JP6588500B2 - 移植用中脳ドーパミン（ｄａ）ニューロン - Google Patents

移植用中脳ドーパミン（ｄａ）ニューロン Download PDF

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Description

政府許認可権
本発明は、部分的に、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）と米国国立神経疾患・脳卒中研究所（ＮＩＮＤＳ）のＮＩＨ／ＮＩＮＤＳ助成金第ＮＳ０５２６７１号及びＮＩＨ／ＮＩＮＤＳ助成金第Ｐ５０ ＮＳ０４７０８５号の下の政府支援を以て行われた。従って、米国政府は本発明にある特定の権利を有する。
本発明の分野
本発明は幹細胞生物学の分野、とりわけ万能性幹細胞又は多能性幹細胞の系譜特異的分化に関連し、それらの幹細胞には非胚性ヒト人工万能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に加えてヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、体性幹細胞、疾患を有する患者に由来する幹細胞、又は系譜特異的分化が可能である他のあらゆる細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。新規の培養条件を用いて底板中脳始原細胞への、その後さらに、大集団の中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンへのｈＥＳＣ及び／又はｈｉＰＳＣの系譜特異的分化を制御する方法が具体的に記載される。本発明の方法を用いて作製された中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンには、インビトロ創薬アッセイにおける使用、神経生物学研究における使用、及び患者におけるドーパミンニューロンの喪失による疾患又は障害を回復させる治療薬としての使用を含むが、これらに限定されない様々な使用法がさらに企図される。さらに、疾患、特にパーキンソン病のモデル化に使用するため、ヒト万能性幹細胞から中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを分化させるための組成物と方法が提供される。加えて、真正ＤＡニューロンはＣＤ１４２などのマーカー及びＡ９型神経細胞に富む。
多数の特定化した細胞型へ分化する能力を保持する細胞集団は、多数の系譜特異的分化細胞集団の発生にとって有用である。特定化した細胞へさらに分化する能力を保持するこれらの細胞集団は万能性細胞を含有する。万能性細胞の起源は胚性及び／又は非胚性体性幹細胞であり得る。
これらの系譜特異的分化細胞集団は、特定の細胞集団の機能欠損を引き起こす疾患を有する患者への細胞置換療法に使用されると考えられている。それらの細胞集団の直接的な治療上の価値に加えて、系譜特異的分化細胞は、細胞系譜特異的疾患を治療する治療分子の具体的な機能を同定、確認、及び試験するための、又はそれらの分子の送達を試験するためのインビトロスクリーニングアッセイを含む、様々な目的用の有用性が高い研究ツールでもある。
以前、胚性幹細胞と体性幹細胞が神経変性疾患の治療薬及びモデルシステムとして用いられた。胚性幹細胞及び体性幹細胞の制御性分化に関連する研究及び技術開発が、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び多発性硬化症など、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患の分野でなされてきた。しかしながら、これらの研究の結果は、インビボで使用されたこれらの細胞に患者の神経機能を回復させる能力はほとんど無く、多くの場合、患者に好ましくない腫瘍の増殖が生じることを示した。
それ故、特定の機能を有する細胞の喪失を引き起こす疾患を治療するための研究においても、治療薬としても使用され得る細胞集団を得るための組成物と方法が必要である。
本発明は幹細胞生物学の分野、とりわけ万能性幹細胞又は多能性幹細胞の系譜特異的分化に関連し、それらの幹細胞には非胚性ヒト人工万能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に加えてヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、体性幹細胞、疾患を有する患者に由来する幹細胞、又は系譜特異的分化が可能である他のあらゆる細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。新規の培養条件を用いて底板中脳始原細胞への、その後さらに、大集団の中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンへのｈＥＳＣ及び／又はｈｉＰＳＣの系譜特異的分化を制御する方法が具体的に記載される。本発明の方法を用いて作製された中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンには、インビトロ創薬アッセイにおける使用、神経生物学研究における使用、及び患者におけるドーパミンニューロンの喪失による疾患又は障害を回復させる治療薬としての使用を含むが、これらに限定されない様々な使用法がさらに企図される。さらに、疾患、特にパーキンソン病のモデル化に使用するため、ヒト万能性幹細胞から中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを分化させるための組成物と方法が提供される。加えて、真正ＤＡニューロンはＣＤ１４２などのマーカー及びＡ９型神経細胞に富む。
第１シグナル伝達阻害剤、第２シグナル伝達阻害剤及び第３シグナル伝達阻害剤を備えるキットであって、前記第１阻害剤がトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン‐ノーダルシグナル伝達を低下させることができ、前記第２阻害剤がスモールマザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を低下させることができ、そして、前記第３阻害剤がウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させることができる前記キット。１つの実施形態では、前記第１阻害剤はＬＤＮ‐１９３１８９である。他の実施形態では、前記第１阻害剤は、ＬＤＮ‐１９３１８９、その誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記第２阻害剤はＳＢ４３１５４２である。他の実施形態では、前記第２阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記第３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。他の実施形態では、前記第３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、その誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記キットはソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）８受容体ファミリーシグナル伝達活性化剤をさらに備える。１つの実施形態では、前記キットは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、グリア細胞株由来神経栄養因子、ジブチリルｃＡＭＰ及びトランスフォーミング増殖因子タイプβ３をさらに備える。１つの実施形態では、前記キットは、抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、抗フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、及び抗ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）からなる群より選択される抗体をさらに備える。１つの実施形態では、前記キットは、幹細胞、胚性幹細胞、人工万能性幹細胞、及び遺伝子操作細胞からなる群より選択される細胞をさらに備える。１つの実施形態では、前記キットは始原細胞及び中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを分化させるための指示書をさらに備える。１つの実施形態では、前記キットはパーキンソン病（ＰＤ）を有する患者より細胞を得るための指示書をさらに備える。
第１シグナル伝達阻害剤及び第２シグナル伝達阻害剤と接触する細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団の４０％超がフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）について陽性であり、前記細胞集団がそれまでに第１シグナル伝達阻害剤、第３シグナル伝達阻害剤、及びソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤と接触しており、前記第１阻害剤がトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン‐ノーダルシグナル伝達を低下させることができ、前記第２阻害剤がウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）シグナル伝達を低下させることができ、そして、前記第３阻害剤がスモールマザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を低下させることができる前記組成物。１つの実施形態では、前記第１阻害剤は、ＬＤＮ‐１９３１８９、その誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。１つの実施形態では、前記第２阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１及びその阻害剤からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記第３阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤はソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ及びスムーズンド（ＳＭＯ）受容体小分子アゴニストからなる群より選択され、その中で前記アゴニストはパルモルファミンである。いくつかの実施形態では、前記細胞集団はさらに線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）と以前に接触した。１つの実施形態では、前記細胞集団を含む前記の大半の細胞はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）+ＬＩＭ＋ホメオボックス転写因子１＋、α（ＬＭＸ１Ａ）、+ＮＧＮ２＋及びＤＤＣ＋底板中脳始原細胞である。１つの実施形態では、前記細胞集団は、げっ歯類細胞、霊長類細胞及びヒト細胞からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記細胞はパーキンソン病（ＰＤ）患者細胞に由来する。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）について少なくとも５０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも６０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも７０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも８０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも９０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも９５％で最大１００％陽性である。
インビトロ細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団を含む大半の細胞がチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）+フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）+ＬＩＭホメオボックス転写因子１＋、α（ＬＭＸ１Ａ）+底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンである、前記組成物。１つの実施形態では、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの前記４０％超はチロシンヒドロキシラーゼ陽性（ＴＨ＋）である。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも５０％チロシンヒドロキシラーゼ陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも６０％チロシンヒドロキシラーゼ陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも７０％チロシンヒドロキシラーゼ陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも８０％チロシンヒドロキシラーゼ陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも９０％チロシンヒドロキシラーゼ陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも９５％で最大１００％チロシンヒドロキシラーゼ陽性である。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は大半の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを含む。１つの実施形態では、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンは、核受容体ＮＵＲＲ１（ＮＲ４Ａ２）、ニューロン特異的ＩＩＩ型β‐チューブリン（Ｔｕｊ１）、ＴＴＦ３、ペアード（ｐａｉｒｅｄ）様ホメオドメイン３（ＰＩＴＸ３）、アカエテ‐スクート（ａｃｈａｅｔｅ‐ｓｃｕｔｅ）複合体（ＡＳＣＬ）、初期Ｂ細胞因子１（ＥＢＦ‐１）、初期Ｂ細胞因子３（ＥＢＦ‐３）及びトランスチレチン（ＴＴＲ）からなる群より選択されるマーカーについて陽性である。１つの実施形態では、前記中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロン集団は、ＤＡ、３，４‐ジヒドロキシ‐フェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及びホモバニリン酸（ＨＶＡ）からなる群より選択される分子について陽性である。１つの実施形態では、前記マーカーは、タンパク質及び核酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、前記中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロン集団はパーキンソン病（ＰＤ）患者からなる群より選択される患者においてインビボで移植することができる。１つの実施形態では、前記中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンはインビボで移植することができ、そして、ドーパミン（ＤＡ）神経機能を提供することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＬＤＮ‐１９３１８９及びＣＨＩＲ９９０２１と接触する細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団の４０％超がフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）について陽性であり、前記細胞集団がＬＤＮ‐１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤及びＣＨＩＲ９９０２１と以前に接触した、その組成物を抵抗する。１つの実施形態では、前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ及びパルモルファミンからなる群より選択される。１つの実施形態では、前記の１０％超の前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）とＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）について二重陽性である。１つの実施形態では、前記の大半の前記細胞集団は底板中脳始原細胞の集団である。１つの実施形態では、前記細胞集団は以前に線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）と接触した。１つの実施形態では、前記細胞集団は、げっ歯類細胞、霊長類細胞及びヒト細胞からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記ヒト細胞はパーキンソン病（ＰＤ）の神経学的症状を有する患者に由来する細胞である。１つの実施形態では、前記細胞集団は人工万能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。１つの実施形態では、前記細胞集団の１０％超は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）／ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）について二重陽性、及びフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）／オルトデンティクル（ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ）ホメオボックス２（ＯＴＸ２）について二重陽性の細胞からなる群より選択される。
１つの実施形態では、本発明は、底板中脳始原細胞集団への細胞の制御分化を誘導するための方法であって、ａ）：ｉ）非胚性幹細胞、胚性幹細胞、人工非胚性万能性細胞及び遺伝子操作万能性細胞からなる群より選択される細胞集団；及びｉｉ）第１シグナル伝達阻害剤、第２シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤及び第３シグナル伝達阻害剤であって、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン‐ノーダルシグナル伝達を低下させることができる前記第１阻害剤、スモールマザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を低下させることができる前記第２阻害剤、及びウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）シグナル伝達を低下させることができる前記第３阻害剤；を提供すること、ｂ）前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤と前記細胞集団を接触させること、ｃ）前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤と前記細胞集団を接触させた後に底板中脳始原細胞の集団を分化させるための条件下で前記細胞を前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤とさらに接触させること；及び）前記細胞集団を前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤と接触させた後に前記細胞集団を底板中脳始原細胞の集団に分化させるために前記細胞を前記第３阻害剤とさらに接触させること、を備える方法を提供する。１つの実施形態では、前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤との前記接触は底板中脳始原細胞の前記分化集団を生じさせることができる条件下にある。１つの実施形態では、前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤との前記接触はインビトロでの細胞播種から１時間以内である。１つの実施形態では、前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤との前記接触はインビトロでの細胞播種から４８時間以内である。１つの実施形態では、前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤との前記接触はインビトロでの細胞播種から６２時間以内である。１つの実施形態では、前記細胞の前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤との前記接触は底板中脳始原細胞の前記分化集団を生じさせることができる条件下にある。１つの実施形態では、前記細胞の前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤との前記接触は前記細胞集団の前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤との接触後少なくとも２４時間から最大３６時間までにある。１つの実施形態では、前記細胞の前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤との前記接触は最大１４４時間までにある。１つの実施形態では、前記細胞の前記第３阻害剤との前記接触は底板中脳始原細胞の前記分化集団を生じさせることができる条件下にある。１つの実施形態では、前記細胞の前記第３阻害剤との前記接触は前記細胞集団の前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤との接触後少なくとも２４時間から最大３６時間までにある。１つの実施形態では、前記細胞の前記第３阻害剤との前記接触は最大で１９２時間までにある。１つの実施形態では、前記細胞集団は、前記細胞の前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤との接触後少なくとも第１１日までに前記底板中脳始原細胞に分化する。１つの実施形態では、前記第１阻害剤はＳＢ４３１５４２である。１つの実施形態では、前記第２阻害剤はＬＤＮ‐１９３１８９である。１つの実施形態では、前記第３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。１つの実施形態では、前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ及びパルモルファミンからなる群より選択される。１つの実施形態では、前記方法は線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）、及び底板中脳始原細胞の前記分化集団を生じさせることができる条件下で前記細胞集団を前記ＦＧＦ８と接触させることをさらに提供する。１つの実施形態では、前記細胞の前記ＦＧＦ８との前記接触は前記細胞集団の前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤との接触後少なくとも２４時間から最大３６時間までにある。１つの実施形態では、前記細胞の前記ＦＧＦ８との前記接触は最大１４４時間までにある。１つの実施形態では、前記底板中脳始原細胞集団は４０％を超えるフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）+細胞を備える。１つの実施形態では、前記底板中脳始原細胞集団は４０％超フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）+ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）±細胞を備える。１つの実施形態では、前記方法は、底板中脳始原細胞の底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンへの分化のためにＮ２培地、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、グリア細胞株由来神経栄養因子、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）及びトランスフォーミング増殖因子タイプβ３を含む神経細胞成熟培地と底板中脳始原細胞の前記集団を接触させるステップｅ）をさらに備える。１つの実施形態では、前記方法は、底板中脳始原細胞の底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンへの分化のためにＢ２７栄養補助剤を含む神経細胞成熟培地と底板中脳始原細胞の前記集団を接触させるステップｅ）をさらに備える。１つの実施形態では、Ｂ２７栄養補助剤を含む神経基礎培地と接触した前記細胞は、底板中脳始原細胞の底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンへの分化のために脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、グリア細胞株由来神経栄養因子、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）及びトランスフォーミング増殖因子タイプβ３と接触する。１つの実施形態では、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンはフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）+ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）+、核受容体関連１タンパク質（ＮＵＲＲ１）+及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）+である。１つの実施形態では、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの４０％超がチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）+である。１つの実施形態では、底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの前記集団は前記細胞集団の前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤との接触後少なくとも第２５日までに分化する。１つの実施形態では、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンは分子を識別するマーカーについて陽性である。１つの実施形態では、前記マーカーは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１、ドムパミン（ｄｏｍｐａｍｉｎｅ）、３，４‐ジヒドロキシ‐フェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及びホモバニリン酸（ＨＶＡ）、α、核受容体ＮＵＲＲ１（ＮＲ４Ａ２）、ニューロン特異的ＩＩＩ型β‐チューブリン（Ｔｕｊ１）、ＴＴＦ３、ペアード（ｐａｉｒｅｄ）様ホメオドメイン３（ＰＩＴＸ３）、アカエテ‐スクート（ａｃｈａｅｔｅ‐ｓｃｕｔｅ）複合体（ＡＳＣＬ）、初期Ｂ細胞因子１（ＥＢＦ‐１）、初期Ｂ細胞因子３（ＥＢＦ‐３）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、シナプシン、ドーパミン・トランスポーター（ＤＡＴ）、及びＧタンパク質共役内向き整流性カリウムチャネル（Ｋｉｒ３．２／ＧＩＲＫ２）からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記分子は、タンパク質及び核酸からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記分子は、抗体、ＰＣＲプライマー、核酸配列及び酵素アッセイからなる群より選択されるマーカーを用いて識別される。１つの実施形態では、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンはドーパミン（ＤＡ）神経機能を提供するためにパーキンソン病（ＰＤ）を有する患者においてインビボで移植することができる。１つの実施形態では、前記方法は、ドーパミン産生ニューロンを必要とする患者であって、少なくとも１つの神経学的症状を示す前記患者を提供すること、及びドーパミン（ＤＡ）神経機能を提供するために前記患者へ底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを移植するステップをさらに備える。１つの実施形態では、前記神経学的症状は、身震い、運動緩慢（過度に遅い動作）、屈曲姿勢、姿勢動揺、及び強直からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記患者は前記神経学的症状の減少を示す。１つの実施形態では、前記細胞はげっ歯類細胞、霊長類細胞及びヒト細胞から選択される。１つの実施形態では、前記ヒト細胞はパーキンソン病（ＰＤ）の神経学的症状を有する患者に由来する細胞である。
１つの実施形態では、本発明は、治療処置のためのインビボ移植方法であって、ａ）：ｉ）底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの集団であって、前記集団の４０％超がチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現する前記集団；及びｉｉ）少なくとも１つの神経学的症状を示す対象；を提供すること、及びｂ）ドーパミン（ＤＡ）神経機能を提供するためにインビボ移植を可能にする条件下で前記対象に前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを移植すること、を備えるインビボ移植方法を提供する。１つの実施形態では、前記神経学的症状は、身震い、運動緩慢（過度に遅い動作）、屈曲姿勢、姿勢動揺及び強直からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記対象は前記神経学的症状の減少を示す。１つの実施形態では、底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの前記集団は、本発明の方法に従って処理された底板中脳始原細胞の集団に由来する。１つの実施形態では、底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの前記集団は、底板中脳始原細胞の底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンへの分化のためにＮ２培地、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、雑種細胞株由来神経栄養因子、ジブチリルｃＡＭＰ及びトランスフォーミング増殖因子タイプβ３を含む神経細胞成熟培地と底板中脳始原細胞の前記集団を接触させるステップをさらに備える方法に従って処理された底板中脳始原細胞の集団に由来する。１つの実施形態では、底板中脳始原細胞の前記集団は本発明の方法に従って処理された細胞集団に由来する。１つの実施形態では、底板中脳始原細胞の前記集団は、底板中脳始原細胞集団への細胞の制御分化を誘導するための方法であって、ａ）：ｉ）非胚性幹細胞、胚性幹細胞、人工非胚性万能性細胞及び遺伝子操作万能性細胞からなる群より選択される細胞集団；及びｉｉ）第１シグナル伝達阻害剤、第２シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤及び第３シグナル伝達阻害剤であって、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン‐ノーダルシグナル伝達を低下させることができる前記第１阻害剤、スモールマザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を低下させることができる前記第２阻害剤、及びウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）シグナル伝達を低下させることができる前記第３阻害剤；を提供すること、ｂ）前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤と前記細胞集団を接触させること、ｃ）前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤と前記細胞集団を接触させた後に底板中脳始原細胞の集団を分化させるための条件下で前記細胞を前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤とさらに接触させること；及びｄ）前記細胞集団を前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤と接触させた後に前記細胞集団を底板中脳始原細胞の集団に分化させるために前記細胞を前記第３阻害剤とさらに接触させること、を備える方法に従って処理された細胞集団に由来する。１つの実施形態では、底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの前記集団は動物、霊長類及びヒトからなる群より選択される細胞集団に由来する。１つの実施形態では、前記ヒト細胞はパーキンソン病（ＰＤ）の症状を有する患者に由来する細胞である。
１つの実施形態では、本発明は、ＬＤＮ‐１９３１８９及びＣＨＩＲ９９０２１と接触する細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団の４０％超がフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）について陽性であり、そして、前記細胞集団が以前にＬＤＮ‐１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤及びＣＨＩＲ９９０２１と接触した、前記組成物を提供し、前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤が、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ及びパルモルファミンからなる群より選択される。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）について少なくとも５０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも６０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも７０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも８０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも９０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも９５％で最大１００％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団の１０％超は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）／ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）について二重陽性、及びフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）／オルトデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）について二重陽性の細胞からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、少なくとも９５％から最大１００％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団の少なくとも２０％が、Ｎｕｒｒ１＋、ＣＤ１４２、ＤＣＳＭ１、ＣＤ６３及びＣＤ９９からなる群より選択されるマーカーについて陽性である。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、少なくとも９５％から最大１００％陽性である。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、少なくとも９５％から最大で１００％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団は、げっ歯類細胞、霊長類細胞、ヒト細胞及びパーキンソン病（ＰＤ）の神経学的症状を有する患者に由来するヒト細胞からなる群より選択される。
１つの実施形態では、本発明は、底板中脳始原細胞集団への細胞の制御分化を誘導するための方法であって、ａ）：ｉ）非胚性幹細胞、胚性幹細胞、人工非胚性万能性細胞及び遺伝子操作万能性細胞からなる群より選択される細胞集団；及びｉｉ）第１シグナル伝達阻害剤、第２シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤及び第３シグナル伝達阻害剤であって、ＳＢ４３１５４２である前記第１阻害剤、ＬＤＮ‐１９３１８９である前記第２阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ及びパルモルファミンからなる群より選択される前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤、及びＣＨＩＲ９９０２１である前記第３阻害剤；を提供すること、ｂ）前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤と前記細胞集団を接触させることであって、前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤との前記接触がインビトロでの細胞播種から４８時間以内にあるように底板中脳始原細胞の前記分化集団を生じさせることができる条件下で前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤と接触させること、ｃ）前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤と前記細胞集団を接触させた後に底板中脳始原細胞の集団を分化させるための条件下で前記細胞を前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤とさらに接触させること；及びｄ）前記細胞集団を前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤と接触させた後に前記細胞集団を底板中脳始原細胞の集団に分化させるために前記細胞を前記第３阻害剤とさらに接触させることを備える方法を提供する。１つの実施形態では、前記細胞の前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤との接触は、前記細胞の前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤との前記接触が前記細胞集団の前記第１阻害剤及び前記第２阻害剤との接触後少なくとも２４時間から最大で３６時間までにあるように底板中脳始原細胞の前記分化集団を生じさせることができる条件下にある。１つの実施形態では、前記細胞の前記第３阻害剤との接触は、前記細胞の前記第３阻害剤との前記接触が前記細胞集団の前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤との接触後少なくとも２４時間から最大で３６時間までにあるように底板中脳始原細胞の前記分化集団を生じさせることができる条件下にある。１つの実施形態では、底板中脳始原細胞集団は４０％を超えるフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）±ＬＩＭホメオボックス転写因子１＋、α（ＬＭＸ１Ａ）+細胞を備える。１つの実施形態では、その方法は、底板中脳始原細胞の底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンへの分化のためにＮ２培地、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、グリア細胞株由来神経栄養因子、ジブチリルｃＡＭＰ及びトランスフォーミング増殖因子タイプβ３を含む神経細胞成熟培地と底板中脳始原細胞の前記集団を接触させるステップｅ）をさらに備える。１つの実施形態では、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンは、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）／ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）／チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）；フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２／ＬＩＭホメオボックス転写因子１α／チロシンヒドロキシラーゼ／ＣＤ１４２；フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２／ＬＩＭホメオボックス転写因子１α／チロシンヒドロキシラーゼ／核受容体関連１タンパク質（ＮＵＲＲ１）；フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２／ＬＩＭホメオボックス転写因子１α／チロシンヒドロキシラーゼ／ＣＤ１４２／核受容体関連１タンパク質及びチロシンヒドロキシラーゼ／α‐シヌクレインからなる群より選択されるマーカーセットについて陽性である。１つの実施形態では、前記方法は、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンをＣＤ１４２の発現について選別してＣＤ１４２について少なくとも８０％陽性の細胞からなる集団に選別するステップｆ）をさらに備える。１つの実施形態では、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１、ドムパミン（ｄｏｍｐａｍｉｎｅ）、３，４‐ジヒドロキシ‐フェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及びホモバニリン酸（ＨＶＡ）、α、核受容体ＮＵＲＲ１（ＮＲ４Ａ２）、ニューロン特異的ＩＩＩ型β‐チューブリン（Ｔｕｊ１）、ＴＴＦ３、ペアード（ｐａｉｒｅｄ）様ホメオドメイン３（ＰＩＴＸ３）、アカエテ‐スクート（ａｃｈａｅｔｅ‐ｓｃｕｔｅ）複合体（ＡＳＣＬ）、初期Ｂ細胞因子１（ＥＢＦ‐１）、初期Ｂ細胞因子３（ＥＢＦ-３）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、シナプシン、ドーパミン・トランスポーター（ＤＡＴ）、及びＧタンパク質共役内向き整流性カリウムチャネル（Ｋｉｒ３．２／ＧＩＲＫ２）、ＣＤ１４２、ＤＣＳＭ１、ＣＤ６３及びＣＤ９９からなる群より選択される分子を特定するマーカーについて陽性である。１つの実施形態では、その方法は、ドーパミン産生ニューロンを必要とする患者、及びドーパミン（ＤＡ）神経機能を提供するために前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを移植することにより前記患者を処置するｅ）の後のステップをさらに備える、提供する。１つの実施形態では、前記患者は、身震い、運動緩慢（過度に遅い動作）、屈曲姿勢、姿勢動揺、及び強直からなる群より選択される少なくとも１つの神経学的症状を備える。１つの実施形態では、前記患者は、身震い、運動緩慢（過度に遅い動作）、屈曲姿勢、姿勢動揺、及び強直からなる群より選択される少なくとも１つの神経学的症状を有することが観察される。１つの実施形態では、前記患者は前記神経学的症状のうちの少なくとも１つの減少を示す。
１つの実施形態では、本発明は、治療処置のためのインビボ移植方法であって、ａ）：ｉ）底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの集団であって、前記集団の４０％超がチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現する前記集団；及びｉｉ）身震い、運動緩慢（過度に遅い動作）、屈曲姿勢、姿勢動揺及び強直からなる群より選択される少なくとも１つの神経学的症状を示す対象；を提供すること、及びｂ）ドーパミン（ＤＡ）神経機能を提供するためにインビボ移植を可能にする条件下で前記対象に前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを移植すること、を備える移植方法を提供する。１つの実施形態では、前記対象は前記神経学的症状のうちの少なくとも１つの減少を示す。１つの実施形態では、底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの前記集団は、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンをＣＤ１４２の発現について選別してＣＤ１４２について少なくとも８０％陽性の細胞からなる集団に選別するステップをさらに備える細胞の集団に由来する。１つの実施形態では、底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの前記集団は、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンをＣＤ１４２発現について選別してＣＤ１４２について少なくとも８０％陽性である細胞の集団に選別するステップの後の底板中脳始原細胞の集団に由来する。１つの実施形態では、底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの前記集団は、動物、霊長類、ヒト及びパーキンソン病（ＰＤ）の症状を有する患者からなる群より選択される細胞集団に由来する。１つの実施形態では、底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの前記集団は、動物、霊長類、ヒト及びパーキンソン病（ＰＤ）の症状を有する患者からなる群より単離された細胞集団に由来する。
ＣＨＩＲ９９０２２１添加に依存するヒトＥＳ細胞由来中脳底板前駆細胞の例となる誘導と神経原性変換を示す図である。（ａ）分化第１１日におけるＦＯＸＡ２（赤）、ＮＥＳＴＩＮ（緑、上段のパネル）、ＬＭＸ１Ａ（緑、中段のパネル）及びＯＴＸ２（緑、下段のパネル）の発現についての免疫細胞化学分析。（ｂ、ｃ）（ａ）に提示されているデータの定量。データ（平均値±ＳＥＭ）はそれぞれ３つ組で実施された３回の独立した実験からのものである。個々のマーカーについての有意性レベルがＬＳＢのみでの処理と比較して提示されている：ＡＮＯＶＡ；ダネット検定：***ｐ＜０．００１；**ｐ＜０．０１；ｐ＜０．０５）。（ｄ）３つの処理条件に使用された培養条件の略図。（ｅ、ｆ）ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ条件をＬＳＢ（ｅ）又はＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８（ｆ）と比較する第１１日における選択された差次的発現した遺伝子の表。（ｇ、ｈ）中脳ＤＡ前駆細胞同一性（ｇ）、前脳及び腹側非ＤＡ前駆細胞同一性（ｈ）の特徴を示す選択されたマーカーの時間的遺伝子発現分析。スケールバーは５０μｍに対応する。 ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理における中脳ＤＡニューロン運命の、ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８（腹側／視床下部）運命及びＬＳＢ（背側前脳）運命と比べた例となる免疫細胞化学及び分子分析を示す図である。（ａ）第２５日におけるＴｕｊ１（赤）／ＬＭＸ１Ａ（緑）（上段のパネル）及びＮＵＲＲ１（赤）／ＴＨ（緑）（下段のパネル）と組み合わせたＦＯＸＡ２（青）の発現についての免疫細胞化学分析。（ｂ）ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理培養物における定量的共発現分析。データ（平均値±ＳＥＭ）はそれぞれ３つ組で実施された３回の独立した実験からのものである。（ｃ、ｄ）包括的遺伝子発現分析を第２５日に実施した（３条件全てについて３つ組の試料）。ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ条件において第１３日と第２５日を比較する（ｃ）、及びＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理をＬＳＢ（ｄ、左のパネル）及びＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８（ｄ、右のパネル）と比較する最も差次的発現した遺伝子の選択された表。（ｅ）重要な中脳ＤＡニューロンマーカーについて正規化された差次的遺伝子発現分析。個々のマーカーについての有意性レベルがＬＳＢのみでの処理と比較して提示されている：ＡＮＯＶＡ；ダネット検定：***ｐ＜０．００１；**ｐ＜０．０１；ｐ＜０．０５）．スケールバーは５０μｍに対応する。 底板由来中脳ＤＡニューロンとロゼット由来中脳ＤＡニューロンを比べる例となるインビトロ成熟、特徴解析及び機能評価を示す図である。図３−１は例となる以下のものを示す。（ａ）分化第５０日におけるＬＭＸ１Ａ（緑、左のパネル）、ＦＯＸＡ２（青、左のパネル）及びＮＵＲＲ１（緑、右のパネル）と組み合わせたＴＨ（赤）についての免疫細胞化学分析。（ｂ）ロゼット由来培養物と底板由来（ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ）培養物を比べる、それらの培養物の総細胞のうちのＴＨ＋細胞、ＦＯＸＡ２＋細胞、ＬＭＸ１＋細胞及びＮＵＲＲ１＋細胞の定量。（ｃ）底板由来ＤＡニューロン培養物とロゼット由来ＤＡニューロン培養物における第５０日でのセロトニン＋（５‐ＨＴ）神経細胞サブタイプ、及びＧＡＢＡ＋神経細胞サブタイプの定量。（ｄ、ｅ）ＤＡと代謝物を測定するためのＨＰＬＣ分析。（ｄ）底板由来培養物の試料におけるＤＡの電気化学的検出の代表的なクロマトグラム。（ｅ）底板由来培養物とロゼット由来培養物の間のＤＡレベル、ＤＯＰＡＣレベル及びＨＶＡレベルの比較。（ｆ）ＴＨ（赤）及びシナプシン（緑）についての底板由来培養物（第８０日）の免疫細胞化学分析。（ｇ〜ｉ）ＤＡニューロン分化第８０日における底板培養物の電気生理学的分析。パッチされたニューロンの位相差画像（ｇ）及び対応する記録物（ｈ）。（ｉ）ＤＡニューロン同一性に特徴的な膜電位の振動（２から約５Ｈｚ）を示す出力分析。個々のマーカーについての有意性レベル（パネルｂ、ｃ、ｅ）がＦＰ由来培養物とロゼット由来培養物の比較として提示されている：スチューデントのＴ検定：***ｐ＜０．００１；**ｐ＜０．０１；ｐ＜０．０５）。スケールバーは（ａ）では５０μｍに、（ｆ、上段のパネル）では２０μｍに、（ｆ、下段のパネル）では５μｍに、そして、（ｇ）では２０μｍに対応する。（ｊ）ｍＤＡニューロンインビトロの成熟（第６５日）。ＴＨ陽性ニューロンは今までとおりＦｏｘＡ２を発現しており、そして、ｍＤＡニューロンに典型的な長い線維を伸長する。（ｋ）ＨＰＬＣによるＤＡ放出測定：６５日齢ＴＨ＋ニューロンはインビトロで機能的である。 底板由来中脳ＤＡニューロンとロゼット由来中脳ＤＡニューロンを比べる例となるインビトロ成熟、特徴解析及び機能評価を示す図である。図３−２は、本明細書に記載される底板系中脳ＤＡニューロンプロトコルによって作製された細胞の例となる概要を示す。（ａ）過去の戦略（例えば、Ｐｅｒｒｉｅｒ， Ａ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１， １２５４３〜８ （２００４））と対照的に、本明細書に記載される新規のプロトコルはＬＭＸ１Ａ／ＦＯＸＡ２陽性中脳底板（左のパネル）の生成とそれに続くニューロン変換（真中のパネル）及びＤＡニューロン成熟（右のパネル）に基づく。成熟した底板生成ＤＡニューロン細胞はＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ発現を保持する。 マウス、ラット及びサルのＰＤモデル宿主脳における底板由来ヒトＤＡニューロンの例となるインビボでの生存と機能を示す図である。（ａ〜ｄ）６‐ＯＨＤＡ傷害成体マウス（ＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌル株）における底板由来ＤＡニューロンの移植。（ａ）移植後４．５か月でのＴＨ発現と移植片の形態。（ｂ）ヒト特異的マーカー（ｈＮＣＡＭ、青）、ＴＨ（緑）、及びＦＯＸＡ２（赤）の発現。（ｃ）底板由来移植片におけるＦＯＸＡ２＋細胞、ＴＨ＋細胞及び二重標識細胞の定量（移植後４．５か月での平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４）。（ｄ）底板由来（青）移植片とロゼット由来（緑）移植片を比べるアンフェタミン誘導性回転分析。スケールバーは（ａ）では５００μｍに、（ｂ）では１００μｍに、及び（４ｃ）では４０μｍに対応する。（ｅ〜ｐ）６‐ＯＨＤＡ傷害成体ラットへの底板由来ＤＡニューロンの移植。ＴＨ（緑）とヒト特異的マーカー（赤）であるｈＮＡ（ｅ）及びｈＮＣＡＭ（４ｆ）の共発現についての免疫組織化学分析。（ｇ）総（ｈＮＡ＋）細胞数、ＴＨ＋細胞数及びＦＯＸＡ２を共発現するＴＨ＋細胞数の立体解析学的定量。平均的な移植片体積は２．６±０．６ｍｍ3）であった。（ｈ〜ｊ）中脳特異的転写因子であるＦＯＸＡ２、ＰＩＴＸ３及びＮＵＲＲ１（赤）とＴＨ（緑）の共発現を示す高出力画像。（ｋ〜ｍ）底板由来ＤＡニューロン移植片で処置された動物対偽処置動物の行動分析。（ｋ）アンフェタミン誘導性回転非対称。（ｌ）ステッピング試験：影響を受けた側と影響を受けていない側の間で前肢の無動を測定する。（ｍ）円筒試験：立ち上がり時の同側の足と反対側の足の間の嗜好性を測定する。移植された動物は少なくとも３回の試験で有意な改善を示した（４．５〜５か月でｐ＜０．０１；それぞれｎ＝４〜６）。（ｎ〜ｐ）ＴＨ（緑）のＤＡＴ（ｎ）、ＧＩＲＫ２（ｏ）及びカルビンジン（ｐ）との共発現（赤）についての免疫組織化学分析。有意性レベル（パネルｄ、ｋ、ｌ、ｍ）は：**ｐ＜０．０１；ｐ＜０．０５）である。スケールバーは（ｅ）では２００μｍに、（ｆ）では５０μｍに、（ｈ〜ｊ）では２０μｍに、そして、（ｎ〜ｐ）では４０μｍに対応する。（ｑ〜ｔ）成体１‐メチル‐４‐フェニル‐１，２，３，６‐テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）傷害アカゲザルへの底板由来ＤＡニューロンの移植。（ｑ）ヒト特異的細胞質マーカーであるＳＣ‐１２１（緑）の発現によって示される、移植から１か月後の代表的な移植部位の概観。（ｒ）周囲のＴＨ＋線維のハロ（矢印）を有する移植片におけるＴＨ発現。（ｓ）移植中核におけるＳＣ‐１２１（赤）のＴＨ（緑）との共発現の分析。（ｔ）ＴＨ＋ニューロン（緑）におけるＦＯＸＡ２（赤）の共発現分析。スケールバーは（ｑ）では２ｍｍに、（ｒ）では５００μｍに、（ｓ）では２００μｍに、そして、（ｔ）では５０μｍに対応する。（ｕ）宿主線条体への移植片由来線維伸長（ｈｕＮＣＡＭ＋）。（ｖ）移植片由来細胞はグリア細胞に分化しない。しかしながら、移植片はＴＨ＋細胞集団に加えて少数のセロトニン系線維を含有した。 例となるＣＨＩＲ９９０２１曝露のタイミングがＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ中脳底板前駆細胞の誘導を決定することを示す図である。（ａ）ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８処理のみ又は表示されている様々な時点で開始したＣＨＩＲ処理と組み合わせたＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８処理の後の分化第１１日におけるＦＯＸＡ２（赤）／ＬＭＸ１Ａ（緑）の免疫細胞化学分析。（ｂ）（ａ）に記載されるＣＨＩＲ曝露の差次的開始後の分化第１１日におけるＦＯＸＡ２＋細胞、ＬＭＸ１Ａ＋細胞及び二重標識細胞のパーセンテージの定量。個々のマーカーについての有意性レベルがＣＨＩＲ無し条件と比較して提示されている：ＡＮＯＶＡ；ダネット検定：***ｐ＜０．００１；**ｐ＜０．０１；ｐ＜０．０５）。スケールバーは５０μｍに対応する。 図例となるＦＧＦ８曝露がＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ中脳底板前駆細胞の誘導に主要な役割を果たさないことを示す図である。分化第１１日における免疫細胞化学によるＦＯＸＡ２（赤）／ＬＭＸ１Ａ（緑）発現の代表的な画像。細胞はＳＨＨ（パルモルファミン＋ＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ）及びＦＧＦ８の存在下、又は不在下でＬＳＢ／ＣＨＩＲに曝露された。スケールバーは５０μｍに対応する。 例となる高用量のＳＨＨ及び／又はスムーズンド小分子アゴニスト（パルモルファミン）への曝露がＣＨＩＲ９９０２１の存在下での効率的な中脳底板誘導に必要とされることを示す図である。分化第１１日におけるＦＯＸＡ２（赤）／ＬＭＸ１Ａ（緑）免疫細胞化学の代表的な画像。細胞は様々な濃度のＳＨＨ（ＳＨＨ‐Ｃ２５ＩＩ）及びスムーズンドアゴニストパルモルファミンの存在下でＬＳＢ／Ｆ８／ＣＨＩＲによって処理された。スケールバーは５０μｍに対応する。 分化第１１日と第２５日においてＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理培養物とＬＳＢ及びＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８処理培養物の間で差次的に発現した遺伝子の例となる分析を示す図である。（ａ）第０日、第１日、第３日、第５日、第７日、第１１日及び第１３日に３条件から得られた包括的遺伝子発現データの階層的クラスター分析（試料は各条件と各日について３つ組で評価された）。（ｂ）ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖのＤＡＶＩＤを用いるＧＯクラスに従った遺伝子濃縮分析。第１１日における比較により、正準ＷＮＴシグナル伝達のＣＨＩＲ９９０２１介在性活性化と合致する、ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ条件におけるＳＨＨとＷＮＴシグナル伝達の両方の濃縮が明らかにされる。「前脳発生」などの代替的な細胞運命及び「間脳」並びに「ホメオボックス」は第１１日と第２５日において非常に濃縮された他のＧＯタームである。（ｃ）中脳ＤＡニューロン条件（ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ）において濃縮される候補マーカーについてのアレン遺伝子ヒト発現データベース（ｈｔｔｐ：／／ｈｕｍａｎ．ｂｒａｉｎ‐ｍａｐ．ｏｒｇ）を用いるオンライン検証。利用可能なヒト脳領域特異的マイクロアレイデータによると、ＴＴＦ３、ＥＢＦ１、ＥＢＦ３及びＴＴＲが発現した。ＦＯＸＡ２の古典的な転写標的であるＴＴＲは成体の黒質ではわずかにしか発現せず、これは、ＴＴＲの主な役割が発生中に存在し得ること、又は、ＳＨＨ処理がインビトロ分化中に人工的に高いＴＴＲ発現レベルを引き起こし得ることを示唆している。 代表的な独立したｈＥＳＣ株とｈｉＰＳＣ株における底板誘導と中脳ＤＡニューロン発生の例となる分化プロトコルを示す図である。