CN117202914A - 一种质控和富集人多巴胺能神经前体细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了鉴别、分离和/或富集多巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括检测候选细胞是否具备下述一种或多种特征：CLSTN2+，PTPRO+，NTRK3+，FLRT2+，KITLG+，CD83+，和/或LMX1A+EN1+，以及根据所述方法得到的细胞产品。还提供了评价细胞产品、优化细胞产品制备过程的方法。所述的产品和方法可用于治疗神经系统疾病或病症。
Description
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种使用新型细胞表面标记物或转录因子组合质控和富集人多巴胺能神经前体细胞的方法。
帕金森氏症(PD)是继阿尔兹海默病之后，第二常见的中枢神经系统退行性疾病。临床上尚无治愈帕金森氏症的有效治疗方案，目前的治疗方法主要是对症治疗，包括以左旋多巴为代表的药物治疗和脑深部电刺激。然而药物治疗只在早期阶段有效，而脑深部刺激只适用于部分病人，且会引起抑郁症等副作用。目前针对PD治疗有较大前景的是细胞移植和替代疗法(细胞治疗)。在PD细胞治疗中，通常使用人多能干细胞(hPSCs)，包括人胚胎干细胞(hESCs)和人诱导多能干细胞(hPSCs)，通过体外分化得到包含中脑多巴胺(mDA)神经前体细胞在内的中脑腹侧神经细胞类群，这些细胞移植后可以分化成熟得到含有mDA神经元的移植物，从而解救帕金森氏症患者的运动功能障碍。
然而仍存在许多限制PD细胞治疗广泛临床应用的问题。
首先，缺乏有效的细胞制剂的质控和评估方法。在PD细胞治疗中，通常是移植未成熟的神经前体(干)细胞，而不是终末神经元，这些未成熟的神经前体(干)细胞在移植之前不表达终末神经元的特征性基因。同时hPSCs分化得到的并不是单一类型的神经前体(干)细胞，而是包括mDA神经前体细胞在内的多种类型和命运的神经前体(干)细胞的混合物。在临床治疗中，需要在病人移植手术之前对同一批次的细胞制剂进行抽样，并移植到模型动物脑内，至少3个月后进行免疫组化检测，才能明确移植至病人体内的目的神经元-mDA神经元在移植物中的比例，这一评估方法耗时长，工作量大。
获益于以小鼠为模型的mDA神经元发育过程的解析，现有技术中通过对多巴胺能神经元发育过程中一些关键基因(包括底板的标记分子FOXA2、中前脑的标记分子OTX2、腹侧间脑-中脑的标记分子LMX1A和中脑-后脑的标记分子EN1)的表达进行检测，以评估hPSCs来源的细胞制剂中特定mDA神经前体细胞的比例，然而这些基因并不只在mDA神经前体细胞内表达，且研究发现这些基因在神经前体细胞中表达的高低和移植后mDA神经元的比例也没有相关性。此外，核酸和蛋白质水平表达的差异化，以及随之带来的检测难度，使得在 分化过程中，在mDA神经前体细胞上表达增加的基因并不一定能作为评估或质控的分子标记物。因此，尽管很多国家都在进行基于hPSCs神经分化的PD细胞治疗临床实验，但是对于PD细胞治疗制剂并没有科学意义上的评估和质控方法。
其次，细胞移植后目的神经细胞比例低。在基于hPSCs神经分化的PD细胞治疗中，不同分化方法得到的细胞制剂在移植后，目的多巴胺能神经元的比例不高，并且差异很大，大约在0.3％-20％左右。目前尚无有效且特异的mDA神经前体细胞的标记分子。事实上，目前研究认为的mDA标记分子(例如CORIN、FOXA2、LMX1A)在很多其它神经细胞内也有表达，其表达不特异。目前利用这些标记分子都不能明显富集mDA神经元，或者富集程度不高。
最后，脑内移植组织的细胞组成不明确。在基于hPSCs神经分化的PD细胞治疗中，移植块中占绝大多数的是非多巴胺能神经细胞(80％-99.7％)，其类型和身份远未研究清楚。同时移植组织中的非目的神经细胞也是潜在副作用的来源。脑内移植细胞组成不明确，也为PD细胞治疗的安全性和长期潜在副作用的评估带来了困难。
因此，亟需一种质控、富集或评估PD细胞疗法产品的方法。
发明内容
本申请的发明人惊讶地发现了中脑多巴胺能(mDA)神经前体细胞的一种或多种新型分子标记物：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。本申请提供了这些分子标记物应用于多巴胺能神经前体细胞或细胞群的鉴别、分离和/或富集的方法，以及通过所述方法制备得到的细胞产品和/或细胞制剂。
此外，当用于本申请中的产品和/或方法时，与单独利用标记物LMX1A
+或单独利用标记物EN1
+相比，使用LMX1A
+EN1
+双标记物能够获得显著更好的技术效果(例如，显著更好的鉴别、分离和/或富集效果)。
根据本申请的方法制备得到的细胞产品和/或细胞制剂分化后的移植物具有高比例(例如，大于30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、95％或更高)的mDA神经元(主要是黒质多巴胺能神经元)。
本申请提供的移植物可以具有令人惊讶的一致性的细胞组成(例如，可以被scRNA-seq分析和/或组织学分析所验证)，可见该移植物被移植后的结果也可以是稳定的和/或可预测的。本申请提供的移植物的细胞组成稳定且可预测，极大地提高了PD细胞治疗的有效性和安全性。本申请在新型的mDA神经前体细胞的分子标记物的基础上，为临床级PD细胞治疗制剂的生产和制造提供了质量控制和纯化，以及长期移植预后的可预测性提供了一系列产品和 方法，对PD细胞替代疗法的临床应用提供了指导意义。
同时，根据本申请的方法制备得到的细胞产品和/或细胞制剂分化后的移植物可以具有更高的治疗效力(换句话说，具有达到治疗效果仅需要低剂量的移植细胞的优势)。例如，显著减少本申请的方法制备得到的细胞产品和/或细胞制剂分化后的移植物的移植细胞数量(例如，可以减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高)，仍可以达到常规方法获得的细胞产品或其移植物的治疗效果(例如针对PD的治疗效果)。
此外，根据本申请的方法制备得到的细胞产品和/或细胞制剂分化后的移植物可以提供更强的多巴胺能神经元支配。
本申请提供了一种鉴别多巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括：判断候选细胞是否具备下述一种或多种特征：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+；将具备所述特征的细胞鉴别为多巴胺能神经前体细胞。
另一方面，本申请提供了一种预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：鉴别候选细胞是否具备下述一种或多种特征：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+；挑选具备所述特征的细胞；和向有需要的受试者施用有效剂量的具备所述特征的细胞。在某些实施方式中，所述神经系统疾病或病症包括帕金森氏症。
在某些实施方式中，所述候选细胞为神经前体细胞。
在某些实施方式中，所述候选细胞源自多能干细胞。
在某些实施方式中，所述候选细胞源自人多能干细胞。
在某些实施方式中，所述候选细胞已在体外分化至少约10天。
在某些实施方式中，所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：CLSTN2
+。
在某些实施方式中，所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的CLSTN2的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述CLSTN2的表达和/或活性水平包括编码CLSTN2的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或CLSTN2蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述检测包括对所述候选细胞进行修饰。
在某些实施方式中，所述检测包括使用标记分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括标记基因蛋白质、核酸和/或小分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括荧光报告基因。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性结合CLSTN2蛋白的试剂和/或能够测定CLSTN2蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性扩增编码CLSTN2的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码CLSTN2的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：PTPRO
+。
在某些实施方式中，所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的PTPRO的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述PTPRO的表达和/或活性水平包括编码PTPRO的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或PTPRO蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述间接检测包括对所述候选细胞进行修饰。
在某些实施方式中，所述间接检测包括使用标记分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括荧光报告基因。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性结合PTPRO蛋白的试剂和/或能够测定PTPRO蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性扩增编码PTPRO的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码PTPRO的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：NTRK3
+。
在某些实施方式中，所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的NTRK3的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述NTRK3的表达和/或活性水平包括编码NTRK3的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或NTRK3蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述检测包括对所述候选细胞进行修饰。
在某些实施方式中，所述检测包括使用标记分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括荧光报告基因。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性结合NTRK3蛋白的试剂和/或能够测定NTRK3蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性扩增编码NTRK3的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码NTRK3的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：FLRT2
+。
在某些实施方式中，所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的FLRT2的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述FLRT2的表达和/或活性水平包括编码FLRT2的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或FLRT2蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述检测包括对所述候选细胞进行修饰。
在某些实施方式中，所述检测包括使用标记分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括荧光报告基因。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性结合FLRT2蛋白的试剂和/或能够测定FLRT2蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性扩增编码FLRT2的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码FLRT2的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：KITLG
+。
在某些实施方式中，所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的KITLG的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述KITLG的表达和/或活性水平包括编码KITLG的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或KITLG蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述检测包括对所述候选细胞进行修饰。
在某些实施方式中，所述检测包括使用标记分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括荧光报告基因。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性结合KITLG蛋白的试剂和/或能够测定KITLG蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性扩增编码KITLG的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码KITLG的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：CD83
+。
在某些实施方式中，所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的CD83的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述CD83的表达和/或活性水平包括编码CD83的核酸分子的表达 和/或活性水平，和/或CD83蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述检测包括对所述候选细胞进行修饰。
在某些实施方式中，所述检测包括使用标记分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括荧光报告基因。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性结合CD83蛋白的试剂和/或能够测定CD83蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性扩增编码CD83的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码CD83的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：LMX1A
+EN1
+。
在某些实施方式中，所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的LMX1A表达和/或活性水平，和EN1的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述LMX1A的表达和/或活性水平包括编码LMX1A的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或LMX1A蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述EN1的表达和/或活性水平包括编码EN1的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或EN1蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述检测包括对所述候选细胞进行修饰。
在某些实施方式中，所述检测包括使用标记分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
在某些实施方式中，所述标记分子包括荧光报告基因。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性结合LMX1A蛋白的试剂和/或能够测定LMX1A蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性扩增编码LMX1A的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码LMX1A的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性结合EN1蛋白的试剂和/或能够测定EN1蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括使能够特异性扩增编码EN1的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码EN1的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
另一方面，本申请提供了细胞产品，其包含所述的方法得到的多巴胺能神经前体细胞。
另一方面，本申请提供了分离多巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括(a)提供 神经前体细胞群，(b)分离所述神经前体细胞群中具备下述一种或多种特征的细胞：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。
另一方面，本申请提供了富集多巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括(a)提供神经前体细胞群，(b)富集所述神经前体细胞群中具备下述一种或多种特征的细胞：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。
在某些实施方式中，所述方法包括(a)提供神经前体细胞群，(b)分离或富集所述神经前体细胞群中CLSTN2
+的细胞。
在某些实施方式中，所述方法包括(a)提供神经前体细胞群，(b)分离或富集所述神经前体细胞群中CLSTN2
+的细胞。
在某些实施方式中，所述方法包括(a)提供神经前体细胞群，(b)分离或富集所述神经前体细胞群中LMX1A
+EN1
+的细胞。
另一方面，本申请提供了多巴胺能神经前体细胞群，其包含根据所述的方法得到的多巴胺能神经前体细胞。
另一方面，本申请提供了制备细胞产品的方法，其包括(a)提供神经前体细胞，(b)分离和/或富集具备下述一种或多种特征的神经前体细胞：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。
在某些实施方式中，所述方法包括由细胞群体分化获得所述神经前体细胞。
在某些实施方式中，所述细胞群体源自啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞。
在某些实施方式中，所述细胞群体源自多能干细胞。
在某些实施方式中，所述细胞群体源自人多能干细胞。
在某些实施方式中，所述方法包括将所述细胞群体与ALK抑制剂、音猥因子(SHH)信号传导激活剂和GSK-3抑制剂接触。
在某些实施方式中，所述ALK包括ALK2抑制剂、ALK4抑制剂、ALK5抑制剂和/或ALK7抑制剂。
在某些实施方式中，所述ALK4抑制剂包括SB431542。
在某些实施方式中，所述ALK2抑制剂包括DMH-1。
在某些实施方式中，所述SHH信号传导激活剂包括SHH C25II、SAG和/或Purmorphamine。
在某些实施方式中，所述GSK-3抑制剂包括CHIR99021。
在某些实施方式中，所述接触在能够使所述细胞群体能够分化为中脑底板前体细胞的条 件下进行。
在某些实施方式中，所述神经前体细胞能够分化为神经细胞，且所述神经细胞中包含至少30％的多巴胺能神经细胞。
在某些实施方式中，所述分化包括体外分化和体内分化。
另一方面，本申请提供了用于评估细胞产品的方法，所述方法包括检测所述细胞产品中具备下述一种或多种特征的细胞的比例：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+，以进行所述评估。
