예컨대, 효능제, 억제제 등)의 농도는 원하는 세포 유형을 나타내는 마커의 발현을 유도하는 데 효과적인 유효량이다.
한 실시양태에서, FGF 효능제는 FGF이다.
한 실시양태에서, FGF의 농도는 약 2 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 임의의 농도, 임의적으로 약 20 ng/ml이다.
한 실시양태에서, BMP 억제제는 도소모르핀 (DM)이다.
한 실시양태에서, DM의 농도는 약 0.5 uM 내지 약 5 uM의 임의의 농도, 임의적으로 약 4 uM (예컨대, 마이크로몰)이다.
한 실시양태에서, TGFb 효능제는 TGFbI, 2 및/또는 3이다.
한 실시양태에서, TGFbI, 2 및/또는 3의 농도는 약 1 ng/ml 내지 약 50 ng/ml의 임의의 농도, 임의적으로 약 10 ng/ml이다.
명시된 범위 사이의 임의의 수치는 예를 들어, 매 0.1씩 또는 매 0.5씩의 단위 증분을 포함한다.
한 실시양태에서, TGF베타3의 농도는 약 1 ng/ml 내지 약 50 ng/ml의 임의의 농도, 임의적으로 약 10 ng/ml이다.
한 실시양태에서, BMP4 효능제는 BMP4이다.
한 실시양태에서, BMP4의 농도는 약 10 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 임의의 농도, 임의적으로 약 50 ng/ml이다.
방법은 또한 예를 들어, 본 코사(Von Kossa) 염색법에 의해 임의적으로 시험관내 또는 생체내에서 프로테오글리칸 생산, 및/또는 석회화 및/또는 무기질화에 대해 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 코사 염색법을 사용하여 무기질화를 확인할 수 있으며, 이는 성장판 유사 연골 발생을 나타낸다.
본 개시내용의 추가의 측면은 임의적으로 본원에 기술된 유용성을 위해 사용하기 위한, 본원에 기술된 방법을 사용하여 생성된 세포 또는 조직의 집단을 포함한다.
따라서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 연골세포 유사 세포, 임의적으로 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직 및/또는 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직의 단리된 집단, 또는 전구체 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 단리된 집단은 세포 표면 CD73, CD105 및 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 집단이다.
한 실시양태에서, 연골세포 유사 세포의 단리된 집단은 예를 들어, 관절 구역간 세포와 유사한 GDF5, WNT9A, 및/또는 ERG, 관절 연골세포와 유사한 루브리신 MeoxI 및/또는 CIP2, 또는 비대성 연골 세포와 유사한 RUNX2, SP7, 알칼리성 포스파타제 (ALP/ALPL), 및/또는 COL10A1과 같이, 하나 이상의 연골세포 마커 및/또는 유전자를 발현하는 세포를 포함한다.
추가의 측면은 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직 및/또는 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직, 및/또는 전구체 세포의 집단; 및 담체를 포함하는 조성물이다. 사용 용도에 따라, 담체는 임의적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 히드로겔, 골 스캐폴딩재, 골 대체용 스캐폴딩재 및/또는 마트리겔일 수 있다. 다른 담체로는 예를 들어, 담체로는 히알루론산 나트륨, 히알루론산 및 그의 유도체, 젤라틴, 콜라겐, 키토산, 알기네이트, 완충처리된 PBS, 덱스트란 및 중합체로 이루어진 군 중 하나 이상의 것을 포함한다. 예를 들어, 담체는 이식 적용에 사용하는 데 적합한 담체, 예컨대, 제약 등급 담체일 수 있다. 담체는 또한 수송 및/또는 보관하는 동안 세포를 안정화시키는 데 적합한 것일 수 있다. 세포는 예를 들어, 냉동될 수 있고/거나, 조직은 실온에서 및/또는 실온 내지 약 4℃ 사이의 임의의 온도에서 수송될 수 있다.
조성물은 예를 들어, 대상체에게 투여하기 위한, 해리된 세포를 포함하는 슬러리 형태일 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 예를 들어, 성장판 세포/연골 이식을 위한 다른 세포, 예를 들어, 내피 세포 및/또는 섬유모세포를 포함할 수 있다.
추가의 측면은 본원에 기술된 세포 및/또는 조직 및 스캐폴드 또는 막을 포함하는 연골 또는 골 조직 제품을 포함한다. 예를 들어, 이식 적용 동안, 연골세포는 막 (예컨대, 경골 골막 또는 생체막)과 함께 조합하여 손상된 부위에 투여될 수 있거나, 또는 스캐폴드 매트릭스에 미리 시딩될 수 있다. 한 실시양태에서, 스캐폴드는 골 대체물이다.
본원에 개시된 방법에 따라 생성된 세포 및 조직은 예를 들어, 관절 또는 골 장애를 앓는 대상체에서 증상을 완화시키기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 측면은 본원에 기술된 세포 및/또는 조직 집단을 투여하고/거나, 상기 세포를 포함하는 제품을 삽입/임플란트하는 단계를 포함하는, 증상 완화 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체의 증상을 완화시키고/거나 상기 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
또 다른 측면에서는 또한 세포, 조직 및 제품의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 증상 완화 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체의 증상을 완화시키고/거나 상기 대상체를 치료하기 위한, 본원에 기술된 세포 및/또는 조직의 집단 또는 조성물 또는 제품의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 예를 들어, 대상체에게 투여되는, 예를 들어, 본원에 기술된 용도 또는 방법을 위한 세포 집단은 자가 세포로부터 유도된 것이다.
한 실시양태에서, 세포 집단은 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직에 대하여 풍부화된 것이다.
한 실시양태에서, 대상체는 관절 병증, 예컨대, 골관절염, 박리성 골연골염, 다발연골염, 및 다른 연골병증, 또는 연골을 이환시키는 관절 손상을 앓는 대상체이다.
추가의 실시양태에서, 세포 집단은 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직에 대하여 풍부화된 것이다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 풍부화된 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직은 스캐폴드 또는 막에 부착된다.
또 다른 실시양태에서, 대상체는 골 병증, 예컨대, 골 골절, 절골을 앓거나, 또는 예를 들어, 악성 종양 또는 외상, 연골무형성증, 불완전 골형성증, 골다공증 또는 다른 골병증에 기인하여 골 대체를 필요로 하는 대상체이다.
생성된 세포는 임의적으로 예를 들어, 전형적으로 관절 연골세포 유사 세포에서 발현되는 유전자의 프로모터, 예컨대, 루브리신 프로모터, 및/또는 전형적으로 비대성 연골세포에서 발현되는 것의 프로모터, 예컨대, 콜라겐 10 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 (예컨대, 리포터 시스템)를 안정하게 발현하도록 무한증식되고/거나, 변형될 수 있으며, 이로써, 예를 들어, 후보 물질을 관절 연골세포 또는 비대성 연골세포에서 촉진시킬 수 있거나, 억제시킬 수 있거나, 유지시킬 수 있거나, 또는 활성을 띨 수 있는 그의 능력에 대하여 시험하는 데 사용될 수 있는 모델 세포를 수득할 수 있다. 다수의 리포터 유전자가 공지된 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이는 예를 들어, 형광성 단백질, 예컨대, GFP, RFP, dsRed 등, 루시페라제를 포함한다. 리포터 유전자 검정은 다용도의 감응성 방법이며, 고처리량 약물 스크리닝 프로그램에서 다수의 후보 물질을 검정하는 데 사용될 수 있다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 세포 또는 조직, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되고, 임의적으로 리포터 시스템 또는 다른 변형을 포함하는 세포 또는 조직을 포함하는 제품 또는 조성물 중 하나 이상의 것, 효능제, 억제제, 배지, 장치 또는 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 다른 성분으로부터 선택되는 2종 이상의 것의 조합, 및 사용 설명서, 예를 들어, 세포를 생성하는 방법, 검정을 수행하는 방법, 또는 세포, 조직, 조성물, 또는 제품을 투여하는 방법에 관한 설명서, 및 상기 언급된 세포, 조직, 조성물, 제품, 효능제, 억제제, 배지 등 중 하나를 하우징하기 위한 바이알 또는 다른 용기를 포함하는 키트를 제공한다.
본원에 기술된 방법에 따라 생성된 세포 및 조직은 다양한 적용을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 및 조직은 예측 약물 독성 및 신약 개발을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 풍부화된 hPSC-유래된 연골세포, 관절 또는 성장판 집단은 예측 약물 독성 스크린에서 뿐만 아니라, 연골세포 생물학적 성질 및 생리학적 성질에 영향을 주는 신규 화합물을 확입하는 것을 목적으로 하는 스크린을 위해 사용될 수 있다. 과거에는 환자로부터 일차 관절 연골세포를 확장시킴에 따라 연골세포는 중간엽 유사 표현형으로 탈분화되었고, 이로써, 이상적인 연골 대체가 일어나지 않았으며, 임의적으로, 하나 이상의 질환 매개 인자의 존재하에서 관절 연골세포의 증식 뿐만 아니라, 유지를 촉진시키는 약물은 관심의 대상이 될 것이다.
따라서, 실시양태는
a) 시험 물질을 연골세포 전구체 계통 세포 집단과 접촉시키는 단계로서, 시험 물질을 연골세포 전구체 계통 세포 집단과 접촉시키는 것은 본원에 기술된 방법 중 임의의 단계에서 이루어지는 것인 단계;
b) 시험 물질 부재하에서 생성된 대조군 집단과 비교하여 시험 물질이 연골세포 증식, 유지 및/또는 분화에 미치는 효과를 평가하는 단계; 및
c) 시험 물질이 대조군과 비교하여 증식을 증가 또는 감소시켰고/거나, 연골세포 유지 또는 분화에 영향에 주었다면, 시험 물질을 후보 연골발생 조절 물질인것으로 확인하는 단계를 포함하는 것인, 후보 연골발생 조절 물질을 시험하는 방법을 포함한다.