ｈＥＳＣ株Ｈ１及びｈｉＰＳＣ株の２Ｃ６（散発性ＰＤ患者に由来）とＳｅＶ６（センダイ系、無挿入）のデータが提示されている。図１ｄ及び図１０に記載されている底板系プロトコルを用いた後に分化第１１日におけるＦＯＸＡ２（赤）発現と分化第２５日におけるＴＨ（緑）／ＦＯＸＡ２（赤）を分析した。 底板由来ニューロン培養物とロゼット由来ＤＡニューロン培養物のために用いられた分化条件の例となる概略を示す図である。両方のプロトコルが二重ＳＭＡＤ阻害を用いて神経運命獲得を促進した。ＬＤＮは底板プロトコルにおいてＢＭＰ阻害のために使用され、一方、伝統的なノギン誘導がロゼット培養物のために使用された。略語は次の通りである：ＬＤＮ：ＬＤＮ‐１９３１８９、ＳＢ：ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨ（パルモルファミン＋ＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ）、ＦＧＦ８：ＦＧＦ８、ＢＡＧＣＴ：ＢＤＮＦ＋アスコルビン酸＋ＧＤＮＦ＋ｄｂｃＡＭＰ＋ＴＧＦβ３。ロゼットプロトコルにおけるＳＨＨ／ＦＧＦ８は、ロゼット由来ＤＡニューロン培養物のパターン形成についての最初の提言に従って、パルモルファミンが存在しない状態でＳＨＨ Ｃ２５Ｉのみを使用した。注記：ロゼット期におけるパルモルファミン処理は底板細胞のパターン形成に適切な濃度で毒性を示す。ＢＡＳＦ：ＢＤＮＦ＋アスコルビン酸＋ＳＨＨ／ＦＧＦ８。 底板由来ＤＡニューロン培養物の例となるインビトロ成熟を示す図である。（ａ）ＤＡＴ発現（赤；第８０日）についての底板由来ＴＨニューロン（緑）の免疫細胞化学分析。（ｂ）広範囲のＴｕｊ１＋（赤）線維路が分化第６０日までに観察され、２ｍｍ超の長さに及んだ。（ｃ）分化第８０日でのＴＨ＋ニューロン（緑）におけるＧＩＲＫ２（赤）の共発現。スケールバーは（ａ）では２０μｍに、（ｂ）では１００μｍに、そして、（ｃ）では２０μｍに対応する。 成体未処置（非傷害）マウス線条体（ＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌル株）における短期（６週間）インビボ生存試験の例となる免疫組織化学分析を示す図である。底板由来移植片の分析（第２５日細胞；１５０×１０3細胞／動物）。（ａ）ＴＨ＋宿主線維に囲まれるＴＨ＋細胞を示す移植中核の代表的な画像。平均６，２００ＴＨ＋細胞（ｎ＝３）が移植後６週間で移植片に存在した。（ｂ）ＦＯＸＡ２発現細胞（赤）は移植片で見出されたのみであり、周囲の宿主線条体では見出されず、移植片の起源と細胞の中脳同一性を示した。ほぼ全てのＴＨ＋ニューロン（緑）がＦＯＸＡ２（赤）を共発現した。しかしながら、かなりの割合のＦＯＸＡ２＋細胞はＴＨを共発現せず、これらの細胞が未だ成熟したＤＡ表現型を獲得していないこと、又はＤＡニューロンマーカーについて陰性である別のＦＯＸＡ２＋ニューロン集団を表していることを示唆した。スケールバーは５０μｍに対応する。 底板由来移植片とロゼット由来移植片を比較する長期（４．５か月）移植６‐ＯＨＤＡ傷害マウス（ＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌル株）の例となる組織学的分析を示す図である。底板由来移植片の分析。（ａ）最も底板由来移植片のうちの１つの例。その移植片は境界明瞭なｈＮＣＡＭ＋（赤）細胞構造を保持する。（ｂ）堅固なｈＮＣＡＭ＋線維伸長が移植片縁で観察された。（ｃ）移植片におけるセロトニン系（５‐ＨＴ＋）線維（緑）は大半がｈＮＣＡＭ（赤）について陰性であり、宿主の起源を示唆する。（ｄ）移植片におけるＧＡＢＡ系ニューロンと線維（緑）。ロゼット由来移植片の分析：（ｅ）宿主脳組織の圧縮を有する神経過形成。大半の細胞がＮＣＡＭ（赤）とＤＣＸ（緑）の両方について陽性であり、ニューロン運命を示唆した。（ｆ）ＮＣＡＭ＋／ＤＣＸ＋線維は移植されていない脳の反対側に伸長した。（ｇ）移植中核内では複数のＤＣＸ＋クラスターが観察された。（ｈ）ＴＨ＋細胞（緑）と線維は移植片縁においてほとんど観察されず、そして、ほぼ全てのロゼット由来ＴＨ＋細胞はインビボでＦＯＸＡ２（青）について陰性であった。４．５か月における底板由来対ロゼット由来移植片の免疫組織化学分析。代表的な画像が増殖マーカーＫｉ６７（赤）と神経前駆細胞マーカーＰＡＸ６（緑）の発現について（ｉ）、ＦＯＸＡ２／ＤＣＸの発現について（ｊ）、ＦＯＸＧ１／ｈＮＣＡＭの発現について（ｊ、挿入図）、及び星細胞マーカーＧＦＡＰ（緑）の発現について（ｋ）提示されている。スケールバーは（ａ）では５００μｍに、（ｂ〜ｄ）では５０μｍに、（ｅ）では５００μｍに、（ｇ〜ｈ）では５０μｍに、（ｉ）では５０μｍに、（ｊ）では４０μｍに、そして、（ｋ）では２０μｍに対応する。 長期（５か月）移植６‐ＯＨＤＡ傷害ＳＤラットの例となる組織学的分析を示す図である。（ａ）多数のｈＮＡ＋（赤）細胞がＴｕｊ１（緑）を発現し、ニューロン運命同一性を示した。（ｂ）移植片内のＧＦＡＰ＋線維（緑）はｈＮＡ（赤）を共発現せず、宿主の起源を示唆した。（ｃ）少数のヒトセロトニン系（５‐ＨＴ＋）細胞身体（緑）が観察され、一方、ほとんどのセロトニン系線維がマウス宿主におけるデータと同様に宿主に由来した（図１３Ｃ）。（ｄ）移植片内のＴＨ＋ニューロン（緑）のその他の例はｈＮＣＡＭ（赤）の発現を特徴とし、宿主脳における細胞のヒト同一性を確認した。スケールバーはパネル中で２５μｍに対応する。 霊長類の脳における底板由来移植片の例となる組織学的分析を示す図である。Ｈ９ ｈＥＳＣ由来の底板由来ＤＡニューロン、及びＨ９‐ＧＦＰ ｈＥＳＣ由来の底板由来ＤＡニューロン（第２５日培養物；１．２５×１０6細胞／路、３路／半球、総計６路）を成体ＭＰＴＰ傷害アカゲザル（２匹）の線条体に移植した。（ａ）上段の左及び右のパネル：代表的な移植部位（移植後１か月）の高解像度画像再構成像。移植片細胞構造がヒト特異的マーカーＳＣ‐１２１（非ヒト霊長類組織との交差反応性無し）についての免疫組織化学によって例示されている。下段の左のパネル：移植中核から伸長するＳＣ‐１２１＋線維。下段の右のパネル：ニューロン前駆細胞の形態を示すＳＣ‐１２１＋細胞のより高解像度の画像。（ｂ）移植中核におけるＧＦＰ発現の分析により、ＳＣ‐１２１データを補うそれらの細胞のヒト同一性がさらに確認された。注記：両方の動物について、それぞれ一方の半球は非標識Ｈ９由来細胞を移植され、他方の半球はＨ９‐ＧＦＰ細胞（ＥＦ１ａプロモーターの制御下でのＧＦＰの発現）に由来する細胞を受容した。（ｃ）ＤＡＢ検出を用いたＧＦＰ＋移植片のより高解像度の画像であって、神経芽細胞の形態を示す、移植片縁にある多数のＧＦＰ＋細胞を示す画像。（ｄ）ＧＦＰ及びＳＣ‐１２１について陰性である移植中核中の領域の免疫組織化学分析。これらの領域はＩｂａ１発現（赤）に基づく多数の宿主ミクログリア並びに少数のＥＤ１＋マクロファージ（青）を含有し、このことがシクロスポリン免疫抑制にもかかわらず持続する炎症を示唆した。スケールバーは（ａ、上段のパネル）では５００μｍに、（ａ、下段の左のパネル）では５０μｍに、（ａ、下段の右のパネル）では２０μｍに、（ｂ）では２μｍに、（ｃ、左のパネル）では５００μｍに、（ｃ、上段の右のパネル）では５０μｍに、（ｃ、下段の右のパネル）では１００μｍに、（ｄ）では１００μｍに対応する。 細胞を、ロゼット細胞中間体を介して（経て）ＤＡニューロン様細胞に分化させたこれまでのＭＳ５フィーダー細胞ベース方法を用いるｈＥＳＣからのＴＨ＋細胞の例となる誘導を示す図である。（上段）Ｐ０において、ＭＳ５フィーダー細胞を用いて、Ｏｃｔ４＋細胞のロゼット細胞への神経誘導を開始するための分子（Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４）とｈＥＳＣを接触させた。Ｐ１期において、細胞をＰ２期の細胞であって、ＴＨ＋／Ｅｎ１＋ＤＡニューロンにさらに分化するＰａｘ２＋／Ｅｎ１＋ＤＡ始原細胞を含む、特異的発現パターンを有する細胞に分化させるためのさらなる分子と細胞を接触させることによってロゼット細胞を増大させた。これらの細胞が６ＯＨＤＡ傷害ラットにおける移植のために使用され、シクロスポリンＡ処理により免疫抑制された。これらの移植試験はＴＨ＋表現型の喪失を含むＤＡ様ニューロンの非常に低いインビボ生存性を示し、そして、患者へのさらなる医療上の問題を引き起こすだろう移植動物にとって望ましくない、おそらくは致死性の細胞、すなわち、テラトーマのさらなる増殖、及び不適切な神経種への細胞の成長への懸念を示した。（Ａ）ロゼット由来ＤＡニューロン前駆細胞の移植片に移植後４．５か月において非常に少数の生存ＴＨ＋ニューロン（５０未満ＴＨ＋細胞／動物）が存在した。しかしながら、ＴＨ＋細胞と対照的に、ＧＦＰ標識細胞（ＧＦＰは広範に存在するプロモーターによって誘導された）は移植後では極めて生存性が高かった。このことは、移植後の大半の生存細胞は非ＤＡニューロン同一性を有する神経細胞であったことを示唆する（１６Ｂ）。（図１６Ｃ）ＴＨ（赤）を共発現する移植片由来細胞（ｈＮＡ＋（緑））はほとんど無く、これは大半の移植されたヒト細胞が非ＤＡニューロン表現型を装うことを示唆する。パネル１６Ｄ〜Ｅは、Ｄ〜Ｅ、非常に低いインビボ生存にもかかわらず、アンフェタミン誘導性回転（Ｄ）、円筒試験及び突発性回転（Ｅ）などの少数の行動試験においていくらかの（非常にわずかで、非常に変わりやすいが）改善が存在したことを示す。 少数の底板細胞の誘導のための例となるプロトコルを示す図である。改変二重ＳＭＡＤ阻害プロトコルが底板（ｆｐ）細胞を作製した。高濃度のＳＨＨがＦｏｘＡ２＋ｆｐ細胞の誘導に必要であり、そして、ＦＧＦ８、Ｗｎｔ１又はＲＡなどの尾方化パターン形成の合図のその付加はＦＯＸＡ２発現の低下を引き起こさなかったが、領域の独自性の変化を引き起こした。（Ａ）左のパネル：ＮＳＢ（ノギン／ＳＢ４３１５４２）での処理後の分化第１１日における細胞；中央の左のパネル：ＮＳＢ＋ＳＨＨ（ソニックＣ２５ＩＩ）処理；中央のパネル：ＮＳＢ＋ＳＨＨ＋ＲＡ；中央の右のパネル：ＮＳＢ＋ＳＨＨ＋Ｗｎｔ１；ＮＳＢ＋ＳＨＨ＋ＦＧＦ８；注記：ＮＳＢのみでの処理はＦｏｘＡ２発現を誘導しない。ＦｏｘＡ２＋底板細胞は高用量のＳＨＨの存在下で誘導されるのみである。ＲＡ、Ｗｎｔ１及びＦＧＦ８の添加はＦｏｘＡ２誘導を阻害しない。（Ｂ）ＲＡ又はＦＧＦでの処理後のＦＯＸＡ２の発現の維持を（又は、増加すら）示し、最も前方の底板様細胞を標識するＳＩＸ６発現の下方制御を同時に示す、ＦＯＸＡ２及びＳＩＸ６の遺伝子発現のｑＲＴ‐ＰＣＲ分析。（Ｃ）ＦＧＦ８及びＷｎｔ１の存在下における中脳前駆細胞及び中脳底板マーカーの遺伝子発現の誘導。 図１６及び１７において用いられた方法から作製された細胞での低レベルの、又は存在しないレベルの特徴と比べて高レベルの中脳の特徴を示す、底板細胞の誘導の例となるプロトコルを示す図である。Ａ：高レベルのＳＨＨ、ＦＧＦ８及びＣＨＩＲと接触させた細胞集団における中脳底板誘導が、図１６及び１７に示される他の２つの方法において記載される分子（それぞれＮ／ＳＢ及びＳＨＨ／ＦＧＦ８）と接触させた細胞と対照的に、分化第１１日において中脳マーカーであるＬＭＸ１Ａ及びＯｔｘ２の発現と共にＦｏｘＡ２の共発現を引き起こした。Ｂ：本発明の３つ目の方法を含む３つの方法の各々の分子（ＬＤＮ／ＳＢ、ＳＨＨ／ＦＧＦ８、ＬＳＢ／ＳＨＨ／ＦＧＦ８／ＣＨＩＲ）と接触させた細胞からなる３群を比較する、第１１日における包括的遺伝子発現分析。チャートＢは３つの処理条件の間で共通の遺伝子とそれぞれ個々の条件に特有の遺伝子を具体的に示す。チャートＢは図１において提示されたマイクロアレイの結果について用いられた予備分析である。Ｃ：中脳マーカーＦｏｘＡ２、ＬＭＸ１ＡのｍＲＮＡレベルはＳＨＨ／ＦＧＦ処理群と比べてＬＳＢ／ＳＨＨ／ＦＧＦ８／ＣＨＩＲ処理群において非常に濃縮されている。 底板の中脳領域に由来するドーパミンニューロンの例となるインビトロ特徴解析を示す図である。Ａ：分化第２５日におけるｍＤＡニューロンマーカーであるＴＨ、Ｎｕｒｒ１及びＬＭＸ１ＡによるＦｏｘＡ２＋ニューロンの共標識。Ｂ：ＬＤＮ／ＳＢ＋ＳＨＨ／ＦＧＦ８＋ＳＨＨ／ＦＧＦ８＋ＣＨＩＲ処理群におけるｍＤＡニューロンマーカー並びに他の中脳細胞種のｑＲＴ‐ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現レベル。 ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳ細胞と野生型ｈＥＳ（又はｉＰＳ）細胞の間の中脳ＤＡニューロン運命への例となる同等の分化能を示す図である。ＰＩＮＫ１ Ｑ４５６Ｘ変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株は本発明の新規底板ベース中脳ＤＡニューロン方法を用いて分化させられ、Ｈ９株から得られる中脳分化プロファイルと同等のプロファイルを生じた。（Ａ〜Ｃ）ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株の分化第１１日（中脳前駆細胞期）におけるＦＯＸＡ２（赤）、ＬＭＸ１Ａ（緑）及びＤＡＰＩ（青）（Ａ）についての、分化第２５日（初期分裂終了後ＤＡニューロン期）におけるＦＯＸＡ２（赤）とＴＨ（緑）（Ｂ）についての、及び、ＮＵＲＲ１（赤）とＴＨ（緑）（Ｃ）についての免疫細胞化学分析。（Ｄ〜Ｆ）分化第１１におけるＦＯＸＡ２（赤）、ＬＭＸ１Ａ（緑）及びＤＡＰＩ（青）（Ｄ）についての、分化第２５日におけるＦＯＸＡ２（赤）とＴＨ（緑）（Ｅ）についての、及び、ＮＵＲＲ１（赤）とＴＨ（緑）（Ｆ）についての、Ｈ９由来細胞を使用して実施された同じセットの免疫細胞化学分析。 インビトロでの長期分化と成熟の後のタンパク質凝集という例となるＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ提示ＰＤ様表現型を示す図である。分化第５５日において、ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣはＴＨ＋ＤＡニューロンの細胞質中にα‐シヌクレイン（ＰＤ患者におけるレビー小体形成の主要成分）発現の証拠を示した。それらの細胞はユビキチン（古典的なレビー小体マーカー）の高発現も示した。対照的に、対照ｉＰＳ株に由来するＤＡニューロンは（細胞質性と対照的に）正常なシナプス性α‐シヌクレイン発現と非常に低レベルのユビキチンの発現を示した。（Ａ、Ｂ）ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株の分化第５５日におけるα‐シヌクレイン（ＬＢ５０９、赤）、ＴＨ（緑）についての免疫細胞化学分析と統合画像（Ａ）及びα‐シヌクレイン（赤）とユビキチン（緑）についての免疫細胞化学分析（Ｂ）。（Ｃ、Ｄ）対照ｉＰＳＣ株の分化第５５日におけるα‐シヌクレイン（赤）とＴＨ（緑）（Ｃ）、及びα‐シヌクレイン（赤）とユビキチン（緑）（Ｄ）についての免疫細胞化学分析。 凝集型のα‐シヌクレインの例となる発現を示す図である。ＰＤ患者の脳では、二量体化した不溶性形態のα‐シヌクレインがレビー小体において凝集を引き起こす。二量体型のα‐シヌクレインはα‐シヌクレイン上のセリン１２９のリン酸化を示す。ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞はセリン１２９リン酸化α‐シヌクレインの強い発現を示し、対照ｉＰＳＣ由来細胞の非常に低レベルの発現と対照的であった。（Ａ、Ｂ）分化第５５日におけるＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞（Ａ）及び匹敵する対照ｉＰＳＣ由来細胞（Ｂ）におけるセリン１２９リン酸化α‐シヌクレイン（緑）及びＤＡＰＩ（青）の免疫細胞化学分析。 例となるα‐シヌクレイン発現パターンの差異が分化プロトコル中に観察されることを示す図である。発明者らは、「真正」中脳ＤＡニューロンがＰＤ特異的脆弱性及び対応する特異的インビトロ表現型を有することを示す。古典的なＭＳ５間質性フィーダー細胞ベース分化プロトコル（Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ２００４、参照により本明細書中に援用）を用いて得られるＤＡニューロンは多数のＴＨ＋ニューロンを産出することができる。しかしながら、本発明のデータによると、古典的なＭＳ５間質性フィーダー細胞プロトコルによる分化から生じるＴＨ＋細胞は真正中脳ＤＡニューロンではない。ＭＳ５プロトコルにより分化する培養物には多数のα‐シヌクレイン陽性細胞が存在した。しかしながら、それらの細胞はＴＨを共発現しなかった。また、ＭＳ５分化戦略を用いるとき、ＰＤ‐ｉＰＳＣと対照ｉＰＳＣの間では発現パターンに差異は存在しなかった。これらのデータは、α‐シヌクレインが他の非ＤＡ細胞種においても発現すること、及びそのような非ＤＡ α‐シヌクレインは、特に標準的なＭＳ５分化プロトコルを用いたときに、疾患由来細胞と対照ｉＰＳＣ由来細胞の間で変化しないことを示している。そして、本発明の新しい底板系分化プロトコルによりα‐シヌクレインを共発現する多数のＴＨ＋細胞が生じる。それらのＴＨ＋細胞は細胞質性発現パターンでα‐シヌクレインを発現する。（Ａ、Ｂ）ＭＳ５ベース分化の第６０日におけるＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株（Ａ）、及び対照ｉＰＳＣ（Ｂ）のα‐シヌクレイン（ＬＢ５０９、赤）、ＴＨ（緑）についての免疫細胞化学分析。（Ｃ）底板ベース分化の第５５日におけるＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株のα‐シヌクレイン（赤）、ＴＨ（緑）についての免疫細胞化学分析。 ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣに由来する例となるＤＡニューロンは有害性刺激に対してより脆弱であることを示す図である。本発明の底板系プロトコルから得られたＰＤ‐ｉＰＳＣ由来ＴＨ＋ＤＡニューロンは対照ｉＰＳＣ由来細胞よりも毒素負荷（バリノマイシン：ミトコンドリアイオノフォア、５ｕＭ、４８時間）に対して脆弱であった。対照的に、古典的なＭＳ５系プロトコルにより得られたＴＨ＋ニューロンはＰＤ由来細胞と対照由来細胞の間で差次的脆弱性を示さなかった。（Ａ〜Ｆ）分化第６０日における代表的なＴＨ免疫細胞化学：底板系プロトコルにより得られたＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞と対照ｉＰＳＣ由来細胞の両方の正常状態（毒素処理無し）（Ａ、ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞が示される）、毒素処理後のＰＤ‐ｉＰＳＣにおけるほぼ完全なＴＨ＋ＤＡニューロンの分解（Ｂ）、部分的に分解された対照ｉＰＳＣに由来するＴＨ＋ＤＡニューロン（Ｃ）、ＭＳ５系プロトコルより得られたＰＤ‐ｉＰＳＣ由来培養物と対照ｉＰＳＣ由来培養物の両方の正常状態（Ｄ、ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞が示される）、ＰＤ‐ｉＰＳＣにおける毒素負荷後のＴＨ＋ニューロン（Ｅ）、及びＭＳ５プロトコルより得られた対照ｉＰＳＣ由来培養物（Ｆ）。 ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣに由来する例となるＤＡニューロンは有害性刺激に対してより脆弱であることを示す図である。本発明の底板系プロトコルから得られたＰＤ‐ｉＰＳＣ由来ＴＨ＋ＤＡニューロンは対照ｉＰＳＣ由来細胞よりも毒素負荷（バリノマイシン：ミトコンドリアイオノフォア、５ｕＭ、４８時間）に対して脆弱であった。対照的に、古典的なＭＳ５系プロトコルにより得られたＴＨ＋ニューロンはＰＤ由来細胞と対照由来細胞の間で差次的脆弱性を示さなかった。（Ｇ〜Ｈ）分化第６０日における底板系プロトコルによるＴｕｊ１（赤）及びＴＨ（緑）についての免疫細胞化学の低出力画像：正常状態（Ｇ）と毒素負荷状態（Ｈ）のＰＤ‐ｉＰＳＣ及び正常状態（Ｉ）と毒素負荷状態（Ｊ）の対照ｉＰＳＣ。 ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣに由来する例となるＤＡニューロンは有害性刺激に対してより脆弱であることを示す図である。本発明の底板系プロトコルから得られたＰＤ‐ｉＰＳＣ由来ＴＨ＋ＤＡニューロンは対照ｉＰＳＣ由来細胞よりも毒素負荷（バリノマイシン：ミトコンドリアイオノフォア、５ｕＭ、４８時間）に対して脆弱であった。対照的に、古典的なＭＳ５系プロトコルにより得られたＴＨ＋ニューロンはＰＤ由来細胞と対照由来細胞の間で差次的脆弱性を示さなかった。（Ｋ〜Ｎ）分化第６０日におけるＭＳ５系プロトコルによるＴｕｊ１（赤）とＴＨ（緑）についての免疫細胞化学の低出力画像：正常状態（Ｋ）と毒素負荷状態（Ｌ）のＰＤ‐ｉＰＳＣ及び正常状態（Ｍ）と毒素負荷状態（Ｎ）の対照ｉＰＳＣ。 毒素負荷についての細胞生存性用量応答アッセイの例となる定量を示す図である。バリノマイシン処理から４８時間後のアラマーブルーを使用する細胞生存性アッセイによって、ＰＤ‐ｉＰＳＣと対照ｉＰＳＣを比較すると（本発明の底板ベース分化の第６０日）、毒素負荷（５及び１０ｕＭ）について特定の用量範囲における差次的細胞生存が示された。注記：このアッセイは全ての細胞死について試験するが、最も劇的な効果はＤＡニューロンにおいて特異的に観察された（図１４を参照のこと）。従って、アラマーブルーに基づく定量はＤＡニューロン系譜で観察される差次的効果の程度を過小評価する可能性がある。 万能性幹細胞に由来する、例となる移植されたヒトＤＡニューロンはマウス黒質緻密部（ＳＮｐｃ）において見られる電気生理的特徴に典型的な特徴を有することを示す図である。（Ａ）上段−移植片領域におけるペースメーカー・ニューロンの再構成。下段−９か月前にｈＥＳ由来ニューロンを注入したラットから作製した脳の薄片の顕微鏡写真；移植片の輪郭が示されている；より高倍率の画像が底部にある挿入図に示されている。その薄片をチロシンヒドロキシラーゼについて処理した。白色の領域を参照のこと。（Ｂ）上段−移植片中の推定されるＤＡニューロンからのセルアタッチ・パッチレコーディング；下段−同じ細胞からのホールセル・レコーディング。レコーディングは、シナプス入力を排除するためにグルタミン酸受容体アンタゴニストとＧＡＢＡ受容体アンタゴニスト（５０μＭ ＡＰ５、１０μＭ ＣＮＱＸ及び１０μＭガバジン）の存在下で行われた。これらのレコーディングは、ＰＳ由来ニューロンが通常の体細胞内電圧軌道を有する自律的なペースメーカーであったことを示す。移植片で記録された別のニューロンが同様の特性を有した。（Ｃ）比較のため、成体マウスのＳＮｐｃにおけるドーパミン系ニューロンからのセルアタッチ・レコーディングとホールセル・レコーディングが示されている。略語（ＣＴｘ＝皮質、ＳＴｒ＝線条体、ＳＮｐｃ＝黒質緻密部、ＤＡ＝ドーパミン系）。 例となるＡ９候補表面マーカー及びｈＰＳＣにおけるＣＤスクリーンを示す図である。（ａ）ＦＡＣＳ精製マウスＥＳＣ由来ｍＤＡニューロンからのトランスクリプトームデータのベン図。ＰＩＴＸ３とＮｕｒｒ１の間で共有される１０７遺伝子の間で大部分が中脳ＤＡニューロンの公知のマーカーであり、並びに新規マーカーが腹側中脳内で発現して確認された。ｂ）それらのマーカーのうちの１つは、ｍＲＮＡインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）発現データ（アレン・ブレイン・アトラス， Ｌｅｉｎ， Ｅ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｔｌａｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ４４５：１６８〜１７６ （２００７））によると、Ａ９領域内で濃縮されているようである推定上の表面マーカーであるＤＣＳＭ１であった。（ｃ〜ｆ）ＣＤスクリーン：（ｃ）代表的な９６ウェルプレート（完全ＣＤパネルをスクリーニングするために使用された３枚の９６プレートのうちの１枚）。黒色のウェルは第２５日でｈＥＳＣ ＤＡニューロンにおいて高発現するＣＤマーカーを標識する。（ｅ）ｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンにおけるＣＤスクリーニングの結果の概要。（ｆ）１つの例となるマーカーであって、Ｎｕｒｒ１＋期においてＤＡニューロンに特異的に濃縮される表面マーカーであるＣＤ１４２は、ＣＤ１４２＋細胞とＣＤ１４２−細胞の間のＦＡＣＳ介在性単離と選別後第７日での分析によって見出された。 例となるＣＤ１４２がＮｕｒｒ１＋中脳ＤＡニューロン期を濃縮し、ＧＡＢＡ及びセロトニン系のニューロンを失わせることを示す図である。（ａ）フローサイトメトリーにより分化第２５日における代表的なＣＤ１４２発現が示された。（ｂ）ＣＤ１４２はｈＥＳＣ株（例えば、ＷＡ０９；図２７ｆ）及び試験されたｈｉＰＳＣ株（Ｃ２９及びＭ３Ｘは分化第２５日の２つのヒトｉＰＳＣ株を表す）のＦＯＸＡ２／ＴＨ中脳ＤＡニューロンの中でＮｕｒｒ１＋期のものを濃縮した。（ｃ、ｄ）ＣＤ１４２によって、第２５日での選別及び３週間のインビトロ培養の後にＧＡＢＡ系及びセロトニン系の混入細胞が失われる。（ｅ、ｆ）ＣＤ１４２によって、移植から３か月後にインビボでＧＡＢＡ系及びセロトニン系のニューロンが失われる。細胞は第２５日にＣＤ１４２について選別された。注記：ＣＤ１４２細胞はＴＨ及びＡＡＤＣについても濃縮した。 例となる企図されたＰＳＡの実験上の使用法を示す図である。ＰＳＴ発現性及びＰＳＴｎｍ曝露ｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンがインビトロでＤＡ表現型及び線維伸長に対する影響について評価される。６ＯＨＤＡラットモデルにおけるインビボ試験によって、ＰＳＡの強制発現によるＤＡニューロンの数の低下が標準的移植片の行動回復と合致し得るかどうか、及び、ｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンにおけるＰＳＡの強制発現が複雑な運動機能のアッセイにおいて回復を誘導することができるかどうか試験される。 例となるＰＳＴの使用を示す図である。過剰発現（マウスＰＳＴ）によりマウスＥＳ細胞の分化においてＰＳＡ‐ＮＣＡＭレベルの上昇が引き起こされた。（Ａ）対照細胞（Ｎｕｒｒ１）及びＰＳＴを過剰発現する細胞（Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴ）におけるｑＰＣＲによるＰＳＴｍＲＮＡの定量。データはＮｕｒｒ１細胞に対してＮｕｒｒ１／ＰＳＴ細胞におけるＰＳＴレベルの濃縮倍率として表されている。（Ｂ）分化第１４日でのＤＡニューロン培養物におけるＰＳＡ免疫染色によりＮｕｒｒ１／ＰＳＴ細胞におけるＰＳＡレベルの上昇が示されている（スケールバー：１００μｍ）。（Ｃ）分化細胞におけるＮＣＡＭのウエスタンブロット。Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴ細胞（レーン２）は対照（レーン１）と比べたポリシアル酸化された形状のＮＣＡＭ（スメア、括弧）のレベルの上昇を示している。ＰＳＡはｅｎｄｏＮ処理後にＮＣＡＭから取り除かれる（レーン３）。（Ｄ）任意単位で表されるＰＳＡスメアの強度の定量。（Ｅ）分化第１４日におけるＰＳＡのＦＡＣＳ分析。分化の終了２４時間前の２０単位のｅｎｄｏＮによる細胞の処理がＰＳＴ効果を消失させた。（Ｆ）ＧＦＰ免疫蛍光とＤＡマーカーについてＮｕｒｒ１分化細胞とＮｕｒｒ１／ＰＳＴ分化細胞を比較する代表的な顕微鏡写真。ＧＦＰについて選別され、再播種された細胞がそれまで通りにＤＡ表現型（選別後）を保持した。スケールバー：１００μｍ。 ＥＳ由来ＤＡニューロンの例となるＦＡＣＳ分析を示す図である。フローサイトメトリーに基づくＧＦＰ＋及びＳＳＥＡ‐１−細胞の単離。二重陰性及びＧＦＰ陰性の対照として、Ｊ１マウスＥＳ−細胞を使用した。約５〜１０％の細胞が陽性として選別された。 例となるＮｕｒｒ１／ＰＳＴ移植片は６ＯＨＤＡマウスモデルにおける行動回復の誘導により効果的であったことを示す図である。Ｎｕｒｒ１：：ＧＦＰ細胞が分化させられ、第１４日にＧＦＰ＋／ＳＳＥＡ‐１−集団について選別された。ｅｎｄｏＮで処理した細胞は、２０単位のその酵素を用いる選別の前に１２時間培養された。５５，０００個の細胞をＢＤＮＦ及びＡＡを含む１ｍｌのＮ２培地中で移植した。（Ａ）移植前の３週間と、次に移植後の７週間の間のアンフェタミン誘導性回転についての動物のスコア（２０分の間の回転／分）。Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴ細胞はＮｕｒｒ１対照と比べて結果を有意に改善する（２元配置ＡＮＯＶＡ：ｐ＜０．０１、ボンフェローニ・ポストテスト付：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１；６動物／群）。ｅｎｄｏＮによるＰＳＡの除去はＰＳＴ効果を消失させる（ｐ＝０．２６）。（Ｂ）対照よりもエンドポイントのＰＳＴ移植片において多くのＧＦＰ＋細胞が存在した（ｐ＜０．０５、ｔ検定）。（Ｃ）中核部におけるＰＳＡ／ＧＦＰ免疫蛍光の比。**ｐ＜０．０１．スチューデントのｔ検定（ｎ＝５／移植片種）。（Ｄ）ＧＦＰ、ＴＨ及びＰＳＡの免疫蛍光。スケールバー：２００μｍ。（Ｅ）移植された細胞はＤＡマーカーを発現する。共焦点顕微鏡像の個々のｚ平面が示されている。スケールバー：２０μｍ。値は平均値±ＳＥＭである。 ＥＳ由来ＤＡニューロンによる宿主線条体神経支配を増加させた例となるＰＳＡ増加を示す図である。ＰＳＡ‐ＮＣＡＭ過剰発現は突起伸長を増大させた。（Ａ）対照におけるＧＦＰ／ＴＨ＋突起、ＧＦＰ／Ｇｉｒｋ２＋突起及びＧＦＰ／シナプシン＋突起の代表的な顕微鏡写真。Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴ試料における染色は同様であった。スケールバー：２０μｍ。（Ｂ）Ｎｕｒｒ１移植片及びＮｕｒｒ１／ＰＳＴ移植片の両方から伸長するＧＦＰ＋突起を示す代表的なｚスタック投影図。Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴ移植片から伸長するより多くのＧＦＰ＋突起が存在する（スケールバー：５０μｍ）。挿入図は同じ切片中のＧＦＰ＋／ＴＨ＋突起を示す。矢印：伸長の方向。（Ｃ〜Ｅ）注入領域に最も近くでの強度に対して正規化された様々な移植部位からの距離におけるＧＦＰ＋突起（Ｃ、Ｅ）及びＴＨ＋（Ｄ）突起の強度の定量（領域は約１００μｍずつ離れた５つのゾーンに分割された）。正規化はゾーンＩに対するものである；ＧＦＰ及びＴＨの両方データ、ｎ＝５／細胞種について２元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１；値は平均値±ＳＥＭである）。Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴ移植片は宿主線条体により多くの神経突起を伸長し、それはｅｎｄｏＮ処理によって部分的に抑制された（Ｅ）。（Ｆ）動物の回復は突起伸長の程度と相関した。グラフは非処理及びｅｎｄｏＮ処理Ｎｕｒｒ１移植動物及びＮｕｒｒ１／ＰＳＴ移植動物についてのゾーンＩＶにおけるＧＦＰ＋神経突起の強度と動物の回復の間の相関（線形回帰分析）を示す。それぞれの値は１匹の動物を表す（ｒ２＝０．６５、ｐ＜０．００１、ｎ＝１７）。 脊髄損傷に関連する方法及び運動ニューロンでの発現に方法に関する方法おけるＰＳＴの例となる使用を示す図である。対照脊髄では、移植されたＧＦＰシュワン細胞（ＳＣ）は宿主瘢痕組織により病変部に限定されるが（Ａ）、ＰＳＴ修飾ＳＣはかなりの距離を容易に移動する（Ｂ）。このＰＳＡ工学により運動力の向上、ＢＢＢサブスコアの向上（（Ｃ）の下方の線に対して上方の線）及び後肢機敏性の向上（グリッドウォーク試験；（Ｄ）の上方の線の対照に対して下方の線）が引き起こされた。（Ｅ、Ｈ）：ＰＳＴ導入が線維発芽と細胞移動（矢頭）をインビトロで増大させている、ＨＢ９：：ＧＦＰマウスＥＳＣの運動ニューロンへの分化（Ｅ、Ｆ）。これらのＰＳＴ−細胞の坐骨神経への移植が、ＥＤＬ筋肉における神経筋接合部（矢印）の数によって示されるように（Ｇ、Ｈ）、より良い標的神経支配を引き起こす。 例となるＰＳＴｎｍ酵素の使用を示す図である。（Ａ）ＰＳＴｎｍ産生ＰＳＡ（赤色の最も下の線）がＰＳＴの強制発現により産生されたＰＳＡ（緑色の真中の線）よりもさらに効果的に懸濁状態のシュワン細胞のシュワン細胞単層への接着を阻害する。（Ｂ）ＥＳＣ由来ＨＢ９運動ニューロンにおけるＰＳＡイムノブロッティングにより、ＰＳＴｎｍで処理された対照試料は検出不可能なＰＳＡレベルを有することが示される。ＰＳＴｎｍ＋ＣＭＰ‐シアル酸基質とのインキュベーションにより大きなＰＳＡのバンドが生じ、そのバンドはｅｎｄｏＮ処理により除去される。（Ｃ、Ｄ）ＰＳＴ遺伝子を用いて得られる効果と同様に、分化中のＰＳＴｎｍと基質によるこれらの細胞のポリシアル酸化が神経突起伸長と細胞移動（矢頭）を強化する。（Ｅ）第３０日のｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンのＰＳＡ免疫染色。（Ｆ）この染色はＰＳＴｎｍと基質を用いる処理の後で著しく増大する。（Ｇ）ＰＳＴｎｍのみのインビボ注射は何の効果も有しないが、（Ｈ）ＰＳＴｎｍの基質との共投与はマウス線条体における大量のＰＳＡ発現を引き起こす。
定義
本明細書において使用される場合、「疾患のモデル化」という用語は、障害の結果としてヒトにおいて観察される特定の兆候又は症状を模倣する、実験生物又はインビトロ細胞培養物を用いる方法を指す。１つの実施形態では、神経障害、例えばパーキンソン病（ＰＤ）を引き起こす遺伝的変異を有する動物モデルから得られた万能性幹細胞を培養し、ＰＤに関連するニューロンの新しい特徴を特定するために神経細胞に分化させることができる。１つの実施形態では、神経障害、例えばパーキンソン病（ＰＤ）を引き起こす遺伝的変異を有する個人から得られたヒト万能性幹細胞を培養し、その個人に観察されたのと同様の欠損を保持する神経細胞に分化させることができる。
本明細書において使用される場合、「パーキンソン症候群」という用語は、運動を制御する脳の部分である基底核におけるドーパミンの不足に全て関連する一群の疾患を指す。症状には身震い、運動緩慢（過度に遅い動作）、屈曲姿勢、姿勢動揺、及び強直が含まれる。パーキンソン症候群の診断はこれらの症状のうちの少なくとも２つの存在を必要とし、それらのうちの１つは身震い又は運動緩慢でなくてはならない。パーキンソン症候群の最も一般的な形態は特発性、又は古典的パーキンソン病（ＰＤ）であるが、かなり少数の診断、総数の約１５パーセントにパーキンソン・プラス症候群（ＰＰＳ）のうちの１つが存在し得る。これらの症候群は非典型的パーキンソン症候群としても知られ、皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、及び進行性核上性麻痺を含む。一般に、パーキンソン病は脳内の、主に黒質と呼ばれる脳の領域にある生神経細胞の機能不全と死を伴う。これらの生神経細胞の多くがドーパミンを産生し、これらのニューロンが死に絶えると脳内での分化により生じるドーパミンの量が減少し、ヒトが正常に運動を制御できないようにする。腸もパーキンソン病患者において変性するドーパミン細胞を有し、これがその疾患の一部である胃腸症状における重要な原因因子であり得る。個体が経験する一群の症状は人によって異なる。パーキンソン病の主要な運動上の兆候には次のものが含まれる：手、腕、脚、顎及び顔面の震え、運動緩慢又は動作緩慢、四肢及び胴体の強直又はこわばり、並びに姿勢動揺又はバランスと運動感覚の障害。
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、あらゆる種類の制御を含む特定の処置の受容者である哺乳類動物（ヒト及び動物、すなわち、非ヒト動物）を指す。典型的には、「対象」及び「患者」という用語はヒト対象に関して本明細書において互換的に使用される。
本明細書において使用される場合、「非ヒト動物」という用語は、げっ歯類動物、非ヒト霊長類動物、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類等を含むが、これらに限定されないあらゆる非ヒト動物を指す。
本明細書において使用される場合、「ドーパミン」という用語は、運動と協調運動を制御するニューロンを含有する脳の部分にメッセージを送るドーパミンニューロンによって作製される化学物質を指す。
本明細書において使用される場合、「ＬＳＢ」という用語は、細胞においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン‐ノーダルシグナル伝達及びスモールマザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）シグナル伝達からなるシグナル伝達を低下又は阻止することができる２つの化合物ＬＤＮ‐１９３１８９及びＳＢ４３１５４２の組合せを指す。
本明細書において使用される場合、「ＳＢ４３１５４２」という用語は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン‐ノーダルシグナル伝達を低下又は阻止することができ、ＣＡＳ番号３０１８３６‐４１‐９、Ｃ22Ｈ18Ｎ4Ｏ3の分子式、及び４‐［４‐（１，３‐ベンゾジオキシオル‐５‐イル）‐５‐（２‐ピリジニル）‐１Ｈ‐イミダゾール‐２‐イル］‐ベンズアミドの名称を有する分子を指す。例えば、下記の構造：
を参照のこと。一例では、ＳＢ４３１５４２は米国マサチューセッツ州、ケンブリッジのステムジェント（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）社のＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＳＢ４３１５４２である。
本明細書において使用される場合、「ＬＤＮ‐１９３１８９」という用語はＩＵＰＡＣ名４‐（６‐（４‐（ピペラジン‐１‐イル）フェニル）ピラゾロ［１，５‐ａ］ピリミジン‐３‐イル）キノリン、Ｃ25Ｈ22Ｎ6の化学式を有する小分子ＤＭ‐３１８９：
を指す。ＬＤＮ‐１９３１８９はＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤として機能することができる。ＬＤＮ‐１９３１８９はＡＬＫ２、ＡＬＫ３、及びＡＬＫ６タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の非常に強力な小分子阻害剤でもあり、Ｉ型ＴＧＦβ受容体のＡＬＫ１ファミリー及びＡＬＫ３ファミリーのメンバーのシグナル伝達を阻害し、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、及びアクチビンサイトカインのシグナルを含む複数の生物学的シグナルの伝達を阻害し、その後にＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、及びＳｍａｄ８のＳＭＡＤリン酸化を阻害することになる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｎａｔ Ｍｅｄ １４：１３６３〜１３６９； Ｃｕｎｙ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １８：４３８８〜４３９２、参照により本明細書中に援用）。一例となる実施形態では、ＬＤＮ‐１９３１８９は米国マサチューセッツ州、ケンブリッジのステムジェント社のＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＬＤＮ‐１９３１８９である。
本明細書において使用される場合、「グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害剤」又は「ＧＳＫ３β阻害剤」という用語はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β酵素を阻害する化合物を指す。例えば、Ｄｏｂｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ２００３；１１６：１１７５〜１１８６（参照により本明細書中に援用）を参照のこと。本発明の目的にとって、ＧＳＫ３β阻害剤はＷＮＴシグナル伝達経路を活性化することができる。例えば、Ｃａｄｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ２００６；１１９：３９５〜４０２、Ｋｉｋｕｃｈｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． ２００７；１９：６５９〜６７１（参照により本明細書中に援用）を参照のこと。
本明細書において使用される場合、「ＣＨＩＲ９９０２１」又は「ＣＨＩＲ」又は「アミノピリミジン」又は「３−［３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２−メチリデニル］−２−インドリノン」という用語はＩＵＰＡＣ名６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２‐イル）ピリミジン−２−イルアミノ）エチルアミノ）ニコチノニトリル：
を指す。ＣＨＩＲ９９０２１はＷＮＴシグナル伝達経路を活性化するグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の小分子化学阻害剤の一例であり、非常に選択的であり、一団の関連及び非関連キナーゼに対してほぼ千倍の選択性を示し、ヒトＧＳＫ３βに対して６．７ｎＭのＩＣ50を有し、げっ歯類ＧＳＫ３βホモログに対してナノモルレベルのＩＣ50値を有する。一例となる実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１は米国マサチューセッツ州、ケンブリッジのステムジェント社のＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＣＨＩＲ９９０２１である。
本明細書において使用される場合、「パルモルファミン」という用語は、例えば、スムーズンドを標的とすることによってヘッジホッグ経路を活性化する、ＣＡＳ番号第４８３３６７−１０−８号などのプリン誘導体を指す。一例として、下記の構造を参照のこと：
。一例となる実施形態では、パルモルファミンは米国マサチューセッツ州、ケンブリッジのステムジェント社のＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）パルモルファミンである。
本明細書において使用される場合、「シグナル伝達タンパク質」との関連において「シグナル伝達」という用語は、膜受容体タンパク質へのリガンド結合又は他の何らかの刺激によって活性化されるか、影響を受けるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例にはＳＭＡＤ、ＷＮＴ複合体タンパク質が含まれ、別の実施形態では、β‐カテニン、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ノッチ、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ、アクチビン、ノーダル、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）タンパク質、及び同種のものを含むＷＮＴ複合体タンパク質が含まれる。多数の細胞表面受容体又は内部受容体タンパク質にとって、リガンド受容体相互作用は細胞の応答には直接関係しない。リガンド活性化受容体は、細胞の挙動に対するそのリガンドの最終的な生理的効果が生じる前にまず細胞の内部の他のタンパク質と相互作用するに違いない。多くの場合、受容体の活性化又は阻害に続いて一連のいくつかの相互作用細胞タンパク質の挙動が変化する。受容体の活性化によって誘導される細胞の変化全体がシグナル伝達機構又はシグナル伝達経路と呼ばれる。
本明細書において使用される場合、「ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ」又は「ＬＳＢ／ＳＨＨ／ＦＧＦ８／ＣＨＩＲ」という用語は、本発明のＳ、ソニックヘッジホッグ活性化剤、Ｆ８、ＦＧＦ８、及びＣＨＩＲに加えてＬＤＮ‐１９３１８９及びＳＢ４３１５４２（すなわち、ＬＳＢ）と細胞を接触させることを指す。対照的に、「ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８」又は「ＳＨＨ／ＦＧＦ８」又は「ＳＨＨ／ＦＧＦ」は、以前に公開された方法において見られるように、ＣＨＩＲを除き、Ｓ、ソニックヘッジホッグ活性化剤、Ｆ８、ＦＧＦ８に加えてＬＤＮ‐１９３１８９及びＳＢ４３１５４２（すなわち、ＬＳＢ）と細胞を接触させることを指す。類似の略記法において、「ＬＤＮ／ＳＢ」はＬＤＮ‐１９３１８９及びＳＢ４３１５４２と細胞を接触させることを指す。
本明細書において使用される場合、「阻害する」又は「阻止する」という用語は、化合物（すなわち、阻害剤）で処理されたときの細胞の特定のシグナル伝達経路の活性レベルの、そのような化合物で処理されずにいるか、対照で処理された細胞の前記シグナル伝達経路の活性と比べた低下を意味する。
本明細書において使用される場合、「活性化する」という用語は、化合物（すなわち、阻害剤）で処理されたときの細胞の特定のシグナル伝達経路の活性レベルの、そのような化合物で処理されずにいるか、対照で処理された細胞の前記シグナル伝達経路の活性と比べた上昇を意味する。特定のシグナル伝達経路のあらゆるレベルの阻害又は活性化は、そのような阻害又は活性化が幹細胞の制御分化を引き起こす場合、本発明の実施形態と見なされる。
本明細書において使用される場合、「Ｓｍａマザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック」又は「スモールマザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック」又は「ＳＭＡＤ」という用語はシグナル伝達分子を指す。
本明細書において使用される場合、リガンドとの関連において「ＷＮＴ」又は「ウィングレス」という用語は、ＷＮＴ受容体、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄ及びＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体ファミリー内の受容体と相互作用することができる一群の分泌タンパク質（すなわち、ヒトのＩｎｔ１（インテグレーション１））を指す。
本明細書において使用される場合、シグナル伝達経路との関連において「ＷＮＴ」又は「ウィングレス」という用語は、β‐カテニンが介在する、又は介在しない、Ｗｎｔファミリーリガンド及びＷｎｔファミリー受容体、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄ及びＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体から構成されるシグナル経路を指す。本明細書に記載される目的にとって、好ましいＷＮＴシグナル伝達経路はβ‐カテニンによる仲介、すなわち、ＷＮＴ／β‐カテニンを含む。
本明細書において使用される場合、ＷＮＴとの関連において「正準経路」又は「古典的活性化」は複数のＷｎｔ下流シグナル経路のうちの１つを指し、例えば、正準経路においてＷｎｔリガンドの受容体へのそのＷｎｔリガンドの結合の主要な効果はβ‐カテニン分解複合体の阻害による細胞質性β‐カテニンの安定化である。他のＷｎｔ経路は非正準である。
一例として、小分子ＣＨＩＲは正準Ｗｎｔシグナル伝達下流経路に影響する。
本明細書において使用される場合、「ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ又はＳｈｈ）」という用語は、ヘッジホッグと呼ばれ、別のものはデザート・ヘッジホッグ（ＤＨＨ）であり、３つ目のものがインディアン・ヘッジホッグ（ＩＨＨ）である哺乳類シグナル伝達経路ファミリーの少なくとも３つのタンパク質のうちの１つであるタンパク質を指す。Ｓｈｈは経膜分子パッチト（ＰＴＣ）及びスムーズンド（ＳＭＯ）と相互作用することにより、少なくとも２つの経膜タンパク質と相互作用する。Ｓｈｈは通常ＰＣＴに結合し、それにより次にシグナル伝達因子としてＳＭＯを活性化させる。ＳＨＨが存在しない場合、ＰＴＣは通常ＳＭＯを阻害し、それにより次に転写抑制因子を活性化し、それで特定の遺伝子の転写が起こらない。Ｓｈｈが存在し、ＰＴＣに結合すると、ＰＴＣはＳＭＯの機能に干渉することができない。ＳＭＯが阻害されていないと、ある特定のタンパク質が細胞核に進入し、ある特定の遺伝子を活性化させる転写因子として作用することができる（Ｇｉｌｂｅｒｔ、２０００年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（マサチューセッツ州、サンダーランド：シナウアー・アソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）社刊）を参照のこと）。
本明細書において使用される場合、「活性化剤」又は「活性化物」という用語は本発明の細胞の制御分化を引き起こす活性化分子である小分子、ペプチド、タンパク質及び化合物を指す。例となる活性化剤にはＣＨＩＲ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ、小分子スムーズンドアゴニストパルモルファミン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤」という用語は、ＰＣＴ又はスムーズンドアゴニスト及び同種のものに結合する分子又は化合物を含む、ＳＨＨシグナル伝達経路を活性化するあらゆる分子又は化合物を指す。そのような化合物の例はタンパク質ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ及び小分子スムーズンドアゴニストパルモルファミンである。
本明細書において使用される場合、「ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ」という用語は、ＳＨＨを活性化するためにＳＨＨ受容体に結合することができる全長型マウスソニックヘッジホッグタンパク質の組換えＮ末端断片を指し、一例はＲ＆Ｄシステムズ社のカタログ番号４６４−ＳＨ−０２５／ＣＦである。
本明細書において使用される場合、「シグナル」という用語は細胞の構造と機能の変化を制御する内部因子及び外部因子を指す。それらの因子の性状は化学的又は物理的である。
本明細書において使用される場合、「リガンド」という用語は受容体（Ｒ）に結合する分子及びタンパク質を指し、例にはトランスフォーミング増殖因子β、アクチビン、ノーダル、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「阻害剤」又は「シグナル伝達阻害剤」という用語はシグナル伝達分子又はシグナル伝達分子の経路の阻害、例えばＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の阻害剤に関連しており、その分子又は経路のシグナル伝達機能に干渉する（すなわち、低下、又は抑制、又は排除、又は阻止する）化合物又は分子（例えば、小分子、ペプチド、ペプチドミメティック、天然化合物、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、又は抗体）を指す。言い換えると、阻害剤は、一例では、ＳＭＡＤシグナル伝達と直接的に接触することにより、ＳＭＡＤ ｍＲＮＡと接触することにより、ＳＭＡＤの立体構造の変化を引き起こすことにより、ＳＭＡＤタンパク質レベルを減少させることにより、又はＳＭＡＤのシグナル伝達パートナー（例えば、本明細書に記載されるものを含む）との相互作用に干渉することにより、及びＳＭＡＤ標的遺伝子（例えば、本明細書に記載されるものを含む）の発現に影響することにより、指名されたタンパク質（シグナル伝達分子、指名されたシグナル伝達分子に関与するあらゆる分子、指名された関連分子、例えばグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３０））（例えば、本明細書に記載されるシグナル伝達分子を含むが、これらに限定されない）のあらゆる活性を変えるあらゆる化合物又は分子である。阻害剤は上流シグナル伝達分子を横取りすることによってＳＭＡＤ生物活性を間接的に調節する分子も含む。従って、１つの実施形態では、本発明の阻害剤は既定細胞種から非既定細胞種への分化を誘導する（変える）、又は変更し、例えば、本発明の方法のうちの１つがＬＤＮ／ＳＢ、ＣＨＩＲ及び（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βを阻害し得る）ＳＨＨ活性化剤で非既定神経始原細胞に分化した始原細胞を備える。好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、例えば、底板中脳始原細胞の分化と本発明の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンについて本明細書に記載されるように、非既定細胞種への細胞分化を制御するために既定のシグナル伝達を「変更する」又は「低下させる」又は「阻止する」。従って、本発明の阻害剤は、出発細胞集団の底板中脳始原細胞への分化（第０日）に寄与するようにシグナル分子活性を変更する天然化合物又は小分子である。始原細胞が阻害剤と接触すると、これらの小分子は本発明の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンへのさらなる分化に寄与し得る。阻害剤は、次に指名された分子の阻害を引き起こす、指名されたシグナル伝達分子の上流に位置する分子に結合し、影響を与えることにより誘発された阻害に加えて、（活性部位に結合して別の既知の結合化合物の結合を排除又は低減する）競合的阻害と（タンパク質に結合してそのタンパク質の立体構造を変更し、そのタンパク質の活性部位への化合物の結合に干渉する）アロステリック阻害の見地から記載されている。いくつかの事例では、阻害剤は、実際にシグナル伝達標的に接触することによりシグナル伝達標的又はシグナル伝達標的経路を阻害することを指す、「直接阻害剤」と呼ばれる。例えば、γセクレターゼの直接阻害剤は、γセクレターゼタンパク質に結合するＤＡＰＴ分子である。
本明細書において使用される場合、「誘導体」という用語は類似の中核構造を有する化学化合物を指す。
本明細書において使用される場合、中脳ニューロンの胚発生期のものを含む、中脳に位置するインビボ細胞との関連において「底板中脳始原細胞」という用語はドーパミン産生細胞に分化し得る細胞を指す。いくつかの実施形態では、「底板中脳始原細胞」は、インビボで細胞が発現するマーカーと比べると、重複する、又は同一のマーカーセットを発現する、すなわち、例えば本明細書に記載される制御分化の開始後第１１日の辺りで本発明の培養細胞における底板マーカーＦＯＸＡ２と蓋板マーカーＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２、ＮＧＮ２、及びＤＤＣの共発現するインビトロの培養細胞を人工的に作製するために使用される培養中の細胞を指す。底板中脳始原細胞は「ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋」又は「ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋」であることが好ましい。いくつかの実施形態では、分化始原集団中の少数の細胞がＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ／ＴＨ＋である。
本明細書において使用される場合、「底板由来ＤＡニューロン」又は「真正中脳ＤＡニューロン」又は「中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロン」又は「底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロン」又は「移植可能中脳ＤＡニューロン」又は「ｍＤＡニューロン」又は「ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋」又は「ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ／ＴＨ」又は「ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＮＵＲＲ１＋ＴＨ＋」又は「ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ／ＮＵＲＲ１／ＴＨ」という用語は、通常制御分化の開始後第２５日の辺り、又はそれまでに本明細書に記載される方法によって得られた移植可能中脳ＤＡニューロン集団を指す。好ましい実施形態では、「真正中脳ＤＡニューロン」はＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋／ＮＵＲＲ１＋／ＴＨ＋である。これらのニューロンは、神経過形成及びテラトーマ形成にあまり干渉されることなくパーキンソン様神経学的症状を回復させるこれらのニューロンの能力を示したマウス及び霊長類における移植実験の後に「移植可能」と分類された。本発明の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンは移植能力を保持しつつインビトロで数か月間維持された。
本明細書において使用される場合、底板中脳始原細胞及び中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを得るために使用される細胞は、胚性供給源及び非胚性供給源、例えば、ｈＥＳＣ及び非胚性ｈｉＰＳＣ、体性幹細胞、疾患幹細胞、すなわち、パーキンソン病患者から単離された単離万能性細胞及び遺伝子操作由来幹細胞、癌幹細胞、ヒト万能性細胞又は哺乳類万能性細胞等を含む様々な供給源から得られる。
本明細書において使用される場合、「幹細胞」という用語は、培養状態で無期限の期間に細胞分裂し、そして、特殊化した細胞を生じさせる能力を有する細胞を指す。ヒトを含む動物及び患者から幹細胞を得ることができ、例えば、ヒト幹細胞はヒト性である幹細胞を指す。胚性供給源及び非胚性供給源を含む様々な供給源、例えば臍帯細胞、小児の細胞及び成人の細胞から幹細胞を得ることができる。本発明の目的にとって、成人幹細胞は概して元々胎児から得られなかった細胞、言い換えると、乳児由来の細胞、放棄臍帯、放棄胎盤細胞、小児由来の細胞、成人由来の細胞等を指す。
本明細書において使用される場合、「臍帯血幹細胞」という用語は、体内の血液細胞の全てを少なくとも作製する能力を有する（造血性の）生誕時に臍帯から回収された幹細胞を指す。
本明細書において使用される場合、「体性（成体）幹細胞」という用語は、（実験室における）自己新生と分化の両方の限定的な能力を有する、多くの器官及び分化組織において見出される比較的にまれな未分化細胞を指す。そのような細胞はそれらの細胞の分化能の点で異なるが、その分化能は通常、起源となった器官中の細胞種に限定される。
本明細書において使用される場合、「体細胞」という用語は配偶子（卵又は精子）以外の体内のあらゆる細胞を指し、時には「成体」細胞と呼ばれる。
本明細書において使用される場合、「神経系譜細胞」という用語は、発生期又は成体において神経系（中枢と末梢の両方）又は神経堤細胞運命に寄与する細胞を指す。神経系は脳、脊髄、及び末梢神経系を含む。神経堤細胞運命は頭蓋性、胴体性、迷走神経性、仙髄性、及び心臓性を含み、外胚葉系中胚葉、頭蓋軟骨、頭蓋骨、胸腺、歯、メラニン形成細胞、虹彩色素細胞、脳神経節、後根神経節、交感神経節／副交感神経節、内分泌細胞、腸神経系、及び心臓の部分を生じさせる。
本明細書において使用される場合、「成体幹細胞」という用語は体性幹細胞を指し、一例では、全ての赤血球と白血球と血小板を生じさせる乳児、小児、及び成体の幹細胞を指す「造血性幹細胞」を指す。
本明細書において使用される場合、「胚性幹細胞」という用語は、限定されないが、培養状態で長期間にわたり分化することなく細胞分裂することができ、３種の一次胚葉性の、すなわち、外肺葉性、中胚葉性、及び内胚葉性の細胞及び／又は組織に発生する能力を有することが知られている、未着床期の胚、人工的に作製された、すなわち、インビトロ受精による胚等を含むいくつかの供給源のうちの１つから得られる初生（未分化）細胞を指す。
本明細書において使用される場合、「内胚葉」という用語は胚盤胞の内部細胞塊に由来する細胞からなる層を指し、内胚葉は肺、他の呼吸構造、及び消化器官、又は一般的に「腸」を「インビボ」で生じさせ、そして、様々な細胞種をインビトロで生じさせる能力を有する。