另一方面，本申请提供了优化细胞产品制备过程的方法，所述方法包括检测所述细胞产品中具备下述一种或多种特征的细胞的比例：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+，以进行所述优化。
在某些实施方式中，所述制备过程包括优化细胞产品的产生、分化、分离和/或纯化。
另一方面，本申请提供了由所述细胞产品经过进一步扩增和增殖得到的细胞制剂。
另一方面，本申请提供了CLSTN2
+指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
另一方面，本申请提供了PTPRO
+指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
另一方面，本申请提供了NTRK3
+指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
另一方面，本申请提供了FLRT2
+指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
另一方面，本申请提供了KITLG
+指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
另一方面，本申请提供了CD83
+指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
另一方面，本申请提供了LMX1A
+EN1
+指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
另一方面，本申请提供了制备多巴胺能神经前体细胞的质控试剂盒，其包括质控试剂，所述质控试剂能够用于判断候选细胞是否具备下述一种或多种特征：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。
在某些实施方式中，所述试剂盒包括能够培养和/或保存所述候选细胞的试剂。
在某些实施方式中，所述候选细胞为神经前体细胞。
在某些实施方式中，所述候选细胞源自多能干细胞。
在某些实施方式中，所述候选细胞源自人多能干细胞。
在某些实施方式中，所述候选细胞已在体外分化至少约10天。
在某些实施方式中，所述能够培养和/或保存所述候选细胞的试剂与所述质控制剂独立包装。
在某些实施方式中，所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的CLSTN2的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述CLSTN2的表达和/或活性水平包括编码CLSTN2的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或CLSTN2蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述质控试剂包括能够特异性扩增编码CLSTN2的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码CLSTN2的核酸分子的探针。
在某些实施方式中，所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的PTPRO的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述PTPRO的表达和/或活性水平包括编码PTPRO的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或PTPRO蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述质控试剂包括能够特异性扩增编码PTPRO的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码PTPRO的核酸分子的探针。
在某些实施方式中，所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的NTRK3的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述NTRK3的表达和/或活性水平包括编码NTRK3的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或NTRK3蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述质控试剂包括能够特异性扩增编码NTRK3的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码NTRK3的核酸分子的探针。
在某些实施方式中，所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的FLRT2的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述FLRT2的表达和/或活性水平包括编码FLRT2的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或FLRT2蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述质控试剂包括能够特异性扩增编码FLRT2的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码FLRT2的核酸分子的探针。
在某些实施方式中，所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的KITLG的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述KITLG的表达和/或活性水平包括编码KITLG的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或KITLG蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述质控试剂包括能够特异性扩增编码KITLG的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码KITLG的核酸分子的探针。
在某些实施方式中，所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的CD83的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述CD83的表达和/或活性水平包括编码CD83的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或CD83蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述质控试剂包括能够特异性扩增编码CD83的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码CD83的核酸分子的探针。
在某些实施方式中，所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的LMX1A表达和/或活性水平，和EN1的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述LMX1A的表达和/或活性水平包括编码LMX1A的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或LMX1A蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述EN1的表达和/或活性水平包括编码EN1的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或EN1蛋白的表达和/或活性水平。
在某些实施方式中，所述质控试剂包括能够特异性结合LMX1A蛋白的试剂和/或能够测定LMX1A蛋白活性的试剂。
在某些实施方式中，所述质控试剂包括能够特异性结合EN1蛋白的试剂和/或能够测定EN1蛋白活性的试剂。
另一方面，本申请提供了控制制备的多巴胺能神经前体细胞的质量的方法，其包括以下步骤：a)检测制备的细胞中具备下述一种或多种特征的细胞的比例：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+；b)如果步骤a)检测到的比例为至少约10％，则所述制备的多巴胺能神经前体细胞的质量符合要求。
在某些实施方式中，如果步骤a)检测到的比例为至少约30％，则所述制备的多巴胺能神经前体细胞的质量符合要求。
另一方面，本申请提供了分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群，其特征为表达下述一种或多种多巴胺能神经前体细胞标记物：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+， CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。
在某些实施方式中，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为CLSTN2
+。
在某些实施方式中，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为PTPRO
+。
在某些实施方式中，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为NTRK3
+。
在某些实施方式中，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为FLRT2
+。
在某些实施方式中，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为KITLG
+。
在某些实施方式中，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为CD83
+
在某些实施方式中，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为LMX1A
+EN1
+。
另一方面，本申请提供了多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达下述一种或多种多巴胺能神经前体细胞标记物：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达CLSTN2。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达PTPRO。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达NTRK3。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达FLRT2。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达KITLG。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达CD83。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达LMX1A和EN1。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达下述一种或多种多巴胺能神经前体细胞标记物：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％， 80％，或90％的细胞表达CLSTN2。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达PTPRO。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达NTRK3。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达PTPRO+。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达FLRT2。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达CD83。
在某些实施方式中，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达LMX1A和EN1。
另一方面，本申请提供了细胞产品，所述细胞产品包含根据本申请所述方法得到的多巴胺能神经前体细胞。
另一方面，本申请提供了细胞产品，所述细胞产品包含本申请所述的多巴胺能神经前体细胞群。
另一方面，本申请提供了移植物组合物，其由本申请所述的多巴胺能神经前体细胞群在体内或者体外分化而来。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含本申请所述的多巴胺能神经前体细胞群或本申请所述的细胞产品。
在某些实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本申请所述的多巴胺能神经前体细胞群、所述细胞产品和/或所述药物组合物。
在某些实施方式中，所述神经系统疾病或病症包括帕金森氏症。
另一方面，本申请提供了本申请所述的多巴胺能神经前体细胞群、所述细胞产品和/或所述的药物组合物在制备预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症的药物中的用途。
在某些实施方式中，所述神经系统疾病或病症包括帕金森氏症。
另一方面，本申请提供了所述的多巴胺能神经前体细胞群、所述细胞产品，和/或所述 药物组合物，其用于预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症。
在某些实施方式中，所述神经系统疾病或病症包括帕金森氏症。
另一方面，本申请还包括上述体内或体外分化后的移植物(例如，移植物组合物)，以及对这些移植物或移植组合物的使用。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是进行scRNA-seq的人干细胞体外分化采样时间点示意图。
图2显示的是使用t-SNE可视化人干细胞体外mDA分化每个阶段的聚类结果。水平比率条指示细胞类型的比例，并以相应的细胞群深浅度显示。
图3和图4显示的是mDA谱系的多个关键转录因子(例如EN1和LMX1A)和中脑腹侧底板神经前体细胞标记物在第21天(图3)和第28天(图4)前体细胞群的umap聚类图的中的表达。
图5显示的是mDA谱系的两个关键转录因子(EN1和LMX1A)和CLSTN2、PTPRO在第21天(上排)和第28天(下排)前体细胞群的umap聚类图的中的表达。
图6显示的是umap聚类中NTRK3、FLRT2、KITLG和CD83在第21天scRNA-seq数据(左)和第28天scRNA-seq数据(右)的表达。
图7显示的是双报告细胞系图和批量RNA-seq和scRNA-seq数据联合分析的示意图。
图8显示的是LMX1A-tdTomato hESC系的PCR鉴定(图8的左图)，基于重组臂左臂(LA)和右臂(RA)的正确靶向LMX1A基因编辑的预期PCR产物分别为
和
通过
的PCR产物鉴定是否纯合克隆。那些没有
PCR产物的克隆是纯合克隆。母细胞系(H9 ESC)作为对照，以及LMX1A-tdTomato/EN1-mNeonGreen hESC系的PCR鉴定(图8的右图)。基于重组臂左臂(LA)和右臂(RA)正确靶向的EN1基因编辑的预期PCR产物分别为
和
通过
的PCR产物鉴定是否纯合克隆。没有
PCR产物的克隆是纯合克隆。母细胞系(H9 ESC)作为对照。选择的克隆是杂合的。
图9显示的是使用LMX1A-tdTomato/EN1-mNeonGreen hESC系在mDA分化第21天时的FACS典型图。LMX1A
+EN1
+细胞约占总细胞的30％。
图10显示的是热图中四组细胞群的DEG表达情况(第21天LMX1A
+EN1
+，第21天Others，第28天LMX1A
+EN1
+和第28天Others)。Others代表其他细胞，包括LMX1A
-EN1
-，LMX1A
+EN1
-和LMX1A-EN1
+一起收集的细胞。代表性标记基因在热图的右侧列出。方框框出的基因来自第21天LMX1A
+EN1
+和第28天LMX1A
+EN1
+DEG。
图11显示的是火山图中在第21天LMX1A
+EN1
+与其他细胞，第28天LMX1A
+EN1
+与其他细胞以及第21天LMX1A
+EN1
+与第28天LMX1A
+EN1
+细胞的差异表达基因。使用阈值确定分配的DEG(方框内的点)：Log2倍数变化>2，p值＝10-3。放大的点是代表细胞类型的标记基因(LMX1A，HOXA2，PHOX2B和OLIG2)或分子标记物基因(CLST2N，PTPRO和NTRK3)。与第28天LMX1A
+EN1
+组相比，第21天LMX1A
+EN1
+的点(PTPRO，各图中两个方框之间的区域)放大表示PTPRO具有显著性，但未达到Log2倍数变化阈值。
图12的A显示的是使用图10中相同的DEG分别显示第21天(顶部)和第28天(底部)细胞群的表达情况。星号所在群分别是第21天的P_MesenFP_LMX1A_Early和第28天的P_MesenFP_LMX1A_Late，它们是假定的mDA前体细胞群。方框内的基因来自第21天LMX1A
+EN1
+和第28天LMX1A
+EN1
+的DEG，与图10相同。图12的B显示的是热图中分别基于第21天(顶部)和第28天(底部)的scRNA-seq数据，对批量RNA测序样品中的LMX1A
+EN1
+和Others细胞群作细胞类型比例估算。在所包括的细胞类型中，将估算比例标准化为总和为1。星号所在群分别是第21天的P_MesenFP_LMX1A_Early和第28天的P_MesenFP_LMX1A_Late，它们是假定的mDA前体细胞群。
图13的A显示的是两种质粒构建体示意图。SP代表所选表面标记基因的信号肽。在构建体I中，SP和其余氨基酸编码序列之间插入了3xHA标签，而在构建体II中3xHA标签融合于表面标记基因氨基酸序列之后。图13的B和C在HEK293T细胞中，磷酸钙转染构建体I(上)和构建体II(下)，用抗HA抗体分别做活染(B)和固定/破膜(C)的免疫细胞化学。对于活染细胞免疫，仅在3xHA标签位于细胞膜外的构建体I中可以检测到HA信号，而无法在3xHA位于细胞内结构域的构建体II中检测到HA信号(B)。
图14显示的是表面分子标记物报告细胞系的构建。图14A显示了CLSTN2-和PTPRO-tdT hPSC细胞系的PCR基因分型。LA和RA在CLSTN2基因位点预期插入PCR产物分别为～2200bp和～2800bp。纯合子，～680bp。LA和RA在PTPRO基因位点预期插入PCR产物分别为～3000bp；～1600bp；纯合子，～300bp。图14B显示了使用CSLTN2-或PTRPO-tdT hPSC细胞系在mDA分化的III期(CLSTN2)和IV期(PTPRO)的典型FACS图像。
图15显示的是分子标记物LMX1A和EN1的组合、CLSTN2和PTPRO对mDA神经元的体外富集。其中，图15A显示了标记物基因报告细胞系的基因编辑示意图，并且将分选获得的神经细胞进行体外和体内成熟的实验示意图。通过FACS对前体细胞进行分选，并重新聚集成神经球，然后在体外进行成熟，或者将其移植到PD小鼠的大脑中进行体内成熟。图15B-图15E显示了用腹侧中脑标记分子LMX1A(图15B)和OTX2(图15C)的抗体进行体外免疫染色的神经球。比例尺，25μm。神经球中LMX1A+(图15D)和OTX2+细胞(图15E)的定量比率。使用Holm-Sidak校正的多重非配对t检验。图15F-15H显示CLSTN2和PTPRO可预测mDA神经元分化，并可在神经前体细胞分选和体外成熟后产生高度富集的mDA神经元。图15F显示了TH+的结果。图15G显示了使用Holm-Sidak校正的多重非配对t检验的结果，3批，每批5个神经球。比例尺，25μm。图15H显示表达CLSTN2神经前体细胞的比率与分选富集后成熟神经球内TH神经元比率之间的相关性(左，CLSTN2-TH；右，PTPRO-TH)。
图16显示的是hiPSCs表面分子标记物报告细胞系的构建，表面分子标记物对hiPSCs来源的mDA神经细胞的作用神经，以及feeder-free条件下mDA神经细胞的富集作用。在两个独立的hiPSC细胞系上构建CLSTN2或PTPRO报告细胞系。图16A和图16B分别显示CLSTN2-和PTPRO-tdT hiPSC细胞系的PCR基因分型，其中将相应的母细胞系(XZ#2hiPSC系或ZYW#2hiPSC，标记为WT)作为对照。图16C-图16D显示在阶段III(CLSTN2)使用CSLTN2-tdT(图16C)hiPSC，或者在阶段IV(PTPRO)使用PTPRO-tdT(图16D)hiPSC细胞系进行hiPSCs来源的神经前体细胞的FACS检测的典型图像。图E-H显示的是分选组和未分选组体外成熟神经球免疫染色TH的典型图及TH阳性细胞比率的统计结果。图16I显示feeder-free条件下hESCs来源的神经前体内CLSTN2阳性细胞的比率。图16J-图16K显示CLSTN2对feeder-free条件下hESCs来源的mDA神经元的体外富集作用。比例尺，25μm。非配对t检验。数据表示为平均值±SEM。***p<0.001。