조절 물질은 예를 들어, 질환 매개 인자 또는 보호 활성을 가진 성분일 수 있다. 질환 매개 인자는 또한 질환 매개 인자의 질환 유도 효과를 억제 및/또는 감소시키는 작용제를 스크리닝하기 위해 시험 물질의 존재 또는 부재에서 사용될 수 있다.
세포 및 조직은 임의적으로 세포 이식 프로토콜을 평가하는 데 사용되고, 세포 이식을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 방법을 통해서 예를 들어, a) 관절 또는 성장판 유사 hPSC-유래된 연골세포 또는 연골 조직 대 자가 연골세포 이식 또는 성인 중간엽 줄기 세포-유래된 연골세포 또는 연골 조직을 이식시키는 것의 효과 및 효율, b) 골관절염을 비롯한 다양한 수준의 관절 질환을 앓는 동물 모델 또는 환자에서 다양한 관절 연골 결합을 치료하기 위해 관절 유사 연골 조직 및/또는 연골세포-세포-슬러리를 이식하는 것의 효과, c) (연골 주형 중간체를 통해) 골 재생을 위해 사용될 수 있는 hESC-유래된 성장판-유사 연골세포 또는 연골 유사 조직의 능력을 비교할 수 있게 될 것이다.
*세포 및 조직은 예를 들어, 조직 조작 적용에서 사용될 수 있다. 예를 들어, hPSC 배양물로부터의 풍부화된 연골세포 집단은 예를 들어, 정의된 비율의 연골세포 및 다른 세포 유형 또는 스캐폴딩을 가지는 조작된 구축물로 생성되고, 사용될 수 있다. hPSC-유래된 연골세포는 예를 들어, 골 대체물 상에 시딩될 수 있고, 예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 연골/골 경계면을 허용할 수 있다. 상기 제품은 골-연골 접합부가 손상되어 있는 환자 또는 동물 내에 이식될 수 있다.
본 방법은 (예를 들어, 유전 성분을 포함하는 질환에 대하여 환자로부터 iPS 세포주를 생성함으로써) 환자-특이 질환 모델을 확립하는 데 사용될 수 있다. 연골세포 유사 세포 및 조직 집단은 본원에 기술된 방법을 사용하여 인간 환자로부터 확립될 수 있다. 분화 뿐만 아니라, 상기 이환된 세포의 표현형을 분석하기 위해, 본 개시내용에 기술된 프로토콜을 사용하여 축주위 중배엽 집단을 생성할 수 있고, 상기 세포는 연골세포 운명으로, 및 최종적으로는 관절 또는 성장판 유사 연골 조직으로 특정화시킬 수 있다.
본원에 기술된 방법은 또한 골관절염과 관련된 것을 포함하는, 연골 질환 (예컨대, 비대)의 일반 모델을 확립하는 데 사용될 수 있다. 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, BMP4는, 대개 골관절염의 발병시 관절 연골에서 상향조절되는 경로인 것인 관절-유사 연골세포 및 연골 조직에서의 비대성 운명을 유도할 수 있다. 또 다른 일례로서, 골관절염 환자로부터 단리된 인자를 본원에 기술된 배양물에 첨가하는 것은 대사적으로 활성인 화합물 (예컨대, OA 환자의 무릎 중 지방 패드에서 발견되는 것)이 시험관내에서 조직의 정질에 영향을 줄 수 있는지 여부를 측정하는 데 사용될 수 있다.
또한, CD73을 통해 관절 연골세포 유사 세포를 확인할 수 있는 것으로 나타난 바와 같이, 유동 세포측정법에 의한 CD73 사용, 및 유동 세포측정법에 의한, 비대를 나타내는 세포 크기의 정량적 척도는 마커 기반 평가 방법을 통해 관절 또는 성장판 유사 운명 뿐만 아니라, 조직 그 자체의 조직학적 성질을 촉진시키는 인자에 대한 고처리량 스크리닝을 촉진시킬 수 있다. 비대는 예를 들어, 마우스 모델에서 골관절염과 관련이 있으며, 이는 환자에서도 유사하게 원인이 되는 것으로 사료된다. 본 출원은 예를 들어, 비대의 조절 인자를 확인하는 데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 후보 연골발생 조절 물질은 연골 또는 골이 이환된 대상체로부터 단리된 인자이다. 한 실시양태에서, 인자는 관절염을 앓고/거나, 비만인 대상체의, 또는 대조군으로서 건강한 대상체로부터의 관절, 임의적으로, 무릎 관절내 지방 패드로부터 단리된다. 또 다른 실시양태에서, 시험 물질을 BMP4 효능제와 함께 첨가하고, 시험 물질을 시험 물질의 부재하에서 처리된 대조군과 비교하여 비대를 억제시킬 수 있는 그의 능력에 대해 평가한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 비대는 유동 세포측정법을 사용하여, 임의적으로, 전방 및 측방 산란을 평가함으로써 평가된다.
또 다른 실시양태에서, 본 방법은
(a) 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직을 수득하는 단계;
(b) 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직을 시험 물질과 함께 배양하는 단계;
(c) 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 증식을 측정하는 단계;
(d) 시험 물질의 부재하에서 배양된 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직과 비교하여 증식 증가를 검출하며, 이는 시험 물질이 후보 관절 연골세포 증식 유도제라는 것을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 후보 관절 연골세포 증식 유도제를 평가하는 방법을 포함한다.
추가의 실시양태는
(a) 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 수득하는 단계;
(b) 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직을 시험 물질과 함께 배양하는 단계;
(c) 비대성 연골세포 세포 증식을 측정하는 단계;
(d) 시험 물질의 부재하에서 배양된 비대성 연골세포 유사 세포 및/또는 연골 유사 조직과 비교하여 증식 증가를 검출하며, 이는 시험 물질이 후보 비대성 연골세포 증식 유도제라는 것을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 후보 비대성 연골세포 증식 유도제를 평가하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, CD73 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직은 시험 물질과의 배양 이전에 단리되고, 임의적으로는 유동 세포측정법에 의해 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 비대성 연골세포 유사 세포는 임의적으로는 루브리신 프로모터 요소에, 관절 연골세포 특이적 프로모터에 기능적으로 커플링된 리포터 유전자 (즉, 관절 연골세포 리포터 시스템), 및/또는 비대성 연골세포 특이적 프로모터, 임의적으로 콜라겐 10 프로모터 요소에 기능적으로 커플링된 리포터 유전자 (즉, 비대성 연골세포 리포터 시스템); 및 (관절 연골세포 리포터 시스템 활성을 측정함으로써 확인되는) 관절 연골세포 분화를 유도하는 화합물 및/또는 (예를 들어, 비대성 연골세포 리포터 시스템 활성에 확인되는) 비대성 연골세포 분화를 유도하는 화합물을 포함한다.
한 실시양태에서, 증식 증가는 하기 방법: 3H 티미딘 혼입 검정; 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU) 혼입 검정; 및 프로피듐 아이오딘 검정 중 하나 이상의 것을 사용하여 측정된다.
추가의 실시양태는
(a) 본원에 기술된 방법에 따라 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직 및/또는 GPC 유사 세포 및/또는 성장판 연골을 생성하는 단계;
(b) 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 연골 유사 조직 및/또는 GPC 세포를 시험 물질과 함께 배양하는 단계;
(c) 시험 물질의 세포 독성 및/또는 세포 보호 활성을 측정하는 단계;
(d) 시험 물질의 부재하에서 배양된 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 GPC 세포 및/또는 조직과 비교하여 세포 독성 증가를 검출하며, 이는 시험 물질이 관절 연골세포 및/또는 GPC 세포에 독성이라는 것을 나타내는 것인 단계, 또는 시험 물질의 부재하에서 배양된 관절 유사 비-비대성 연골 세포 및/또는 GPC 세포 및/또는 조직과 비교하여 보호 활성 증가 (예컨대, 세포 독성 감소)를 검출하며, 이는 시험 물질이 보호성이라는 것을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 시험 화합물의 AC 세포 및/또는 GPC 세포 독성 또는 보호 활성을 평가하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 세포 독성은 하기 검정: 트립판 블루(Trypan Blue) 염료 검정; 루시페라제 검정; 테트라졸륨 염 전환 검정, 예컨대, MTT 검정 및 WST-1 검정 중 하나를 사용하여 측정된다.
본원에서 입증된 바와 같이, IL-1베타는 연골 세포 집단에서 골관절염 유사 변화를 유도할 수 있다. Il-1b 및 다른 매개 인자, 예를 들어, 다른 시토카인 및 무릎 지방 패드 성분 (예컨대, 질환 매개 인자) 뿐만 아니라, 기계식 파괴는 본원에 기술된 스크리닝 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법을 사용하여 제조된 세포를 시험 물질의 존재 또는 부재하에서 상기 질환 매개 인자 또는 기계식 파괴와 접촉시킬 수 있다 (예컨대, 질환 매개 인자 또는 기계식 파괴를 첨가하기 이전, 또는 세포를 접촉시키고/거나, 기계식으로 파괴시킨 이후에 첨가함으로써 질환 매개 인자 기능을 억제하거나, 또는 역전시킬 수 있는 시험 물질의 능력을 평가할 수 있다).
한 실시양태에서, 임의적으로 시험 물질과의 배양 이전에, AC 유사 연골세포(들) 및/또는 연골 유사 조직(들) 또는 비대성 유사 연골세포(들) 및/또는 연골 유사 조직(들)을 질환 매개 인자와 접촉시킨다.
한 실시양태에서, 질환 매개 인자는 시토카인, 임의적으로 IL-1 베타이다. 또 다른 실시양태에서, 질환 매개 인자는 관절 지방 패드 성분, 임의적으로, 무릎 지방 패드 성분이다.