本明細書において使用される場合、「胚性幹細胞株」という用語は、例えば、ヒトＷＡ‐０９細胞株の細胞を分化させることなく最大で数日、数か月から数年まで増殖させるインビトロ条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。
本明細書において使用される場合、「ヒト胚性幹細胞」又は「ｈＥＳＣ」という用語は、培養状態で長期間にわたり分化することなく細胞分裂することができ、３種の一次胚葉性の、すなわち、外肺葉性、中胚葉性、及び内胚葉性の細胞及び組織に発生することが知られている、胚盤胞期までを含むヒト初期胚から得られる種類の万能性幹細胞を指す。
本明細書において使用される場合、「人工万能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」という用語は、胚性幹細胞に類似した種類の万能性幹細胞を指し、それによって胚性幹細胞（ＥＳＣ）の「幹細胞性」の維持に重要な因子を強制的に発現させることにより体性（成体）細胞が再プログラム化されて胚性幹細胞様状態に進入する。マウスｉＰＳＣは２００６年に報告され（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ）、そして、ヒトｉＰＳＣは２００７年後半に報告された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ａｎｄ Ｙｕ ｅｔ ａｌ．）。マウスｉＰＳＣは、幹細胞マーカーの発現、３種全ての胚葉に由来する細胞を含有する腫瘍の形成、及び発生の非常に初期にマウス胚に注入されると多数の異なる組織に寄与する能力を含む、万能性幹細胞の重要な特徴を示す。ヒトｉＰＳＣも幹細胞マーカーを発現し、３種全ての胚葉に特徴的な細胞を形成することができる。胚性幹細胞と異なり、ｉＰＳＣはある特定の胚性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４導入遺伝子）（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６， ６６３〜６７６ （２００６）を参照のこと。参照により本明細書中に援用）を、例えば、導入される細胞であるＣ１４、Ｃ７２、及び同種のものに由来する細胞株の体細胞に導入することによって人工的に形成される。ｉＰＳＣの別の例は、プラスミドにクローン化された遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、及びＫＬＦ４）を用いて形質転換された成体ヒト皮膚細胞、又は線維芽細胞である。例えば、Ｙｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ＤＯＩ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７２４８２（参照により本明細書中に援用）を参照のこと。
本明細書において使用される場合、「全能性」という用語は身体の全ての細胞種、及び胎盤などの胚外組織を構成する細胞種の全てを生じさせる能力を指す。
本明細書において使用される場合、「多能性」という用語は１種より多くの身体の細胞種に発生する能力を指す。
本明細書において使用される場合、「万能性」という用語は少なくとも２つの身体の細胞種を生じさせるが、多くの場合、多数の異なる身体の細胞種を生じさせる能力を有する細胞を指す。万能性細胞は多くの場合免疫抑制マウスに注入された後にテラトーマを形成する。
本明細書において使用される場合、「万能性幹細胞」という用語は、環境要因、すなわち、すなわち、モルフォゲン、成長因子、シグナル伝達分子、活性化剤か阻害剤のどちらか等に応じて少なくとも２つの異なる細胞種に発生するこの細胞の能力を指す。いくつかの実施形態では、万能性幹細胞は、内胚葉、中胚葉、及び外肺葉を含む３種の発生起源層のうちのいずれか１つに発生する細胞の能力を指す。
本明細書において使用される場合、「特殊化した細胞」という用語は多細胞生物において特定の機能を実行するある種類の細胞を指す。例えば、特殊化した細胞、例えばニューロンの群は一緒に作用してある系、例えば神経系を形成する。
本明細書において使用される場合、「神経外胚葉」という用語は、神経系譜の細胞を生じさせることができる、発生初期又は万能性幹細胞の分化中に見出される細胞又は細胞運命を指す。
本明細書において使用される場合、「細胞増殖マーカー」という用語は、急速に細胞周期を回す細胞に関連する分子であって、成熟したゆっくりと細胞周期を回す細胞、又は細胞周期を回さない細胞では通常存在しない分子、すなわち、細胞周期時間が長期化した細胞、又は細胞周期を回さない細胞に対して活動性分裂細胞に関連する分子の発現を指す。そのようなマーカーの例には細胞増殖のＫｉ６７マーカー（Ｇｅｒｄｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３１：１３〜２０ （１９８３）、参照により本明細書中に援用）及び体細胞分裂のＧ２／Ｍ期のリン酸化ヒストンＨ３マーカー（Ｈｅｎｄｚｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ １０６：３４８〜３６０ （１９９７）、参照により本明細書中に援用）が含まれる。
本明細書において使用される場合、「増殖」という用語は細胞数の増加を指す。
本明細書において使用される場合、「分化」という用語は、特殊化していない胚性細胞が特定の種類のニューロン、脳細胞、心臓細胞、肝臓細胞、又は筋肉細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得する過程を指す。分化は、通常、細胞表面に埋め込まれているタンパク質を伴うシグナル伝達経路を介して細胞の外部の物理的条件及び化学的条件と細胞の遺伝子の相互作用によって制御されている。
本明細書において使用される場合、「分化」という用語は、細胞分化系の細胞に関して使用される場合、ある細胞種（例えば、多能性分化可能細胞、全能性分化可能細胞又は万能性分化可能細胞）から目標とする分化細胞などの別の細胞種に分化する過程を指す。
本明細書において使用される場合、「細胞分化」という用語は、あまり特殊化していない細胞（すなわち、幹細胞）が発達又は成熟してより明瞭な形態と機能を有するようになる（例えば、ｉＰＳＣが神経堤始原細胞から神経系譜の細胞へ、そして、底板中脳始原細胞へ、そして、本発明の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンに発達する）経路を指す。
本明細書において使用される場合、「未分化」という用語は特殊化した細胞種に未だ発達していない細胞を指す。
本明細書において使用される場合、細胞分化経路との関連において「既定」又は「受動的」という用語は、あまり特殊化していない細胞がある特定の化合物で処理されていないときに、すなわち、少なくとも１つのモルフォゲンと接触することも無い通常の細胞培養条件のときに培養状態においてある特定の分化細胞種になる経路を指す。言い換えると、既定細胞は、細胞が分化細胞種を変化させることができる分子（すなわち、モルフォゲン）と接触していないときに生じ、例えば、ＬＳＢのみで処理され、本発明のフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）＋細胞を作製するためのＳＨＨの活性化剤又はＷｎｔの活性化剤で処理されていない培養物は代わりにマーカーＨＥＳＳ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、及びＥＭＸ２を発現する。対照的に、細胞との関連において「非既定」は、既定細胞とは異なる細胞種を生じる分化細胞種を指す。すなわち、非既定細胞は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）＋神経細胞、底板中脳始原細胞及び本発明の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロン等を含む本発明の細胞など、非既定条件により生じる分化細胞である。既定細胞は、ＣＨＩＲなどのモルフォゲンとの接触が無いために中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンではない、後で既定細胞になる非既定底板中脳始原細胞のような、細胞が非既定細胞になるためにモルフォゲンと接触した後の既定細胞であって、その後にモルフォゲン化合物と接触していない既定細胞でもあり得る。
本明細書において使用される場合、「モルフォゲン」という用語は細胞の分化に影響する、すなわち、少なくとも部分的に細胞運命を決定する化合物を指す。モルフォゲンは細胞に影響して非既定細胞種に分化させることもできる。
本明細書において使用される場合、「制御分化」という用語は、底板中脳始原細胞及び本発明の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンのような特定の（例えば、所望の）細胞種への分化を誘導する幹細胞培養条件の操作を指す。１つの実施形態では、細胞との関連において「制御分化」という用語は、万能性状態からより成熟した、又は特殊化した細胞運命（例えば、中枢神経系細胞、神経細胞、底板中脳始原細胞及び本発明の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロン等）への細胞の移行を促進する小分子、成長因子タンパク質、及び他の培養条件の使用を指す。１つの好ましい実施形態では、制御分化の開始は第０日における細胞のＬＤＮ／ＳＢとの接触である。本明細書に記載される制御分化を受ける細胞は底板中脳始原細胞及び本発明の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンという非基底細胞種を形成する。
本明細書において使用される場合、細胞との関連において「分化誘導」という用語は既定細胞種（遺伝子型及び／又は表現型）を非既定細胞種（遺伝子型及び／又は表現型）に変更することを指す。従って、「幹細胞における分化誘導」は、細胞を分裂させて、遺伝子型（すなわち、マイクロアレイなどの遺伝解析によって決定される遺伝子発現の変化）及び／又は表現型（すなわち、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）及びＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）について陽性（＋）であり、ＰＡＸ６については陰性（−）であるといった、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）又は一連のタンパク質などのタンパク質の発現の変化）などの、幹細胞と異なる特徴を有する子孫細胞になるように誘導することを指す。
本明細書において使用される場合、「細胞運命決定」など、細胞との関連において「運命」という用語は概して遺伝的に決定された系譜を有する細胞であって、インビボ又はインビトロの培養条件に応じて様々な細胞種又は少数の特定の細胞種になることができる子孫細胞を有する細胞を指す。言い換えると、細胞の予め定められた運命はその細胞の環境によって特定の分化経路に向かうように決定され、細胞がある細胞種の代わりに別の細胞種、例えば、筋肉細胞又は皮膚細胞の代わりに神経細胞になる「神経運命」を有する幹細胞の子孫細胞になる。
本明細書において使用される場合、「神経突起伸長」又は「神経伸長」という用語は細胞から伸長した、膜に包まれた細胞質の突出部の観察を指す。
対照的に、「神経過形成」は望ましくない無制限の神経増殖、すなわち、ニューロンの無制御増殖、移植部位における移植細胞の無制御増殖を指す。本明細書において使用される場合、「テラトーマ」という用語は移植細胞から増殖する、あらゆる組織種に由来する非癌性腫瘍を指す。
本明細書において使用される場合、「テラトーマ形成」という用語は移植細胞の増殖による様々な組織種の非癌性腫瘍への望ましくない増殖を指す。
本明細書において使用される場合、「ドーパミンニューロン」又は「ドーパミン系ニューロン」という用語は概してドーパミンを発現することができる細胞を指す。「中脳ドーパミンニューロン」又は「ｍＤＡ」は前脳構造における予定運命上のドーパミン発現細胞、及び前脳構造におけるドーパミン発現細胞を指す。
本明細書において使用される場合、「神経幹細胞」という用語はニューロン及びグリア（支持）細胞を生じさせることができる、成体神経組織中に見出される幹細胞を指す。グリア細胞の例には星細胞及び乏突起膠細胞が含まれる。
本明細書において使用される場合、「底板」又は「ＦＰ」又は「ｆｐ」という用語は、神経管の非対合腹側長軸方向ゾーンとも記載される、又は神経管のシグナル伝達センターとも呼ばれる、腹側正中全体に沿って伸長するインビボでの神経管の領域を指す。言い換えると、神経管は様々な領域に分割され、正中に最も近い腹側細胞が底板を構成した。さらなる細胞の特定化の一例として、ニワトリの中脳ＦＰは遺伝子発現、誘導形式及び機能に基づいて内側（ＭＦＰ）領域と外側（ＬＦＰ）領域に分割され得る。底板細胞は発生中の胚のいくつかの領域においてインビボで見出され、例えば底板細胞は中脳、後脳等において見出される。インビボでは中脳領域における底板細胞は、他の領域における底板細胞から分化した細胞と異なる細胞を生じさせると考えられている。中脳領域における１つの主要な底板マーカーはＦＯＸＡ２である。
本明細書において使用される場合、「蓋板」という用語は正中に最も近い背側細胞を指す。１つの蓋板マーカーはＬＭＸ１Ａである。胚発生中に、底板細胞と蓋板細胞は、それらの細胞の誘導について正反対のパターン形成の要求によってＣＮＳ中の別個の位置（腹側対背側）に位置する。
本明細書において使用される場合、「中脳」という用語は発生中の脊椎動物の脳の前脳（前方）と後脳（後方）の間の領域を指す。中脳領域は、運動機能に影響する脳幹の領域である被蓋の部分である網様体、大脳半球を小脳に連結する神経線維から構成される大脳脚、及び黒質と呼ばれる大きい色素性沈着した核を含むが、これらに限定されない脳の多くの領域を生じさせる。発生中の中脳に特有の特徴は底板マーカーであるＦＯＸＡ２と蓋板マーカーであるＬＭＸ１Ａの共発現である。
本明細書において使用される場合、「ニューロン」という用語は神経系の主要な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは細胞体とその細胞体の突起である軸索、及び１つ以上の樹状突起からなる。ニューロンはシナプスにおいて神経伝達物質を放出することにより情報を他のニューロン又は細胞に伝達する。
本明細書において使用される場合、「細胞培養」という用語は研究又は医療処置用の人工培地内のインビトロでの細胞の培養を指す。
本明細書において使用される場合、「培地」という用語は、ペトリプレート、マルチウェルプレート、及び同種のものなどの培養容器中において細胞を覆い、それらの細胞を育て、支援するための栄養を含む液体を指す。培地は細胞において所望の変化を誘導するために添加される成長因子を含むこともあり得る。
本明細書において使用される場合、「神経細胞成熟培地」又は「ＢＡＧＣＴ」培地という用語は、Ｎ２培地を含み、中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンに分化させるために脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、グリア細胞株由来神経栄養因子、ジブチリルｃＡＭＰ及びトランスフォーミング増殖因子タイプβ３をさらに含む培地を指す。
本明細書において使用される場合、「フィーダー細胞層」という用語は万能性幹細胞を維持するための共培養において使用される細胞を指す。ヒト胚性幹細胞培養にとって、典型的なフィーダー細胞層には、培養中に細胞分裂しないように処理されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）又はヒト胚性線維芽細胞が含まれる。
本明細書において使用される場合、細胞培養物との関連において「継代」という用語は、一周の細胞成長と増殖の後に細胞を分離させて、洗浄し、そして、新しい培養容器に蒔く処理を指す。ある系統の培養細胞が経た継代の数はその培養細胞の歳と予想される安定性の指標である。
本明細書において使用される場合、遺伝子又はタンパク質に関連して「発現する」という用語は、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイ、及び同種のものなどの測定法を用いて観察され得るｍＲＮＡ又はタンパク質の作製を指す。
本明細書において使用される場合、「ペアード（ｐａｉｒｅｄ）ボックス遺伝子６」又は「ＰＡＸ６」という用語は非既定神経始原細胞のマーカーを指す。
本明細書において使用される場合、本発明の分化細胞との関連において「ＴＵＪ１」又は「ニューロン特異的ＩＩＩ型β‐チューブリン」という用語は初期神経ヒト細胞分化、例えば神経始原細胞のマーカーを指し、そして、ＰＮＳ及びＣＮＳのニューロンにおいて発現して見出される。
本明細書において使用される場合、ＳＭＡＤ分子との関連において「ホモ二量体」という用語は、例えば、ジスルフィド結合によって互いに結合した少なくとも２分子のＳＭＡＤを指す。
本明細書において使用される場合、細胞を本発明の化合物と「接触させること」という用語は、「接触した」細胞を生じさせる（得る）ためにその化合物を細胞に触れさせるほどの位置にその化合物を配置することを指す。接触はあらゆる適切な方法を用いて達成され得る。例えば、１つの実施形態では、接触は、細胞を含むチューブに化合物を添加することによる。接触は細胞の培養物に化合物を添加することによっても達成され得る。
本明細書において使用される場合、「付着細胞」という用語はインビトロで増殖している細胞であって、細胞が培養容器の底又は側面に接着している状態の細胞であり、細胞外マトリックス分子及び同種のものを介してその容器と接触することができ、そして、培養皿／培養器からこの細胞を剥がすための酵素、すなわち、トリプシン、ディスパーゼ等の使用を必要とする付着細胞を指す。「付着細胞」は、付着しておらず、培養容器から細胞を剥がすための酵素の使用を必要としない懸濁培養物中の細胞の反対である。
本明細書において使用される場合、「マーカー」又は「細胞マーカー」という用語は特定の細胞又は細胞種を識別する遺伝子又はタンパク質を指す。細胞に対するマーカーは１つのマーカーに限定されることはあり得ず、マーカーはマーカーの「パターン」を指すことがあり得、指定されたマーカー群が細胞又は細胞種を別の細胞又は細胞種から見分けることができる。例えば、本発明の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンは、前駆細胞である、あまり分化していない細胞から底板中脳始原細胞を区別する、すなわち、例えば図１ｅ及び１ｆにおける例となる遺伝子発現パターンによって示されるように、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）陽性及びＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）陽性細胞とＨＥＳＳ＋及びＰＡＸ６＋細胞を区別する１つ以上のマーカーを発現する。
本明細書において使用される場合、細胞に関連して「陽性細胞」を含む「陽性」という用語は、マーカー、一例として、抗体染色（検出）系を用いたときのそのマーカーに対する抗体による「染色」、又は二本鎖核酸配列に結合したレポーター分子、すなわち、蛍光分子によって測定される、マーカー核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を対照細胞又は比較細胞よりも上の検出可能な定量的量及び／又は定性的量で発現する細胞を指す。例えば、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）等のようなマーカーについて陽性である細胞は、遺伝子アレイ又は抗体などの測定法で検出されるとそれぞれＦＯＸＡ２ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を発現する細胞を指す。そのような陽性細胞がＦＯＸＡ２＋と言及され得る。細胞が１つより多くのマーカーについて陽性であるとき、例えばＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋という表記法を用いるとき、その細胞又はその細胞集団の大半はＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａの両方について陽性である。
本明細書において使用される場合、細胞又は細胞集団に関連して「陰性細胞」を含む「陰性」という用語は、マーカーについて検出可能なシグナルが存在しない、又は対照集団のレベルのシグナルが存在しない細胞又は集団を指す。例えば、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）抗体検出法、又はＦＯＸＡ２ ｍＲＮＡの検出を含む遺伝子アレイ等との接触後の染色に失敗した細胞はＦＯＸＡ２−又はＦＯＸＡ２について陰性である。
本明細書において使用される場合、「レポーター遺伝子」又は「レポーターコンストラクト」という用語は、着色タンパク質、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質、又はβ‐ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子）などの酵素のような、容易に検出可能な、又は容易に測定可能なタンパク質をコードする核酸を備える遺伝的構築物を指す。
本明細書において使用される場合、「ＧＦＰ」という用語は、通常、標的遺伝子の発現の指示マーカーとして使用される、細胞内で発現すると蛍光タンパク質を産生することができるあらゆる緑色蛍光タンパク質ＤＮＡ配列を指す。ＧＦＰの例には、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）などの腔腸動物から単離されたＧＦＰ配列、及び「ｅＧＦＰ」などのそれらの合成配列派生物が含まれる。
「試料」という用語はその用語の広い意味で使用される。ある意味では、その用語は細胞又は組織を指すことができる。別の意味では、その用語はあらゆる供給源から得られた標本又は培養物を含むものとされ、そしれ、液体、固体、及び組織を包含する。環境試料は、表面物質、土、水、及び産業試料などの環境材料を含む。これらの例は本発明に適用可能な試料の種類を限定するものと解釈されてはならない。
「精製された」、「精製すること」、「精製」、「単離された」、「単離すること」、「単離」という用語、及びそれらの用語の文法的同等語は、本明細書において使用される場合、試料から少なくとも１つの汚染混入物質の量を減少させることを指す。例えば、所望の細胞種は、望ましくない細胞種の対応する量の減少によって少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、そして最も好ましくは少なくとも９０％精製される。例えば、本発明の制御分化の結果、分化底板中脳始原細胞又は本発明の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの純度の所望の増加が生じる。言い換えると、「精製する」及びその同等語は、フローサイトメーター細胞選別によるなど機械的に、又は制御分化を介して試料からある特定の細胞（例えば、望ましくない細胞）を除去することを指す。例えば、本発明のフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）＋ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）＋始原細胞の精製集団の分化について、始原細胞は、フローサイトメトリーによって混合細胞集団からフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）＋ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）＋二重陽性細胞を選別して、混入しているＰＡＸ６神経細胞を除去することにより精製される。中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンも、本発明の組成物と方法を備える細胞培養の特定の方法を用いることにより非ドーパミン（ＤＡ）（既定細胞）から精製又は「選択」される。非中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）神経細胞の除去又は選択により、試料中の所望の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンのパーセントが増加する。従って、細胞種の精製により、試料中の所望の細胞、すなわち、中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの「濃縮」、すなわち、そのニューロンの量の増加が生じる。
本明細書において使用される場合、「天然の」という用語は、物（例えば、細胞、組織等）及び／又は化学物質（例えば、タンパク質、アミノ酸配列、核酸配列、コドン等）に適用されるとき、その物及び／又は化合物が自然界に見出される／見出されたことを意味する。例えば、天然の細胞は、自然界の供給源から単離され得る、生物に存在する細胞であって、実験室において人によって意図的に改変されていない細胞、例えば、胚性細胞を指す。
本明細書において使用される場合、「インビトロ」という用語は人工的な環境、及び人工的な環境内で起こる過程又は反応を指す。インビトロ環境は、限定されないが、試験管及び細胞培養物を例として示す。
本明細書において使用される場合、「インビボ」という用語は自然の環境（例えば、動物又は細胞）、及び自然の環境内で起こる過程又は反応、例えば、胚発生、細胞分化、神経管形成等を指す。
本明細書において開示されるあらゆる細胞との関連において使用されるとき、「から得られた」又は「から構築された」又は「から分化した」という用語は、細胞株、組織（例えば、限定されないが、単一細胞単離、インビボで培養された、処理及び／又は突然変異形成などのあらゆる操作を用いた解離胚又は体液）の中の親細胞から得られた（例えば、単離された、精製された、など）細胞を指す。例えば化学処理、放射線照射、例えば、ウイルスの感染、ＤＮＡ配列の形質移入、モルフォゲンとの接触（処理）等による新規タンパク質発現の誘導、及び培養親細胞中に含まれるあらゆる細胞種の（例えば、連続培養による）選択を用いて細胞を別の細胞から得ることができる。得られた細胞は、成長因子、サイトカインに対する反応、選択されたサイトカイン処理の進行、接着性、接着性の欠如、選別方法、及び同種のものの力によって混合集団から選択され得る。
本明細書において使用される場合、「細胞」という用語は単一細胞並びに細胞の集団（すなわち、１個より多くの細胞）を指す。その集団は１つの細胞種を含む純粋な集団、例えば神経細胞の集団又は未分化胚性細胞の集団であり得る。あるいは、その集団は１つより多くの細胞種、例えば混合細胞集団を含み得る。集団内の細胞の数は限定されないものとする。例えば、１つの実施形態では、細胞の混合集団は少なくとも１個の分化細胞を含み得る。本発明では、細胞集団が含み得る細胞種の数に制限はない。
本明細書において使用される場合、「非常に濃縮された集団」という用語は、培養皿中の細胞の集団など、比較集団よりも高いパーセンテージ又は量でマーカーを発現する細胞の集団を指し、例えば、ＬＳＢ接触細胞培養物を第１日にパルモルファミンで処理し、第３日にＣＨＩＲで処理することにより、ＬＳＢのみでの処理と比べて非常に濃縮された底板中脳始原細胞の集団が生じる。他の例では、濃縮された集団は、ＣＤ１４２濃縮集団、Ａ９濃縮集団、及び同種のものなど、１つ以上のマーカーを発現する細胞を、所望のマーカーを発現しない細胞から選別又は分離することにより生じた集団である。
「細胞生物学（ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ）」又は「細胞生物学（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」という用語は、細胞の解剖学的形態と機能、例えば、ａ細胞の生理的特質、構造、オルガネラ、及び細胞の環境との相互作用、細胞の生活環、細胞分裂、及び死のような生細胞の研究を指す。
「目的のヌクレオチド配列」という用語は、当業者があらゆる理由（例えば、疾患の治療、改善された特質の付与、宿主細胞における目的のタンパク質の発現、リボザイムの発現、等）でその操作を好ましいと見なし得る、あらゆるヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）を指す。そのようなヌクレオチド配列には構造遺伝子（例えば、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、癌遺伝子、薬剤耐性遺伝子、成長因子等）のコード配列、及びｍＲＮＡ又はタンパク質産物をコードしない非コード調節性配列（例えば、プロモーター配列、ポリアデニル化配列、終止配列、エンハンサー配列等）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「目的のタンパク質」という用語は目的の核酸によってコードされるタンパク質を指す。
「遺伝子」という用語はポリペプチド又は前駆体（例えば、プロインスリン）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは全長コード配列によって、又は全長又は断片の所望の活性又は機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達等）が保持されている限り、コード配列のあらゆる部分によってコードされ得る。その用語は構造遺伝子のコード領域も包含し、そして、その遺伝子が全長型ｍＲＮＡの長さに対応するように５’末端側と３’末端側の両方でコード領域に隣接して位置する、どちらかの末端について約１ｋｂ以上の長さの配列を含む。コード領域の５’側に位置し、そして、ｍＲＮＡ上に存在する配列は５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’側又は下流に位置し、そして、ｍＲＮＡ上に存在する配列は３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語はｃＤＮＡ型とゲノム型の遺伝子の両方を包含する。ゲノム型の遺伝子又は遺伝子のクローンは「イントロン」又は「介在領域」又は「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって中断されるコード領域を含有する。イントロンは核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子の断片であり、イントロンはエンハンサーなどの調節性配列を含有することもあり得る。イントロンは核内転写物又は一次転写物から除去又は「スプライスアウト」され、それ故イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物に存在しない。ｍＲＮＡは、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列又は順序を指定するように翻訳中に機能する。
本明細書において使用される場合、「遺伝子発現」という用語は、遺伝子の「転写」により（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用により）その遺伝子にコードされる遺伝情報をＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｓｎＲＮＡ）に変換する過程を指し、そして、タンパク質をコードする遺伝子については、ｍＲＮＡの「翻訳」によりタンパク質に変換する過程を指す。遺伝子発現はその過程の多くの段階において調節され得る。「上方制御」又は「活性化」は遺伝子発現産物（すなわち、ＲＮＡ又はタンパク質）の産生を上昇させる調節を指し、一方、「下方制御」又は「抑制」は産生を低下させる調節を指す。上方制御又は下方制御に関与する分子（例えば、転写因子）は多くの場合、それぞれ「活性化因子」及び「抑制因子」と呼ばれる。
本明細書において使用される場合、「をコードする核酸分子」、「をコードするＤＮＡ配列」、「をコードするＤＮＡ」、「をコードするＲＮＡ配列」、及び「をコードするＲＮＡ」という用語はデオキシリボ核酸又はリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの順序又は配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの順序がポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列はこうしてアミノ酸配列をコードする。
「単離オリゴヌクレオチド」又は「単離ポリヌクレオチド」におけるように、核酸に関して使用されるとき、「単離された」という用語は、核酸配列がその自然の供給源では通常結合している少なくとも１つの成分又は汚染混入物質から同定及び単離されているその核酸配列を指す。単離核酸は自然界で見出される形状又は状態と異なる形状又は状態で存在する。対照的に、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸のような非単離核酸はそれらが自然界で存在する状態で見出される。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は宿主細胞の染色体上で隣接する遺伝子の近傍に見出され、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中に見出される。しかしながら、所与のタンパク質をコードする単離核酸には、例として、その所与のタンパク質を通常発現する細胞内のそのような核酸であって、自然の細胞の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在する、又は他の場合では、自然界で見出されるものとは異なる核酸配列によって隣接されるそのような核酸が含まれる。単離核酸、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドは一本鎖形状又は二本鎖形状で存在し得る。単離核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用される予定でいるとき、そのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは少なくともセンス鎖又はコード鎖を含有する（すなわち、そのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは一本鎖であり得る）が、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含有してもよい（すなわち、そのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは二本鎖であり得る）。
本明細書において使用される場合、「キット」という用語は物質を送達するためのあらゆる送達系を指す。細胞分化との関連では、キットは幹細胞と接触するための材料からなる組合せ物を指すことがあり得、そのような送達系は、適切な容器（例えば、チューブ類等）内のある場所から別の場所への反応試薬の貯蔵、移動、又は送達を可能にする系、及び／又は補助材料（例えば、緩衝液、細胞分化を実施するための指示書等）（例えば、化合物、タンパク質、検出剤（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）等に結合する抗体）等を含む。例えば、キットは、シグナル伝達経路を阻害するための適切な反応試薬、例えば、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン‐ノーダルシグナル伝達を低下させるための阻害剤、例えばＳＢ４３１５４２（又はＳＢ４３１５４２置換物）及び同種のもの、ＳＭＡＤシグナル伝達を低下させるための阻害剤、ＬＤＮ‐１９３１８９（又はＬＤＮ‐１９３１８９置換物）及び同種のもの、一例ではウィングレス（Ｗｎｔ又はＷｎｔｓ）シグナル伝達の活性化のための、他の場合ではＷＮＴシグナル伝達活性化剤（ＷＮＴアゴニスト）として知られるグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させるための阻害剤、例えばＣＨＩＲ９９０２１（又はＣＨＩＲ９９０２１置換物）等）及び同種のもの、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤（例えば、スムーズンド（ＳＭＯ）受容体小分子アゴニスト）、例えば、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ分子、パルモルファミン及び同種のもの、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）活性を有する分子、例えば線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）等、及びニューロン成熟分子、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、グリア細胞株由来神経栄養因子、ジブチリルｃＡＭＰ及びトランスフォーミング増殖因子タイプβ３、これらの成分に置き換わることができる分子を含む、及び／又は補助材料を含有する１つ以上の容器（例えば、箱、又は袋、試験管、エッペンドルフチューブ、毛細管、マルチウェルプレート、及び同種のもの）を含む。１つの実施形態では、キット中の試薬は溶液状であり得、凍結されていてよく、又は凍結乾燥されていてよい。１つの実施形態では、キット中の試薬は個々の容器の中に存在し得る、又は、ＬＳＢ（ＬＤＮ‐１９３１８９とＳＢ４３１５４２）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ分子とパルモルファミン、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ分子とパルモルファミンとＣＨＩＲ９９０２１、又はパルモルファミンとＣＨＩＲ９９０２１、ニューロン成熟分子及び同種のものからなる組合せ物など、特定の組合せ物として提供され得る。
本発明の説明
本発明は幹細胞生物学の分野、とりわけ万能性幹細胞又は多能性幹細胞の系譜特異的分化に関連し、それらの幹細胞には非胚性ヒト人工万能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に加えてヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、体性幹細胞、疾患を有する患者に由来する幹細胞、又は系譜特異的分化が可能である他のあらゆる細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。新規の培養条件を用いて底板中脳始原細胞への、その後さらに、大集団の中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンへのｈＥＳＣ及び／又はｈｉＰＳＣの系譜特異的分化を制御する方法が具体的に記載される。本発明の方法を用いて作製された中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンには、インビトロ創薬アッセイにおける使用、神経生物学研究における使用、及び患者におけるドーパミンニューロンの喪失による疾患又は障害を回復させる治療薬としての使用を含むが、これらに限定されない様々な使用法がさらに企図される。さらに、疾患、特にパーキンソン病のモデル化に使用するため、ヒト万能性幹細胞から中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを分化させるための組成物と方法が提供される。
本発明は、患者の脳における中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンの選択的変性を含むパーキンソン病（ＰＤ）の特徴に関連する。ＰＤの症状は主に腹側中脳の黒質におけるＤＡニューロンの選択的喪失に起因するので、ＰＤは、治療に細胞置換治療戦略が最も適切である疾患のうちの１つと考えられる。従って、中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンの機能喪失を置換するために患者の脳へ細胞を移植する多くの試みがなされた。しかしながら、これらの実験は成功せず、現在では患者に対して用いられている対症療法が多種多様な好結果を有している。従って、神経機能の喪失を遅らせるために新しい治療がＰＤの患者に必要とされる。
ヒト万能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は再生医療において適用される細胞の供給源である。本発明の方法以外の方法による分化により生じる脊髄運動ニューロン（Ｌｉ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３， ２１５〜２２１ （２００５）、参照により本明細書中に援用）又は中脳ドーパミン（ＤＡ）様ニューロンなどの特殊化した細胞へのｈＰＳＣの制御分化。本発明者らは本明細書に記載されるように、本明細書においてドーパミン（ＤＡ）様ニューロンと呼ばれるこれまでのドーパミン（ＤＡ）ニューロン（すなわち、Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１， １２５４３〜８ （２００４）内、参照により本明細書中に援用）は本発明の真正中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンではないことを発見した（図３、１０、１３及び１６を参照のこと）。従って、本発明者らは、公開された方法によって作製されたドーパミン産生ニューロンと異なり、本発明の「真正」ドーパミン産生ニューロンがげっ歯類動物及び霊長類動物に移植されると、それらのニューロンが神経過形成及びテラトーマ形成の干渉をあまり受けることなくパーキンソン病様神経学的症状を回復させるので、本明細書に記載される方法によって作製される底板由来ドーパミン産生ニューロン、すなわち、本発明のドーパミン産生ニューロンを「真正」と呼ぶ。また、ドーパミン産生ニューロンを作製するこれまでの方法と異なり、本発明の「真正」ドーパミン産生ニューロンは出発集団からより高いパーセンテージで作製され、そして、培養状態で数か月間移植能を保持する。
従って、真正中脳ＤＡニューロンを作製するための方法が本明細書に記載される分化方法を用いることによって発見された。しかしながら、細胞療法のためのｈＰＳＣの効果的な使用は細胞培養の進歩よりもかなり遅れている。マウスＰＳＣ由来ＤＡニューロンはパーキンソン病（ＰＤ）モデルにおいて効力を示したが（Ｔａｂａｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １４， ３７９〜３８１ （２００８）； Ｗｅｒｎｉｇ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ １０５， ５８５６〜５８６１ （２００８）、それらの全てを参照により本明細書中に援用）、ヒトＰＳＣに由来するＤＡニューロンは全般的に低いインビボ性能を示す（Ｌｉｎｄｖａｌｌ ａｎｄ Ｋｏｋａｉａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ １２０， ２９〜４０ （２０１０）、参照により本明細書中に援用）。内在的な神経機能喪失を補わないことに加えて、ｈＰＳＣ由来ニューロンが移植に使用され、それらのニューロンのテラトーマ形成能又は神経過形成能（Ｒｏｙ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １２， １２５９〜１２６８ （２００６）； Ｅｌｋａｂｅｔｚ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２２， １５２〜１６５ （２００８）、参照により本明細書中に援用）に関連するとき、重大な安全性への懸念が存在する。
移植用の細胞の別の可能な供給源はヒトＥＳＣ由来のＤＡニューロンである。これらの細胞を出発細胞集団として使用する、げっ歯類ＰＤモデルに移植されるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来ＤＡ様中脳ニューロンに見える分化細胞を作製するこれまでの試みは、移植後の移植物の低いインビボ生存という結果に終わった。この失敗は、中脳ＤＡニューロンに見えるが、失われたニューロン機能を置換するために移植可能ではない細胞を生じさせることになるインビトロでの不完全な中脳ＤＡニューロン分化が原因である可能性が最も高いと考えられた。実際、本発明者らは本明細書において、本発明者らの研究室において以前に作製され、刊行物において記載されたＤＡ様ニューロンは本発明の底板中脳ＤＡ神経細胞と同一の細胞種でもなければ、同様の機能又は移植能も有しなかったことを示す。例えば、図１６及び１７を参照のこと。従って、本発明者らはまた、細胞が研究室において多数の適切に機能するニューロンを含有する細胞集団を作製するための制御分化を受けるため、細胞が細胞系置換療法に適切な置換細胞集団になるために特定の発生ステージを通過する必要があったことも発見した。本発明者らはまた、少なくとも本発明の移植可能ＤＡニューロンを得るために、ＦＯＸ２Ａ／ＬＩＭ１Ａ＋第１１日中間体のようなある特定の発生ステージが存在しなければならないことも発見した。そのような発生ステージが存在しない場合、生じるＤＡ様ニューロンはＦＯＸ２Ａ／ＬＩＭ１Ａ＋第１１日中間体から得られた本発明の中脳ＤＡニューロンと同じ機能的能力を有しないことを本発明者らは発見した。
以前の観察と対照的に、インビボで効率的に生着するヒトＤＡニューロンの誘導のための底板細胞誘導系先着に関連する新規培養技術が本明細書において記載される。従って、本発明の運命決定されたＤＡニューロン（すなわち、効率的な生着が可能なＦＯＸＡ２＋及びＬＭＸ１Ａ＋ＤＡニューロン）を主に含む細胞集団の獲得における過去の失敗は、ＤＡ様ニューロンの移植の失敗、すなわち、ＤＡ様細胞の不完全な特定化が原因で失敗したことが理由であると考えられた。移植の失敗は細胞の特定的な脆弱性が原因であった、すなわち、ＤＡ様培養ニューロンは移植ストレスを乗り越えて生存することができなかったというのが以前の仮説であった。本明細書に記載されるように、中脳ＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋底板前駆細胞はソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）及び正準ＷＮＴシグナル伝達という小分子活性化剤への曝露から１１日後のｈＰＳＣから得られた。ＦＯＸＡ２＋及びＬＭＸ１Ａ＋について二重陽性であるこれらの第１１日細胞をさらなる小分子と接触させて第２５日までにＴＨ＋ＦＯＸＡ２＋及びＬＭＸ１Ａ＋について陽性である移植可能中脳ＤＡニューロンへのさらなる分化を誘導する。これらの成熟した底板中脳ＤＡニューロンをインビトロで数か月間維持することができる。詳細なインビトロ分子プロファイリング、生化学的データ及び電気生理学的データが発生進行を明らかにし、そして、ｈＰＳＣ由来中脳ＤＡニューロンの同一性を確認した。インビボ生存及び機能が３種の宿主種のＰＤ動物モデルにおいて示された。６‐ＯＨＤＡ傷害マウス及びラットにおける長期移植は中脳ＤＡニューロンの堅固な生存、アンフェタミン誘導性回転行動の完全な回復、及び前肢の使用と無動の改善を示す。そして、パーキンソン病のサルへの移植によって規模拡大性が示される。試験された３種の動物モデルにおける良好なＤＡニューロン生存、機能及び神経過形成の欠如が本発明の組成物と方法に基づくＰＤの細胞ベース治療法の開発の有望性を表す。
従って、本発明者らは前臨床治療適用及び臨床治療適用に適切な完全に機能的な底板由来中脳ＤＡニューロンを無限に供給する能力として本発明者らの発見の主な使用を企図する。具体的には、本発明者らはげっ歯類動物及びヒト（ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト人工万能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ））から単離した少なくとも万能性の細胞集団からのｍＤＡニューロンの効率的な分化のための新規プロトコルを発見した。それらの試験は遺伝性のパーキンソン病を患うヒト患者から得られたＰＩＮＫ１変異体ｉＰＳ細胞株（Ｓｅｉｂｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１１， ３１（１６）：５９７０〜５９７６、参照により本明細書中に援用）を含んだ。ヒト幹細胞集団（ｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣ）を中脳表現型に分化させ、それらはニューロン成熟分子との接触の後により真正の移植可能ＤＡニューロンになった。このプロトコルは、重要な転写因子、例えばＴＨ、ＦｏｘＡ２及びＬＭＸ１Ａの発現を含み、さらに分化すると、さらなる重要なタンパク質、例えばＴＨを産出する中脳ＤＡ（ｍＤＡ）ニューロン表現型への制御分化の第１１日までに高収量のｈＥＳＣ子孫を実証するために使用された。免疫無防備状態のげっ歯類宿主及び霊長類宿主へのこれらのｈＥＳＣ由来ｍＤＡニューロンの移植は、以前のインビトロ獲得ＤＡニューロンと異なり、移植された細胞の良好なインビボ生存を示し、行動欠陥の機能回復を有した。
ＤＡ神経細胞の作製のために本発明の方法を用いる他の方法に対する利点は、部分的には次の情報から明らかである。インビボで効率的に生着する真正中脳ＤＡニューロンを作製することを目標とする他の方法では体性幹細胞及び神経幹細胞の使用は成功していない（概説についてＫｒｉｋｓ ＆ Ｓｔｕｄｅｒ， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ＥＳ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ （Ｐａｓｔｅｒｋａｍｐら編）（Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２００８を参照、 参照により本明細書中に援用）。その後、ＥＳ細胞などの多能性幹細胞が移植可能細胞を作製するための供給源として使用された。１９９０年代のマウスＥＳ細胞を使用する初期の試験は万能性細胞からインビトロでニューロンを含む特定の系譜を誘導する可能性を示した（Ｏｋａｂｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ． ５９：８９〜１０２ （１９９６）； Ｂａｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６８ｖ３４２〜３５７ （１９９５）、それらの全てを参照により本明細書中に援用）。実際、中脳ＤＡニューロンは初期体外移植試験（Ｙｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ９３：７５５〜７６６ （１９９８）、参照により本明細書中に援用）に由来する発生上の見識に基づく制御分化戦略（Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８ｖ６７５〜６７９ （２０００）、参照により本明細書中に援用）を用いて作製された。他の制御分化戦略は体性運動ニューロン（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １１０， ３８５〜３９７ （２００２）、参照により本明細書中に援用）などの他のニューロン種を作製するために用いられた。しかしながら、これらの努力はインビボで神経機能を回復させることができる高パーセンテージの中脳ＤＡニューロン又は細胞を含有する細胞集団を生じさせなかった。実際、結果生じた集団は中脳ＤＡニューロンに加えて（複数の）細胞種の混合物を含有した。本発明者らでさえ中脳ＤＡニューロンを作製する他の方法を開発したが（部分的には下記を参照のこと）しかしながら、これらの細胞集団は（複数の）細胞種の混合物でもあり、神経機能を回復させることができなかった。特に、ヒトＥＳ細胞は神経ロゼットと呼ばれる初期神経上皮細胞に分化し、続いてロゼット期細胞が中脳ＤＡニューロン前駆細胞マーカー及び分化マーカーを発現する細胞に誘導される。それらの細胞はさらに進んで電気生理学による機能性ニューロンの特徴、インビトロＤＡ放出、及びＴＨ免疫金陽性シナプス連絡の形成を示した（Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． 表紙より： Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１， １２５４３〜８ （２００４）、 参照により本明細書中に援用）。しかしながら、これらの有望なインビトロデータにもかかわらず、６ＯＨＤＡ傷害マウス宿主における細胞の移植では非常に少数の生存ドーパミン系ニューロンが生じた。マウスＥＳ由来ＤＡニューロンのインビボ機能性の強力な証拠（Ｂａｒｂｅｒｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２１：１２００〜１２０７ （２００３）； Ｔａｂａｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １４：３７９〜３８１ （２００８）； Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ Ａ． ９９：２３４４〜２３４９ （２００２）； Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４１８：５０〜５６ （２００２）、それらの全てを参照により本明細書中に援用）、ヒトＥＳ由来ＤＡニューロンの堅固なインビトロ機能特徴（Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ．， 表紙より： Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１：１２５４３〜８ （２００４）、参照により本明細書中に援用）及びヒト胎児ＤＡニューロンが線条体の異種移植片として生存することができることの明らかな証拠（Ｂｒｕｎｄｉｎ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ７０：１９２〜２０８ （１９８８）； Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｎｅｕｒａｌ ｉｍｐｌａｎｔｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｄｏｍｄｅｌｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｒａｖｅｎ． Ｐｒｅｓｓ．， Ｎｅｗ． Ｙｏｒｋ． ４５５〜４９２ （１９８８）、それらの全てを参照により本明細書中に援用）を考えると、これは驚くべき負の結果であった。ヒトＥＳ細胞由来ＤＡニューロンの移植の最初の失敗した試みからほぼ８年間にこの分野にはほとんど進展がなかった。ＦＧＦ２０又はＷｎｔ５Ａで前処理された細胞である霊長類万能性幹細胞供給源（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｒｎａｕｔｅ， ｅｔ ａｌ． Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｉｍａｔｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ （Ｃｙｎｏ１） ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｐｒｉｍａｔｅ ｓｔｒｉａｔｕｍ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：９１４〜９２２ （２００５）、 参照により本明細書中に援用）、又は不死化中脳星細胞から分泌される因子の存在下で分化したヒトＥＳ細胞（Ｒｏｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １２：１２５９〜１２６８ （２００６）、 参照により本明細書中に援用）を用いていくらかの限定的な改善が観察された。 しかしながら、これまでの戦略の中で、インビボで神経機能を回復させるための移植方法に使用する本発明のＤＡニューロンの濃縮集団の作製に成功するものはなかった。
Ｉ． ニューロン前駆（系譜）細胞を誘導するための細胞培養法：Ｓ１３４３１５４２及びＬＤＮ‐１９３１８９とのヒト多能性幹細胞の接触により分化神経系譜細胞が生じた。
次の実施例は本発明の開発中に使用された神経系譜細胞を提供する例となる方法を説明する。
ｈＰＳＣから神経系譜細胞のうちの１種を誘導するための短時間で行われ、非常に有効な方法として二重ＳＭＡＤ阻害がこれまで用いられた（Ｃｈａｍｂｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７，（２００９）、参照により本明細書中に援用）。ノギンを含む分子により誘導されるこれらの神経系譜細胞は、中枢神経系細胞への発生を可能にする既定経路，すなわち、神経細胞運命を有した。ノギンの代わりに小分子ドルソモルフィン（ＤＭ）を使用することによって、培養物の一貫性についての大きな違いと共に類似しているが同一ではない分化細胞が少なくとも部分的に生じることが追跡試験によって報告された（Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｏｂｕｓｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳ ａｎｄ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇａｒｄｌｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｉｎｎａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ ６， ２７０〜２８１，（２０１０）； Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｈＥＳＣ ａｎｄ ｈｉＰＳＣ ｗｉｔｈ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＴＧＦ−ｂｅｔａ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ５０４，（２０１０）、参照により本明細書中に援用）。
本発明者らは、ノギンを使用して作製された細胞は、ＬＤＮ処理細胞と同一の発生ステージを示すにもかかわらず、同じマーカーの大半を発現し、様々な神経系譜を作製する類似の発生能力を有するが、ＬＤＮを使用して誘導された神経細胞と比べて前後軸についてより前方に配向する（すなわち、より多くの前脳、より多くの細胞がＦＯＸＧ１を発現する、など）のといった差異も示すことを観察した。従って、他のシグナル伝達経路の中でもＢＭＰを阻害するためにノギンの代わりにＬＤＮを使用したが、ノギン及びＬＤＮはＢＭＰの阻害とは異なる他の種類の活性を有する可能性がある。
部分的には高額のノギンの使用支出のため、本発明者らは、ＢＭＰ阻害剤の使用が神経細胞運命性の細胞の分化においてノギンの代わりになり得るのではと考えた。従って、小分子ＢＭＰ阻害剤であるＬＤＮ‐１９３１８９（Ｙｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ １４， １３６３〜１３６９、（２００８）、参照により本明細書中に援用）が本発明の開発中に使用され、ｈＰＳＣから神経細胞運命を有する細胞，すなわち、ＣＮＳ細胞である始原神経外胚葉を作製するためにＳＢ４３１５４２と組み合わせてノギンと置き換わることが分かった（図２Ａ）。この併用処理は、これらの２つの阻害剤ＬＤＮ‐１９３１８９とＳＢ４３１５４２の組合せを表してＬＳＢと名付けられた。
概して、細胞分化はＳＭＡＤシグナル伝達の二重阻害による高集密単層ｈＥＳ又はｈｉＰＳの処理によって開始された。好ましい実施形態は５０％〜１００％のパーセンテージ集密を利用し、最も好ましい実施形態は７０％〜８０％集密を利用する。本発明の好ましい集密を達成するために必要とされる初期播種密度は細胞種、サイズ、播種効率、生存、接着及び他のパラメーターに左右され、当業者側では過度の実験を行うことなく経験的に決定することができることは当業者にとって明白である。ＳＭＡＤの二重阻害は、ノギン、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ‐１９３１８９、ドルソモルフィン、又はＴＧＦβ、ＢＭＰ及びアクチビン／ノーダルのシグナル伝達を阻止する他の分子を含む様々な化合物によって達成され得る。好ましい実施形態は、ＳＢ４３１５４２とＬＤＮ‐１９３１８９（まとめてＬＳＢ）を０．１μＭ〜２５０μＭ、又はより好ましくは１〜２５μＭ、又は最も好ましくは１０μＭのＳＢ４３１５４２、及び１０〜５０００ｎＭ、又は最も好ましくは１００〜５００ｎＭのＬＤＮ‐１９３１８９の濃度で含む組成物を利用する。
