KR102426327B1 - 생착용 중뇌 도파민(da) 뉴런 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기 세포 생물학 분야, 특히 비배아 인간 유도 다능성 줄기 세포(hiPSC), 체세포 줄기 세포, 질환 환자로부터의 줄기 세포, 또는 계통 특이적 분화가 가능한 임의의 다른 세포에 부가하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 비제한적으로 포함할 수 있는 다능성 또는 다중능성 줄기 세포의 계통 특이적 분화에 관한 것이다. 구체적으로는 hESC 및/또는 hiPSC를 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포로, 이어서 신규 배양 조건을 이용해서 중뇌 운명을 가진 큰 모집단의 FOXA2+LMX1A+TH+ 도파민(DA) 뉴런으로 계통 특이적 분화를 지정하는 방법이 기재된다. 본 발명의 방법을 이용해서 제조되는 중뇌 운명을 가진 FOXA2+LMX1A+TH+ 도파민(DA) 뉴런은 시험관내 약물 발견 분석, 신경학 연구에서, 그리고 환자에서 도파민 뉴런의 부족 질환 또는 이러한 손상을 역전시키는 치료제로서의 용도를 비제한적으로 포함하는 다양한 용도들에 대해 추가로 고려된다. 또한, 질환 모델링, 특히 파킨슨 질환에서 사용하기 위한 인간 다능성 줄기 세포로부터 중뇌 운명을 가진 FOXA2+LMX1A+TH+ 도파민(DA) 뉴런을 분화시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 추가적으로 진정한 DA 뉴런에 CD142, 및 A9 유형 뉴런 세포와 같은 마커가 농축된다.

Description

생착용 중뇌 도파민(DA) 뉴런{MIDBRAIN DOPAMINE (DA) NEURONS FOR ENGRAFTMENT}
정부 라이센스 권리
본 발명은 부분적으로 미국 국립 위생 연구소(NIH) 및 국립 신경 장애 및 뇌졸중 협회(NINDS)로부터의 NIH/NINDS 연구비 NS052671 및 NIH/NINDS 연구비 P50 NS047085 하에 정부 지원으로 수행되었다. 이에 따라, 미국 정부는 본 발명에 있어 일정한 권리를 갖는다.
발명 분야
본 발명은 줄기 세포 생물학 분야, 특히 비배아 인간 유도 다능성 줄기 세포(hiPSC), 체세포 줄기 세포, 질환 환자로부터의 줄기 세포, 또는 계통 특이적 분화가 가능한 임의의 다른 세포에 부가하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 비제한적으로 포함할 수 있는 다능성 또는 다중능성 줄기 세포의 계통 특이적 분화에 관한 것이다. 구체적으로는 hESC 및/또는 hiPSC를 바닥 플레이트(floor plate) 중뇌 선조체(progenitor) 세포로, 이어서 신규 배양 조건을 이용해서 중뇌 운명을 가진 큰 모집단의 FOXA2+LMX1A+TH+ 도파민(DA) 뉴런으로 계통 특이적 분화를 지정하는 방법이 기재된다. 본 발명의 방법을 이용해서 제조되는 중뇌 운명을 가진 FOXA2+LMX1A+TH+ 도파민(DA) 뉴런은 시험관내 약물 발견 분석, 신경학 연구에서, 그리고 환자에서 도파민 뉴런의 부족 질환 또는 이러한 손상을 역전시키는 치료제로서의 용도를 비제한적으로 포함하는 다양한 용도들에 대해 추가로 고려된다. 또한, 질환 모델링, 특히 파킨슨 질환에서 사용하기 위한 인간 다능성 줄기 세포로부터 중뇌 운명을 가진 FOXA2+LMX1A+TH+ 도파민(DA) 뉴런을 분화시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 추가적으로 진정한(authentic) DA 뉴런에 CD142, 및 A9 유형 뉴런 세포와 같은 마커가 농축된다.
여러 특화 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 보유하는 세포 모집단은 다수의 계통 특이적 분화 세포 모집단의 개발을 위해 유용하다. 특화된 세포로의 추가 분화능을 보유하는 이들 세포 모집단은 다능성 세포를 함유한다. 다능성 세포는 배아 및/또는 비배아 체세포 줄기 세포에서 기원할 수 있다.
이들 계통 특이적 분화 세포 모집단은 정의된 세포 모집단의 기능 상실을 일으키는 질환을 갖는 환자에 대한 세포 대체 치료에서의 용도를 찾는데 고려된다. 이들의 직접적인 치료적 가치에 부가하여, 계통 특이적 분화 세포는 또한 기능의 특정을 위해 또는 세포 계통 특이적 질환을 처치하기 위한 치료 분자의 전달을 평가하기 위해 동정, 확인 및 시험하기 위한 시험관내 스크리닝 분석을 포함하는 다양한 목적들에 대해서도 귀중한 연구 도구이다.
종래에 배아 및 체세포 줄기 세포는 신경퇴화성 질환에 대한 치료제 및 모델 시스템으로 사용되었다. 배아 및 체세포 줄기 세포의 지정 분화에 관한 연구 및 기술 개발은 중추 신경계(CNS) 질환 분야, 예컨대 헌팅턴, 알츠하이머, 파킨슨, 및 다발성 경화증에서 일어났다. 그러나 이들 연구 결과들은 생체내에서 사용되는 이들 세포가 환자에서 뉴런 기능을 회복하도록 하는 능력이 거의 없는 것으로 나타났으며 종종 환자에서 원치 않는 종양 성장을 일으켰다.
따라서 특정 기능을 갖는 세포의 손실을 일으키는 질환을 처치하기 위한 치료제로서 그리고 연구에서 모두 사용될 수 있는 세포 모집단을 얻기 위한 조성물 및 방법이 필요하다.
본 발명은 줄기 세포 생물학 분야, 특히 비배아 인간 유도 다능성 줄기 세포(hiPSC), 체세포 줄기 세포, 질환 환자로부터의 줄기 세포, 또는 계통 특이적 분화가 가능한 임의의 다른 세포에 부가하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 비제한적으로 포함할 수 있는 다능성 또는 다중능성 줄기 세포의 계통 특이적 분화에 관한 것이다. 구체적으로는 hESC 및/또는 hiPSC를 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포로, 이어서 신규 배양 조건을 이용해서 중뇌 운명을 가진 큰 모집단(population)의 FOXA2+LMX1A+TH+ 도파민(DA) 뉴런으로 계통 특이적 분화를 지정하는 방법이 기재된다. 본 발명의 방법을 이용해서 제조되는 중뇌 운명을 가진 FOXA2+LMX1A+TH+ 도파민(DA) 뉴런은 시험관내 약물 발견 분석, 신경학 연구에서, 그리고 환자에서 도파민 뉴런의 부족 질환 또는 이러한 손상을 역전시키는 치료제로서의 용도를 비제한적으로 포함하는 다양한 용도들에 대해 추가로 고려된다. 또한, 질환 모델링, 특히 파킨슨 질환에서 사용하기 위한 인간 다능성 줄기 세포로부터 중뇌 운명을 가진 FOXA2+LMX1A+TH+ 도파민(DA) 뉴런을 분화시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 추가적으로 진정한 DA 뉴런에 CD142, 및 A9 유형 뉴런 세포와 같은 마커가 농축된다.
제1 신호전달 억제제, 제2 신호전달 억제제 및 제3 신호전달 억제제를 포함하는 키트에 있어서, 상기 제1 억제제는 전환 성장 인자 베타(transforming growth factor beta, TGFβ)/액티빈-노달 신호전달을 낮출 수 있고, 상기 제2 억제제는 SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic) 신호전달을 낮출 수 있고, 상기 제3 억제제는 Wnt(wingless) 신호전달의 활성화를 위한 글리코겐 합성효소 키나아제 3β(GSK3β)를 낮출 수 있다. 한 구현예에서, 상기 제1 억제제는 LDN-193189이다. 다른 구현예에서, 상기 제1 억제제는 LDN-193189, 이들의 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 제2 억제제는 SB431542이다. 다른 구현예에서, 상기 제2 억제제는 SB431542, 이들의 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 제3 억제제는 CHIR99021이다. 다른 구현예에서, 상기 제3 억제제는 CHIR99021, 이들의 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 키트는 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제(activator) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF) 8 수용체 패밀리 신호전달의 활성화제를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 상기 키트는 뇌유래 신경영양 인자(BDNF), 아스코르브산(AA), 신경아교 세포주 유래 신경영양 인자, 디부티릴 cAMP 및 전환 성장 인자 유형 β3을 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 상기 키트는 항-티로신 히드록실라아제(TH), 항-FOXA2(forkhead box protein A2), 및 항-LIM 호메오박스 전사 인자 1, 알파(LMX1A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 상기 키트는 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 및 조작된(engineered) 세포로 구성된 군에서 선택되는 세포를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 상기 키트는 선조체 세포 및 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런을 분화시키기 위한 지침을 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 상기 키트는 파킨슨 질환(PD)을 갖는 환자로부터 세포를 얻기 위한 지침을 추가로 포함한다.
제1 신호전달 억제제 및 제2 신호전달 억제제와 접촉하는 세포 모집단을 포함하는 조성물에 있어서, 상기 세포 모집단의 40% 이상은 FOXA2(forkhead box protein A2)에 대해 양성이며, 상기 세포 모집단은 제1 신호전달 억제제, 제3 신호전달 억제제, 및 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제로 사전 접촉되었으며, 상기 제1 억제제는 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달을 낮출 수 있고, 상기 제2 억제제는 Wnt(wingless) 신호전달의 활성화를 위한 글리코겐 합성효소 키나아제 3β(GSK3β)를 낮출 수 있고, 상기 제3 억제제는 SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic) 신호전달을 낮출 수 있다. 한 구현예에서, 상기 제1 억제제는 LDN-193189, 이들의 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다. 한 구현예에서, 상기 제2 억제제는 CHIR99021 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 제3 억제제는 SB431542, 이들의 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제는 SHH(Sonic hedgehog) C25II 및 SMO(smoothened) 수용체 소분자 작용제(agonist)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 작용제는 푸르모르파민(purmorphamine)이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 모집단은 또한 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8)과 추가로 사전 접촉되었다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단을 포함하는 상기 세포의 대부분은 FOXA2(forkhead box protein A2)+LIM+호메오박스 전사 인자 1+, 알파(LMX1A)+, NGN2 + 및 DDC + 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단은 설치류 세포, 영장류 세포 및 인간 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 세포는 파킨슨 질환(PD) 환자 세포로부터 유래된다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단은 FOXA2(forkhead box protein A2)에 대해 적어도 50% 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단은 FOXA2에 대해 적어도 60%양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단은 FOXA2에 대해 적어도 70% 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단은 FOXA2에 대해 적어도 80% 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단은 FOXA2에 대해 적어도 90% 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단은 FOXA2에 대해 적어도 95% 내지 100%까지 양성이다.