한 실시양태에서, 스크리닝 검정으로는 하기 분석 또는 검정: 조직학적 분석, 생화학적 검정, 예컨대, 글리코사미노글리칸 및 프로테오글리칸 생산을 정량화하는 검정, 유전자 발현 분석, 현미경법 또는 유동 세포측정법에 의한 형광 리포터, 예컨대, 루브리신 또는 콜라겐 10의 획득/손실, CD73 세포 표면 수용체 발현의 획득 또는 손실, 세포 사멸에 대한 검정, 및 연골세포 비대를 나타낼 수 있는 세포 크기에 대한 유동 세포측정법 중 하나 이상의 것을 포함한다.
CD73은 관절-유사 연골세포에 대하여 풍부화하기 위한 세포 분류 실험에서 양성 선별 마커로서 사용될 수 있다. 상기 마커는 현재 사용되는 동종이계 또는 자가 연골 수복 전략법과 함께 사용되는, 조직의 주요 공급원으로부터의 관절 연골세포의 단리가 용이하게 이루어질 수 있도록 촉진시킬 수 있다.
따라서, 추가의 측면은 항체 (또는 다른 결합 분자):CD73 세포 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 CD73에 결합하는 항체 (또는 다른 결합 분자)와, 연골세포를 포함하는 혼합된 세포 집단을 접촉시키는 단계; 및 항체 CD73 세포 복합체를 단리하는 단계를 포함하는, 관절 연골세포를 단리하는 방법을 포함한다. 이는 세포 분류 기반 방법을 비롯한, 관련 기술분야에 공지되어 있는 다수의 공지된 면역학적 방법에 의해 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 혼합된 세포 집단은 비-연골세포인 세포, 비-관절 연골세포 유사 세포, 및/또는 비대성 연골세포 유사 세포를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 예를 들어, 단리를 촉진시키는 태그, 예컨대, 비드, 예컨대, 세파로스 비드 또는 자기 비드에 커플링된다.
CD73, CD105, 및 PDGFR-베타의 조합은 다른 계통 또는 다른 계통의 전조체로부터 축주위/연골발생 중배엽을 단리하기 위한 양성 선별 마커로서 사용될 수 있다. 다른 계통으로서, 예컨대, 심장 계통이 축주위 중배엽을 생성하는 데 사용되는 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 유도되고, 상기 세포 표면 마커를 사용하여 세포 분류에 의해 축주위 중배엽을 단리하는 것은 상기 집단을 풍부화하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, 세포는 유동 세포측정법을 사용함으로써 풍부화된다.
따라서, 실시양태는 축주위 연골발생 중배엽 세포를 포함하는 세포 집단을, CD73 특이적 결합제, CD105 특이적 결합제, 및 PDGFR베타 특이적 결합제를 포함하는 칵테일과 접촉시키는 단계; 및 CD73+, CD105+ 및 PDGFR베타+ 세포에 대해 풍부화하는 단계를 포함하는, 축주위 연골발생 중배엽 세포 집단을 단리하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 결합제는 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 유동 세포측정법을 사용함으로써 풍부화된다. 또한, 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 것으로서, 본원에 기술된 조성물에 또는 제품에 포함될 수 있는, 단리된 축주위 연골발생 중배엽 세포 집단을 제공한다. 상기 세포는 또한 본원에 기술된 스크리닝 검정에서 사용될 수 있다. 축주위 중배엽 집단은 예를 들어, 다른 세포 유형을 생성하는 데, 예를 들어, 골격근 전조체, 지방세포 전조체 (지방 세포) 및 잠재적으로 골 전조체 (골아세포)를 생성하는 데 사용될 수 있다.
추가로, 특정 섹션에서 기술된 정의 및 실시양태는 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 적합한 것으로 기술된 본원의 다른 실시양태에도 적용가능한 것으로 한다. 정의에서 언급된, 예를 들어, 효능제, 억제제 등을 비롯한 상이한 효능제, 억제제 및/또는 다른 성분의 선택 및 조합 또한 고려된다. 예를 들어, 하기 구절에서 본 발명의 상이한 측면이 더욱 상세하기 정의된다. 그렇게 정의된 각 측면은 달리 명백하게 명시되지 않는 한, 임의의 다른 측면 또는 측면들과 함께 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나, 또는 이로운 것으로 명시된 임의의 특징은 바람직하거나, 또는 이로운 것으로 명시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 함께 조합될 수 있다.
상기 개시내용은 일반적으로 본 출원을 기술한다. 하기의 구체적인 실시예를 참조함으로써 더욱 완전하게 이해할 수 있다. 본 실시예는 단지 예시 목적으로 기술되는 것이며, 본 출원의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다. 상황이 적당한 것으로 제안되거나, 또는 그러한 것으로 만들 수 있으므로, 형태 변경 및 등가물 치환이 고려된다. 비록 본원에서는 특정 용어가 사용되었지만, 상기 용어는 제한 목적이 아니라, 기술적 의미의 것으로 의도된다.
하기의 비-제한적인 예는 본 개시내용의 예시이다:
실시예
실시예 1
결과
시험관내에서의 연골세포 형성은 배아체로서 원시선-유사 (PS) 집단 유도 (1 단계), 단층 배양물 중에서 축주위 중배엽 특정화 (2 단계), 고세포 밀도 마이크로매스 배양물 중 또는 콜라겐 코팅된 막 필터에서의 연골세포 전조체 생성 (3 단계), 및 마이크로매스 또는 필터 배양물 중에서 관절 및 성장판 연골세포 및 연골 조직 특정화 (4 단계)를 포함한다 (도 1a).
만능 줄기 세포 (PSC) 상태로부터의 분화에서 제1 단계는 PS 집단의 형성인데, 이는 배아에서 3개의 배엽 (내배엽, 중배엽, 및 외배엽)이 형성될 때, 장배 형성 동안에 발생한다. PS 집단 및 내배엽 및 중배엽 서브세트는 액티빈 A (액티빈, 노들에 대한 대용물), Wnt, 및 BMP 신호전달 분자의 조합을 사용하여 PSC로부터 유도될 수 있다 (Nostra, Cheng et al. 2008, Kattman, Witty et al. 2011, Craft, Ahmed et al. 2013). 액티빈, BMP4 및 bFGF로 유도된 PS 집단은 세포 표면 마커 CD56 및 PDGF 수용체 알파 (PDGFRa)의 발현에 의해 관찰될 수 있다 (도 1b).
도 1c에 제시된 바와 같이, hESC 유래 원시선 (PS) 중배엽은 CD56, PDGFR알파 및 KDR,을 발현한다. 유도 1일째 내지 3일째 동안 액티빈 A (3 ng/ml), BMP4 (1 ng/ml), 염기성 FGF (5 ng/ml) 및 CHIR99061 (1 마이크로몰), 소형 분자 Wnt 효능제를 사용하여 hIPSC를는 PS 중배엽 집단으로 유도하였다. HES2 hES 세포주의 경우에는 3일 기간 (1일째 내지 4일째) 대신 2일 기간 (1일째 내지 3일째) 동안 hIPSC를 유도하였다 (도 1c). hIPSC-유래된 PS 중배엽은 또한 CD56, PDGFR알파 및 KDR도 발현하지만 (도 1d), hiPSC가 CHIR99061의 부재하에서 유도된 경우에는 상기 세포 표면 마커는 발현되지 않는다 (도 1e).
배양 4일째 이후에 어떤 인자도 첨가하지 않았을 때, 상기 집단 내에 함유되어 있는 전조체는, T5일 때 세포 표면 마커 KDR 및 PDGFRa의 공동 발현 (도 2a, 0 DM, 0 FGF), 및 이어서, 15일째 (T15) 심장 전사 인자 Nkx2.5의 발현으로 (Kattman, Witty et al. 2011) (도 2c)으로 관찰되는 바와 같이, 심장인 운명으로 특정화될 수 있다.
연골 세포를 생성하기 위해서는 먼저 상기 PS 집단을 축주위 중배엽 운명으로 특정화시키는 것이 필수적이다. 이전 연구에서 대개 중간엽 줄기 세포에서 발견되는 세포 표면 마커인 CD73 및 CD105를 발현하는 중배엽 집단은 연골발생 잠재능을 가지는 것으로 밝혀졌다 (Hwang, Kim et al. 2006). 상기 두 세포 표면 마커의 발현 뿐만 아니라, 축주위 중배엽 집단 출현을 모니터링하기 위한 Nkx2.5의 발현 결여와 함께 조합된 전사 인자 MeoxI 및 Nkx3.2의 발현이 사용되었다. 마우스 ESC 모델 시스템에서의 이전 실험에서는 심장 중배엽의 출현을 억제하고, 축주위 중배엽의 발생을 촉진시키는 FGF 신호전달과 관련하여 BMP 신호전달 경로의 억제가 중요한 것으로 나타났다 (Craft, Ahmed et al. 2013). T4 내지 T6까지의 2일간의 기간 동안 (분화 4일째 내지 6일째) I형 BMP 수용체 도소모르핀 (DM) 억제제를 첨가하였을 때, 이는 세포가 비처리 중배엽보다 더 적은 PDGFRa를 발현한 바와 같이, T5와 같이 이른 시점까지 PDGFRa 및 KDR의 발현 패턴에 변화을 일으켰다 (도 2a). bFGF 첨가는 PDGFRa/KDR 집단에 대하여 큰 변화를 일으키지 않았다. 비처리 중배엽 조건하의 극소수의 세포가 CD73 및 CD105를 발현하였다 (7.46%, 도 2b). DM 처리는 상기 집단에서 단지 약간의 증가만을 일으킨 반면, FGF 처리는 4일째부터 15일째까지 CD73 및 CD105를 발현하는 세포의 비율을 크게 증가시켰다 (52%, 도 2b). 상기 표면 마커 발현의 변화는 축주위 유전자 MeoxI 및 Nkx3.2의 상향조절을 동반하였다 (도 2c). T4-T6에 DM으로, 및 T4-T15에 bFGF로 처리하였을 때, 더욱 강력한 CD73/CD105 집단 (67%), 및 더욱더 높은 MeoxI 및 Nkx3.2 발현 (도 2c)이 일어났고, 이는 BMP 억제 및 FGF 처리, 둘 모두는 PS 집단으로부터의 축주위 중배엽 특정화를 위해 요구된다는 것을 제안한다. CD73/CD105 발현 이외에도, FGF- 또는 DM+FGF-처리 단층으로부터 유래된 CD73-양성 세포는 또한 PDGF 수용체 베타 (PDGFR-베타, P베타)도 발현하는데, 이는 축주위 중배엽 또한 상기 세포 표면 마커 를 발현한다는 것을 제안한다 (도 2b).