ＩＩ． ｈＥＳＣからのロゼット細胞中間体を介したＤＡニューロンの誘導とこれらのＤＡ様ニューロンを使用した移植試験の結果
本発明者らは、ＤＡ様ニューロンを含有する細胞集団を生じることになるいくつかの他の制御分化方法をこれまでに使用した。これらのＤＡ様ニューロンを移植試験において使用し、治療用途にこれらの細胞をさらに使用することに対する懸念が生じた。例えば、ＭＳ５神経誘導を含む、Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４及び Ｆａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１０に記載される方法がロゼット細胞形成を引き起こし、そして、それらの方法が第１１日の前駆細胞（例えば、図２、１６及び１７を参照のこと）を作製するために用いられ、ＤＡ様ニューロンを得るためにさらに用いられた。これらのニューロンは、生じた第１１日の細胞集団中の低パーセンテージの前駆細胞より生じた。これらのニューロンを使用した移植試験は、テラトーマの発生を引き起こす増殖制御の喪失と共に不適切な神経種の移植後発生が観察されたことに加えて、低い移植後生存率とＤＡ様ニューロンの表現型の喪失を示した。図１６及び１７を参照のこと。
具体的には、Ｐ０においてＭＳ５フィーダー細胞（Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４）を使用してＯｃｔ４＋細胞のロゼット細胞への神経誘導を開始するための分子とｈＥＳＣを接触させた。Ｐ１期において、細胞をＰ２期の細胞であって、Ｐａｘ２＋／Ｅｎ１＋ＤＡ始原細胞を含む、特異的発現パターンを有する細胞に分化させるためのさらなる分子と細胞を接触させることによってロゼット細胞を増大させ、そして、ＴＨ＋／Ｅｎ１＋ＤＡニューロンにさらに分化させた。これらの細胞が６ＯＨＤＡ傷害ラットにおける移植のために使用され、シクロスポリンＡ処理により免疫抑制された。それらの移植試験は低いインビボ生存性、ＴＨ＋表現型の喪失、患者へのさらなる医療上の問題を引き起こすだろう望ましくない、おそらくは致死性の細胞、すなわち、テラトーマのさらなる増殖及び不適切な神経種への細胞の成長への懸念を示した。
ロゼット由来ＤＡニューロン前駆細胞の移植片に移植後４．５か月において非常に少数の生存ＴＨ＋ニューロン（５０未満ＴＨ＋細胞／動物）が存在した（図１６Ａ）。しかしながら、ＴＨ＋細胞と対照的に、ＧＦＰ標識細胞（ＧＦＰは広範に存在するプロモーターによって誘導された）は移植後では極めて生存性が高かった。このことは、移植後の大半の生存細胞は非ＤＡニューロン同一性を有する神経細胞であったことを示唆する（１６Ｂ）。ＴＨ（赤）を共発現する移植片由来細胞（ｈＮＡ＋（緑））はほとんど無く、これは大半の移植されたヒト細胞が非ＤＡニューロン表現型を装うことを再度示唆する（図１６Ｃ）。パネル１６Ｄ〜Ｅは、Ｄ〜Ｅ、非常に低いインビボ生存にもかかわらず、アンフェタミン誘導性回転（Ｄ）、円筒試験及び突発性回転（Ｅ）などの少数の行動試験においていくらかの（わずかで、非常に変わりやすい）改善が存在したことを示す。無フィーダー細胞神経誘導が前に記載されたように（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９、参照により本明細書中に援用）実施されたが、底板細胞を産出するようにさらに改変された（Ｆａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１０、参照により本明細書中に援用）。
万能性細胞を底板細胞に分化させるための改変二重ＳＭＡＤ阻害方法では、本発明者らは、高濃度のＳＨＨが第１１日までのＦＰ誘導に必要とされることを以前に発見している。例えば、いくつかの実施形態では、ソニックＣ２５ＩＩは２００ｎｇ／ｍｌで添加された。いくつかの実験では、ＤＫＫ‐１（Ｒ＆Ｄ社；１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８（Ｒ＆Ｄ社；５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ‐１（ペプロテック社；５０ｎｇ／ｍｌ）及びレチノイン酸（Ｒ＆Ｄ社；１ｍＭ）を添加した。図１７を参照のこと。しかしながら、これまでの方法を用いて第１１日においてもたらされた細胞集団の中には、本発明の方法を用いるＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋中脳底板始原細胞の高いパーセンテージを含むものは無かった。
ＩＩＩ． 制御分化に使用される化合物：本発明のニューロン系譜細胞を使用する小分子のスクリーニングにより培養第１１日までに細胞をＦＯＸ２Ａ＋及びＬＩＭＸ１Ａ＋神経細胞に分化させる化合物が見つかった。
次の実施例は、小分子候補化合物をスクリーニングするための節Ｉの例となる細胞の使用、及び、それらの化合物の使用が二重ＳＭＡＤ阻害剤との最初の接触から第１１日までに高パーセンテージの中脳底板ニューロンを含有する細胞集団の制御分化を引き起こすかの判定を説明する。このスクリーンの結果は、ＳＨＨ活性化分子ＦＧＦ８及びＷｎｔの活性化と共に分化第１１日までにｈＥＳＣからＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋陽性中脳底板細胞の効率的な誘導を引き起こすことを最初に示した。本発明者らは、第１１日において所望のＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋陽性細胞集団を誘導するために必要である分子、及び最適接触時間を明らかにする例となる実験の結果を本明細書において示す。
近年のマウス遺伝学研究により中脳ＤＡニューロンの発生と生存における転写因子ＦＯＸＡ２の重要な役割が示された。発生中の中脳の独特の特徴は底板マーカーＦＯＸＡ２と蓋板マーカーＬＭＸ１Ａの共発現である。通常、底板細胞と蓋板細胞は、それらの細胞の誘導について正反対のパターン形成の要求によってＣＮＳ中の別個の位置（腹側対背側）に位置する。改変二重ＳＭＡＤ阻害プロトコルを用いるｈＥＳＣからの領域特異的底板前駆細胞の誘導が近年記載された。正準Ｗｎｔシグナル伝達は蓋板機能と中脳ＤＡニューロン発生の両方にとって重要であった。
Ａ． ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）が培養第１１日までに高収量の中脳ＤＡニューロン前駆細胞運命を誘導した。本明細書に記載されるように、ＷＮＴシグナル伝達を強力に活性化することが知られている強力なＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）への曝露によって、ＦＯＸＡ２＋底板前駆細胞においてＬＭＸ１Ａが誘導された（図１ａ）。ＣＨＩＲはＬＭＸ１Ａ発現の誘導において組換えＷｎｔ３Ａ又はＷｎｔ１よりも強力であった。ＬＭＸ１Ａ誘導の効率はＣＨＩＲ曝露のタイミングに左右され、最大の効果は第３日〜第１１日にあった（図５）。ＣＨＩＲはＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａの共発現を誘導し、一方、ＦＧＦ８などの他の因子はわずかな効果を有するのみであった（図６）。ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ共発現の誘導は小分子アゴニストであるパルモルファミンのみを使用する、又は組換えＳＨＨを併用するＳＨＨシグナル伝達の強力な活性化を必要とした（図７）。
ＣＨＩＲ９９０２１が存在しない状態でのＳＨＨアゴニスト（パルモルファミン＋ＳＨＨ）及びＦＧＦ８（Ｓ／Ｆ８）による処理によって、第１１日までのＦＯＸＡ２の有意に低い発現とＬＭＸ１Ａ発現の完全な喪失が示された（図１ａ、ｂ）。二重ＳＭＡＤ阻害（ＬＤＮ‐１９３１８９＋ＳＢ４３１５４２＝「ＬＳＢ」への曝露）はＦＯＸＡ２発現性細胞を産出しなかったが、ＬＭＸ１Ａ＋細胞のサブセットを産出した（図１ａ、ｂ）。Ｔｈｅ前方マーカーであるＯＴＸ２がＬＳＢ処理培養物及びＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理培養物において堅固に誘導されたが、ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８条件では誘導されなかった（図１ａ、ｃ）。包括的時間的遺伝子発現プロファイリングを用いて３つの培養条件の系統的な比較（図１ｄ）が実施された。差次的発現した遺伝子の階層的クラスター分析が分化第１１日までの３つの処理条件を分離した（図８ａ）。ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、及びＰＴＣＨ１を含むいくつかの他のＳＨＨ下流標的がＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理セットとＬＳＢ処理セットの間において最も差次的に調節された転写物の中にあった（図１ｅ）。ＬＭＸ１Ａ、ＮＧＮ２、及びＤＤＣの発現は早くも第１１日までの中脳ＤＡニューロン前駆細胞運命の確立を示した（図１ｅ、ｆ）。対照的に、ＬＳＢ培養物はＨＥＳＳ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、及びＥＭＸ２などの背側前脳前駆細胞マーカーを濃縮した。ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理とＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８処理の直接比較（図１ｆ）によりＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ群における中脳ＤＡ前駆細胞マーカーの選択的濃縮が確認され、ＲＡＸ１、ＳＩＸ３、及びＳＩＸ６の差次的発現に基づいてＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８処理培養物における視床下部前駆細胞同一性が示唆された（下の図２ｄにおけるＰＯＭＣ発現、ＯＴＰ発現も参照のこと）。差次的に発現した転写物の完全なリスト（表１、２）、及び遺伝子オントロジー分析（図８ｂ）（ＤＡＶＩＤ；ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ）がＣＨＩＲ処理による正準ＷＮＴシグナル伝達の強化を確認した。生データは未だＧＥＯ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：［ＴＢＤ］）において利用可能ではない。中脳ＤＡ前駆細胞マーカー（図１ｇ）と前方腹側非ＤＡニューロン運命のマーカー（図１ｈ）の遺伝子発現の時間的比較分析により３つの誘導条件が：ｉ）ＬＳＢ：背側前脳同一性；ｉｉ）ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８：腹側／視床下部同一性及びｉｉｉ）ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ：中脳ＤＡ前駆細胞同一性に配分された。
本発明の開発中に得られたプロトコルから生じる細胞を以前の方法により得られる細胞と比較した。本発明のＳＨＨ／ＦＧＦ８＋ＣＨＩＲ処理細胞に対する例となる視覚的比較として図２及び１８を参照のこと。図１９ＡはＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理後のＦＯＸＡ２／Ｔｕｊ１二重標識細胞の例（上段のパネル）並びにＴＨ、Ｎｕｒｒ１及びＬＭＸ１ＡとのＦＯＸＡ２の共標識（下段のパネル）を示す。それらのマーカーの組合せは初期ステージ中脳ＤＡニューロン前駆細胞の診断に役立つ。図１９Ｂは重要なドーパミンニューロン前駆細胞マーカーについての遺伝子発現データ（図２Ｅとの比較のため）を示す。
概して、本明細書において使用される材料と方法が次に説明される。ヒトＥＳＣ（Ｈ９、Ｈ１）及びｉＰＳＣ株（２Ｃ６及びＳｅＶ６）を改変二重ＳＭＡＤ阻害（Ｃｈａｍｂｅｒｓ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２７：２７５〜２８０ （２００９）、参照により本明細書中に援用）ベース底板誘導（Ｆａｓａｎｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ６：３３６〜３４７ （２０１０）、参照により本明細書中に援用）プロトコルの対象とした。中脳底板のため、及びＤＡニューロンの新規集団の産出のためにＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ、パルモルファミン、ＦＧＦ８及びＣＨＩＲ９９０２１への曝露を最適化した（図１ｄを参照のこと）。底板誘導後、ＡＡ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦβ３及びｄｂｃＡＭＰなどのＤＡニューロン生存及び成熟因子（Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ１０１：１２５４３〜８ （２００４）、参照により本明細書中に援用）の存在下でＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７系の分化培地でさらなる成熟（第１１〜２５日、又は２５日より長く培養状態であり、最大で少なくとも１００日培養状態である）を実施した（詳細について方法全体を参照のこと）。結果生じるＤＡニューロン集団を免疫細胞化学、ｑＲＴ‐ＰＣＲ、包括的遺伝子発現プロファイリング、ドーパミンの検出のためのＨＰＬＣ分析及びインビトロ電気生理学的レコーディングによる詳細な表現型特徴解析の対象とした。半身パーキンソン症げっ歯類動物（動物の脳の一方の側に６ＯＨＤＡ毒素を注入したマウス又はラット）でインビボ試験を実施した。６‐ヒドロキシドーパミン傷害を前に記載されたようにその毒素の定位的注入により受けた成体ＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃマウス（ジャクソン・ラブズ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）社）及び成体スプレイグ・ダウリー・ラット（タコニック・ファームス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）社）、並びにＭＰＴＰの片側のみの頸動脈注射により処置された２匹の成体アカゲザルにおいてそれらの試験を実施した。
ＤＡニューロンはそれらの動物の線条体中に定位的に注入され（マウスでは１５０×１０3細胞、ラットでは２５０×１０3細胞）、そして、サルでは総計７．５×１０6細胞（６路に供給；脳の各側に３路）。アンフェタミン介在性回転分析並びに焦点性無動症及び四肢使用についての試験（「ステッピング試験」及び「円筒試験」）を含む行動アッセイを移植後に月単位の間隔で実施した。ラットとマウスを移植後の１８〜２０週間で、及びそれらの霊長類動物を移植後の１か月で殺処理した。それらの移植片の特徴解析を細胞数と移植片体積の立体解析学的分析により、並びに表現型の包括的特徴解析を免疫組織化学により実施した。未分化ヒトＥＳ細胞の培養．ｈＥＳＣ株Ｈ９（ＷＡ‐０９、ＸＸ、２００９年１０月の時点より２７〜５５継代）、Ｈ１（ＷＡ‐０１、ＸＹ、２０１０年６月の時点より３０〜４０継代）並びにｉＰＳ細胞株２Ｃ６（Ｋｉｍ、ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：６９５〜７０６ （２０１１）、参照により本明細書中に援用）（ＸＹ、２０〜３０継代）及びＳｅＶ６（ＸＹ、２０〜３０継代；非挿入性４因子センダイ・ベクター・システム（Ｂａｎ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ （２０１１） １０８（３４）：１４２３４〜１４２３９：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１０３５０９１０８、 参照により本明細書中に援用）を使用するＭＲＣ‐５胚性線維芽細胞由来）を、ヒトＥＳ細胞に基づいてｃｍ2当たり０．５×１０3個からｃｍ2当たり１００×１０3個までの範囲に推定される播種濃度で、至適２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ、インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）含有ヒトＥＳ細胞培地（前に記載された（Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：６９５〜７０６ （２０１１）、参照により本明細書中に援用）において細胞をクラスター化する傾向があるマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ、グローバル・ステム社、メリーランド州、ロックビル）上に維持した。ノックアウト血清代替物の使用は０％から４０％までの範囲にあり得る。
神経誘導．底板系中脳ドーパミンニューロン誘導のため、改変型の二重ＳＭＡＤ阻害（Ｃｈａｍｂｅｒｓ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２７：２７５〜２８０ （２００９）、参照により本明細書中に援用）及び底板誘導（Ｆａｓａｎｏ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６：３３６〜３４７ （２０１０）、参照により本明細書中に援用）プロトコルが、ＬＤＮ‐１９３１８９（１００ｎＭ（０．５〜５０μＭまでの濃度範囲、ステムジェント社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ（０．５〜５０μＭまでの濃度範囲、トクリス（Ｔｏｃｒｉｓ）社、ミシガン州、エリスビル）、ＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ（１００ｎｇ／ｍｌ（１０〜２０００ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲、Ｒ＆Ｄ社、ミネソタ州、ミネアポリス）、パルモルファミン（２μＭ（１０〜５００ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲、ステムジェント社）、ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ（１０〜５００ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲、Ｒ＆Ｄ社）及びＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ；３μＭ（０．１〜１０ｕＭまでの濃度範囲、ステムジェント社）への指定時刻に作動する曝露に基づいて用いられた。
底板誘導プロトコルについて、「ＳＨＨ」処理は１００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ＋パルモルファミン（２μＭ）の組合せへの細胞の曝露、すなわち接触を指す。細胞を播種し（３５〜４０×１０3細胞／ｃｍ2）、ＤＭＥＭ含有ノックアウト血清代替物培地（ＫＳＲ）（１５％ノックアウト血清代替物、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン及び１０μＭ（１〜２５μＭまでの濃度範囲）β‐メルカプトエタノール）中のマトリゲル又はゲルトレックス（購入して使用）（ＢＤ社、ニュージャージー州、フランクリン・レイクス）上で１１日間培養した。前に記載された（Ｃｈａｍｂｅｒｓ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２７：２７５〜２８０ （２００９）、参照により本明細書中に援用）ように、分化第５日から開始して、第５〜６日に７５％（ＫＳＲ）：２５％（Ｎ２）の比率で、第７〜８日に５０％（ＫＳＲ）：５０％（Ｎ２）の比率で、そして、第９〜１０日に２５％（ＫＳＲ）：７５％（Ｎ２）の比率で混合することによってＫＳＲ培地を徐々にＮ２培地に転じていった。ＣＨＩＲを添加され（第１３日まで）、且つ、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子、５〜１００までの範囲の２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ社）、アスコルビン酸（ＡＡ；０．２ｍＭ（０．０１〜１ｍＭまでの濃度範囲）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、ミシガン州、セントルイス）、ＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ（１〜２００ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲）；Ｒ＆Ｄ社）、ＴＧＦβ３（トランスフォーミング増殖因子タイプβ３、１ｎｇ／ｍｌ（０．１〜２５ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲）；Ｒ＆Ｄ社）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．５ｍＭ（０．０５〜２ｍＭまでの濃度範囲）；シグマ社）、及びＤＡＰＴ（１０ｎＭ（０．５〜５０ｎＭまでの濃度範囲）；トクリス社）を添加されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地／Ｂ２７培地（１：５０希釈）／Ｌ‐グルタミン（０．２〜２ｍＭの有効範囲））含有培地（ＮＢ／Ｂ２７；インビトロジェン社）に培地を第１１日から９日間変更した。第２０日にアキュラーゼ（登録商標）（イノベーティブ・セル・テクノロジー社、カリフォルニア州、サンディエゴ）を使用して細胞を解離させ、そして、所与の実験にとって所望の成熟段階まで分化培地（ＮＢ／Ｂ２７＋ＢＤＮＦ、ＡＡ、ＧＤＮＦ、（本明細書に記載される濃度範囲の）ｄｂｃＡＭＰ、ＴＧＦβ３及び（本明細書に記載される濃度範囲の）ＤＡＰＴ）中において、１５μｇ／ｍｌ（１〜５０μｇ／ｍｌまでの濃度範囲）のポリオルニチン（ＰＯ）／ラミニン（１μｇ／ｍｌ）（０．１〜１０μｇ／ｍｌまでの濃度範囲）／フィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ（０．１〜２０μｇ／ｍｌまでの濃度範囲）で事前に被覆されたディッシュに高細胞密度条件（例えば、３００から４００ｋ細胞／ｃｍ2）で再播種した。
ロゼット系ＤＡニューロン誘導について、最初の神経誘導ステップを促進するために二重ＳＭＡＤ阻害を用いたことを少なくとも１つの例外として、以前に記載されたプロトコル（Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１：１２５４３〜８ （２００４）、参照により本明細書に援用）に部分的に従った。簡単に説明すると、分化第２〜８日までＳＢ４３１５４２とノギン（２５０ｎｇ／ｍｌ（１０〜１０００ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲）；Ｒ＆Ｄ社）、及び第６〜１１日までＳＨＨ＋ＦＧＦ８を添加したＫＳＲ中において放射線照射ＭＳ５細胞と共培養することによって、ｈＥＳＣを神経運命に向かって誘導した。１１日後にＫＳＲ中で神経ロゼットを手作業で単離し、そして、ＳＨＨ、ＦＧＦ８、ＢＤＮＦ及びＡＡを添加されたＮ２培地中で、前に記載された（Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ ＳＡ １０１：１２５４３〜８ （２００４）、参照により本明細書中に援用）ように培養した（Ｐ１期）。Ｐ１期の５〜７日後、ロゼットを機械的に再度回収し、そして、１時間の無Ｃａ2／Ｍｇ2ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中でのインキュベーション後に研和し、そして、ポリオルニチン（ＰＯ）／ラミニン／フィブロネクチン被覆プレート上に再播種した。ＳＨＨ／ＦＧＦ８を使用するパターン形成をＰ２期において７日間継続し、所与の実験にとって所望の成熟段階まで（通常、移植試験には５〜７日又はインビトロ機能試験には３２日）上に記載されたようにＢＤＮＦ、ＡＡ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦｂ３及びｄｂｃＡＭＰの存在下での最終分化が続いた。
遺伝子発現分析．対照ＬＳＢ、ＬＳＢ／ＳＨＨ／ＦＧＦ８及びＬＳＢ／ＳＨＨ／ＦＧＦ８／ＣＨＩＲの各条件からＲＮｅａｓｙキット（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社、カリフォルニア州、バレンシア）を使用して分化中の第０日、第１日、第３日、第５日、第７日、第９日、第１１日、第１３日、及び第２５日に全ＲＮＡを抽出した。マイクロアレイ分析について、ＭＳＫＣＣゲノム・コア施設が全ＲＮＡを処理し、イルミナ・ヒト参照１２ビーズアレイに製造業者の明細書に従ってハイブリダイズさせた。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）のＬＩＭＭＡパッケージを使用して各日及び各条件の間で比較を実施した。０．０５未満の調整済みＰ値と２よりも大きい変化倍率を有することが分かった遺伝子が有意であると見なされた。市販のソフトウェアパッケージ（Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（第６．１０．０９１５版））を使用して説明的なマイクロアレイデータ分析と提示のいくつかを実施した。ｑＲＴ‐ＰＣＲ分析について、各条件の第２５日における全ＲＮＡを逆転写し（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｈ、キアジェン社）、そして、市販のＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（アプライド・バイオシステムズ社、カリフォルニア州、カールスバッド）を使用して増幅された物質を検出し、ＨＰＲＴに対してそのデータを正規化した。各データポイントは３つの独立した生物試料からの９回の技術複製を表す。マイクロアレイ試験の生データは未だＧＥＯ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ）において利用可能ではない。
動物の外科手術．げっ歯類動物及びサルに対する手技はＮＩＨのガイドラインに従って実施されており、そして、地域の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）、バイオセイフティ委員会（ＩＢＣ）、並びに胚性幹細胞研究委員会（ＥＳＣＲＯ）により承認された。
マウス．ＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌルマウス（２０〜３５ｇの体重；ジャクソン・ラボラトリー社、メーン州、バーハーバー）をケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ；アコーン（Ａｋｏｒｎ）社、イリノイ州、ディケーター）とキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ、アイオワ州、フォート・ドッジ）で麻酔した。６‐ヒドロキシドーパミン（１０μｇ（０．１〜２０μｇまでの濃度範囲）６‐ＯＨＤＡ（シグマ・アルドリッチ社）を次の座標（ミリメートル単位）で線条体に定位的に注入した：ＡＰ、０．５（定位的外科手術の基準として用いられる頭蓋縫合、すなわち、ブレグマより）；ＭＬ、−２．０；ＤＶ、−３．０（基準として用いられる脳を包み込む膜である硬膜より）。上出来な病変を有するマウス（平均で６回転超／分）を移植用に選択した。総計で１５０×１０3細胞を１．５μｌの体積で、次の座標（ｍｍ単位）で線条体に注入した：ＡＰ、０．５；ＭＬ、−１．８；ＤＶ、３．２。マウスを移植後１８週間で殺処理した。
ラット．成体雌スプレイグ・ダウリー（タコニック社、ニューヨーク州、ハドソン）ラット（１８０〜２３０ｇ）をケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。片側のみの内側前脳束の黒質線条体経路の病変を、２か所（Ｓｔｕｄｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １：２９０〜２９５ （１９９８）、参照により本明細書中に援用）での６‐ＯＨＤＡ（０．２％アスコルビン酸及び０．９％生理食塩水（シグマ社）中の３．６ｍｇ／ｍｌ）の定位的注入により確立した。注入後６〜８週間までにアンフェタミン誘導性回転が６回転／分を超えた場合、移植用にラットを選択した。２５０×１０３細胞を各動物の線条体に移植した（座標：ＡＰ＋１．０ｍｍ、ＭＬ−２．５ｍｍ及びＶ−４．７ｍｍ；−２．５のこぎ歯セット）。対照ラットは代わりにＰＢＳを受容した。外科的手技は前に記載された（Ｓｔｕｄｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １：２９０〜２９５ （１９９８）、参照により本明細書中に援用）。毎日の１５ｍｇ／ｋｇのシクロスポリン（ベッドフォード・ラブズ（Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌａｂｓ）社、オハイオ州、ベッドフォード）の腹腔内注射を細胞移植の２４時間前に開始し、そして、細胞移植から２０週間後の殺処理まで継続した。霊長類動物．両側性のパーキンソン症候群をもたらす頸動脈ＭＰＴＰ投与とそれに続く毎週の静脈内ＭＰＴＰ投与（Ｋｏｒｄｏｗｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：７６７〜７７３ （２０００）、参照により本明細書中に援用）により２匹の成体（１７〜１８歳；１０〜１２ｋｇ；雌）アカゲザルを半身性パーキンソン症にした。両方の動物が、猫背、跛行及び硬直性症状（運動の硬直性）、空間無視（片側への刺激に対する運動的アウェアネス）及び運動緩慢（動作緩慢の開始）を含む行動分析に基づいて適度に重症な病変に適合するパーキンソン病の症状を示した。改変パーキンソン病臨床評価尺度（ＣＲＳ）を用いてこれらのパラメーターをサルにおいて評価することができる。移植手術の日に動物をケタミン（３．０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）とデクスドミター（０．０２〜０．０４ｍｇ／ｋｇ筋肉内）で鎮静化し、安定した気道を維持するために挿管し、そして、イソフルランで麻酔した。次に外科手術のためにそれらの動物を定位枠に設置した。両方のアカゲザルが定位的座標（Ｐａｘｉｎｏｓ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｒｈｅｓｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２０００）、参照により本明細書中に援用）に基づくヒト底板由来ＤＡ培養物の３回の頭蓋内注入による単回の外科手術を受けた。細胞の両側性注入（１０ｕｌ／注入；１２５，０００細胞／ｕｌ）を総計で半球当たり３０μｌの体積になるように３つの部位（１つは後方尾状核、２つは交連前被殻と覆っている白質）に実施した。定位的顕微操作装置に取り付けられた点滴ポンプを利用して１μｌ／分の速度で２８Ｇの針を付けた５０μｌのハミルトン注射筒から細胞を送達した。注入の完了後、その針をさらに２〜５分間その場所に留めて点滴物を針の先端から拡散させた後に注射筒をゆっくりと引き抜いた。外科手術直後から術後７２時間まで動物は鎮痛薬（ブプレネックス（ｂｕｐｒｅｎｅｘ）、０．０１ｍｇ／ｋｇ筋肉内、術後７２時間の間に１日２回；メロキシカム、０．１ｍｇ／ｋｇ皮下、術後７２時間の間に１日１回）並びに抗生物質（セファゾリン（ｃｅｐｈａｚｏｌｉｎ）、２５ｍｇ／ｋｇ筋肉内、１日２回）を受容した。それらの動物はシクロスポリンＡ（ネオラール、サンディミュン）を外科手術の４８時間前に開始して移植から１か月後の殺処理まで経口的に（３０ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇまで徐々に減量して）受容した。
行動アッセイ．アンフェタミン誘導性回転（マウス及びラット）とステッピング試験（ラット）を移植前と移植後４週間、８週間、１２週間、１８週間に実施した。マウスにおける回転行動はｄ‐アンフェタミン（１０ｍｇ／ｋｇ、シグマ社）の腹腔内注射から１０分後に記録され、３０分間記録された。ラットにおける回転行動はｄ‐アンフェタミン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射から４０分後に記録され、そして、ＴＳＥ ＶｉｄｅｏＭｏｔ２システム（ドイツ）により自動的に評価された。データが分当たりの平均回転数として提示された。ステッピング試験は、Ｂｌｕｍｅ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２１９：２０８〜２１１ （２００９）及びＣｒａｗｌｅｙ， ｅｔ ａｌ． Ｗｈａｔ’ｓ Ｗｒｏｎｇ Ｗｉｔｈ Ｍｙ Ｍｏｕｓｅ： Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｉｃｅ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， ２０００）（それらの全てを参照により本明細書中に援用）から改変された。簡単に説明すると、各ラットを平面に配置し、尾をそっと持ち上げることによってそのラットの後肢を引き上げて前足だけをテーブルに接触させた。実験者が一定の速度でラットを後方に１メートル引きずった。対側性と同側性の前足の両方の順応性のステップの数を計数した。データは、対側性の順応ステップ／（対側性＋同側性の順応ステップ）のパーセンテージとして提示された。円筒試験は、前に記載されたように（Ｔａｂａｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １４：３７９〜３８１ （２００８）、参照により本明細書中に援用）各動物をガラスの円筒中に配置し、その円筒の壁への（２０回の接触のうちの）同側性と対側性の足の接触の回数を計数することによって実施された。げっ歯類動物及び霊長類動物の組織処理が下に記載される。
マウス及びラット：動物（マウス及びラット）は深麻酔の誘導のために過剰用量のペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に受容し、そして、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で潅流された。脳を摘出し、４％のＰＦＡ中で後固定し、その後、３０％のショ糖溶液中に２〜５日間浸漬した。Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（サクラ・ファインテック社、カリフォルニア州、トーランス）中に包埋した後、それらの脳をクライオスタットで切片にした。
霊長類動物：動物を、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内（ＩＭ））とペントバルビタール（２５ｍｇ／ｋｇ、静脈内（ＩＶ））による深麻酔下でヘパリン処置０．９％生理食塩水とそれに続く冷４％ＰＦＡ固定液（ｐＨ７．４）を用いる頸動脈潅流により殺処理した。一次固定の直後に脳を頭骨から取り出し、４％ＰＦＡ中に浮かせて２４〜３６時間後固定した。次にそれらの脳を濯ぎ、４℃で低速振盪器上の１０％ショ糖中に再浮遊させ、そして、「沈めて」おいた。その後、その処理を２０％ショ糖、続いて３０％ショ糖で反復した。脳全体を凍結滑走式ミクロトーム上で４０ｕｍの連続切片に冠状に切断し、そして、−２０℃の凍結保存媒体中に浮かせて貯蔵した。
免疫組織化学：細胞を４％ＰＦＡ中で固定し、０．３％トリトンを含む１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロックした。脳組織切片を冷ＰＢＳ中で洗浄し、そして、同様に処理した。一次抗体を１〜５％のＢＳＡ又は通常ヤギ血清に希釈し、そして、製造業者の推奨に従ってインキュベートした。抗体と供給業者の包括的なリストが表６として提供されている。適切なＡｌｅｘａ４８８複合体化、Ａｌｅｘａ５５５複合体化及びＡｌｅｘａ６４７複合体化二次抗体（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社、カリフォルニア州、カールスバッド）を４’、６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＮ）細胞核対比染色液（サーモ・フィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）社、イリノイ州、ロックフォード）と共に使用した。いくつかの分析について、ビオチン化二次抗体を使用し、続いてＤＡＢ（３，３’‐ジアミノベンジジン）色素原による視覚化を行った。
ＨＰＬＣ分析．ドーパミン、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）及びＤＯＰＡＣ（３，４‐ジヒドロキシ‐フェニル酢酸）のレベルを測定するための電気化学的検出を用いる逆相ＨＰＬＣを前に記載されたように（Ｒｏｙ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １２：１２５９〜１２６８ （２００６）； Ｓｔｕｄｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｕｌｌ． ４１：１４３〜１５０ （１９９６）、それらの全てを参照により本明細書中に援用）実施した。培養試料を分化第６５日に過塩素酸中に収集した。いくつかの実験について、同じ検出系を用いて、しかし、前に記載されたような（Ｓｔｕｄｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｕｌｌ． ４１：１４３〜１５０ （１９９６）、参照により本明細書中に援用）市販のキットを用いるドーパミンとその代謝物のアルミニウム抽出の後にＤＡを媒体中で直接測定した。
電気生理学的レコーディング：４０倍の水浸対物レンズを装着した正立顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００ＦＮ；ニコン）上のレコーディング・チャンバーに培養物を移し、ｍＭ単位で次のものを含有する生理食塩水で培養物を潅流した：１２５ＮａＣｌ、２．５ＫＣｌ、２５ＮａＨＣＯ3、１．２５ＮａＨ2ＰＯ4、２ＣａＣｌ、１ＭｇＣｌ2、及び２５グルコース（３４℃；９５％Ｏ2・５％ＣＯ２で飽和；ｐＨ７．４；２９８ｍＯｓｍ／Ｌ）。生理食塩水の流速は２〜３ｍｌ／分であり、インライン・ヒーター（ＴＣ‐３２４Ｂ制御器付きのＳＨ‐２７Ｂ；ワーナー・インスツルメンツ社）を通過した。冷却ＣＣＤデジタルカメラ（フォトメトリクス社のＣｏｏｌＳＮＡＰ ＥＳ2、ローパー・サイエンティフィック社、アリゾナ州、ツーソン）を取り付けたビデオ顕微鏡法によりニューロンを視覚化した。電気生理学的レコーディングのために選択した細胞は細かい分岐した神経突起を有するニューロン様形態を有した。ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ７００Ｂ増幅器（モレキュラー・デバイス社）を用いて電流固定設定の体細胞ホールセル・パッチクランプ・レコーディングを実施した。シグナルを１〜４ｋＨｚについてフィルターにかけ、そして、５〜２０ｋＨｚについてＤｉｇｉｄａｔａ１４４０Ａ（モレキュラー・デバイス社）を使用してデジタル化した。レコーディングパッチ電極はフレイミング・ブラウン・ガラス電極作製器（Ｐ‐９７、サッター・インスツルメンツ社）上で引っ張られてフィラメント化ボロケイ酸ガラス（サッター・インスツルメンツ社）から作製され、そして、槽中で４〜６ＭΩの抵抗を有した。電極はｍＭ単位で次のものを含有する内部溶液で満たされた：１３５Ｋ‐ＭｅＳＯ4、５ＫＣｌ、５ＨＥＰＥＳ、０．２５ＥＧＴＡ、１０ホスホクレアチン（ｐｈｏｓｐｈｏｃｒｏｅａｔｉｎｅ）‐ジ（トリス）、２ＡＴＰ‐Ｍｇ、及び０．５ＧＴＰ‐Ｎａ（ｐＨ７．３、浸透圧を２９０〜３００ｍＯｓｍ／Ｌに調節）。電極の抵抗を補正するために増幅器ブリッジ回路を調節し、そして、モニターした。電極の静電容量が補正された。レコーディング中に直列抵抗が２０％超増加したときは、増加した抵抗がレコーディング中の部分的な技術的故障を示唆したので、そのデータを廃棄した。
細胞計数と立体解析学的解析．底板期（第１１日）図１、中脳ドーパミンニューロン前駆細胞期（第２５日）、図２及び成熟ＤＡニューロン期（第５０日以降）図３及び１１におけるマーカー陽性細胞のパーセンテージを少なくとも３回ずつの独立した実験から得られた試料において決定した。定量用の画像を画一的で無作為的な方法で選択し、そして、各画像にまずＤＡＰＩ陽性細胞核の数について点数を付け、続いて目的のマーカーを発現する細胞の数を計数した。データは平均値±ＳＥＭとして提示されている。移植片内のヒト細胞（抗ｈＮＡで同定された）とＴＨ＋ニューロンの定量を、移植片が確認できる１０枚ごとの切片について実施した。前にＴａｂａｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３：６０１〜６０６ （２００５）（参照により本明細書中に援用）において記載されたように、光学分画器のプローブとステレオ・インベスティゲーター・ソフトウェア（ＭＢＦバイオサイエンス社、バーモント州）を使用するカバリエリ（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ）推定量を使用して細胞数と移植片体積を決定した。データは推定された総細胞数と総移植片体積±標準誤差（ＳＥＭ）として提示されている。
次の処方は本発明の実施形態の開発のために使用された例となる細胞培養培地を説明する。
維持用ｈＥＳＣ培地（１リットル）：８００ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２、２００ｍＬのノックアウト血清代替物、５ｍＬの２００ｍＭ Ｌ‐グルタミン、５ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０ｍＬの１０ｍＭ ＭＥＭ最小非必須１５アミノ酸溶液、５５μＭの１３‐メルカプトエタノール、及びｂＦＧＦ（最終濃度は４ｎｇ／ｍＬである）。
ｈＥＳＣ分化用ＫＳＲ培地（１リットル）：８２０ｍＬのノックアウトＤＭＥＭ、１５０ｍＬのノックアウト血清代替物、１０ｍＬの２００ｍＭ Ｌ‐グルタミン、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０ｍＬの１０ｍＭ ＭＥＭ、及び５５μＭの１３‐メルカプトエタノール。
ｈＥＳＣ分化用Ｎ２培地（１リットル）：ＤＭＥＭ／Ｆ１２粉末と９８５ｍｌの蒸留水、１．５５ｇのグルコース（シグマ社、カタログ番号Ｇ７０２１）、２．００ｇの炭酸水素ナトリウム（シグマ社、カタログ番号Ｓ５７６１）、プトレシン（１００ｍＬの蒸留水に溶解した１．６１ｇのうちの１００ｕＬのアリコット；シグマ社、カタログ番号Ｐ５７８０）、プロゲステロン（１００ｍＬの１００％エタノールに溶解した０．０３２ｇのうちの２０ｕＬのアリコット；シグマ社、カタログ番号Ｐ８７８３）、亜セレン酸ナトリウム（蒸留水中の０．５ｍＭ溶液の６０ｕＬのアリコット；バイオショップ・カナダ社、カタログ番号ＳＥＬ８８８）、及び１００ｍｇのトランスフェリン（セリアンス（Ｃｅｌｌｉａｎｃｅ）／ミリポア社、カタログ番号４４５２−０１）、及び１０ｍＬの５ｍＭ ＮａＯＨ中の２５ｍｇのインスリン（シグマ社、カタログ番号１６６３４）。
ＰＭＥＦ（（初代マウス胚線維芽細胞（ＰＭＥＦ））フィーダー細胞）調製用の１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１リットル）：８８５ｍＬのＤＭＥＭ、１００ｍＬのＦＢＳ、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び５ｍＬのＬ‐グルタミン。
ＭＳ‐５フィーダー細胞媒体の調製用の１０％ＦＢＳ含有アルファ最小必須培地（ＭＥＭ）（１リットル）：８９０ｍＬのアルファＭＥＭ、１００ｍＬのＦＢＳ、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐゼラチン溶液（５００ｍｌ）：０．５ｇのゼラチンを５００ｍｌの温Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水（５０〜６０℃）に溶解。室温まで冷却。
次のものは、概して、移植に使用される成熟ＤＡニューロンの産生をモニターする例となる方法の概略である（表７に示されている条件も参照のこと）。第１３日はＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａの共発現を特徴とする中脳底板ステージである。ＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａの発現に加えて、ＯＣＴ４発現の喪失並びに前脳マーカーＰＡＸ６及びＦＯＸＧ１の誘導の欠如が見出された。第２５日は、ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａの連続的発現及びニューロンマーカー（ＴＵＪ１）とＤＡマーカー（ＮＵＲＲ１、ＴＨ）の発現を特徴とする中脳ＤＡニューロン前駆細胞ステージである。増殖するＫｉ６７＋細胞とＰＡＸ６及びＦＯＸＧ１前脳神経前駆細胞の数が、これらのマーカーが望まれない場合、モニターされた。免疫蛍光データの不偏で短時間の定量のためにオペレッタ（パーキン・エルマー社）ハイコンテント顕微鏡を測定のために使用した。各マーカーについて免疫蛍光データの確認のためにｑＲＴ‐ＰＣＲアッセイも用いた。いくつかの実施形態では、これらの予備的なインビトロ試験を通過した細胞株（培養物）を移植用に用いる。表７を参照のこと。いくつかの実施形態では、成熟ＤＡニューロンは第２５日（第２０日〜第２５日の範囲）において７％のＤＭＳＯ（３％〜１２％の範囲）を含む培地中で血清を含まずに、移植に使用するため融解されるまで凍結保存された。いくつかの実施形態では、細胞試料は液体窒素中に貯蔵される。いくつかの実施形態では、細胞は低温冷蔵庫中に貯蔵される。他の実施形態では、ミオイノシトール、ポリビニルアルコール、血清代替物、カスパーゼ阻害化合物などの凍結保護物質をＤＭＳＯに加えて使用することを企図する。融解後、細胞を移植に使用する前に生存性、マーカー発現等について試験する。いくつかの実施形態では、凍結貯蔵条件をモニターするために長期インビトロアッセイ及びインビボアッセイにおいて融解細胞を機能の維持について試験する。
Ｂ． 機能性ＤＡニューロンの作製用のさらなる因子を特定する試験。本発明の細胞の作製において組織培養成分のさらなる「除去」及び「添加」実験を用いることが企図される。例えば、ＦＧＦ８の使用により本発明の細胞が生じるが、これらの細胞の作製にそれは必要とされないことが示された。本発明のＤＡ神経細胞を生じる４種の「中核」分子、すなわち、ｉ）Ａｌｋ４／５／７（「ＴＧＦβ）阻害剤（ＳＢ４３１５４２）、ｉｉ）Ａｌｋ２／３（「ＢＭＰ」）阻害剤（ＬＤＮ‐１９３１８９）、ｉｉｉ）スムーズンド（「ＳＨＨ」）アゴニスト（パルモルファミン）、及びｉｖ）ＧＳＫ３β阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）と共に細胞培養物への添加物として表８に記載されるもののような追加的な試薬に対してこれらの実験が拡大される。
本明細書に記載されるように、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９の使用は万能性幹細胞の効率的な神経変換を示したが、一方、パルモルファミン及びＣＨＩＲ９９０２１のこれらの細胞への添加は中脳底板誘導を示した。長期の栄養補助を提供するため、及び／又は分化を促進するために他の化学物質及び組換えタンパク質を使用した、又は使用することができる。これらの化合物のうちのいくつかを、本明細書に記載される細胞分化におけるそれらの役割を明らかにするためにさらなる試験で使用する。
これらの実験のために他の化合物の性能を４種の中核因子の使用（表８）に対してＤＡニューロン分化の例となる限度（表７）について比較する。
これらの種類の実験は本発明の真正ＤＡ神経細胞の作製に必要な最も少ない数の因子を明らかにすると考えられる。
Ｃ． 可能性がある増殖性混入細胞（万能性ｈＥＳＣ、神経ロゼット）の用量反応曲線を確立するための実施形態。本発明の開発中にインビボで少なくとも５か月の生存までは移植片内にテラトーマ又は過剰な過形成は観察されなかった。ヒトにおいて考慮される移植片の寿命（ｌｏｎｇｉｔｉｖｉｔｙ）を反映するための長期試験のための安全性をモニターするため、テラトーマに発達し得る未分化ｈＥＳＣ又はかなり増殖することができる始原神経外胚葉前駆細胞などの問題性がある細胞種の臨床的に適切な混入限度の決定に細胞数閾値を企図する。従って、いくつかの実施形態が移植に使用される細胞中のドーパミン系ニューロンのさらなる濃縮、すなわち、移植前の混入細胞種の枯渇のために企図される。例となる限度について表７を参照のこと。
以下は増強戦略の検証のためのアッセイにおいて例となる追加の規格化セットを説明する。ｈＥＳＣについて、ｈＥＳ由来ＤＡニューロンと未分化（Ｏｃｔ４＋／ナノグ＋）細胞の既定の混合物を使用して動物実験における集団効果及び／又は動物の死を示唆する臨床症状をモニターする。１０，０００ｈＥＳＣ由来ＤＡ細胞当たり１個のｈＥＳ細胞、１／５０００、１／１０００及び１／１００の用量反応を実施する。細胞を線条体内に注入し、そして、動物が免疫抑制を受容する。ラットを厳密にモニターし、そして、神経学的症状が現れたところで、又は最大６か月で殺処理する。脳を移植片体積及び本明細書に記載される組成物について分析する。テラトーマの出現について明確なインビボ閾値が確立されるまで細胞比率を調節する。始原神経外胚葉前駆細胞の混入レベルの決定について、類似の戦略に従う。初期神経前駆細胞の存在は増殖と中枢神経系運命並びに末梢神経系（ＰＮＳ）運命への広範な分化へのかなりの可能性を有する。移植片分析はロゼット細胞（ＰＬＺＦ発現）、それらの細胞のＣＮＳ子孫（ネスチン／Ｓｏｘ２を発現する神経前駆細胞又はＦｏｘＧ１を発現する前脳前駆細胞）に対するＩＨＣ並びに移植片体積及び増殖指数（総生存細胞のうちのＫｉ６７＋の％）からなる。
ＩＶ． パーキンソン病
パーキンソン病（ＰＤ）は２番目に最も一般的な神経変性障害であり、世界中で４１０万〜４６０万人の患者を冒していると推定され、人数は２０３０年までに２倍を超えると予想されている。パーキンソン病はアルツハイマー病の後に２番目に最も一般的な神経変性障害であり、米国では約１００万人の患者を冒しており、毎年６０，０００人の新しい患者がパーキンソン病と診断される。その疾患は著しい罹患率と死亡率をもたらすので大きい社会経済的影響を有し、そして、医療費と所得の損失を含むＰＤの直接的及び間接的損失の合計は米国だけで毎年約２５０億ドルと推定される。現在のところ加齢に関連し、進行性であり、そして、無力化する障害であるパーキンソン病（ＰＤ）の治療法は存在しない。ＰＤは黒質における中脳ＤＡニューロンの選択的喪失を病理学的な特徴とする。従って、ＰＤの基礎的な特徴は、最終的には無力化する運動機能不全を引き起こす中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの進行性であり、重篤で不可逆的な喪失である。薬理学的療法、運動系療法、遺伝子療法及び外科的療法がＰＤに向けて開発されてきたが、それらのアプローチの中で適切なＤＡニューロン機能を回復させることができるものは未だ無い。患者における運動症状の長期制御は多くの場合最適以下で留まり、そして、進行性非ドーパミン応答性運動症状及び非運動症状の重要性を認識している一方で、長期ドーパミン応答性症状制御の基礎的問題は重大な治療必要性のある領域のままである。中枢と末梢の両方神経系を冒す広範囲に及ぶ病態がＰＤにおいて認識されており、ＰＤの基本的特徴（部分的には運動緩慢、強直、及び身震い）は基本的にＤＡ神経細胞の喪失に関連し、そして、ドーパミン応答性である。従って、ＰＤには、その疾患の大半の運動症状の原因である中脳ＤＡニューロンのどちらかと言えば選択的な喪失のため、神経細胞置換を用いる治療が企図される。健康なヒトの脳は約１００万のＤＡニューロンを有する。従って、１つの実施形態では、ＣＮＳにおける大半の他の障害と比べて比較的に少数の生存細胞を必要とするＤＡニューロン置換が企図される。
ＰＤ向けの細胞ベースの治療法の開発における１つの課題は、ニューロン置換において使用される適切な細胞供給源の特定であった。この探索は３０年を超えて継続されており、ＤＡニューロン置換のための多くの潜在的な供給源が提案された（Ｋｒｉｋｓ， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ＥＳ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ （Ｐａｓｔｅｒｋａｍｐ，Ｒ．Ｊ．， Ｓｍｉｄｔ， ＆ Ｂｕｒｂａｃｈ編）（Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２００８； Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｏｘｉｄ． Ｒｅｄｏｘ． Ｓｉｇｎａｌ． １１：２１８９〜２２０８ （２００９））。副腎髄質に由来するカテコールアミン系細胞（Ｍａｄｒａｚｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１６， ８３１〜８３４ （１９８７））、頚動脈小体移植物（Ａｒｊｏｎａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ５３：３２１〜３２８ （２００３））、又はカプセル化網膜色素上皮細胞（Ｓｐｈｅｒａｍｉｎｅ ｔｒｉａｌ Ｂａｋａｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ． ９， ５９２〜６０２ （２００４）を含むそれらの供給源のうちのいくつかが過去に初期段階の臨床治験に進んだ。しかしながら、それらの治験はほとんど臨床的有効性を示すことに失敗し、そして、低い長期生存性と移植された細胞からの低いＤＡ放出という結果に終わった。別のアプローチは、世界中で３００人を超える患者に実施された胎児中脳ＤＡニューロンの移植（Ｂｒｕｎｄｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １８４， ２６５〜２９４ （２０１０）； Ｌｉｎｄｖａｌｌ， ＆ Ｋｏｋａｉａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ １２０：２９〜４０ （２０１０））であった。これらの患者におけるヒト胎児組織を使用した治療法は幾人かの患者において移植から最大で１０年又は２０年のＤＡニューロン生存とインビボＤＡ放出の証拠を示した。しかしながら、多くの患者では、胎児組織移植はＤＡ神経機能を置換することに失敗している。さらに、胎児組織移植は、少量低品質のドナー組織、組織獲得にまつわる倫理的及び実際的問題、及び様々な臨床転帰に寄与する要因のうちのいくつかである、ほとんど明らかになっていない移植細胞の不均一性を含む複数の課題によって悩まされている。胎児移植の例はＭｅｎｄｅｚ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．（２００８））； Ｋｏｒｄｏｗｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３２：１１１８〜１１２４ （１９９５）； Ｐｉｃｃｉｎｉ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２：１１３７〜１１４０ （１９９９）に記載されている。しかしながら、臨床結果は初期の非盲検試験における陽性データ（Ｌｉｎｄｖａｌｌ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：５７４〜５７７ （１９９０）； Ｗｉｄｎｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５５６〜１５６３ （１９９２）； Ｂｒｕｎｄｉｎ， ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ １２３：１３８０〜１３９０ （２０００）； Ｆｒｅｅｄ， ｅｔ ａｌ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５４９〜１５５５ （１９９２）； Ｆｒｅｅｍａｎ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｆｅｔａｌ ｎｉｇｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｏｓｔｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌ ｐｕｔａｍｅｎ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ３８：３７９〜３８８ （１９９５））と混合された。しかしながら、米国における２つのより大規模なＮＩＨ後援プラセボ対照臨床治験では適度な結果が見出された（Ｆｒｅｅｄ， ｅｔ ａｌ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４４， ７１０〜７１９ （２００１）； Ｏｌａｎｏｗ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ５４：４０３〜４１４ （２００３））。ヒト胎児移植試験において観察された限定的な有効性に対して、胎児移植は最適な治療効果に適した正確な発生ステージにおいて充分な数の細胞を提供することができないということを含む多くの仮説が存在する。さらに、胎児組織は細胞種によってほとんど区別されておらず、そして、各組織試料のステージと品質について変動がある（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ， ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ． ２， ４３７〜４４５ （２００３））。別の要因は移植片に対する低レベルの炎症性宿主応答であり得る（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ， ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ． ２， ４３７〜４４５ （２００３））。
対照的に、幹細胞由来細胞供給源又は移植用の細胞の供給における使用に矛盾の無い他の種類の細胞種が胎児組織移植に関係する課題のうちの多くを克服すると考えられており、そして、移植に最適なステージにおいてＤＡニューロンの無制限の供給源を提供することができるだろう。様々な可能性がある幹細胞供給源を使用するほぼ２０年の試みの後、本発明者らはネズミ科動物及び霊長類動物における神経学的異常を回復させることができる万能性幹細胞由来の真正ヒト中脳ＤＡニューロンを得ることに成功した。この新規分化戦略は非常に効率的であり、そして、それらの細胞の堅固なインビボ移植、ＰＤ疾患モデルにおける機能回復の誘導、及び臨床前データより裏付けられる不適切な細胞増殖などの有害事象の欠如を導いた。ＦＤＡは脊髄損傷（Ｓｔｒａｕｓｓ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２８：９８９〜９９０ （２０１０））及び黄斑変性（Ｓｃｈｗａｒｔｚ， ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ ３７９：７１３〜７２０ （２０１２））における他のヒトＥＳ細胞派生物の試験を認可したので、ＰＤ治療のためのヒトＥＳ細胞ベースの戦略に対するＦＤＡの認可が企図される。