시험관내 세포 모집단을 포함하는 조성물에 있어서, 상기 세포 모집단을 포함하는 세포의 대부분은 티로신 히드록실라아제(TH)+FOXA2(forkhead box protein A2)+LIM 호메오박스 전사 인자 1+, 알파(LMX1A)+ 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런이다. 한 구현예에서, 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 40% 이상은 티로신 히드록실라아제 양성(TH+)이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 50%는 티로신 히드록실라아제 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 60%는 티로신 히드록실라아제 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 70%는 티로신 히드록실라아제 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 80%는 티로신 히드록실라아제 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 90%는 티로신 히드록실라아제 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 95% 내지 100%까지는 티로신 히드록실라아제 양성이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 모집단은 대부분 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런은 핵 수용체 NURR1(NR4A2), 뉴런-특이적 클래스 Ⅲ 베타-튜불린(Tuj1), TTF3, PITX3(paired-유사 호메오도메인 3), ASCL(achaete-scute 복합체), 초기 B-세포 인자 1(EBF-1), 초기 B-세포 인자 3(EBF-3) 및 트랜스타이레틴(TTR)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커에 대해 양성이다. 한 구현예에서, 상기 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런 모집단은 DA, 3,4-디히드록시-페닐아세트산(DOPAC) 및 호모 바니린산(HVA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자에 대해 양성이다. 한 구현예에서, 상기 마커는 단백질 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런 모집단은 파킨슨 질환(PD) 환자로 이루어진 군으로부터 선택되는 환자에서 생체내 생착(engraftment)이 가능하다. 한 구현예에서, 상기 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런은 생체내 생착 및 도파민(DA) 뉴런 기능의 제공이 가능하다.
일부 구현예에서, 본 발명은 LDN-193189 및 CHIR99021과 접촉하는 세포 모집단을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 세포 모집단의 40% 이상은 FOXA2(forkhead box protein A2)에 대해 양성이고, 상기 세포 모집단은 LDN-193189, SB431542, SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제 및 CHIR99021과 사전 접촉되었다. 한 구현예에서, 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제는 SHH(Sonic hedgehog) C25II 및 푸르모르파민으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 10% 이상은 FOXA2(forkhead box protein A2) 및 LIM 호메오박스 전사 인자 1, 알파(LMX1A)에 대해 이중 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 대부분은 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 모집단이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단은 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8)과 사전 접촉되었다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단은 설치류 세포, 영장류 세포 및 인간 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 인간 세포는 파킨슨 질환(PD)의 신경학적 증상을 갖는 환자의 세포이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단은 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래된다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 10% 이상은 FOXA2(forkhead box protein A2)/LIM 호메오박스 전사 인자 1, 알파(LMX1A)에 대해 이중 양성 및 FOXA2(forkhead box protein A2)/치열 호메오박스 2(OTX2)에 대해 이중 양성으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포 모집단으로 세포의 지정 분화를 유도하는 방법을 제공한다: a) ⅰ) 비배아 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 비배아 다능성 세포 및 조작된 다능성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 모집단; 및 ⅱ) 제1 신호전달 억제제, 제2 신호전달 억제제, SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제 및 제3 신호전달 억제제를 제공하고(여기서 상기 제1 억제제는 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달을 낮출 수 있고, 상기 제2 억제제는 SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic) 신호전달을 낮출 수 있고 상기 제3 억제제는 Wnt(wingless) 신호전달의 활성화를 위한 글리코겐 합성효소 키나아제 3β(GSK3β) 신호전달을 낮출 수 있음); b) 상기 세포 모집단과 상기 제1 및 상기 제2 억제제를 접촉시키고, c) 상기 세포 모집단과 상기 제1 및 상기 제2 억제제를 접촉시킨 후 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 모집단을 분화시키기 위한 조건 하에 상기 세포를 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제와 추가 접촉시키고; d) 상기 세포 모집단과 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제를 접촉시킨 후, 상기 세포 모집단을 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포 모집단으로 분화시키기 위해 상기 세포를 상기 제3 억제제와 추가 접촉시킴. 한 구현예에서, 상기 제1 및 상기 제2 억제제와의 상기 접촉은 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 분화된 모집단을 생성할 수 있는 조건 하이다. 한 구현예에서, 상기 제1 및 상기 제2 억제제와의 상기 접촉은 시험관내 세포 플레이팅의 1시간 이내이다. 한 구현예에서, 상기 제1 및 상기 제2 억제제와의 상기 접촉은 시험관내 세포 플레이팅의 48시간 이내이다. 한 구현예에서, 상기 제1 및 상기 제2 억제제와의 상기 접촉은 시험관내 세포 플레이팅의 62시간 이내이다. 한 구현예에서, 상기 세포와 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제의 상기 접촉은 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 분화된 모집단을 생성할 수 있는 조건 하이다. 한 구현예에서, 상기 세포와 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제의 상기 접촉은 상기 세포 모집단과 상기 제1 및 상기 제2 억제제를 접촉시킨 후 적어도 24시간 내지 최대 36시간이다. 한 구현예에서, 상기 세포와 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제의 상기 접촉은 최대 144시간이다. 한 구현예에서, 상기 세포와 상기 제3 억제제의 상기 접촉은 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 분화된 모집단을 생성할 수 있는 조건 하이다. 한 구현예에서, 상기 세포와 상기 제3 억제제의 상기 접촉은 상기 세포 모집단과 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제를 접촉시킨 후 적어도 24시간 내지 최대 36시간이다. 한 구현예에서, 상기 세포와 상기 제3 억제제의 상기 접촉은 최대 192시간이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단은 상기 세포와 상기 제1 및 상기 제2 억제제를 접촉시킨 후 적어도 11일에 상기 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포로 분화된다. 한 구현예에서, 상기 제1 억제제는 SB431542이다. 한 구현예에서, 상기 제2 억제제는 LDN-193189이다. 한 구현예에서, 상기 제3 억제제는 CHIR99021이다. 한 구현예에서, 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제는 SHH(Sonic hedgehog) C25II 및 푸르모르파민으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 방법은 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8)을 제공하고 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 분화된 모집단을 생성할 수 있는 조건 하에 상기 세포 모집단과 상기 FGF8을 접촉시키는 것을 추가로 제공한다. 한 구현예에서, 상기 세포와 상기 FGF8의 상기 접촉은 상기 세포 모집단과 상기 제1 및 상기 제2 억제제를 접촉시킨 후 적어도 24시간 내지 최대 36시간이다. 한 구현예에서, 상기 세포와 상기 FGF8의 상기 접촉은 최대 144시간이다. 한 구현예에서, 상기 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포 모집단은 40% 이상의 FOXA2(forkhead box protein A2)+ 세포를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포 모집단은 40% 이상의 FOXA2(forkhead box protein A2)+LIM 호메오박스 전사 인자 1, 알파(LMX1A)+ 세포를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 e) 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 모집단을 뉴런 성숙 배지와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 배지는 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포를 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런으로 분화시키기 위해 N2 배지, 뇌유래 신경영양 인자(BDNF), 아스코르브산(AA), 신경아교 세포주 유래 신경영양 인자, 디부티릴 cAMP(dbcAMP) 및 전환 성장 인자 유형 β3을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 e) 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 모집단을 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포를 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런으로 분화시키기 위해 B27 보강제를 함유하는 신경 분화 배지와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, B27 보강제를 함유하는 신경기본 배지와 접촉시킨 상기 세포는 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포를 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런으로 분화시키기 위해 뇌유래 신경영양 인자(BDNF), 아스코르브산(AA), 신경아교 세포주 유래 신경영양 인자, 디부티릴 cAMP(dbcAMP) 및 전환 성장 인자 유형 β3과 접촉된다. 한 구현예에서, 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런은 FOXA2(forkhead box protein A2)+LIM 호메오박스 전사 인자 1, 알파(LMX1A)+, 핵 수용체 관련 1 단백질(NURR1)+ 및 티로신 히드록실라아제(TH)+이다. 한 구현예에서, 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 40% 이상은 티로신 히드록실라아제(TH)+이다. 한 구현예에서, 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 상기 모집단은 상기 세포 모집단과 상기 제1 및 상기 제2 억제제를 접촉시킨 후 적어도 25일에 분화된다. 한 구현예에서, 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런은 분자를 확인하는 마커에 대해 양성이다. 한 구현예에서, 상기 마커는 티로신 히드록실라아제(TH), FOXA2(forkhead box protein A2), LIM 호메오박스 전사 인자 1, 도파민, 3,4-디히드록시-페닐 아세트산(DOPAC) 및 호모바니린산(HVA), 알파, 핵 수용체 NURR1(NR4A2), 뉴런-특이적 클래스 Ⅲ 베타-튜불린(Tuj1), TTF3, PITX3(paired-유사 호메오도메인 3), ASCL(achaete-scute 복합체), 초기 B-세포 인자 1(EBF-1), 초기 B-세포 인자 3(EBF-3), 트랜스타이레틴(TTR), 시냅신(synapsin), 도파민 전달체(DAT), 및 G-단백질 커플링된 내측 정류(inwardly rectifying) 칼륨 채널(Kir3.2/GIRK2)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 분자는 단백질 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 분자는 항체, PCR 프라이머, 핵산 서열 및 효소 분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커를 이용해서 확인된다. 한 구현예에서, 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런은 도파민(DA) 뉴런 기능을 제공하기 위해 파킨슨 질환(PD) 환자에서 생체내 생착될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 방법은 도파민 생산 뉴런을 필요로 하는 환자에게(상기 환자는 적어도 하나의 신경학적 증상을 보임), 도파민(DA) 뉴런 기능을 제공하기 위해 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런을 상기 환자 내로 이식하는(transplanting) 단계를 제공하는 것을 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 상기 신경학적 증상은 경련(tremor), 운동완만증(bradykinesia)(극히 느린 움직임), 굽은 자세, 자세 불안정, 및 경직(rigidity)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 환자는 상기 신경학적 증상의 감소를 나타낸다. 한 구현예에서, 상기 세포는 설치류 세포, 영장류 세포 및 인간 세포로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 인간 세포는 파킨슨 질환(PD)의 신경학적 증상을 갖는 환자의 세포이다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 치료적 처치를 위한 생체내 생착 방법을 제공한다: a) ⅰ) 모집단의 40% 이상이 티로신 히드록실라아제(TH)를 발현하는 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 모집단; 및 ⅱ) 대상체를 제공하고(여기서, 상기 대상체는 적어도 하나의 신경학적 증상을 나타냄); b) 도파민(DA) 뉴런 기능을 제공하기 위한 생체내 생착을 허용하는 조건 하에 상기 대상체 내로 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런을 이식함. 한 구현예에서, 상기 신경학적 증상은 경련, 운동완만증(극히 느린 움직임), 굽은 자세, 자세 불안정 및 경직으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 대상체는 상기 신경학적 증상의 감소를 나타낸다. 한 구현예에서, 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 상기 모집단은 발명의 방법에 따라 처리되는 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 모집단에서 유래된다. 한 구현예에서, 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 상기 모집단은 뉴런 성숙 배지를 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 모집단과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법에 따라 처리된 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 모집단에서 유래되며, 상기 배지는 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런으로의 분화를 위한 N2 배지, 뇌유래 신경영양 인자(BDNF), 아스코르브산(AA), 신경아교 세포주 유래 신경영양 인자, 디부티릴 cAMP 및 전환 성장 인자 유형 β3을 포함한다. 한 구현예에서, 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 모집단은 본 발명의 방법에 따라 처리된 세포 모집단에서 유래된다. 한 구현예에서, 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 모집단은 하기를 포함하는, 세포의 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 모집단으로의 지정 분화를 유도하는 방법에 따라 처리된 세포 모집단에서 유래된다: a) ⅰ) 비배아 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 비배아 다능성 세포 및 조작된 다능성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 모집단; 및 ⅱ) 제1 신호전달 억제제, 제2 신호전달 억제제, SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제 및 제3 신호전달 억제제를 제공하고(여기서, 상기 제1 억제제는 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달을 낮출 수 있고, 상기 제2 억제제는 SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic) 신호전달을 낮출 수 있고 상기 제3 억제제는 Wnt(wingless) 신호전달의 활성화를 위한 글리코겐 합성효소 키나아제 3β(GSK3β) 신호전달을 낮출 수 있음); b) 상기 세포 모집단을 상기 제1 및 상기 제2 억제제와 접촉시키고, c) 상기 세포 모집단과 상기 제1 및 상기 제2 억제제를 접촉시킨 후 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 모집단을 분화시키는 조건 하에 상기 세포를 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제와 추가 접촉시키고; d) 상기 세포 모집단과 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제를 접촉시킨 후 상기 세포 모집단을 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 모집단으로 분화시키기 위해 상기 세포를 상기 제3 억제제와 추가 접촉시킴. 한 구현예에서, 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 상기 모집단은 동물, 영장류 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 모집단에서 유래된다. 한 구현예에서, 상기 인간 세포는 파킨슨 질환(PD)의 증상을 갖는 환자의 세포이다.