단층 배양물 중에서의 축주위 중배엽 특정화 동안, (PS 중배엽 유도 후 2일간의 기간 동안 (hESC의 경우, 4일째 내지 6일째, hIPSC의 경우, 5일째 7일째)) Wnt 경로 억제가 분화 15일째 세포 표면 마커 CD73 및 CD105를 발현하는 세포의 비율을 증가시킨 것으로 관찰되었다 (도 2c). 따라서, 일부 세포주에서, 축주위 중배엽 특정화율은 PS 중배엽 유도 단계 후 즉시 Wnt 경로 길항제의 존재에 의해 개선될 수 있다.
축주위 중배엽으로부터 연골세포 전조체를 생성하는 데에는 TGF베타/BMP 신호전달이 요구되는 것으로 이전 연구에서 밝혀졌다. 상기 중배엽을 BMP4 함유 배지로 직접 플레이팅하였을 때, 연골 조직을 형성하지 않는 비-부착성 세포 응집체가 발생하였으며, 이로써 3 단계 (예컨대, 15일째 출발)를 위해서는 TGFβ3 (뿐만 아니라, TGF베타1 또는 TGF베타2)이 필요한 것으로 나타났다. TGFβ3 처리 후 10일이 경과하였을 때 (총 25일째), 연골세포의 서브세트 (관절/비-비대성 또는 성장판/비대성)를 특정화하기 위해 배양물을 BMP4 함유 배지로 교체할 수 있거나, TGFβ3 중에 유지시킬 수 있다 (4 단계). 15일째 중배엽 집단의 연골세포 잠재능을 측정하기 위해 세포를 1시간 동안 조직 배양물 처리된 페트리 디쉬 상에 20 ㎕ 부피로 고세포 밀도로 플레이팅 (마이크로매스)한 후, '스폿'을 배지로 침지/커버하였다. 본 발명자들의 초기 연구에서는 세포를 2% 우태아 혈청을 함유하는 배지 중에 '스폿팅'시켰다. 그러나, 이러한 단기간의 혈청 노출은 후기 단계에서는 연결 형성에 어떤 영향도 주지 않았으므로 생략될 수 있고, 이로써, 본 프로토콜은 임의적으로 무혈청인 것으로 이루어지게 된다. 2 내지 3일 경과 후, TGFβ3을 함유하는 무혈청 배지를 배양물에 첨가하여 연골세포 전조체를 생성한다. 4개의 중배엽 (0 DM +/- FGF; 4 μM DM +/- FGF)으로부터 유래된 집단을 상기 마이크로매스 검정으로 시험하였다. 4개의 중배엽 집단 모두 배양 1일 이내에는 디쉬에 부착되었지만 (도 2d), 1주 후에는 상이한 표현형이 관찰되었다. 유동 세포측정법에 의해 심장 트로포닌 T (cTnT)의 발현에 정량화한 바 (도 2e), 비처리된 중배엽 (0 DM, 0 FGF)으로부터 유래된 마이크로매스 중에서 수축 (박동성) 심장 근육 세포가 관찰되었다. DM 단독으로 처리된 중배엽은 부착성을 띠지 않는 상태로 연골세포를 형성하였지만, 대신, 긴 스트랜드로 응집되었고, 배지 교체로 세척되었다. FGF-처리 뿐만 아니라, DM+FGF-처리 세포는 부착성 세포층으로서 마이크로매스 배양 1주째 살아남았지만, 어느 심장 근육 세포도 생성하지 못했다. 마이크로매스 배양 4주 후, 단층 단계에서 DM+FGF로 처리된 세포는 육안으로 관찰가능한 (대략 직경 1 cm) 연골-유사 조직을 생성하였다. 단층 단계에서 FGF 단독으로 처리된 세포는 연골 조직 표현형을 유지하지 못하였고, 배양 디쉬로부터 분리되었다 (도 2f). FGF-처리 및 DM+FGF-처리 단층 배양물 둘 모두 유사한 수준의 CD73/CD105/PDGFR-베타를 발현하였지만, 15일째 축주위 유전자 발현 뿐만 아니라, 전체 연골 조직 생존은 BMP 억제 (본원에서 DM 처리 형태) 및 FGF 자극, 둘 모두 시험관내에서 연골-유사 조직을 형성할 수 있는 잠재능을 가진 축주위 중배엽 운명을 특정화하는 필요하는 것을 제안한다.
CD73, CD105 및 P베타가 hESC 분화 배양물 중 연골세포 잠재능을 가진 집단 상에서 발현되는지 여부를 측정하기 위해, CD73+CD105+ 및 CD73-CD105- 및 CD73+P베타+ 및 CD73-P베타- 분획을 15일째 DM+FGF-처리 단층으로부터 단리하고, 마이크로매스 배양물 중에서 검정하였다 (도 3a). 마이크로매스에서 10일 경과 후, CD73+CD105+ 세포 및 CD73+P베타+ 세포는 부착되었고, 살아남아 있었다. 두 실험 모두에서 이중 음성 세포는 상기 조건에서 생존하지 못했다 (도 3b). 2주 후, CD73+CD105+ 및 CD73+P베타+ 분류된 세포로부터 유래된 배양물 (TGFβ3에서 유재되거나, BMP4 함유 배지로 교체된 것) 중에서 연골 조직이 발생하였다. 그에 반해, 상기 두 모든 경우에서 이중 음성 세포는 임의의 연골 조직을 형성하지 못하였다 (도 3c). 연골 조직을 생성할 수 있는 잠재능 상의 차이는 도 3d에 제시되어 있다. 상기 데이터는 CD73+CD105+P베타+ 세포가 연골세포 및 연골-유사 조직을 생성할 수 있는 잠재능을 가지는 반면, 상기 마커를 발현하지 못하는 세포는 잠재능을 가지지 않는다는 것을 입증한다.
2 단계 종료시 유래된 적절한 축주위 중배엽 집단으로의 접근, 및 3 단계 종료시 연골세포 전조체의 생성은 연골세포의 2가지 서브타입인 관절 연골세포 (AC) 및 성장판 연골세포 (GPC)의 발생에 관해 연구할 수 있는 기회를 제공하였다. 약 10일 동안 TGFb3으로 축주위 중배엽 세포를 자극시킨 후, 상기 연골세포/연골 배양물을 수개월 동안 TGFb3 함유 배지 중에 유지시키거나, 또는 BMP4 함유 배지로 교체할 수 있다 (4 단계). TGFb3 또는 BMP4-처리 배양물은 12주 동안에 걸쳐 연골-유사 조직을 형성하는 데, 이는 연골-특이 세포외 기질의 존재를 나타내는 염료 (톨루이딘 블루)를 이용하여 조직학적으로 및 관절 연골 또는 성장판 연골과 관련된 유전자의 발현에 의해 분석될 수 있다. 형태학상, TGFb3-처리 연골 조직에서 관찰되는 연골세포는 작은 섬유모세포 유사 표현형을 가지는 반면, BMP4-처리 연골세포는 조약돌과 유사한 외관을 가지는 둥근 형태이다 (도 4a). 톨루이딘 블루로 균일하게 염색된 TGFb3-처리 연골은 조직 전역에 고르게 분산되어 있는 작은 세포 (연골세포)를 함유하였다 (13주된 조직, 도 4b). 그에 반해, BMP4-처리 조직은 확대된 비대성 연골세포를 함유한다. BMP4-처리 연골 조직에서의 현저한 연골세포 크기 증가는 GPC 분화와 연루된 정상적인 과정인 연골세포 비대를 나타내는 것일 수 있다. 생체내에서 성장판 중 비대성 연골세포는 콜라겐 10 발현을 특징으로 한다. 성장판 분화 프로그램은 최종적으로는 세포 사멸로 유도하고, 새로운 골이 형성될 수 있는 석회화된 기질이 남게 된다. 살아있는 세포의 전방 및 측방 산점도를 사용한 유동 세포측정법에 의한 분석시에, 비대는 또한 BMP4-처리 연골 조직에서도 관찰되었다 (도 4c). TGFb3-처리 연골세포는 더 작고, 과립성이 덜한 세포로 이루어진 조밀한 집단을 형성하는 반면, BMP4-처리 세포는 모든 평가 시점에서 세포 크기가 더 큰 것을 나타내는 더 큰 전방 산란 (FSC) 뿐만 아니라, 세포 입도가 더 높은 것을 나타내는 더 큰 측방 산란 (SSC)을 보인다 (제시된 3주 및 5주 마이크로매스).