細胞純度を制御する「増強」戦略を含むさらなる実施形態が軸索線維伸長を促進し、そして、企図されている移植戦略に新規安全性／規制性特徴を含む。例えば、いくつかの実施形態では、目的の細胞種に対する単なる表面マーカースクリーン（例えば、ＣＤ１４２）から始まって特定のニューロン種についての意義ある濃縮戦略までの細胞精製の方法が示される。いくつかの実施形態では、ヒトにおいて使用される細胞の供給にこの方法を用いることが企図される。さらに、他の実施形態では、ＰＳＡ‐ＮＣＡＭの遺伝子操作発現がインビボでの神経修復に用いるための軸索伸長の強化に企図される。そのような適用には、運動ニューロン病、ハンチントン病又は主に投射ニューロンを冒す他の障害を治療するための長距離軸索伸長の促進が含まれる。さらなる実施形態がＧＭＰ適格万能性細胞供給源及び同種のもののために企図される。本明細書に記載される移植方法は少数のＤＡニューロンを必要とし、そして、ＤＡニューロン誘導に開発された比較的に費用効果がある小分子方法に基づくので、ＤＡニューロン置換療法は患者一人当たり妥当な費用であると考えられる。
ＰＤにおける移植アプローチの１つの可能性がある生物学的制限は、ＰＤにおけるニューロン変性が進行して、特にその疾患の後期ステージにおいて中脳ドーパミンニューロン以外の多くの細胞種を冒すという事実である。実際に長期試験では、非ＤＡ応答性症状が後期ＰＤにおいて優勢であり、嚥下障害、転倒、認知症及び他の重要な罹病につながる。しかしながら、いくつかの非運動症状はドーパミン系機能の回復から利益を受けると考えられる。さらに、その疾患の初期ステージにおけるｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンの使用が線条体のドーパミン応答性集団の変性を含む二次的ＰＤ症状のいくつかを防止すると考えられる。しかしながら、その疾患の非ＤＡ応答性症状への影響が無い状態であっても、線条体の長期機能性ドーパミン系の回復はこの現在では不治の障害の治療に対する主要成果であろう。パーキンソン病の場合、薬物系戦略及び脳深部刺激療法などの外科的アプローチを含む、いくつかの利用可能な代替的療法が存在する。いくつかの実施形態では、回復の効力は代替的療法によって達成されるレベルと同等、又はそれを超えると考えられる。他の実施形態では、この成熟ＤＡニューロン細胞移植療法の使用は特定のサブセットの患者に特に有益であると考えられる。他の実施形態では、この成熟ＤＡニューロン細胞移植療法の使用は既存の薬物アプローチ及び外科的アプローチへの追加的使用のために考えられる。本発明の成熟ＤＡニューロン細胞移植療法を使用することの１つの主要な利益は、移植後の独特の神経回復性、すなわち、薬物療法の段階的除去のために患者に使用することが考えられる神経機能の長期回復である。細胞移植は、薬物又は他の療法に対して反応するものと異なる範囲のＤＡ関連症状に影響すると考えられる。従って、１つの実施形態では、成熟ＤＡニューロン移植をＤＢＳと使用することが考えられる。別の実施形態では、成熟ＤＡニューロンを治療法との関連で使用することが考えられる。
Ａ）パーキンソン病と現行の治療法。家族型のＰＤに寄与するまれな遺伝的変化の特定に大きな進歩がなされた。しかしながら、大部分のＰＤの事例にとって、どのような潜在的な遺伝的素質の寄与も不明のままである。ＰＤにおける伝統的な治療戦略は、臨床的症状の発生時に黒質における全てのＤＡニューロンの３０〜７０％が不可逆的に変性したという事実によって制限される。１つの治療選択肢はＤＡ前駆体Ｌ‐ドーパを使用するＤＡニューロン欠損の薬理学的置換である。しかしながら、Ｌ‐ドーパ療法に対する幾人かのＰＤ患者の劇的な初期応答にもかかわらず、長期臨床転帰は不良のままであり、そして、運動変動及びジスキネジアを含むＬ‐ドーパ療法の重篤な副作用が後期ステージの疾患に頻繁に生じる。Ｌ‐ドーパの拍動性送達はこれらの後期ステージ運動合併症の発生に主要な役割を有するので、ドーパミンの「よりなめらかで」より生理的な送達、すなわち、例えば本発明の移植された細胞からの送達が従って非常に望ましいだろう。薬理学的戦略に加えていくつかの外科的治療選択肢が存在する。これらには淡蒼球切除術による基底核内の細胞の除去若しくは機能不活化、又は視床下核若しくは淡蒼球内節を標的とすることによる脳深部刺激が含まれる。これらの外科的選択肢幾人かの患者に対する代替法であるが、それらの選択肢は疾患の症状の軽減をもたらすが、正常なＤＡ機能を取り戻すことはない。さらに、ハードウェア不良、感染症、卒中、出血及び同種のものを含む外科的及び非外科的副作用が報告されている。他の治療選択肢には直接的な実質内点滴又は遺伝子療法によるウイルス性発現を用いるＧＤＮＦ又はニュールツリンなどの成長因子の送達が含まれる。ＰＤにおける最初の非盲検試験はＧＤＮＦについて有望な結果を示したが、その後のより大きい組の患者での比較対象試験はどのような利益も確認することができず、そして、患者のサブセットにおいて抗ＧＤＮＦ抗体の産生に起因する可能性がある安全性の懸念を引き起こした。ＧＤＮＦ関連分子であるニュールツリンのＡＡＶベースの送達も大規模なプラセボ対照多施設臨床試験においてどのような有意な臨床的利益も示すことができなかった。視床下核へのＡＡＶ担持グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）注射の第２相試験の初期のデータが細菌報告された（Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２０１１年４月）。しかしながら、臨床的利益はこの試験では最善でも控えめであった。神経栄養因子ベース又は代替的神経保護戦略に対する努力によって患者に一時的な軽減がもたらされ得るが、それらの戦略の中で細胞置換療法の主要目標である疾患のために既に失われたＤＡニューロンの回復／置換を行うことができるものはない。
Ｂ）ＰＤにおける細胞療法。線条体ドーパミンニューロンの７０〜８０％及び黒質ドーパミンニューロンの約５０％が失われた後に臨床的症状がＰＤにおいて明らかになる。しかしながら、中脳ドーパミンニューロンは妊娠から８．５週間後までに発生し、寿命の残りの時間を通してドーパミンニューロン置換の証拠はほとんどなかった。従って、疾患発症の時点までのドーパミンニューロンは、これらの細胞を置換する自然の機構が無いので数十歳であり、従ってＰＤ患者の脳においてそれらの細胞を置換するために細胞移植が必要とされ得る。ＰＤにおけるＤＡニューロン置換は副腎髄質由来クロム親和性細胞の使用に基づいて１９８０年代に行われた。それらのホルモン産生細胞はＣＮＳへ異所的に配置されると神経伝達物質表現型をアドレナリンからＤＡに切り換えることが示された。このアプローチを用いて世界中で数百人のＰＤ患者が移植されたが、移植された細胞の生存は非常に悪く、せいぜい一過性の効果を有するだけであることが時間と共に明らかになった。従って、このアプローチは臨床的使用については直ぐに放棄された。対照的に、胎児中脳組織移植は、堅固な長期移植と一群のＤＡ関連行動アッセイにわたる機能改善を示すげっ歯類モデルにおけるより詳細な前臨床試験に基づいた。それらの前臨床データに勇気づけられて、胎児移植が１９８０年代後期及び１９９０年代初期に複数の医療施設で続行した。それらの試験は、フルオロドーパＰＥＴ及び無関連の原因によって死亡した幾人かの患者におけるその後の組織学的試験によって測定される移植領域におけるＤＡ放出の増加を有する機能性長期移植の明確な証拠を示した。しかしながら、胎児移植片の使用は細胞ベースの治療アプローチに関する２つの潜在的な問題を提起した。第一に、胎児移植片の予期せぬ問題は約１５％の患者における移植片誘導性ジスキネジア（ＧＩＤ）の誘導であった。ＧＩＤの機構には議論の余地がのこっているが、近年の証拠によりセロトニン系ニューロンはＤＡの不適切な貯蔵と放出を行うことができることが示された。ＧＩＤを説明すると示唆された別の可能性がある機構はＤＡニューロンの不均一な分布、すなわち、ＤＡ放出のホットスポットの原因となる不均一な分布であった。対照的に、本発明の開発中に、ＧＩＤの発生率を低下させるだろうセロトニン系ニューロンを検出及び減少させるための方法が発見された。さらに、成熟ＤＡニューロンの注射が、ドーパミン系線維末端の宿主線条体内での伸長を含む成熟したニューロンの均一な分布をもたらすだろう。胎児移植治療に関する別の問題は適切な発生ステージにおける胎児中脳組織の限られた利用可能性であった（及び、である）。胎児ブタ由来ＤＡニューロンを使用することにより限定的な供給の問題に応える代替的戦略が臨床的に試みられた。しかしながら、それらの異種移植片におけるＤＡニューロン生存は悪く、そのアプローチ全体が放棄された。網膜色素上皮を使用する近年の試験もどのような利益も示すことができなかった。対照的に、移植細胞の供給源としてのヒトＥＳ細胞の使用が移植に使用されるドーパミンニューロンを作製するための細胞の無制限の供給源を提供すると考えられる。
Ｖ． 化合物及び培養方法が本発明の中脳ＤＡ（ｍＤＡ）ニューロンへのＦＯＸＡ２＋及びＬＭＸ１Ａ＋陽性ニューロン前駆細胞の制御分化のために発見された。
本発明者らは、ＣＨＩＲ９９０２１曝露のタイミングがＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ中脳底板前駆細胞の誘導を決定することを本発明の開発中に発見した。従って、本発明者らは、ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８処理（すなわち、ＬＳＢ、Ｓ、すなわちＳＨＨ、及びＦＧＦ８（Ｆ８）での細胞の処理）のみ又は様々な時点で開始するＣＨＩＲと組み合わせた、すなわち、第０日〜第１１日、第１日〜第１１日、第３日〜第１１日、第５日〜第１１日、第７日〜第１１日の処理の後の分化第１１日においてＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａの免疫細胞化学分析について試験し、ＣＨＩＲ処理が無い細胞の２つ組の培養物と比較した。その後、ＦＯＸＡ２＋細胞、ＬＭＸ１Ａ＋細胞及び二重標識細胞のパーセンテージの定量を、免疫細胞化学分析において記載されるようにＣＨＩＲ曝露の差次的開始後の分化第１１日に行った。
Ａ． ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）はヘッジホッグの活性化剤及びパルモルファミンと接触したＬＳＢ培養細胞から第１１日までにＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋細胞を誘導するための因子である。次の実施例は、ｍＤＡニューロンのニューロン制御分化を誘導するための各化合物の効力を試験するための例となる方法の使用について説明する。
この実施例は、本発明のＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＤＡニューロンの制御分化をもたらすための小分子の発見と接触タイミングについて説明する。次のものは、本明細書に記載される実験上の発見のうちのいくつかの概要である：ＣＨＩＲ９９０２１が存在しない状態でのＳＨＨアゴニスト（パルモルファミン＋ＳＨＨ）及びＦＧＦ８（Ｓ／Ｆ８）による二重ＳＭＡＤ阻害細胞の処理によって、第１１日までのＦＯＸＡ２の有意に低い発現とＬＭＸ１Ａ発現の完全な喪失が示された（図１ａ、ｂ）。ＬＳＢ処理培養物及びＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理培養物において前方マーカーであるＯＴＸ２が堅固に誘導されたが、ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８条件下では誘導されなかった（図１ａ、ｃ）。
万能性細胞を含有する細胞集団が出発集団用に本発明者らによって選択され、第０日に播種された。細胞は分化前に集密近く（６０〜１００％の間の集密）まで培養される。これらの細胞を第０日に二重ＳＭＡＤ阻害剤と接触させた（すなわち、ＬＤＮ‐１９３１８９＋ＳＢ４３１５４２＝「ＬＳＢ」への曝露）。本発明者らは、第１１日まで新しいＬＳＢを含有する栄養補給物を定期的に与えて細胞集団に注目し、そして、いくつかの残存細胞はＬＭＸ１Ａ＋であるが、ＦＯＸＡ２を発現しないことを発見した（図１ａ、ｂ）。本発明者らは、出発細胞を２つ組で播種し、次にそれらの細胞を異なる曝露計画で接触させる、すなわち、細胞を第０日、又は第１日、又は第２日等に特定の時間、すなわち、２４時間、４８時間等の間接触させる、次のＳＨＨアゴニスト（パルモルファミン＋ＳＨＨ）及びＦＧＦ８（Ｓ／Ｆ８）のうちのいずれかを含有する混合物との接触の後に、細胞種（すなわち、遺伝子発現パターン／タンパク質発現パターン）について試験した。試験された３つの主要な例となる培養条件は次のものである。１）細胞を第０日にＬＤＮ／ＳＢ（ＬＳＢ）と接触させ、次に第５日まで新しいＬＳＢと接触させ、第５日から細胞を第１１日までＳＢ抜きで新しいＬＤＮと接触させた。２）細胞を第０日にＬＤＮ／ＳＢ（ＬＳＢ）と接触させ、次に第５日まで新しいＬＳＢと接触させ、第５日から細胞を第１１日までＳＢ抜きで新しいＬＤＮと接触させ、一方、この期間に細胞を第７日まで新しいパルモルファミン、ＳＨＨ及びＦＧＦ８とさらに接触させた。３）細胞を第０日にＬＤＮ／ＳＢ（ＬＳＢ）と接触させ、次に第５日まで新しいＬＳＢと接触させ、第５日から細胞を第１１日までＳＢ抜きで新しいＬＤＮと接触させ、一方、この期間に細胞を第７日まで新しいパルモルファミン、ＳＨＨ及びＦＧＦ８とさらに接触させ、一方、細胞種の最適収量を決定するためにこれらの主要な条件をいくつか変えて培養第３日に開始して第１１日まで新しいＣＨＩＲとさらに接触させた。
Ｂ． 他の技術を用いて作製されたＤＡ前駆細胞と比べた底板の中脳領域に由来するＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋細胞のインビトロ特徴解析。包括的時間的遺伝子発現プロファイリングを用いて３つの培養条件の系統的な比較（図１ｄ）が実施された。差次的発現した遺伝子の階層的クラスター分析が分化第１１日までの３つの処理条件を分離した（図８ａ）。ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、及びＰＴＣＨ１を含むいくつかの他のＳＨＨ下流標的がＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理セットとＬＳＢ処理セットの間において最も差次的に調節された転写物の中にあった（図１ｅ）。ＬＭＸ１Ａ、ＮＧＮ２、及びＤＤＣの発現は早くも第１１日までの中脳ＤＡニューロン前駆細胞運命の確立を示した（図１ｅ、ｆ）。対照的に、ＬＳＢ培養物はＨＥＳＳ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、及びＥＭＸ２などの背側前脳前駆細胞マーカーを濃縮した。ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理とＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８処理の直接比較（図１ｆ）によりＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ群における中脳ＤＡ前駆細胞マーカーの選択的濃縮が確認され、ＲＡＸ１、ＳＩＸ３、及びＳＩＸ６の差次的発現に基づいてＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８処理培養物における視床下部前駆細胞同一性が示唆された（下の図２ｄにおけるＰＯＭＣ発現、ＯＴＰ発現も参照のこと）。差次的に発現した転写物の例となるリスト、すなわち表１、２が示されており、そして、第１１日の遺伝子オントロジー分析（図８ｂ）（ＤＡＶＩＤ；ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ）がＣＨＩＲ処理による正準ＷＮＴシグナル伝達の強化を確認した。生データは未だＧＥＯ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：［ＴＢＤ］）において利用可能ではない。中脳ＤＡ前駆細胞マーカー（図１ｇ）と前方腹側非ＤＡニューロン運命のマーカー（図１ｈ）の遺伝子発現の時間的比較分析により３つの誘導条件が：ｉ）ＬＳＢ：背側前脳同一性；ｉｉ）ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８：腹側／視床下部同一性及びｉｉｉ）ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ：中脳ＤＡ前駆細胞同一性に配分された。
ＶＩ． 第２５日までの中脳ＤＡニューロンへのＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋第１１日細胞のさらなる分化と最大で第６５日まで維持された分化。
さらなる分化のためにニューロン成熟を促進する培地（ＢＡＧＣＴ、実施例Ｉを参照のこと）中に前駆細胞ＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋細胞を維持した。比較のために２つの他の技術を用いてＤＡニューロン前駆細胞を作製した。これまでの方法と本発明の方法から生じる分化細胞の集団の間で次の種類の比較を行った：Ａ）分化第５０日におけるＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２及びＮＵＲＲ１と組み合わせたＴＨについての免疫細胞化学分析、Ｂ）ロゼット由来培養物と底板由来（ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ）培養物を比較する総細胞の中のＴＨ＋細胞、ＦＯＸＡ２＋細胞、ＬＭＸ１＋細胞、及びＮＵＲＲ１＋細胞の定量。（Ｃ）底板ＤＡニューロン培養物及びロゼット由来ＤＡニューロン培養物における第５０日でのセロトニン＋（５‐ＨＴ）神経細胞サブタイプとＧＡＢＡ＋神経細胞サブタイプ（非ＤＡニューロン混入細胞）のパーセンテージの定量。そして、（Ｄ）ドーパミンと代謝物を測定するためのＨＰＬＣ分析：底板由来培養物とロゼット由来培養物の間のＤＡレベル、ＤＯＰＡＣレベル及びＨＶＡレベルの比較。
第２５日までに３つの前駆細胞集団がＴｕｊ１＋ニューロン（図２ａ）、及びＤＡの合成における律速性酵素であるＴＨを発現する細胞を産出した。しかしながら、ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理により、ＬＭＸ１Ａ及びＦＯＸＡ２を共発現するＴＨ＋細胞が生じ、そして、核受容体ＮＵＲＲ１（ＮＲ４Ａ２）の強力な誘導が示された（図２ａ、ｂ）。第１３日培養物と第２５日培養物における遺伝子発現の比較によって、他の分裂終了後ＤＡニューロンマーカーの堅固な誘導が確認された（図２ｃ）。ＬＳＢ処理培養物とＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８処理培養物に対する比較において第２５日におけるＤＡニューロン同一性の特徴解析によって、既知の中脳ＤＡニューロン転写物の濃縮が確認され、そして、複数の新規候補マーカーが同定された（図２ｄ、表３〜５、図８ｂ）。例えば、ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ（中脳ＤＡ群）において最も濃縮された転写物は、もともと中脳ＤＡニューロン発生と関係していないが、ヒト黒質において強力に発現している遺伝子であるＴＴＦ３であった（図８ｃ；アレン・ブレイン・アトラス：ｈｔｔｐ：／／ｈｕｍａｎ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇ）。
ＥＢＦ‐１、ＥＢＦ‐３（図８ｃ）並びに肝臓におけるＦＯＸＡ２の公知の転写標的であるＴＴＲについて同様のデータが得られた。本発明の開発中に得られたデータは中脳ＤＡ前駆細胞におけるいくつかのＰＩＴＸ遺伝子の濃縮を示した。中脳ＤＡニューロンの古典的なマーカーであるＰＩＴＸ３も分化第２５日において強固に発現した（図２ｅ）。そして、無関係のｈＥＳＣ株とｈｉＰＳＣ株が容易に中脳底板誘導とＤＡニューロン誘導の両方を再現することができた（図９）。本明細書において示されるデータによって、他の試験されたプロトコルと対照的にＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲプロトコルが中脳ＤＡニューロン運命に合致するマーカープロファイルを発現する細胞を産出することが示された。
底板由来ＤＡニューロンのインビトロ及びインビボの特質を神経ロゼット中間体から得られたＤＡ様ニューロンと比較した（図１０及び１６）。神経ロゼットのパターン形成はｈＰＳＣからＤＡニューロンを得るための現在最も広く用いられている戦略を表す。底板系プロトコルとロゼット系プロトコルの両方が、長期インビトロ生存が可能であるＴＨ＋ニューロンの作製に優れていた（分化第５０日；図３−１ａ）。しかしながら、ＴＨ＋細胞のパーセンテージは底板由来培養物において有意に高かった（図３−１ｂ）。両方のプロトコルのＴＨ＋細胞はＮＵＲＲ１の共発現を示したが、底板由来ＤＡニューロンはＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａを共発現した（図３−１ａ、ｂ及び３−２）。
ＧＡＢＡ及びセロトニン（５‐ＨＴ）陽性ニューロンはほとんど観察されなかった（図３−１ｃ）。ＤＡとその代謝物であるＤＯＰＡＣ及びＨＶＡはどちらのプロトコルで作製された培養物にも存在したが、ＤＡレベルは底板培養物で約８倍高かった（図３−１ｄ、ｅ）。中脳ＤＡニューロンは広範囲にわたる線維伸長とシナプシン、ドーパミン・トランスポーター（ＤＡＴ）、及びＧタンパク質共役内向き整流性カリウムチャネルを含む成熟ニューロンマーカーの堅固な発現を示した（黒質緻密部（ＳＮｐｃ）ＤＡニューロンにおいて発現する、ＧＩＲＫ２とも呼ばれるＫｉｒ３．２）（図３−１ｆ、図１１）。ＳＮｐｃ ＤＡニューロンは、脳においてそれらを他の大半のニューロンと識別する電気生理的表現型をインビボで示す。具体的には、それらのニューロンは低速で（１〜３Ｈｚ）突発的に電位上昇を示す。また、この低速の電位上昇は低速の閾値下振動電位を伴う。インビトロで２〜３週間の後、生後初期マウスから培養されたＳＮｐｃ ＤＡニューロンがこれらの同じ生理的特徴を示す。ｈＥＳＣから分化したＤＡニューロンが一貫して（４／４試験）この特徴的な生理的表現型を示した（図３−１ｇ〜ｉ）。
第６５日におけるｍＤＡニューロンのインビトロでの維持によって、ＴＨ陽性ニューロンがそれまでのようにＦｏｘＡ２を発現しており、ｍＤＡニューロンに典型的な長い線維を伸長することが示された（図３−１ｊ）。ＨＰＬＣによるＤＡ放出の測定によって、６５日齢ＴＨ＋ニューロンはインビトロで機能的であることが示された（図３−１ｋ）。
まとめると、中脳底板前駆細胞の神経原性変換及び最適化底板中脳ＤＡニューロン分化プロトコルの開発が本明細書に記載される。底板由来ＤＡニューロンは初期分化ステージ中のＳＨＨ及び正準ＷＮＴシグナル伝達の小分子ベースの活性化の後にヒトＥＳ細胞から得られた（図３−２）。これらのｈＥＳ細胞はＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ二重陽性中脳底板ステージからＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａの共発現を有するＴｕｊ１＋幼若ニューロンへ、その後堅固なＤＡ放出、及び自律的ペースメーカー活性（図３−２ｃ）を含む黒質緻密部（ＳＮｐｃ；Ａ９型）中脳ＤＡニューロンに特徴的な電気生理学的特質を有する成熟ＤＡニューロンへ（図３−２ａ、ｂ）発達した。驚くことに、これは非常に効率的な処理であり、培養皿中の半分以上の細胞が成熟中脳マーカープロファイルを採用した（図３−２ｂを参照のこと）。
ＶＩＩ． 移植されたニューロンとしての底板由来中脳ドーパミンニューロンのインビボでの特徴解析。
次の実施例は治療的細胞置換に使用するための本発明の例となる方法の使用について説明する。その分野における１つの主要な課題は、神経過形成又は非中脳ニューロンへの不適切な分化のリスクが無い状態で機能的にインビボにおいて生着するｈＰＳＣ由来中脳ＤＡニューロンを作製する、又はテラトーマを発生させる能力である。胎児組織移植試験に基づき、ＮＵＲＲ１の発現によって示される細胞周期離脱の時が移植に適切な期間であり得ると本発明者らは考えた（およそ分化第２５日、図２）。非傷害成体マウスの第２５日細胞を使用する最初の試験によって、移植後６週間でｈＰＳＣ由来ＦＯＸＡ２＋／ＴＨ＋ニューロンの堅固な生存が示された（図１２）。パーキンソン病の宿主における、神経過形成を引き起こすことがない、ＦＯＸＡ２＋／ＴＨ＋細胞の長期生存が試験された。この目的のため、まれな腫瘍原性細胞の曝露に特定の感受性を有する、異種移植片の生存を効率的に支援する株（Ｑｕｉｎｔａｎａ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｕｍｏｕｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５９３〜５９８ （２００８）、参照により本明細書中に援用）であるＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌルマウスにおいて６‐ヒドロキシ‐ドーパミン（６‐ＯＨＤＡ）傷害（Ｔａｂａｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １４：３７９〜３８１ （２００８）、参照により本明細書中に援用）を行った。高い増殖能を有する細胞の混入の可能性を示すために事前精製することなく底板由来ＤＡニューロン培養物とロゼット由来ＤＡニューロン培養物の両方を移植した（１５０×１０3細胞／動物）。移植から４．５か月の後に底板由来ＤＡニューロン移植片がＦＯＸＡ２共発現性ＴＨ＋細胞から構成される輪郭のはっきりした移植中核とヒト特異的マーカーｈＮＣＡＭを示した（図４ａ〜ｃ）。機能分析によってアンフェタミン誘導性回転行動の完全な救出が示された。対照的に、ロゼット由来ニューロン移植片はＴＨ＋ニューロンをほとんど示さず、回転行動の有意な減少をもたらさず（図４ｄ）、そして、大規模な神経過形成を示した（２０ｍｍ3超の移植片体積；図１３）。本明細書において報告される、移植に使用されたロゼット由来神経細胞の広範囲の過形成は本発明者らのグループ（Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ． ｍｉＲ−３７１−３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｅｄｉｃｔｓ Ｎｅｕｒａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：６９５〜７０６ （２０１１）、参照により本明細書中に援用）及び他のグループ（Ｈａｒｇｕｓ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０７：１５９２１〜１５９２６ （２０１０）、参照により本明細書中に援用）のロゼット由来ＤＡ移植片を用いるこれまでの研究に匹敵した。その過形成はより長い生存期間（４．５か月対６週間）、移植前のＦＡＣＳ精製の欠如、及びＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌル宿主の選択に起因する可能性があった。増殖性のＫｉ６７＋細胞の数は底板由来移植片では最小であった（総細胞の１％未満）が、ロゼット由来移植片は増殖性神経前駆細胞からなるポケットを保持した。神経過形成は移植片内の初期前方神経外胚葉性細胞によって引き起こされると考えられている（Ｅｌｋａｂｅｔｚ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２２：１５２〜１６５ （２００８）； Ａｕｂｒｙ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． ＳＡ １０５：１６７０７〜１６７１２ （２００８）、参照により本明細書中に援用）。この仮説は底板由来移植片ではなくロゼット由来移植片での前脳マーカーＦＯＸＧ１の発現によって裏付けられた。底板由来移植片とロゼット由来移植片の両方に小パーセンテージのアストログリア細胞が存在したが、大半のＧＦＡＰ＋細胞は宿主起源を示すヒトマーカーについて陰性であった（図１３）。
本明細書に記載されるＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌルマウスにおける結果はＦＯＸＡ２＋／ＴＨ＋ニューロンの堅固な長期生存、アンフェタミン誘導性回転行動の完全な回復、及び神経過形成のあらゆる兆候の喪失を示した。しかしながら、これらの結果のいくつかはＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌルマウスの特定的な使用に起因し得た。この仮説を検証するため、シクロスポリンＡを使用して薬理的に免疫抑制した成体６‐ＯＨＤＡ傷害ラットに底板由来ＤＡニューロン培養物（２５０×１０3細胞）を移植した。移植から５か月後で移植片の生存は堅固であり（図４ｅ〜ｈ）、ＦＯＸＡ２（図４ｇ）とヒト核抗原（ｈＮＡ）（図４ｅ）を共発現するＴＨ＋細胞は平均で１５，０００個より多く、ＴＨ＋／ｈＮＣＡＭ＋線維が移植中核から周囲の宿主線条体へ発出した（図４ｆ）。ＴＨ＋細胞はＦＯＸＡ２に加えて中脳ＤＡニューロンマーカーＰＩＴＸ３及びＮＵＲＲ１を発現した（図４ｈ〜ｊ）。行動分析によって、改善を示さなかった偽移植動物と対照的に、アンフェタミン誘導性回転非対称の完全な回復が示された（図４ｋ）。移植された動物は、ＤＡ系の薬理的刺激に依存しないアッセイ法である前肢の無動を測定するステッピング試験（図４ｌ）と円筒試験（図４ｍ）にも改善を示した。遅発性（移植から約３〜４か月後）の回復がヒトＤＡニューロンについて予期され、そして、それはＤＡＴ発現（図４ｎ）のレベルなどのインビボ成熟の速度に依存する。Ｋｉｒ３．２チャネル（ＧＩＲＫ２）又はカルビンジンを発現するＴＨ＋細胞の存在は、ＳＮｐｃ（Ａ９）と腹側被蓋領域（Ａ１０）のＤＡニューロンが移植片に存在することを示す（図４ｏ、ｐ）。
マウス（図１３）に見られるように、たいていは宿主由来のＧＦＡＰ＋グリア細胞がそうであったように（総細胞の７％；図１４）、ラット細胞の中にセロトニン系細胞及びＧＡＢＡ系細胞はまれであった（総細胞の１％未満）。セロトニン＋ニューロンは移植片中にほとんど検出されなかったが、宿主由来セロトニン系線維でありそうなｈＮＣＡＭ陰性細胞が観察された（図１４）。
マウス、ラット、及びサルにおける底板由来ＤＡニューロンの移植はげっ歯類及び霊長類の種における神経機能の驚くべき回復を示した。短期（６週間）生存アッセイは驚くほど長期の生存のために６ＯＨＤＡ傷害を受け免疫無防備状態の宿主マウスのマウス線条体に対して移植後から最大で５か月間まで延長された。実際、本明細書に記載される新規底板系ＤＡニューロン分化プロトコルと比較されるＤＡニューロン作製の伝統的なロゼット系の方法（Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１， １２５４３〜８ （２００４））の直接比較は、底板由来ＤＡニューロンは長期ＤＡニューロン移植可能であるが、一方、ロゼット系ニューロンは移植可能ではないことを示した（図４ａ〜ｃ）。
特に、底板（ｆｐ）由来（青色の線）ニューロン及びロゼット由来（赤色の線）ＤＡニューロン（図４ｄ）を移植された６‐ＯＨ傷害マウスにおけるアンフェタミン誘導性回転の行動回復の堅固な誘導により、ｆｐ由来ニューロンはより高い回復率を有することが示された。底板由来ＤＡニューロンを移植されたマウスはアンフェタミンスコアのほとんど完全な回復を示した。ロゼット由来ＤＡニューロンを移植された動物はより低い行動回復を示し、幾匹かは時間経過と共に最初の高い回転数に回復した。
健全な移植片の機能も６ＯＨＤＡ傷害ラットモデルにおいて見出された。そのラットはＰＤマウスと異なりより複雑な行動アッセイを許容し、そして、薬理学的免疫抑制後の異種移植片設定（ヒト移植プロトコルをより厳密に模倣する治療法）におけるＤＡニューロン生存を扱う。ＤＡ線維伸長と中脳特異的転写因子発現の維持の証拠である良好な移植片生存が真正中脳ＤＡニューロンマーカーを発現する底板由来ニューロンの長期生存を確証した（図４ｅ〜ｊ）。一連の機能アッセイが薬物誘導性回転（アンフェタミン誘導性回転）と突発性行動試験（円筒試験及びステッピング試験）の両方の有意な改善を示した。
本明細書において示される結果によって、２つの独立したマウスモデルにおいて良好な移植片生存と行動分析結果が示された。しかしながら、マウス又はラットの脳において必要とされるＤＡニューロンの数は霊長類動物及びヒトにおける移植に必要とされるより大きな数の細胞の小さな部分を表す。このプロトコルの拡大可能性を試験するため、２匹の成体ＭＰＴＰ傷害アカゲザルにおいてパイロット移植試験を実施した。
加えて、本明細書に記載される方法と細胞が霊長類動物においても神経機能を回復させるかということは、ヒトにおけるこれらの方法と細胞の使用を可能にすることを支援するときに用いられ得る情報であるが、最初は知られていなかった。従って、霊長類の脳における短期（４〜６週間）インビボ生存と中脳ＤＡニューロン表現型の維持を試験するために少なくとも２匹のサルで最初の一組の試験を実施した。本明細書に記載されるそれらの試験はＴＨ／ＦＯＸＡ２陽性中脳ＤＡニューロンの堅固な生存と宿主線条体の神経再支配の証拠を示した（図４ｑ〜ｔ）。将来のヒト移植試験に必要とされる範囲の数に推定されるものに類似したより大きな数の細胞の移植によって、堅固な中脳ＤＡニューロン生存が引き起こされた。これらの短期のデータに加えて、アカゲザルにおける一組の長期試験を行って細胞の３か月の生存と（併用三重療法として用いられる）毎日のセルセプト、プログラフ、及びプレドニゾンの最適化免疫抑制投与計画を評価した。驚くことに、霊長類の脳におけるヒトＥＳ由来中脳ＤＡニューロンの堅固な３か月の生存が、最初の移植試験において観察された強力な宿主ミクログリア応答と比べて大いに低下した移植片に対する炎症性宿主応答と共に発見された（図１５を参照のこと）。
具体的には、サルの試験に関連する方法には、底板系プロトコルを用いて分化第２５日までに５０×１０6個もの多くの移植可能ＤＡニューロン前駆細胞を得たことが含まれた。古典的な用量は頸動脈に注射された３ｍｇのＭＰＴＰ塩酸（０．５〜５ｍｇの範囲）であった。これにＭＰＴＰの０．２ｍｇ／ｋｇ静脈内投与によるＭＰＴＰの全身性注射が続いた。細胞を脳の各側の３つの位置（後方尾状核及び交連前被殻）に注入し（総計６路、１．２５×１０6細胞／路）、シクロスポリンＡで動物を免疫抑制した。その脳の一方の側にＨ９のＧＦＰ発現性サブクローンに由来するＤＡ前駆細胞を注入し、他方の側に非標識Ｈ９細胞に由来する細胞を移植した。継続的なＦＯＸ２Ａ発現とＴＨ産生を有する、アカゲザルにおけるニューロンの移植を示す結果が図４ｑ〜ｔに示されている。移植から１か月後に中脳ＤＡニューロンの堅固な生存がＧＦＰ（図１５）及びヒト特異的細胞質性マーカー（ＳＣ‐１２１）（図４ｑ）の発現に基づいて観察された。各移植中核は、宿主の中に最大で３ｍｍまで伸長するＴＨ＋線維のハロによって囲まれた（図４ｒ）。それらの移植中核はＳＣ‐１２１（図４ｓ）及びＦＯＸＡ２（図４ｔ）を共発現するＴＨ＋ニューロンから構成された。移植片内のＳＣ‐１２１及びＧＦＰ陰性領域はＩｂａ１＋宿主ミクログリアを含有し（図１５）、不完全な免疫抑制を示した。
まとめると、霊長類動物、すなわち、重篤な９５％超の内在性中脳ＤＡニューロンの喪失を含む成体ＭＰＴＰ（３ｍｇのＭＰＴＰ塩酸（１‐メチル‐４‐フェニル‐１，２，３，６‐テトラヒドロピリジン；０．５〜５ｍｇＭＰＴＰ塩酸までの濃度範囲）傷害アカゲザルにおける新規ＤＡ神経細胞集団の移植。ＭＰＴＰ曝露はヒトにおけるパーキンソン病に類似した観察可能な変化と症状を引き起こした。
まとめると、中脳ＤＡニューロン発生を忠実に再現する新規底板ベースのｈＰＳＣ分化プロトコルが発見された。中脳ＤＡニューロンの基本的特徴を有する細胞の利用が基本的発生研究、ハイスループット創薬、及びＰＤ‐ｉＰＳＣベースの疾患モデリングなどの広範囲の生物医学的応用を可能にする。重要なことに、この試験は、ＰＤに対する細胞ベースの療法の検討に向かう路での大きな歩みである神経移植用のＦＯＸＡ２＋／ＴＨ＋ニューロンの規模拡大可能な供給源を得る方法を最終的に確立した。
さらに、ｈＥＳＣからの真正中脳ＤＡニューロンの誘導は移植の時点で優れたインビボ成績（図４を参照のこと）及びＤＡニューロン収率を示した（ヒト胎児腹側中脳組織の精査後に得られるパーセンテージ（通常約１０％）（Ｓａｕｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｔｏｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２：１２３〜１３５ （１９９１）を超える、分化第２５日〜第３０日の集団中の約４０％の成熟したニューロン）。
次は移植後の２つの主要なパラメーターである生存期間と行動評価の程度を評価するときに使用される材料と方法の簡単な説明である。例えば、細胞生存又は表現型の構成を確認することを目的とする短期試験のために行動評価が企図され、そして、動物が生存について移植から約４〜８週間後に試験される。長期試験には移植後の行動評価及び移植から少なくとも５か月間の動物生存が含まれる。ＰＳＡ‐ＮＣＡＭ修飾などの増強戦略を分析するとき、行動評価は熟練した前肢使用についての階段試験などのより複雑なパラメーターを含むことが考えられる。
インビボ成績を評価するための例となるプロトコルは少なくとも４種の主要な構成要素を有し、そして、次のものを含む：ｉ−傷害誘導、ｉｉ−中核行動分析、ｉｉｉ 移植、及びｉｖ−組織分析。これらの方法はラットに用いられたが、いくつかの実施形態では、これらの方法を他の種に用いることができる。
ｉ−傷害誘導．内側前脳束（ＭＦＢ）内の片側のみの６‐ヒドロキシドーパミン（６‐ＯＨＤＡ）の注射がラットにおいてパーキンソン病様症状を誘導するための１つの標準的アプローチである。６‐ＯＨＤＡは、ＭＦＢ内の黒質線条体経路を経由して黒質へ逆行して輸送され、それによってミトコンドリア呼吸酵素の損傷を介して神経細胞死を引き起こす神経毒素である。標的とされるニューロンには黒質緻密部（ＳＮＣ）内のＡ９ドーパミン系ニューロン並びに腹側被蓋領域内のＡ１０ニューロンが含まれる。この傷害モデルは尾状核被殻複合体（ＣＰＵ）内のドーパミンの大規模な片側性除去を引き起こすので、進行したＰＤの神経化学的結果及び行動結果の試験のための優れた前臨床モデルとして広く試験され、受容されている。行動結果もよく説明されており、突発性回転及び薬物誘導性回転並びに四肢使用障害を含む（下記を参照のこと）。パーキンソン症の両側性モデルはヒトの疾患をよりよく模倣し得るが、それらはラットにおいて無飲症と嚥下不能を引き起こす。
その方法は内側前脳束に沿った２か所への定位的注射により麻酔した動物（ケタミン／キシラジン）において実施された。完全傷害誘導の効率は実験操作者の経験に非常に左右され、本発明の開発中では６０〜８０％の範囲であった。動物を回復させ、その後、外科手術から２週間後に開始する一連の行動試験の対象とした。
ｉｉ−中核行動分析．行動分析は外科手術から２週間後に開始され、移植後から動物が殺処理されるまで継続する。行動分析の目的は１）傷害が安定的であり、完全であること、及び動物が部分的に被傷害動物にみられる現象である症状の突発的な回復を示していないことを確証すること、２）確立された行動パラメーターに対するドーパミンニューロンの移植の影響を実証することである。
ａ−回転行動．ラットを突発性回転及びＤ‐アンフェタミン誘導性（同側性）回転（１０ｍｇ／ｋｇ）について観察する。有意な傷害の指標として１分当たり６回転超の閾値が必要とされる。アポモルフィン誘導性回転を分析することもできるが、陽性結果は尾状核被殻におけるドーパミン神経支配の８０〜９０％超の除去を必要とすると考えられ、そして、ＣＰＵ傷害と比べるとＭＦＢ傷害の場合はあまり一貫していない。三組のデータを２週間の間隔で得て、平均した。６未満の回転スコアを有するラットは試験に含まれない。
ｂ−ステッピング試験．これは前肢の無動についての試験である。実験者が片手でラットを持ち上げ、後肢を動かないようにし（胴をわずかに上げる）、そして、他方の手でモニターすることがない前肢を固定する。こうして他方の前足は体重を支えなくてはならない。ラットをフォアハンド位置とバックハンド位置の両方で横にゆっくりと移動させる。両方の方向と両足について順応ステップ数を計数する。
ｃ−円筒試験．これは前肢使用の非対称性についての試験である。ラットを透明な円筒に配置する。５分の時間の間にラットの立ち上がり行動を記録する。その行動を立ち上がりと着地の間に分析する。これらの運動中の足の同時使用及び非対称性使用のパーセンテージを決定する。これをコンピューター化ビデオモニタリングシステムにより実施することができる。これらの試験での陰性結果はドーパミンの枯渇と相関することがわかり、結果は本明細書に記載され回復性移植のあとに改善されることが示された。
ｉｉｉ−移植．動物がパーキンソン症誘導性傷害から３週間後の時点で線条体へのドーパミンニューロンの定位的注入を受け、そして、行動試験が充分な傷害を確証するか。注射のための座標が広く確立される。移植後に同じセットの行動試験を様々な期間の間（平均で５か月が安定的な行動回復を達成するために必要とされる）２か月毎に実施する。
ｉｖ−組織分析．動物を安楽死させ、そして、潅流する。脳の切片を作製し、そして、免疫組織化学と立体解析学的分析のために処理した。抗体にはドーパミンニューロンの同一性と機能に対するＴＨ、ＦｏｘＡ２、Ｐｉｔｘ３、Ｎｕｒｒ１、Ｌｍｘ１ａ、Ｇｉｒｋ２、ＤＡＴ：セロトニン系ニューロンを特定するための５‐ＨＴ；ヒト同一性に対するヒトＮＣＡＭ又はヒト核抗原；神経前駆細胞に対するネスチン、Ｓｏｘ２；増殖に対するＫｉ‐６７；万能性マーカーに対するＯｃｔ４、ナノグ；α‐フェトプロテイン；ミオシン；テラトーマ形成を除外するための複数系譜マーカーに対するサイトケラチンが含まれる。定量的パラメーターには移植片体積（カバリエリ推定量）、総細胞数とドーパミン系細胞数（ＴＨ／ＦｏｘＡ２二重標識ニューロンを使用）及び増殖指数（Ｋｉ６７＋の％）が含まれる。記載される抗体は市販されており、本発明の開発中に使用される。
いくつかの実施形態では、ヒトの状況をより良くモデル化するためにスプレイグ・ダウリー（ＳＤ）ラットの使用が企図される。ＳＤラットは移植の前日に開始して殺処理まで毎日シクロスポリン（１５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を受ける。水性形状のシクロスポリン（ネオーラル、ヒトに使用される経口溶液）の長期の注射に関する罹患は無視できた。
いくつかの実施形態では、ｍＤＡニューロン培養物の規模を拡大するための例となる方法が提供される。表９を参照のこと。特定の実施形態では、臨床使用のためのＧＭＰレベルの培養物の作製においてそのような方法の使用が企図される。
評価パラメーター．インビボ試験の使用が、移植片効力がある短期方法と長期方法において企図された。本発明の開発中に得られた結果は両方の事例で同一な組織特徴解析を示し、移植された前駆細胞の分化に起因する長期生存細胞中のＴＨ＋細胞の割合の上昇が予期された。
平均して２５０，０００個の細胞当たり１５，０００個のＴＨ＋／ＦｏｘＡ２＋ニューロンが移植されると動物は移植後５か月生存した。短時間の生存個体では著しく少ない二重標識細胞が生存し、数えられた。従って、表９に示されるインビボ収量は控えめな見積もりと考えられる。移植片組成物の結果について合格／不合格状態を評価するために用いられた例となるパラメーターが表１０に示されている。
長期移植片では、行動評価はｈＥＳ株産物の性能の必須の構成要素である。機能の喪失と回復を定義する指標が、健全な移植片が行動を正常化し、時にはＤＡの不均衡に起因する対側性運動を引き起こすはずであるアンフェタミン回転について最もよく記載された。表１１に記載される限度は本発明の開発中に決定される例となる指標である。
いくつかの実施形態では、本発明の分化方法において使用するための細胞供給源にはＷＡ０９細胞株、ＡＣＴ（Ｍ０９）細胞株、バイオ‐タイム細胞株及びロスリン（Ｒｏｓｌｉｎ）細胞株が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の分化方法において使用するための細胞供給源にはＧＭＰグレードの株が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の分化方法において使用するための細胞供給源には短期移植生存分析において使用するための成熟ＤＡニューロンの産生が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の分化方法において使用するための細胞供給源には行動評価を含む移植実験において使用するための成熟ＤＡニューロンの産生が含まれるが、これらに限定されない。対照は研究グレードのＷＡ０９と偽生理食塩水処置群からなる。統計分析はダネット・ポストホク・テスト付きのＡＮＯＶＡを用いる。
Ａ． 神経再支配の程度を評価するための複雑な行動アッセイ．標準的な行動試験（本明細書に記載される）が移植片内の生存しているドーパミンニューロンの数との直接的な相関を示した。本発明の成熟ＤＡ神経細胞で処置されたラットでは、行動試験は最大の回復を示し、アンフェタミン誘導性回転を減少させるために必要とされる約３０％のＤＡニューロンの回復が推定される。従って、一度宿主におけるＤＡニューロンの生存の閾値が達成されると（ラットモデルにおいて推定８００〜１２００ＤＡニューロン）、増強戦略を反映する行動の違いを区別することが困難であり得る。大きな移植片と対照的に複数の小移植片を線条体全体に配置することになる微量移植アプローチが説明された。移植されるＤＡ細胞の総数を調整しているが、２群を比較すると行動的治療成績に差異が観察された。複数の小移植片を有するラットは単一の大きい移植片及び同じ数のＤＡニューロン及び同じ量のドーパミン放出を有する動物と比べると薬物誘導性回転及びステッピング試験においてより早く、より広範な行動回復を示した。驚くことに、前肢の上手な使用に明確な差異が存在し、広範囲に分布する小移植片を有する動物が改善を示し、一方、標準的移植片を担持するラットは示さなかった。上手な前肢の使用は、ＤＡ放出の空間的及び時間的制御を必要とし、従って移植されたニューロンと宿主線条体の間の適切な連絡を必要とする作業と考えられる。従って、いくつかの実施形態では、移植方法における本発明の成熟ＤＡニューロンの使用により前肢使用の回復がもたらされた。従って、いくつかの実施形態では、本発明の成熟ＤＡニューロンは線条体の１か所に投与される。他の実施形態では、本発明の成熟ＤＡニューロンは線条体内の少なくとも２か所以上に投与される。
Ｂ． 上手な前肢使用（又は階段）試験．前肢試験は前肢を伸ばし、ものをつかむことを分析する。前肢試験を傷害前後及び移植後に実施した。試験前に４８時間動物を絶食させ、そして、傷害前の５日間に毎日試験し、次に傷害後に３週間の間隔で２回試験した。移植後にその試験を第３月及び第５月にさらに２回繰り返す。二重の階段を装備したプレキシガラスチャンバーに動物を配置した。移植前試験について５つの段の両側にペレット状の食物を配置し、移植後は片側（回転とは反対側の影響を受けた肢の側）に配置する。動物は設定された時間枠（例えば、１０分）にわたって試験される。食された（到達に成功した）ペレットと取られたペレットの数と比率が計算され、個々の動物の傷害前の実績と比較された。試験の反復回数とタイミングに関するこの試験のいくつかの変法が存在した。
ＶＩＩＩ． 本明細書に記載される方法を用いることによって分化した細胞はＤＡ細胞と類似した電気生理的応答をその場で（Ｉｎ Ｓｉｔｕ）示した。
次の実施例は、本明細書に記載される方法による分化により生じる中脳ＤＡニューロンの機能的能力を決定するための本発明の例となる方法の使用について説明する。黒質緻密部（ＳＮｐｃ）ＤＡニューロンは脳における他の大半のニューロンからそれらを区別する電気生理学的表現型をインビボで示す。具体的には、それらのニューロンは低速で（１〜３Ｈｚ）突発的に電位上昇を示す。また、この低速の電位上昇は低速の閾値下振動電位を伴う。インビトロで２〜３週間の後、生後初期マウスから培養されたＳＮｐｃ ＤＡニューロンがこれらの同じ生理的特徴を示す。本発明のｍＤＡニューロンが同等の電気生理学的表現型を示したか判定するため、本発明のｍＤＡニューロンの電気的応答シグネチャについてそれらを試験した。培養第８０日〜第１００日の本発明の中脳ＤＡニューロンを単一細胞レコーディングにより試験した。ｈＥＳＣから分化したこれらのｍＤＡニューロンが、特定の自律的内部標準添加行動及び振動性膜電位変化を示すことによって一貫して（４／４試験）この特徴的な生理的表現型を示した（図３ｇ〜ｉ）。この挙動は自律的ペースメーカー活性として知られ、そして、中脳ＤＡニューロン及び特にパーキンソン病に最も関係があるサブタイプの中脳ドーパミンニューロン（黒質型中脳ＤＡニューロン）の特異的な特性である。
急性スライス調製物、すなわち、移植領域の生検試料からの調製物において電気生理学的測定法を用いることが企図される。１つの実施形態では、ＰＤにおいて最も冒されるＡ９型ドーパミンニューロンに特異的な自律性ペースメーキング活性の試験に基づいてＡ９型移植片由来ＤＡニューロンとＡ１０型移植片由来ＤＡニューロンがインビボで見分けられる。言い換えると、Ａ１０型ニューロンはペースメーキング活性を有しない。
条件が急性スライス調製物中のヒト万能性幹細胞由来ＤＡニューロンのインビボレコーディングのために確立された。図２６を参照のこと。具体的には、移植された万能性幹細胞由来ヒトＤＡニューロンをマウス黒質緻密部（ＳＮｐｃ）に見られる電気生理的特徴に典型的な特徴について測定し、それらの特徴を有することを発見した。図２６Ａの上の図は移植片領域におけるペースメーカー・ニューロンの再構成を示す。下の図は、９か月前にｈＥＳ由来ニューロンを注入したラットから作製した脳の薄片の例となる顕微鏡写真を示す。移植片の輪郭が示されている。より高倍率の画像が底部にある挿入図に示されている。その薄片をチロシンヒドロキシラーゼについて処理した。その処理が白色として際立つ（図２６Ｂ）。さらに、上の図は細胞移植片中の推定されるＤＡニューロンからの例となるセルアタッチ・パッチレコーディングを示す。下の図は同じ細胞からの例となるホールセル・レコーディングを示す。レコーディングは、シナプス入力を排除するためにグルタミン酸受容体アンタゴニストとＧＡＢＡ受容体アンタゴニスト（５０μＭ ＡＰ５、１０μＭ ＣＮＱＸ及び１０μＭガバジン）の存在下で行われた。これらのレコーディングは、ＰＳ由来ニューロンが通常の体細胞内電圧軌道を有する自律的なペースメーカーであることを示した。移植片試料で記録された別のニューロンが同様の特性を有した（図２６Ｃ）。比較のため、成体マウスのＳＮｐｃにおけるドーパミン系ニューロンからのセルアタッチ・レコーディングとホールセル・レコーディングが示されている。略語（ＣＴｘ＝皮質、ＳＴｒ＝線条体、ＳＮｐｃ＝黒質緻密部、ＤＡ＝ドーパミン系）。このデータは、移植から数か月後の移植されたラット線条体のインビボ機能試験を示す。従って、いくつかの実施形態では、移植された組織に対するインビボ機能試験は黒質緻密部（ＳＮｐｃ）の回復を示す。
ＩＸ． ＤＡニューロンへのＰＩＮＫ１変異体遺伝的ＰＤ‐ｉＰＳ細胞（ＰＩＮＫ１変異）の制御分化が成熟ＤＡニューロンにおけるパーキンソン病様異常を明らかにした。
この実施例は、大集団の中脳ＤＡニューロンが、胚の破壊を引き起こさない方法で得られたＰＤ患者の細胞株、すなわちＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ細胞が本発明のＦＯＸＡ２／ＬＩＭ１ＸＡ／ＴＨ＋ＤＡニューロンを得るための細胞集団として使用されたときにＰＤ患者のニューロンの特徴を有して発生したという発見について説明した。
１つの実施形態では、１）神経学的症状を有しないヒトに由来する真正ＤＡニューロンと比べた分化又は機能異常を観察し、次に２）観察された異常を回復させるための治療処置の開発にその異常を用い、そして、３）パーキンソン病の症状を軽減、すなわち回復させるためにその治療処置で患者を治療することについてのインビトロ試験における処置細胞の使用の潜在的利点のため、本発明者らは、真正ＤＡニューロンをインビトロで作製する方法において使用するためにパーキンソン病（ＰＤ）の症状を有する患者から出発細胞集団を単離することを企図する。
１つの実施形態では、免疫学的拒絶、すなわち、移植拒絶の減少という潜剤的利点のため、本発明者らは、移植処理において使用するための真正ＤＡニューロンを得るためにパーキンソン病（ＰＤ）の症状を有する同じ患者から出発細胞集団を単離することを企図する。他の実施形態では、その主要組織適合抗原（ＭＨＣ）が適合するヒト（すなわち双子）又は移植に許容可能なＭＨＣ組織適合を有するヒト（例えば、患者の親類）又は重複するＭＨＣ分子を発現する無関係のヒトから単離された初期細胞供給源を使用することによって移植拒絶の減少が考えられた。
Ａ． 制御分化により遺伝的ＰＤ‐ｉＰＳ細胞ＰＩＮＫ１細胞は中脳様ＤＡニューロンに発達する能力を含有することが示された。図２０〜２５を参照のこと。本明細書に記載される新規底板ベース中脳ＤＡニューロンプロトコル（方法）を用いてＰＩＮＫ１ Ｑ４５６Ｘ変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株を分化させ、新規底板ベース中脳ＤＡニューロンプロトコルで分化したＨ９株から得られた分化プロファイルと同等のプロファイルを発現する中脳ＤＡニューロンを産出した（図２０）。この実施例は、大集団の中脳ＤＡニューロンが、胚の破壊を引き起こさない方法で得られたＰＤ患者の細胞株、すなわちＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ細胞が本発明のＦＯＸＡ２／ＬＩＭ１ＸＡ／ＴＨ＋ＤＡニューロンを得るための細胞集団として使用されたときにＰＤ患者のニューロンの特徴を有して発生したという発見について説明した。
ＰＩＮＫ１ Ｑ４５６Ｘ変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株は本発明の新規底板ベース中脳ＤＡニューロンプロトコル（方法）を用いて分化させられ、ｉＰＳＣ Ｈ９株から得られる中脳分化プロファイルと同等のプロファイルを生じた。（Ａ〜Ｃ）ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株の分化第１１日（中脳前駆細胞期）におけるＦＯＸＡ２（赤）、ＬＭＸ１Ａ（緑）及びＤＡＰＩ（青）（Ａ）についての、分化第２５日（初期分裂終了後ＤＡニューロン期）におけるＦＯＸＡ２（赤）とＴＨ（緑）（Ｂ）についての、及び、ＮＵＲＲ１（赤）とＴＨ（緑）（Ｃ）についての免疫細胞化学分析。（Ｄ〜Ｆ）分化第１１におけるＦＯＸＡ２（赤）、ＬＭＸ１Ａ（緑）及びＤＡＰＩ（青）（Ｄ）についての、分化第２５日におけるＦＯＸＡ２（赤）とＴＨ（緑）（Ｅ）についての、及び、ＮＵＲＲ１（赤）とＴＨ（緑）（Ｆ）についての、Ｈ９由来細胞を使用して実施された同じセットの免疫細胞化学分析。
Ｂ． 遺伝的ＰＤ‐ｉＰＳＣはタンパク質凝集というＰＤ様表現型を発現した。図２１〜２４．本発明者らは、新規底板ベース中脳ＤＡニューロン誘導プロトコルを用いる分化の第５５日にＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣがＴＨ＋ＤＡニューロンの細胞質においてα‐シヌクレイン（ＰＤ患者のレビー小体の主要成分）発現の証拠を示すことを発見した（図２１ａ〜ｂ）。（Ａ、Ｂ）ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株の分化第５５日におけるα‐シヌクレイン（ＬＢ５０９、赤）、ＴＨ（緑）についての免疫細胞化学分析と統合画像（Ａ）及びα‐シヌクレイン（赤）とユビキチン（緑）についての免疫細胞化学分析（Ｂ）。これらのα‐シヌクレイン陽性細胞はユビキチン（古典的なレビー小体マーカー）の高発現も示した。対照的に、対照ｉＰＳ株に由来するＤＡニューロンは（細胞質性と対照的に）正常なシナプス性α‐シヌクレイン発現と非常に低レベルのユビキチンの発現を示した（図２１ｃ〜ｄ）。（Ｃ、Ｄ）対照ｉＰＳＣ株の分化第５５日におけるα‐シヌクレイン（赤）とＴＨ（緑）（Ｃ）、及びα‐シヌクレイン（赤）とユビキチン（緑）（Ｄ）についての免疫細胞化学分析。
Ｃ． 凝集型のα‐シヌクレインの発現。ＰＤ患者の脳では、二量体化した不溶性形態のα‐シヌクレインがレビー小体において凝集を引き起こす。二量体型のα‐シヌクレインはα‐シヌクレイン上のセリン１２９のリン酸化を示す。分化の同じ日にＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞はセリン１２９リン酸化α‐シヌクレインの強い発現を示し、対照ｉＰＳＣ由来細胞の非常に低レベルの発現と対照的であった（図２２）。
ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞はセリン１２９リン酸化α‐シヌクレインの強い発現を示し、対照ｉＰＳＣ由来細胞の非常に低レベルの発現と対照的であった。（Ａ、Ｂ）分化第５５日におけるＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞（Ａ）及び匹敵する対照ｉＰＳＣ由来細胞（Ｂ）におけるセリン１２９リン酸化α‐シヌクレイン（緑）及びＤＡＰＩ（青）の免疫細胞化学分析。
Ｄ． α‐シヌクレイン発現パターンの差異が分化プロトコル中に観察される。本発明者らは、底板由来「真正」中脳ＤＡニューロンがＰＤ特異的脆弱性及び対応する特異的インビトロ表現型を示すと考えた。古典的なＭＳ５間質性フィーダー細胞ベース分化プロトコル（Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ２００４、参照により本明細書中に援用）を用いて得られるＤＡニューロンは多数のＴＨ＋ニューロンを産出した。しかしながら、本発明の開発中に得られたデータに基づき、本発明者らは、ＭＳ５系ＴＨ＋細胞が真正の底板由来中脳ＤＡニューロンではないことを示した。ＭＳ５プロトコルにより分化する培養物には多数のα‐シヌクレイン陽性細胞が存在した。しかしながら、それらの細胞はＴＨを共発現しなかった。また、ＭＳ５分化戦略を用いるとき、ＰＤ‐ｉＰＳＣと対照ｉＰＳＣの間では発現パターンに差異は存在しなかった（図２３ａ〜ｂ）。これらのデータは、α‐シヌクレインが他の非ＤＡ細胞種においても発現すること、及びそのような非ＤＡ α‐シヌクレインは、特に標準的なＭＳ５分化プロトコルを用いたときに、疾患由来細胞と対照ｉＰＳＣ由来細胞の間で変化しないことを示している。これらは刊行物（例えば、Ｐｅｒｒｉｅｒ ＰＮＡＳ ２００４）において報告されているＤＡ様ロゼット由来ニューロンである。それらのＭＳ５系ＴＨ＋（＝ＤＡ様）細胞は図３、１０、１３及び１６における比較のために使用される。これらのデータは、α‐シヌクレインが他の非ＤＡ細胞種においても発現すること、及びそのような非ＤＡ α‐シヌクレインは、特に標準的なＭＳ５分化プロトコルを用いたときに、疾患由来細胞と対照ｉＰＳＣ由来細胞の間で変化しないことを示している。そして、本明細書に記載される新しい底板系分化プロトコルによりα‐シヌクレインを共発現する多数のＴＨ＋細胞が生じる。それらのＴＨ＋細胞は細胞質性発現パターンでα‐シヌクレインを発現する。（図２４Ａ、Ｂ）ＭＳ５ベース分化の第６０日におけるＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株（Ａ）、及び対照ｉＰＳＣ（Ｂ）のα‐シヌクレイン（ＬＢ５０９、赤）、ＴＨ（緑）についての免疫細胞化学分析。（Ｃ）底板ベース分化の第５５日におけるＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株のα‐シヌクレイン（赤）、ＴＨ（緑）についての免疫細胞化学分析。
Ｅ． 遺伝的ＰＤ‐ｉＰＳ細胞に由来するＤＡニューロンは有害性刺激に対してより脆弱である（図２４〜２５）。底板系プロトコルから得られたＰＤ‐ｉＰＳＣ由来ＴＨ＋ＤＡニューロンは対照ｉＰＳＣ由来細胞よりも毒素負荷に対して脆弱であった（バリノマイシン：ミトコンドリアイオノフォア、５ｕＭ（１〜１０ｕＭまでの濃度範囲）、４８時間）。対照的に、古典的なＭＳ５系プロトコルにより得られたＴＨ＋ニューロンはＰＤ由来細胞と対照由来細胞の間で差次的脆弱性を示さなかった（図２４）。バリノマイシン処理から４８時間後のアラマーブルーを使用する全細胞生存性アッセイによっても、ＰＤ‐ｉＰＳＣ及び対照ｉＰＳＣを比較すると毒素負荷（５及び１０ｕＭ）について特定の範囲における差次的細胞生存が示された（図２５）。ＭＳ５系プロトコルより得られたＰＤ‐ｉＰＳＣ由来培養物と対照ｉＰＳＣ由来培養物の両方の正常状態（Ｄ、ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞が示される）、ＰＤ‐ｉＰＳＣにおける毒素負荷後のＴＨ＋ニューロン（Ｅ）、及びＭＳ５プロトコルより得られた対照ｉＰＳＣ由来培養物（Ｆ）。（Ｇ〜Ｈ）分化第６０日における底板系プロトコルによるＴｕｊ１（赤）及びＴＨ（緑）についての免疫細胞化学の低出力画像：正常状態（Ｇ）と毒素負荷状態（Ｈ）のＰＤ‐ｉＰＳＣ及び正常状態（Ｉ）と毒素負荷状態（Ｊ）の対照ｉＰＳＣ。（Ｋ〜Ｎ）分化第６０日におけるＭＳ５系プロトコルによるＴｕｊ１（赤）とＴＨ（緑）についての免疫細胞化学の低出力画像：正常状態（Ｋ）と毒素負荷状態（Ｌ）のＰＤ‐ｉＰＳＣ及び正常状態（Ｍ）と毒素負荷状態（Ｎ）の対照ｉＰＳＣ。