한 구현예에서, 본 발명은 LDN-193189 및 CHIR99021과 접촉하는 세포 모집단을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 세포 모집단의 40% 이상은 FOXA2(forkhead box protein A2)에 대해 양성이고, 상기 세포 모집단은 LDN-193189, SB431542, SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제 및 CHIR99021로 사전 접촉되었으며, 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제는 SHH(Sonic hedgehog) C25II 및 푸르모르파민으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 50%는 FOXA2(forkhead box protein A2)에 대해 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 60%는 FOXA2에 대해 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 70%는 FOXA2에 대해 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 80%는 FOXA2에 대해 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 90%는 FOXA2에 대해 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 95% 내지 100%까지는 FOXA2에 대해 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 10% 이상은 FOXA2(forkhead box protein A2)/LIM 호메오박스 전사 인자 1, 알파(LMX1A)에 대해 이중 양성 및 FOXA2(forkhead box protein A2)/치열 호메오박스 2(OTX2)에 대해 이중 양성으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 적어도 95% 내지 최대 100%가 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 20%는 Nurr1+, CD142, DCSM1, CD63 및 CD99로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 적어도 95% 내지 100%까지가 양성이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 모집단의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 적어도 95% 내지 100%까지가 양성이다. 한 구현예에서, 상기 세포 모집단은 설치류 세포, 영장류 세포, 인간 세포 및 파킨슨 질환(PD)의 신경학적 증상을 갖는 환자의 인간 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 모집단으로의 세포의 지정 분화 유도 방법을 제공한다: a) ⅰ) 비배아 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 비배아 다능성 세포 및 조작된 다능성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 모집단; 및 ⅱ) 제1 신호전달 억제제, 제2 신호전달 억제제, SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제 및 제3 신호전달 억제제를 제공하고(여기서, 상기 제1 억제제는 SB431542이며, 상기 제2 억제제는 LDN-193189이고, 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제는 SHH(Sonic hedgehog) C25II 및 푸르모르파민으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 제3 억제제는 CHIR99021임); b) 상기 세포 모집단을 상기 제1 및 상기 제2 억제제와 접촉시키고(여기서, 상기 제1 및 상기 제2 억제제와의 상기 접촉은 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 분화된 모집단을 생성할 수 있는 조건 하에서 시험관내 세포 플레이팅의 48시간 이내임), c) 상기 세포 모집단과 상기 제1 및 상기 제2 억제제를 접촉시킨 후 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 모집단으로의 분화를 위한 조건 하에 상기 세포를 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제와 추가 접촉시키고; d) 상기 세포 모집단과 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제를 접촉시킨 후, 상기 세포 모집단을 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 모집단으로 분화시키기 위해 상기 세포를 상기 제3 억제제와 추가 접촉시킴. 한 구현예에서, 상기 세포와 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제의 상기 접촉은 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 분화된 모집단을 생성할 수 있는 조건 하에서 상기 세포와 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제의 상기 접촉이 상기 세포 모집단과 상기 제1 및 상기 제2 억제제를 접촉시킨 후 적어도 24시간 내지 최대 36시간인 것이다. 한 구현예에서, 상기 세포와 상기 제3 억제제의 접촉은 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 분화된 모집단을 생성할 수 있는 조건 하에 상기 세포와 상기 제3 억제제의 상기 접촉이 상기 세포 모집단과 상기 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제를 접촉시킨 후 적어도 24시간 내지 최대 36시간인 것이다. 한 구현예에서, 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포 모집단은 40% 이상의 FOXA2(forkhead box protein A2)+LIM 호메오박스 전사 인자 1+, 알파(LMX1A)+ 세포를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 e) 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 상기 모집단을 뉴런 성숙 배지와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 배지는 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런으로의 분화를 위해 N2 배지, 뇌유래 신경영양 인자(BDNF), 아스코르브산(AA), 신경아교 세포주 유래 신경영양 인자, 디부티릴 cAMP 및 전환 성장 인자 유형 β3을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런은 FOXA2(forkhead box protein A2)/LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파(LMX1A)/티로신 히드록실라아제(TH); FOXA2(forkhead box protein A2)/LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파/티로신 히드록실라아제/CD142; FOXA2(forkhead box protein A2)/LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파/티로신 히드록실라아제/핵 수용체 관련 1 단백질(NURR1); FOXA2(forkhead box protein A2)/LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파/티로신 히드록실라아제/CD142/핵 수용체 관련 1 단백질 및 티로신 히드록실라아제/α-시누클레인(synuclein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 세트들에 대해 양성이다. 한 구현예에서, 상기 방법은 f) 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런을 CD142 발현에 대해 적어도 80%가 CD142에 대해 양성인 세포 모집단으로 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런은 티로신 히드록실라아제(TH), FOXA2(forkhead box protein A2), LIM 호메오박스 전사 인자 1, 도파민, 3,4-디히드록시-페닐아세트산(DOPAC) 및 호모바니린산(HVA), 알파, 핵 수용체 NURR1(NR4A2), 뉴런-특이적 클래스 Ⅲ 베타-튜불린(Tuj1), TTF3, PITX3(paired-유사 호메오도메인 3), ASCL(achaete-scute 복합체), 초기 B-세포 인자 1(EBF-1), 초기 B-세포 인자 3(EBF-3), 트랜스타이레틴(TTR), 시냅신, 도파민 전달체(DAT), 및 G-단백질 커플링된 내측 정류 칼륨 채널(Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 및 CD99로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자를 확인하는 마커에 대해 양성이다. 한 구현예에서, 방법은 도파민 생산 뉴런을 필요로 하는 환자에게 이후에 e) 상기 환자에게 도파민(DA) 뉴런 기능을 제공하기 위한 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런을 이식하여 치료하는 단계를 제공하는 것을 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 상기 환자는 경련, 운동완만증(극히 느린 움직임), 굽은 자세, 자세 불안정, 및 경직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 신경학적 증상을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 환자는 경련, 운동완만증(극히 느린 움직임), 굽은 자세, 자세 불안정, 및 경직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 신경학적 증상을 갖는 것으로 관찰된다. 한 구현예에서, 상기 환자는 적어도 하나의 상기 신경학적 증상의 감소를 나타낸다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 치료적 처치를 위한 생체내 생착 방법을 제공한다: a) ⅰ) 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 모집단(여기서 상기 모집단의 40% 이상은 티로신 히드록실라아제(TH)를 발현함); 및 ⅱ) 대상체를 제공하고(여기서 상기 대상체는 적어도 하나의 신경학적 증상을 나타내며, 상기 신경학적 증상은 경련, 운동완만증(극히 느린 움직임), 굽은 자세, 자세 불안정 및 경직으로 이루어진 군으로부터 선택); b) 도파민(DA) 뉴런 기능을 제공하기 위한 생체내 생착을 허용하는 조건 하에 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런을 상기 대상체 내로 이식함. 한 구현예에서, 상기 대상체는 적어도 하나의 상기 신경학적 증상의 감소를 나타낸다. 한 구현예에서, 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 상기 모집단은 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런을 CD142 발현에 대해 적어도 80%가 CD142에 대해 양성인 세포 모집단으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 세포의 모집단에서 유래된다. 한 구현예에서, 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 상기 모집단은 상기 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런을 CD142 발현에 대해 적어도 80%가 CD142에 대해 양성인 세포 모집단으로 분류하는 단계 이후 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 모집단에서 유래된다. 한 구현예에서, 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 상기 모집단은 동물, 영장류, 인간 및 파킨슨 질환(PD)의 증상을 갖는 환자로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 모집단에서 유래된다. 한 구현예에서, 바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 상기 모집단은 동물, 영장류, 인간 및 파킨슨 질환(PD)의 증상을 갖는 환자로 구성된 군에서 단리된 세포 모집단에서 유래된다.