조직학상, TGFb3-처리 연골 조직은 19주된 태아 대퇴골의 추후 관절 연골 부위와 같은 특징들 다수를 보이는 반면 (상단 패널, 도 4d), BMP4-처리 연골에서 발견되는 비대성 연골세포는 태아 대퇴골의 연골 하골 부위 근처에서 발견되는 성장판 연골세포의 외관과 유사하다 (하단 패널). 이러한 표현형은 연골의 2가지 독특한 서브타입의 특징을 가지는 연골 조직이 인간 PSC로부터 시험관내에서 생성되었다는 것을 제안하는 것이다. 무릎 관절로부터 단리된 일차 태아 연골세포 또한, 15일째 hPSC-유래된 축주위 중배엽을 위해 사용된 프로토콜과 동일한 마이크로매스 검정으로 배양하였고, 이 또한 시험관내에서 연골 조직을 생성하였다. 조직학상, TGFB3-처리 및 BMP4-처리 태아 연골세포 유래 연골 조직은 또한 hPSC로부터 유래된 연골 조직과 매우 유사한 것으로 보였다. 도 4e는 BMP-4를 GDF5로 대체함에 따라 도 4a의 것과 유사한 비대성 연골세포가 생성되었다는 것을 보여주는 것이다.
세포 크기 및 형태상에서의 유사한 차이는 TGF베타3 및 BMP4를 이용하여 hiPSC로부터 생성된 12주된 연골 조직에서 관찰되었다. 프로테오글리칸의 존재를 나타내는 톨루이딘 블루를 이용하여 조직을 이염성으로 염색하였다 (도 4f). 예상대로, II형 콜라겐 단백질은 두 조건 모두에서 생성된 hPSC-유래된 조직에 존재하였다(도 4g). 상기 시점에 X형 콜라겐은 어느 조직에서도 검출되지 않았다. 루브리신 단백질은 BMP4-처리 마이크로매스 조직이 아닌, TGF베타3-처리 마이크로매스 조직에 존재하였고 (도 4h), 이는 조직 구조의 상부를 피복하는 편형화된 세포에서 우선적으로 발견되었다. 종합해 보면, 상기 관찰 결과는, 지속적인 TGF베타3 신호전달이 관절 연골-유사 조직을 생성할 수 있는 관절 연골세포의 발생을 촉진시키는 반면, BMP4 신호전달은 성장판 특징을 가지는 연골을 형성하는 비대성 (확대된) 연골세포의 분화를 유도한다는 해석을 강력하게 지지한다.
이어서, 두 조건에서 생성된 조직을 qRT-PCR에 의해서 유전자 발현 패턴에 대하여 (도 5), 및 면역조직화학법 및 면역염색법에 의해 연골 발생과 관련된 특이적 단백질의 존재에 대하여 (도 4) 분석하였다. 두 관절 및 비대성 연골세포 모두에서 발현되는 유전자인 SOX9 및 COL2A1의 발현은 TGF베타3- 및 BMP4-처리 조직, 둘 모두에서 배양 2주째까지 상향조절되었다 (도 5a-b). 발현 수준은 일차 인간 태아 AC, 건강한 성인 AC, 및 장골 능선 (비대성) 연골세포에서 발견된 것과 유사하였다. RUNX2, SP7, 알칼리성 포스파타제 (ALP/ALPL), 및 COL10A1을 비롯한, 비대성 연골세포와 관련된 유전자의 발현은 TGFb3에서 유지시킨 조직에서의 것보다 8- 내지 12주된 BMP4-처리 조직에서 유의적으로 더 높았다 (도 5c-f). 루브리신 (PRG4)을 비롯한, 표재 영역 관절 연골세포에서 발현되는 것으로 알려져 있는 유전자, 및 연골 중간층 단백질 2 (CILP2) (도 5g-h) 뿐만 아니라, AC의 전조체 집단이 관절 구역간 세포에서 발현되는 것 예컨대, GDF5, WNT9A, ?? ERG에 대해서는 반대되는 패턴이 관찰되었다 (도 1-k).
종합해 보면, TGFB3-처리 세포 및 BMP4-처리 세포로부터 유래된 hPSC-유래된 연골의 조직학적 성질 및 유전자 발현 분석은 2개의 독특한 연골세포 집단 및 연골-유사 조직이 시험관내에서 생성되었다는 것을 제안한다. 장기간 동안 (최대 12주)의 TGFB3-처리 연골 조직의 성숙화로 성숙한 AC 유전자, 예컨대, 루브리신 및 CILP2가 발현될 수 있다. TGFB3 배양물을 BMP4로 처리하면, 비대성 반응이 유도되는데, 이는 조직학적 성질에 의해, 및 성장판에서 발견되는 비대성 연골세포와 관련된 유전자인 콜라겐 10 및 Runx2의 상향조절에 의해 쉽게 관찰된다. 따라서, TGFB3 처리로 유도된 hPSC-유래된 연골 조직은 관절-유사 연골을 나타내는 반면, BMP4-처리 연골 조직은 성장판-유사 비대성 연골을 나타낸다.
hPSC 분화 배양물로부터, 또는 자가 연골세포 이식을 위해 환자로부터 단리된 연골 조직으로부터 AC를 풍부화하기 위해서 사용될 수 있는 세포 표면 마커를 확인하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 350개의 항체로 이루어진 유동 세포측정법 기반 항체 스크린을 수행하였다. 성장판 특징을 가지는 것인, 동종이계 이식을 위해 사용된 2개 이상의 인간 건강한 성인 관절 연골 샘플, 16-19주된 4개 이상의 인간 태아 연골세포, 및 둔부의 장골 능선으로부터 단리된 1개의 인간 성인 연골세포 샘플을 비롯한, 무릎 관절로부터의 일차 연골세포의 여러 공급원을 스크리닝하였다. 상기 스크린으로부터, 본 발명자들은 관절 연골세포의 마커로서 CD73을 확인하였다 (도 6). CD73은 실제로 무릎으로부터 단리된 건강한 성인 관절 연골세포 모두 (>96%)에 의해 발현되지만, 장골 능선 GPC-유사 연골세포 중 단지 약 22%에 의해서만 발현된다 (도 6a). CD73은 태아 연골세포 중 대략 절반에 의해 발현되는데 (도 6b), 청소년기에 발생하는 2차 골화 중심의 골화가 아직 일어나지 않았다면, 성장판 연골세포로부터 상기 세포만을 단리하는 것은 어렵기 때문에, 상기는 순수하지 않은 관절 연골세포 집단임을 나타낼 수 있다.
hPSC-유래된 연골 조직을 형성한 방법과 유사하게, TGFB3 또는 BMP4를 이용하여 마이크로매스 중에서 일차 (P0) 및 계대된 (P2) 태아 연골세포를 또한 배양할 수 있다. TGFB3-처리 태아 P0-유래된 또는 태아 P2-유래된 연골 조직은 93% 초과로 CD73 양성 세포를 함유하는 반면, BMP4 처리는 CD73+ 세포의 비율을 각각 70% 및 61%로 감소시킨다 (도 6c, d). CD73 발현은 또한 TGFB3-처리로 유도된 hPSC-유래된 연골 조직 중 98% 초과에 의해 발현된다 (도 6e). BMP4-처리 후, CD73+ 세포의 비율은 단지 약 57%의 세포로 감소된다. 따라서, CD73은 일차 건강한 성인 AC, 건강한 태아 연골세포, TGFB3 중 마이크로매스로서 배양된 태아 연골세포 또는 계대된 태아 연골세포, 및 인간 PSC로부터 유래된 TGFB3-처리 관절 연골세포-유사 세포의 비율을 나타내는 특징이 된다.
흥미롭게도, 중간엽 세포 표면 마커, 예컨대, CD73은 분화에서 조기에 hPSC-유래된 축주위 중배엽 뿐만 아니라, 중배엽으로부터 유래된 말기의 관절-유사 연골세포를 나타내는 특징이 된다. 12일째 (T12) 및 15일째 (T15) 축주위 중배엽은 CD73 및 PDGFR-베타를 발현하고, 3일간의 '스폿팅' 단계 (총 18일째) 후, 모든 세포는 CD73+PDGFR-베타+ (도 6f)이다. 흥미롭게도, 상기 세포 표면 수용체 둘 모두 10일 후 2주간의 마이크로매스 배양까지 하향조절된다. 4 내지 5주 경과 후, CD73은 TGFB3-처리 마이크로매스 배양물에서 재발현되고 (도 6g), 이는 연골세포 전조체가 관절 연골세포 운명 쪽으로 분화된 때에는 발현될 수 있다는 것을 제안하는 것이다.
2가지 유형의 연골세포의 잠재능의 특징을 추가로 규명하기 위해, 해리된, 8-12주된 조직으로부터의 세포를 NSG 면역결핍 마우스 내로 피하로 주사하였다. 두 집단 모두 II형 콜라겐을 발현하는, 프로테오글리칸이 풍부한 연골 조직을 생성하였고, 이식 후 4주째까지 무기질화의 증거는 없었다. 이식 후 12주 경과한 후에 이식편에서 뚜렷한 차이가 관찰되었다. BMP4-처리 연골세포로부터 유래된 조직에서는 프로테오글리칸이 거의 유지되지 않았고 (도 7a, c), 각각 양성 본 코사 (도 7b) 및 X형 콜라겐 염색법 (도 7e)에 의해 나타난 바와 같이, 석회화/무기질화 및 비대 부위를 포함하였다. 흥미롭게도, TGF베타3-처리 연골세포로부터의 이식편은 프로테오글리칸이 풍부한 ECM (도 7a, c) 및 II형 콜라겐이 풍부한 ECM을 유지하였고 (도 7d), 석회화/무기질화 또는 비대의 증거는 없었다 (도 7b, e). 상기 이식 연구로부터 얻은 관찰 결과에 따라, 두 연골세포 집단은 기능상 상이하다는 것이 입증되고, 이는 TGF베타3-처리 세포가 생체내에서 12주 초과의 기간 동안에 안정한 연골을 생성하고 유지시키는 바, 상기 세포는 관절 연골세포를 나타낸다는 추가의 증거를 제공한다. 그에 반해, BMP4의 존재하에서 발생된 연골세포는 생체내에서 연골내 골화를 개시한 조직을 생성하는 바와 같이, 성장판에서 발견되는 것의 특징을 보인다.