图17显示的是分子标记物LMX1A和EN1的组合、CLSTN2和PTPRO对mDA神经元的体内富集。其中，图17A分别显示的是由未分选的前体细胞，CLSTN2分选出的前体细胞 和PTPRO分选出的前体细胞为来源的移植物，并做人细胞核(HNA)和TH的免疫染色。图17B显示移植物中TH+神经元比率的量化结果。N＝6(未分选)、5(CLSTN2)和7(PTPRO)。单因素方差分析，再进行Tukey的多重比较检验。图17C显示了阶段IIILMX1A
+EN1
+神经前体细胞和IV期LMX1A
+EN1
+神经前体细胞衍生移植物，用人细胞核(hN))和TH进行免疫染色的结果。比例尺，100μm。其中(i)和(ii)分别代表移植物的边缘和中心区域。比例尺，20μm。图17D显示移植物中TH+神经元比率的量化。N＝5(阶段III LMX1A
+EN1
+)和8(阶段IV LMX1A
+EN1
+)。单因素方差分析，然后Tukey多重比较检验。
图18显示的是富集mDA神经元的细胞特性。用FOXA2、hN和TH(图18A)和FOXA2
+细胞(图18B)比率定量的典型移植物免疫染色。比例尺，20μm。N＝7(Unsort),6(CLSTN2),6(PTPRO),5(stage III LMX1A
+EN1
+)和6(stage IV LMX1A
+EN1
+)。单因素方差分析，然后是Tukey的多重比较检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图18C用hN和DAT(上)或PITX3(下)进行移植免疫染色。比例尺，20μm。图18D：DAT
+TH
+/TH
+细胞(左)和PITX3
+TH
+/TH
+细胞(右)比率的量化。图18E和图18F：移植物免疫染色hN和GIRK2(顶部)或CB(底部)和mDA亚型在总TH
+神经元比率中的量化(F)。比例尺，20μm。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图19显示的是通过移植分选或不分选富集的mDA前体细胞移植后的细胞组成分析。其中，(A)用于移植物单细胞测序的细胞系示意图和实验示意图，(B)代表移植物主要细胞类型的典型基因表达，(C)表示移植物中的主要细胞类型组成，(D)神经细胞进一步聚类分析，(E)各类型神经细胞的典型的标记基因，(F)每组移植物的神经细胞亚型比率(未分选组，CLSTN2分选组和PTPRO分选组)。
图20的A分别显示的是由未分选的前体细胞，CLSTN2分选出的前体细胞和PTPRO分选出的前体细胞为来源的移植物，并做人细胞核(HNA)，TH和DAT的免疫染色典型图。其中，通过5-羟色胺能神经元标记基因5-HT(B)或GABA能神经元标记基因GABA(D)和mDA标记基因TH进行免疫染色的典型图。各移植组的5-HT+神经元比率(C)和GABA+神经元比率(E)的定量分析。
图21显示的是移植物细胞类型的组成。其中，图21A使用scRNA-seq数据计算的每个移植组的VLMC亚型比率。图21B显示LMX1A和EN1组合分选细胞来源的移植物的典型图像，由5-HT或GABA和TH免疫染色(左)。移植物中5-HT
+和GABA
+神经元比率(右) 的量化。图21C-G显示各组移植物中少突胶质细胞或少突胶质前体细胞标记Olig2(图21C)、星形胶质细胞标记GFAP(图21D)、VLMC标记COL1A1(图21E)和hN的免疫组化染色。Olig2
+细胞(图21F)比例、GFAP
+细胞(图21G)比例的量化。
图22显示富含CLSTN2或PTPRO的神经前体细胞在移植后会产生更小的移植物但更密集的多巴胺能神经支配。图22A显示hNCAM与移植神经元的免疫染色显示hNCAM
+纤维在背侧纹状体(尾状壳核，CPu；插图框i)和腹侧纹状体(外侧伏隔核壳，LAcbSh；插图框ii；嗅结节，Tu；插图中)的分布和延伸方框三)。白色星号表示移植部位。比例尺，500μm。图22B显示在6个月时通过hN染色估计的移植体积。N＝9(未分选)、7(CLSTN2)、8(PTPRO)。单因素方差分析，然后是Tukey的多重比较检验。图22C显示表面标记衍生移植物中TH特异性组织学评估和电生理记录的示意图。图22D显示CLSTN2-(左)或PTPRO衍生(右)移植物中TH+神经元中tdT的免疫染色。方框区域在右侧被放大。白色箭头表示共表达tdT和TH的神经元。比例尺，20μm。图22E显示用于tdT的移植物免疫染色的连续冠状切片。白色星号表示移植部位。比例尺，500μm。图22F显示通过在移植物中标记tdT(代表TH)的典型免疫组织化学图像。比例尺，500μm。图22G显示量化四个随机区域移植物的tdT像素的平均灰度值。单因素方差分析，然后是Tukey的多重比较检验。
图23显示跨不同大脑区域的移植纤维神经支配和mDA神经元的突触整合。图23A显示III期或IV期LMX1A
+EN1
+组中的hNCAM
+纤维分布和延伸。白色星号表示移植部位。比例尺，500μm。图23B显示检查各组不同大脑区域的hNCAM纤维延伸。比例尺，500μm。图23C显示6个月时III期或IV期LMX1A
+EN1
+组中的移植体积。N＝5(III期LMX1A
+EN1
+)和8(IV期28LMX1A
+EN1
+)。图23D显示共同标记人类特异性纤维STEM121和TH的移植物。比例尺，100μm。插图框代表延伸接枝纤维的放大视图。比例尺，20μm。图23E显示通过在CLSTN2衍生移植物中共同标记人类特异性突触素和TH的典型免疫组织化学图像。方框区域在右侧被放大。白色箭头表示人类特异性突触素与TH沿TH纤维的共定位。比例尺，20μm。
图24显示移植mDA神经元的电生理记录。图24A和图24B显示移植后5个月，来自全细胞膜片钳记录的移植mDA神经元的电流诱导AP(图24A)和电流诱导单个AP(图24B)的典型图。图24C和图24D来自移植mDA神经元静息膜电位(图24C)、阈值(图24D)和后超极化后(AHP)(图24E)。图24F和图24G显示斜坡电流诱导的AP(100–300pA，持续时间2000ms)(图24F)和移植mDA神经元的斜坡电流诱导的AP的最大频率的统计(图24G)。记录的单元数，n＝23(未分选)、11(CLSTN2)、18(PTPRO)。图24H和图 24I显示sIPSCs(图22H)和sEPSCs(图24I)的振幅。图24J显示苯丙胺诱导的旋转行为在移植后6个月内发生变化。N＝9(III期LMX1A
+EN1
+)和8(V期LMX1A
+EN1
+)。
图25显示富含CLSTN2或PTPRO的神经前体细胞整合到宿主电路中并表现出更高的治疗效力。图25A-25D显示自发动作电位(SAP)(图25A)和SAP频率(图25B)的全细胞膜片钳记录的典型轨迹，显示来自移植mDA神经元的sag(图25C)和sag的统计(图25D)。记录的单元数，n＝24(未分选)、15(CLSTN2)、22(PTPRO)。单因素方差分析，然后是Tukey的多重比较检验。图25E显示移植后5个月，移植的人mDA神经元中sIPSCs(上)和sEPSCs(下)的典型轨迹。图25F-25G绘制了sIPSCs(图25F)和sEPSCs(图25G)的频率。小鼠数量，n＝4(未分选)，3(CLSTN2)，4(PTPRO)。记录的sEPSC细胞数，n＝16(未分选)、16(CLSTN2)、20(PTPRO)。记录的sIPSC细胞数，n＝16(未分选)、18(CLSTN2)、20(PTPRO)。图25H和图25I显示苯丙胺诱导的PD小鼠在移植后6个月内的旋转行为变化。每只小鼠的移植剂量为100,000个细胞(图25H)。N＝5(aCSF)、9(未分选)、11(CLSTN2)、9(PTPRO)。图25I显示每只小鼠的移植剂量为7,500个细胞。使用H9-CLSTN2-P2A-tdT细胞系。N＝4(未分选)，3(分选)。使用Dunnett的多重比较检验与未分选组比较的双向ANOVA。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“CD83”通常是指分化簇83，也可称为BL11或HB15，CD83蛋白是I型跨膜蛋白质，属于受体免疫球蛋白超家族的成员。所述“CD83”可包括全长的CD83、以及CD83的截短体、功能性片段、不同的转录本、剪接变体和亚型，天然存在的CD83、人工修饰的或突变的CD83蛋白。关于“CD83”的基因信息可参考Ensembl数据库登录号ENSG00000112149，关于“CD83”的蛋白信息可参考UniProt数据库登录号Q01151。在本申请中，所述“CD83”可以作为多巴胺能神经前体细胞的分子标记物。
在本申请中，术语“CLSTN2”通常是指钙调素2，也可称为CDHR13、CS2、CSTN2和FLJ39113，是一种膜蛋白。所述“CLSTN2”可包括全长的CLSTN2、以及CLSTN2的截短体、功能性片段、不同的转录本、剪接变体和亚型，天然存在的CLSTN2、人工修饰的或突变的CLSTN2蛋白。关于“CLSTN2”的基因信息可参考Ensembl数据库登录号 ENSG00000158258，关于“CLSTN2”的蛋白信息可参考UniProt数据库登录号Q9H4D0。在本申请中，所述“CLSTN2”可以作为多巴胺能神经前体细胞的分子标记物。
在本申请中，术语“FLRT2”通常是指纤连蛋白富含亮氨酸的重复跨膜蛋白2，是一种是I型跨膜蛋白质。FLRT2蛋白在细胞间粘附、细胞迁移和轴突导向中起作用。所述“FLRT2”可包括全长的FLRT2、以及FLRT2的截短体、功能性片段、不同的转录本、剪接变体和亚型，天然存在的FLRT2、人工修饰的或突变的FLRT2蛋白。关于“FLRT2”的基因信息可参考Ensembl数据库登录号ENSG00000185070，关于“FLRT2”的蛋白信息可参考UniProt数据库登录号O43155。在本申请中，所述“FLRT2”可以作为多巴胺能神经前体细胞的分子标记物。
在本申请中，术语“KITLG”通常是指受体型蛋白酪氨酸激酶KIT的配体，也称为DFNA69、FPH2、Kitl、KL-1、MGF、SCF、SF和/或SLF。在调节细胞存活和增殖、造血、干细胞维持、配子发生、肥大细胞发育、迁移和功能以及黑色素形成中起着至关重要的作用。所述“KITLG”可包括全长的KITLG、以及KITLG的截短体、功能性片段、不同的转录本、剪接变体和亚型，天然存在的KITLG、人工修饰的或突变的KITLG蛋白。关于“KITLG”的基因信息可参考Ensembl数据库登录号ENSG00000049130，关于“KITLG”的蛋白信息可参考UniProt数据库登录号P21583。在本申请中，所述“KITLG”可以作为多巴胺能神经前体细胞的分子标记物。
在本申请中，术语“NTRK3”通常是指神经营养受体酪氨酸激酶3，也可称为TRKC。NTRK3是一种膜结合受体，可参与神经系统和心脏的发育。所述“NTRK3”可包括全长的NTRK3、以及NTRK3的截短体、功能性片段、不同的转录本、剪接变体和亚型，天然存在的NTRK3、人工修饰的或突变的NTRK3蛋白。关于“NTRK3”的基因信息可参考Ensembl数据库登录号ENSG00000140538，关于“NTRK3”的蛋白信息可参考UniProt数据库登录号Q16288。在本申请中，所述“NTRK3”可以作为多巴胺能神经前体细胞的分子标记物。
在本申请中，术语“PTPRO”通常是指蛋白酪氨酸磷酸酶O型受体，也可称为GLEPP1、NPHS6、PTP-oc、PTP-U2和PTPU2，是一种跨膜蛋白。所述“PTPRO”可包括全长的PTPRO、以及PTPRO的截短体、功能性片段、不同的转录本、剪接变体和亚型，天然存在的PTPRO、人工修饰的或突变的PTPRO蛋白。关于“PTPRO”的基因信息可参考Ensembl数据库登录号ENSG00000151490，关于“PTPRO”的蛋白信息可参考UniProt数据库登录号Q16827。在本申请中，所述“PTPRO”可以作为多巴胺能神经前体细胞的分子标记物。
在本申请中，术语“LMX1A”通常是指LIM同源框转录因子1α，在胚胎发生过程中对多巴胺能神经元的发育起作用。所述“LMX1A”可包括全长的LMX1A、以及LMX1A的截短体、功能性片段、不同的转录本、剪接变体和亚型，天然存在的LMX1A、人工修饰的或突变的LMX1A蛋白。关于“LMX1A”的基因信息可参考Ensembl数据库登录号ENSG00000162761，关于“LMX1A”的蛋白信息可参考UniProt数据库登录号Q8TE12。在本申请中，所述“LMX1A”可以作为多巴胺能神经前体细胞的分子标记物。
在本申请中，术语“EN1”通常是指Engrailed同源盒，主要帮助调节背中脑和后脑的发育。所述“EN1”可包括全长的EN1、以及EN1的截短体、功能性片段、不同的转录本、剪接变体和亚型，天然存在的EN1、人工修饰的或突变的EN1蛋白。关于“EN1”的基因信息可参考Ensembl数据库登录号ENSG00000163064，关于“EN1”的蛋白信息可参考UniProt数据库登录号Q05925。在本申请中，所述“EN1”可以作为多巴胺能神经前体细胞的分子标记物。
在本申请中，分子标记物(如“CD83”、“CLSTN2”、“FLRT2”、“KITLG”、“NTRK3”、“PTPRO”、“LMX1A”和/或“EN1”)后的上标的“+”在涉及细胞时，通常是指该细胞对于该分子标记物为阳性，即该细胞表达该分子标记物。例如，CLSTN2
+在涉及细胞时，表示该细胞对于CLSTN2是阳性的，例如，该细胞可以表达CLSTN2蛋白，或该细胞可以转录CLSTN2RNA。当细胞对于一种以上的标记物为阳性时，例如，当使用LMX1A
+EN1
+表示时，该细胞对于LMX1A和EN1二者均是阳性的。术语“阳性”是指在测定分子标记物表达和/或活性的实验中，其中对于被认为可重现地含有可检测水平的分子标记物的样品，该结果高于该测定试验的阈值或截断值。
细胞对某一分子标记物是否是阳性的，可以通过检测细胞的所述分子标记物(包括蛋白和/或核酸)的表达情况来判断。在某些情况下，对于一个分子标记物(如“CD83”、“CLSTN2”、“FLRT2”、“KITLG”、“NTRK3”、“PTPRO”、“LMX1A”和/或“EN1”)，可以使用能够特异性识别或结合所述分子标记物的分子，所述分子可包括蛋白质、核酸、大分子和/或小分子。例如，所述分子可以是带可检测标记的能够特异性结合所述分子标记物蛋白的抗体。将抗体和待检测的细胞混合，如果检测到该抗体能够与待检测的细胞结合，表示该细胞是对于该分子标记物是阳性的。又例如，所述分子可以是带可检测标记(例如荧光探针)的能够特异性杂交所述分子标记物核酸的探针，如果检测到该可检测标记的表达，表示该细胞是对于该分子标记物是阳性的。与对照细胞或阴性细胞相比，该细胞的所述分子标记物的表达和/或活性是可以被定性或定量的。在某些情况下，还可以通过在目标分子标记物的表 达框插入可检测的标记分子(例如荧光报告基因)，通过标记分子的表达来判断目标分子标记物的表达。
在本申请中，术语“标记分子”通常是指能够用于指示所述分子标记物(如“CD83”、“CLSTN2”、“FLRT2”、“KITLG”、“NTRK3”、“PTPRO”、“LMX1A”和/或“EN1”)表达和/或活性的物质，包括能够直接识别或结合所述分子标记物蛋白或核酸的那些，以及通过自身的表达和/或活性反应所述分子标记物蛋白或核酸的表达和/或活性的那些。例如，所述标记分子可以是放射性同位素、荧光团、化学发光物质、生色团、抗体、酶、酶的底物、酶的辅助因子、酶的抑制剂、生色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(如生物素、亲和素、链亲和素或半抗原)等。
在本申请中，术语“多巴胺能神经前体细胞”通常是指能够在体外或体内增殖和/或分化为多巴胺能神经元的细胞。多巴胺能神经前体细胞可以来自中脑腹侧神经细胞，可以由多能干细胞分化而来。多巴胺能神经前体细胞也可以从其他细胞类型分化或重编程。常见的多巴胺能神经前体细胞标记物可以包括LMX1A、EN1、OTX2和/或FOXA2。
在本申请中，术语“多巴胺能神经元”通常是指含有并释放多巴胺作为神经递质的细胞。常见的多巴胺能神经细胞标志物可以有酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)、转录激活因子FOXA2、G-蛋白调控的钾离子通道GIRK2、转录因子Nurr1、转录因子EN1，和/或转录因子LMX1B。在本申请中，术语“多巴胺能神经细胞”可以与“多巴胺能神经前体细胞”或“多巴胺能神经元”互换地使用。多巴胺能神经细胞可以是多巴胺能神经祖细胞或多巴胺能神经前体细胞，或成熟的多巴胺能神经元，但不限于此。本申请所述多巴胺能神经细胞可以是中脑多巴胺能神经细胞。如本文所用，术语“中脑多巴胺能(mDA)神经细胞”通常是指在中脑区域中观察到的多巴胺能神经细胞，例如，在中脑腹侧区域中观察到的多巴胺能神经细胞，但不限于此。此外，mDA神经细胞可以是A9区特异性的。“9区域”是中脑腹侧区域，其对应于黑质的致密部。A9区域是其中大量发现多巴胺能神经细胞的区域，并且与运动功能的控制有关。特别是对于PD患者，多巴胺能神经细胞在该区域特异性地发生退行性变。
在本申请中，术语“细胞群体”可包括人干细胞；其祖细胞或前体；衍生自人干细胞或前体的多巴胺能神经祖细胞和/或多巴胺能神经前体细胞或成熟多巴胺能神经元，以及衍生自其的神经衍生物，但不限于此。具体来说，人干细胞或前体细胞的实例可包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、成年干细胞和胎儿细胞，但不限于此。
在本申请中，术语“多能干细胞”通常是指一类具有分化成人体任何细胞的潜能的细胞。多能干细胞可以源自受精卵或体细胞，所述体细胞可包括血液细胞、尿液细胞、皮肤细胞和/或脐带血细胞。根据其来源不同，多能干细胞可包含人胚胎干细胞(源自受精卵)和人诱导多能干细胞(体细胞)。多能干细胞具有可持续增殖能力，并可分化成各种细胞。
在本申请中，术语“候选细胞”通常是指待鉴定是否为多巴胺能神经前体细胞的细胞。所述“候选细胞”可以是神经前体细胞。
在本申请中，术语“神经前体细胞”通常是指尚未表达终末分化特征的未分化的前体细胞，其能够增殖和/或分化为成熟神经元细胞。在本文中，“祖细胞”、“前体”和“前体细胞”可以互换使用。根据分化产生的神经元的神经递质的不同，神经前体细胞可以包含胆碱能前体细胞、肾上腺能前体细胞、GABA能前体细胞、谷氨酸能前体细胞、多巴胺能前体细胞、血清素能前体细胞和/或嘌呤能前体细胞。根据分化区域的同步，神经前体细胞可以包含中中脑腹侧底板神经前体细胞、后脑底板神经前体细胞和/或中脑底板神经前体细胞。
在本申请中，术语“神经细胞”是指构成神经系统的细胞，可包含神经祖细胞、前体细胞、干细胞、未成熟神经元和/或成熟神经元。在某些实施方式中，神经细胞可以与神经元相同的含义使用。
在本申请中，术语“修饰”通常是指对所述候选细胞进行标记，例如，使用标记分子。所述修饰可以是对所述候选细胞基因水平的修饰，RNA水平的修饰，也可以是蛋白质水平的修饰。例如，所述修饰可以是指在分子标记物基因表达框插入报告基因。
在本申请中，术语“帕金森氏症(Parkinson's disease，PD)”通常是指一组与基底神经节(其是大脑中控制运动的部分)中多巴胺不足有关的疾病。症状包括震颤、运动迟缓(活动极为缓慢)、屈曲位、姿势不稳和僵直。帕金森氏症的诊断要求存在有这些症状中的至少两种，其中之一必须为震颤或运动迟缓。所述帕金森氏症包括特发性或典型帕金森氏病和有帕金森氏叠加综合症(非典型帕金森氏症)。通常，帕金森氏病牵涉到主要在称作黑质(substantia nigra)的大脑区域中的重要神经细胞的功能障碍和死亡。许多这些重要神经细胞产生多巴胺，当这些神经元相继死亡时，脑中的多巴胺的量下降，使人不能正常控制运动。个体经历的症状群因人而异。帕金森氏病的主要运动病征包括以下：手、臂、腿、下颌和面部的震颤、运动迟缓或运动缓慢、肢体和躯干的僵直或僵硬以及姿势不稳或者平衡和协调受损。帕金森氏症的发展速度可以通过总帕金森氏症统一评分量表(Total Unified Parkinson’s Disease Rating Scale，总UPDRS)评分量化。
在本申请中，术语“中脑”是指发育中的脊椎动物脑在前脑(前部)和后脑(后部)之间的区域。中脑区域产生许多脑区域，包括但不限于网状结构，其为被盖的一部分，是脑干的影响运动功能的区域，cms cerebri，其由连接大脑半球与小脑的神经纤维组成，以及称作黑质的大的有色核。发育的腹侧中脑的独特特征是底板标记物FOXA2和顶板标记物LMX1A的共表达。
在本申请中，术语“多巴胺神经元”或“多巴胺能神经元”通常是指含有并能够释放多巴胺的细胞。“中脑多巴胺神经元”或“mDA”是指中脑结构中的推定含有并释放多巴胺的神经元细胞和中脑结构中的含有并释放多巴胺的神经元细胞。
在本申请中，术语“多巴胺”通常是指多巴胺能神经元所制造和释放的儿茶酚胺类神经递质。
在本申请中，术语“音猬因子(SHH或Shh)”是指哺乳动物信号传导通路家族中至少三种蛋白中的一种蛋白，包括刺猬因子(hedgehog)、沙漠刺猬因子(deserthedgehog，DHH)和印度刺猬因子(Indian hedgehog，IHH)。Shh通过与跨膜分子Patched(PTC)和Smoothened(SMO)相互作用而与至少两种跨膜蛋白相互作用。Shh通常与PCT结合，其然后使得SMO作为信号转导物被激活。在不存在SHH的情况下，PTC通常抑制SMO，这进而又激活转录阻遏物，使得某些基因的转录不会发生。当存在Shh并且与PTC结合时，PTC不会干扰SMO发挥作用。SMO不受抑制时，某些蛋白能够进入细胞核，并起到转录因子的作用，使得某些基因得以激活。