Ｆ． 毒素負荷についての細胞生存性用量応答アッセイの例となる定量。バリノマイシン処理から４８時間後のアラマーブルーを使用する細胞生存性アッセイによって、ＰＤ‐ｉＰＳＣと対照ｉＰＳＣを比較すると、毒素負荷（５及び１０ｕＭ）について特定の用量範囲における差次的細胞生存が示された（底板ベース分化の第６０日）。注記：このアッセイは全ての細胞死について試験するが、最も劇的な効果はＤＡニューロンにおいて特異的に観察された（図１４を参照のこと）。従って、アラマーブルーに基づく定量はＤＡニューロン系譜で観察される差次的効果の程度を過小評価する可能性がある。
Ｘ． 例となるｍＤＡニューロンを提供するために本発明の組成物と方法を使用する大規模培養の企図
本明細書における記載は、本明細書に記載される組成物と方法による分化により生じるｍＤＡ神経細胞の大規模生産のための例となる方法と使用を示す。規模拡大可能な作成法（すなわち、比較的少数の細胞を含有する培養物からのｍＤＡ神経細胞の作製に成功すると考えられている方法）が第２５日において移植可能なｍＤＡニューロンが可能である細胞集団を産出することが示された。とりわけ、ＰＩＮＫ ｉＰＳＣ細胞について表９を参照のこと）。
ＸＩ． 中脳ＤＡニューロンの濃縮方法
（複数の）問題を克服することによって、例えば、混入万能性幹細胞を含むが、これらに限定されない混入細胞集団を除去することによって中脳ＤＡニューロン前駆細胞について細胞集団を濃縮することを目標に、本発明の開発前及び開発中にいくつかの方法を開発及び試験した。初代の胚性マウスニューロン集団、胚性ラットニューロン集団及びマウスＥＳＣ由来集団を使用して最初の試験を実施した。ＤＡニューロン濃縮に使用するための神経集団の増加という目標を有することに加えて、そのマウスＥＳＣ試験は以前の方法で問題であったテラトーマの形成を防止する方法の開発を含んだ。これらの戦略には神経マーカー（ＮＣＡＭ）を発現する細胞の陽性選択と共に万能性細胞で発現される細胞表面マーカー（例えば、ＳＳＥＡ１）についての陰性選択が含まれた。マウス細胞を使用して、ＤＡニューロン移植パラダイムにおける神経細胞の濃縮の特定（例えば、ＳＯＸ１、コリン（Ｃｏｒｉｎ）／Ｌｍｘ１ａ、Ｎｇｎ２、ＴＨ、Ｐｉｔｘ又はＤＡＴの発現を有する細胞の特定）において使用されるいくつかの遺伝的レポーター戦略が提唱された。機能試験がＮｇｎ２レポーターマウス由来の初代細胞（Ｔｈｏｍｐｏｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ． １９８（１）：１８３〜９８ （２００６））及びコリンについても選別されたＬｍｘ１Ａレポーターマウス由来の初代細胞（Ｊｏｎｓｓｏｎ， Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ． ２１９（１）：３４１〜５４ （２００９））において実施された。マウスＥＳＣ由来集団についてはＳＯＸ１（Ｂａｒｒａｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００５ ２２（７）：１５５５〜６９）、ＴＨ（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｎｅｒｖａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １９９１ １６（４）：２０３〜６）、Ｐｉｔｘ３（Ｈｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２００８ ２６（６）：１５２６〜３６）及びＤＡＴ（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２００９ ２７（１２）：２９５２〜６１）マウスＥＳＣレポーター株を使用して試験が実施された。加えて、本発明者らは本発明の開発中にＤＡニューロン発生の連続するステージを代表する３種の精製されたマウスＥＳＣ由来集団、すなわち、中脳前駆細胞（Ｈｅｓ５：：ＧＦＰ）、初期分裂終了後細胞（Ｎｕｒｒ１：：ＧＦＰ）、及び成熟ＤＡニューロン（Ｐｉｔｘ３：：ＹＦＰ）のインビボ成績を直接比較する包括的な移植試験を実施した。それらの試験はＮｕｒｒ１発現性ＤＡ発生を移植に特に適切なものと特定し、そして、精製されたＤＡニューロンはインビボで効率的な生着が可能であることを示した。さらに、これらの結果は、ＰＤのマウスモデル、ラットモデル及びアカゲザルモデルへのｈＥＳＣ‐ＤＡニューロンの移植に使用するための分化第２５日（Ｎｕｒｒ１発現の開始日）における細胞の選択のために使用された。
本発明の開発中にｈＥＳＣからの真正中脳ＤＡニューロンの作製がｓｈｏｗｅｄ優れたインビボ成績（図４を参照のこと）を示し、本明細書に記載されるプロトコルの使用が移植の時点で約４０％のＤＡニューロンの収率をもたらした。このパーセンテージはヒト胎児腹側中脳組織の精査後に得られるＤＡニューロンのパーセンテージ（通常約１０％）を超えた。従って、細胞精製戦略を用いるとき、本明細書に記載されるＤＡニューロンのｈＥＳＣ系供給源の使用が純度を一層さらに改善するために企図される。加えて、マウス試験において使用されるレポーター株と類似したｈＥＳＣと使用するためのＮｕｒｒ１：：ＧＦＰ株のようなヒト細胞株を含む遺伝的レポーター株が開発された。しかしながら、ＧＦＰはヒトにおいて免疫原性であり、したがって、ヒトでの使用に適切ではないため、遺伝的レポーターの使用はヒトにおける翻訳による使用にとって問題であり得る。さらに、高額な費用の可能性と貯蔵状態からの回復後のより低い細胞収量に加えて移植毎に必要とされる約１０9個もの規模の細胞を選別することに必要であろう時間の長さを考えると、ＦＡＣＳ選別は臨床グレードのＤＡニューロンマスター細胞バンクの確立（すなわち、移植に使用するためのヒトＤＡニューロンの凍結貯蔵物の開発）にとって問題であり得る。
本発明者らは、遺伝的レポーター系とＦＡＣＳベースの細胞単離と対照的に、ＰＤ患者での使用について考えられている細胞分離技術の代替的戦略を用いる表面マーカーの発現に基づくＤＡニューロンの単離を企図した。例えば、磁性ビーズ選別（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム）はＦＤＡに認可された細胞ベースの用途において広く使用されており、ＧＭＰ準拠条件、すなわち、ヒトで使用するための細胞の単離について承認された条件の下での最大１０10個の細胞の迅速で費用効果がある単離を可能にした。従って、いくつかの実施形態では、移植において使用されるＮｕｒｒ１＋ニューロンの濃縮のために、例えば、磁性ビーズに結合したＣＤ１４２を使用する磁性ビーズ選別が成熟ＤＡニューロンの濃縮のために企図される。
ＸＩＩ． 成熟ＤＡニューロンを提供する方法において使用される細胞表面マーカーの特定
本発明の開発中に収集された細胞表面マーカー発現データは中脳ＤＡニューロンで発現されるいくつかの新規細胞表面マーカーの特定を示した。具体的には、細胞、例えばＤＡニューロン、本発明の成熟ＤＡニューロン及びＡ９細胞に成熟するだろう特定の細胞をさらに特定するためのマーカーが見出された。２つの主要な戦略がそのような表面マーカーを特定するために用いられた。第一に遺伝的レポーター株における無作為遺伝子発現スクリーン（図２７ａ）がＣＤ１４２、及び中脳ＤＡニューロンで選択的に発現し、Ａ９型ＤＡニューロンを特異的に標識するように見えるＤＣＳＭ１という名前のマーカー（図２７ｂ）を含むいくつかの候補マーカーを示した。第２の戦略は、９６ウェル形式の２４２種の市販の抗体を試験するｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンにおけるＣＤ細胞表面マーカースクリーンの使用であった（図２７ｃ、ｄ）。そのような例となるスクリーンの結果（図２７ｅ）によって、ＣＤ６３、ＣＤ９９、及びＤＣＳＭ１に加えてＮｕｒｒ１＋ＤＡニューロン期を選択的に標識したマーカー（図２７ｆ）であるＣＤ１４２を含む、中脳ＤＡニューロンにおいて濃縮される少なくとも５個の検証済みのマーカーが特定された。
具体的には、図２７に示されるように、分化第２５日におけるＷＡ０９由来ＤＡニューロンについてＣＤ表面マーカースクリーンが最大で２４２種の個々の抗体を試験した。これらの結果が広範囲の他のＷＡ０９由来神経細胞種（例えば、ｈＥＳＣ由来ＨＢ９：：ＧＦＰ＋運動ニューロン、ｈＥＳＣ由来大脳皮質ニューロン、ｈＥＳＣ由来Ｎｋｘ２．１：：ＧＦＰ＋腹側前脳前駆細胞、及びいくつかの他のｈＥＳＣ由来ニューロン種）の２つ組のスクリーンと比較された。次に、表面マーカー発現プロファイルについての結果生じるデータベースを使用して中脳ＤＡニューロン（図２７）などのあらゆる所与のサブタイプに関して選択的に濃縮された候補ＣＤマーカーを選択した。ｈＥＳＣ ＤＡニューロン分化に関連して発見されたマーカーのうちの１つがＣＤ１４２であった。細胞のＣＤ１４２選別がＮｕｒｒ１＋ステージにおいてｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンを特異的に濃縮したが、一方、他のニューロンサブタイプを除去した。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２はＮｕｒｒ１＋の前に発現する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２について選別された中脳ＤＡ神経細胞集団はＮｕｒｒ１＋細胞及びＮｕｒｒ１−細胞を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２について選別された中脳ＤＡ神経細胞集団はＮｕｒｒ１−細胞を有する。いくつかの実施形態では、Ｎｕｒｒ１−ＣＤ１４２＋選別済み培養中脳ＤＡ神経細胞集団は選別から最大で２日の間にＮｕｒｒ１を発現し始める（すなわち、Ｎｕｒｒ１＋になる）。
ＣＤ１４２に加えて、ＣＤ６３及びＣＤ９９がｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンで濃縮されるマーカーであった。従って、いくつかの実施形態において、ＤＡニューロン培養物は、ＣＤ１４２、ＣＤ６３、ＣＤ９９、ＤＣＳＭ１、Ｎｕｒｒ１＋等を含むが、これらに限定されないマーカーによる選別又は選択によってＤＡニューロンを濃縮される。ＣＤ１４２は通常分化第２５日において総細胞集団の約３０％を標識する（図２８ａ）。Ｎｕｒｒ１＋ＤＡニューロン期についてのＣＤ１４２の選択性は複数の無関係のｈＥＳＣ株とｈｉＰＳＣ株で確認された（図２８ｂ）。重要なことに、ＤＡニューロンの濃縮に加えて、ＣＤ１４２はＧＡＢＡ系ニューロンとセロトニン系ニューロンなどの他のニューロンサブタイプを選択的に枯渇させる（図２８ｃ〜ｆ）。検出可能な混入ＧＡＢＡ系ニューロン及びセロトニン系ニューロンが無い高純度のＤＡニューロン移植片を生じさせるＣＤ１４２の能力を示すインビボ試験が実施された。セロトニン系ニューロンは、移植片誘導性ジスキネジアの潜在的な原因としてヒト胎児組織移植に関連付けられている細胞種である。精製されていない細胞を使用する本明細書に記載される移植方法によって早くも非常に少ないセロトニン系ニューロンが生じたが、ＣＤ１４２の使用がこの危険性をさらに低下させるはずである。
Ａ． Ａ９型成熟ｍＤＡニューロンを特定するためのマーカー．Ａ９由来ＤＡニューロンとＡ１０由来ＤＡニューロンはそれぞれ中脳線条体系機能と中脳辺縁系機能におけるそれらの役割に特異的な別個のインビトロ及びインビボ機能特性並びに神経支配パターンを有することが分かった。本発明の開発中に本発明者らは、本発明の方法によって作製された真正ｍＤＡニューロン（図４）がＡ１０の特徴よりもＡ９の特徴を多く有するニューロンを生じることを発見した。特に、ＴＨ＋である真正ｍＤＡニューロンは、Ａ９型ＤＡニューロンを定義するために使用されるマーカーであるＧｉｒｋ２を少なくとも部分的に発現した。加えて、多くの成熟ＤＡニューロンがＡ９型ＤＡニューロンには存在するが、Ａ１０型ＤＡニューロンには存在しない機能特性である自律的ペースメーカー活性を示した。しかしながら、インビトロで作製されたＴＨ＋細胞にはＡ９同一性を有しないものもあった。従って、本発明者らは（Ａ１０）ニューロンに対して精製されたヒトＡ９型真正ｍＤＡニューロンの集団を提供するための本明細書に記載されるもののような濃縮方法を企図した。本明細書に記載されるように、本発明者らはＡ９型ニューロンに対して特有の少なくとも２つのマーカーと少なくともＡ１０型ニューロンに対して特有の少なくとも２つのマーカーを発見した。従って、いくつかの実施形態では、Ａ９型ニューロンは（Ｇｉｒｋ２、Ａｌｄｈ１）によってＡ１０（カルビンジン、Ｏｔｘ２）マーカーから識別される。
Ｂ． Ａ９サブタイプを有する中脳ＤＡニューロンの収量を増大させたマーカーセットの明確化。Ａ９特異的表面マーカーの明確化のために少なくとも２つの戦略が考えられた。候補マーカーは本明細書に記載されるもののような遺伝子発現スクリーンから得られ、そして、候補ＣＤ抗体は本明細書に記載されるような表面マーカースクリーンから得られた。集団。別の方法では、別個の分化ステージにあるマウスＥＳＣ由来ｍＤＡニューロンの精製集団における包括的トランスクリプトーム分析（ＢＡＣ遺伝子導入技術を用いる；図２７ａ、ｂを参照のこと）。表面マーカーは次の例となる方法を用いてＷＡ０９ＲＣＢに由来するＤＡニューロンに対する表面マーカープロファイルにおいて発見された。分化第２５日のＲＣＢ ＷＡ０９由来ＤＡニューロンを剥離させ、そして、９６ウェルプレートに再播種し、続いて２４２種のＣＤ抗体に曝露し、そして、オペレッタ・ハイコンテント・スキャナーを使用してデータ分析した。これらのスクリーンにおいて特定されたＣＤマーカー（例えば、ＣＤ１４２、ＣＤ６３及びＣＤ９９）に結合するさらに少なくとも５種の抗体についてＤＡ濃縮の量を試験した。候補ＣＤ陽性細胞とＣＤ陰性細胞は、ＦＯＸＡ２／ＴＨ及びＴＨ／Ｎｕｒｒ１の発現を含めてＤＡ ＱＣアッセイを用いて評価された（表７を参照のこと）。いくつかの実施形態では、包括的遺伝子発現プロファイルがＣＤ１４２＋細胞に対する無選別の細胞の比較のために考えられる。いくつかの実施形態では、所望のマーカーの発現について選別／分離された細胞が本明細書に記載される短期及び長期のインビボ試験において使用された。中でもこれらの試験において特定されたＤＡニューロン特異的マーカーはＤＣＳＭ１（ＤＡ細胞表面マーカー１）と呼ばれる表面マーカー遺伝子であった。インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）発現データに基づくと、発生中のマウスの脳と成体マウスの脳（図２７）でもヒト成体脳でも発現は腹側中脳内であるが、より驚くことに、少なくともＡ９選択的であることが分かった。ｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンにおいてＤＣＳＭ１発現を発現する多数の細胞が観察された。Ａ１０同一性に対するＡ９同一性についてのインビトロアッセイにはマーカー＋細胞の長期分化（分化第５０日と第７５日）及び（ｉ）成熟ニューロンにおけるＡ１０（カルビンジン、Ｏｔｘ２）マーカーに対するＡ９、（Ｇｉｒｋ２、Ａｌｄｈ１）マーカーの発現の分析、（ｉｉ）ネトリン‐１とＳｅｍａ３に対する差次的軸索ガイダンス応答の分析が含まれ、そして、（ｉｉｉ）濃縮Ａ９ニューロンは電気生理学試験によって評価された。Ａ９ＤＡニューロンは、ｈＥＳＣ由来Ａ９ニューロンについて本明細書に記載される特異的な機能特性を示した。（ｉ）Ａ１０マーカー（カルビンジン、Ｏｔｘ２）に対するＡ９マーカー（Ｇｉｒｋ２、Ａｌｄｈ１）の発現、（ｉｉ）移植片ＤＡ線維伸長及び（ｉｉｉ）薄片調製した移植細胞における電気生理学的Ａ９特性（図２６を参照のこと）を確証するためにＤＣＳＭ１及び他のマーカーを発現する細胞に対してインビボ試験を実施した。
ＸＩＩＩ． ポリシアル酸（ＰＳＡ）とポリシアル酸トランスフェラーゼ（ＰＳＴ）酵素の使用
移植片の組み込みとＤＡ線維伸長の程度はＰＤ患者における胎児移植試験を含む移植方法における課題である。移植片組織及び細胞が出会う１つの問題は患者を治療するときのこれらの移植片からの線維伸長の制限である。この問題は、患者の回復が広範囲の線条体神経再支配を必要とするのでヒトにおいて特に重大である。以前の方法では、組織移植後の充分な神経再支配の達成には線条体のいたる所への細胞供託物の複数回の注入が必要とされた。注入毎に他の外科的リスクと共に線条体の損傷と炎症が引き起こされ得る。そのようなリスクには、患者において卒中又はけいれんを引き起こす可能性があるだろう細胞注入の間の血管の損傷が含まれる。ＰＳＡは、（ポリシアル酸化）神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ＮＣＡＭ（ＣＤ５６）、及び同種のものなど、他の細胞表面分子の（ポリシアル酸トランスフェラーゼ（ＰＳＴ）酵素の作用による）翻訳後修飾として特定された天然細胞表面シアル酸ホモ重合体（すなわち、α２，８‐結合シアル酸）である。ＰＳＡは、細胞移動と軸索伸長を含む、細胞間相互作用の変化を必要とするいくつかの細胞行動の可塑性の調節に機能するようであった。ＰＳＡは、胚においてよく発現されるが、構造的及び生理的可塑性を維持するＣＮＳの局所領域（例えば、海馬、視交叉上核、ＳＶＺ）を例外として成体の組織では下方制御された。従って、いくつかの実施形態では、移植された細胞の線維伸長の促進にポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用することが企図された。他の細胞種におけるＰＳＡの使用の例は、全体の参照により本明細書中に援用される国際公開第２００６／０４２１０５号に記載されている。いくつかの実施形態では、本発明者らは本明細書に記載されるＰＳＡと組み合わせた真正ＤＡニューロンの使用を企図する。
Ａ． ＰＤ患者において使用するためのＤＡニューロンにおけるＰＳＡの増加．小動物モデルの使用による以前の結果に基づく方法と細胞を提供するために、移植細胞の限定的な生存と宿主組織の貧弱な線維神経支配を含む、大きな課題が残っている。これらの制限の影響はより大きなヒト線条体でより重大であると考えられ、従って、生存と神経支配の強化がＥＳ由来ＤＡニューロンの効果的な臨床的応用に必要である。少なくとも１回の注入、最大で数回の注入の使用を含む、動物モデルにおける線維伸長と移植片の組み込みの改善は、インビボでのＤＡニューロンの複数回の注入又は少ない分布に関連するリスクの低下を表すと考えられる。
ポリシアル酸（ＰＳＡ）による細胞相互作用の調節は、脊椎動物の発生の間に細胞分布、軸索伸長及び標的神経支配を促進する要因のうちの１つである。例えば、Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ， Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ９， ２６〜３５ （２００８）を参照のこと。ＰＳＡは、細胞間相互作用を弱め、それによって組織可塑性を促進する、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）に結合した炭水化物重合体であった。グリア性瘢痕では、成体脳におけるＰＳＡの発現強化が脳室下帯から大脳皮質へのニューロン前駆細胞の移動を促進し、軸索伸長を改善した（Ｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｕｓｅ ｏｆ ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １６９８９〜１６９９４ （２００６））。本明細書に記載されるように、精製されたマウスＥＳ由来ＤＡニューロンでのＰＳＡ発現の遺伝子操作による増加が移植片細胞数の改善、宿主線条体への広範囲のＤＡニューロン線維伸長及び、驚くことに、パーキンソン病のマウスにおける行動回復の強化を引き起こした。さらに、細胞表面ＰＳＡレベルの上昇のためのＥＳＣ由来ＤＡニューロンの遺伝子操作がインビボ生存と宿主線条体への線維伸長を同時に増大させた。哺乳類、すなわち、マウス又はヒトのＰＳＴ遺伝子を使用するための一例となる実施形態が図２９に示されている。図２９に示されている別の例となる実施形態は細菌性ＰＳＴ、すなわち、ＰＳＴｎｍの使用を示す。具体的には、本明細書に記載されるように、ＰＤの治療において使用するために、成熟ＤＡニューロンベースの細胞療法に使用される細胞でのＰＳＡの増加が考えられる。
Ｂ． ＰＳＡ発現を上昇させるためのマウスＰＳＴの使用．インビボの結果はマウスＰＳＴ細胞修飾移植片を受容した６‐ＯＨＤＡマウスにおける神経突起伸長の増大とアンフェタミン誘導性回転の回復を示したが、ＰＳＴで修飾されていない同数の細胞は同じことを達成することができなかった（図３３）。また、ＤＡ線維神経支配の改善は、ＰＤマウスモデルにおける行動的治療成績の向上と相関することが観察され、例えば小（約５０，０００細胞の注入）ＰＳＡ陽性細胞移植片が作製されたときにそれらは、より大きい（１００，０００以上の細胞）比較のための移植片の使用と比べて対象とされる約７０％の領域である移植片の組み込みと線維伸長をもたらす。ＰＳＡ増強ＥＳ由来ＤＡニューロン移植片と対照処理ＥＳ由来ＤＡニューロン移植片の並置比較は（移植片がそれぞれ５５，０００細胞の移植によるとき）対照細胞では観察されない行動回復をＰＳＡ群において示した。マウス脳における１００，０００個のＥＳ由来ＤＡニューロンの移植はＰＳＡ処理ＥＳ由来ＤＡニューロンと対照処理ＥＳ由来ＤＡニューロンの両方で行動回復を示し、１００，０００細胞に由来する移植片はＰＳＡの増強無しでマウス脳を神経再支配するのに充分であることを示唆した。従って、別の実施形態では、ＰＤを有する患者の治療のための方法の中で真正ＤＡニューロンの表面におけるＰＳＡ発現の遺伝子操作による発現を使用することが考えられる。ＰＳＡが本発明の神経細胞で誘導されたとき、それは脳細胞で自然に生じるＰＳＡ重合体と同一であり、従って、治療細胞種の遺伝子操作のために他の細胞表面分子を使用することと異なり、ＰＳＡ発現について遺伝子操作された細胞は、ヒトにおける移植方法のための細胞に対して使用されると、インビボで抗原性をほとんど持たないと考えられる。また、神経前駆細胞（Ｂａｔｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ３０（１１）：３９９５〜４００３ （２０１０））であれ、シュワン細胞（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｉａ． ６０（６）：９７９〜９２（２０１２））であれ、そして、本発明のＥＳ由来ＤＡニューロンであれ、移植される細胞の高ＰＳＡレベルは、様々な成体げっ歯類モデルで使用されたときに検出可能な副作用を引き起こさなかった。遺伝子操作によるＰＳＡの有効レベルまでの発現は、その唯一の産物がこの独特な糖重合体である単一のポリシアル酸トランスフェラーゼ（ＰＳＴ）酵素の作用を必要とした。驚くことに、発現したタンパク質の量と酵素産物の性質は非常に一定であり、胚組織において自然状態で見出されるＰＳＡと非常に似ていた。
本明細書に記載されるように、移植方法において使用される神経細胞における遺伝子操作によるＰＳＡ発現が企図される。特に、他の種類の誘導された細胞表面マーカーの発現を用いるときに出会う問題を克服することによって、治療用途の細胞の調製にＰＳＡを使用することが考えられる。さらに、ＰＳＡの受容体も種を越えて構造が均一であり、細胞表面の大部分で見出されるので、ＰＳＡ発現の使用は（例えば、ヒト細胞で発現するマウスＰＳＴ遺伝子を使用する）脊椎動物の種を横断するプロトコルにおいて再現性があった。ＤＡニューロン上のＰＳＡを増加させるためのｈＥＳＣへのＰＳＴ遺伝子の操作．ヒトポリシアル酸トランスフェラーゼ（ｈＰＳＴ）をコードする遺伝子を、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｙ、インビトロジェン社）を使用して、そして、本明細書に記載されるようにｈＥＳＣ株（ＷＡ０１）に導入した。２０種の選択されたクローンを増殖させ、そして、ＰＳＴ発現について分析した。ＰＳＴ発現性ｈＥＳＣクローンを分化させてＤＡニューロンでＰＳＴが発現停止されていないことを確実にした。ＦＡＣＳ分析と免疫蛍光（オペレッタ）を用いて異なる分化ステージ（第０日、第１１日、第２５日、及び第５０日）におけるＰＳＡ‐ＮＣＡＭの定量を行った。陽性クローンを表７に概説されている一揃いのＤＡニューロンの品質管理（ＱＣ）パラメーターの対象とした。分化中に均一で高レベルのＰＳＡ‐ＮＣＡＭを保持し、ＱＣパラメーターにおいてうまくいく（表７）少なくとも３クローンをＰＳＴ過剰発現性のｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンにおける神経突起伸長の評価に進める。本明細書に記載される標準的なプロトコルを用いて選択された対照とＰＳＴ過剰発現ｈＥＳＣクローンをＤＡニューロンに分化させ、続いて第２５日と第５０日に細胞を固定し、そして、分析した。そのような培養物におけるＴＨ陽性線維の数と長さをオペレッタ・ハイコンテント顕微鏡で定量した。ハーモニー・ソフトウェア３．０の神経突起分析モジュールがＰＳＴを有する、又は有しない神経突起の数と長さを定量し、そして、２元配置ＡＮＯＶＡを用いてデータを統計的に解析した。上のインビトロ試験から先に進むＰＳＴ過剰発現性ｈＥＳＣクローンと対照ｈＥＳＣクローンを再度ＤＡニューロンに分化させ、そして、ＰＤのラットモデルに移植した。生存性、ＰＳＡ‐ＮＣＡＭ発現及び神経突起伸長を判定するための短期移植（４〜６週間）を行った。インビボで短期間経過した各クローンについて、パラメーターを長期移植試験の対象とした。それらの試験について、動物は標準的用量（２００×１０3個）の半分又は４分の１の細胞を受容した。これらの試験は、ＰＳＡの増加が移植後（５か月）の長期生存の増加につながるか、及び、より少ない数のＤＡニューロンが標準的な細胞用量で移植された非ＰＳＴ移植片の機能的能力に一致するか、又はそれより優れることができるか問うものであった（図２７）。
加えて、ＰＳＴ ＤＡニューロン移植片と対照ＤＡニューロン移植片の間の機能的能力をさらに識別するために線条体性再神経支配の程度に敏感である複雑な行動アッセイがモニターされた。行動アッセイの完了後に動物を殺処理し、ＮＣＡＭとＳＣ１２１のヒト特異的抗体及びＴＨに対する抗体を使用して線維伸長を定量した（図２９も参照のこと）。ｈＮＣＡＭ＋、ＳＣ１２１＋及びＴＨ＋の移植片の強度と広がり、並びにＤＡニューロンマーカー（ＴＨ、ＦＯＸＡ２）とＰＳＡを共発現するヒト細胞のパーセンテージを測定した。移植片から発出する神経突起のＮＣＡＭ／ＴＨ＋ハロの密度を様々な距離で定量した。ボンフェローニ・ポストホク・テスト付きの２元配置ＡＮＯＶＡを用いてデータを群間で比較した。加えて、切片を定性的変化（例えば、分岐、厚み、移植片分布、及び形状）について調査した。加えて、Ａ９表現型、宿主線条体とのシナプス形成、並びに内在性の求心神経による神経支配に関する薄片の電気生理学的評価（図２６を参照のこと）のためにいくつかの移植片を処理する。
次の実施例はパーキンソン病のマウスにおけるＥＳ由来ドーパミンニューロン移植片の機能を改善するポリシアル酸発現の増強を示す。
Ｎｕｒｒ１プロモーターの制御下にあるＧＦＰを発現するＥＳ細胞（Ｎｕｒｒ１：：ＧＦＰ ＥＳ細胞）にポリシアル酸トランスフェラーゼ（ＰＳＴ）を広範に発現するレンチウイルスベクターを安定的に形質導入した。形質導入された細胞は対照と比べてＰＳＴ ｍＲＮＡの劇的な増加を示した（図３０Ａ）。ＰＳＴの発現はＮＣＡＭ上のＰＳＡ合成に充分であることが観察された。従って、ＰＳＡ‐ＮＣＡＭ発現はＤＡニューロン分化の第１４日にＰＳＴ改変細胞において大いに上昇した（図３０Ｂ〜Ｅ）。ＰＳＡの特有のα‐２，８結合シアル酸重合体を特異的に切断するファージ・エンドノイラミニダーゼ（ｅｎｄｏＮ）によってＥＳ由来ＤＡニューロン上の内在性細胞表面ＰＳＡと誘導性細胞表面ＰＳＡの両方を取り除くことができた（図３０Ｅ）。驚くことに、ＰＳＴ形質導入がＧＦＰ精製ＤＡニューロンにおいてニューロンマーカー又は中脳マーカーの発現に影響することは観察されなかった（図３０Ｆ）。
６ＯＨＤＡ傷害性半身パーキンソン症マウスにおける他の試験が、約１００，０００個のＥＳ由来ＤＡニューロン前駆細胞の移植がアンフェタミン促進性回転試験によって判定される堅固な機能回復をもたらすのに必要であることを示した。本試験では、ＰＳＡ発現の増大を評価することができるように最適以下の数の細胞を移植することが求められた。混入万能性細胞が枯渇させられている非常に濃縮されたＤＡニューロン集団を移植するために、分化第１４日の培養物はＮｕｒｒ１誘導性ＧＦＰの発現に対して、及びＳＳＥＡ‐１発現の欠如に対してＦＡＣＳ精製された（図３１）。ＰＳＴ過剰発現がないとき、半分までの最小有効移植サイズの減少（５５，０００Ｎｕｒｒ１＋ＤＡ細胞）により、検出可能な行動回復をもたらすことができなかった。対照的に、ＰＳＡ発現の増加があるとき、同じ数のＮｕｒｒ１／ＰＳＴ ＤＡニューロンによりＰＤ性行動障害の有意な是正（ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ）がもたらされ、外科手術から約５週間後に完全な回復がもたらされた（図３２Ａ）。Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴを用いて得られた機能回復がｅｎｄｏＮ処理によって部分的に反転させられた（図３２Ａ）ということで、ｅｎｄｏＮとのインキュベーションによる移植前のＰＳＡの除去がＰＳＡの機能向上の特異性を示した。
移植される細胞の特徴を調査するために移植から２か月後に免疫組織化学のために動物を処理した。ＰＳＴ形質導入株を移植された動物は対照細胞を移植された動物の二倍の数のＧＦＰ＋細胞を平均で有した（ＰＳＴ試料と対照試料の間で移植片当たり、それぞれ、９，３００±１，４００ＧＦＰ＋細胞対４，２３０±１０１０ＧＦＰ＋細胞；図３２Ｂ、ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）ということで、生存しているＮｕｒｒ１＋ニューロンの数に差が存在した。さらに、Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴ移植片はより高レベルのＰＳＡ発現もインビボで示した（図３２Ｃ、Ｄ）。しかしながら、移植中核内の中脳ＤＡマーカーＴＨとＦｏｘＡ２を発現する細胞の割合はＮｕｒｒ１細胞とＮｕｒｒ１／ＰＳＴ細胞について同等であった（それぞれ、ＴＨ：６２．０％±８．０対５１．３％±７．０、ｐ＝０．３３；ＦｏｘＡ２：６３．２％±８．６対５５．４％±２．０、ｐ＝０．３；図３２Ｅ）。
Ｎｕｒｒ１細胞及びＮｕｒｒ１／ＰＳＴ細胞から出現する神経突起は同等レベルのＴＨ、Ｇｉｒｋ２（Ｇタンパク質共役内向き整流性カリウムチャネル）及びシナプシンを示した（図３３Ａ）。移植されたシュワン細胞についての他の研究（Ｇｈｏｓｈ、 ｅｔ ａｌ． Ｇｌｉａ ６０， ９７９〜９９２ （２０１２））と異なり、ＰＳＡ発現の増強は移植部位からのＤＡ細胞の移動にほとんど効果を持たなかった。しかしながら、神経突起伸長には明らかな変化が存在した。図３３Ｂに示されるように、Ｎｕｒｒ１＋対照と比べてＮｕｒｒ１／ＰＳＴ細胞から出現するより多くのＤＡ神経突起が存在した。ＧＦＰ及びＴＨの免疫蛍光強度が移植物から５つの連続する１００μｍゾーンで定量されたとき、Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴ移植片はずっと高い突起の相対的密度を示した（図３３Ｃ、Ｄ；ＧＦＰとＴＨの両方についてｐ＜０．０１、２元配置ＡＮＯＶＡ）。この効果を定量するとき、突起の相対的密度が移植中核に最も直近のゾーンで観察された密度に対して正規化された。そのような正規化は、Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴ移植片内のより大きな数の生存細胞について補正し、神経突起伸長に対するＰＳＡの特異的な効果を確認するために必要とされた。細胞表面のＰＳＡが移植前にｅｎｄｏＮ処理によって取り除かれたときにも特異性が示された。従って、ｅｎｄｏＮを使用する前処理により遠位部の線維伸長が対照レベルまで低下させられた（図３３Ｅ）。
これらの発見は、移植片機能に対するＰＳＡの効果の少なくともいくつかが線条体の線維神経支配の増強により生じることを示した。従って、移植片機能と、例えばゾーンＩＶへのＧＦＰ陽性線維の相対的伸長程度の間に強力な相関が存在した（図３３Ｆ；ｐ＜０．００１、ｒ２＝０．６５、ｎ＝１７）。驚くことに、線維伸長と行動の関係は実験群（対照、ＰＳＡ増加、及びｅｎｄｏＮ処理）について一貫しており、移植片宿主神経支配がパーキンソン病モデルマウスにおける行動回復のパラメーターであることを示した。移植中核を包み込む反応性グリアのゾーンの穿通性の増大、神経発芽能の上昇、周囲の宿主組織への伸長の向上（例えば、より容易な成長円錐の転移）、及び移植中核の近くにある宿主組織との成熟前連絡の防止などのいくつかの要因が線維伸長の増大に機構的に寄与した。その例となる機構は、正常な発生中の突起伸長の促進及び成体神経系におけるＰＳＡの役割と一致する。
本明細書に記載される実験は、他の種類の細胞に由来する移植片と比べて優れた結果をもたらすＤＡニューロン移植における改変ＰＳＡの使用を実証した。ＰＳＡの増加によって、宿主線条体を神経支配し、ＰＤ性機能障害を低減させる移植されたＤＡニューロンの能力の著しい増大がもたらされることがデータから明確に示された。従って、本発明のＤＡニューロンを備える臨床上の転移術が移植前に細胞を提供することについて企図される。いくつかの実施形態では、それらの細胞はＰＳＡの発現について遺伝的に操作される。いくつかの実施形態では、ＰＳＴは、その精製された酵素と基質へのインビトロでの曝露により移植前の細胞に直接送達されてもよい。いくつかの実施形態では、ＰＤ移植におけるヒト転移術のためのＰＳＡ戦略は複数回の注入の必要性を最小化し、それによってこれらの複数回の注入により生じる外科手術上のリスクを減少させると考えられている。
他の実施形態では、他の細胞種と種に対して、例えば、脊髄損傷部位での軸索の再伸長のための架橋（例えば、細胞間連絡）の作製において移植シュワン細胞の移動を増大させるためにこの技術を用いることが企図される。
次のものはこの実施例における例となる材料と方法である。動物：食物と水を自由に利用可能にして６週齢の１２９Ｓ３／ＳｖＩｍＪマウス（ジャクソン・ラボラトリー社）を温度管理下で飼育した。実験技法はＮＩＨと研究所の動物使用に関する指針に従って実施され、そして、地域の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）とバイオセイフティ委員会（ＩＢＣ）によって承認された。
６ＯＨＤＡ注射とアンフェタミン誘導性試験：動物をペントバルビタールナトリウム（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、そして、右線条体に２μｌの６ＯＨＤＡ（生理食塩水、０．５％アスコルビン酸中に４μｇ／μｌ）を注射した。注射は次の座標にハミルトン注射筒を用いて実施した：ブレグマに対して０．５ｍｍ後方、１．８ｍｍ外側、及び脳表面に対して２．５ｍｍ腹側。外科手術の前に動物はデシプラミンの単回腹腔内注射（２５ｍｇ／Ｋｇ、シグマ社）を受けた。外科手術から２週間後にアンフェタミン誘導性回転試験において動物に点数を付けた。それらの動物を３０ｃｍの直径の透明なプラスチック製円筒に３０分間配置し、その後に動物はアンフェタミンの単回腹腔内注射（１０ｍｇ／Ｋｇ、シグマ社）を受けた。２０分後からさらに２０分の間の同側性回転／対側性回転の回数を記録した。７週間の間に週に１回動物に点数を付け、その後、動物を深麻酔し、ＰＢＳと０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで心臓を通過する潅流を行った。脳を摘出し、４℃の４％パラホルムアルデヒド中で一晩後固定し、その後ビブラトーム（Ｐｅｌｃｏ‐１０１、テッド・ペラ（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）社）で厚さ４０μｍの矢状面切片に薄片化した。
細胞分化と移植： Ｎｕｒｒ１：：ＧＦＰ ＢＡＣ遺伝子導入ＢＡＣマウスＥＳレポーター細胞株（すなわち、ＧＦＰ発現がＮｕｒｒ１プロモーターによって誘導される）５にＣＭＶプロモーターの制御下にあるマウスＰＳＴ遺伝子を含有するレンチウイルス（ｐＬｅｎｔｉ、インビトロジェン社）を形質導入した。ＥＳ細胞を、１，４００ユニット／ｍｌのＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ；インビトロジェン社）、２ｍＭのＬ‐グルタミン、１ｍＭのβ‐メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｐｓ／ｍｌのストレプトマイシン（インビトロジェン社）を添加されたＤＭＥＭ（インビトロジェン社）、１０％ＦＢＳ（ハイクローン社）中のマイトマイシンＣ処理済みＭＥＦ（ステムセル・テクノロジーズ社）上で培養した。ＤＡ分化をＢａｒｂｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１， １２００〜１２０７ （２００３）に従って、変更を加えて誘導した。簡単に説明すると、ゼラチン被覆ディッシュ中のＭＳ５フィーダー細胞上で細胞（１０，０００細胞／１０ｃｍディッシュ）を分化させ、そして、血清代替物培地（ＳＲＭ）上で４日間培養した。第４日にソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ、２００ｎｇ／ｍｌ）及びＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した。分化第７日にＳＨＨ、ＦＧＦ８及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＮ２に培地を交換した。第１１日にＳＨＨ、ＦＧＦ８及びｂＦＧＦの除去、及びアスコルビン酸（ＡＡ、２００μＭ）とＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の添加により終末分化を誘導した。
細胞を第１４〜１５日に４５分間のアキュターゼ処理により回収し、Ｎ２で１回洗浄し、そして、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ‐６４７複合体化抗ＳＳＥＡ‐１抗体（ＢＤファーミンゲン社）と２５分間インキュベートした。細胞をＮ２で１回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁した。生存度を評価するためにＤＡＰＩを添加した。ＭｏＦｌｏ細胞選別機を使用してＦＡＣＳを実施し、ＧＦＰ蛍光（Ｎｕｒｒ１）について目的の集団を選別した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ‐６４７（ＳＳＥＡ‐１）について陽性の集団をネガディブ選別した。ＧＦＰ陰性対照については同じ分化ステージでナイーブＪ１マウスＥＳ細胞を使用した。
Ｎｕｒｒ１：：ＧＦＰ選別細胞を生存度について分析し、そして、ＢＤＮとＡＡを含むＮ２に５５，０００細胞／μｌの終濃度まで再懸濁した。先端を５０μｍにした細いガラス毛細管を使用して次の座標で傷害マウス線条体に１μｌを注入した：ブレグマより０．３ｍｍ後方、１．５ｍｍ外側、及び脳表面に対して２．２ｍｍ腹側。さらなる特徴解析のために細胞懸濁液のアリコットをマトリゲル被覆６ｍｍディッシュに再播種した。
免疫蛍光分析のために細胞を４ｏＣのパラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、５％ＢＳＡ（ＰＢＳ中に０．１％のトリトンＸ‐１００）でブロックし、そして、一次抗体と室温で２時間インキュベートした：ウサギ抗ＧＦＰ（１：１０００、インビトロジェン社）、マウスＩｇＭ抗ＰＳＡ（１：２０００、５Ａ５）、マウス抗ＮｅｕＮ（１：８００、ケミコン社）、マウス抗ＴＨ（１：１０００、シグマ社）、ヤギ抗ＦｏｘＡ２（１：８００、サンタクルーズ社）、ヤギ抗エングレイルド（１：８００、サンタクルーズ社）。その後、細胞をＣｙ複合体化二次抗体（１：１０００、ジャクソン社）とインキュベートした。
ＥｎｄｏＮ処理：ＮＣＡＭよりＰＳＡを除去するために回収の前の晩に、ＰＳＡ７‐９を特異的に取り除くファージの酵素であるｅｎｄｏＮを２０単位で用いて細胞を処理した。その後、細胞を回収し、前に記載したように注入したが、ＢＤＮＦとＡＡ及び５単位のｅｎｄｏＮを含むＮ２に再懸濁した。我々は、傷害マウスへの同じ量のｅｎｄｏＮのみの注射では動物の行動を改善しないと以前に評価した。
ＰＳＴ ｍＲＮＡとＰＳＡ‐ＮＣＡＭのインビトロ分析：ウエスタンブロット分析のために細胞をＷＢ緩衝液（１％のＮＰ４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び抽出直前に添加される１×プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）で処理し、５秒間の超音波処理を２回行い、遠心し、そして、ラエムリ緩衝液（ＬＢ）に再懸濁した。ＬＢを含まないアリコットをタンパク質測定のために保存した。等量のタンパク質を６％ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル（バイオラド社）に負荷した。電気泳動によりタンパク質をポリビニリデン膜（ミリポア社）に転写した。その膜を、５％の脱脂粉乳を含む０．１％トリトンＸ‐１００ＴＢＳ（ＴＢＳ‐Ｔ）中で１〜６時間ブロックし、そして、５％ミルクを含むＴＢＳ‐Ｔ中の抗ＮＣＡＭ抗体（１：１０，０００、サンタクルーズ社）と一晩インキュベートした。その後、ブロットをペルオキシダーゼ複合体化二次抗体（１：１０，０００、ジャクソン社）とインキュベートし、そして、ＥＣＬ検出法（アマシャムファルマシア・バイオテック社）を用いて検出した。イメージＪソフトウェアを用いてタンパク質レベルを定量した。
ｑＲＴ‐ＰＣＲ分析のためにトリゾール（シグマ社）を用いて全ＲＮＡを抽出し、逆転写し（キアジェン社）、そして、１０μｌの２×ＳＹＢＲ反応混合物と２０μｌの終体積に対して０．２μＭのフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて増幅した。ＰＳＡ‐ＮＣＡＭ ＦＡＣＳ分析のために細胞を４５分間のアキュターゼ処理により回収し、１回洗浄し、そして、マウスＩｇＭ抗ＰＳＡ（１：２５０、５Ａ５）と２５分間氷上でインキュベートし、Ｎ２培地で１回洗浄し、そして、Ｃｙ３複合体化抗マウスＩｇＭ（１：２５０、ジャクソン社）と氷上でさらに２５分間インキュベートした。細胞をＮ２で１回洗浄し、７ＡＡＤを含む０．１％ＢＳＡで再懸濁し、そして、ＦＡＣＳカリバー細胞選別機で分析した。対照として一次抗体を添加しなかった。
免疫組織学的方法及び立体解析学的方法：自由浮遊冠状切片をＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ‐１００、５％ロバ血清において室温で３０分間ブロックし、そして、様々な抗体と４℃で４８時間インキュベートした：ウサギ抗ＧＦＰ（１：３００）、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：２００、ケミコン社）、マウス抗ＴＨ（１：２００）、マウスＩｇＭ抗ＰＳＡ（１：１０００）、マウス抗ＮｅｕＮ（１：４００）、ヤギ抗ＦｏｘＡ２（１：３００）、ウサギ抗Ｇｉｒｋ２（１：３００、アロモネ・ラブズ（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）社）、マウス抗シナプシン（１：２００、ＢＤトランスダクション・ラボラトリーズ社）。次に切片を洗浄し、そして、二次抗体：Ｃｙ２複合体化、Ｃｙ３複合体化、及びＣｙ５複合体化ロバ抗体（１：４００、ジャクソン社）とインキュベートした。ＰＳＡにはＣｙ５複合体化ロバ抗ＩｇＭ（１：５００ ジャクソン社）を使用した。インキュベーションを室温で２時間実施した。切片をＰＢＳ中で２回洗浄し、そして、モウィオール（Ｍｏｗｉｏｌ）（カルビオケム社）中でスライドに固定した。脳の３枚の冠状切片のうちの１枚をそれぞれの免疫標識について分析した。３種のレーザー（アルゴン４８８、ＨｅＮｅ５４３及びＨｅＮｅ６３３）を用い、ｃ‐アポクロマット４０倍対物レンズ（水浸）を装着したツァイスＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡によりデジタル画像を収集した。脳全体を包含する３枚の切片のうちの１枚において、４０倍の対物レンズ下でＧＦＰ＋及びＴＨ＋の細胞数を計数し、移植片当たりの細胞の総数を推定した。二重に標識された細胞をｚ軸全体に渡って単一光学平面において分析した。
ＧＦＰ／ＴＨ＋標識細胞及びＧＦＰ／ＦｏｘＡ２＋標識細胞のパーセンテージの分析のために１００個のＧＦＰ＋細胞を各マーカーについて分析した。突起伸長の分析のために４０倍の対物レンズ下で１μｍのピンホールを用いてｚ軸全体（２０〜４０μｍ）にわたって０．８μｍの間隔で共焦点ｚスキャンを実施した。注入部位から外側に突起が観察されなくなるまで切片を走査した。全走査領域を包含する３Ｄ投影図を連続的に整合させた。ＧＦＰ及びＴＨ強度分析のために全走査領域を移植物から１００μｍずつ離れた５つの連続するゾーンに分割し、そして、イメージＪソフトウェアを使用して強度を測定した。移植片サイズのあらゆる差異の可能性を考えて調整するために移植片に最も近いゾーン（ゾーンＩ）における強度に対してデータを正規化した。
統計分析：データは平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として提示されている。スチューデントのｔ検定又はボンフェローニ・ポストホク・テスト付き２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較を実施した。線形回帰分析を実施し、そして、ピアソン相関を用いて定量化した。
Ｃ． ヒトＰＳＴ遺伝子（ポリシアル酸トランスフェラーゼ）の過剰発現
被傷害動物群は野生型細胞又はＰＳＴを発現する細胞又はＰＳＴ酵素で前処理された細胞からなる３つの用量のうちの１つを受容した。それらの動物群は表１１で考察されるパラダイム（アンフェタミン回転、円筒試験、ステッピング試験）に従う行動試験のために処理された。結果生じるニューロンがマウスＰＳＴ遺伝子について本明細書に記載される結果を示すように、選択された用量（例えば、２００，０００個、１００，０００個、５０，０００個の細胞）をマウスで使用することに成功した。
Ｄ． 細胞への精製ＰＳＴ酵素の直接投与．言い換えると、ＰＳＡ誘導の非遺伝子導入方法．ポリシアル酸化と表面ＰＳＡの発現上昇を引き起こすＰＳＴ酵素による細胞の前処理．哺乳類ＰＳＴはゴルジで働く低含量の膜タンパク質であるが、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）の精製された２，８‐ポリシアル酸トランスフェラーゼ（ＰＳＴｎｍ）は、市販の非毒性基質（すなわち、ＣＭＰ‐シアル酸）を使用すると、細胞外の環境で働き、そして、哺乳類ＰＳＡと化学的に同一である重合体を作製した。一例として、この酵素の活性断片は、インビボ薬物動態を増加させるためにインビトロで治療タンパク質にＰＳＡを付加するのに有効であった。ＣＭＰシアル酸の存在下でＰＳＡはインビトロでマウス及びヒトのＥＳＣを含む多種多様な細胞種の表面において直接的にＰＳＴｎｍによって合成された（図３５Ａ〜Ｅ）。ＰＳＴｎｍと基質の直接注入が大脳皮質、線条体及び脊髄（図３５ＧＨ）を含む成人の脳の領域内の細胞表面でのＰＳＡ蓄積の増加をインビボで引き起こす。ＰＳＴｎｍによって作製されたＰＳＡは、発現誘導されたＰＳＡを除去するｅｎｄｏＮ（図３５Ｂ）によって分解され、ＰＳＴｎｍ作製ＰＳＡは内在性ＰＳＡと同等の機能特性を有することを示した（図３５Ａ、Ｃ、Ｄ）。ＰＳＴｎｍによるＰＳＡ発現は１時間未満で起こり、遅いＰＳＴ導入遺伝子誘導を克服した。発現はインビボで数週間持続し、その後でＰＳＡマーカーが減少し、そうしてＰＳＴ導入遺伝子の誘導の延長による副作用を克服した。従って、インビトロでの細胞のＰＳＴｎｍ＋基質への曝露の使用は、移植方法において使用するためのｈＥＳＣ由来ＤＡニューロン及び他の細胞種におけるＰＳＡレベルの上昇を引き起こすための簡単な代替的戦略であると考えられる。部分的には、翻訳、すなわち、ヒト移植方法における使用のためのこの代替的アプローチは、非侵襲性であること、すなわち、遺伝子導入方法の使用を避けていることの利点を有し、ＧＭＰグレードの試薬が臨床使用プロトコルに適合するためにこれらの方法において使用され、そして、移植のために操作された細胞を使用することのいくつかの危険な副作用を避けるために必要な、ＤＡ線維が移植中核から出発し、宿主脳に進入する予想される時間枠に合う生化学的に作製されたＰＳＡの発現の一過性の性質を有する。
次の実施例は精製した細菌性ポリシアル酸トランスフェラーゼであるＰＳＴｎｍを使用する、移植効力を強化するためのｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンに対するＰＳＡの酵素工学を示す。
有効ではあるが、ＰＳＴ遺伝子形質移入はポリシアル酸化の期間にわたって限定的な制御を有するｈＥＳＣの遺伝的改変を必要とした。この実施例は、遺伝子送達の代わりに外来性ＰＳＴｎｍがＰＳＡを誘導したという発見（図３５を参照のこと）について説明する。図３５ＡではＰＳＴ処理されたシュワン細胞（ＳＣ）（緑色の真ん中の線）が接着時間を増加させていたが、一方、ＰＳＴｎｍにより産生されたＰＳＡは接着を阻害した。特に、（Ａ）ＰＳＴｎｍにより産生されたＰＳＡ（赤色の一番下の線）はＰＳＴの強制発現により産生されたＰＳＡ（緑色の真ん中の線）よりもさらに効果的に懸濁状態のシュワン細胞のシュワン細胞単層への接着を阻害する。（Ｂ）ＥＳＣ由来ＨＢ９運動ニューロンにおけるＰＳＡのイムノブロッティングは、ＰＳＴｎｍだけで処理された対照試料が検出不可能なＰＳＡレベルを有したことを示す。ＰＳＴｎｍ＋ＣＭＰ‐シアル酸基質とのインキュベーションにより大きなＰＳＡのバンドが生じ、そのバンドはｅｎｄｏＮ処理により除去される。（Ｃ，Ｄ）ＰＳＴ遺伝子を用いて得られる効果と同様に、分化中のＰＳＴｎｍと基質によるこれらの細胞のポリシアル酸化が神経突起伸長と細胞移動（矢頭）を強化する。（Ｅ）第３０日のｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンのＰＳＡ免疫染色。（Ｆ）この染色はＰＳＴｎｍと基質を用いる処理の後で著しく増大する。（Ｇ）ＰＳＴｎｍのみのインビボ注射は何の効果も有しないが、（Ｈ）基質とのＰＳＴｎｍの共投与はマウス線条体における大量のＰＳＡ発現を引き起こす。
従って、外部よりＰＳＴｎｍで処理された成熟ＤＡニューロンを移植のための細胞の作製に使用することが企図される。哺乳類ＰＳＴとＰＳＴｎｍの両方が化学的に同一であるＰＳＡ鎖を作製した。ｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンに対するＰＳＡの増加（図３５Ｆ）が、ＤＡ線維が移植中核から出るのに充分である数週間の間持続すべきである。ＰＳＴｎｍは移植前に除去されるので、この酵素を混入移植細胞に対する免疫原性が原因ではないはずである。
ＰＳＴｎｍは、強化された溶解性と活性の特徴を有する遺伝子操作断片から作製された（Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａ−２，８−ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｗｉｔｈ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｃｃｅｐｔｏｒｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｌｆ−ｐｒｉｍｉｎｇ ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １８， １７７〜１８６ （２００８））。ＰＳＴｎｍへの曝露、基質への曝露、又は両方への曝露の前にｈＥＳＣの培養物のＤＡニューロンへの分化誘導を行った。定量的免疫蛍光（オペレッタ）とウエスタンブロッティングによって、曝露の様々な時点（１０分から６時間）で培養物を調査してポリシアル酸化の速度とレベルを決定した。このように本明細書に記載される条件を用いて第２５日の分化したｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンを至適濃度のＰＳＴｎｍと基質と共にインキュベートする。ＰＳＡ＋ｍＤＡニューロンは本明細書及び図２９に記載される短期アッセイ及び長期アッセイにおいて移植される。
Ｅ． 脊髄損傷のための応用．ヒト患者及び本明細書に記載される戦略における究極的な使用を目標としたいくつかの試験は、軸索再生と内在性始原細胞の移動を促進するためのＰＳＴを発現するレンチウイルスベクターを直接的にＣＮＳに注入することによるＰＳＴ遺伝子送達を含むこれらの方法の広範な可能性を示した。ヒト向けの方法において使用するための１つのそのような戦略は脊髄損傷を標的とする。ある型の脊髄再生方法では、シュワン細胞移植片がインビボ軸索再生において使用される細胞架橋の再構築のための治療法の一部として使用された。しかしながら、優れた筋肉制御を含む患者の運動機能の回復はどのような治療介入にも抵抗した。本明細書において示されるように、移植に使用されるシュワン細胞でのＰＳＡ発現の強化はシュワン細胞の移動と軸索伸長の増強を引き起こし、それが運動機能上昇に対する劇的な効果をさらに引き起こした（図３０Ａ〜Ｄ）。従って、いくつかの実施形態では、脊髄損傷を有するヒトにおける移植方法において、インビトロでのシュワン細胞におけるＰＳＡ発現の上昇を利用することが考えられる。操作されたＰＳＡの発現の使用についての別の戦略であって、ヒト方法におけるＰＳＴ遺伝子の発現上昇による戦略はＨＢ９ ＥＳＣ由来運動ニューロンを必要とし、その戦略ではレンチウイルスベクターベースの遺伝子発現を介したこれらのニューロンにおけるＰＳＴ遺伝子の誘導が培養状態でも機械的に誘発された坐骨神経損傷の修復のためのマウスにおける移植後でも軸索の伸長の劇的な増大を引き起こした。後者は筋肉組織の改善された特異的な標的化を引き起こした（図３０Ｅ〜Ｈ）。従って、別の実施形態では、坐骨神経の機能回復に使用されるＥＳＣ由来運動ニューロンの表面でのＰＳＡ発現の遺伝子操作による発現。
ＩＶＸ． ＤＡニューロン移植片の安全性の上昇
本発明の細胞作製方法における使用のため、患者への健康上のリスクをさらに減少させるために考えられた実施形態が下に記載される。
本明細書に記載される方法によって作製される細胞は移植に使用されると患者への減少したリスクに関する特徴を示したが、移植細胞を受容する患者の健康に対するリスクの可能性をさらに低下させるため、さらなる実施形態が企図される。ｈＥＳＣ−ベースの細胞療法方法へのいくつかの懸念のうちの１つは、移植後の条件により患者に対する危害の原因となる細胞に発達する、分化に抵抗した混入未分化細胞を導入する可能性である。万能性細胞の場合では、１つの有害な結果は、患者の生命を危険にさらすテラトーマ形成である。ｈＥＳＣ由来細胞を使用するテラトーマ形成が突発性細胞分化に基づく短期神経分化プロトコルの後で報告された。しかしながら、本発明者らによるヒトＥＳ由来神経細胞種の使用は、それらのマウスＥＳＣ由来同等物と異なり、本発明において記載される適切な神経分化戦略（すなわち、単層培養、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコル及び増殖を促進しないサイトカインがあるなかでの増殖）の後にテラトーマ形成をほとんど引き起こさなかった。実際、過去１０年にわたって様々な神経分化戦略を用い、ヒト細胞移植片を有する数百匹の動物を分析した後でテラトーマ形成は観察されなかった。さらに、テラトーマは、移植片にヒト細胞を使用する本発明のＰＤ移植方法では観察されなかった。ヒトで用いられる移植方法のためにヒト細胞とマウス細胞を使用することの間の違いは、ヒトＥＳＣとマウスＥＳＣで獲得されている異なるステージの万能性に関連していると考えられ、ヒト細胞はＥｐｉ−ＳＣ（エピブラスト幹細胞）として記載される万能性ステージの特質に適合すると考えられており、マウスＥＳＣと異なり異なる発生ステージにある可能性がある。
しかしながら、以前の移植試験の細胞を使用する問題のうちの少なくとも１つは、成熟ＤＡニューロンと本発明の移植方法を用いると驚くほどに存在しない、Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ２００４と類似のプロトコルにおいて実在する神経過形成の継続的なリスクであった。さらに、以前の研究における移植試験において見つかった別の問題はインビボで増殖し続けるｈＥＳＣ由来神経上皮構造物（すなわち、神経ロゼット型）の形成であった。移植された神経上皮細胞のこのインビボ増殖はげっ歯類動物のパーキンソン病モデル及びハンチントン病モデルにおけるｈＥＳＣ由来ＤＡニューロン移植試験を含む様々な神経移植パラダイムにおいて観察された。それらの「神経ロゼット型」増殖細胞は、異所的な、ほとんど皮質型の組織から構成される大移植片を移植動物に生じさせる固有の高い増殖能を有する非形質転換初代細胞を表す。本明細書に記載されるように、いくつかの戦略が移植の時点で万能性細胞又は神経上皮細胞の混入を排除するために用いられた（例えば、ＳＳＥＡ‐４（万能性マーカー）又はＦｏｒｓｅ‐１（神経上皮マーカー）の選択）。ロゼット系の分化戦略が用いられたときにこれらの戦略の成功は部分的であり、神経過形成はそれでもＦｏｒｓｅ１について選別された移植片又はＳＳＥＡ‐４について負に選別された移植片のサブセットで観察された。驚くことに、ロゼット系ＤＡニューロン分化方法の発生よりもむしろこの底板系ＤＡニューロン分化方法の発生を用いて神経上皮過形成の問題が克服された。機能性ｈＥＳＣ底板由来ＤＡニューロン移植片内では移植片由来の増殖細胞はほとんど観察されなかった。
他の移植方法の不利な結果に基づくと、ヒトへＤＡニューロン移植を用いることの別の安全性の懸念は、移植治験において胎児組織を受容する患者の約１５％で観察される移植片誘導性ジスキネジア（ＧＩＤ）の発生などの、その治療法の副作用である。しかしながら、本明細書において考察されるように、望ましくない細胞種をさらに除去する可能性を有するより一貫した細胞供給源を使用することに加えて移植片由来セロトニン系細胞がほぼ完全に存在しないこと（図２８に関連する本文を参照のこと）、及びインビボＤＡ線維分布を制御する可能性があること（図２９を参照のこと；すなわち、Ｌ‐ドーパ及び他の化合物を分泌するニューロンクラスターの「ホットスポット」を防止する）が、移植方法において使用される細胞を供給するために他の方法よりも本発明の方法を用いることの大きい利点である。従って、本発明の方法の使用が患者に対するリスクを最小化すると考えられる。
ＶＸ． 臨床的転移術のためのヒトＥＳＣの使用