정의
본 발명에서 사용되는 "질환 모델링"이라는 용어는 장애의 결과 인간에서 관찰되는 특정 징후 또는 증상을 모방하는 실험 유기체 또는 시험관내 세포 배양물을 이용하는 공정을 나타낸다. 한 구현예에서, 신경학적 장애, 예컨대 파킨슨 질환(PD)을 일으키는 유전적 돌연변이를 갖는 동물 모델에서 유래된 다능성 줄기 세포가 PD에 관련된 뉴런의 새로운 특징을 확인하기 위해 신경 세포로 성장 및 분화될 수 있다. 한 구현예에서, 신경학적 장애, 예컨대 파킨슨 질환(PD)을 일으키는 유전적 돌연변이를 갖는 개인에서 유래된 인간 다능성 줄기 세포가 해당 개인에서 관찰되는 유사 결함을 보유하는 신경 세포로 성장 및 분화될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "파킨슨증"이라는 용어는 모두 운동을 조절하는 뇌 부분인 기저핵(basal ganglia) 내의 도파민 결핍에 연관되는 질환군을 나타낸다. 증상에는 경련, 운동완만증(극히 느린 움직임), 굽은 자세, 자세 불안정, 및 경직이 포함된다. 파킨슨증의 진단에는 이들 증상 중 적어도 두 개의 존재가 필요하며, 그 중 하나가 경련 또는 운동완만증이어야 한다. 파킨슨증의 가장 일반적인 형태는 특발성 또는 전통적인 파킨슨 질환(PD)이지만, 전체의 약 15%인 상당한 소수 진단으로 파킨슨 플러스 증후군(PPS) 중 하나가 있을 수 있다. 비정형 파킨슨증으로도 알려진 이들 증후군에는 피질기저 퇴화, 레비 소체 치매, 다계통 위축, 및 진행성 핵상 마비가 포함된다. 일반적으로 파킨슨 질환에는 흑색질(substantia nigra)로 불리는 뇌 영역에서 주로 뇌의 중추 신경 세포의 기능이상 및 사멸이 관여된다. 이들 중추 신경 세포의 다수는 도파민을 생성하며, 이들 뉴런이 사멸됨에 따라 뇌에서 분화로 생성되는 도파민의 양이 감소되어 개인이 운동을 정상적으로 조절할 수 없게 된다. 장도 또한 파킨슨 질환 환자에서 퇴화되는 도파민 세포를 가지며, 이는 질환의 일부인 위장관 증상에서의 중요한 유발 인자일 수 있다. 개인이 경험하는 증상군은 사람별로 다르다. 파킨슨 질환의 주요 운동 징후에는 하기가 포함된다: 손, 팔, 다리, 턱 및 얼굴의 경련, 운동완만증 또는 운동의 완화, 사지 및 몸통의 경직 또는 경축 및 자세 불안정 또는 손상된 균형 및 조율.
본 발명에서 사용되는 "대상체"라는 용어는 임의 유형의 조절을 포함하는 특정 치료의 수신자가 될 포유류(인간 및 동물, 즉 비인간 동물)를 나타낸다. 전형적으로 "대상체" 및 "환자"라는 용어는 인간 대상체를 나타내며 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 "비인간 동물"이라는 용어는 척추동물, 예컨대 설치류, 비인간 영장류, 양, 소, 반추동물, 토끼, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새 등을 비제한적으로 포함하는 모든 비인간 동물을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "도파민"이라는 용어는 운동 및 조율을 조절하는 뉴런을 포함하는 뇌 부분에 메시지를 보내는 도파민 뉴런에 의해 생성되는 화학물질을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "LSB"라는 용어는 세포에서 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달 및 SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic) 신호전달로 구성된 신호전달을 낮추거나 차단할 수 있는 두 화합물 LDN-193189 및 SB431542의 조합을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "SB431542"라는 용어는 CAS 번호 301836-41-9, 분자식 C22H18N4O3, 및 명칭 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드, 예를 들어 하기 구조를 갖는 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달을 낮추거나 차단할 수 있는 분자를 나타낸다:
Figure 112020050340817-pat00001
한 예에서, SB431542는 Stemolecule™ SB431542(Stemgent, Inc. Cambridge, Massachusetts, United States)이다.
본 발명에서 사용되는 "LDN-193189"라는 용어는 IUPAC 명칭 4-(6-(4-(피페라진-1-일)페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴놀린, 화학식 C25H22N6을 갖는 소분자 DM-3189를 나타낸다. LDN-193189는 SMAD 신호전달 억제제로서 기능할 수 있다. LDN-193189는 또한 ALK2, ALK3, 및 ALK6, 단백질 티로신 키나아제(PTK)의 매우 강력한 소분자 억제제로서, I형 TGF 수용체의 ALK1 및 ALK3 패밀리 구성원의 신호전달을 억제하여 뼈 형태형성 단백질(BMP) BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, 및 액티빈 시토카인 신호, 그리고 이에 따라 Smad1, Smad5, 및 Smad8의 SMAD 인산화를 포함하는 여러 생물학적 신호들의 전파를 억제한다(Yu et al., (2008) Nat Med 14:1363-1369; Cuny et al., (2008) Bioorg. Med. Chem. Lett. 18: 4388-4392, 인용에 의해 본 명세서에 포함됨).
Figure 112020050340817-pat00002
한 구현예에서, LDN-193189는 Stemolecule™ LDN-193189(Stemgent, Inc. Cambridge, Massachusetts, United States)이다.
본 발명에서 사용되는 "글리코겐 합성효소 키나아제 3β 억제제" 또는 "GSK3β 억제제"라는 용어는 글리코겐 합성효소 키나아제 3β 효소를 억제하는 화합물을 나타낸다. 예를 들어 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 [Doble et al., J Cell Sci. 2003;116:1175-1186]를 참조. 본 발명의 목적을 위해, GSK3β 억제제는 WNT 신호전달 경로를 활성화할 수 있다. 예를 들어 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 [Cadigan et al., J Cell Sci. 2006; 119:395-402; Kikuchi et al., Cell Signaling. 2007;19:659-671]을 참조.
본 발명에서 사용되는 "CHIR99021" 또는 "CHIR" 또는 "아미노피리미딘" 또는 "3-[3-(2-카르복시에틸)-4-메틸피롤-2-메틸리데닐]-2-인돌리논"이라는 용어는 IUPAC 명칭 6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코니노니트릴을 나타낸다. CHIR99021은 WNT 신호전달 경로를 활성화하는 글리코겐 합성효소 키나아제 3β(GSK3β)의 소분자 화학 억제제의 한 예이며 매우 선택적이어서 인간 GSK3β에 대해 IC50 = 6.7 nM 및 설치류 GSK3β 상동체에 대해 나노몰 수준의 IC50값을 가지며 관련 및 미관련 키나아제 패널에 대해 거의 천배의 선택성을 나타낸다.
Figure 112020050340817-pat00003
한 예에서, CHIR99021은 Stemolecule™ CHIR99021(Stemgent, Inc. Cambridge, Massachusetts, United States)이다.
본 발명에서 사용되는 "푸르모르파민"이라는 용어는 퓨린 유도체, 예컨대 CAS 번호 483367-10-8을 나타내며, 한 예로서 Smoothened를 표적화하는 것을 포함하는 헷지호그(Hedgehog) 경로를 활성화하는 하기 구조를 참조.
Figure 112020050340817-pat00004
한 예시적 구현예에서, 푸르모르파민은 Stemolecule™ 푸르모르파민(Stemgent, Inc. Cambridge, Massachusetts, United States)이다.
본 발명에서 사용되는 "신호 전달 단백질"에서의 "신호전달"이라는 용어는 막 수용체 단백질에 대한 리간드 결합 또는 일부 다른 자극에 의해 영향을 받아 활성화되거나 달리 영향받는 단백질을 나타낸다. 신호 전달 단백질의 예에는 SMAD, WNT 복합체 단백질이 포함되며, 또 다른 구현예에서 베타-카테닌을 포함하는 WNT 복합체 단백질, SHH(Sonic hedgehog), NOTCH, 전환 성장 인자 베타(TGFβ), 액티빈, 노달, 글리코겐 합성효소 키나아제 3β(GSK3β) 단백질 등이 포함된다. 여러 세포 표면 수용체 또는 내부 수용체 단백질에 있어서, 리간드-수용체 상호작용은 세포 반응에 직접 연관되지 않는다. 리간드 활성화된 수용체는 세포의 거동에 있어서 리간드의 궁극적인 생리학적 효과가 생성되기 전에 먼저 세포 내부의 다른 단백질과 상호작용해야 한다. 종종 수용체 활성화 또는 억제에 이어 여러 상호작용 세포 단백질 사슬의 거동이 변경된다. 수용체 활성화에 유도되는 전체 세포 변화 세트가 신호 전달 기전 또는 신호전달 경로로 불린다.
본 발명에서 사용되는 "LSB/S/F8/CHIR" 또는 "LSB/SHH/FGF8/CHIR"이라는 용어는 본 발명의 S, 음파 헷지호그(Sonic Hedgehog) 활성화제, F8, FGF8, 및 CHIR에 부가하여 LDN-193189 및 SB431542(즉 LSB)와 세포의 접촉을 나타낸다. 대조적으로 "LSB/S/F8" 또는 "SHH/FGF8" 또는 "SHH/FGF"는 종래에 공개된 방법에서와 같이 CHIR 없이, S, 음파 헷지호그 활성화제, F8, FGF8에 부가하여 LDN-193189 및 SB431542(즉 LSB)와 세포의 접촉을 나타낸다. 유사한 약어에서, "LDN/SB"는 LDN, LDN-193189 및 SB, SB431542와 세포의 접촉을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "억제하다" 또는 "차단하다"라는 용어는 해당 화합물로 처리되지 않고 남겨진 또는 대조군으로 처리된 세포의 신호전달 경로의 활성에 비해 화합물(즉 억제제)의 처리 시 세포의 특정 신호전달 경로의 활성 수준 감소를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 "활성화하다"라는 용어는 해당 화합물로 처리되지 않고 남겨진 또는 대조군으로 처리된 세포의 신호전달 경로의 활성에 비해 화합물(즉 활성화제)의 처리 시 세포의 특정 신호전달 경로의 활성 수준 증가를 의미한다. 특정 신호전달 경로의 임의 수준의 억제 또는 활성화는 이러한 억제 또는 활성화가 줄기 세포의 지정 분화를 일으키는 경우 본 발명의 구현예로 간주된다.
본 발명에서 사용되는 "Sma Mothers Against Decapentaplegic" 또는 "Small Mothers Against Decapentaplegic" 또는 "SMAD"라는 용어는 신호전달 분자를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 리간드에 대한 "WNT" 또는 "wingless"라는 용어는 WNT 수용체, 예컨대 Frizzled 및 LRPDerailed/RYK 수용체 패밀리의 수용체와 상호작용할 수 있는 일군의 분비 단백질(즉 인간에서 Int1(integration 1))을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 신호전달 경로에 대한 "WNT" 또는 "wingless"라는 용어는 β-카테닌과 함께 또는 없이 매개되는 Wnt 패밀리 리간드 및 Wnt 패밀리 수용체, 예컨대 Frizzled 및 LRPDerailed/RYK 수용체로 이루어진 신호 경로를 나타낸다. 본 명세서에 기재된 목적에 있어서 바람직한 WNT 신호전달 경로에는 β-카테닌, 즉 WNT/β-카테닌에 의한 매개가 포함된다.