在本申请中，术语“音猬因子(SHH)信号传导激活剂”通常是指任何能够激活SHH信号传导通路的分子或化合物，其包括与PCT或Smoothened激动剂等结合的分子或化合物。例如，可包括蛋白质音猬因子(SHH)C25II、SAG和小分子Smoothened激动剂purmorphamine。
在本申请中，术语“分化”通常是指未特化的干细胞获得特化细胞(例如特定类型的神经元、血液细胞、心脏、肝或肌肉细胞)的特征的过程。分化由细胞基因与细胞外的物理和化学条件之间的相互作用控制，通常通过涉及嵌在细胞表面中的蛋白质的信号传导通路而控制。在本申请中，术语“分化”应用于分化细胞系统中的细胞时，是指细胞从一种细胞类型分化成另一细胞类型的过程。
在本申请中，术语“分离”、“分选”和“筛选”可互换地使用，用于细胞时，通常是指根据细胞所具有的特性将某种特定的细胞亚群从混合的细胞群中分离出来。例如在本申请中，所述分离是指将具有下述一种或多种特征的细胞从细胞群体中分离：CLSTN2
+，PTPRO
+， NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+，所述待分离的细胞群体除了包含上述特征的细胞，通常还包含不具备上述特征的其他细胞。例如，所述细胞群里可以是异质的神经前体细胞，或未分化的神经前体细胞(例如，多能干细胞)，或已完全或部分分化的神经前体细胞。常见的细胞分离方法可包括基于免疫识别特性的方法和/或基于细胞物理性质的方法。例如，所述分离方法可包括流式细胞分选、免疫磁性细胞分选和/或密度梯度离心法。
在本申请中，术语“富集”通常是指提高细胞群体中具备某些共同特征的细胞的比例。所述富集可以通过将具备所述共同特征的细胞和不具备所述共同特征的细胞分离来实现。
发明详述
鉴别、分离和富集方法
一方面，本申请提供一种鉴别多巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括：判断候选细胞是否具备下述一种或多种特征：CLSTN2
+、PTPRO
+、NTRK3
+、FLRT2
+、KITLG
+、CD83
+和/或LMX1A
+EN1
+；将具备所述特征的细胞鉴别为多巴胺能神经前体细胞。在本申请中，如果所述候选细胞具备以下一种或多种特征：CLSTN2
+、PTPRO
+、NTRK3
+、FLRT2
+、KITLG
+、CD83
+和/或LMX1A
+EN1
+，则可以将所述候选细胞鉴别为多巴胺能神经前体细胞。在本申请中，所述候选细胞可以源自多能干细胞，例如，人多能干细胞，又例如，胚胎干细胞和诱导多能干细胞。例如，所述诱导多能干细胞可以源自自体细胞或异体细胞。所述在本申请中，所述候选细胞可以源自中脑腹侧神经组织。
在本申请中，所述候选细胞可以是已进行适当分化的神经前体细胞群，这些神经前体细胞群通常是异质的。异质的神经前体细胞群是指包含两种或两种以上神经前体细胞，甚至神经母细胞和/或神经元的细胞群。在本申请中，所述候选细胞可以是多能干细胞(例如，人多能干细胞)，此时，所述多能干细胞可以在一定条件下在体内(例如，移植至受试者脑内)或体外进行分化为神经前体细胞。在本申请中，所述多能干细胞可以为人胚胎干细胞和/或人诱导多能干细胞。在本申请中，所述待分化的细胞(例如，多能干细胞)可以源自啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞。例如，所述待分化的细胞(例如，多能干细胞)可以源自正常人或具有帕金森氏症症状的患者的细胞。
从干细胞或其他类型的细胞分化为神经前体细胞的方法是已知的，例如，通过使用小分子、生长因子蛋白质和其他生长条件来促进细胞从多能状态转变为更加成熟或特化的细胞结局(例如，中枢神经系统细胞、神经细胞、底板中脑细胞或多巴胺能神经细胞)。在某些情形中，所述分化可包括将所述待分化的细胞或细胞群与ALK抑制剂、音猥因子(SHH)信 号传导激活剂和/或GSK-3抑制剂接触。所述接触可以在能够使所述细胞群体分化为中脑底板前体细胞的条件下进行。
根据分化条件和分化方法的不同，所述多能状态的细胞的分化时间可以至少为约10天、约12天、约13天、约14天、15天、18天、21天、25天、28天、30天、35天或更多天，例如，14天或21天。本领域技术人员有能力在不同的分化条件和方法下判断从多能干细胞分化而来的神经前体细胞是否可以用于判断具备下述一种或多种特征：CLSTN2
+、PTPRO
+、NTRK3
+、FLRT2
+、KITLG
+、CD83
+和/或LMX1A
+EN1
+。
另一方面，本申请提供了一种分离多巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括(a)提供神经前体细胞群，(b)将所述神经前体细胞群中具备下述一种或多种特征的细胞分离：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。
另一方面，本申请提供了一种富集多巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括(a)提供神经前体细胞群，(b)判断所述神经前体细胞群中的细胞是否具备下述一种或多种特征：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+，(c)将具备上述任意一种或多种特征的细胞富集。
在本申请中，所述分离和/或富集可包括使用能够特异性识别和/或结合分子标记物(例如，CLSTN2、PTPRO、NTRK3、FLRT2、KITLG、CD83，和/或LMX1A和EN1的组合)的试剂。所述试剂可以是蛋白质，例如，抗体或其抗原结合片段、亲和配体，可以在所述试剂上标记荧光素(对于流式分选)或搭配磁珠使用(对于磁珠分选)。当待分离的细胞群体与所述蛋白质混合时，具备上述一种或多种特征的细胞与所述试剂特异性结合，然后通过性质(例如，分子量、极性、电荷、荧光波长等)差异使得其与不具备上述性质的细胞区别。所述试剂可以是能够特异性识别和/或扩增分子标记物(例如，CLSTN2、PTPRO、NTRK3、FLRT2、KITLG、CD83，和/或LMX1A和EN1的组合)的核酸分子(例如，探针、引物)，所述核酸分子上可以带有标记基因。当待分离的细胞群体与所述核酸分子混合时，所述核酸分子识别和/或结合具备上述一种或多种特征的细胞，当所述分子标记物的基因表达时，所述标记基因的存在使得其与不具备上述性质的细胞区别。
在本申请中，本申请的细胞群体也可以使用基于非抗体的纯化方法分离和/或富集，所述分离和/或富集方法包括但不限于大小选择(例如通过密度梯度、FACS或MACS)，将标记的配体用于细胞表面受体，或通过使用增强子-启动子报道基因表达或使用标记的表面标志物。
经过本申请鉴定、分离和/或富集的神经前体细胞可以进一步分化为神经元，所述神经 细胞中可包含至少10％以上(例如，15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或更多)的中脑多巴胺能神经元。
另一方面，本申请提供了制备细胞产品的方法，其包括分离和/或富集具备下述一种或多种特征的神经前体细胞：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。
在本申请中，通过本申请所述的方法制备得到的细胞产品包含神经前体细胞，其具备下述一种或多种特征：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。当所述细胞产品进一步在体内或体外分化为神经元时，所述神经元可包含至少10％以上(例如，15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或更多)的中脑多巴胺能神经元。本申请的细胞产品在体内(移植)或体外分化后，具备明确稳定的细胞组成。例如，在具体实施方式中，通过不同的分子标记物进行分选后的移植物，其神经元组成是相似的，都主要由三种不同亚型的多巴胺能神经元和一种亚型的谷氨酸能神经元组成。
另一方面，所述细胞产品可以在体内或体外进一步扩增和增殖，得到细胞制剂，所述神经前体细胞，其具备下述一种或多种特征：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。所述细胞制剂也可以包含多巴胺能神经细胞。
对于通过任意方法(包括本申请的方法和/或现有技术中已知的方法)制备得到的细胞产品，本申请还提供了评估这些细胞产品的方法，所述方法包括检测所述细胞产品中具备下述一种或多种特征的细胞的比例：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。可以根据具备上述一种或多种特征的细胞的比例(例如，1％-10％、10％-20％或20％以上)来评估所述细胞产品的质量、预测所述细胞产品移植后的治疗效果，或指导所述细胞产品的施用剂量和施用方案。通常来说，当细胞产品中具备上述一种或多种特征的细胞的比例较高(例如，大于10％)时，可以降低所述细胞产品的施用剂量或施用频率。通常来说，当细胞产品中具备上述一种或多种特征的细胞的比例较低(例如，低于10％)时，可以增加所述细胞产品的施用剂量或施用频率。
本申请还提供了优化细胞产品制备过程的方法，其包括检测所述细胞产品中具备下述一种或多种特征的细胞的比例：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+，根据所述比例指导所述细胞产品的制备过程。例如，当细胞产品中具 备上述一种或多种特征的细胞的比例较低(例如，低于10％)，可以认为所述细胞产品的制备过程需要进行优化。所述制备过程可包括细胞产品的产生、分化、分离和/或纯化。
本申请还提供了控制制备的多巴胺能神经前体细胞的质量的方法，其包括以下步骤：检测制备的细胞中具备下述一种或多种特征的细胞的比例：a)CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+；b)如果步骤a)检测到的比例为至少10％(例如可以为例如，15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或更多)，则所述制备的多巴胺能神经前体细胞的质量符合要求。例如，如果步骤a)检测到的比例为至少10％，则所述制备的多巴胺能神经前体细胞满足后续进一步在体内(移植)或体外分化后，获得移植体的要求，例如，此时所述制备的多巴胺能神经前体细胞能获得治疗效果。
反之，如果步骤a)检测到的比例为小于10％，则可能需要利用本申请所述的优化细胞产品制备过程的方法来提高所述制备的多巴胺能神经前体细胞的质量。
分子标记物
对于每一种分子标记物，根据其表达特性和活性特性，例如表达在细胞表面还是胞内、表达产物是膜结合蛋白还是游离蛋白，可采用不同的检测方法，判断该分子标记物是否是阳性。所述检测方法包括但不限于免疫组织化学分析、PCR、RT-PCR、原位杂交、southern印迹、western印迹、northern印迹、分光光度测定法、基因芯片、流式细胞计量术(FACS)、蛋白质芯片、DNA测序和ELISA。
对于提供的细胞或细胞群体，本申请所述方法包括判断所述细胞(例如，候选细胞)是否具备下述特征：CLSTN2
+。例如，所述方法包括检测所述候选细胞CLSTN2蛋白的表达水平，CLSTN2蛋白的活性水平，CLSTN2核酸的表达水平，和/或CLSTN2核酸的活性水平。在一些情况下，所述方法可包括使用能够特异性扩增编码CLSTN2的核酸分子的引物。引物可为一对引物。此外，所述方法可包括使用能够特异性识别编码CLSTN2的核酸分子的探针。探针可能够结合CLSTN2核苷酸序列或其片段，而非另一核苷酸序列。探针可具有可检测信号。在其他情况下，所述方法可包括使用能够特异性识别CLSTN2蛋白的试剂和/或能够测定CLSTN2蛋白的活性的试剂，诸如CLSTN2蛋白的抗体和/或配体和/或其片段。
对于提供的细胞或细胞群体，本申请所述方法包括判断所述细胞(例如，候选细胞)是否具备下述特征：PTPRO
+。例如，所述方法包括检测所述候选细胞PTPRO蛋白的表达水平，PTPRO蛋白的活性水平，PTPRO核酸的表达水平，和/或PTPRO核酸的活性水平。在一些 情况下，所述方法可包括使用能够特异性扩增编码PTPRO的核酸分子的引物。引物可为一对引物。此外，所述方法可包括使用能够特异性识别编码PTPRO的核酸分子的探针。探针可能够结合PTPRO核苷酸序列或其片段，而非另一核苷酸序列。探针可具有可检测信号。在其他情况下，所述方法可包括使用能够特异性识别PTPRO蛋白的试剂和/或能够测定PTPRO蛋白的活性的试剂，诸如PTPRO蛋白的抗体和/或配体和/或其片段。
对于提供的细胞或细胞群体，本申请所述方法包括判断所述细胞(例如，候选细胞)是否具备下述特征：NTRK3
+。例如，所述方法包括检测所述候选细胞NTRK3蛋白的表达水平，NTRK3蛋白的活性水平，NTRK3核酸的表达水平，和/或NTRK3核酸的活性水平。在一些情况下，所述方法可包括使用能够特异性扩增编码NTRK3的核酸分子的引物。引物可为一对引物。此外，所述方法可包括使用能够特异性识别编码NTRK3的核酸分子的探针。探针可能够结合NTRK3核苷酸序列或其片段，而非另一核苷酸序列。探针可具有可检测信号。在其他情况下，所述方法可包括使用能够特异性识别NTRK3蛋白的试剂和/或能够测定NTRK3蛋白的活性的试剂，诸如NTRK3蛋白的抗体和/或配体和/或其片段。
对于提供的细胞或细胞群体，本申请所述方法包括判断所述细胞(例如，候选细胞)是否具备下述特征：FLRT2
+。例如，所述方法包括检测所述候选细胞FLRT2蛋白的表达水平，FLRT2蛋白的活性水平，FLRT2核酸的表达水平，和/或FLRT2核酸的活性水平。在一些情况下，所述方法可包括使用能够特异性扩增编码FLRT2的核酸分子的引物。引物可为一对引物。此外，所述方法可包括使用能够特异性识别编码FLRT2的核酸分子的探针。探针可能够结合FLRT2核苷酸序列或其片段，而非另一核苷酸序列。探针可具有可检测信号。在其他情况下，所述方法可包括使用能够特异性识别FLRT2蛋白的试剂和/或能够测定FLRT2蛋白的活性的试剂，诸如FLRT2蛋白的抗体和/或配体和/或其片段。
对于提供的细胞或细胞群体，本申请所述方法包括判断所述细胞(例如，候选细胞)是否具备下述特征：KITLG
+。例如，所述方法包括检测所述候选细胞KITLG蛋白的表达水平，KITLG蛋白的活性水平，KITLG核酸的表达水平，和/或KITLG核酸的活性水平。在一些情况下，所述方法可包括使用能够特异性扩增编码KITLG的核酸分子的引物。引物可为一对引物。此外，所述方法可包括使用能够特异性识别编码KITLG的核酸分子的探针。探针可能够结合KITLG核苷酸序列或其片段，而非另一核苷酸序列。探针可具有可检测信号。在其他情况下，所述方法可包括使用能够特异性识别KITLG蛋白的试剂和/或能够测定KITLG蛋白的活性的试剂，诸如KITLG蛋白的抗体和/或配体和/或其片段。
对于提供的细胞或细胞群体，本申请所述方法包括判断所述细胞(例如，候选细胞)是 否具备下述特征：CD83
+。例如，所述方法包括检测所述候选细胞CD83蛋白的表达水平，CD83蛋白的活性水平，CD83核酸的表达水平，和/或CD83核酸的活性水平。在一些情况下，所述方法可包括使用能够特异性扩增编码CD83的核酸分子的引物。引物可为一对引物。此外，所述方法可包括使用能够特异性识别编码CD83的核酸分子的探针。探针可能够结合CD83核苷酸序列或其片段，而非另一核苷酸序列。探针可具有可检测信号。在其他情况下，所述方法可包括使用能够特异性识别CD83蛋白的试剂和/或能够测定CD83蛋白的活性的试剂，诸如CD83蛋白的抗体和/或配体和/或其片段。
对于提供的细胞或细胞群体，本申请所述方法包括判断所述细胞(例如，候选细胞)是否具备下述特征：LMX1A
+EN1
+，即，所述细胞是否呈LMX1A和EN1双阳性。例如，所述方法包括检测所述候选细胞LMX1A蛋白的表达水平，LMX1A蛋白的活性水平，LMX1A核酸的表达水平，和/或LMX1A核酸的活性水平，以及检测所述候选细胞EN1蛋白的表达水平，EN1蛋白的活性水平，EN1核酸的表达水平，和/或EN1核酸的活性水平。在一些情况下，所述方法可包括使用能够特异性扩增编码LMX1A或EN1的核酸分子的引物。引物可为一对引物。此外，所述方法可包括使用能够特异性识别编码LMX1A或EN1的核酸分子的探针。探针可能够结合LMX1A或EN1核苷酸序列或其片段，而非另一核苷酸序列。探针可具有可检测信号。在其他情况下，所述方法可包括使用能够特异性识别LMX1A或EN1蛋白的试剂和/或能够测定LMX1A或EN1蛋白的活性的试剂，诸如LMX1A或EN1蛋白的抗体和/或配体和/或其片段。
在本申请中，分子标记物(CLSTN2、PTPRO、NTRK3、FLRT2、KITLG、CD83和/或LMX1A与EN1的组合)的表达可以包括所述细胞(例如，候选细胞)中所述分子标记物的表达量和/或对所述分子标记物阳性的细胞数量占整体细胞群中细胞数量的比例。在某些实施方式中，在不同检测方法下，当检测到该细胞中分子标记物的含量高于检测限或阈值时，可以认为该细胞对于所述分子标记物是阳性的。或者，在一个细胞群体中，当检测到对所述分子标记物阳性的细胞数量占整体细胞群中细胞数量的比例，可以认为该细胞群体中多巴胺能神经前体细胞的比例，也可用于推测分化(包括体内分化和体外分化)得到的终末多巴胺能神经元的比例。
另一方面，本申请提供了CLSTN2
+指示剂、PTPRO
+指示剂、NTRK3
+指示剂、FLRT2
+指示剂、KITLG
+指示剂、CD83
+指示剂和/或LMX1A
+EN1
+指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。所述指示剂可用于指示或检测所述分子标记物的活性和/或水平。在本申请中，所述指示剂可包括蛋白质、核酸和/或小分子。例如，所 述指示剂可以包括能够特异性结合分子标记物蛋白的试剂和/或能够测定分子标记物蛋白活性的试剂。又例如，所述指示剂可包括能够特异性扩增编码分子标记物的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码分子标记物的核酸分子的探针。例如，所述指示剂可以是能够特异性结合CLSTN2、PTPRO、NTRK3、FLRT2、KITLG、CD83，或LMX1A和EN1的组合的抗体或其抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种制备多巴胺能神经前体细胞的质控试剂盒，其包括质控试剂，所述质控试剂能够用于判断候选细胞是否具备下述一种或多种特征：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。在某些情况下，所述质控试剂可以包括本申请所述的CLSTN2
+指示剂、PTPRO
+指示剂、NTRK3
+指示剂、FLRT2
+指示剂、KITLG
+指示剂、CD83
+指示剂和/或LMX1A
+EN1
+指示剂。
在某些情况下，所述试剂盒还可以包括够培养和/或保存所述候选细胞的试剂。所述试剂可以为细胞培养基，例如可以为神经前体细胞培养基和/或神经前体细胞分化培养基。在所述试剂盒中，所述能够培养和/或保存所述候选细胞的试剂可以与所述质控制剂独立包装。
在某些情况下，所述试剂盒还可以包括本申请所述的候选细胞。所述候选细胞可以为本申请所述的后续细胞，例如，可以为所述神经前体细胞(例如可以为源自人多能干细胞的神经前体细胞)。
细胞产品
本申请提供了分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群，其特征为表达下述一种或多种多巴胺能神经前体细胞标记物：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。
在某些情况下，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为CLSTN2
+。
在某些情况下，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为PTPRO
+。
在某些情况下，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为NTRK3
+。
在某些情况下，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为FLRT2
+。
在某些情况下，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为KITLG
+。
在某些情况下，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为CD83
+。
在某些情况下，所述分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群的特征为LMX1A
+EN1
+。