好ましい実施形態では、ヒトにおける移植方法、言い換えると、ＰＤの治療のための細胞療法のために細胞を作製し、使用するための方法にヒトＥＳＣを使用することが考えられる。特に、本発明の方法においてヒトＥＳＣはヒトｉＰＳＣの使用よりも多数の利点を有し、一例ではＰＤ細胞療法として使用される移植可能中脳ＤＡニューロンの供給に使用される。特に、ＤＡニューロン誘導のための細胞供給源としての人工万能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の使用は、各患者にとって遺伝的に適合した細胞供給源を供給することなど、いくつかの利点を有する。しかしながら、多数の近年の研究により、ｉＰＳＣの安全性と完全な遺伝的適合性に関する不確実性が生み出された。再プログラム化細胞は、臨床的利用に望ましくない危険な可能性がある遺伝的異常及びエピジェネティックな異常を有することが示されている。さらに、マウスｉＰＳＣにおける研究は、ｉＰＳＣ由来細胞が、それらの細胞のヒト移植における使用を後押しする主要な言い分である、完全に免疫適合性であるわけではないことを示した。さらに、移植にｉＰＳＣを使用するＦＤＡが認可した方法は存在しない。そして、それぞれ個々の患者のためにＧＭＰに準拠し、ＱＣ管理された細胞バンクを作製することを考えることは実際的ではないし、桁違いの費用がかかるだろう。比較すると、ｈＥＳＣと比べたｈｉＰＳＣの遺伝的安定性が集中的に研究された。ｈＥＳＣは培養状態で時間が経つにつれ変異を獲得することが観察されたが、そのような変異のタイミングと率はｈｉＰＳＣとは異なるように見え、ｈＥＳＣは概してｉＰＳＣよりも遺伝的に安定していると考えられた。例えば、Ｈｕｓｓｅｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４７１， ５８〜６２ （２０１１）； Ｍａｙｓｈａｒ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ７， ５２１〜５３１ （２０１０）； Ｌｉｓｔｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４７１， ６８−７３ （２０１１）； Ｌａｕｒｅｎｔ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８， １０６〜１１８ （２０１１）を参照のこと。加えて、細胞療法製品及び遺伝子療法製品についてＦＤＡによって要求される厳密な安全性試験を満足させるいくつかのｈＥＳＣ株について標準操作手順が考え出された。ＦＤＡはｈＥＳＣ−ベースの細胞療法を臨床使用に進めるように米国の２つのグループに認可した。例えば、ゲロン（Ｇｅｒｏｎ）社はｈＥＳＣ由来乏突起膠細胞前駆細胞（ＧＲＮＯＰＣ１）を用いる第Ｉ相試験に入っていた。アドバンスド・セル・テクノロジー（ＡＣＴ）社はシュタルガルト黄斑ジストロフィー（治験番号ＮＣＴ０１３４５００６）及び乾燥進行性加齢黄斑変性（治験番号ＮＣＴ０１３４４９９３）を治療するためにｈＥＳＣ由来網膜色素上皮細胞を使用する、現在行われている２つの第Ｉ相／ＩＩ相試験を有する。
そして、それらのＦＤＡ認可ｈＥＳＣベースの臨床治験の両方が神経系障害を標的としているという事実が、神経系疾患と損傷を治療するための移植材料を提供するためにｈＥＳＣベースの方法を用いることの利点を示す。神経系は、外来性組織（同種移植片）が末梢に配置された同じ移植片と比べられると弱い免疫応答を発するので、免疫特権部位と考えられている。実際、２５年間の胎児細胞のヒト脳への移植の後、いくらかの異質遺伝子的ニューロンが一過性の免疫抑制によりヒトの脳の中で最大１６年間生存することが分かった。従って、細胞供給源と移植片受容者の間の同一の抗原適合は必須ではないように見える。従って、ｈＥＳＣは他の神経系疾患、障害及び損傷に加えてＰＤを治療するためのＤＡニューロンの普遍的な異質遺伝子的供給源として考えられる。本発明の細胞を受容する患者はＰＤの臨床的診断を有すると考えられる。初期介入において、及び、レボドパなどの利用可能な薬物療法、補助的薬物療法等による症状制御が不充分である患者を含む中程度から重症のＰＤにおいて真正ＤＡニューロン移植片を使用することが考えられる。いくつかの実施形態では、ニューロン移植片を受容すると考えられる患者は初期ＰＤにおいてわずかな兆候を有する（例えば、ドーパミン系の欠陥を検出するための神経画像法、ＦＤＧ‐ＰＥＴ、及びジスキネジアの兆候等の使用による）。統合ジスキネジア評価尺度（ＵＤｙｓＲＳ）（Ｇｏｅｔｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ． ２３， ２３９８〜２４０３ （２００８））によって評価されるジスキネジアを患者の移植前後のモニタリングにおいて使用することが考えられる。患者は「ドーパミン系欠陥の証拠が無い状態でのスキャン」（ＳＷＥＤＤＳ）を有することもあり得、それらのうちの何人かは筋緊張異常又は本態性振戦を有することがあり得る。パーキンソン症に対する他の（非ドーパ）寄与因子を有する患者を特定するために脳ＭＲＩが行われるだろう。いくつかの実施形態では、患者はレボドパに対して正の応答を有するだろう。移植前及び移植後のパラメーター、及び運動評価、非運動評価、生活の質などの対象モニタリングのエンドポイントの決定、並びにまた神経画像法及び他の生体マーカーの使用。運動機能：ＵＰＤＲＳ及び新規に検証されたＭＤＳ‐ＵＰＤＲＳ（Ｇｏｅｔｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ． ２３， ２１２９〜２１７０ （２００８））はＰＤの運動症状を評価するために広く使用されている。しかしながら、１０ｍ歩行試験又は６分歩行試験、タイムドアップ・アンド・ゴー（ｔｉｍｅｄ ｕｐ ａｎｄ ｇｏ）テスト、機能的歩調評価、機能的リーチテスト、及び他のものを含む他の試験がより患者指向性の結果判定法に考えられる。患者は「オフ」状態並びに「オン」状態で試験され、そして、評価尺度は検証済みウェアリングオフ尺度（Ａｎｔｏｎｉｎｉ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ． ２６， ２１６９〜２１７５ （２０１１））及びジスキネジア評価尺度（例えばＵｄｙｓＲＳ（Ｇｏｅｔｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ． ２３， ２３９８〜２４０３ （２００８））の臨床測定特性に基づいて、（例えば運動障害疾患学会の勧告に従う）「オフ」時の間に含まれるだろう。「オン」状態と「オフ」状態の両方で標準化された患者の診察をビデオテープに撮ることが考えられる。非運動機能：処置は移植前後の認知、鬱、不安感、無気力、眠気、疲労感、精神病、及び他の非運動症状の対処に加えて認知機能の転帰、精神病理についての転帰及び自律神経障害を主に標的とする。生活の質：ＰＤ特異的質問集（ＰＤ‐ＱＵＡＬＩＦ）及び／又はＳＦ‐３６などの検証済みの生活の質についての尺度が患者の転帰をモニターすると考えらえる。
神経画像法及び他の生体マーカー：機能画像法は外科的ＰＤ治験において広く用いられた。ドーパミンベースの画像法（例えば、ＦＤＯＰＡ‐ＰＥＴ）を移植片維持の調査に使用することが考えられるが、予備的なデータ収集として画像法ベースのマーカー、例えば炎症標的化、及び非画像法全身性マーカーを含む他のリガンドを使用する神経画像法技術を使用することが考えられる。画像法は手術前計画，例えば、基底核内のＤＡ除去の程度と位置の計画、及びそれぞれの患者の外科手術計画の調整におけるＰＥＴデータの援用において使用されるだろう。移植片配置の位置と細胞供託物の数。いくつかの実施形態では、被殻（Ｆｒｅｅｄ， ｅｔ ａｌ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４４， ７１０〜７１９ （２００１）； Ｌｉｎｄｖａｌｌ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８２， ７２９〜７３４ （１９９０））及び交連後被殻（Ｏｌａｎｏｗ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ５４， ４０３〜４１４ （２００３））が細胞移植（投与）部位である。いくつかの実施形態では、様々な手術痕を介した複数の配置が考えられる。リアルタイム画像法及び軌跡経路と標的化の正確性の画像化をもたらすクリアポイントシステム付きのＭＲＩが移植された細胞のモニタリングのために考えられる。このシステムはＰＤ患者において脳深部刺激用電極の配置に使用される。移植片の細胞数と構成。多数の細胞種を有する胎児移植片材料を使用したので基本的に不明の数のＤＡニューロンを用いて胎児治験が実施された。本明細書において提供されるデータによると、ＤＡ神経機能の回復のために推定１００，０００〜２００，０００個の生存ＴＨ＋ニューロンが考えられる。
免疫抑制．いくつかの実施形態では、移植された患者の免疫抑制が少なくとも６か月で最大で患者の寿命まで考えられる。いくつかの実施形態では、患者は移植された組織を有するうえで免疫抑制を受けない。
実施例
以下の実施例は本発明のある特定の実施形態と態様の例示に役立ち、そして、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。以下の実験の開示では、次の略語を適用する：Ｎ（規定）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｐｍｏｌ（ピコモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｐｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；ｐｇ（ｐｉｃｏグラム）；Ｌａｎｄ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（ユニット）；ｍｉｎ（分）；ｓ及びｓｅｃ（秒）；ｄｅｇ（度）；ｐｅｎ（ペニシリン）、ｓｔｒｅｐ（ストレプトマイシン）及び℃（セルシウス度）。
材料と方法
方法の概要：ヒトＥＳＣ（Ｈ９、Ｈ１）及びｉＰＳＣ株（２Ｃ６及びＳｅＶ６）を改変二重ＳＭＡＤ阻害（Ｃｈａｍｂｅｒｓ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２７：２７５〜２８０ （２００９）、参照により本明細書中に援用）ベース底板誘導（Ｆａｓａｎｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６：３３６〜３４７ （２０１０）、参照により本明細書中に援用）プロトコルの対象とした。中脳底板のため、及びＤＡニューロンの新規集団の産出のためにＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ、パルモルファミン、ＦＧＦ８及びＣＨＩＲ９９０２１への曝露を最適化した（図１ｄを参照のこと）。底板誘導後、ＡＡ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦβ３及びｄｂｃＡＭＰなどのＤＡニューロン生存及び成熟因子（Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：１２５４３〜８ （２００４）、参照により本明細書中に援用）の存在下でＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７系の分化培地でさらなる成熟（第１１〜２５日、又は２５日より長く培養状態であり、最大で少なくとも１００日培養状態である）を実施した（詳細について方法全体を参照のこと）。結果生じるＤＡニューロン集団を免疫細胞化学、ｑＲＴ‐ＰＣＲ、包括的遺伝子発現プロファイリング、ドーパミンの検出のためのＨＰＬＣ分析及びインビトロ電気生理学的レコーディングによる詳細な表現型特徴解析の対象とした。半身パーキンソン症げっ歯類動物（動物の脳の一方の側に６ＯＨＤＡ毒素を注入したマウス又はラット）でインビボ試験を実施した。６‐ヒドロキシドーパミン傷害を前に記載されたようにその毒素の定位的注入により受けた成体ＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃマウス（ジャクソン・ラブズ社）及び成体スプレイグ・ダウリー・ラット（タコニック・ファームス社）、並びにＭＰＴＰの片側のみの頸動脈注射により処置された２匹の成体アカゲザルにおいてそれらの試験を実施した。ＤＡニューロンはそれらの動物の線条体中に定位的に注入され（マウスでは１５０×１０3細胞、ラットでは２５０×１０3細胞）、そして、サルでは総計７．５×１０6細胞（６路に供給；脳の各側に３路）。アンフェタミン介在性回転分析並びに焦点性無動症及び四肢使用についての試験（「ステッピング試験」及び「円筒試験」）を含む行動アッセイを移植後に月単位の間隔で実施した。ラットとマウスを移植後の１８〜２０週間で、及びそれらの霊長類動物を移植後の１か月で殺処理した。それらの移植片の特徴解析を細胞数と移植片体積の立体解析学的分析により、並びに表現型の包括的特徴解析を免疫組織化学により実施した。未分化ヒトＥＳ細胞の培養．ｈＥＳＣ株Ｈ９（ＷＡ‐０９、ＸＸ、２００９年１０月の時点より２７〜５５継代）、Ｈ１（ＷＡ‐０１、ＸＹ、２０１０年６月の時点より３０〜４０継代）並びにｉＰＳ細胞株２Ｃ６（Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：６９５〜７０６（２０１１）、参照により本明細書中に援用）（ＸＹ、２０〜３０継代）及びＳｅＶ６（ＸＹ、２０〜３０継代；非挿入性４因子センダイ・ベクター・システム（Ｂａｎ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ（２０１１）１０８（３４）：１４２３４〜１４２３９：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１０３５０９１０８、参照により本明細書中に援用）を使用するＭＲＣ‐５胚性線維芽細胞由来）を、ヒトＥＳ細胞に基づいてｃｍ2当たり０．５×１０3個からｃｍ2当たり１００×１０3個までの範囲に推定される播種濃度で、至適２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ、インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）含有ヒトＥＳ細胞培地（前に記載された（Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：６９５〜７０６ （２０１１）、参照により本明細書中に援用）において細胞をクラスター化する傾向があるマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ、グローバル・ステム社、メリーランド州、ロックビル）上に維持した。ノックアウト血清代替物の使用は０％から４０％までの範囲にあり得る。
神経誘導．底板系中脳ドーパミンニューロン誘導のため、改変型の二重ＳＭＡＤ阻害（Ｃｈａｍｂｅｒｓ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２７：２７５〜２８０ （２００９）、参照により本明細書中に援用）及び底板誘導（Ｆａｓａｎｏ， ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６：３３６〜３４７ （２０１０）、参照により本明細書中に援用）プロトコルが、ＬＤＮ‐１９３１８９（１００ｎＭ（０．５〜５０μＭまでの濃度範囲、ステムジェント社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ（０．５〜５０μＭまでの濃度範囲、トクリス社、ミシガン州、エリスビル）、ＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ（１００ｎｇ／ｍｌ（１０〜２０００ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲、Ｒ＆Ｄ社、ミネソタ州、ミネアポリス）、パルモルファミン（２μＭ（１０〜５００ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲、ステムジェント社）、ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ（１０〜５００ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲、Ｒ＆Ｄ社）及びＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ；３μＭ（０．１〜１０ｕＭまでの濃度範囲、ステムジェント社）への指定時刻に作動する曝露に基づいて用いられた。注記：底板誘導プロトコルについて、「ＳＨＨ」処理は１００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ＋パルモルファミン（２μＭ）の組合せへの細胞の曝露、すなわち接触を指す。細胞を播種し（３５〜４０×１０3細胞／ｃｍ2）、ＤＭＥＭ含有ノックアウト血清代替物培地（ＫＳＲ）（１５％ノックアウト血清代替物、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン及び１０μＭ（１〜２５μＭまでの濃度範囲）β‐メルカプトエタノール）中のマトリゲル又はゲルトレックス（購入して使用）（ＢＤ社、ニュージャージー州、フランクリン・レイクス）上で１１日間培養した。前に記載された（Ｃｈａｍｂｅｒｓ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２７：２７５〜２８０ （２００９）、参照により本明細書中に援用）ように、分化第５日から開始して、第５〜６日に７５％（ＫＳＲ）：２５％（Ｎ２）の比率で、第７〜８日に５０％（ＫＳＲ）：５０％（Ｎ２）の比率で、そして、第９〜１０日に２５％（ＫＳＲ）：７５％（Ｎ２）の比率で混合することによってＫＳＲ培地を徐々にＮ２培地に転じていった。ＣＨＩＲを添加され（第１３日まで）、且つ、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子、５〜１００までの範囲の２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ社）、アスコルビン酸（ＡＡ；０．２ｍＭ（０．０１〜１ｍＭまでの濃度範囲）、シグマ社、ミシガン州、セントルイス）、ＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ（１〜２００ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲）；Ｒ＆Ｄ社）、ＴＧＦβ３（トランスフォーミング増殖因子タイプβ３、１ｎｇ／ｍｌ（０．１〜２５ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲）；Ｒ＆Ｄ社）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．５ｍＭ（０．０５〜２ｍＭまでの濃度範囲）；シグマ社）、及びＤＡＰＴ（１０ｎＭ（０．５〜５０ｎＭまでの濃度範囲）；トクリス社）を添加されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地／Ｂ２７培地（１：５０希釈）／Ｌ‐グルタミン（０．２〜２ｍＭの有効範囲））含有培地（ＮＢ／Ｂ２７；インビトロジェン社）に培地を第１１日から９日間変更した。第２０日にアキュラーゼ（登録商標）（イノベーティブ・セル・テクノロジー社、カリフォルニア州、サンディエゴ）を使用して細胞を解離させ、そして、所与の実験にとって所望の成熟段階まで分化培地（ＮＢ／Ｂ２７＋ＢＤＮＦ、ＡＡ、ＧＤＮＦ、（本明細書に記載される濃度範囲の）ｄｂｃＡＭＰ、ＴＧＦβ３及び（本明細書に記載される濃度範囲の）ＤＡＰＴ）中において、１５μｇ／ｍｌ（１〜５０μｇ／ｍｌまでの濃度範囲）のポリオルニチン（ＰＯ）／ラミニン（１μｇ／ｍｌ）（０．１〜１０μｇ／ｍｌまでの濃度範囲）／フィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ（０．１〜２０μｇ／ｍｌまでの濃度範囲）で事前に被覆されたディッシュに高細胞密度条件（例えば、３００から４００ｋ細胞／ｃｍ2）で再播種した。
ロゼット系ＤＡニューロン誘導について、最初の神経誘導ステップを促進するために二重ＳＭＡＤ阻害を用いたことを少なくとも１つの例外として、以前に記載されたプロトコル（Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：１２５４３〜８ （２００４）、参照により本明細書に援用）に部分的に従った。簡単に説明すると、分化第２〜８日までＳＢ４３１５４２とノギン（２５０ｎｇ／ｍｌ（１０〜１０００ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲）；Ｒ＆Ｄ社）、及び第６〜１１日までＳＨＨ＋ＦＧＦ８を添加したＫＳＲ中において放射線照射ＭＳ５細胞と共培養することによって、ｈＥＳＣを神経運命に向かって誘導した。１１日後にＫＳＲ中で神経ロゼットを手作業で単離し、そして、ＳＨＨ、ＦＧＦ８、ＢＤＮＦ及びＡＡを添加されたＮ２培地中で、前に記載された（Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：１２５４３〜８ （２００４）、参照により本明細書中に援用）ように培養した（Ｐ１期）。Ｐ１期の５〜７日後、ロゼットを機械的に再度回収し、そして、１時間の無Ｃａ2／Ｍｇ2ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中でのインキュベーション後に研和し、そして、ポリオルニチン（ＰＯ）／ラミニン／フィブロネクチン被覆プレート上に再播種した。ＳＨＨ／ＦＧＦ８を使用するパターン形成をＰ２期において７日間継続し、所与の実験にとって所望の成熟段階まで（通常、移植試験には５〜７日又はインビトロ機能試験には３２日）上に記載されたようにＢＤＮＦ、ＡＡ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦｂ３及びｄｂｃＡＭＰの存在下での最終分化が続いた。
遺伝子発現分析．対照ＬＳＢ、ＬＳＢ／ＳＨＨ／ＦＧＦ８及びＬＳＢ／ＳＨＨ／ＦＧＦ８／ＣＨＩＲの各条件からＲＮｅａｓｙキット（キアジェン社、カリフォルニア州、バレンシア）を使用して分化中の第０日、第１日、第３日、第５日、第７日、第９日、第１１日、第１３日、及び第２５日に全ＲＮＡを抽出した。マイクロアレイ分析について、ＭＳＫＣＣゲノム・コア施設が全ＲＮＡを処理し、イルミナ・ヒト参照１２ビーズアレイに製造業者の明細書に従ってハイブリダイズさせた。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）のＬＩＭＭＡパッケージを使用して各日及び各条件の間で比較を実施した。０．０５未満の調整済みＰ値と２よりも大きい変化倍率を有することが分かった遺伝子が有意であると見なされた。市販のソフトウェアパッケージ（Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（第６．１０．０９１５版））を使用して説明的なマイクロアレイデータ分析と提示のいくつかを実施した。ｑＲＴ‐ＰＣＲ分析について、各条件の第２５日における全ＲＮＡを逆転写し（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｈ、キアジェン社）、そして、市販のＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（アプライド・バイオシステムズ社、カリフォルニア州、カールスバッド）を使用して増幅された物質を検出し、ＨＰＲＴに対してそのデータを正規化した。各データポイントは３つの独立した生物試料からの９回の技術複製を表す。マイクロアレイ試験の生データは未だＧＥＯ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ）において利用可能ではない。動物の外科手術．げっ歯類動物及びサルに対する手技はＮＩＨのガイドラインに従って実施されており、そして、地域の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）、バイオセイフティ委員会（ＩＢＣ）、並びに胚性幹細胞研究委員会（ＥＳＣＲＯ）により承認された。
マウス．ＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌルマウス（２０〜３５ｇの体重；ジャクソン・ラボラトリー社、メーン州、バーハーバー）をケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ；アコーン社、イリノイ州、ディケーター）とキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ、アイオワ州、フォート・ドッジ）で麻酔した。６‐ヒドロキシドーパミン（１０μｇ（０．１〜２０μｇまでの濃度範囲）６‐ＯＨＤＡ（シグマ・アルドリッチ社）を次の座標（ミリメートル単位）で線条体に定位的に注入した：ＡＰ、０．５（定位的外科手術の基準として用いられる頭蓋縫合、すなわち、ブレグマより）；ＭＬ、−２．０；ＤＶ、−３．０（基準として用いられる脳を包み込む膜である硬膜より）。上出来な病変を有するマウス（平均で６回転超／分）を移植用に選択した。総計で１５０×１０3細胞を１．５μｌの体積で、次の座標（ｍｍ単位）で線条体に注入した：ＡＰ、０．５；ＭＬ、−１．８；ＤＶ、３．２。マウスを移植後１８週間で殺処理した。
ラット．成体雌スプレイグ・ダウリー（タコニック社、ニューヨーク州、ハドソン）ラット（１８０〜２３０ｇ）をケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。片側のみの内側前脳束の黒質線条体経路の病変を、２か所（Ｓｔｕｄｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １：２９０〜２９５ （１９９８）、参照により本明細書中に援用）での６‐ＯＨＤＡ（０．２％アスコルビン酸及び０．９％生理食塩水（シグマ社）中の３．６ｍｇ／ｍｌ）の定位的注入により確立した。注入後６〜８週間までにアンフェタミン誘導性回転が６回転／分を超えた場合、移植用にラットを選択した。２５０×１０３細胞を各動物の線条体に移植した（座標：ＡＰ＋１．０ｍｍ、ＭＬ−２．５ｍｍ及びＶ−４．７ｍｍ；−２．５のこぎ歯セット）。対照ラットは代わりにＰＢＳを受容した。外科的手技は前に記載された（Ｓｔｕｄｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １：２９０〜２９５ （１９９８）、参照により本明細書中に援用）。毎日の１５ｍｇ／ｋｇのシクロスポリン（ベッドフォード・ラブズ社、オハイオ州、ベッドフォード）の腹腔内注射を細胞移植の２４時間前に開始し、そして、細胞移植から２０週間後の殺処理まで継続した。
霊長類動物．両側性のパーキンソン症候群をもたらす頸動脈ＭＰＴＰ投与とそれに続く毎週の静脈内ＭＰＴＰ投与（Ｋｏｒｄｏｗｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：７６７〜７７３ （２０００）、参照により本明細書中に援用）により２匹の成体（１７〜１８歳；１０〜１２ｋｇ；雌）アカゲザルを半身性パーキンソン症にした。両方の動物が、猫背、跛行及び硬直性症状（運動の硬直性）、空間無視（片側への刺激に対する運動的アウェアネス）及び運動緩慢（動作緩慢の開始）を含む行動分析に基づいて中程度から重症の病変に適合するパーキンソン病の症状を示した。改変パーキンソン病臨床評価尺度（ＣＲＳ）を用いてこれらのパラメーターをサルにおいて評価することができる。移植手術の日に動物をケタミン（３．０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）とデクスドミター（０．０２〜０．０４ｍｇ／ｋｇ筋肉内）で鎮静化し、安定した気道を維持するために挿管し、そして、イソフルランで麻酔した。次に外科手術のためにそれらの動物を定位枠に設置した。両方のアカゲザルが定位的座標（Ｐａｘｉｎｏｓ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｒｈｅｓｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、参照により本明細書中に援用）に基づくヒト底板由来ＤＡ培養物の３回の頭蓋内注入による単回の外科手術を受けた。細胞の両側性注入（１０ｕｌ／注入；１２５，０００細胞／ｕｌ）を総計で半球当たり３０μｌの体積になるように３つの部位（１つは後方尾状核、２つは交連前被殻と覆っている白質）に実施した。定位的顕微操作装置に取り付けられた点滴ポンプを利用して１μｌ／分の速度で２８Ｇの針を付けた５０μｌのハミルトン注射筒から細胞を送達した。注入の完了後、その針をさらに２〜５分間その場所に留めて点滴物を針の先端から拡散させた後に注射筒をゆっくりと引き抜いた。外科手術直後から術後７２時間まで動物は鎮痛薬（ブプレネックス（ｂｕｐｒｅｎｅｘ）、０．０１ｍｇ／ｋｇ筋肉内、術後７２時間の間に１日２回；メロキシカム、０．１ｍｇ／ｋｇ皮下、術後７２時間の間に１日１回）並びに抗生物質（セファゾリン（ｃｅｐｈａｚｏｌｉｎ）、２５ｍｇ／ｋｇ筋肉内、１日２回）を受容した。それらの動物はシクロスポリンＡ（ネオラール、サンディミュン）を外科手術の４８時間前に開始して移植から１か月後の殺処理まで経口的に（３０ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇまで徐々に減量して）受容した。
行動アッセイ．アンフェタミン誘導性回転（マウス及びラット）とステッピング試験（ラット）を移植前と移植後４週間、８週間、１２週間、１８週間に実施した。マウスにおける回転行動はｄ‐アンフェタミン（１０ｍｇ／ｋｇ、シグマ社）の腹腔内注射から１０分後に記録され、３０分間記録された。ラットにおける回転行動はｄ‐アンフェタミン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射から４０分後に記録され、そして、ＴＳＥ ＶｉｄｅｏＭｏｔ２システム（ドイツ）により自動的に評価された。データが分当たりの平均回転数として提示された。ステッピング試験は、Ｂｌｕｍｅ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２１９：２０８〜２１１ （２００９）及びＣｒａｗｌｅｙ， ｅｔ ａｌ． Ｗｈａｔ’ｓ Ｗｒｏｎｇ Ｗｉｔｈ Ｍｙ Ｍｏｕｓｅ： Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｉｃｅ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， ２０００）（それらの全てを参照により本明細書中に援用）から改変された。簡単に説明すると、各ラットを平面に配置し、尾をそっと持ち上げることによってそのラットの後肢を引き上げて前足だけをテーブルに接触させた。実験者が一定の速度でラットを後方に１メートル引きずった。対側性と同側性の前足の両方の順応性のステップの数を計数した。データは、対側性の順応ステップ／（対側性＋同側性の順応ステップ）のパーセンテージとして提示された。円筒試験は、前に記載されたように（Ｔａｂａｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １４：３７９〜３８１ （２００８）、参照により本明細書中に援用）各動物をガラスの円筒中に配置し、その円筒の壁への（２０回の接触のうちの）同側性と対側性の足の接触の回数を計数することによって実施された。組織処理．マウス及びラット：動物（マウス及びラット）は深麻酔の誘導のために過剰用量のペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に受容し、そして、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で潅流された。脳を摘出し、４％のＰＦＡ中で後固定し、その後、３０％のショ糖溶液中に２〜５日間浸漬した。Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（サクラ・ファインテック社、カリフォルニア州、トーランス）中に包埋した後、それらの脳をクライオスタットで切片にした。
霊長類動物：動物を、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内（ＩＭ））とペントバルビタール（２５ｍｇ／ｋｇ、静脈内（ＩＶ））による深麻酔下でヘパリン処置０．９％生理食塩水とそれに続く冷４％ＰＦＡ固定液（ｐＨ７．４）を用いる頸動脈潅流により殺処理した。一次固定の直後に脳を頭骨から取り出し、４％ＰＦＡ中に浮かせて２４〜３６時間後固定した。次にそれらの脳を濯ぎ、４℃で低速振盪器上の１０％ショ糖中に再浮遊させ、そして、「沈めて」おいた。その後、その処理を２０％ショ糖、続いて３０％ショ糖で反復した。脳全体を凍結滑走式ミクロトーム上で４０ｕｍの連続切片に冠状に切断し、そして、−２０℃の凍結保存媒体中に浮かせて貯蔵した。
免疫組織化学：細胞を４％ＰＦＡ中で固定し、０．３％トリトンを含む１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロックした。脳組織切片を冷ＰＢＳ中で洗浄し、そして、同様に処理した。一次抗体を１〜５％のＢＳＡ又は通常ヤギ血清に希釈し、そして、製造業者の推奨に従ってインキュベートした。抗体と供給業者の包括的なリストが表６として提供されている。適切なＡｌｅｘａ４８８複合体化、Ａｌｅｘａ５５５複合体化及びＡｌｅｘａ６４７複合体化二次抗体（モレキュラー・プローブス社、カリフォルニア州、カールスバッド）を４’、６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＮ）細胞核対比染色液（サーモ・フィッシャー社、イリノイ州、ロックフォード）と共に使用した。いくつかの分析について、ビオチン化二次抗体を使用し、続いてＤＡＢ（３，３’‐ジアミノベンジジン）色素原による視覚化を行った。ＨＰＬＣ分析．ドーパミン、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）及びＤＯＰＡＣ（３，４‐ジヒドロキシ‐フェニル酢酸）のレベルを測定するための電気化学的検出を用いる逆相ＨＰＬＣを前に記載されたように（Ｒｏｙ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １２：１２５９〜１２６８ （２００６）； Ｓｔｕｄｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｕｌｌ． ４１：１４３〜１５０ （１９９６）、それらの全てを参照により本明細書中に援用）実施した。培養試料を分化第６５日に過塩素酸中に収集した。いくつかの実験について、同じ検出系を用いて、しかし、前に記載されたような（Ｓｔｕｄｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｕｌｌ． ４１：１４３〜１５０ （１９９６）、参照により本明細書中に援用）市販のキットを用いるドーパミンとその代謝物のアルミニウム抽出の後にＤＡを媒体中で直接測定した。電気生理学的レコーディング：４０倍の水浸対物レンズを装着した正立顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００ＦＮ；ニコン）上のレコーディング・チャンバーに培養物を移し、ｍＭ単位で次のものを含有する生理食塩水で培養物を潅流した：１２５ＮａＣｌ、２．５ＫＣｌ、２５ＮａＨＣＯ3、１．２５ＮａＨ2ＰＯ4、２ＣａＣｌ、１ＭｇＣｌ2、及び２５グルコース（３４℃；９５％Ｏ2・５％ＣＯ2で飽和；ｐＨ７．４；２９８ｍＯｓｍ／Ｌ）。生理食塩水の流速は２〜３ｍｌ／分であり、インライン・ヒーター（ＴＣ‐３２４Ｂ制御器付きのＳＨ‐２７Ｂ；ワーナー・インスツルメンツ社）を通過した。冷却ＣＣＤデジタルカメラ（フォトメトリクス社のＣｏｏｌＳＮＡＰ ＥＳ2、ローパー・サイエンティフィック社、アリゾナ州、ツーソン）を取り付けたビデオ顕微鏡法によりニューロンを視覚化した。電気生理学的レコーディングのために選択した細胞は細かい分岐した神経突起を有するニューロン様形態を有した。ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ７００Ｂ増幅器（モレキュラー・デバイス社）を用いて電流固定設定の体細胞ホールセル・パッチクランプ・レコーディングを実施した。シグナルを１〜４ｋＨｚについてフィルターにかけ、そして、５〜２０ｋＨｚについてＤｉｇｉｄａｔａ１４４０Ａ（モレキュラー・デバイス社）を使用してデジタル化した。レコーディングパッチ電極はフレイミング・ブラウン・ガラス電極作製器（Ｐ‐９７、サッター・インスツルメンツ社）上で引っ張られてフィラメント化ボロケイ酸ガラス（サッター・インスツルメンツ社）から作製され、そして、槽中で４〜６ＭΩの抵抗を有した。電極はｍＭ単位で次のものを含有する内部溶液で満たされた：１３５Ｋ‐ＭｅＳＯ4、５ＫＣｌ、５ＨＥＰＥＳ、０．２５ＥＧＴＡ、１０ホスホクレアチン（ｐｈｏｓｐｈｏｃｒｏｅａｔｉｎｅ）‐ジ（トリス）、２ＡＴＰ‐Ｍｇ、及び０．５ＧＴＰ‐Ｎａ（ｐＨ７．３、浸透圧を２９０〜３００ｍＯｓｍ／Ｌに調節）。電極の抵抗を補正するために増幅器ブリッジ回路を調節し、そして、モニターした。電極の静電容量が補正された。レコーディング中に直列抵抗が２０％超増加したときは、増加した抵抗がレコーディング中の部分的な技術的故障を示唆したので、そのデータを廃棄した。
細胞計数と立体解析学的解析．底板期（第１１日）図１、中脳ドーパミンニューロン前駆細胞期（第２５日）、図２及び成熟ＤＡニューロン期（第５０日以降）図３及び１１におけるマーカー陽性細胞のパーセンテージを３回ずつの独立した実験から得られた試料において決定した。定量用の画像を画一的で無作為的な方法で選択し、そして、各画像にまずＤＡＰＩ陽性細胞核の数について点数を付け、続いて目的のマーカーを発現する細胞の数を計数した。データは平均値±ＳＥＭとして提示されている。移植片内のヒト細胞（抗ｈＮＡで同定された）とＴＨ＋ニューロンの定量を、移植片が確認できる１０枚ごとの切片について実施した。前にＴａｂａｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３：６０１〜６０６ （２００５）（参照により本明細書中に援用）において記載されたように、光学分画器のプローブとステレオ・インベスティゲーター・ソフトウェア（ＭＢＦバイオサイエンス社、バーモント州）を使用するカバリエリ推定量を使用して細胞数と移植片体積を決定した。データは推定された総細胞数と総移植片体積±標準誤差（ＳＥＭ）として提示されている。
次の処方は本発明の実施形態の開発のために使用された例となる細胞培養培地を説明する。
維持用ｈＥＳＣ培地（１リットル）：８００ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２、２００ｍＬのノックアウト血清代替物、５ｍＬの２００ｍＭ Ｌ‐グルタミン、５ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０ｍＬの１０ｍＭ ＭＥＭ最小非必須１５アミノ酸溶液、５５μＭの１３‐メルカプトエタノール、及びｂＦＧＦ（最終濃度は４ｎｇ／ｍＬである）。
ｈＥＳＣ分化用ＫＳＲ培地（１リットル）：８２０ｍＬのノックアウトＤＭＥＭ、１５０ｍＬのノックアウト血清代替物、１０ｍＬの２００ｍＭ Ｌ‐グルタミン、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０ｍＬの１０ｍＭ ＭＥＭ、及び５５μＭの１３‐メルカプトエタノール。
ｈＥＳＣ分化用Ｎ２培地（１リットル）：ＤＭＥＭ／Ｆ１２粉末と９８５ｍｌの蒸留水、１．５５ｇのグルコース（シグマ社、カタログ番号Ｇ７０２１）、２．００ｇの炭酸水素ナトリウム（シグマ社、カタログ番号Ｓ５７６１）、プトレシン（１００ｍＬの蒸留水に溶解した１．６１ｇのうちの１００ｕＬのアリコット；シグマ社、カタログ番号Ｐ５７８０）、プロゲステロン（１００ｍＬの１００％エタノールに溶解した０．０３２ｇのうちの２０ｕＬのアリコット；シグマ社、カタログ番号Ｐ８７８３）、亜セレン酸ナトリウム（蒸留水中の０．５ｍＭ溶液の６０ｕＬのアリコット；バイオショップ・カナダ社、カタログ番号ＳＥＬ８８８）、及び１００ｍｇのトランスフェリン（セリアンス（Ｃｅｌｌｉａｎｃｅ）／ミリポア社、カタログ番号４４５２−０１）、及び１０ｍＬの５ｍＭ ＮａＯＨ中の２５ｍｇのインスリン（シグマ社、カタログ番号１６６３４）。
ＰＭＥＦ（（初代マウス胚線維芽細胞（ＰＭＥＦ））フィーダー細胞）調製用の１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１リットル）：８８５ｍＬのＤＭＥＭ、１００ｍＬのＦＢＳ、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び５ｍＬのＬ‐グルタミン。
ＭＳ‐５フィーダー細胞媒体の調製用の１０％ＦＢＳ含有アルファ最小必須培地（ＭＥＭ）（１リットル）：８９０ｍＬのアルファＭＥＭ、１００ｍＬのＦＢＳ、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐゼラチン溶液（５００ｍｌ）：０．５ｇのゼラチンを５００ｍｌの温Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水（５０〜６０℃）に溶解。室温まで冷却。
この実施例は、本発明のＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＤＡニューロンの制御分化をもたらすための小分子の発見と接触タイミングについて説明する。
次のものは、本明細書に記載される実験上の発見のうちのいくつかの概要である：ＣＨＩＲ９９０２１が存在しない状態でのＳＨＨアゴニスト（パルモルファミン＋ＳＨＨ）及びＦＧＦ８（Ｓ／Ｆ８）による二重ＳＭＡＤ阻害細胞の処理によって、第１１日までのＦＯＸＡ２の有意に低い発現とＬＭＸ１Ａ発現の完全な喪失が示された（図１ａ、ｂ）。ＬＳＢ処理培養物及びＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理培養物において前方マーカーであるＯＴＸ２が堅固に誘導されたが、ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８条件下では誘導されなかった（図１ａ、ｃ）。
本発明者らは、ＤＡ様ニューロンを含有する細胞集団を生じることになるいくつかの他の制御分化方法をこれまでに使用した。これらのＤＡ様ニューロンを移植試験において使用し、治療用途にこれらの細胞をさらに使用することに対する懸念が生じた。例えば、ＭＳ５神経誘導を含む、Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４及び Ｆａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１０に記載される方法がロゼット細胞形成を引き起こし、そして、それらの方法が第１１日の前駆細胞（例えば、図２、１６及び１７を参照のこと）を作製するために用いられ、ＤＡ様ニューロンを得るためにさらに用いられた。これらのニューロンは、生じた第１１日の細胞集団中の低パーセンテージの前駆細胞より生じた。これらのニューロンを使用した移植試験は、テラトーマの発生を引き起こす増殖制御の喪失と共に不適切な神経種の移植後発生が観察されたことに加えて、低い移植後生存率とＤＡ様ニューロンの表現型の喪失を示した。
具体的には、Ｐ０においてＭＳ５フィーダー細胞（Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４）を使用してＯｃｔ４＋細胞のロゼット細胞への神経誘導を開始するための分子とｈＥＳＣを接触させた。Ｐ１期において、細胞をＰ２期の細胞であって、Ｐａｘ２＋／Ｅｎ１＋ＤＡ始原細胞を含む、特異的発現パターンを有する細胞に分化させるためのさらなる分子と細胞を接触させることによってロゼット細胞を増大させ、そして、ＴＨ＋／Ｅｎ１＋ＤＡニューロンにさらに分化させた。これらの細胞が６ＯＨＤＡ傷害ラットにおける移植のために使用され、シクロスポリンＡ処理により免疫抑制された。それらの移植試験は低いインビボ生存性、ＴＨ＋表現型の喪失、患者へのさらなる医療上の問題を引き起こすだろう望ましくない、おそらくは致死性の細胞、すなわち、テラトーマのさらなる増殖及び不適切な神経種への細胞の成長への懸念を示した。
ロゼット由来ＤＡニューロン前駆細胞の移植片に移植後４．５か月において非常に少数の生存ＴＨ＋ニューロン（５０未満ＴＨ＋細胞／動物）が存在した（図１６Ａ）。しかしながら、ＴＨ＋細胞と対照的に、ＧＦＰ標識細胞（ＧＦＰは広範に存在するプロモーターによって誘導された）は移植後では極めて生存性が高かった。このことは、移植後の大半の生存細胞は非ＤＡニューロン同一性を有する神経細胞であったことを示唆する（１６Ｂ）。ＴＨ（赤）を共発現する移植片由来細胞（ｈＮＡ＋（緑））はほとんど無く、これは大半の移植されたヒト細胞が非ＤＡニューロン表現型を装うことを再度示唆する（図１６Ｃ）。パネル１６Ｄ〜Ｅは、Ｄ〜Ｅ、非常に低いインビボ生存にもかかわらず、アンフェタミン誘導性回転（Ｄ）、円筒試験及び突発性回転（Ｅ）などの少数の行動試験においていくらかの（わずかで、非常に変わりやすい）改善が存在したことを示す。無フィーダー細胞神経誘導が前に記載されたように（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９）実施されたが、底板細胞を産出するようにさらに改変された（Ｆａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。万能性細胞を底板細胞に分化させるための改変二重ＳＭＡＤ阻害方法では、本発明者らは、高濃度のＳＨＨが第１１日までのＦＰ誘導に必要とされることを以前に発見している。例えば、いくつかの実施形態では、ソニックＣ２５ＩＩは２００ｎｇ／ｍｌで添加された。いくつかの実験では、ＤＫＫ‐１（Ｒ＆Ｄ社；１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８（Ｒ＆Ｄ社；５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ‐１（ペプロテック社；５０ｎｇ／ｍｌ）及びレチノイン酸（Ｒ＆Ｄ社；１ｍＭ）を添加した。図１７を参照のこと。しかしながら、これまでの方法を用いて第１１日においてもたらされた細胞集団の中には、本発明の方法を用いるＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋中脳底板始原細胞の高いパーセンテージを含むものは無かった。
本明細書において示されるように、万能性細胞を含有する細胞集団が出発集団用に本発明者らによって選択され、第０日に播種された。細胞は分化前に集密近く（６０〜１００％の間の集密）まで培養される。これらの細胞を第０日に二重ＳＭＡＤ阻害剤と接触させた（すなわち、ＬＤＮ‐１９３１８９＋ＳＢ４３１５４２＝「ＬＳＢ」への曝露）。本発明者らは、第１１日まで新しいＬＳＢを含有する栄養補給物を定期的に与えて細胞集団に注目し、そして、いくつかの残存細胞はＬＭＸ１Ａ＋であるが、ＦＯＸＡ２を発現しないことを発見した（図１ａ、ｂ）。本発明者らは、出発細胞を２つ組で播種し、次にそれらの細胞を異なる曝露計画で接触させる、すなわち、細胞を第０日、又は第１日、又は第２日等に特定の時間、すなわち、２４時間、４８時間等の間接触させる、次のＳＨＨアゴニスト（パルモルファミン＋ＳＨＨ）及びＦＧＦ８（Ｓ／Ｆ８）のうちのいずれかを含有する混合物との接触の後に、細胞種（すなわち、遺伝子発現パターン／タンパク質発現パターン）について試験した。試験された３つの主要な例となる培養条件は次のものである。１）細胞を第０日にＬＤＮ／ＳＢ（ＬＳＢ）と接触させ、次に第５日まで新しいＬＳＢと接触させ、第５日から細胞を第１１日までＳＢ抜きで新しいＬＤＮと接触させた。２）細胞を第０日にＬＤＮ／ＳＢ（ＬＳＢ）と接触させ、次に第５日まで新しいＬＳＢと接触させ、第５日から細胞を第１１日までＳＢ抜きで新しいＬＤＮと接触させ、一方、この期間に細胞を第７日まで新しいパルモルファミン、ＳＨＨ及びＦＧＦ８とさらに接触させた。３）細胞を第０日にＬＤＮ／ＳＢ（ＬＳＢ）と接触させ、次に第５日まで新しいＬＳＢと接触させ、第５日から細胞を第１１日までＳＢ抜きで新しいＬＤＮと接触させ、一方、この期間に細胞を第７日まで新しいパルモルファミン、ＳＨＨ及びＦＧＦ８とさらに接触させ、一方、細胞種の最適収量を決定するためにこれらの主要な条件をいくつか変えて培養第３日に開始して第１１日まで新しいＣＨＩＲとさらに接触させた。包括的時間的遺伝子発現プロファイリングを用いて３つの培養条件の系統的な比較（図１ｄ）が実施された。例となる図８及び表１〜６を参照のこと。差次的発現した遺伝子の階層的クラスター分析が分化第１１日までの３つの処理条件を分離した（図８ａ）。ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、及びＰＴＣＨ１を含むいくつかの他のＳＨＨ下流標的がＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理セットとＬＳＢ処理セットの間において最も差次的に調節された転写物の中にあった（図１ｅ）。ＬＭＸ１Ａ、ＮＧＮ２、及びＤＤＣの発現は早くも第１１日までの中脳ＤＡニューロン前駆細胞運命の確立を示した（図１ｅ、ｆ）。対照的に、第１１日までのＬＳＢ培養物はＨＥＳＳ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、及びＥＭＸ２などの背側前脳前駆細胞マーカーを濃縮した。ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理とＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８処理の直接比較（図１ｆ）によりＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ群における中脳ＤＡ前駆細胞マーカーの選択的濃縮が確認され、ＲＡＸ１、ＳＩＸ３、及びＳＩＸ６の差次的発現に基づいてＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８処理培養物における視床下部前駆細胞同一性が示唆された（図２ｄにおけるＰＯＭＣ発現、ＯＴＰ発現も参照のこと）。
表１、２に第１１日についての、及び、表３〜５に第２５日についての差次的に発現した転写物の例となるリストが示され、遺伝子オントロジー分析（図８ｂ）（ＤＡＶＩＤ；ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ）がＣＨＩＲ処理による正準ＷＮＴシグナル伝達の強化を確認した。生データは未だＧＥＯ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：［ＴＢＤ］）において利用可能ではない。中脳ＤＡ前駆細胞マーカー（図１ｇ）と前方腹側非ＤＡニューロン運命のマーカー（図１ｈ）の遺伝子発現の時間的比較分析により３つの誘導条件が：ｉ）ＬＳＢ：背側前脳同一性；ｉｉ）ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８：腹側／視床下部同一性及びｉｉｉ）ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ：中脳ＤＡ前駆細胞同一性に配分された。
ＤＡニューロンの分化．さらなる分化のため、ニューロン成熟を促進する培地（ＢＡＧＣＴ、材料と方法を参照のこと）中に前駆細胞を維持した。これまでの方法と本発明の方法から生じる分化細胞の集団の間で次の種類の比較を行った：Ａ）分化第５０日におけるＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２及びＮＵＲＲ１と組み合わせたＴＨについての免疫細胞化学分析、Ｂ）ロゼット由来培養物と底板由来（ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ）培養物を比較する総細胞の中のＴＨ＋細胞、ＦＯＸＡ２＋細胞、ＬＭＸ１＋細胞、及びＮＵＲＲ１＋細胞の定量。（Ｃ）底板ＤＡニューロン培養物及びロゼット由来ＤＡニューロン培養物における第５０日でのセロトニン＋（５‐ＨＴ）神経細胞サブタイプとＧＡＢＡ＋神経細胞サブタイプ（非ＤＡニューロン混入細胞）のパーセンテージの定量。そして、（Ｄ）ドーパミンと代謝物を測定するためのＨＰＬＣ分析：底板由来培養物とロゼット由来培養物の間のＤＡレベル、ＤＯＰＡＣレベル及びＨＶＡレベルの比較。第２５日までに３つの前駆細胞集団がＴｕｊ１＋ニューロン（図２ａ）、及びＤＡの合成における律速性酵素であるＴＨを発現する細胞を産出した。しかしながら、ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ処理により、ＬＭＸ１Ａ及びＦＯＸＡ２を共発現するＴＨ＋細胞が生じ、そして、核受容体ＮＵＲＲ１（ＮＲ４Ａ２）の強力な誘導が示された（図２ａ、ｂ）。第１３日培養物と第２５日培養物における遺伝子発現の比較によって、他の分裂終了後ＤＡニューロンマーカーの堅固な誘導が確認された（図２ｃ）。ＬＳＢ処理培養物とＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８処理培養物に対する比較において第２５日におけるＤＡニューロン同一性の特徴解析によって、既知の中脳ＤＡニューロン転写物の濃縮が確認され、そして、複数の新規候補マーカーが同定された（図２ｄ、表３〜５、図８ｂ）。例えば、ＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲ（中脳ＤＡ群）において最も濃縮された転写物は、もともと中脳ＤＡニューロン発生と関係していないが、ヒト黒質において強力に発現している遺伝子であるＴＴＦ３であった（図８ｃ；アレン・ブレイン・アトラス：ｈｔｔｐ：／／ｈｕｍａｎ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇ）。
ＥＢＦ‐１、ＥＢＦ‐３（図８ｃ）並びに肝臓におけるＦＯＸＡ２の公知の転写標的であるＴＴＲについて同様のデータが得られた。本発明の開発中に得られたデータは中脳ＤＡ前駆細胞におけるいくつかのＰＩＴＸ遺伝子の濃縮を示した。中脳ＤＡニューロンの古典的なマーカーであるＰＩＴＸ３も分化第２５日において強固に発現した（図２ｅ）。そして、無関係のｈＥＳＣ株とｈｉＰＳＣ株が容易に中脳底板誘導とＤＡニューロン誘導の両方を再現することができた（図９）。本明細書において示されるデータによって、他の試験されたプロトコルと対照的にＬＳＢ／Ｓ／Ｆ８／ＣＨＩＲプロトコルが中脳ＤＡニューロン運命に合致するマーカープロファイルを発現する細胞を産出することが示された。
底板由来ＤＡニューロンのインビトロ及びインビボの特質を神経ロゼット中間体から得られたＤＡ様ニューロンと比較した（図１０及び１６）。神経ロゼットのパターン形成はｈＰＳＣからＤＡニューロンを得るための現在最も広く用いられている戦略を表す。底板系プロトコルとロゼット系プロトコルの両方が、長期インビトロ生存が可能であるＴＨ＋ニューロンの作製に優れていた（分化第５０日；図３ａ）。しかしながら、ＴＨ＋細胞のパーセンテージは底板由来培養物において有意に高かった（図３ｂ）。両方のプロトコルのＴＨ＋細胞はＮＵＲＲ１の共発現を示したが、底板由来ＤＡニューロンはＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａを共発現した（図３ａ、ｂ）。ＧＡＢＡ及びセロトニン（５‐ＨＴ）陽性ニューロンはほとんど観察されなかった（図３ｃ）。ＤＡとその代謝物であるＤＯＰＡＣ及びＨＶＡはどちらのプロトコルで作製された培養物にも存在したが、ＤＡレベルは底板培養物で約８倍高かった（図３ｄ、ｅ）。中脳ＤＡニューロンは広範囲にわたる線維伸長とシナプシン、ドーパミン・トランスポーター（ＤＡＴ）、及びＧタンパク質共役内向き整流性カリウムチャネルを含む成熟ニューロンマーカーの堅固な発現を示した（黒質緻密部（ＳＮｐｃ）ＤＡニューロンにおいて発現する、ＧＩＲＫ２とも呼ばれるＫｉｒ３．２）（図３ｆ、図１１）。ＳＮｐｃ ＤＡニューロンは、脳においてそれらを他の大半のニューロンと識別する電気生理的表現型をインビボで示す。具体的には、それらのニューロンは低速で（１〜３Ｈｚ）突発的に電位上昇を示す。また、この低速の電位上昇は低速の閾値下振動電位を伴う。インビトロで２〜３週間の後、生後初期マウスから培養されたＳＮｐｃ ＤＡニューロンがこれらの同じ生理的特徴を示す。ｈＥＳＣから分化したＤＡニューロンが一貫して（４／４）この特徴的な生理的表現型を示した（図３ｇ〜ｉ）。
第６５日におけるｍＤＡニューロンのインビトロでの維持によって、ＴＨ陽性ニューロンがそれまでのようにＦｏｘＡ２を発現しており、ｍＤＡニューロンに典型的な長い線維を伸長することが示された（図３Ａ）。ＨＰＬＣによるＤＡ放出の測定によって、６５日齢ＴＨ＋ニューロンはインビトロで機能的であることが示された（図３Ｂ）。
損傷を受けたニューロンを含有するげっ歯類動物、すなわち、マウス及びラットにおける新規ＤＡ神経細胞集団の移植
本分野の課題のうちの１つは、神経過形成又は非中脳ニューロンへの不適切な分化のリスクが無い状態で機能的にインビボにおいて生着するｈＰＳＣ由来中脳ＤＡニューロンを作製する、又はテラトーマを発生させる能力である。胎児組織移植試験に基づき、ＮＵＲＲ１の発現によって示される細胞周期離脱の時が移植に適切な期間であり得ると本発明者らは考えた（およそ分化第２５日、図２）。非傷害成体マウスの第２５日細胞を使用する最初の試験によって、移植後６週間でｈＰＳＣ由来ＦＯＸＡ２＋／ＴＨ＋ニューロンの堅固な生存が示された（図１２）。パーキンソン病の宿主における、神経過形成を引き起こすことがない、ＦＯＸＡ２＋／ＴＨ＋細胞の長期生存が試験された。この目的のため、まれな腫瘍原性細胞の曝露に特定の感受性を有する、異種移植片の生存を効率的に支援する株（Ｑｕｉｎｔａｎａ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｕｍｏｕｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５９３〜５９８ （２００８）、参照により本明細書中に援用）であるＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌルマウスにおいて６‐ヒドロキシ‐ドーパミン（６‐ＯＨＤＡ）傷害（Ｔａｂａｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １４：３７９〜３８１ （２００８）、参照により本明細書中に援用）を行った。高い増殖能を有する細胞の混入の可能性を示すために事前精製することなく底板由来ＤＡニューロン培養物とロゼット由来ＤＡニューロン培養物の両方を移植した（１５０×１０3個／動物）。移植から４．５か月の後に底板由来ＤＡニューロン移植片がＦＯＸＡ２共発現性ＴＨ＋細胞から構成される輪郭のはっきりした移植中核とヒト特異的マーカーｈＮＣＡＭを示した（図４ａ〜ｃ）。機能分析によってアンフェタミン誘導性回転行動の完全な救出が示された。対照的に、ロゼット由来ニューロン移植片はＴＨ＋ニューロンをほとんど示さず、回転行動の有意な減少をもたらさず（図４ｄ）、そして、大規模な神経過形成を示した（２０ｍｍ3超の移植片体積；図１３）。本明細書において報告される、移植に使用されたロゼット由来神経細胞の広範囲の過形成は本発明者らのグループ（Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ． ｍｉＲ−３７１−３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｅｄｉｃｔｓ Ｎｅｕｒａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：６９５〜７０６ （２０１１）、参照により本明細書中に援用）及び他のグループ（Ｈａｒｇｕｓ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０７：１５９２１〜１５９２６ （２０１０）、参照により本明細書中に援用）のロゼット由来ＤＡ移植片を用いるこれまでの研究に匹敵した。その過形成はより長い生存期間（４．５か月対６週間）、移植前のＦＡＣＳ精製の欠如、及びＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌル宿主の選択に起因する可能性があった。増殖性のＫｉ６７＋細胞の数は底板由来移植片では最小であった（総細胞の１％未満）が、ロゼット由来移植片は増殖性神経前駆細胞からなるポケットを保持した。神経過形成は移植片内の初期前方神経外胚葉性細胞によって引き起こされると考えられている（Ｅｌｋａｂｅｔｚ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２２：１５２〜１６５ （２００８）； Ａｕｂｒｙ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ Ａ １０５：１６７０７〜１６７１２ （２００８）、参照により本明細書中に援用）。この仮説は底板由来移植片ではなくロゼット由来移植片での前脳マーカーＦＯＸＧ１の発現によって裏付けられた。底板由来移植片とロゼット由来移植片の両方に小パーセンテージのアストログリア細胞が存在したが、大半のＧＦＡＰ＋細胞は宿主起源を示すヒトマーカーについて陰性であった（図１３）。