본 발명에서 사용되는 WNT에 대한 "정준 경로" 또는 "전통적 활성화"는 여러 Wnt 하류 신호 경로 중 하나, 예를 들어 정준 경로에서 Wnt 리간드의 그 수용체로의 결합의 주요 효과가 베타-카테닌 분해 복합체의 억제를 통한 세포질 베타-카테닌의 안정화인 것이다. 다른 Wnt 경로는 비정준인 것이다.
한 예로서, 소분자 CHIR는 정준 Wnt 신호전달 하류 경로에 영향을 미친다.
본 발명에서 사용되는 "음파 헷지호그(SHH 또는 Shh)"라는 용어는 헷지호그로 불리는 포유류 신호전달 경로 패밀리의 3개 이상의 단백질 중 하나인 단백질을 나타내며, 다른 것은 DHH(desert hedgehog)이고 또 다른 것은 IHH(Indian hedgehog)이다. Shh는 막통과 분자(PTC Patched) 및 SMO(Smoothened)와의 상호작용에 의해 2개 이상의 막통과 단백질과 상호작용한다. Shh는 전형적으로 PCT와 결합한 뒤 신호 변환기로서 SMO의 활성화를 허용한다. SHH의 부재 하에서, PTC는 전형적으로 SMO를 억제하며, 이는 다시 전사 억제물질을 활성화하여 특정 유전자의 전사가 일어나지 않는다. Shh가 존재하고 PTC에 결합하는 경우, PTC는 SMO의 기능을 방해할 수 없다. SMO가 억제되지 않으면, 특정 단백질들이 핵으로 들어가서 특정 유전자가 활성화될 수 있도록 하는 전사 인자로 작용할 수 있다(Gilbert, 2000 Developmental Biology(Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates, Inc., Publishers) 참조).
본 발명에서 사용되는 "활성화제" 또는 "활성화"라는 용어는 본 발명의 세포의 지정 분화를 일으키는 분자를 활성화하기 위한 소분자, 펩티드, 단백질 및 화합물을 나타낸다. 예시적인 활성화제에는 하기가 비제한적으로 포함된다: CHIR, SHH(Sonic hedgehog) C25II, 소분자 Smoothened 작용제 푸르모르파민, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 등.
본 발명에서 사용되는 "SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제"라는 용어는 PCT 또는 Smoothened 작용제 등에 결합하는 분자 또는 화합물을 포함하여 SHH 신호전달 경로를 활성화하는 임의의 분자 또는 화합물을 나타낸다. 이러한 화합물의 예로는 단백질 SHH(Sonic hedgehog) C25II 및 소분자 Smoothened 작용제 푸르모르파민이 있다.
본 발명에서 사용되는 "SHH(Sonic hedgehog) C25II"라는 용어는 SHH의 활성화를 위해 SHH 수용체에 결합할 수 있는 전장 쥐과 SHH(Sonic hedgehog) 단백질의 재조합 N-말단 단편을 나타내며, 한 예로는 R & D systems 카탈로그 번호: 464-SH-025/CF가 있다.
본 발명에서 사용되는 "신호"라는 용어는 세포 구조 및 기능의 변화를 조절하는 내부 및 외부 인자를 나타낸다. 이들은 성질 상 화학적이거나 물리적인 것이다.
본 발명에서 사용되는 "리간드"라는 용어는 수용체(R)에 결합하는 분자 및 단백질을 나타내며, 예에는 전환 성장 인자-베타, 액티빈, 노달, 뼈 형태형성 단백질(BMPs) 등이 비제한적으로 포함된다.
본 명세서에서 신호전달 분자 또는 신호전달 분자의 경로의 억제에 대해 나타내는 "억제제" 또는 "신호전달 억제제"라는 용어, 예컨대 SMAD 신호전달의 억제제, 글리코겐 합성효소 키나아제 3β(GSK3β)의 억제제는 분자 또는 경로의 신호전달 기능을 방해하는(즉 감소시키거나 억제하거나 제거하거나 차단하는) 화합물 또는 분자(예로, 소분자, 펩티드, 펩티드 모사체, 천연 화합물, 단백질, siRNA, 안티센스 핵산, 앱타머, 또는 항체)를 나타낸다. 다시 말하면, 억제제는 명명된 단백질(신호전달 분자, 명명된 신호전달 분자에 관련된 임의 분자, 명명된 연합 분자, 예컨대 글리코겐 합성효소 키나아제 3β(GSK3β)(예로, 본 명세서에 기재된 신호전달 분자를 비제한적으로 포함함))의 임의 활성을, 한 예를 들어 직접적으로 SMAD 신호전달과 접촉시켜, SMAD mRNA와 접촉시켜, SMAD의 형태 변화를 야기하여, SMAD 단백질 수준을 감소시켜, 또는 신호전달 파트너(예로, 본 명세서에 기재된 것들 포함)와 SMAD 상호작용을 방해하여 그리고 SMAD 표적 유전자(예로, 본 명세서에 기재된 것들)의 발현에 영향을 미쳐서 변화시키는 임의 화합물 또는 분자이다. 억제제에는 또한 상류 신호전달 분자를 방해하여 SMAD의 생물학적 활성을 간접적으로 조절하는 분자가 포함된다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명의 억제제는 기본에서 비기본 세포 유형으로의 분화를 유도(변화) 또는 변경하며, 예를 들어 본 발명의 방법 중 하나는 비기본 신경 선조체 세포로 LDN/SB, CHIR 및 SHH 활성화제(글리코겐 합성효소 키나아제 3β를 억제할 수 있음) 분화된 선조체 세포를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 억제제는 비기본 세포 유형으로의 세포 분화를 지시하기 위해, 예컨대 본 발명의 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포 및 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런의 분화를 위해 본 명세서에 기재된 것과 같이 기본 신호전달을 "변경하거나" "낮추거나" 또는 "차단한다". 따라서 본 발명의 억제제는 출발 세포 모집단(0일)의 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포로의 분화에 기여하는 방식으로 신호 분자 활성을 변화시키는 천연 화합물 또는 소분자이다. 선조체 세포가 억제제와 접촉되는 경우, 이들 소분자는 본 발명의 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런으로의 추가 분화에 기여할 수 있다. 억제제는 명명된 신호전달 분자 상류의 분자에 결합하고 영향을 미쳐서 다시 명명된 분자의 억제를 야기하여 유도된 억제에 부가하여, 경쟁적 억제(또 다른 알려진 결합 화합물의 결합을 배제하거나 감소시키는 방식으로 활성 부위에 결합) 및 알로스테릭 억제(단백질의 활성 부위에 대한 화합물의 결합을 방해하는 방식으로 단백질 구조에 변화를 일으키는 방식으로 단백질에 결합)의 측면에서 설명된다. 일부 경우에서, 억제제는 신호전달 표적에 실제로 접촉하여 신호전달 표적 또는 신호전달 표적 경로를 억제하는 것을 나타내는 "직접적 억제제"로 불린다; 예를 들어 감마 시크리타아제의 직접적 억제제는 감마 시크리타아제 단백질에 결합하는 DAPT 분자이다.
본 발명에서 사용되는 "유도체"라는 용어는 유사한 코어 구조를 갖는 화학적 화합물을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 중뇌 뉴런의 배아 발생 동안을 포함하여 중뇌에 위치하는 생체내 세포에 대한 "바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포"라는 용어는 도파민 생산 세포로 분화할 수 있는 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, "바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포"는 생체내 세포에 의해 발현되는 마커에 비교할 때 겹치거나 동일한 마커 세트, 즉 예컨대 본 명세서에 기재된 것과 같은 지정 분화 개시 후 11일 근처에 본 발명의 배양 세포 중에서 바닥 플레이트 마커 FOXA2 및 루프 플레이트(roof plate) 마커 LMX1A, OTX2, NGN2, 및 DDC의 동시-발현을 발현하는 시험관내 배양 세포를 인공 생산하는데 사용되는 배양 중 세포를 나타낸다. 바람직하게는 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포는 "FOXA2+LMX1A+" 또는 " FOXA2/LMX1A+"이다. 일부 구현예에서, 분화된 선조체 모집단 중 소수의 세포는 FOXA2/LMX1A/TH+이다.
본 발명에서 사용되는 "바닥 플레이트 유래 DA 뉴런" 또는 "진정한 중뇌 DA 뉴런" 또는 "중뇌 운명을 가진 FOXA2+LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런" 또는 "바닥 플레이트 중뇌 도파민(DA) 뉴런" 또는 "생착가능한 중뇌 DA 뉴런" 또는 "mDA 뉴런" 또는 "FOXA2+LM1A+TH+" 또는 "FOXA2/LMX1A/TH" 또는 "FOXA2+LMX1A+ NURR1+TH+" 또는 "FOXA2/LMX1A/NURR1/TH"라는 용어는 전형적으로 지정 분화 개시 후 25일 또는 근처에 본 명세서에 기재된 방법으로 얻어지는 생착가능한 중뇌 DA 뉴런 모집단을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, "진정한 중뇌 DA 뉴런"은 FOXA2+/LMX1A+/NURR1+/TH+이다. 이들 뉴런은 마우스 및 영장류에서의 이식 실험 후 신경 증식 및 테라토마(teratoma) 형성으로 인한 간섭이 적고 파킨슨 유사 신경 상태를 역전시키는 이들 뉴런의 능력을 나타내어 "생착가능한" 것으로 표지되었다. 본 발명의 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런은 생착 능력을 보유하면서 시험관내에서 수 개월 유지되었다.
본 발명에서 사용되는 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포 및 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런을 얻기 위해 사용되는 세포는 배아 및 비배아 원천, 예를 들어 hESC 및 비배아 hiPSC, 체세포 줄기 세포, 질환 줄기 세포, 즉 파킨슨 질환 환자에서 단리된 다능성 세포 및 단리된 조작 유래 줄기 세포, 암 줄기 세포, 인간 또는 포유류 다능성 세포 등을 포함하는 다양한 원천들에서 얻어진다.
본 발명에서 사용되는 "줄기 세포"라는 용어는 배양 중 무기한의 기간 동안 분열하여 특화된 세포를 만들 수 있는 세포를 나타낸다. 줄기 세포는 인간을 포함하는 환자 및 동물에서 얻어질 수 있다; 예를 들어, 인간 줄기 세포는 인간인 줄기 세포를 나타낸다. 줄기 세포는 배아 및 비배아를 포함하는 다양한 원천, 예컨대 탯줄 세포, 어린이 세포 및 성체 세포에서 얻어질 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 일반적으로 성체 줄기 세포는 처음에 태아에서 얻어지지 않은 세포, 즉 아기의 세포, 탯줄에서 얻은 세포, 태반에서 얻은 세포, 어린이 세포, 성체 세포 등을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "탯줄 혈액 줄기 세포"라는 용어는 체내에서 적어도 모든 혈액 세포를 만들 능력이 있는(조혈) 출생 시 탯줄에서 수집한 줄기 세포를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "체세포(성체) 줄기 세포"라는 용어는 자가 재생(실험실 내) 및 분화 모두에 대해 제한된 능력을 갖는 여러 기관 및 분화된 조직에서 발견되는 상대적으로 드문 미분화 세포를 나타낸다. 이러한 세포는 이들의 분화능이 다르지만, 보통 기원 기관의 세포 유형으로 제한된다.