另一方面，本申请提供了多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达下述一种或多种多巴胺能神经前体细胞标记物：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达CLSTN2。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达PTPRO。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达NTRK3。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达FLRT2。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达KITLG。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达CD83。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达LMX1A和EN1。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达下述一种或多种多巴胺能神经前体细胞标记物：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达CLSTN2。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达PTPRO。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达NTRK3。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达PTPRO+。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达FLRT2。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达CD83。
在某些情况下，所述多巴胺能神经前体细胞群中至少约40％，50％，60％，70％，80％， 或90％的细胞表达LMX1A和EN1。
另一方面，本申请提供了细胞产品，所述细胞产品包含根据本申请所述方法得到的多巴胺能神经前体细胞。
另一方面，本申请提供了细胞产品，所述细胞产品包含本申请所述的多巴胺能神经前体细胞群。
另一方面，本申请提供了移植物组合物，其由本申请所述的多巴胺能神经前体细胞群在体内或者体外分化而来。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含本申请所述的多巴胺能神经前体细胞群或本申请所述的细胞产品。
在某些情况下，所述药物组合物还包括药学上可接受的佐剂。
治疗方法或制备药物的用途
另一方面，本申请提供了本申请所述的细胞产品在筛选药物中的用途，所述药物用于预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症。例如，所述神经系统疾病或病症可以包含神经元退行性变相关疾病或病症(例如帕金森氏症)。在本申请中，可以使所述细胞产品分化为多巴胺能神经元，然后使所述多巴胺能神经元与待筛选药物接触。如果所述待筛选药物具有以下一种或多种性质：(1)能够阻止所述多巴胺能神经元死亡，(2)能够促进所述多巴胺能神经元存活，和(3)能够改善多巴胺能神经元的代谢，则将所述待筛选药物选择为能够预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症预防的药物。
另一方面，本申请提供了一种预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：鉴别候选细胞是否具备下述一种或多种特征：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+；挑选具备所述特征的细胞；和向有需要的受试者施用有效剂量的具备所述特征的细胞。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含具备下述一种或多种特征的神经前体细胞：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+。在某些实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的佐剂。在某些实施方式中，所述细胞能够分化为神经细胞，其中所述神经细胞包含至少10％(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高)的多巴胺能神经细胞。在某些实施方式中，所述分化包括体外分化和体内分化。
根据预期的方法，所述药物组合物的剂量、药物制剂类型、给药途径和时间可以根据受试者的状况、体重、疾病的程度而变化，且可以由本领域技术人员适当选择。
本申请的药物组合物或细胞产品以药学上的有效剂量施用。所述“药学上的有效剂量”是指足以以适用于医学治疗或改善的合理的受益/风险比来治疗疾病的量，并且可以根据包括以下种类的元素来确定有效剂量水平：受试者的疾病、疾病严重程度、年龄和性别、药物活性、受试者对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排放率、治疗持续时间以及同时使用的药物和在医学领域众所周知的其他元素。术语“受试者”通常是指需要治疗的受试者，更具体地，是指哺乳动物，例如人或非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和/或牛。
在本申请中，本申请的方法或产品可用于治疗神经系统疾病或病症。所述神经系统疾病或病症可以包括退行性疾病。退行性疾病是一种特定细胞类型例如神经元的衰退(例如，功能、结构、生物化学)的疾病，导致不良临床状况。例如，帕金森病是中枢神经系统中基底神经节的退行性疾病。可以使用本申请同质的细胞群体治疗的退行性疾病包括例如，帕金森病、多发性硬化、癫痫、亨廷顿舞蹈病、肌张力障碍(变形性肌张力障碍)和舞蹈手足徐动症(choreoathetosis)。
另一方面，本申请提供了预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症(例如，帕金森氏症)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用所述细胞产品和/或所述药物组合物。
另一方面，本申请提供了所述细胞产品和/或所述的药物组合物在制备预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症(例如，帕金森氏症)的药物中的用途。
另一方面，本申请提供了所述细胞产品，和/或所述药物组合物，其用于预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症(例如，帕金森氏症)。
另一方面，本申请提供了提高包含多巴胺能神经前体细胞的细胞产品在神经系统疾病或病症(例如，帕金森氏症)的细胞替代疗法中的功效并增强移植安全性的方法。
在本申请中，可以使用旋转试验来验证包含多巴胺能神经前体细胞的细胞产品在神经系统疾病或病症(例如，帕金森氏症)的治疗效果。例如，在一定条件下，旋转试验的旋转次数越少，可以显示治疗效果的提升。
在本申请中，具备下述一种或多种特征的神经前体细胞：CLSTN2
+，PTPRO
+，NTRK3
+，FLRT2
+，KITLG
+，CD83
+，和/或LMX1A
+EN1
+，可以减轻帕金森氏病的症状，和/或可以提高细胞替代疗法的安全性，和/或可以提高细胞替代疗法的疗效。
本申请的细胞产品和/或药物组合物可被，例如，移植或放置在中枢神经系统，例如，脑或脊髓，或外周神经系统。神经系统中用于所述细胞产品和/或药物组合物的移植位置基于特定的神经状况确定，例如直接注射到损伤的纹状体、脊髓实质或背神经节中。例如，本申请的细胞产品和/或药物组合物可以移植至患有帕金森病的患者的纹状体中或附近。根据 神经状况的位置和患者的医学状况，本领域技术人员将能够确定最适合移植细胞的方式。本申请的细胞产品和/或药物组合物可以和其他治疗神经系统疾病或病症的疗法共同施用。
本申请还包括上述体内或体外分化后的移植物(例如，移植组合物)，以及对这些移植物或移植组合物的使用。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的细胞产品、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实验模型和实验对象
1.细胞培养
H9人胚胎干细胞(hESCs)系，正常人来源血细胞来源的诱导多能干细胞(hiPSCs)，hESCs报告细胞系，和hiPSCs报告细胞系培养在铺有经辐照抑制生长的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)上。培养液由DMEM/F-12，1x NEAA，0.5x Glutamax，0.1mM 2-巯基乙醇和4ng/mL FGF-2组成。每天更换一次新鲜的培养液，并每周用Dispase II传代。在一些实验中hESCs/hiPSCs在无滋养层条件中进行培养，具体细胞培养在vitronectin上，培液使用mTeSR
TM Plus，每2天更换一次新鲜的培养液，每5天用TrypLE
TM Express Enzyme(1X)传代。
2.PD模型和细胞移植
所有动物实验均根据中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心批准的方案进行。在SCID小鼠中进行构建PD模型的手术流程在前人研究中已有描述(Chen et al。，2016)。将成年SCID小鼠(8-12周)用1％–2％的异氟烷与氧气混合麻醉。通过脑立体定位技术，将1μL的6-OHDA(3mg/ml，溶于含1％抗坏血酸的生理盐水中)直接注入左侧大脑黑质中(前后[AP]＝-2.9mm，侧面[L]＝-1.1mm，垂直[V]＝4.5mm，垂直深度从头骨计算)。在6-OHDA损伤手术后4周，选择苯丙胺诱导下可以在1小时内以大于5圈/分钟旋转的动物进行细胞移植。将动物随机分组并移植多巴胺能神经前体细胞或等体积人工脑脊液(ACSF)(对照)。将50,000个细胞重悬于含Rock抑制剂(0.5μM)，B27，20ng/ml BDNF的1μL ACSF中，并注入左侧黑质(前后[AP]＝-2.9mm，侧面[L]＝1.1mm，垂直[V]＝4.4mm，垂直深度从头骨计算)或左纹状体(AP＝+0.6mm，L＝1.8mm，V＝3.2mm，垂直深度从硬脑膜计算)。
实验方法
1.CRISPR/Cas9介导的基因编辑和hESCs报告细胞系生成
为了建立报告细胞系，通过Web工具(https://zlab.bio/guide-design-resources和https://www.benchling.com/)设计了靶点位置靶向guide RNA。供体质粒按以下结构设计：5’同源臂包括选定基因的终止密码子前约1000bp基因组序列；将P2A和tdTomato插入选定基因(LMX1A，CLSTN2和PTPRO)的终止密码子之前；在P2A和tdTomato之后插入人源GH polyA，小鼠PGK启动子，嘌呤霉素抗性基因和polyA序列；3’同源臂包括终止密码子及其后约1000bp的基因组序列。
对于LMX1A-tdTomato/EN1-mNeonGreen报告基因系，首先生成LMX1A-tdTomato hESC细胞系，然后将P2A和mNeonGreen插入与LMX1A-tdTomato相同结构但使用新霉素抗性基因的EN1供体质粒中。
为了建立用于scRNA-seq的表面标记物报告基因/EGFPnls细胞系，构建了AAVS1-NeoR-CAG-EGFPnls-WPRE-polyA供体质粒，并使用转录激活效应核酸酶(TALENs)电穿孔到H9ES细胞中，或者电穿孔至已经构建好的表面标记报告基因细胞系。
对于TH-tdTomato/表面标记物-EGFP报告细胞系，在TH-tdTomato细胞系(细胞系构建请参见Xiong,M.et al.(2021).Human Stem Cell-Derived Neurons Repair Circuits and Restore Neural Function.Cell Stem Cell 28,112-126.e6.)基础上进一步构建。简而言之，通过用EGFP替换tdTomato，使用新霉素抗性基因重建了表面标志物-tdTomato供体质粒，靶向guide RNA与表面标志物-tdTomato细胞系使用的相同。
电穿孔，基因组DNA提取和基因组PCR鉴定的详细信息在以前的报告中进行了描述(Chen et al.,2015,2016；Xiong et al.,2021)。
2.中脑腹侧神经细胞的分化
包含中脑多巴胺能神经细胞的中脑腹侧神经细胞的诱导方法是基于前人建立的方法(Xi et al，2012)进行修改的。简而言之，人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞(传代后1天)在添加有SB431542(10μM)和DMH-1(2μM)的神经诱导培养基(NIM)中培养。为了使分化细胞形成中脑底板前体细胞，从第1天到第7天，在培养物中添加SHH和CHIR99021。在第7天，用移液器轻轻吹下神经上皮细胞集落，并重新进行单层培养，用添加SAG，SHH和CHIR99021的NIM再培养6天(D7-12)。在第12天，撤去CHIR99021，将SHH浓度降低至一定浓度，将SAG和FGF8b加入培养液中以使前体细胞在悬浮液中扩增直至第19天。第21天，在含有SHH和FGF8b的神经诱导培养基中培养，直至移植。第36天后，用添加 有脑源性神经营养因子(BDNF)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，抗坏血酸(AA)，cAMP，转化生长因子β3(TGFβ3)的神经分化培养基(Neurobasal培养基，1xN2supplement，1xB27)(NDM)继续培养。
3.细胞分选和流式细胞仪分析
在室温下，用Accutase将神经球处理8分钟使其解离成单个细胞。将分选的细胞以10,000细胞/孔的密度重新接种在低细胞粘附力的96孔板(Lipidure-Coatded Plate A-96U)上。在BD LSRFortessa流式细胞仪(美国BD)上进行分析，并使用FlowJo软件进一步分析数据。添加了Rho激酶(ROCK)抑制剂(0.5μM，Tocris)和10％不含维生素A的B-27补充剂，以提高接种后的细胞存活率。
对于第28天分选的细胞系，在添加有脑源性神经营养因子(BDNF，10ng/ml)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF，10ng/ml)，抗坏血酸(AA，200μM)，cAMP(1μM)，转化生长因子β3(TGFβ3，1ng/ml)的神经分化培养基(Neurobasal培养基，1xN2supplement，1xB27)(NDM)继续培养。
对于第21天分选的细胞系，在含有20ng/ml SHH，20ng/ml FGF8b和50mg/ml青霉素/链霉素的神经诱导培养基(NIM)中培养神经球。直到第30天，然后进行神经元成熟，即在添加有脑源性神经营养因子(BDNF，10ng/ml)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF，10ng/ml)，抗坏血酸(AA，200μM)，cAMP(1μM)，转化生长因子β3(TGFβ3，1ng/ml)和50mg/ml青霉素/链霉素的神经分化培养基(Neurobasal培养基，1xN2supplement，1xB27)(NDM)继续培养。
4.使用10x chromium平台scRNA-seq
对于体外分化样品，将附着的细胞克隆(第8天)或神经球(第14天，第21天，第28天，第35天)在37℃下用TrypLE Express(ThermoFisher)消化10分钟，并用MIM洗涤两次中。然后将细胞通过35μm细胞筛(BD)，以获得单细胞悬液。根据制造商的建议(10X Genomics)，使用chromium单细胞3'试剂盒(v2)或(v3)进行文库制备。文库在Illumina Hiseq PE150上测序。
对于移植样品，将表面标记物-tdTomato/AAVS1-CAG-EGFPnls-WPRE-polyA细胞系或AAVS1-CAG-EGFPnls-WPRE-polyA细胞系衍生的mDA神经前体细胞移植到4个月大的PD小鼠的纹状体中，并用过量剂量的水合氯醛处死，随后经颅灌注用冷的充氧的人工脑脊液中(aCSF,in mM:124NaCl,2.5KCl,1NaH
2PO
4,25NaHCO
3,37glucose,2CaCl
2,2MgSO
4)。取出大脑，收集200μm的震动切片，并在带有冷却平台的立体荧光显微镜下显微解剖移植物区 域(大部分位于纹状体中)。将这些脑片使用自制冰冷充氧的解离液(Dissection medium,DM,in mM:81.76Na
2SO
4,120K
2SO
4,5.8MgCl
2,25.2CaCl
2,1HEPES,20glucose,20NaOH)的加入木瓜蛋白酶(20units/ml，Worthington)，0.067mM 2-巯基乙醇(Sigma)，1.1mM EDTA，半胱氨酸和DNase I，并进行30-40分钟的酶消化，然后使用火抛光的巴斯德移液器进行手动吹打，并通过35μm DM平衡过的细胞过滤器(BD)进行过滤。然后将细胞在400g，5分钟下沉淀，小心除去上清液，然后重悬于1-2ml含2.5％FBS的DM中。然后，根据制造商的建议(MiltenyiBiotec)，使用碎片去除溶液进行细胞悬浮液的碎片去除步骤。然后将细胞沉淀重悬于含有2.5％FBS的200-400ul DM中，以进行细胞分选以富集EGFP阳性人源移植物。根据制造商的建议(10X Genomics)，使用chromiun单细胞3'试剂盒(v3)进行文库制备。库在Illumina Novaseq 6000上测序。
5.scRNA-seq数据的预处理
将scRNA-seq数据与人类参考基因组GRCh38-3.0.0进行比对，并使用Cellranger软件的默认参数(10x Genomics，v3.0.2或v4.0.0)进行多路分解。获得的过滤计数矩阵用于下游分析。
6.细胞群的聚类和鉴定
使用Seurat和Scanpy分析和处理过滤后的计数矩阵，包括数据过滤，标准化，高度可变的基因选择，缩放，降维和聚类。首先，将从每个时间点采样的scRNA-seq分别创建为Seurat对象。去除少于3个计数的基因，并去除检测到少于200个基因的细胞。其次，将每个Seurat对象转换为loom文件，并导入到Scanpy中进行聚类。然后，使用Seurat中的“合并”功能合并六个Seurat对象，并将其转换为loom文件以进行细胞类型聚类。下游分析的详细信息如下：
6.1.数据过滤：线粒体基因比例大于5％的细胞被排除。然后，检测到具有超过1000个基因的细胞，检测到少于6000个基因的细胞(检测到6000个基因的细胞是潜在的双峰)，以及检测到1000个以上的计数和少于40000个计数(检测到的40000个以上的细胞是潜在的双细胞)被保留。
6.2.数据归一化：对于每个细胞，使用Seurat中的“NormalizeData”功能进行对数归一化，“scale.factor”设置为40000。
6.3.高度可变的基因选择：使用Seurat中的“FindVariableFeatures”功能计算了2000个高度可变的基因。然后，我们鉴定了与细胞周期标记TOP2A相关的基因(Pearson相关系数大于0.15)，并将其从2000个高度可变的基因中排除。
6.4.细胞周期评分：使用“CellCycleScoring”功能，将一个具有细胞周期相关基因集的G1/S期表达的43个基因和G2/M期表达的54个基因用于计算S期评分和G2M期评分。细胞周期差异分数作为S期分数减去G2M期分数的差值。
6.5.数据缩放：Seurat对象使用默认参数执行“ScaleData”功能。计数的数目，基因的数目，线粒体基因比例和细胞周期差异评分是在“ScaleData”中回归的变量。
6.6.主成分分析：使用高度可变的基因来计算“RunPCA”功能中的主成分。获得了100个主要成分(PC)，并将其存储在Seurat对象中，以在下一部分中计算邻域图和umap。
6.7.Leiden聚类：将Seurat对象转换为loom文件并由Scanpy导入。观测值的邻域图由scanpy的“pp.neighbors”计算。然后，leiden算法是由“scanpy.tl.leiden”用于计算细胞聚类。
6.8.细胞群合并和修剪：每个细胞群排名前200的差异表达的基因通过“scanpy.tl.rank_genes_groups”。细胞群注释是根据发育中脑和小鼠发育的大脑图谱的先前经典的标记物手动完成的。对于具有相似标记基因表达的细胞群，我们将它们合并为一个群。对于具有未知标记基因表达的细胞群，我们使用基于网络的基因注释分析工具Metascape(Zhou et al。，2019)来定义它们的细胞群身份。结合过滤计数矩阵和Metascape的分析结果，我们定义了一些细胞群，这些细胞群是低质量的(检测到的细胞数和基因数少)，应激的，凋亡的，核糖体蛋白基因的检出率高的和低氧响应的。然后，我们将它们过滤掉，以获得最终修剪的细胞列表。最后，我们重新进行分析步骤1-8，以在单独的时间点数据集和合并的数据集中获得一致的聚类注释。
7.区域基因模块得分分析
基于我们数据集中的检测到的基因，先前的研究和小鼠发育脑图谱，对区域基因模块进行了整理。简而言之，中脑基因模块包括OTX1，OTX2，LMX1A，EN1，PITX2和SIM2。后脑基因模块包括HOXB-AS1，HOTAIRM1，HOXA2，HOXB2，GATA3和GBX2；MHB基因模块包括FGF8，FGF17，NKX2-8和PAX8。然后，基因模块的分数，用“scanpy.tl.score_genes”计算。基于UMAP嵌入中的三个基因模块表达来定义区域分类。
8.单细胞RNA速度分析
首先，应用velocyto的命令行界面为每个时间点scRNA-seq数据生成剪接/未剪接的表达矩阵(La Manno et al.,2018)。然后将所有矩阵以loom的形式合并，并使用scVelo进行下游RNA速度分析(Bergen et al.,2020)。筛选出了少于20个计数的21531个基因，保留了前2000个高度可变的基因，并将所有用于合并时程数据集聚类的细胞取交集。检测到了2000个高度可变基因的完整剪接动力学，在“随机”模式下估计了速度，并基于余弦相似度计算了 速度图。在umap嵌入上绘制了速度流图。基于“随机”模式下的速度估计值，计算了通用的基因共享潜伏时间，该潜伏时间代表细胞的内部时钟，仅基于其转录动力学，并绘制在umap嵌入上。