COL2A1, PRG4 (루브리신) 및 CILP2는 12주 동안 TGF베타1 및 TGF베타2로 처리된 마이크로매스 조직에서 상향조절되었으며 (도 8), 이는 hPSC-유래된 축주위 중배엽 반응으로부터의 관절 연골세포의 생성이 리간드 특이성이 아님을 나타낸다.
hPSC-유래된 관절-유사 연골의 비제한적인 공급에의 접근은 골관절염 (OA)의 초기 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 염증유발성 시토카인, 예컨대, 인터루킨-1a (IL1 베타)의 효과를 분석하기 위한 플랫폼을 확립할 수 있는 기회를 제공한다. 2주 동안 TGFb3의 부재하에서 10주된 hPSC-유래된 AC를 IL1 베타로 처리한 결과 (도 9a), 기질 메탈로펩티다제 13 (MMP13) (도 9b) 및 MMP2 (도 9c), 및 ADAMTS4 & S5 (도 9d, e)를 비롯한, 이화 작용 효소의 발현이 상향조절되었다. 상기 효소는 연골 세포외 기질 (ECM)에서 발견되는 단백질, 예컨대, 콜라겐 및 아그레칸을 절단하며, 이에 의해 연골 조직은 분해된다. TGF베타3의 부재하에서만 오직 MMP13 및 ADAMTS4가 유의적으로 상향조절된 것으로 관찰되었다. ADAMTS5는 TGF베타3의 존재하에서 또는 부재하에서 유도되었다. TGF베타3의 부재 (도 9h-i) 또는 존재하에서 IL1 베타를 조직에 첨가하였을 때, 루브리신 (PRG4) 및 CILP2의 발현 또한 하향조절되었다. IL1 베타의 첨가 또한 COL2A1 및 ACAN 발현을 감소시켰고 (도 9f-g), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 발현을 증가시켰고 (도 9j), 조직내 프로테오글리칸을 현저히 손실시켰다 (도 9k). 종합해 보면, 상기 관찰 결과는 IL1 베타 신호전달이 조기 OA 발병 동안 천연 연골에서 관찰되는 것과 유사한 hPSC-유래된 AC에서 동화 환경에서부터 이화 상태로의 전이를 개시시킬 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 2
CD73+ 세포는 관절 비- 비대성 연골세포를 나타내고, CD73 양성성 결여를 통해 성장판-유사 비대성 연골세포를 확인할 수 있다.
본원에 기술된 방법, 예를 들어, 실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 연골세포 및 연골-유사 조직을 생성할 수 있다. CD73 세포 마커를 이용하여 전구체 또는 성장판-유사 연골세포인 세포로부터 관절 연골세포인 세포를 단리하고/분리할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, AC-유사 세포를 BMP4로 자극시키면, 상기 세포는 비대성이 되고, 그의 세포 표면 상에서의 CD73 발현은 손실된다. 사용될 수 있는 CD73 세포 표면 마커의 발현을 모니터링하는 방법은 형광성-활성화된 세포 분류 (FACS) 분석이다.
실시예 3
약물 독성 스크리닝을 위한 hESC - 유래된 연골세포의 용도
예를 들어, 실시예 1과 같이, 본원에 기술된 방법을 사용하여 수득된 HESC-유래된 연골세포는 예측 약물 독성 스크리닝 뿐만 아니라, 신약 개발을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 성장판-유사 연골 조직 계통을 대표하는 연골 조직 및/또는 비대성 연골 세포 뿐만 아니라, 그의 전구체를 시험 물질과 접촉시키고, 하나 이상의 생물학적 종점, 예컨대, 세포 사멸을 측정할 수 있다. 예를 들어, 세포 사멸은 예를 들어, 생활성 세포 염료 배제 검정, 예컨대, 트립판 블루 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 원하는 시점 이후에 트립판 블루 염료에 투과가능한 세포를 계수함으로써 시험 물질 (약물)에 노출된 AC-유사 연골세포를 세포 독성에 대해 모니터링할 수 있다. 다른 검정으로는 테트라졸륨 염 전환 검정을 포함한다. 상기 검정의 예로는 MTT 검정 뿐만 아니라, WST-1 검정을 포함한다. 상기 검정은 고처리량 스크리닝을 위해 자동화될 수 있다.
실시예 4
시험 물질에 의해 유도됨에 따른 세포 증식을 시험하는 데 있어서 hESC - 유래된 연골세포 또는 연골의 용도
hESC-유래된 연골세포 용도의 또 다른 일레는 세포 분화 또는 증식에 영향을 미치는 약물 검사이다. AC-유사 운명을 나타내는 CD73 마커 사용에 의해 모니터링시에, 일차 관절 연골세포의 관절 연골 조직으로의 증식에 영향을 줄 수 있는 약물 검사가 특히 관심의 대상이 될 것이다. 다양한 세포 증식 검정이 이용가능하고, 이는 관심 시험 물질에 대한 반응을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 3H 티미딘 혼입 검정은 시험 물질 또는 성장 인자 처리 이후의 세포 증식을 모니터링한다. 상기 처리 후, 세포를 16-24시간 동안 3H-티미딘과 함께 인큐베이션시킨다. 대안 검정은 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU) 혼입 검정이다. 추가의 또 다른 대안은 프로피듐 아이오딘 검사를 사용하는 것이다. 형광은 샘플 중 DNA 함량에 정비례한다. 세포 증식을 모니터링하는 본 방법은 단층 상에서 성장한 세포와 함께 사용될 수 있으므로, hESC-유래된 연골세포와 관련하여 특히 유용할 수 있다.
실시예 5
세포 계통을 구별하기 위한 방식으로서 연골세포의 크기 및 입도 사용
본 개시내용은 상이한 계통의 연골세포, 더욱 구체적으로, AC-유사 연골세포 뿐만 아니라, 성장판 유사 연골세포를 생성하는 방법을 기술한다. 상기 계통은 예를 들어, 크기에 기초하여 구별될 수 있다. 예를 들어, 살아있는 세포의 유동 세포측정법에 의한 분석 동안에 관찰되는 항체 기반 염색법의 부재하에서 hESC-유래된 연골세포의 전방 산란 (FSC-A) 및 측방 산란 (SSC-A)을 사용하는 것이 사용될 수 있다. TGFβ3으로 처리된 AC 유사 세포 집단은 일반적으로 균일한 크기 및 입도를 가지는 조밀한 세포 집단을 나타낸 반면, BMP4-처리 비대성 연골세포는 FSC-A 및 SSC-A 속상이 일반적으로 좀 더 큰 이질성 세포 집단을 보였다. 따라서, 살아있는 FSC-A 및 SSC-A 속성은 연골세포 비대를 유도하거나, 그를 막는 인자를 시험하는 실험에서 유용한 판독치가 될 수 있다.
실시예 6
리포터 유전자 검정을 사용한 세포 발생 및 세포 계통 모니터링
본원에 기술된 방법과 함께 리포터 유전자 검정을 사용함으로써 성숙한 연골 유전자, 예컨대, 루브리신 또는 콜라겐 10를 비롯한, 연골세포 특이적 유전자의 발현을 유지시키거나, 또는 변경시키는 인자 및 물질을 확인할 수 있다. 예를 들어, 루브리신 프로모터-RFP (적색 형광성 단백질) 표적화된 hESC 세포주는 형광성 현미경법에 의해 검출가능한 RFP의 발현 및 루브리신 프로모터 활성을 유도하는 시험 물질을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 루브리신 프로모터 RFP+ 발현, 형광 증가, 또는 루브리신 프로모터 RFP+를 발현하는 세포 비율의 증가가 비-비대성 관절 유사 연골세포 특징을 나타낸 세포 비율의 증가를 나타낼 것이다. 반대로, 루브리신 프로모터 RFP+ 손실은 상기 세포 및/또는 관절 연골세포 유사 특징의 손실을 나타낼 수 있다.
유사하게, 콜라겐 10 리포터 (예컨대, 콜라겐 10 프로모터-녹색 형광성 단백질 - GFP)는 연골 세포 또는 조직 중 콜라겐 10 발현 수준의 증가 또는 감소를 검출하는 데 유용할 것이다. 콜라겐 10-GFP+ 발현, 형광 증가, 또는 콜라겐 10-GFP를 발현하는 세포 비율의 증가가 비대성 연골세포 특징을 나타낸 세포 비율의 증가를 나타낼 것이다. 반대로, 콜라겐 10-GFP 손실은 비대 손실을 나타낼 수 있다.
리포터 라인 또한 유동 세포측정법 기반 스크린에서 사용될 수 있다.
대안적으로, 비-비대성 연골 세포 및/또는 비대성 연골 세포는, 리포터 유전자가 관절 연골세포 특이적 프로모터 (즉, 관절 연골세포 리포터 시스템), 임의적으로, 루브리신 프로모터 요소에 기능적으로 커플링된, 및/또는 리포터 유전자가 비대성 연골세포 특이적 프로모터, 임의적으로, 콜라겐 10 프로모터 요소 (즉, 비대성 연골세포 리포터 시스템)에 기능적으로 커플링된 것인, 리포터 유전자 시스템으로 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염될 수 있다. 세포를 선별한 후, 이어서, 시험 물질과 접촉시킬 수 있다. 관절 연골세포 분화를 유도화는 시험 물질은 (예컨대, 대조군과의 비교로) 관절 연골세포 리포터 시스템 활성을 측정함으로써 확인할 수 있고, 비대성 연골세포 분화를 유도화는 시험 물질은 (예컨대, 대조군과의 비교로) 비대성 연골세포 리포터 시스템 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다.