본 발명에서 사용되는 "체세포"라는 용어는 생식체(난자 또는 정자) 이외의 체내 임의 세포를 나타낸다; 때때로 "성체" 세포로 불린다.
본 발명에서 사용되는 "신경 계통 세포"라는 용어는 발생 동안 또는 성인에서 신경계(중추 및 말초 모두) 또는 신경 능선 운명에 기여하는 세포를 나타낸다. 신경계에는 뇌, 척추 및 말초 신경계가 포함된다. 신경 능선 운명을 갖는 세포에는 중외배엽을 만드는 안면, 몸통, 미주신경, 천골 및 심장, 안면 연골, 안면골, 흉선, 치아, 멜라틴 세포, 홍채 색소 세포, 안면 신경절, 후근절, 교감/부교감 신경절, 내분비 세포, 장관 신경계 및 심장의 일부가 포함된다.
본 발명에서 사용되는 "성체 줄기 세포"라는 용어는 체세포 줄기 세포를 나타내며, 한 예를 들어 "조혈 줄기 세포"는 모든 적혈구 및 백혈구 그리고 혈소판을 만드는 아기, 어린이 및 성인에서의 줄기 세포를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "배아 줄기 세포"라는 용어는 배양 중 연장된 기간 동안 분화 없이 분열할 수 있고, 3개의 주요 배엽층인 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 세포 및 조직으로 발생하는 능력을 갖는 것으로 알려진, 착상 전 단계의 배아, 인공 생성 배아, 즉 시험관내 수정 등에 의한 것을 비제한적으로 포함하는 여러 원천들 중 하나에서 유래된 원시(미분화) 세포를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "내배엽"이라는 용어는 포배의 내세포괴에서 유래된 세포층을 나타낸다; 이는 폐, 다른 호흡 구조 및 소화 기관, 또는 일반적으로 "생체내"에서 "장" 및 시험관내에서 다양한 세포 유형을 만들 능력을 갖는다.
본 발명에서 사용되는 "배아 줄기 세포주"라는 용어는 수 일, 수 개월 내지 수년 동안 분화 없이 증식을 허용하는 시험관내 조건 하에 배양된 배아 줄기 세포의 모집단, 예를 들어 인간 WA-09 세포주의 세포를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "인간 배아 줄기 세포" 또는 "hESC"라는 용어는 배양 중 연장된 기간 동안 분화 없이 분열할 수 있고 세 개의 주요 배엽층인 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 세포 및 조직으로 발생하는 것으로 알려진 포배 단계를 포함하여 여기까지의 초기 단계 인간 배아에서 유래된 다능성 줄기 세포 유형을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "유도된 다능성 줄기 세포" 또는 "iPSC"라는 용어는 배아 줄기 세포와 유사한 다능성 줄기 세포 유형을 나타내며, 체세포(성체) 세포는 배아 줄기 세포(ESC)의 "줄기성"을 유지하는데 중요한 인자를 발현하도록 유도되어 배아 줄기 세포 유사 상태로 들어가도록 재프로그래밍된다. 마우스 iPSC는 2006년에 보고되었으며(Takahashi 및 Yamanaka), 인간 iPSC는 2007년 후반에 보고되었다(Takahashi et al., 및 Yu et al.). 마우스 iPSC는 발생의 매우 초기 단계에 마우스 배아 내로 주입되는 경우 줄기 세포 마커의 발현, 모든 세 배엽층으로부터의 세포를 함유하는 종양 형성 및 여러 상이한 조직에 기여하는 능력을 포함하는 다능성 줄기 세포의 중요한 특징을 나타낸다. 인간 iPSC도 줄기 세포 마커를 발현하며 모든 세 배엽층의 특징 세포들을 생성할 수 있다. 배아 줄기 세포와 다르게, iPSC는 체세포, 예를 들어 유도된 세포 C14, C72 등의 세포주 내로 특정 배아 유전자(예컨대 OCT4, SOX2, 및 LF4 삽입유전자)의 도입에 의해 인공적으로 형성된다(예를 들어 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 Takahashi and Yamanaka Cell 126, 663-676 (2006) 참조). iPSC의 또 다른 예로는 플라스미드 내로 클로닝된 유전자(OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, 및 KLF4)를 이용해서 형질변환된 성인 인간 피부 세포, 또는 섬유아세포 세포가 있으며, 예를 들어 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 [Yu et al., Science DOI: 10.1126/science. 1172482]를 참조.
본 발명에서 사용되는 "만능(totipotnet)"이라는 용어는 신체의 모든 세포 유형에 더하여 배아 외 조직, 예컨대 태반을 구성하는 모든 세포 유형을 만드는 능력을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "다중능성(multipotent)"이라는 용어는 신체의 둘 이상의 세포 유형으로 발생하는 능력을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "다능성"이라는 용어는 신체의 적어도 두 개의, 그러나 종종 여러 상이한 세포 유형을 만드는 능력을 갖는 세포를 나타낸다. 다능성 세포는 종종 면역억제 마우스 내로의 주입 후 테라토마를 생성한다.
본 발명에서 사용되는 "다능성 줄기 세포"라는 용어는 환경 요인, 즉 형태원, 성장 인자, 활성화제 또는 억제제인 신호전달 분자 등에 따라 적어도 두 개의 상이한 세포 유형으로 발생하는 상기 세포의 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 다능성 줄기 세포는 내배엽, 중배엽 및 외배엽을 포함하는 유기체의 세 발생 배엽층 중 임의 하나로 발생하는 세포의 능력을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "특화된 세포"라는 용어는 다세포 유기체에서 특정 기능을 수행하는 세포 유형을 나타낸다. 예를 들어 특화된 세포군, 예컨대 뉴런은 함께 작용하여 계, 예컨대 신경계를 형성한다.
본 발명에서 사용되는 "신경외배엽"이라는 용어는 신경 계통 세포를 만들 수 있는 다능성 줄기 세포 분화 동안 또는 발생 초기에 발견되는 세포 또는 세포 운명을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "세포 증식의 마커"라는 용어는 성숙한 느리게 순환하거나 순환하지 않는 세포에서는 통상 존재하지 않는 빠르게 순환하는 세포, 즉 연장된 순환 시간을 갖거나 순환하지 않는 세포 대비 활발하게 분열하는 세포에 연관된 분자의 발현을 나타낸다. 이러한 마커의 예에는 세포 증식의 Ki67 마커(Gerdes et al., Int J Cancer 31:13-20 (1983), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 및 유사분열의 G2/M-상의 포스포-히스톤 H3 마커(Hendzel et al., Chromosoma 106:348-360 (1997), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)가 포함된다.
본 발명에서 사용되는 "증식"이라는 용어는 세포수의 증가를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "분화"라는 용어는 비특화된 배아 세포가 특화된 세포, 예컨대 특정 유형의 뉴런, 뇌 세포, 심장, 간 또는 근육 세포의 특징들을 획득하는 공정을 나타낸다. 분화는 보통 세포 표면에 포함된 단백질이 관여되는 신호전달 경로를 통해 세포 외부의 물리적 및 화학적 조건과 세포 유전자의 상호작용으로 조절된다.
본 명세서에서 분화 세포계에서의 세포에 대해 사용되는 "분화"라는 용어는 세포가 하나의 세포 유형(예로 다중능성, 만능 또는 다능성 분화가능 세포)에서 또 다른 세포 유형, 예컨대 표적 분화 세포로 분화하는 공정을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "세포 분화"라는 용어는 덜 특화된 세포(즉 줄기 세포)가 보다 특징적인 형태와 기능을 보유하도록 발생하거나 성숙하는(예를 들어, iPSC의 신경 능선 선조체로, 뉴런 계통 세포로, 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포로, 본 발명의 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런으로의 처리) 경로를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "미분화"라는 용어는 아직 특화된 세포 유형으로 발생되지 않은 세포를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 세포 분화 경로에 대한 "기본" 또는 "수동"이라는 용어는 덜 특화된 세포가 특정 화합물로 처리되지 않은 경우, 즉 적어도 하나의 형태원과 접촉 없이 일반 세포 배양 조건에서 배양 중 특정한 분화 세포 유형이 되는 경로를 나타낸다. 다시 말하면, 세포가 분화된 세포 유형을 변화시킬 수 있는 분자(즉 형태원)와 접촉되지 않은 경우 기본 세포가 얻어지지만, 예를 들어 LSB 단독으로 처리되지만 본 발명의 FOXA2(forkhead box protein A2)+ 세포를 제조하기 위한 SHH 활성화제 또는 Wnt 활성화제로는 처리되지 않은 배양에서는 대신에 마커 HES5, PAX6, LHX2, 및 EMX2가 발현된다. 대조적으로, 세포에 대한 "비기본"은 기본 세포와 다른 세포 유형으로 이어지는 분화된 세포 유형을 나타낸다, 즉 비기본 세포는 비기본 조건에서 야기되는 분화된 세포 유형, 예컨대 FOXA2(forkhead box protein A2)+ 뉴런 세포, 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포 및 본 발명의 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런 등을 포함하는 본 발명의 세포이다. 기본 세포는 또한 세포가 형태원과 접촉한 뒤 후속 형태형성 화합물 없이 비기본 세포가 되는 기본 세포, 예컨대 후속적으로 CHIR과 같은 형태원과의 접촉 부재로 인해 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런이 아닌 기본 세포가 되는 비기본 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "형태원"이라는 용어는 세포 분화에 영향을 미치는, 즉 적어도 부분적으로 세포 운명을 결정하는 화합물을 나타낸다. 형태원은 또한 세포가 비기본 세포 유형으로 분화하도록 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "지정 분화"라는 용어는 특정한(예를 들어 원하는) 세포 유형, 예컨대 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포 및 본 발명의 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런으로의 분화를 유도하는 줄기 세포 배양 조건의 조작을 나타낸다. 한 구현예에서, 세포에 대해 "지정 분화"라는 용어는 다능성 상태 세포에서 보다 성숙한 또는 특화된 세포 운명(예로 중추 신경계 세포, 신경 세포, 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포 및 본 발명의 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런 등)으로의 전이를 촉진하는 소분자, 성장 인자 단백질, 및 다른 성장 조건의 사용을 나타낸다. 하나의 바람직한 구현예에서, 지정 분화의 시작은 0일에 세포와 LDN/SB의 접촉이다. 본 명세서에 기재된 것과 같은 지정 분화를 겪는 세포는 비기본 세포 유형의 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포 및 본 발명의 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런 형성으로 이어진다.