9.伪时间和基因级联分析
只有mDA相关细胞群(0-P_MesenFP_LMX1A_Early，1-P_MesenFP_LMX1A_Late，2-P_MesenFP_D14，11-N_DA，14-N_DA_Neuroblast)被提取并用于pseudotime分析。1978个基因，在不到3个细胞中检测到的基因被滤出。然后，执行类似细胞群的聚类和鉴定中步骤2-6，包括数据标准化，高度可变的基因选择，细胞周期评分，数据缩放和主成分分析。伪时间值是使用URD软件包计算的(Farrell et al.,2018)。简而言之，使用在URD中使用“calcDM”函数计算了扩散图。P_MesenFP_D14细胞群被选为根细胞，然后pseudotime通过进行第k最近邻图的概率广度优先搜索计算得到。为了找到随伪时间变化的基因，我们仅将至少在1％细胞中表达的基因视为“表达基因”。然后，我们计算了一条样条曲线，该曲线适合每组五个细胞的平均表达。我们选择随时间变化的基因，它们是：(1)实际平均表达值变化至少0.5，而其换算的log2平均表达值变化至少20％；(2)通过样条曲线拟合良好，这里我们对残差平方和设置阈值0.045；(3)样条曲线的拟合明显好于斜率0的平坦线，这里我们将阈值0.25设置为比flat更好。接下来，我们将这些基因的交集用于基因表达级联。
10.细胞类型重复性分析
为了评估在体外和体内发育的人类中脑产生的细胞类型之间的相似性，应用MetaNeighbor R软件包(v1.6.0)来计算AUROC得分，分别作为神经元类型和神经前体细胞类型的性能载体。首先，我们选择了2000个基因作为Seurat对象的整合特征和并将公共数据集准备为Seurat对象。然后，使用'FindIntegrationAnchors'函数找到的锚点集成了两个数据集。接下来，我们使用SummarizedExperiment R包(v1.16.1)准备了2000个锚定基因(可变基因)的归一化数据矩阵作为SummarizedExperiment类。使用快速，低内存和无监督版本的MetaNeighbor来计算AUROC得分(MetaNeighborUS功能，使用了快速版本)。跨数据集的平均AUROC得分绘制在热图中。
11.整合移植物scRNA-seq数据集
为了对移植样品的scRNA-seq数据集进行整合分析，使用了Harmony整合来减少不同标记物分选组之间的技术批次效应(未分类组为两批，CLSTN2衍生组为一批次，PTPRO衍生组为一批次)。Harmony软件包中的“RunHarmony”函数用于计算校正后的Harmony坐标。然后，将Seurat对象转换为loom文件并由Scanpy导入。观测值的邻域图由 “scanpy.pp.neighbors”计算。然后，使用leiden算法通过Scanpy中的“scanpy.tl.leiden”函数对单元进行聚类，该函数使用更正的Harmony嵌入而不是PC。细胞群注释是根据以前主要细胞类型的经典标记物手动完成的。为了在神经元中进一步聚类，通过表达STMN2过滤了神经元并聚类，重复进行了类似的数据处理，执行类似细胞群的聚类和鉴定中步骤2-6。
12.跨阶段某些基因阳性细胞比率估算
为了估计某些基因代表细胞群的百分比，从每个时间点的scRNA-seq数据集中随机选择了10％的细胞，重复10次作为10次试验。然后，我们为某些基因的UMI计数设置阈值(UMI数>0)。最后，我们指定特定基因超过UMI计数阈值的细胞作为阳性细胞。
对于平均伪批量表达，通过在Seurat中使用“Average Expression”，按合并的时间过程scRNA-seq数据集的阶段平均基因表达。被选择基因(LMX1A、EN1、CLSTN2和PTPRO)的平均表达水平被提取和绘制。
13.转录组测序和数据分析
对于LMX1A-tdTomato/EN1-mNeonGreen报告基因系的转录分析，将LMX1A-tdTomato/EN1-mNeonGreen细胞系向多巴胺能神经元定向分化。将细胞如上所述消化并用BD LSRFortessa流式细胞仪在第21天或第28天分选。tdTomato+Neongreen+收集为一组，而tdTomato-Neongreen+，tdTomato+Neongreen-和tdTomato-Neongreen-被收集在一起作为另一组。将细胞以400g，5分钟的速度沉淀并用TRIzol裂解。测序文库用
UltraTM RNA Library Prep Kit for
(NEB,USA)按照样品制造商的制备。文库在Illumina Hiseq PE150上测序。
原始测序序列的读数通过质量控制和衔接子修饰进行处理。然后，使用HISAT2软件(版本2.1.0)将干净的测序读段映射到UCSC人GRCh38基因组。Bam文件是使用SamTools(版本0.1.19)生成的。读数通过GenomicFeatures包的“summarizeOverlaps”计数。使用edgeR软件包中的'glmTreat'函数执行了差异表达分析。DEGs被选取的标准为：绝对倍数变化大于1.5(|Log2FC|>1.5),以及截断值Benjamini-Hochberg校正后p值0.05。
对于DEG火山图，选择具有统计学意义的临界值为0.001，选择绝对log2倍数变化的临界值为2。使用EnhancedVolcano R软件包(v1.4.0)实现了火山图。
14.使用单细胞数据估计转录组测序中细胞类型的比例
为了进行反卷积分析，使用MuSiC(Wang et al.,2019)来使用相应阶段(第21天和第28天)的scRNA-seq数据估算转录组数据的细胞类型比例。使用Biobase包将转录组数据集和scRNA-seq数据集都准备为“ExpressionSet”对象。使用默认的单尾Wilcoxon秩和检验从 “FindAllMarkers”功能计算出的前500个DEG中提取每种scRNA-seq细胞类型的输入基因标记。
15.组织制备和免疫组织化学
用过量的戊巴比妥(250mg/kg，腹腔内)处死动物，并先用盐水灌注，再用4％冰冷的磷酸盐缓冲的多聚甲醛(PFA)灌注。取出大脑并将其依次浸入20％和30％的蔗糖中直至沉没。在冷冻切片机(Leica SM2010R)上，以30mm的厚度切下连续矢状(从内侧到外侧0.12至3.12mm)或冠状(从Bregma 1.42至0.10mm)切片，并在20℃下保存在冷冻保护剂溶液中。将漂浮的脑片与一抗在4℃中孵育1-2晚，然后除去未结合的一抗。对于DAB染色，将切片与相应的生物素化二抗孵育1h，然后在室温下与抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶孵育1h。用DAB染色试剂盒观察免疫反应性。然后将切片用乙醇脱水，在二甲苯中透化，并固定在中性树脂中。为了进行荧光免疫标记，将切片与相应的荧光二抗在室温下孵育1小时。然后通过Fluoromount-G进行封片。
16.成像和细胞定量
为了量化TH细胞中表达EN1，FOXA2，LMX1A，和GIRK2的细胞的数量或TH细胞的比例，使用ImageJ软件对至少5张从盖玻片中随机选择的图像进行计数。数据重复三次，并表示为平均值±SEM。为了测量大脑切片中的人源纤维密度，使用Nikon TE600或Olympus VS120显微镜捕获平铺图像。通过图像处理和分析系统(Image Pro Plus 5.1软件)测量了人脑在小鼠大脑不同区域的光密度。数据显示为不同区域的光密度。对于TH，GIRK2，LMX1A，人细胞核(hN)和FOXA2染色，用尼康TIE倒置激光扫描共聚焦显微镜(尼康，60倍物镜)或奥林巴斯VS120(奥林巴斯，20倍物镜)勾勒并捕获移植物。用ImageJ手动计数单染或双染细胞。数据表示为TH-，LMX1A-，FOXA2-与总hN的比例，或GIRK2/TH/hN与TH/hN细胞的比例。所有数据均表示为平均值±SEM。
为了估计移植物体积，对用hN免疫染色的部分进行20倍放大并用ImageJ进行分析。移植面积以每个1:6部分外推，并且使用Cavalireis原理计算体积。为定量tdT+纤维的平均灰度值，所有条件包括染色和捕获一致的。选择纹状体左右侧四个区域，基于Li算法设置阈值，阈值内的像素被量化。相对平均灰度值定义为移植部位减去未移植部位的平均灰度值。
17.行为测试
17.1.旋转测试
在移植前以及移植后每月至6个月对苯丙胺诱导的旋转进行测试。腹膜注射苯丙胺(2 mg/ml生理盐水中，5mg/kg)5-10分钟后，通过摄像机记录2小时。数据表示为90分钟内每分钟的平均净转数。人工分析视频。同侧和对侧旋转均被计算。显示的数据是60分钟内净同侧旋转。表现出行为缺陷(即60分钟内大于300次旋转)的动物被定义为成功的PD模型，并可用于细胞移植。在移植后第2、4、6个月时进行旋转测试。
17.2.量化和统计分析
使用SPSS软件进行统计分析。在所有研究中，均通过Student-t检验，配对t检验，双因素方差分析，Holm-Sidak检验，Two-way ANOVA followed by Holm-Sidak test和Tukey’s post hoc检验或One-way ANOVA和Holm-Sidak检验进行数据分析。统计学显着性确定为p<0.05。*，**，和***分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001。
18.脑切片全细胞膜片钳记录
细胞移植后5个月，在冰冷的切割溶液(以mM计：100葡萄糖、75NaCl、26NaHCO
3、2.5KCl、2MgCl
2-6H
2O、1.25NaH
2PO
4-6H
2O和0.7CaCl
2)中使用振动切片机(Leica VT1200S)从PD小鼠制备前脑的水平冠状脑切片(300毫米厚)。切片被转移到95％O
2和5％CO
2饱和条件下、人工脑脊液(aCSF，单位mM：124NaCl、4.4KCl、2CaCl
2、1MgSO
4、25NaHCO
3、1NaH
2PO4和10葡萄糖)中在32℃下处理12分钟，然后在室温下转移到aCSF中。恢复60分钟后，将切片转移到记录室在28℃下以2-4毫升/分钟的速度连续灌注含氧aCSF。通过移植物中的tdT荧光鉴定移植的mDA神经元。
在整个实验过程中监测初始访问电阻，范围为15-30MΩ。丢弃访问阻力变化>15％的细胞。数据以1kHz过滤并以10kHz数字化。使用Axon 700B放大器(Axon)记录电压和电流信号。记录电极(3-5MΩ)充满内部溶液(以mM为单位：120K
+-葡萄糖、5NaCl、0.2EGTA、10HEPES、2MgATP、0.1Na
3GTP和10磷酸肌酸，用HCl调整pH为7.2)用于动作电位记录。以电流钳模式记录响应去极化电流(0-180pA，步长20pA，持续时间600ms)的动作电位(AP)。Ramp current injections(100–300pA，持续时间2000ms)用于记录mDA神经元的最大放电频率。在电流钳模式下通过注入电流(-120pA，持续时间2000ms)对移植的mDA神经元进行电压骤降测量。
充满内部溶液(以mM为单位：112Cs-葡萄糖酸盐、5TEA-Cl、3.7NaCl、0.2EGTA、10HEPES、2MgATP、0.3Na
3GTP和5QX-314，用CsOH调节至pH 7.2)的记录电极(3-5MΩ)用于记录自发兴奋突触后电流(sEPSC)和自发抑制性突触后电流(sIPSC)。为记录sEPSC和sIPSC，细胞的电压分别为-60mV或-10mV。
实施例1发现mDA前体细胞新型分子标记物
本申请发明人应用高通量单细胞转录组学解析了hPSCs来源的中脑腹侧神经细胞的分化过程及其异质性。具体来说，发明人模拟体内神经元的发育，采用了改进方案把hPSCs定向分化为包含mDA神经细胞在内的中脑腹侧神经细胞(Xi et al.,2012；Xiong et al.,2021)(图1)。mDA前体细胞群最初在第21天被检测到(细胞群P_Mesen_LMX1A_Early，第21天，图2)，其特征在于典型的中脑腹侧底板神经前体细胞标记物(LMX1A
+，EN1
+，OTX2
+和FOXA2
+，图4)的共表达。还检测到其他神经前体细胞群，包括一组后脑底板神经前体细胞(细胞群P_MetenFP_PDE1A，第21天，PDE1A
+，EN1
+和OTX2
-，图2和图3)，以及两组中脑底板神经前体细胞(细胞群P_MesenFP_CRH，BARHL1
+和PITX2
+；细胞群P_MesenFP_ABP，SIM2
+和SP5
+，图2和图3)。直到分化中后期，在第28天和第35天，观察到mDA神经母细胞(LMX1A
+和NEUROG2
+)，mDA神经元(TH
+和PITX3
+)和一小部分5-羟色胺能神经元(FEV
+和SLC17A8
+)(图2和图4)。
发明人令人惊讶地发现了在mDA前体细胞群上特异性表达的新型分子标记物CLSTN2，PTPRO，NTRK3，FLRT2，KITLG和CD83，发现中脑腹侧底板神经前体细胞经典转录因子LMX1A和EN1的组合可以特异的代表mDA前体细胞群(图5和图6)。
为了进一步验证mDA神经前体细胞中这些新型分子标记物的表达，发明人通过批量转录组测序分析假定的mDA前体细胞与其他细胞之间的差异表达基因。发明人首先通过CRIPSR/Cas9技术将两种荧光蛋白分别插入LMX1A和EN1基因位点构建了双重荧光报告细胞系(图7和图8)。发明人在第21天和第28天通过流式细胞荧光分选技术(FACS)分离了双阳性细胞(图7和图9)。其它细胞(单阳性细胞和双阴性细胞)作为对照细胞(图7和图9)。批量转录组学分析显示，CLSTN2和PTPRO在双阳性组中高表达，而在对照细胞中低表达(图10，黑色框框出的基因，图11左和中图)。
此外，其他神经元类型或神经前体细胞类型的标志性基因在对照细胞组中高表达，表明双阳性标记所代表的细胞群(LMX1A
+EN1
+)也剔除了mDA前体细胞以外的细胞类型(图10，未框出的基因)。发明人分别从第21天和第28天的scRNA-seq数据集中检查了来自批量转录组测序排名靠前的差异表达基因(DEG)。可以清楚地注意到，双阳性组中高表达基因在单细胞测序注释的mDA前体细胞群上特异性表达(图12A，星标记的列)，而其他类型的细胞标志物则分布在其他非mDA前体细胞群上(图12A)。发明人进一步整合了两组数据(批量转录组测序和单细胞测序)，并使用MuSiC(方法)估算批量转录组测序的细胞类型比例。比例热图显示，批量转录测序的双阳性组由高比例的单细胞测序注释的mDA前体细 胞群(P_MesenFP_LMX1A_Early和P_MesenFP_LMX1A_Late)组成，而对照细胞的细胞转录组由各种非mDA前体细胞群类型组成(图12B)。
为了实验验证两个表面标记物CLSTN2和PTPRO是否定位在细胞膜上，发明人构建了两种基因表达载体，发明人分别将将血凝素标签(HA-tag)插入到CLSTN2或PTPRO的N端(构建体I)或C端(构建体II)(图13)。发明人将这些质粒分别转染到293T细胞中。通过对HA-tag进行免疫染色，发明人发现两种类型的构建体均能够在细胞固定/破膜状态下检测到HA-tag的免疫活性，而对于活细胞状态(即非固定/破膜状态)仅当HA-tag位于N端时才能够检测到HA-tag的免疫活性。这些实验证明CLSTN2和PTPRO是表达在细胞质膜上的跨膜蛋白。
实施例2通过分子标记物分选mDA前体细胞实现mDA神经元体外高效富集
为了实现活细胞状态下分离出富含特定标记物的细胞，本实施例通过CRISPR/Cas9技术将荧光蛋白tdTomato敲入到每个标记物基因(CLSTN2和PTPRO)的C末端来构建荧光报告细胞系(图14A，14B，15A)。发明人在前体细胞大量产生的阶段(CLSTN2第21天，PTPRO第28天)分离了tdTomato
+细胞，将单细胞重新聚集成神经球进行培养，并在Day30开始换成神经分化培液进行体外成熟(图15A)。在诱导分化成熟之前(第30天)发明人检测了分选和未分选的神经球内mDA前体细胞标记分子LMX1A和OTX2的表达，发现和未分选组相比，CLSTN2，或PTPRO，或LMX1A
+EN1
+双阳性分选富集的神经球内LMX1A或OTX2阳性细胞显著富集，提示mDA前体细胞的富集(图15B-15E)。在分化成熟的晚期阶段(第45天)发明人通过对多巴胺能神经元特异性标记物TH的染色发现，发现和未分选组相比，CLSTN2，或PTPRO，或LMX1A
+EN1
+双阳性分选富集的神经球内TH阳性神经细胞显著富集(双阳性分选组：57.7％，双阳性未分选组：14.5％；CLSTN2分选组：46.3％，CLSTN2未分选组：17.9％；PTPRO分选组：41.7％，PTPRO未分选组：8.2％；图15F-15G)，证明分选后终末多巴胺能神经元的富集。此外，未分选的神经前体细胞中CLSTN2+或PTPRO+细胞的百分比与成熟神经球中mDA神经元的比例有很好的相关性(CLSTN2组，R＝0.98，P＝0.0033；PTPRO组，R＝0.94，P＝0.018；Pearson相关性)(图15H)表明神经前体细胞中这两个标志物阳性细胞的比例可预测终末mDA神经元的产量。
以上的神经前体细胞都是滋养层细胞培养的hESCs分化得到的。发明人进一步检测了hiPSCs分化得到的神经前体细胞，以及无滋养层细胞培养的hESCs分化得到的神经前体细胞中CLSTN2或PTPRO的富集作用。构建了两个正常人血细胞来源的hiPSCs，分别命名为 XZ#2-hiPSCs和ZYW#2-hiPSCs。进一步利用CRISRP-Cas9技术把tdTomato基因敲入到的hiPSCs中，获得了XZ#2-CLSTN2-tdTomato和ZYW#2-PTPRO-tdTomato报告细胞系(图16A-D)。发现和未分选组相比，CLSTN2，或PTPRO分选富集的hiPSCs来源的神经前体形成的神经球，分化成熟后球内TH阳性mDA神经元显著富集(XZ#2-CLSTN2组TH+神经元比例：CLSTN2分选组，50.2％±5.9％；未分选组：9.0％±0.9％。ZYW#2-PTPRO组TH+神经元比例：PTPRO分选组41.6％±3.8％，未分选组：13.2％±2.8％)(图16E-H)。在滋养层培养条件下hESCs分化得到的神经前体细胞，CLSTN2分选后可以显著提高成熟神经球内TH阳性mDA神经元比例(CLSTN2分选组，44.0％±4.2％；未分选组，7.7％±0.8％)(图16H-J)。这些结果证明无论是hESCs还是hiPSCs，无论是滋养层细胞培养的hESCs还是无滋养层培养的hESCs，这些细胞分化得到的神经前体细胞都可以通过CLSTN2或PTPRO介导的细胞分选，实现终末多巴胺能神经元的富集。
实施例3通过分子标记物分选mDA前体细胞实现脑内移植物中mDA神经元的高效富集
发明人进一步检测了通过表面分子标记物分选的神经前体细胞脑内移植后，是否可以提高移植块内mDA神经元的比例。本实施例分别将由使用CLSTN2，或PTPRO，或LMX1A
+EN1
+双阳性分选或未分选的前体细胞移植到PD小鼠模型的纹状体中。发现与未分选组相比(未分类组中mDA神经元占比9.80％)，所有条件的分选组中TH阳性的mDA神经元的比例都有显著富集(PTPRO组中58.1％，CLSTN2组中81.5％，第21天LMX1A
+EN1
+组中57.3％，第28天LMX1A
+EN1
+组中32.4％；图17A-D)，并且这些神经元都表达底板标记分子FOXA2，进一步证明这些TH阳性的神经元是确实是中脑底板来源的多巴胺能神经元(图18A和18B)。移植物中TH阳性神经元共表达PITX3和多巴胺转运体SLC6A3(也被称为DAT)，证明这些神经元识成熟的mDA神经元(图18C和18D)。
发明人进一步通过对mDA神经元不同亚型标记分子的染色发现，移植物中90％的TH阳性神经元共表达中脑黑质多巴胺能神经元(A9)的标记物分子GIRK2，而只有不到10％的TH阳性神经元表达中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元(A10)的标记分子CB，并且分选组和未分选组中TH阳性神经元共表达GIRK2或CB的比例没有显著差异，提示未分选和分选富集后得到的mDA神经元主要是中脑黒质多巴胺能神经元(A9)，A9是PD中主要丢失的mDA神经元亚型(图18E和18F)。
实施例4通过scRNA-seq解析移植物组成
本实施例的目的在于明确细胞治疗中移植物的细胞组成。为了便于从PD小鼠移植后的大脑中分离出人源移植细胞，发明人在表面标记物的荧光报告细胞系基础上，构建了表达核定位EGFP的hPSCs细胞系(图19A)。在将CLSTN2或PTPRO分选或未分选的前体细胞移植到纹状体中4-5个月后，将移植的鼠脑解剖，消化成单细胞悬液，通过FACS分离出人源细胞并进行单细胞测序(两批未分类的组，每个表面标志物组各一批；图19A)。通过低分辨率的聚类分析发现移植物主要由四种主要细胞类型组成，包括少突胶质前体细胞(OPC)或少突胶质细胞(OPC/Oligo细胞群)，星形胶质细胞(Astro细胞群)，神经元(Neuron细胞群)和血管软脑膜细胞(VLMC细胞群)(图19C和19B)。其中VLMC细胞群在以前hPSCs来源的中脑腹侧细胞移植物中也被发现(Tiklová et al.,2020)。进一步的分析发现VLMC细胞可以分为不同的亚群，并且不同marker的分选组和未分选组的移植物中VLMC的亚群组成不同(图21A)。组织学染色验证了GFAP阳性的星形胶质细胞，OLIGO2阳性的少突胶质前体细胞或少突胶质细胞，以及COL1A1阳性的VLMC细胞在移植物中的存在(图21C-21D)。进一步对组织学染色的统计分析发现，在分选组和未分选组中，星形胶质细胞的比例保持一致，然而OPC/Oligo细胞群在分选组中几乎检测不到(图21F和21G)。