本明細書に記載されるＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌルマウスにおける結果はＦＯＸＡ２＋／ＴＨ＋ニューロンの堅固な長期生存、アンフェタミン誘導性回転行動の完全な回復、及び神経過形成のあらゆる兆候の喪失を示した。しかしながら、これらの結果のいくつかはＮＯＤ‐ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒｇｃヌルマウスの特定的な使用に起因し得た。この仮説を検証するため、シクロスポリンＡを使用して薬理的に免疫抑制した成体６‐ＯＨＤＡ傷害ラットに底板由来ＤＡニューロン培養物（２５０×１０3細胞）を移植した。移植から５か月後で移植片の生存は堅固であり（図４ｅ〜ｈ）、ＦＯＸＡ２（図４ｇ）とヒト核抗原（ｈＮＡ）（図４ｅ）を共発現するＴＨ＋細胞は平均で１５，０００個より多く、ＴＨ＋／ｈＮＣＡＭ＋線維が移植中核から周囲の宿主線条体へ発出した（図４ｆ）。ＴＨ＋細胞はＦＯＸＡ２に加えて中脳ＤＡニューロンマーカーＰＩＴＸ３及びＮＵＲＲ１を発現した（図４ｈ〜ｊ）。行動分析によって、改善を示さなかった偽移植動物と対照的に、アンフェタミン誘導性回転非対称の完全な回復が示された（図４ｋ）。移植された動物は、ＤＡ系の薬理的刺激に依存しないアッセイ法である前肢の無動を測定するステッピング試験（図４ｌ）と円筒試験（図４ｍ）にも改善を示した。遅発性（移植から約３〜４か月後）の回復がヒトＤＡニューロンについて予期され、そして、それはＤＡＴ発現（図４ｎ）のレベルなどのインビボ成熟の速度に依存する。Ｋｉｒ３．２チャネル（ＧＩＲＫ２）又はカルビンジンを発現するＴＨ＋細胞の存在は、ＳＮｐｃ（Ａ９）と腹側被蓋領域（Ａ１０）のＤＡニューロンが移植片に存在することを示す（図４ｏ、ｐ）。
マウス（図１３）に見られるように、たいていは宿主由来のＧＦＡＰ＋グリア細胞がそうであったように（総細胞の７％；図１４）、ラット細胞の中にセロトニン系細胞及びＧＡＢＡ系細胞はまれであった（総細胞の１％未満）。セロトニン＋ニューロンは移植片中にほとんど検出されなかったが、宿主由来セロトニン系線維でありそうなｈＮＣＡＭ陰性細胞が観察された（図１４）。
損傷を受けたニューロンを含有する霊長類動物における新規ＤＡ神経細胞集団の移植
本明細書において示される結果によって、２つの独立したマウスモデルにおいて良好な移植片生存と行動分析結果が示された。しかしながら、マウス又はラットの脳において必要とされるＤＡニューロンの数は霊長類動物及びヒトにおける移植に必要とされるより大きな数の細胞の小さな部分を表す。このプロトコルの拡大可能性を試験するため、２匹の成体ＭＰＴＰ傷害アカゲザルにおいてパイロット移植試験を実施した。
底板系プロトコルを用いて分化第２５日までに５０×１０6個もの多くの移植可能ＤＡニューロン前駆細胞を得た。しかし、パーキンソン病様状態の誘導のための古典的な用量は頸動脈に注射された３ｍｇのＭＰＴＰ塩酸（０．５〜５ｍｇの範囲）であった。これにＭＰＴＰの０．２ｍｇ／ｋｇ静脈内投与によるＭＰＴＰの全身性注射が続いた。細胞を脳の各側の３つの位置（後方尾状核及び交連前被殻）に注入し（総計６路、１．２５×１０6細胞／路）、シクロスポリンＡで動物を免疫抑制した。その脳の一方の側にＨ９のＧＦＰ発現性サブクローンに由来するＤＡ前駆細胞を注入し、他方の側に非標識Ｈ９細胞に由来する細胞を移植した。継続的なＦＯＸ２Ａ発現とＴＨ産生を有する、アカゲザルにおけるニューロンの移植を示す結果が図４ｑ〜ｔに示されている。移植から１か月後に中脳ＤＡニューロンの堅固な生存がＧＦＰ（図１５）及びヒト特異的細胞質性マーカー（ＳＣ‐１２１）（図４ｑ）の発現に基づいて観察された。各移植中核は、宿主の中に最大で３ｍｍまで伸長するＴＨ＋線維のハロによって囲まれた（図４ｒ）。それらの移植中核はＳＣ‐１２１（図４ｓ）及びＦＯＸＡ２（図４ｔ）を共発現するＴＨ＋ニューロンから構成された。移植片内のＳＣ‐１２１及びＧＦＰ陰性領域はＩｂａ１＋宿主ミクログリアを含有し（図１５）、不完全な免疫抑制を示した。まとめると、霊長類動物、すなわち、重篤な９５％超の内在性中脳ＤＡニューロンの喪失を含む成体ＭＰＴＰ（３ｍｇのＭＰＴＰ塩酸（１‐メチル‐４‐フェニル‐１，２，３，６‐テトラヒドロピリジン；０．５〜５ｍｇＭＰＴＰ塩酸までの濃度範囲）傷害アカゲザルにおける新規ＤＡ神経細胞集団の移植。ＭＰＴＰ曝露はヒトにおけるパーキンソン病に類似した観察可能な変化と症状を引き起こした。
ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ細胞と野生型ｈＥＳ（又はｉＰＳＣ）細胞の中脳ＤＡニューロン運命への同等の分化能
この実施例は、大集団の中脳ＤＡニューロンが、胚の破壊を引き起こさない方法で得られたＰＤ患者の細胞株、すなわちＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ細胞が本発明のＦＯＸＡ２／ＬＩＭ１ＸＡ／ＴＨ＋ＤＡニューロンを得るための細胞集団として使用されたときにＰＤ患者のニューロンの特徴を有して発生したという発見について説明した。
ＰＩＮＫ１ Ｑ４５６Ｘ変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株は本発明の新規底板ベース中脳ＤＡニューロンプロトコル（方法）を用いて分化させられ、ｉＰＳＣ Ｈ９株から得られる中脳分化プロファイルと同等のプロファイルを生じた（図２０）。（Ａ〜Ｃ）ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株の分化第１１日（中脳前駆細胞期）におけるＦＯＸＡ２（赤）、ＬＭＸ１Ａ（緑）及びＤＡＰＩ（青）（Ａ）についての、分化第２５日（初期分裂終了後ＤＡニューロン期）におけるＦＯＸＡ２（赤）とＴＨ（緑）（Ｂ）についての、及び、ＮＵＲＲ１（赤）とＴＨ（緑）（Ｃ）についての免疫細胞化学分析。（Ｄ〜Ｆ）分化第１１におけるＦＯＸＡ２（赤）、ＬＭＸ１Ａ（緑）及びＤＡＰＩ（青）（Ｄ）についての、分化第２５日におけるＦＯＸＡ２（赤）とＴＨ（緑）（Ｅ）についての、及び、ＮＵＲＲ１（赤）とＴＨ（緑）（Ｆ）についての、Ｈ９由来細胞を使用して実施された同じセットの免疫細胞化学分析。
ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣはインビトロでの長期の分化と成熟の後にタンパク質凝集というＰＤ様表現型を示した。本発明者らは、新規底板ベース中脳ＤＡニューロン誘導プロトコルを用いる分化の第５５日にＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣがＴＨ＋ＤＡニューロンの細胞質においてα‐シヌクレイン（ＰＤ患者のレビー小体の主要成分）発現の証拠を示すことを発見した（図２１ａ〜ｂ）。（Ａ、Ｂ）ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株の分化第５５日におけるα‐シヌクレイン（ＬＢ５０９、赤）、ＴＨ（緑）についての免疫細胞化学分析と統合画像（Ａ）及びα‐シヌクレイン（赤）とユビキチン（緑）についての免疫細胞化学分析（Ｂ）。これらのα‐シヌクレイン陽性細胞はユビキチン（古典的なレビー小体マーカー）の高発現も示した。対照的に、対照ｉＰＳ株に由来するＤＡニューロンは（細胞質性と対照的に）正常なシナプス性α‐シヌクレイン発現と非常に低レベルのユビキチンの発現を示した（図２１ｃ〜ｄ）。（Ｃ、Ｄ）対照ｉＰＳＣ株の分化第５５日におけるα‐シヌクレイン（赤）とＴＨ（緑）（Ｃ）、及びα‐シヌクレイン（赤）とユビキチン（緑）（Ｄ）についての免疫細胞化学分析。
凝集型のα‐シヌクレインの発現。ＰＤ患者の脳では、二量体化した不溶性形態のα‐シヌクレインがレビー小体において凝集を引き起こす。二量体型のα‐シヌクレインはα‐シヌクレイン上のセリン１２９のリン酸化を示す。
分化の同じ日にＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞はセリン１２９リン酸化α‐シヌクレインの強い発現を示し、対照ｉＰＳＣ由来細胞の非常に低レベルの発現と対照的であった（図２２）。ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞はセリン１２９リン酸化α‐シヌクレインの強い発現を示し、対照ｉＰＳＣ由来細胞の非常に低レベルの発現と対照的であった。（Ａ、Ｂ）分化第５５日におけるＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞（Ａ）及び匹敵する対照ｉＰＳＣ由来細胞（Ｂ）におけるセリン１２９リン酸化α‐シヌクレイン（緑）及びＤＡＰＩ（青）の免疫細胞化学分析。
α‐シヌクレイン発現パターンの差異が分化プロトコル中に観察される。本発明者らは、底板由来「真正」中脳ＤＡニューロンがＰＤ特異的脆弱性及び対応する特異的インビトロ表現型を示すと考えた。古典的なＭＳ５間質性フィーダー細胞ベース分化プロトコル（Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ２００４、参照により本明細書中に援用）を用いて得られるＤＡニューロンは多数のＴＨ＋ニューロンを産出した。しかしながら、本発明の開発中に得られたデータに基づき、本発明者らは、ＭＳ５系ＴＨ＋細胞が真正の底板由来中脳ＤＡニューロンではないことを示した。ＭＳ５プロトコルにより分化する培養物には多数のα‐シヌクレイン陽性細胞が存在した。しかしながら、それらの細胞はＴＨを共発現しなかった。また、ＭＳ５分化戦略を用いるとき、ＰＤ‐ｉＰＳＣと対照ｉＰＳＣの間では発現パターンに差異は存在しなかった（図２３ａ〜ｂ）。これらのデータは、α‐シヌクレインが他の非ＤＡ細胞種においても発現すること、及びそのような非ＤＡ α‐シヌクレインは、特に標準的なＭＳ５分化プロトコルを用いたときに、疾患由来細胞と対照ｉＰＳＣ由来細胞の間で変化しないことを示している。これらは刊行物（例えば、Ｐｅｒｒｉｅｒ ＰＮＡＳ ２００４）において報告されているＤＡ様ロゼット由来ニューロンである。それらのＭＳ５系ＴＨ＋（＝ＤＡ様）細胞は図３、１０、１３及び１６における比較のために使用される。これらのデータは、α‐シヌクレインが他の非ＤＡ細胞種においても発現すること、及びそのような非ＤＡ α‐シヌクレインは、特に標準的なＭＳ５分化プロトコルを用いたときに、疾患由来細胞と対照ｉＰＳＣ由来細胞の間で変化しないことを示している。そして、本明細書に記載される新しい底板系分化プロトコルによりα‐シヌクレインを共発現する多数のＴＨ＋細胞が生じる。それらのＴＨ＋細胞は細胞質性発現パターンでα‐シヌクレインを発現する。（図２４Ａ、Ｂ）ＭＳ５ベース分化の第６０日におけるＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株（Ａ）、及び対照ｉＰＳＣ（Ｂ）のα‐シヌクレイン（ＬＢ５０９、赤）、ＴＨ（緑）についての免疫細胞化学分析。（Ｃ）底板ベース分化の第５５日におけるＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣ株のα‐シヌクレイン（赤）、ＴＨ（緑）についての免疫細胞化学分析。
ＰＩＮＫ１変異体ＰＤ‐ｉＰＳＣに由来する例となるＤＡニューロンは有害性刺激に対してより脆弱である。底板系プロトコルから得られたＰＤ‐ｉＰＳＣ由来ＴＨ＋ＤＡニューロンは対照ｉＰＳＣ由来細胞よりも毒素負荷に対して脆弱であった（バリノマイシン：ミトコンドリアイオノフォア、５ｕＭ（１〜１０ｕＭまでの濃度範囲）、４８時間）。対照的に、古典的なＭＳ５系プロトコルにより得られたＴＨ＋ニューロンはＰＤ由来細胞と対照由来細胞の間で差次的脆弱性を示さなかった（図２４）。（Ａ〜Ｆ）分化第６０日における代表的なＴＨ免疫細胞化学：底板系プロトコルにより得られたＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞と対照ｉＰＳＣ由来細胞の両方の正常状態（毒素処理無し）（Ａ、ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞が示される）、毒素処理後のＰＤ‐ｉＰＳＣにおけるほぼ完全なＴＨ＋ＤＡニューロンの分解（Ｂ）、部分的に分解された対照ｉＰＳＣに由来するＴＨ＋ＤＡニューロン（Ｃ）。バリノマイシン処理から４８時間後のアラマーブルーを使用する全細胞生存性アッセイによっても、ＰＤ‐ｉＰＳＣ及び対照ｉＰＳＣを比較すると毒素負荷（５及び１０ｕＭ）について特定の範囲における差次的細胞生存が示された（図２５）。
ＭＳ５系プロトコルより得られたＰＤ‐ｉＰＳＣ由来培養物と対照ｉＰＳＣ由来培養物の両方の正常状態（Ｄ、ＰＤ‐ｉＰＳＣ由来細胞が示される）、ＰＤ‐ｉＰＳＣにおける毒素負荷後のＴＨ＋ニューロン（Ｅ）、及びＭＳ５プロトコルより得られた対照ｉＰＳＣ由来培養物（Ｆ）。（Ｇ〜Ｈ）分化第６０日における底板系プロトコルによるＴｕｊ１（赤）及びＴＨ（緑）についての免疫細胞化学の低出力画像：正常状態（Ｇ）と毒素負荷状態（Ｈ）のＰＤ‐ｉＰＳＣ及び正常状態（Ｉ）と毒素負荷状態（Ｊ）の対照ｉＰＳＣ。（Ｋ〜Ｎ）分化第６０日におけるＭＳ５系プロトコルによるＴｕｊ１（赤）とＴＨ（緑）についての免疫細胞化学の低出力画像：正常状態（Ｋ）と毒素負荷状態（Ｌ）のＰＤ‐ｉＰＳＣ及び正常状態（Ｍ）と毒素負荷状態（Ｎ）の対照ｉＰＳＣ。
毒素負荷についての細胞生存性用量応答アッセイの例となる定量。バリノマイシン処理から４８時間後のアラマーブルーを使用する細胞生存性アッセイによって、ＰＤ‐ｉＰＳＣと対照ｉＰＳＣを比較すると、毒素負荷（５及び１０ｕＭ）について特定の用量範囲における差次的細胞生存が示された（底板ベース分化の第６０日）。注記：このアッセイは全ての細胞死について試験するが、最も劇的な効果はＤＡニューロンにおいて特異的に観察された（図１４を参照のこと）。従って、アラマーブルーに基づく定量はＤＡニューロン系譜で観察される差次的効果の程度を過小評価する可能性がある。
参照文献、参照により本明細書中に援用： Ｌｉ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３， ２１５〜２２１ （２００５）； Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ １０１， １２５４３〜８ （２００４）； Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１， １２５４３〜８ （２００４）； Ｔａｂａｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １４， ３７９〜３８１ （２００８）； Ｐｅｒｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１， １２５４３〜８ （２００４）； Ｗｅｒｎｉｇ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ． Ａ １０５， ５８５６〜５８６１ （２００８）； Ｌｉｎｄｖａｌｌ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ １２０， ２９〜４０ （２０１０）； Ｒｏｙ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １２， １２５９〜１２６８ （２００６）； Ｅｌｋａｂｅｔｚ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２２， １５２〜１６５ （２００８）； Ｋｉｔｔａｐｐａ， ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ． Ｂｉｏｌ． ５、 ｅ３２５（２００７） ； Ｆｅｒｒｉ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３４， ２７６１〜２７６９ （２００７）； Ｒｏｅｌｉｎｋ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ７６， ７６１〜７７５ （１９９４）； Ｌｉｅｍ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ８２， ９６９〜９７９ （１９９５）； Ｆａｓａｎｏ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６， ３３６〜３４７ （２０１０）； Ｃｈａｍｂｅｒｓ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２７， ２７５〜２８０ （２００９）； Ｍｕｒｏｙａｍａ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １６， ５４８〜５５３ （２００２）； Ｊｏｋｓｉｍｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １２， １２５〜１３１ （２００９）； Ｌｙａｓｈｅｎｋｏ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３， ７５３〜７６１ （２０１１）； ＶａｎＤｕｎｋ， ｅｔ ａＬ ．１ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ３１， ６４５７〜６４６７ （２０１１）； Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ４， ４４〜５７ （２００９）； Ｃｏｓｔａ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９， １４１５〜１４２５ （１９８９）； Ｅｌｋａｂｅｔｚ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２２， １５２〜１６５ （２００８）； Ｓｏｌｄｎｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ １３６， ９６４〜９７７ （２００９）； Ｇｕｚｍａｎ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２９， １１０１１〜１１０１９ （２００９）； Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ ４６６， ７２７〜７４７ （１９９３）； Ｆｅｒｒａｒｉ， ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２４， １８８５〜１８９６ （２００６）； Ｏｌａｎｏｗ， ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９， １０２〜１０９ （１９９６）； Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｍ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６， ２４８〜２５０ （１９９７）； Ｑｕｉｎｔａｎａ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４５６， ５９３〜５９８ （２００８）； Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ． ｄｉｅｔｓ Ｎｅｕｒａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８， ６９５〜７０６ （２０１１）； Ｈａｒｇｕ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０７， １５９２１〜１５９２６ （２０１０）； Ａｕｂｒｙ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． ＳＡ １０５， １６７０７〜１６７１２ （２００８）； Ｂｌｕｍｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２１９， ２０８〜２１１ （２００９）； Ｂａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ． Ａ（２０１１）； Ｓｔｕｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １， ２９０〜２９５ （１９９８）； Ｋｏｒｄｏｗｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０， ７６７〜７７３ （２０００）； Ｐａｘｉｎｏｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｒｈｅｓｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 ２０００）； Ｃｒａｗｌｅｙ、 Ｗｈａｔ’ｓ Ｗｒｏｎｇ Ｗｉｔｈ Ｍｙ Ｍｏｕｓｅ： Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｉｃｅ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、 ２０００）； Ｓｔｕｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｕｌｌ． ４１， １４３〜１５０ （１９９６）； Ｔａｂａｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３， ６０１〜６０６ （２００５）； ａｎｄ Ｐｌａｃａｎｔｏｎａｋｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７， ５２１〜５３２ （２００９）。
例となる条件が急性スライス調製物中のヒト万能性幹細胞由来ＤＡニューロンのインビボレコーディングのために確立された。図２６に示されている例となる結果を参照のこと。
急性スライス調製物、すなわち、移植領域の生検試料からの調製物において電気生理学的測定法を用いることが企図される。１つの実施形態では、ＰＤにおいて最も冒されるＡ９型ドーパミンニューロンに特異的な自律性ペースメーキング活性の試験に基づいてＡ９型移植片由来ＤＡニューロンとＡ１０型移植片由来ＤＡニューロンがインビボで見分けられる。言い換えると、Ａ１０型ニューロンはペースメーキング活性を有しない。
条件が急性スライス調製物中のヒト万能性幹細胞由来ＤＡニューロンのインビボレコーディングのために確立された。図２６を参照のこと。具体的には、移植された万能性幹細胞由来ヒトＤＡニューロンをマウス黒質緻密部（ＳＮｐｃ）に見られる電気生理的特徴に典型的な特徴について測定し、それらの特徴を有することを発見した。図２６Ａの上の図は移植片領域におけるペースメーカー・ニューロンの再構成を示す。下の図は、９か月前にｈＥＳ由来ニューロンを注入したラットから作製した脳の薄片の例となる顕微鏡写真を示す。移植片の輪郭が示されている。より高倍率の画像が底部にある挿入図に示されている。その薄片をチロシンヒドロキシラーゼについて処理した。その処理が白色として際立つ。（図２６Ｂ）さらに、上の図は細胞移植片中の推定されるＤＡニューロンからの例となるセルアタッチ・パッチレコーディングを示す。下の図は同じ細胞からの例となるホールセル・レコーディングを示す。レコーディングは、シナプス入力を排除するためにグルタミン酸受容体アンタゴニストとＧＡＢＡ受容体アンタゴニスト（５０μＭ ＡＰ５、１０μＭ ＣＮＱＸ及び１０μＭガバジン）の存在下で行われた。これらのレコーディングは、ＰＳ由来ニューロンが通常の体細胞内電圧軌道を有する自律的なペースメーカーであることを示した。移植片試料で記録された別のニューロンが同様の特性を有した（図２６Ｃ）。比較のため、成体マウスのＳＮｐｃにおけるドーパミン系ニューロンからのセルアタッチ・レコーディングとホールセル・レコーディングが示されている。略語（ＣＴｘ＝皮質、ＳＴｒ＝線条体、ＳＮｐｃ＝黒質緻密部、ＤＡ＝ドーパミン系）。このデータは、移植から数か月後の移植されたラット線条体のインビボ機能試験を示す。従って、いくつかの実施形態では、移植された組織に対するインビボ機能試験は黒質緻密部（ＳＮｐｃ）の回復を示す。
本発明の方法おいて使用するための細胞表面マーカーを特定するための例となる方法。具体的には、ＣＤ１４２がこれらの方法で特定された。
候補表面マーカーを特定する２つの主要な戦略：中脳ＤＡニューロンで選択的に発現し、Ａ９型ＤＡニューロン（図２７ｂ）を特に標識するように見えるＤＣＳＭ１という名称のマーカーを含むいくつかの候補マーカーを見出した、遺伝的レポーター株における無作為遺伝子発現スクリーン（図２７ａ）。第２の戦略は、９６ウェル形式の２４２種の市販の抗体を試験するｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンにおけるＣＤ細胞表面マーカースクリーンの使用である（図２７ｃ、ｄ）。そのようなスクリーン（図２７ｅ）の結果によって、Ｎｕｒｒ１＋ＤＡニューロン期を選択的に標識するマーカー（図２７ｆ）であるＣＤ１４２を含む、中脳ＤＡニューロンにおいて濃縮される少なくとも５個の検証済みのマーカーが特定された。本明細書に記載されるＤＡ神経細胞法を用いるとＣＤ１４２は通常分化第２５日において総細胞集団の約３０％を標識した（図２８ａ）。Ｎｕｒｒ１＋ＤＡニューロン期についてのＣＤ１４２の選択性は複数の無関係のｈＥＳＣ株とｈｉＰＳＣ株で確認された（図２８ｂ）。ＤＡニューロンの濃縮に加えて、ＣＤ１４２陽性細胞の濃縮がＧＡＢＡ系ニューロン及びセロトニン系ニューロンなどの好ましくないニューロンサブタイプを選択的に枯渇させることになる（図２８ｃ〜ｆ）。インビボ試験によって、ＧＡＢＡ系ニューロンとセロトニン系ニューロンの混入という問題を克服する高純度のＤＡニューロン移植片を生じさせるＣＤ１４２陽性細胞集団の能力が確認された。精製されていない細胞を使用する移植方法によって早くも非常に少ないセロトニン系ニューロンが生じたが、望ましくない胎児組織移植片誘導性ジスキネジアの潜在的起源としてヒト胎児組織移植の失敗に関係づけられた混入細胞種であるセロトニン系ニューロンの導入の危険性をさらに減少させるためにＣＤ１４２に基づく前駆細胞の選別を用いることが企図される。
この実施例はＰＳＡの細胞表面発現を増加させるためのヒトＰＳＴ遺伝子による細胞の形質転換法について説明する。この実施例はＰＳＡ細胞表面発現が上昇した細胞を使用する例となる方法も示す。
具体的には、この実施例はＤＡニューロン上でのＰＳＡ発現を増加させるためにｈＥＳＣへ導入する改変ＰＳＴ遺伝子を示す。ヒトポリシアル酸トランスフェラーゼ（ｈＰＳＴ）をコードする遺伝子を、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｙ、インビトロジェン社）を使用してｈＥＳＣ株（ＷＡ０１）に導入した。２０種の選択されたクローンを増殖させ、そして、ＰＳＴ発現について分析した。ＰＳＴ発現性ｈＥＳＣクローンを分化させてＤＡニューロンでＰＳＴが発現停止されていないことを確実にした。ＦＡＣＳ分析と免疫蛍光（オペレッタ）を用いて異なる分化ステージ（第０日、第１１日、第２５日、及び第５０日）におけるＰＳＡ‐ＮＣＡＭの定量を行った。陽性クローンを表７に概説されている一揃いのＤＡニューロンの品質管理（ＱＣ）パラメーターの対象とした。分化中に均一で高レベルのＰＳＡ‐ＮＣＡＭを保持し、ＱＣパラメーターにおいてうまくいく（表７）少なくとも３クローンをＰＳＴ過剰発現性のｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンにおける神経突起伸長の評価に進める。本明細書に記載される標準的なプロトコルを用いて選択された対照とＰＳＴ過剰発現ｈＥＳＣクローンをＤＡニューロンに分化させ、続いて第２５日と第５０日に細胞を固定し、そして、分析した。そのような培養物におけるＴＨ陽性線維の数と長さをオペレッタ・ハイコンテント顕微鏡で定量した。ハーモニー・ソフトウェア３．０の神経突起分析モジュールがＰＳＴを有する、又は有しない神経突起の数と長さを定量し、そして、２元配置ＡＮＯＶＡを用いてデータを統計的に解析した。上のインビトロ試験から先に進むＰＳＴ過剰発現性ｈＥＳＣクローンと対照ｈＥＳＣクローンを再度ＤＡニューロンに分化させ、そして、ＰＤのラットモデルに移植した。生存性、ＰＳＡ‐ＮＣＡＭ発現及び神経突起伸長を判定するための短期移植（４〜６週間）を行った。インビボで短期間経過した各クローンについて、パラメーターを長期移植試験の対象とした。それらの試験について、動物は標準的用量（２００×１０3個）の半分又は４分の１の細胞を受容した。これらの試験は、ＰＳＡの増加が移植後（５か月）の長期生存の増加につながるか、及び、より少ない数のＤＡニューロンが標準的な細胞用量で移植された非ＰＳＴ移植片の機能的能力に一致するか、又はそれより優れることができるか問うものであった（図２７ではない）。加えて、ＰＳＴ ＤＡニューロン移植片と対照ＤＡニューロン移植片の間の機能的能力をさらに識別するために線条体性再神経支配の程度に敏感である複雑な行動アッセイがモニターされた。行動アッセイの完了後に動物を殺処理し、ＮＣＡＭとＳＣ１２１のヒト特異的抗体及びＴＨに対する抗体を使用して線維伸長を定量した（図２９以外も参照のこと）。ＨＮＣＡＭ＋、ＳＣ１２１＋及びＴＨ＋の移植片の強度と広がり、並びにＤＡニューロンマーカー（ＴＨ、ＦＯＸＡ２）とＰＳＡを共発現するヒト細胞のパーセンテージを測定した。移植片から発出する神経突起のＮＣＡＭ／ＴＨ＋ハロの密度を様々な距離で定量した。ボンフェローニ・ポストホク・テスト付きの２元配置ＡＮＯＶＡを用いてデータを群間で比較した。加えて、切片を定性的変化（例えば、分岐、厚み、移植片分布、及び形状）について調査した。加えて、Ａ９表現型、宿主線条体とのシナプス形成、並びに内在性の求心神経による神経支配に関する薄片の電気生理学的評価のためにいくつかの移植片を処理する。
次の実施例はパーキンソン病のマウスにおけるＥＳ由来ドーパミンニューロン移植片の機能を改善するポリシアル酸発現の増強を示す。
Ｎｕｒｒ１プロモーターの制御下にあるＧＦＰを発現するＥＳ細胞（Ｎｕｒｒ１：：ＧＦＰ ＥＳ細胞）にポリシアル酸トランスフェラーゼ（ＰＳＴ）を広範に発現するレンチウイルスベクターを安定的に形質導入した。形質導入された細胞は対照と比べてＰＳＴ ｍＲＮＡの劇的な増加を示した（図３０Ａ）。ＰＳＴの発現はＮＣＡＭ上のＰＳＡ合成に充分であることが観察された。従って、ＰＳＡ‐ＮＣＡＭ発現はＤＡニューロン分化の第１４日にＰＳＴ改変細胞において大いに上昇した（図３０Ｂ〜Ｅ）。ＰＳＡの特有のα‐２，８結合シアル酸重合体を特異的に切断するファージ・エンドノイラミニダーゼ（ｅｎｄｏＮ）によってＥＳ由来ＤＡニューロン上の内在性細胞表面ＰＳＡと誘導性細胞表面ＰＳＡの両方を取り除くことができた（図３０Ｅ）。驚くことに、ＰＳＴ形質導入がＧＦＰ精製ＤＡニューロンにおいてニューロンマーカー又は中脳マーカーの発現に影響することは観察されなかった（図３０Ｆ）。
６ＯＨＤＡ傷害性半身パーキンソン症マウスにおける他の試験が、約１００，０００個のＥＳ由来ＤＡニューロン前駆細胞の移植がアンフェタミン促進性回転試験によって判定される堅固な機能回復をもたらすのに必要であることを示した。本試験では、ＰＳＡ発現の増大を評価することができるように最適以下の数の細胞を移植することが求められた。混入万能性細胞が枯渇させられている非常に濃縮されたＤＡニューロン集団を移植するために、分化第１４日の培養物はＮｕｒｒ１誘導性ＧＦＰの発現に対して、及びＳＳＥＡ‐１発現の欠如に対してＦＡＣＳ精製された（図３１）。ＰＳＴ過剰発現がないとき、半分までの最小有効移植サイズの減少（５５，０００Ｎｕｒｒ１＋ＤＡ細胞）により、検出可能な行動回復をもたらすことができなかった。対照的に、ＰＳＡ発現の増加があるとき、同じ数のＮｕｒｒ１／ＰＳＴ ＤＡニューロンによりＰＤ性行動障害の有意な是正（ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ）がもたらされ、外科手術から約５週間後に完全な回復がもたらされた（図３２Ａ）。Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴを用いて得られた機能回復がｅｎｄｏＮ処理によって部分的に反転させられた（図３２Ａ）ということで、ｅｎｄｏＮとのインキュベーションによる移植前のＰＳＡの除去がＰＳＡの機能向上の特異性を示した。
移植される細胞の特徴を調査するために移植から２か月後に免疫組織化学のために動物を処理した。ＰＳＴ形質導入株を移植された動物は対照細胞を移植された動物の二倍の数のＧＦＰ＋細胞を平均で有した（ＰＳＴ試料と対照試料の間で移植片当たり、それぞれ、９，３００±１，４００ＧＦＰ＋細胞対４，２３０±１０１０ＧＦＰ＋細胞；図３２Ｂ、ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）ということで、生存しているＮｕｒｒ１＋ニューロンの数に差が存在した。さらに、Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴ移植片はより高レベルのＰＳＡ発現もインビボで示した（図３２Ｃ、Ｄ）。しかしながら、移植中核内の中脳ＤＡマーカーＴＨとＦｏｘＡ２を発現する細胞の割合はＮｕｒｒ１細胞とＮｕｒｒ１／ＰＳＴ細胞について同等であった（それぞれ、ＴＨ：６２．０％±８．０対５１．３％±７．０、ｐ＝０．３３；ＦｏｘＡ２：６３．２％±８．６対５５．４％±２．０、ｐ＝０．３；図３２Ｅ）。
Ｎｕｒｒ１細胞及びＮｕｒｒ１／ＰＳＴ細胞から出現する神経突起は同等レベルのＴＨ、Ｇｉｒｋ２（Ｇタンパク質共役内向き整流性カリウムチャネル）及びシナプシンを示した（図３３Ａ）。移植されたシュワン細胞についての他の研究（Ｇｈｏｓｈ、 Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ， ａｘｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ． Ｇｌｉａ ６０， ９７９〜９９２ （２０１２））と異なり、ＰＳＡ発現の増強は移植部位からのＤＡ細胞の移動にほとんど効果を持たなかった。しかしながら、神経突起伸長には明らかな変化が存在した。図３３Ｂに示されるように、Ｎｕｒｒ１＋対照と比べてＮｕｒｒ１／ＰＳＴ細胞から出現するより多くのＤＡ神経突起が存在した。ＧＦＰ及びＴＨの免疫蛍光強度が移植物から５つの連続する１００μｍゾーンで定量されたとき、Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴ移植片はずっと高い突起の相対的密度を示した（図３３Ｃ、Ｄ；ＧＦＰとＴＨの両方についてｐ＜０．０１、２元配置ＡＮＯＶＡ）。この効果を定量するとき、突起の相対的密度が移植中核に最も直近のゾーンで観察された密度に対して正規化された。そのような正規化は、Ｎｕｒｒ１／ＰＳＴ移植片内のより大きな数の生存細胞について補正し、神経突起伸長に対するＰＳＡの特異的な効果を確認するために必要とされた。細胞表面のＰＳＡが移植前にｅｎｄｏＮ処理によって取り除かれたときにも特異性が示された。従って、ｅｎｄｏＮを使用する前処理により遠位部の線維伸長が対照レベルまで低下させられた（図３３Ｅ）。
これらの発見は、移植片機能に対するＰＳＡの効果の少なくともいくつかが線条体の線維神経支配の増強により生じることを示した。従って、移植片機能と、例えばゾーンＩＶへのＧＦＰ陽性線維の相対的伸長程度の間に強力な相関が存在した（図３３Ｆ；ｐ＜０．００１、ｒ２＝０．６５、ｎ＝１７）。驚くことに、線維伸長と行動の関係は実験群（対照、ＰＳＡ増加、及びｅｎｄｏＮ処理）について一貫しており、移植片宿主神経支配がパーキンソン病モデルマウスにおける行動回復のパラメーターであることを示した。移植中核を包み込む反応性グリアのゾーンの穿通性の増大、神経発芽能の上昇、周囲の宿主組織への伸長の向上（例えば、より容易な成長円錐の転移）、及び移植中核の近くにある宿主組織との成熟前連絡の防止などのいくつかの要因が線維伸長の増大に機構的に寄与した。その例となる機構は、正常な発生中の突起伸長の促進及び成体神経系におけるＰＳＡの役割と一致する。
本明細書に記載される実験は、他の種類の細胞に由来する移植片と比べて優れた結果をもたらすＤＡニューロン移植における改変ＰＳＡの使用を実証した。ＰＳＡの増加によって、宿主線条体を神経支配し、ＰＤ性機能障害を低減させる移植されたＤＡニューロンの能力の著しい増大がもたらされることがデータから明確に示された。従って、本発明のＤＡニューロンを備える臨床上の転移術が移植前に細胞を提供することについて企図される。いくつかの実施形態では、それらの細胞はＰＳＡの発現について遺伝的に操作される。いくつかの実施形態では、ＰＳＴは、その精製された酵素と基質へのインビトロでの曝露により移植前の細胞に直接送達されてもよい。いくつかの実施形態では、ＰＤ移植におけるヒト転移術のためのＰＳＡ戦略は複数回の注入の必要性を最小化し、それによってこれらの複数回の注入により生じる外科手術上のリスクを減少させると考えられている。
他の実施形態では、他の細胞種と種に対して、例えば、脊髄損傷部位での軸索の再伸長のための架橋（例えば、細胞間連絡）の作製において移植シュワン細胞の移動を増大させるためにこの技術を用いることが企図される。
次のものはこの実施例における例となる材料と方法である。
動物：食物と水を自由に利用可能にして６週齢の１２９Ｓ３／ＳｖＩｍＪマウス（ジャクソン・ラボラトリー社）を温度管理下で飼育した。実験技法はＮＩＨと研究所の動物使用に関する指針に従って実施され、そして、地域の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）とバイオセイフティ委員会（ＩＢＣ）によって承認された。
６ＯＨＤＡ注射とアンフェタミン誘導性試験：動物をペントバルビタールナトリウム（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、そして、右線条体に２μｌの６ＯＨＤＡ（生理食塩水、０．５％アスコルビン酸中に４μｇ／μｌ）を注射した。注射は次の座標にハミルトン注射筒を用いて実施した：ブレグマに対して０．５ｍｍ後方、１．８ｍｍ外側、及び脳表面に対して２．５ｍｍ腹側。外科手術の前に動物はデシプラミンの単回腹腔内注射（２５ｍｇ／Ｋｇ、シグマ社）を受けた。外科手術から２週間後にアンフェタミン誘導性回転試験において動物に点数を付けた。それらの動物を３０ｃｍの直径の透明なプラスチック製円筒に３０分間配置し、その後に動物はアンフェタミンの単回腹腔内注射（１０ｍｇ／Ｋｇ、シグマ社）を受けた。２０分後からさらに２０分の間の同側性回転／対側性回転の回数を記録した。７週間の間に週に１回動物に点数を付け、その後、動物を深麻酔し、ＰＢＳと０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで心臓を通過する潅流を行った。脳を摘出し、４℃の４％パラホルムアルデヒド中で一晩後固定し、その後ビブラトーム（Ｐｅｌｃｏ‐１０１、テッド・ペラ（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）社）で厚さ４０μｍの矢状面切片に薄片化した。
細胞分化と移植： Ｎｕｒｒ１：：ＧＦＰ ＢＡＣ遺伝子導入ＢＡＣマウスＥＳレポーター細胞株（すなわち、ＧＦＰ発現がＮｕｒｒ１プロモーターによって誘導される）５にＣＭＶプロモーターの制御下にあるマウスＰＳＴ遺伝子を含有するレンチウイルス（ｐＬｅｎｔｉ、インビトロジェン社）を形質導入した。ＥＳ細胞を、１，４００ユニット／ｍｌのＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ；インビトロジェン社）、２ｍＭのＬ‐グルタミン、１ｍＭのβ‐メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｐｓ／ｍｌのストレプトマイシン（インビトロジェン社）を添加されたＤＭＥＭ（インビトロジェン社）、１０％ＦＢＳ（ハイクローン社）中のマイトマイシンＣ処理済みＭＥＦ（ステムセル・テクノロジーズ社）上で培養した。ＤＡ分化をＢａｒｂｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１， １２００〜１２０７ （２００３）に従って、変更を加えて誘導した。簡単に説明すると、ゼラチン被覆ディッシュ中のＭＳ５フィーダー細胞上で細胞（１０，０００細胞／１０ｃｍディッシュ）を分化させ、そして、血清代替物培地（ＳＲＭ）上で４日間培養した。第４日にソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ、２００ｎｇ／ｍｌ）及びＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した。分化第７日にＳＨＨ、ＦＧＦ８及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＮ２に培地を交換した。第１１日にＳＨＨ、ＦＧＦ８及びｂＦＧＦの除去、及びアスコルビン酸（ＡＡ、２００μＭ）とＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の添加により終末分化を誘導した。
細胞を第１４〜１５日に４５分間のアキュターゼ処理により回収し、Ｎ２で１回洗浄し、そして、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ‐６４７複合体化抗ＳＳＥＡ‐１抗体（ＢＤファーミンゲン社）と２５分間インキュベートした。細胞をＮ２で１回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁した。生存度を評価するためにＤＡＰＩを添加した。ＭｏＦｌｏ細胞選別機を使用してＦＡＣＳを実施し、ＧＦＰ蛍光（Ｎｕｒｒ１）について目的の集団を選別した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ‐６４７（ＳＳＥＡ‐１）について陽性の集団をネガディブ選別した。ＧＦＰ陰性対照については同じ分化ステージでナイーブＪ１マウスＥＳ細胞を使用した。
Ｎｕｒｒ１：：ＧＦＰ選別細胞を生存度について分析し、そして、ＢＤＮとＡＡを含むＮ２に５５，０００細胞／μｌの終濃度まで再懸濁した。先端を５０μｍにした細いガラス毛細管を使用して次の座標で傷害マウス線条体に１μｌを注入した：ブレグマより０．３ｍｍ後方、１．５ｍｍ外側、及び脳表面に対して２．２ｍｍ腹側。さらなる特徴解析のために細胞懸濁液のアリコットをマトリゲル被覆６ｍｍディッシュに再播種した。
免疫蛍光分析のために細胞を４ｏＣのパラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、５％ＢＳＡ（ＰＢＳ中に０．１％のトリトンＸ‐１００）でブロックし、そして、一次抗体と室温で２時間インキュベートした：ウサギ抗ＧＦＰ（１：１０００、インビトロジェン社）、マウスＩｇＭ抗ＰＳＡ（１：２０００、５Ａ５）、マウス抗ＮｅｕＮ（１：８００、ケミコン社）、マウス抗ＴＨ（１：１０００、シグマ社）、ヤギ抗ＦｏｘＡ２（１：８００、サンタクルーズ社）、ヤギ抗エングレイルド（１：８００、サンタクルーズ社）。その後、細胞をＣｙ複合体化二次抗体（１：１０００、ジャクソン社）とインキュベートした。
ＥｎｄｏＮ処理：ＮＣＡＭよりＰＳＡを除去するために回収の前の晩に、ＰＳＡ７‐９を特異的に取り除くファージの酵素であるｅｎｄｏＮを２０単位で用いて細胞を処理した。その後、細胞を回収し、前に記載したように注入したが、ＢＤＮＦとＡＡ及び５単位のｅｎｄｏＮを含むＮ２に再懸濁した。我々は、傷害マウスへの同じ量のｅｎｄｏＮのみの注射では動物の行動を改善しないと以前に評価した。
ＰＳＴ ｍＲＮＡとＰＳＡ‐ＮＣＡＭのインビトロ分析：ウエスタンブロット分析のために細胞をＷＢ緩衝液（１％のＮＰ４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び抽出直前に添加される１×プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）で処理し、５秒間の超音波処理を２回行い、遠心し、そして、ラエムリ緩衝液（ＬＢ）に再懸濁した。ＬＢを含まないアリコットをタンパク質測定のために保存した。等量のタンパク質を６％ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル（バイオラド社）に負荷した。電気泳動によりタンパク質をポリビニリデン膜（ミリポア社）に転写した。その膜を、５％の脱脂粉乳を含む０．１％トリトンＸ‐１００ＴＢＳ（ＴＢＳ‐Ｔ）中で１〜６時間ブロックし、そして、５％ミルクを含むＴＢＳ‐Ｔ中の抗ＮＣＡＭ抗体（１：１０，０００、サンタクルーズ社）と一晩インキュベートした。その後、ブロットをペルオキシダーゼ複合体化二次抗体（１：１０，０００、ジャクソン社）とインキュベートし、そして、ＥＣＬ検出法（アマシャムファルマシア・バイオテック社）を用いて検出した。イメージＪソフトウェアを用いてタンパク質レベルを定量した。
ｑＲＴ‐ＰＣＲ分析のためにトリゾール（シグマ社）を用いて全ＲＮＡを抽出し、逆転写し（キアジェン社）、そして、１０μｌの２×ＳＹＢＲ反応混合物と２０μｌの終体積に対して０．２μＭのフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて増幅した。ＰＳＡ‐ＮＣＡＭ ＦＡＣＳ分析のために細胞を４５分間のアキュターゼ処理により回収し、１回洗浄し、そして、マウスＩｇＭ抗ＰＳＡ（１：２５０、５Ａ５）と２５分間氷上でインキュベートし、Ｎ２培地で１回洗浄し、そして、Ｃｙ３複合体化抗マウスＩｇＭ（１：２５０、ジャクソン社）と氷上でさらに２５分間インキュベートした。細胞をＮ２で１回洗浄し、７ＡＡＤを含む０．１％ＢＳＡで再懸濁し、そして、ＦＡＣＳカリバー細胞選別機で分析した。対照として一次抗体を添加しなかった。
免疫組織学的方法及び立体解析学的方法：自由浮遊冠状切片をＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ‐１００、５％ロバ血清において室温で３０分間ブロックし、そして、様々な抗体と４℃で４８時間インキュベートした：ウサギ抗ＧＦＰ（１：３００）、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：２００、ケミコン社）、マウス抗ＴＨ（１：２００）、マウスＩｇＭ抗ＰＳＡ（１：１０００）、マウス抗ＮｅｕＮ（１：４００）、ヤギ抗ＦｏｘＡ２（１：３００）、ウサギ抗Ｇｉｒｋ２（１：３００、アロモネ・ラブズ社）、マウス抗シナプシン（１：２００、ＢＤトランスダクション・ラボラトリーズ社）。次に切片を洗浄し、そして、二次抗体：Ｃｙ２複合体化、Ｃｙ３複合体化、及びＣｙ５複合体化ロバ抗体（１：４００、ジャクソン社）とインキュベートした。ＰＳＡにはＣｙ５複合体化ロバ抗ＩｇＭ（１：５００ ジャクソン社）を使用した。インキュベーションを室温で２時間実施した。切片をＰＢＳ中で２回洗浄し、そして、モウィオール（Ｍｏｗｉｏｌ）（カルビオケム社）中でスライドに固定した。脳の３枚の冠状切片のうちの１枚をそれぞれの免疫標識について分析した。３種のレーザー（アルゴン４８８、ＨｅＮｅ５４３及びＨｅＮｅ６３３）を用い、ｃ‐アポクロマット４０倍対物レンズ（水浸）を装着したツァイスＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡によりデジタル画像を収集した。脳全体を包含する３枚の切片のうちの１枚において、４０倍の対物レンズ下でＧＦＰ＋及びＴＨ＋の細胞数を計数し、移植片当たりの細胞の総数を推定した。二重に標識された細胞をｚ軸全体に渡って単一光学平面において分析した。
ＧＦＰ／ＴＨ＋標識細胞及びＧＦＰ／ＦｏｘＡ２＋標識細胞のパーセンテージの分析のために１００個のＧＦＰ＋細胞を各マーカーについて分析した。突起伸長の分析のために４０倍の対物レンズ下で１μｍのピンホールを用いてｚ軸全体（２０〜４０μｍ）にわたって０．８μｍの間隔で共焦点ｚスキャンを実施した。注入部位から外側に突起が観察されなくなるまで切片を走査した。全走査領域を包含する３Ｄ投影図を連続的に整合させた。ＧＦＰ及びＴＨ強度分析のために全走査領域を移植物から１００μｍずつ離れた５つの連続するゾーンに分割し、そして、イメージＪソフトウェアを使用して強度を測定した。移植片サイズのあらゆる差異の可能性を考えて調整するために移植片に最も近いゾーン（ゾーンＩ）における強度に対してデータを正規化した。
統計分析：データは平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として提示されている。スチューデントのｔ検定又はボンフェローニ・ポストホク・テスト付き２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較を実施した。線形回帰分析を実施し、そして、ピアソン相関を用いて定量化した。
次の実施例は精製した細菌性ポリシアル酸トランスフェラーゼであるＰＳＴｎｍを使用する、移植効力を強化するためのｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンに対するＰＳＡの酵素工学を示す。
有効ではあるが、ＰＳＴ遺伝子形質移入はポリシアル酸化の期間にわたって限定的な制御を有するｈＥＳＣの遺伝的改変を必要とした。この実施例は、遺伝子送達の代わりに外来性ＰＳＴｎｍがＰＳＡを誘導したという発見（図３５を参照のこと）について説明する。図３５ＡではＰＳＴ処理されたシュワン細胞（ＳＣ）（緑色の真ん中の線）が接着時間を増加させていたが、一方、ＰＳＴｎｍにより産生されたＰＳＡは接着を阻害した。特に、（Ａ）ＰＳＴｎｍにより産生されたＰＳＡ（赤色の一番下の線）はＰＳＴの強制発現により産生されたＰＳＡ（緑色の真ん中の線）よりもさらに効果的に懸濁状態のシュワン細胞のシュワン細胞単層への接着を阻害する。（Ｂ）ＥＳＣ由来ＨＢ９運動ニューロンにおけるＰＳＡのイムノブロッティングは、ＰＳＴｎｍだけで処理された対照試料が検出不可能なＰＳＡレベルを有したことを示す。ＰＳＴｎｍ＋ＣＭＰ‐シアル酸基質とのインキュベーションにより大きなＰＳＡのバンドが生じ、そのバンドはｅｎｄｏＮ処理により除去される。（Ｃ、Ｄ）ＰＳＴ遺伝子を用いて得られる効果と同様に、分化中のＰＳＴｎｍと基質によるこれらの細胞のポリシアル酸化が神経突起伸長と細胞移動（矢頭）を強化する。（Ｅ）第３０日のｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンのＰＳＡ免疫染色。（Ｆ）この染色はＰＳＴｎｍと基質を用いる処理の後で著しく増大する。（Ｇ）ＰＳＴｎｍのみのインビボ注射は何の効果も有しないが、（Ｈ）基質とのＰＳＴｎｍの共投与はマウス線条体における大量のＰＳＡ発現を引き起こす。
従って、外部よりＰＳＴｎｍで処理された成熟ＤＡニューロンを移植のための細胞の作製に使用することが企図される。哺乳類ＰＳＴとＰＳＴｎｍの両方が化学的に同一であるＰＳＡ鎖を作製した。ｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンに対するＰＳＡの増加（図３５Ｆ）が、ＤＡ線維が移植中核から出るのに充分である数週間の間持続すべきである。ＰＳＴｎｍは移植前に除去されるので、この酵素を混入移植細胞に対する免疫原性が原因ではないはずである。
ＰＳＴｎｍは、強化された溶解性と活性の特徴を有する遺伝子操作断片から作製された（Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａ−２，８−ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｗｉｔｈ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｃｃｅｐｔｏｒｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｌｆ−ｐｒｉｍｉｎｇ ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １８， １７７〜１８６ （２００８））。ＰＳＴｎｍへの曝露、基質への曝露、又は両方への曝露の前にｈＥＳＣの培養物のＤＡニューロンへの分化誘導を行った。定量的免疫蛍光（オペレッタ）とウエスタンブロッティングによって、曝露の様々な時点（１０分から６時間）で培養物を調査してポリシアル酸化の速度とレベルを決定した。このように本明細書に記載される条件を用いて第２５日の分化したｈＥＳＣ由来ＤＡニューロンを至適濃度のＰＳＴｎｍと基質と共にインキュベートする。ＰＳＡ＋ｍＤＡニューロンは本明細書及び図２９に記載される短期アッセイ及び長期アッセイにおいて移植される。
上の明細書で言及された全ての刊行物と特許は参照により本明細書中に援用される。本発明の記載された方法と系の様々な改変と変更が本発明の範囲と精神から逸脱すること無く当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態との関係で説明されたが、請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際には、細胞生物学、神経生物学、癌細胞生物学、分子生物学、生化学、化学、有機合成、又は関連の分野の当業者にとっては明らかである記載された本発明の実施形式の様々な改変が次の特許請求の範囲の範囲内にあるものとされる。

Claims (16)

  1. 万能性幹細胞を分化するためのインビトロの方法であって、
    万能性幹細胞を、少なくとも１つのスモールマザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）シグナル伝達阻害剤に暴露すること、及び前記細胞を、少なくとも１つのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤及び少なくとも１つのウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達活性化剤、に暴露すること；
    ここで、前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）とＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）の両方を発現する分化した細胞を生成するのに有効な量で、前記細胞の前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤への暴露開始から第３日目〜第１１日目にわたって存在する；並びに、
    場合により、更に、前記分化した細胞を、ドーパミンニューロンに成熟させるのに好ましい条件下に置くこと、を含む前記方法。
  2. 前記万能性幹細胞が、ヒト、非ヒト霊長類、又はげっ歯類の非胚性幹細胞、胚性幹細胞、人工非胚性万能性細胞及び遺伝子操作万能性細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  3. ＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａを発現する前記分化細胞が、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、オルトデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）、核受容体関連１タンパク質（ＮＵＲＲ１）、ニューロン特異的ＩＩＩ型β‐チューブリン（Ｔｕｊ１）、トレフォイル因子ファミリー３（ＴＴＦ３）、ペアード様ホメオドメイン３（ＰＩＴＸ３）、アカエテ‐スクート複合体（ＡＳＣＬ）、初期Ｂ細胞因子１（ＥＢＦ‐１）、初期Ｂ細胞因子３（ＥＢＦ‐３）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、シナプシン、ドーパミン・トランスポーター（ＤＡＴ）、及びＧタンパク質共役内向き整流性カリウムチャネル（Ｋｉｒ３．２／ＧＩＲＫ２）、ＣＤ１４２、ＤＣＳＭ１、ＣＤ６３及びＣＤ９９からなる群より選択される少なくとも１つの追加的マーカーを更に発現する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記万能性幹細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤への暴露開始から１１日以内に、前記万能性幹細胞は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）とＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）の両方を発現する神経細胞に分化する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記万能性幹細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤への暴露開始から２５日以内に、前記万能性幹細胞は、前記ドーパミンニューロンに分化する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ドーパミンニューロンの少なくとも２０％が、ＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａを発現し、Ｇｉｒｋ２、ＣＤ１４２、及びＤＣＳＭ１からなる群より選択されるヒトＡ９サブタイプ中脳ドーパミンニューロンの少なくとも１つのマーカーを更に発現する、請求項５に記載の方法。
  7. ＣＤ１４２及びＤＣＳＭ１の一方または他方を発現するドーパミンニューロンの集団を選択することを更に含む、請求項６に記載の方法。
  8. ａ．前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤は、ＬＤＮ‐１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ノギン、ドルソモルフィン、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択されること；
    ｂ．前記少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤は、パルモルファミン、組換えＳＨＨ、精製ＳＨＨ、スムーズンドアゴニスト（Smoothened agonists: SAG）、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択されること；
    ｃ．前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ１、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択されること；
    の１つ以上を特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. ＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａを発現する前記分化細胞は、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２、及びＬＨＸ２からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを発現しない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤は、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン‐ノーダルシグナル伝達阻害剤及び少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン‐ノーダルシグナル伝達阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９である、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記少なくとも１つのウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達活性化剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）シグナル伝達阻害剤を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記ＧＳＫ３βシグナル伝達阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記インビトロで分化した細胞は、中脳底板前駆細胞である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記分化した細胞をドーパミンニューロンに成熟させるのに好ましい前記条件は、
    前記分化した細胞を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子タイプβ３（ＴＧＦβ３）、又はそれらの組み合わせと接触させることを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
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