본 발명에서 사용되는 세포에 대한 "분화 유도"라는 용어는 기본 세포 유형(유전형 및/또는 표현형)에서 비기본 세포 유형(유전형 및/또는 표현형)으로의 변화를 나타낸다. 따라서 "줄기 세포에서의 분화 유도"는 세포를 줄기 세포와 상이한 특징, 예컨대 유전형(즉 유전적 분석, 예컨대 마이크로어레이로 결정되는 유전자 발현의 변화) 및/또는 표현형(즉 단백질 발현의 변화, 예컨대 FOXA2(forkhead box protein A2) 또는 단백질 세트, 예컨대 FOXA2(forkhead box protein A2) 및 LIM 호메오박스 전사 인자 1, 알파(LMX1A) 양성(+)이지만 PAX6에 대해서는 음성(-))을 갖는 자손 세포로 분열하도록 유도하는 것을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 세포, 예컨대 "세포 운명 결정"에 대한 "운명"이라는 용어는 일반적으로 그 자손 세포가 생체내 또는 시험관내 배양 조건에 따라 다양한 세포 유형 또는 소수의 특정 세포 유형이 될 수 있는 유전적으로 결정된 계통을 갖는 세포를 나타낸다. 다시 말하면, 세포의 소정 운명은 세포가 또 다른 세포 유형 대신 하나의 세포 유형, 예를 들어 "신경 운명"이 근육 세포 또는 피부 세포 대신 신경 세포가 되도록 하는 줄기 세포의 자손 세포가 되도록 하는 특정 분화 경로로 결정되는 그 환경에 의해 결정된다.
본 발명에서 사용되는 "신경돌기 증식(neurite outgrowth)" 또는 "신경 증식"이라는 용어는 세포로부터의 연장된 막으로 싸인 세포질의 돌출의 관찰을 나타낸다.
원치 않는 제한되지 않는 신경 성장, 즉 생착 부위에서 이식 세포의 뉴런의 조절되지 않는 성장을 나타내는 "신경 증식"과는 대조된다. 본 발명에서 사용되는 "테라토마"라는 용어는 이식 세포로부터 자라는 임의 조직 유형으로부터의 비암성 종양을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "테라토마 형성"이라는 용어는 이식 세포의 성장으로부터 다양한 조직 유형의 비암성 종양으로의 원치 않는 성장을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "도파민 뉴런" 또는 "도파민성 뉴런"이라는 용어는 일반적으로 도파민을 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. "중뇌 도파민 뉴런" 또는 "mDA"는 전뇌 구조에서의 추정 도파민 발현 세포 및 전뇌 구조에서의 도파민 발현 세포를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "신경 줄기 세포"라는 용어는 뉴런 및 신경아교(지지) 세포를 만들 수 있는 성체 신경 조직에서 발견되는 줄기 세포를 나타낸다. 신경아교 세포의 예에는 별아교세포 및 희소돌기아교세포가 포함된다.
본 발명에서 사용되는 "바닥 플레이트" 또는 "FP" 또는 "fp"라는 용어는 신경관의 신호전달 중추로 불리거나 신경관의 홑 배쪽(ventral) 종단 구역으로도 기재되는 전체 배쪽 중간선을 따라 연장되는 생체내 신경관 영역을 나타낸다. 다시 말하자면, 신경관은 중간선에 가장 가까운 배쪽 세포가 바닥 플레이트을 구성하는 상이한 영역들로 구분되었다. 추가 세포 확인의 한 예를 들면, 닭 중뇌 FP는 유전자 발현, 유도 방식 및 기능을 근거로 안쪽(MFP) 및 바깥쪽(LFP) 영역들로 구분될 수 있다. 바닥 플레이트 세포는 발생 배아의 여러 영역에서, 예를 들어 중뇌, 마름뇌 등에서 바닥 플레이트 세포가 생체내에서 확인된다. 중뇌 영역에서의 생체내 바닥 플레이트 세포는 다른 영역에서의 바닥 플레이트 세포에서 분화된 세포와 상이한 세포를 만드는 것으로 고려된다. 중뇌 영역에서 하나의 주요 바닥 플레이트 마커는 FOXA2이다.
본 발명에서 사용되는 "루프 플레이트"라는 용어는 중간선에 가장 가까운 등쪽(dorsal) 세포를 나타낸다. 하나의 루프 플레이트 마커는 LMX1A이다. 배아 발생 동안, 바닥 플레이트 및 루프 플레이트 세포는 이들의 유도에 필요한 정반대로 배치되는 패턴화를 가지며 CNS에서의 구별되는 위치(배쪽 대 등쪽)에 배치된다.
본 발명에서 사용되는 "중뇌"라는 용어는 전뇌(앞쪽) 및 마름뇌(뒤쪽) 사이에 발생하는 척추동물 뇌 영역을 나타낸다. 중뇌 영역은 운동 기능에 영향을 미치는 뇌간 영역인 피개의 일부인 망상 형성, 대뇌 반구를 소뇌로 연결하는 신경 섬유로 이루어진 대뇌 다리, 및 흑색질로 불리는 큰 색소 핵을 비제한적으로 포함하는 뇌의 여러 영역을 만든다. 발생 중뇌의 독특한 특징은 바닥 플레이트 마커 FOXA2 및 루프 플레이트 마커 LMX1A의 동시-발현이다.
본 발명에서 사용되는 "뉴런"이라는 용어는 신경계의 기본 기능 단위인 신경 세포를 나타낸다. 뉴런은 세포체 및 그 돌기-축삭(axpm) 그리고 하나 이상의 수상돌기(dendrite)로 구성된다. 뉴런은 시냅스에서 신경전달물질을 방출하여 다른 뉴런 또는 세포에 정보를 전달한다.
본 발명에서 사용되는 "세포 배양"이라는 용어는 연구 또는 의학적 처치를 위한 인공 배지 중 시험관내에서의 세포 성장을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "배양 배지"라는 용어는 배양 용기, 예컨대 페트리 디쉬, 멀티웰 플레이트 등에서 세포를 덮으며 세포에 영양을 공급하고 지지하는 영양소를 함유하는 액체를 나타낸다. 배양 배지에는 또한 세포에서 원하는 변화를 유도하기 위해 첨가되는 성장 인자가 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "뉴런 성숙 배지" 또는 "BAGCT" 배지라는 용어는 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런으로 분화시키기 위한 뇌유래 신경영양 인자(BDNF), 아스코르브산(AA), 신경아교 세포주 유래 신경영양 인자, 디부티릴 cAMP 및 전환 성장 인자 유형 β3을 추가로 포함하는 N2 배지를 포함하는 배양 배지를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "영양세포층"이라는 용어는 다능성 줄기 세포를 유지하기 위해 공동 배양에서 사용되는 세포를 나타낸다. 인간 배아 줄기 세포 배양에 있어서, 전형적인 영양세포층에는 이들이 배양 중 분열하는 것을 방지하기 위해 처리된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs) 또는 인간 배아 섬유아세포가 포함된다.
본 명세서에서 세포 배양에 대해 사용되는 "계대"라는 용어는 1회의 세포 성장 및 증식 후 세포가 해리, 세척 및 새로운 배양 용기로 플레이팅되는 절차를 나타낸다. 일련의 배양 세포가 거친 계대의 수는 그 연령 및 예측되는 안정성의 지표이다.
본 발명에서 사용되는 유전자 또는 단백질에 대한 "발현하는"이라는 용어는 분석, 예컨대 마이크로어레이 분석, 항체 염색 분석 등을 이용해서 관찰될 수 있는 mRNA 또는 단백질의 제조를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "paired box 유전자 6" 또는 "PAX6"이라는 용어는 비기본 신경 선조체 세포의 마커를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 본 발명의 세포 분화에 대한 "TUJ1 " 또는 "뉴런-특이적 클래스 Ⅲ 베타-튜불린"이라는 용어는 초기 신경 인간 세포 분화, 예컨대 신경 선조체 세포의 마커를 나타내며, PNS 및 CNS의 뉴런에서 발현되는 것으로 나타난다.
본 발명에서 사용되는 SMAD 분자에 대한 "동종이량체"라는 용어는 예컨대 디설피드 결합에 의해 함께 연결된 적어도 두 분자의 SMAD를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 본 발명의 화합물과 세포를 "접촉시키는"이라는 용어는 "접촉된" 세포를 생성(얻음)하기 위해 세포를 터치할 수 있는 위치로 화합물을 배치하는 것을 나타낸다. 접촉은 임의의 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 한 구현예에서, 접촉은 화합물을 세포 튜브로 첨가하여 수해된다. 접촉은 또한 화합물을 세포 배양으로 첨가하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "부착 세포"라는 용어는 시험관내에서 자라는 세포를 나타내며, 여기서 세포는 배양 용기의 저부 또는 측부에 부착하고, 부착 세포는 세포외 기질 분자들을 통해 용기와 접촉할 수 있고, 배양 디쉬/용기로부터 상기 세포의 탈착을 위해 효소, 즉 트립신, 디스파아제 등의 사용이 필요하다. "부착 세포"는 부착하지 않고 배양 용기로부터 세포를 제거하기 위해 효소의 사용이 필요하지 않은 현탁 배양에서의 세포와 대치된다.
본 발명에서 사용되는 "마커" 또는 "세포 마커"라는 용어는 특정 세포 또는 세포 유형을 확인하는 유전자 또는 단백질을 나타낸다. 세포에 대한 마커는 하나의 마커에 제한되지 않을 수 있고, 마커는 지정된 마커군이 또 다른 세포 또는 세포 유형으로부터 하나의 세포 또는 세포 유형을 확인할 수 있도록 하는 마커의 "패턴"을 나타낼 수 있다. 예를 들어 본 발명의 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런은 전구체(precursor)인 덜 분화된 세포로부터 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포를 구별하는 하나 이상의 마커를 발현한다, 즉 예를 들어 도 1의 e 및 f에서 예시적 유전자 패턴으로 나타낸 바와 같은 FOXA2(forkhead box protein A2) 양성 및 LIM 호메오박스 전사 인자 1, 알파(LMX1A) 양성 대 HES5+ 및 PAX6+ 세포를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "양성 세포"를 포함하여 세포에 대한 "양성"이라는 용어는 대조군 또는 대조 세포를 넘어서는 검출 가능한 정량적 및/또는 정성적 양으로, 리포터 분자, 즉 이중쇄 핵산 서열에 부착하는 형광 분자에 의해 측정되는 마커 핵산 서열과 혼성화하는 핵산 서열 또는 항체 염색(검출) 시스템을 이용하는 경우 마커, 한 예를 들어 그 마커에 대한 항체 "염색"을 발현하는 세포를 나타낸다. 예를 들어 마커, 예컨대 FOXA2(forkhead box protein A2) 등에 대해 양성인 세포는 분석, 예컨대 유전자 어레이 또는 항체 각각에서 검출되는 경우, FOXA2 mRNA 및/또는 단백질을 발현하는 세포를 나타낸다. 예컨대 양성 세포는 FOXA2+로 부를 수 있다. 세포가 둘 이상의 마커에 대해 양성인 경우, 예컨대 표시 FOXA2/LMX1A+를 이용하는 경우, 세포 또는 대부분의 세포 모집단은 FOXA2 및 LMX1A 모두에 대해 양성이다.