进一步针对神经元的聚类分析产生了12个神经元亚型细胞群(图19E)，所有这些亚型细胞群都可以通过代表性标记物来区分(图19F)。发明人检测到三种表达TH和PITX3的mDA神经元亚型(DA_0，DA_1和DA_2)，并且发现DA_0细胞群表达多巴胺转运蛋白SLC6A3，也称为DAT，这可能表明该细胞群是成熟的mDA神经元(图19E和19F)。组织学验证进一步证实未分选和CLSTN2或PTPRO分选的移植物中都有DAT阳性TH阳性的mDA神经元的存在(图20A)。同时，还检测到5种不同亚型的GABA能神经元，3种不同亚型的谷氨酸神经元，和5-羟色胺神经元，这些结果进一步证实移植物中存在多种类型的神经元(图19D和19E)。为了比较表面标记物分选组和未分选组之间神经元组成的变化，发明人按每组计算不同神经元亚型的百分比(图19F)。与组织学检测相似，在CLSTN2或PTPRO分选组中，移植物中mDA神经元比例显著增加(图19A和19B)。在未分选组中，有五种不同类型的GABA能神经元，占移植神经元总数的40.55％，还有一种5-羟色胺神经元，占移植神经元总数的5.78％；而在表面标记物分选组中，移植物中GABA神经元和5-羟色胺神经元均显著减少至
(图19F)。这一结果被组织学染色进一步证实(图20B-20E)。组织学染色发现，在LMX1A和EN1双养性的分选组中，移植物中GABA神经元和5-羟色胺神经元也显著减少(图21B)。在未分选组中还含有三种不同亚型的谷氨酸神经元 (Glut_BARHL1+细胞群，Glut_NKX2-1+细胞群和Glut_NKX6-1+细胞群)，而在CLSTN2或PTPRO分选组中均只有1种谷氨酸神经元亚型(Glut_NKX6-1+细胞群)(图19F)。其中减少的两类细胞群Glut_BARHL1+细胞群和Glut_NKX2-1+细胞群的代表性标记是PITX2，其被认为是间脑或旁侧mFP的标记物(Kirkeby et al.,2017；Nolbrant et al.,2017)(图19D-19F)。相反，Glut_NKX6-1+细胞群表达腹侧mFP的经典标记LMX1A，EN1和FOXA2。这些数据表明，Glut_NKX6-1+细胞群可能也是由mFP衍生的，和mDA神经元具有相同的起源(图19E和19F)。有趣的是通过不同的表面分子标记物进行分选后的移植物，其神经元组成是相似的，都主要由三种不同亚型的多巴胺能神经元(DA_0，DA_1和DA_2)和一种亚型的谷氨酸能神经元(Glut_NKX6-1+细胞群)组成(图19F)，这一结果提示通过表面分子标记物分选的移植物组成是稳定的。
实施例5评估移植物神经支配模式
通过染色人类神经元细胞粘附分子(hNCAM)来评估移植物神经支配模式。在所有分选或未分选的组中，发明人观察到覆盖整个尾状壳核(CPu)的密集hNCAM+纤维(图22A、23A和23B)，CPu是黑质内源性DA神经元靶向的大脑区域。在外侧伏隔核壳(LAcbSh)和嗅结节(Tu)、腹侧被盖区(VTA)内源性mDA神经元的目标区域中观察到较低密度的hNCAM+纤维(图22A、23A和23B)。有趣的是，标记分选的移植物比未分选的移植物小得多，这表明分选去除了具有高增殖潜力的细胞(图22A，22B)。
进一步检查表明，无论是分选组还是未分选组移植物内STEM121阳性人神经纤维(STEM121+)共表达TH(图23D)，证实这些纤维是移植细胞来源的人多巴胺能神经纤维。在标记分选的移植物中，人类突触素抗体标记的点状结构沿CPu中的TH阳性纤维分布，表明移植的mDA神经元与宿主神经元形成了突触连接(图23E)。
为了具体阐明移植的mDA神经元的特异性神经支配，发明人构建了细胞系(TH-tdT/C LSTN2-EGFP hPSCs和TH-tdT/PTPRO-EGFP hPSCs)，这些细胞系通过内源TH表达tdT，通过CLSTN2或PTPRO标记基因表达EGFP。TH-tdT hPSCs作为对照(图22C)。
然后，将源自这些hPSC报告系的表面标记分选或未分选的神经前体细胞移植到PD小鼠的纹状体中。移植后五个月，tdT仅在移植物中的TH阳性mDA神经元中表达(图22D)。与hNCAM阳性纤维的神经支配模式一致，来自标记分选或未分选移植物的tdT+人mDA纤维分布于整个CPu(图22E)。重要的是，来自标记分选移植物的tdT+人mDA纤维比来自未分选移植物的那些tdT+人mDA纤维更密集，这表明表面标记分选的移植物提供更强的多巴胺能神经支配(图22F和22G)。
实施例6富含CLSTN2或PTPRO的神经前体细胞的治疗效力
6.1检查移植的mDA神经元的电生理特性。
全细胞膜片钳记录显示，分选或未分选移植物中的人mDA神经元(tdT+)在移植5个月后显示出相似的电流诱导动作电位(APs)和自发AP(sAPs)，表明它们在功能上已经成熟(图24A,24B和图25A)。静息膜电位(RMP)和AP阈值在分选组和未分选组之间相似(图24C和24D)。对于所有组，sAPs表现为低评率(未分选，0.39Hz；CLSTN2，0.91Hz；PTPRO，0.86Hz；图25A和25B)和后超极化(AHP)突出(图24E)，这些特征与内源性SNc(A9)一致mDA神经元。此外，所有组中大多数移植的mDA神经元在注入超极化电流时表现出下垂电位(sag potentials)，这是A9 mDA神经元的典型特征(图25C和25D)。此外，移植的mDA神经元在达到最大放电频率后显示出去极化阻滞，以响应增加的梯度电流的注入(图24F和24G)。这些结果表明，分选和未分选的mDA神经元在移植5个月后功能成熟，并且大多数具有A9 mDA神经元的电生理特征。
移植后3-6个月建立移植mDA神经元的功能输入。在本实施例中，移植的mDA神经元的电生理分析表明，在移植后5个月，在移植的mDA神经元中很容易检测到自发的兴奋性和抑制性突触后电流(分别为sEPSC和sIPSC)(图25E)。sIPSCs和sEPSCs的平均振幅和频率在分选组和未分选组之间具有可比性(图25F、25G、24H和4I)。这些结果表明，表面标记分选和未分选的mDA神经元都整合入突触前电路中并接收功能输入。
6.2评估移植细胞的功能效果
本实施例进一步在移植前和移植后每2个月通过苯丙胺诱导的旋转评估移植细胞的功能效果。移植经CLSTN2、PTPRO、LMX1A+EN1+分选或未经分选的神经前体细胞的PD小鼠在苯丙胺诱导的旋转中逐渐恢复(图25H和24J)，而仅接受人工脑脊液(aCSF)处理的小鼠则没有恢复(图25H)。这一结果证明移植分选或未分选的神经前体细胞都可以解救PD小鼠的行为学障碍。
基于这一结果，以及标记分选的细胞高度富集mDA神经前体细胞这一事实，可以说明在移植更少的本发明所述的标记分选的细胞的情况下，应该仍然可以看到PD小鼠的功能恢复。
因此，能够将每只小鼠的移植细胞数量从100,000个减少到7500个(即小于原始移植剂量的10％)。在移植后六个月，在标记分选组中观察到苯丙胺诱导的旋转行为的恢复，但在未分类的对照组中没有观察到，这表明标记分选的mDA神经前体细胞具有更高的治疗效力(图25I)。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
Claims (170)
- 鉴别多巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括：判断候选细胞是否具备下述一种或多种特征：CLSTN2 +，PTPRO +，NTRK3 +，FLRT2 +，KITLG +，CD83 +，和/或LMX1A +EN1 +；将具备所述特征的细胞鉴别为多巴胺能神经前体细胞。
- 根据权利要求1所述的方法，其中所述候选细胞为神经前体细胞。
- 根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述候选细胞源自多能干细胞。
- 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述候选细胞源自人多能干细胞。
- 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述候选细胞已在体外分化至少约10天。
- 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：CLSTN2 +。
- 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的CLSTN2的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求7所述的方法，其中所述CLSTN2的表达和/或活性水平包括编码CLSTN2的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或CLSTN2蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求7-8中任一项所述的方法，其中所述检测包括对所述候选细胞进行修饰。
- 根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述检测包括使用标记分子。
- 根据权利要求10所述的方法，其中所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
- 根据权利要求10-11中任一项所述的方法，其中所述标记分子包括荧光报告基因。
- 根据权利要求1-12所述的方法，其包括使能够特异性结合CLSTN2蛋白的试剂和/或能够测定CLSTN2蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其包括使能够特异性扩增编码CLSTN2的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码CLSTN2的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：PTPRO +。
- 根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的PTPRO的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求16所述的方法，其中所述PTPRO的表达和/或活性水平包括编码PTPRO的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或PTPRO蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求16-17中任一项所述的方法，其中所述检测包括对所述候选细胞进行修 饰。
- 根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中所述检测包括使用标记分子。
- 根据权利要求19所述的方法，其中所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
- 根据权利要求19-20中任一项所述的方法，其中所述标记分子包括荧光报告基因。
- 根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其包括使能够特异性结合PTPRO蛋白的试剂和/或能够测定PTPRO蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其包括使能够特异性扩增编码PTPRO的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码PTPRO的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：NTRK3 +。
- 根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的NTRK3的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求25所述的方法，其中所述NTRK3的表达和/或活性水平包括编码NTRK3的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或NTRK3蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求25-26中任一项所述的方法，其中所述检测包括对所述候选细胞进行修饰。
- 根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述检测包括使用标记分子。
- 根据权利要求28所述的方法，其中所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
- 根据权利要求28或29所述的方法，其中所述标记分子包括荧光报告基因。
- 根据权利要求1-30所述的方法，其包括使能够特异性结合NTRK3蛋白的试剂和/或能够测定NTRK3蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其包括使能够特异性扩增编码NTRK3的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码NTRK3的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：FLRT2 +。
- 根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的FLRT2的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求34所述的方法，其中所述FLRT2的表达和/或活性水平包括编码FLRT2的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或FLRT2蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求34-35中任一项所述的方法，其中所述检测包括对所述候选细胞进行修 饰。
- 根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述检测包括使用标记分子。
- 根据权利要求37所述的方法，其中所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
- 根据权利要求37或38所述的方法，其中所述标记分子包括荧光报告基因。
- 根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其包括使能够特异性结合FLRT2蛋白的试剂和/或能够测定FLRT2蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其包括使能够特异性扩增编码FLRT2的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码FLRT2的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：KITLG +。
- 根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的KITLG的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求43所述的方法，其中所述KITLG的表达和/或活性水平包括编码KITLG的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或KITLG蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求43-44中任一项所述的方法，其中所述检测包括对所述候选细胞进行修饰。
- 根据权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述检测包括使用标记分子。
- 根据权利要求46所述的方法，其中所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
- 根据权利要求46或47所述的方法，其中所述标记分子包括荧光报告基因。
- 根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其包括使能够特异性结合KITLG蛋白的试剂和/或能够测定KITLG蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其包括使能够特异性扩增编码KITLG的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码KITLG的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：CD83 +。
- 根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的CD83的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求52所述的方法，其中所述CD83的表达和/或活性水平包括编码CD83的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或CD83蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求52-53中任一项所述的方法，其中所述检测包括对所述候选细胞进行修 饰。
- 根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述检测包括使用标记分子。
- 根据权利要求55所述的方法，其中所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
- 根据权利要求55或56所述的方法，其中所述标记分子包括荧光报告基因。
- 根据权利要求1-57所述的方法，其包括使能够特异性结合CD83蛋白的试剂和/或能够测定CD83蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其包括使能够特异性扩增编码CD83的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码CD83的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中所述方法包括判断候选细胞是否具备下述特征：LMX1A +EN1 +。
- 根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述判断包括直接或间接检测所述候选细胞的LMX1A表达和/或活性水平，和EN1的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求61所述的方法，其中所述LMX1A的表达和/或活性水平包括编码LMX1A的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或LMX1A蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求61-62中任一项所述的方法，其中所述EN1的表达和/或活性水平包括编码EN1的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或EN1蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求61-63中任一项所述的方法，其中所述检测包括对所述候选细胞进行修饰。
- 根据权利要求61-64中任一项所述的方法，其中所述检测包括使用标记分子。
- 根据权利要求65所述的方法，其中所述标记分子包括蛋白质、核酸和/或小分子。
- 根据权利要求65或66所述的方法，其中所述标记分子包括荧光报告基因。
- 根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其包括使能够特异性结合LMX1A蛋白的试剂和/或能够测定LMX1A蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其包括使能够特异性扩增编码LMX1A的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码LMX1A的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其包括使能够特异性结合EN1蛋白的试剂和/或能够测定EN1蛋白活性的试剂与所述候选细胞接触。
- 根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其包括使能够特异性扩增编码EN1的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码EN1的核酸分子的探针与所述候选细胞接触。
- 细胞产品，其包含根据权利要求1-73中任一项所述的方法得到的多巴胺能神经前体细胞。
- 分离多巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括(a)提供神经前体细胞群，(b)分离所述神经前体细胞群中具备下述一种或多种特征的细胞：CLSTN2 +，PTPRO +，NTRK3 +，FLRT2 +，KITLG +，CD83 +，和/或LMX1A +EN1 +。