본 출원은 현재 바람직한 일례로 간주되는 것을 참조로 하여 기술되었지만, 본 출원은 개시된 일례로 한정되는 것은 아님을 이해하여야 한다. 그와 반대로, 본 출원은 첨부되 청구범위의 정신 및 범주 내에 포함되는 다양한 변형 및 등가인 각색도 포함하는 것으로 한다.
모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 공개 문헌, 특허 또는 특허 출원 그 전문이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 명시된 것과 같은 정도로 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 구체적으로, 예를 들어, 표 또는 그 밖에 다른 곳에서 제공된 수탁 번호 및/또는 바이오마커 서열 (예컨대, 단백질 및/또는 핵산)을 비롯한, 본원에서 제공된 각 수탁 번호와 관련된 서열은 그 전문이 참조로 포함된다.
명세서에서 참조된 참고 문헌에 대한 인용
Figure 112015106153130-pct00001
Figure 112015106153130-pct00002

Claims (74)

  1. a. 원시선-유사 중배엽 집단을
    i. FGF2, FGF4 및 FGF9로부터 선택되는 FGF 효능제; 및
    ii. 노긴, LDN-193189, 도소모르핀, 코르딘, 가용성 BMPR1a 또는 가용성 BMPR1b로부터 선택되는 BMP 억제제
    를 포함하는 축주위 중배엽 특정화 칵테일과 함께 배양하여, 세포 표면 CD73 및 CD105, CD73 및 PDGFR-베타, 또는 이들의 조합을 발현하는 축주위 중배엽 세포 집단을 특정화하는 단계;
    b. i. CD73 및 CD105, CD73 및 PDGFR-베타, 또는 이들의 조합을 발현하는 축주위 중배엽 집단을 고세포 밀도로 배양하고;
    ii. 무혈청 배지 중에서 고세포 밀도의 CD73+CD105+ 축주위 중배엽 집단, CD73+PDGFR베타+ 축주위 중배엽 집단 또는 이들의 조합을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 제조하는 것을 포함하는, 연골세포 전구체 집단을 생성하는 단계;
    c. i. 3주 이상 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3으로부터 선택되는 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 제조하거나; 또는
    ii. 3주 이상 동안 고세포 밀도의 Sox9+ 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 BMP4, BMP2, BMP6, BMP7 및 BMP10으로부터 선택되는 BMP4 효능제와 함께 배양하여 비대성 연골세포 유사 세포, 비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 제조하는 단계
    를 포함하고,
    상기 고세포 밀도는 0.2cm 내지 2cm 직경 세포 배양 플레이트 당 200,000 내지 1,000,000개의 세포, 또는 배지 20μl 당 100,000 내지 2,000,000개의 세포를 의미하는,
    연골세포, 연골, 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직, 비대성 연골세포 유사 세포, 비대성 연골 유사 조직 또는 이들의 조합을 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 c)가 3주 이상 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 상기 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 제조하는 것을 포함하는 것인, 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 생성하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 c)가 3주 이상 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 상기 BMP4 효능제와 함께 배양하여 비대성 연골세포 유사 세포, 비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 제조하는 것을 포함하는 것인, 비대성 연골세포 유사 세포, 비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 생성하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 축주위 중배엽 집단이 배아체, 단층 배양물 또는 그의 조합에 포함되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    a'. 만능 줄기 세포의 출발 집단을 원시선 유도 칵테일과 함께 배양하여 CD56 및 PDGFR-알파를 발현하는 원시선-유사 중배엽 세포 집단을 유도하는 단계;
    a. 원시선-유사 중배엽 집단을
    i. FGF2, FGF4 및 FGF9로부터 선택되는 FGF 효능제;
    ii. 노긴, LDN-193189, 도소모르핀, 코르딘, 가용성 BMPR1a 또는 가용성 BMPR1b로부터 선택되는 BMP 억제제; 및
    iii. SB431542, A83-01, D 4476, GW 788388, LY 364947, SB 505124, SB 525334 및 SD 208로부터 선택된 TGF베타 억제제, 및 DKK1, IWP2 또는 XAV939로부터 선택된 Wnt 억제제 중 하나 이상의 것
    을 포함하는 축주위 중배엽 특정화 칵테일과 함께 배양하여, 세포 표면 CD73 및 CD105, CD73 및 PDGFR-베타, 또는 이들의 조합을 발현하는 축주위 중배엽 집단을 특정화하는 단계;
    b. i. CD73 및 CD105, CD73 및 PDGFR-베타, 또는 이들의 조합을 발현하는 축주위 중배엽 집단을 고세포 밀도로 배양하고;
    ii. 무혈청 배지 중에서 고세포 밀도의 CD73+CD105+ 축주위 중배엽 집단, CD73+PDGFR베타+ 축주위 중배엽 집단, 또는 이들의 조합을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 제조하는 것
    을 포함하는, 연골세포 전구체 집단을 생성하는 단계; 및
    c. 3주 이상 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 제조하는 단계
    를 포함하는, 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 생성하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    a'. 만능 줄기 세포의 출발 집단을 원시선 유도 칵테일과 함께 배양하여 CD56 및 PDGFR-알파를 발현하는 원시선-유사 중배엽 세포 집단을 유도하는 단계;
    a. 원시선-유사 중배엽 집단을
    i. FGF2, FGF4 및 FGF9로부터 선택되는 FGF 효능제; 및
    ii. 노긴, LDN-193189, 도소모르핀, 코르딘, 가용성 BMPR1a 또는 가용성 BMPR1b로부터 선택되는 BMP 억제제
    를 포함하는 축주위 중배엽 특정화 칵테일과 함께 배양하여, 세포 표면 CD73, CD105 및 PDGFR-베타를 발현하는 축주위 중배엽 집단을 특정화하는 단계;
    b. i. CD73 및 CD105, CD73 및 PDGFR-베타, 또는 이들의 조합을 발현하는 축주위 중배엽 집단을 고세포 밀도로 배양하고;
    ii. 무혈청 배지 중에서 고세포 밀도의 CD73+CD105+ 축주위 중배엽 집단, CD73+PDGFR베타+ 축주위 중배엽 집단, 또는 이들의 조합을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 제조하는 것
    을 포함하는, 연골세포 전구체 집단을 생성하는 단계; 및
    c. 3주 이상 동안 고세포 밀도의 Sox9+ 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 상기 BMP4 효능제와 함께 배양하여 비대성 연골세포 유사 세포, 비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 제조하는 단계
    를 포함하는, 비대성 연골세포 유사 세포, 비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 생성하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    a'. 만능 줄기 세포의 출발 집단을 원시선 유도 칵테일과 함께 배양하여 CD56 및 PDGFR-알파를 발현하는 원시선-유사 중배엽 집단을 유도하는 단계;
    a. 원시선-유사 중배엽 집단을
    i. FGF2, FGF4 및 FGF9로부터 선택되는 FGF 효능제;
    ii. 노긴, LDN-193189, 도소모르핀, 코르딘, 가용성 BMPR1a 또는 가용성 BMPR1b로부터 선택되는 BMP 억제제; 및
    iii. TGF베타 억제제 및 Wnt 억제제 중 하나 이상의 것
    을 포함하는 축주위 중배엽 특정화 칵테일과 함께 배양하여, 세포 표면 CD73 및 CD105, CD73 및 PDGFR-베타, 또는 이들의 조합을 발현하는 축주위 중배엽 집단을 특정화하는 단계;
    b. i. 세포 표면 CD73 및 CD105, CD73 및 PDGFR-베타, 또는 이들의 조합을 발현하는 축주위 중배엽 집단을 고세포 밀도로 배양하고;
    ii. 무혈청 배지 중에서 고세포 밀도의 CD73+CD105+ 축주위 중배엽 집단, CD73+PDGFR베타+ 축주위 중배엽 집단 또는 이들의 조합을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 제조하는 것
    을 포함하는, 연골세포 전구체 집단을 생성하는 단계; 및
    c. i. 3주 이상 동안 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGF베타 효능제와 함께 배양하여 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 제조하거나; 또는
    ii. 3주 이상 동안 고세포 밀도의 Sox9+ 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 상기 BMP4 효능제와 함께 배양하여 비대성 연골세포 유사 세포, 비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 제조하는 단계
    를 포함하는, 연골세포를 생성하는 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 집단이 인간 배아 줄기 세포 집단 (hESC) 또는 유도성 만능 줄기 세포 집단 (iPSC)인 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, hESC 집단이 HES2 H1, H9, 또는 임의의 인간 iPS 세포주로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 집단이 배아체로 응집되는 것인 방법.
  11. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 집단을 1 내지 5일 동안 원시선 유도 칵테일과 접촉시키는 것인 방법.
  12. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 원시선 유도 칵테일이 액티빈 효능제 및, BMP4, BMP2, BMP6, BMP7 및 BMP10으로부터 선택되는 BMP4 효능제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  13. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 원시선 유도 칵테일이 wnt 효능제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 축주위 중배엽이 단층 배양물 중에서 특정화된 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, BMP 억제제가 1형 BMP 수용체 억제제, BMP 리간드, 가용성 BMP 수용체 또는 이들의 조합인 방법.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 원시선-유사 중배엽 집단을 1, 2, 3 또는 4일 동안 BMP 억제제와 접촉시켜 심장 근육 세포 특정화를 억제하는 것인 방법.
  17. 삭제
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 원시선-유사 중배엽 집단을 적어도 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일 또는 그 초과의 기간 동안 FGF 효능제와 접촉시켜 CD73, CD105 또는 상기 둘 다를 발현하는 세포의 비율을 FGF 효능제 비처리 세포와 비교하여 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65% 이상만큼 증가시키는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 축주위 중배엽 집단이 전사 인자 MeoxI 및 Nkx3.2를 또한 발현하고, Nkx2.5에 대해 음성인 방법.