- 富集多巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括(a)提供神经前体细胞群，(b)富集所述神经前体细胞群中具备下述一种或多种特征的细胞：CLSTN2 +，PTPRO +，NTRK3 +，FLRT2 +，KITLG +，CD83 +，和/或LMX1A +EN1 +。
- 根据权利要求73所述的分离巴胺能神经前体细胞的方法，或根据权利要求74所述的富集巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括(a)提供神经前体细胞群，(b)分离或富集所述神经前体细胞群中CLSTN2 +的细胞。
- 根据权利要求73所述的分离巴胺能神经前体细胞的方法，或根据权利要求74所述的富集巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括(a)提供神经前体细胞群，(b)分离或富集所述神经前体细胞群中PTPRO +的细胞。
- 根据要求73所述的分离巴胺能神经前体细胞的方法，或根据权利要求74所述的富集巴胺能神经前体细胞的方法，所述方法包括(a)提供神经前体细胞群，(b)分离或富集所述神经前体细胞群中LMX1A +EN1 +的细胞。
- 多巴胺能神经前体细胞群，其包含根据权利要求73-77中任一项所述的方法得到的多巴胺能神经前体细胞。
- 制备细胞产品的方法，其包括(a)提供神经前体细胞，(b)分离和/或富集具备下述一种或多种特征的神经前体细胞：CLSTN2 +，PTPRO +，NTRK3 +，FLRT2 +，KITLG +，CD83 +，和/或LMX1A +EN1 +。
- 根据权利要求79所述的方法，其包括由细胞群体分化获得所述神经前体细胞。
- 根据权利要求80所述的方法，其中所述细胞群体源自啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞。
- 根据权利要求80-81中任一项所述的方法，其中所述细胞群体源自多能干细胞。
- 根据权利要求80-82中任一项所述的方法，其中所述细胞群体源自人多能干细胞。
- 根据权利要求80-83中任一项所述的方法，其包括将所述细胞群体与ALK抑制剂、音猥因子(SHH)信号传导激活剂和GSK-3抑制剂接触。
- 根据权利要求80-84中任一项所述的方法，其中所述ALK包括ALK2抑制剂、ALK4 抑制剂、ALK5抑制剂和/或ALK7抑制剂。
- 根据权利要求85所述的方法，其中所述ALK4抑制剂包括SB431542。
- 根据权利要求85-86中任一项所述的方法，其中所述ALK2抑制剂包括DMH-1。
- 根据权利要求84-87中任一项所述的方法，其中所述SHH信号传导激活剂包括SHHC25II、SAG和/或Purmorphamine。
- 根据权利要求84-88中任一项所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂包括CHIR99021。
- 根据权利要求84-89中任一项所述的方法，其中所述接触在能够使所述细胞群体能够分化为中脑底板前体细胞的条件下进行。
- 根据权利要求90所述方法，其中所述分化包括体外分化和体内分化。
- 用于评估细胞产品的方法，其包括检测所述细胞产品中具备下述一种或多种特征的细胞的比例：CLSTN2 +，PTPRO +，NTRK3 +，FLRT2 +，KITLG +，CD83 +，和/或LMX1A +EN1 +，以进行所述评估。
- 优化细胞产品制备过程的方法，其包括检测所述细胞产品中具备下述一种或多种特征的细胞的比例：CLSTN2 +，PTPRO +，NTRK3 +，FLRT2 +，KITLG +，CD83 +，和/或LMX1A +EN1 +，以进行所述优化。
- 根据权利要求93所述的方法，其中所述制备过程包括优化细胞产品的产生、分化、分离和/或纯化。
- 权利要求72所述的细胞产品经过进一步扩增和增殖得到的细胞制剂。
- CLSTN2 +指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
- PTPRO +指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
- NTRK3 +指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
- FLRT2 +指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
- KITLG +指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
- CD83 +指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
- LMX1A +EN1 +指示剂用于制备细胞产品的用途，其中所述细胞产品包含多巴胺能神经前体细胞。
- 制备多巴胺能神经前体细胞的质控试剂盒，其包括质控试剂，所述质控试剂能够用于判断候选细胞是否具备下述一种或多种特征：CLSTN2 +，PTPRO +，NTRK3 +，FLRT2 +，KITLG +，CD83 +，和/或LMX1A +EN1 +。
- 根据权利要求103所述的质控试剂盒，其包括能够培养和/或保存所述候选细胞的试剂。
- 根据权利要求103-104中任一项所述的质控试剂盒，其中所述候选细胞为神经前体细胞。
- 根据权利要求103-105中任一项所述的质控试剂盒，其中所述候选细胞源自多能干细胞。
- 根据权利要求103-106中任一项所述的质控试剂盒，其中所述候选细胞源自人多能干细胞。
- 根据权利要求103-107中任一项所述的质控试剂盒，其中所述候选细胞已在体外分化至少约10天。
- 根据权利要求103-108中任一项所述的质控试剂盒，其中所述能够培养和/或保存所述候选细胞的试剂与所述质控制剂独立包装。
- 根据权利要求103-109中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的CLSTN2的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求110所述的质控试剂盒，其中所述CLSTN2的表达和/或活性水平包括编码CLSTN2的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或CLSTN2蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求110-111中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂包括能够特异性扩增编码CLSTN2的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码CLSTN2的核酸分子的探针。
- 根据权利要求103-112中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的PTPRO的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求113所述的质控试剂盒，其中所述PTPRO的表达和/或活性水平包括编码PTPRO的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或PTPRO蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求113-114中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂包括能够特异 性扩增编码PTPRO的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码PTPRO的核酸分子的探针。
- 根据权利要求103-115中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的NTRK3的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求116所述的质控试剂盒，其中所述NTRK3的表达和/或活性水平包括编码NTRK3的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或NTRK3蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求116-117中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂包括能够特异性扩增编码NTRK3的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码NTRK3的核酸分子的探针。
- 根据权利要求103-118中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的FLRT2的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求119所述的质控试剂盒，其中所述FLRT2的表达和/或活性水平包括编码FLRT2的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或FLRT2蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求119-120中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂包括能够特异性扩增编码FLRT2的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码FLRT2的核酸分子的探针。
- 根据权利要求103-121中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的KITLG的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求122所述的质控试剂盒，其中所述KITLG的表达和/或活性水平包括编码KITLG的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或KITLG蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求122-123中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂包括能够特异性扩增编码KITLG的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码KITLG的核酸分子的探针。
- 根据权利要求103-124中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的CD83的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求125所述的质控试剂盒，其中所述CD83的表达和/或活性水平包括编码CD83的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或CD83蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求125-126中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂包括能够特异性扩增编码CD83的核酸分子的引物和/或能够特异性识别编码CD83的核酸分子的探针。
- 根据权利要求103-127中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂能够直接或间接检测所述候选细胞的LMX1A表达和/或活性水平，和EN1的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求128所述的质控试剂盒，其中所述LMX1A的表达和/或活性水平包括编码LMX1A的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或LMX1A蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求128-129中任一项所述的质控试剂盒，其中所述EN1的表达和/或活性水平包括编码EN1的核酸分子的表达和/或活性水平，和/或EN1蛋白的表达和/或活性水平。
- 根据权利要求128-130中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂包括能够特异性结合LMX1A蛋白的试剂和/或能够测定LMX1A蛋白活性的试剂。
- 根据权利要求128-131中任一项所述的质控试剂盒，其中所述质控试剂包括能够特异性结合EN1蛋白的试剂和/或能够测定EN1蛋白活性的试剂。
- 控制制备的多巴胺能神经前体细胞的质量的方法，其包括以下步骤：a)检测制备的细胞中具备下述一种或多种特征的细胞的比例：CLSTN2 +，PTPRO +，NTRK3 +，FLRT2 +，KITLG +，CD83 +，和/或LMX1A +EN1 +；b)如果步骤a)检测到的比例为至少约10％，则所述制备的多巴胺能神经前体细胞的质量符合要求。
- 根据权利要求133所述的方法，其中如果步骤a)检测到的比例为至少约30％，则所述制备的多巴胺能神经前体细胞的质量符合要求。
- 分离或富集的多巴胺能神经前体细胞群，其特征为表达下述一种或多种多巴胺能神经前体细胞标记物：CLSTN2 +，PTPRO +，NTRK3 +，FLRT2 +，KITLG +，CD83 +，和/或LMX1A +EN1 +。
- 根据权利要求135所述的多巴胺能神经前体细胞群，其特征为：CLSTN2 +。
- 根据权利要求135-136中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其特征为：PTPRO +。
- 根据权利要求135-137中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其特征为：NTRK3 +。
- 根据权利要求135-138中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其特征为：FLRT2 +。
- 根据权利要求135-139中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其特征为：KITLG +。
- 根据权利要求135-140中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其特征为：CD83 +。
- 根据权利要求135-141中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其特征为： LMX1A +EN1 +。
- 多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达下述一种或多种多巴胺能神经前体细胞标记物：CLSTN2 +，PTPRO +，NTRK3 +，FLRT2 +，KITLG +，CD83 +，和/或LMX1A +EN1 +。
- 根据权利要求143中所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达CLSTN2。
- 根据权利要求143-144中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达PTPRO。
- 根据权利要求143-145中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达NTRK3。
- 根据权利要求143-146中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达FLRT2。
- 根据权利要求143-147中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达KITLG。
- 根据权利要求143-148中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达CD83。
- 根据权利要求143-149中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达LMX1A和EN1。
- 根据权利要求143-150中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达下述一种或多种多巴胺能神经前体细胞标记物：CLSTN2 +，PTPRO +，NTRK3 +，FLRT2 +，KITLG +，CD83 +，和/或LMX1A +EN1 +。
- 根据权利要求143-151中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达CLSTN2。
- 根据权利要求143-152中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达PTPRO。
- 根据权利要求143-153中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达NTRK3。
- 根据权利要求143-154中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达KITLG。
- 根据权利要求143-155中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约40％， 50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达FLRT2。
- 根据权利要求143-156中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达CD83。
- 根据权利要求143-157中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，其中至少约40％，50％，60％，70％，80％，或90％的细胞表达LMX1A和EN1。
- 细胞产品，其包含权利要求135-158中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群。
- 移植物组合物，其由权利要求135-158中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群在体内或者体外分化而来。
- 药物组合物，其包含权利要求135-158中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，或者权利要求72或159所述的细胞产品。
- 根据权利要求161所述的药物组合物，其还包括药学上可接受的佐剂。
- 预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求78、135-158中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，权利要求72、159中任一项所述的细胞产品和/或权利要求161-162中任一项所述的药物组合物。
- 根据权利要求163所述的方法，其中所述神经系统疾病或病症包括帕金森氏症。
- 权利要求78、135-158中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，权利要求72、159中任一项所述的细胞产品和/或权利要求161-162中任一项所述的药物组合物在制备预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症的药物中的用途。
- 根据权利要求165所述的用途，其中所述神经系统疾病或病症包括帕金森氏症。
- 权利要求78、135-158中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，权利要求72、159中任一项所述的细胞产品，和/或权利要求161-162中任一项所述的药物组合物，其用于预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症。
- 根据权利要求78、135-158中任一项所述的多巴胺能神经前体细胞群，权利要求72、159中任一项所述的细胞产品，和/或权利要求161-162中任一项所述的药物组合物的使用，其中所述神经系统疾病或病症包括帕金森氏症。
- 预防、治疗或缓解神经系统疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：鉴别候选细胞是否具备下述一种或多种特征：CLSTN2 +，PTPRO +，NTRK3 +，FLRT2 +，KITLG +，CD83 +，和/或LMX1A +EN1 +；挑选具备所述特征的细胞；和向有需要的受试者施用有效剂量的具备所述特征的细胞。
- 根据权利要求169所述的方法，其中所述神经系统疾病或病症包括帕金森氏症。
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