  20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 축주위 중배엽 집단을 마이크로매스 배양물, 펠릿 배양물 또는 필터 배양물 중에, 또는 임의의 고세포 밀도 포맷으로 플레이팅하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 축주위 중배엽 집단을 마이크로매스 배양물 중에 10 x 106개의 세포/ml 내지 50 x 106개의 세포/ml인 세포 밀도로; 또는 막 필터 배양물 중에 500,000 내지 2 x 106개인 세포 밀도로 플레이팅하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 집단을 인슐린 및 트랜스페린을 포함하는 무혈청 기초 배지 중에서 배양하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 기초 배지가 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 보충제, 프롤린, 및 덱사메타손과 함께 DMEM을 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 축주위 중배엽 집단을 0 내지 4일 동안 고세포 밀도로 배양하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, CD73+CD105+ 축주위 중배엽 집단, CD73+PDGFR베타+ 축주위 중배엽 집단 또는 이들의 조합을 무혈청 배지 중에서 TGF베타3 효능제와 함께 3일 이상 동안, 또는 3일 내지 14일 동안 배양하여 Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 제조하는 것인 방법.
  26. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Sox9+, 콜라겐 2+ 연골세포 전구체 집단을 TGF베타 효능제와 함께 배양하는 기간이 적어도 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주 또는 그 초과이며, 이로써, 관절 연골 유사 조직이 제조되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 루브리신, 연골 중간층 단백질 2 (CILP2) 또는 상기 둘 다가 발현될 때까지, 연골세포 전구체 집단을 TGFb 효능제와 함께 배양하는 것인 방법.
  28. 삭제
  29. 제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, G 비대성 연골세포 유사 세포, G 비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 BMP4 효능제와 함께 배양하여 콜라겐 10+ 비대성 연골세포 유사 세포, 콜라겐 10+ 연골 유사 조직, Runx2+ 비대성 연골세포 유사 세포, Runx2+ 연골 유사 조직 또는 이들의 조합을 제조하는 것인 방법.
  30. 제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 고세포 밀도의 Sox9+, 콜라겐2+ 연골세포 전구체 집단을 BMP4 효능제와 함께 배양하는 기간이 적어도 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주 또는 그 초과이며, 이로써, 콜라겐 2를 발현하는 연골 조직 또는 콜라겐 10을 발현하는 비대성 연골세포 집단이 생성되는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, CD73+ CD105+ 세포, CD73+ PDGFR-베타+ 세포 또는 상기 둘 다를 고세포 밀도 배양 이전에 세포 표면 CD73 및 CD105, CD73 및 PDGFR-베타, 또는 이들의 조합을 발현하는 축주위 중배엽 집단으로부터 단리하는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 연골세포 전구체를 연골 조직 형성을 위해 TGF베타 효능제 또는 BMP4 효능제 중에서 배양하는 것인 방법.
  33. 삭제
  34. 제1항에 있어서, 연골세포 전구체 세포가 일차 태아 연골세포 또는 계대된 태아 연골세포인 것인 방법.
  35. 제1항에 있어서, 연골세포 전구체 세포가 연골 또는 골 병증 또는 질환을 앓는 대상체로부터 수득된 일차 세포인 방법.
  36. 제1항 내지 제7항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단계가 시험관내에서 수행되는 것인 방법.
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. a. 시험 물질을 연골세포 전구체 계통 세포 집단과 접촉시키는 단계로서, 시험 물질을 연골세포 전구체 계통 세포 집단과 접촉시키는 것은 제1항 내지 제7항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항의 방법 중 임의의 단계에서 이루어지는 것인 단계;
    b. 시험 물질 부재하에서 생성된 대조군 집단과 비교하여 시험 물질이 연골세포 증식, 유지, 분화 또는 이들의 조합에 미치는 효과를 평가하는 단계; 및
    c. 시험 물질이 대조군과 비교하여 증식을 증가 또는 감소시키거나, 연골세포 유지 또는 분화에 영향에 주었다면, 시험 물질을 후보 연골발생 조절 물질인것으로 확인하는 단계
    를 포함하는, 후보 연골발생 조절 물질을 시험하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 후보 연골발생 조절 물질이 연골 또는 골이 이환된 대상체로부터 단리된 인자인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 인자가 관절염을 앓거나, 비만이거나 또는 둘 다인 대상체의, 또는 대조군으로서의 건강한 대상체로부터의 관절내 지방 패드로부터 단리되는 것인 방법.
  60. 제57항에 있어서, 시험 물질을 BMP4 효능제와 함께 첨가하고, 시험 물질을 시험 물질의 부재하에서 처리된 대조군과 비교하여 비대를 억제시킬 수 있는 그의 능력에 대해 평가하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 비대가 유동 세포측정법을 사용하여 평가되는 것인 방법.
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. a. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 수득하는 단계;
    b. 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 시험 물질과 함께 배양하는 단계;
    c. 관절 유사 비-비대성 연골세포 유사 세포 증식을 측정하는 단계; 및
    d. 시험 물질의 부재하에서 배양된 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다와 비교하여 증식 증가를 검출하며, 이는 시험 물질이 후보 관절 연골세포 증식 유도제라는 것을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 후보 관절 연골세포 증식 유도제를 평가하는 방법.
  66. a. 제1항, 제3항 내지 제7항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 비대성 연골세포 유사 세포, 비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 수득하는 단계;
    b. 비대성 연골세포 유사 세포, 비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다를 시험 물질과 함께 배양하는 단계;
    c. 비대성 연골 세포 증식을 측정하는 단계; 및
    d. 시험 물질의 부재하에서 배양된 비대성 연골세포 유사 세포, 비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다와 비교하여 증식 증가를 검출하며, 이는 시험 물질이 후보 비대성 연골세포 증식 유도제라는 것을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 후보 비대성 연골세포 증식 유도제를 평가하는 방법.
  67. 제65항에 있어서, CD73+ 관절 유사 비-비대성 연골 세포, CD73+ 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직 또는 상기 둘 다가 시험 물질과의 배양 이전에 단리되는 것인 방법.
  68. 제65항에 있어서, 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 비대성 연골세포 유사 세포 또는 상기 둘 다가 관절 연골세포 특이적 프로모터에 기능적으로 커플링된 리포터 유전자 (즉, 관절 연골세포 리포터 시스템), 비대성 연골세포 특이적 프로모터에 기능적으로 커플링된 리포터 유전자 (즉, 비대성 연골세포 리포터 시스템) 또는 상기 둘 다를 포함하고; 관절 연골세포 분화를 유도하는 화합물이 관절 연골세포 리포터 시스템 활성을 측정함으로써 확인되고, 비대성 연골세포 분화를 유도하는 화합물이 비대성 연골세포 리포터 시스템 활성의 측정함으로써 확인되는 것인 방법.
  69. 제65항에 있어서, 증식 증가가 하기 방법: 3H 티미딘 혼입 검정; 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU) 혼입 검정; 프로피듐 아이오딘 검정 중 하나 이상의 것을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  70. a. 제1항 내지 제7항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항의 방법에 따라 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직, GPC 유사 세포, 성장판 연골 또는 이들의 조합을 생성하는 단계;
    b. 관절 유사 비-비대성 연골 세포, 관절 유사 비-비대성 연골 유사 조직, GPC 세포, 연골 유사 조직 또는 이들의 조합을 시험 물질과 배양하는 단계;
    c. 시험 물질의 세포/조직 독성 또는 연골세포 보호 활성을 측정하는 단계; 및
    d. 시험 물질의 부재하에서 배양된 관절 유사 비-비대성 연골 세포, GPC 세포, 조직 또는 이들의 조합과 비교하여 세포 독성 증가를 검출하며, 이는 시험 물질이 관절 연골세포, GPC 세포 또는 상기 둘 다에 독성이라는 것을 나타내는 것이거나, 또는 시험 물질의 부재하에서 배양된 관절 유사 비-비대성 연골 세포, GPC 세포, 조직 또는 이들의 조합과 비교하여 보호 활성 증가 (예컨대, 세포 독성 감소)를 검출하며, 이는 시험 물질이 보호성이라는 것을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 시험 화합물의 AC 세포, GPC 세포, 또는 AC 및 GPC 세포 보호 활성, 독성 또는 상기 둘 다를 평가하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 세포 독성이 하기 검정: 트립판 블루(Trypan Blue) 염료 검정; 루시페라제 검정; 테트라졸륨 염 전환 검정, 예컨대, MTT 검정 및 WST-1 검정 중 하나를 사용하여 측정되는 것인 방법.
  72. 제65항에 있어서, 증식, 세포 독성, 보호 활성 또는 이들의 조합이 하기 분석 또는 검정: 조직학적 분석, 생화학적 검정, 예컨대, 글리코사미노글리칸 및 프로테오글리칸 생산을 정량화하는 검정, 유전자 발현 분석, 현미경법 또는 유동 세포측정법에 의한 형광 리포터, 예컨대, 루브리신 또는 콜라겐 10의 획득/손실, CD73 세포 표면 수용체 발현의 획득 또는 손실, 세포 사멸에 대한 검정, 및 연골세포 비대를 나타낼 수 있는 세포 크기에 대한 유동 세포측정법 중 하나 이상의 것을 사용하여 평가되는 것인 방법.
  73. 제65항에 있어서, AC 유사 연골세포(들), AC 유사 연골 유사 조직(들) 또는 상기 둘 다; 또는 비대성 유사 연골세포(들), 비대성 연골 유사 조직(들) 또는 상기 둘 다를 질환 매개 인자와 접촉시키는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 질환 매개 인자가 시토카인 또는 관절 지방 패드 성분인 방법.
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