본 발명에서 사용되는 "음성 세포"를 포함하여 세포 또는 세포 모집단에 대한 "음성"이라는 용어는 마커에 대해 검출가능한 신호 또는 대조 모집단 수준의 신호가 없는 세포 또는 모집단을 나타낸다. 예를 들어, FOXA2 mRNA 등의 검출을 포함하는 FOXA2(forkhead box protein A2) 항체 검출 방법 또는 유전자 어레이와의 접촉 후 염색되지 못하는 세포는 FOXA2- 또는 FOXA2에 대해 음성이다.
본 발명에서 사용되는 "리포터 유전자" 또는 "리포터 구축물"이라는 용어는 쉽게 검출 가능하거나 또는 쉽게 분석 가능한 단백질, 예컨대 유색 단백질, 형광 단백질, 예컨대 GFP 또는 효소, 예컨대 β-갈락토시다아제(lacZ 유전자)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전적 구축물을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 "GFP"라는 용어는 전형적으로 표적 유전자의 발현을 위한 지표 마커로 사용되는 세포에서 발현 시 형광 단백질을 생성할 수 있는 임의의 녹색 형광 단백질 DNA 서열을 나타낸다. GFP의 예에는 강장동물에서 단리된 GFP 서열, 예컨대 태평양 해파리, 애쿠오리아 빅토리아 및 이들의 합성 서열 유도체, 예컨대 "eGFP"가 포함된다.
"표본"이라는 용어는 그 가장 넓은 의미로 사용된다. 하나의 의미에서, 이는 세포 또는 조직을 나타낼 수 있다. 또 다른 의미에서, 여기에는 임의 원천에서 얻어지는 시편 또는 배양물이 포함되며, 유체, 고체 및 조직을 포괄한다. 환경적 표본에는 환경적 재료, 예컨대 표면 물질, 토양, 물, 및 산업 표본이 포함된다. 이들 예들은 본 발명에 적용 가능한 표본 유형을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본 발명에서 사용되는 "정제된", "정제하기 위해", "정제", "단리된", "단리하기 위해, "단리" 및 이들의 문법적 균등분과 같은 용어는 표본으로부터 적어도 하나의 오염물의 양 감소를 나타낸다. 예를 들어 바람직한 세포 유형은 바람직하지 못한 세포 유형의 양의 대응 감소와 함께 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90% 정제되며, 예를 들어 본 발명의 지정 분화는 분화된 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포 또는 본 발명의 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런의 순도의 바람직한 증가를 일으켰다. 다시 말하자면 "정제하다" 및 그 균등분은 기계적으로, 예컨대 유세포 측정 세포 분류에 의해 또는 지정 분화를 통해 표본으로부터 특정 세포(예로, 바람직하지 못한 세포)의 제거를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 FOXA2(forkhead box protein A2)+ LIM 호메오박스 전사 인자 1, 알파(LMX1A)+ 선조체 세포의 정제된 모집단의 분화를 위해, 선조체 세포는 유세포 측정에 의해 혼합 세포 모집단을 이중 양성 FOXA2(forkhead box protein A2)+ LIM 호메오박스 전사 인자 1, 알파(LMX1A)+ 세포로 분류하여 오염 PAX6 뉴런 세포를 제거함으로써 정제된다; 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런은 또한 본 발명의 조성물을 포함하는 세포 배양의 특화된 방법 및 본 발명의 방법을 이용하여 비도파민(DA)(기본 세포)으로부터 정제되거나 또는 "선택된다". 중뇌 운명을 갖지 않는 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런 세포의 제거 또는 선택은 표본 중에 원하는 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런의 백분율을 증가시킨다. 따라서 세포 유형의 정제는 표본 중 원하는 세포, 즉 중뇌 운명을 가진 FOXA2/LMX1A+ 도파민(DA) 뉴런의 "농축", 즉 양의 증가를 일으킨다.
대상체(예컨대 세포, 조직 등) 및/또는 화합물(예컨대 단백질, 아미노산 서열, 핵산 서열, 코돈 등)에 적용되는 경우 본 발명에서 사용되는 "천연 생성"이라는 용어는 대상체 및/또는 화합물이 자연적으로 발견된다/되었다는 것을 의미한다. 예를 들어 천연 생성 세포는 자연적으로 원천에서 단리될 수 있는 유기체 중에 존재하는 세포, 예컨대 배아 세포를 나타내며, 여기서 세포는 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 개질되지 않았다.
본 발명에서 사용되는 "시험관내"라는 용어는 인공 환경 그리고 인공 환경 내에서 일어나는 절차 또는 반응을 나타낸다. 비제한적으로 예시되는 시험관내 환경은 시험관 및 세포 배양이다.
본 발명에서 사용되는 "생체내"라는 용어는 천연 환경(예로, 동물 또는 세포) 및 천연 환경 내에서 일어나는 절차 또는 반응, 예컨대 배아 발생, 세포 분화, 신경관 형성 등을 나타낸다.
본 명세서에 개시된 임의 세포에 대한 "에서 유래된" 또는 "에서 구축된" 또는 "에서 분화된"이라는 용어는 임의 조작, 예컨대 단세포 단리, 생체내 배양, 처리 및/또는 돌연변이화를 이용하여 세포주, 조직(예컨대 해리된 배아, 또는 유체) 중 모세포에서 얻어지는(예로 단리, 정제되는 등) 세포를 나타낸다. 세포는, 예를 들어 바이러스 감염, DNA 서열로의 형질감염, 형태원과의 접촉(처리) 등 및 배양된 모세포에 함유된 임의 세포 유형의 선택에 의해(예컨대 연속 배양에 의해), 예를 들어 화학적 처리, 조사, 새로운 단백질 발현의 유도를 이용하여 또 다른 세포에서 유래될 수 있다. 유래된 세포는 성장 인자, 시토카인, 시토카인 처리의 선택 진행, 접착성, 접착성의 부재, 정렬 절차 등에 대한 반응에 의해 혼합 모집단에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "세포"라는 용어는 단세포뿐만 아니라 세포의 모집단(즉 둘 이상)을 나타낸다. 모집단은 하나의 세포 유형을 포함하는 순수한 모집단, 예컨대 뉴런 세포의 모집단 또는 미분화 배아 세포의 모집단일 수 있다. 대안적으로, 모집단은 둘 이상의 세포 유형, 예를 들어 혼합된 세포 모집단을 포함할 수 있다. 이는 모집단의 세포 수를 제한하는 것을 의미하지 않는다; 예를 들어 한 구현예에서, 세포의 혼합된 모집단은 적어도 하나의 분화된 세포를 포함할 수 있다. 본 발명에서는 세포 모집단이 포함할 수 있는 세포 유형의 수에 제한이 없다.
본 발명에서 사용되는 "고도로 농축된 모집단"이라는 용어는 비교 모집단에 비해 더 높은 백분율 또는 양으로 마커를 발현하는 세포 모집단, 예컨대 배양 디쉬 중 세포 모집단을 나타내며, 예를 들어 1일에 LSB 접촉된 세포 배양물을 푸르모르파민으로 그리고 3일에 CHIR로 처리하여 LSB만 처리한 것에 비해 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포의 고도로 농축된 모집단을 만든다. 다른 예에서, 농축된 모집단은 원하는 마커를 발현하지 않는 세포에서 하나 이상의 마커를 발현하는 세포를 분류 또는 분리하여 생성되는 모집단, 예컨대 CD142 농축된 모집단, A9 농축된 모집단 등이다.
"세포 생물학" 또는 "세포성 생물학"이라는 용어는 살아있는 세포, 예컨대 세포의 해부구조 및 기능, 예를 들어 세포의 생리학적 특성, 구조, 소기관, 및 환경과의 상호작용, 이들의 생활 주기, 분열 및 사멸의 연구를 나타낸다.
"관심 뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 당업자에 의해 임의 사유로(예로 질환 치료, 개선된 품질 부여, 숙주 세포 내 관심 단백질의 발현, 리보자임의 발현 등) 그 조작이 바람직하게 간주될 수 있는 임의의 뉴클레오티드 서열(예로, RNA 또는 DNA)을 나타낸다. 이러한 뉴클레오티드 서열에는 구조 유전자의 코딩 서열(예로, 리포터 유전자, 선택 마커 유전자, 종양유전자, 약물 내성 유전자, 성장 인자 등), 및 mRNA 또는 단백질 산물을 인코딩하지 않는 비코딩 조절 서열(예로, 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 종결 서열, 인핸서 서열 등)이 비제한적으로 포함된다.
본 발명에서 사용되는 "관심 단백질"이라는 용어는 관심 핵산에 의해 인코딩되는 단백질을 나타낸다.
"유전자"라는 용어는 폴리펩티드 또는 전구체(예로 프로인슐린)의 생성에 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산(예로, DNA 또는 RNA) 서열을 나타낸다. 폴리펩티드는 전장 또는 단편의 원하는 활성 또는 기능 성질(예로 효소 활성, 리간드 결합, 신호 전달 등)이 보유되는 한 코딩 서열의 임의 부분 또는 전장 코딩 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 이 용어는 또한 구조 유전자의 코딩 영역을 포괄하며, 유전자가 전장 mRNA의 길이에 대응하도록 5' 및 3' 말단 중 어느 하나에 약 1kb 이상의 길이로 5' 및 3' 말단 모두에서 코딩 영역에 인접해서 위치하는 서열이 포함된다. 코딩 영역의 5'에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열은 5' 미번역 서열로 불린다. 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치하고 mRNA에 존재하는 서열은 3' 미번역 서열로 불린다. "유전자"라는 용어는 cDNA 및 유전자의 게놈 형태를 모두 포괄한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론" 또는 "개재 영역" 또는 "개재 서열"로 명명된 비코딩 서열로 단속된 코딩 영역을 포함한다. 인트론은 핵 RNA(hnRNA)로 전사되는 유전자 구획이다; 인트론은 조절 요소, 예컨대 인핸서를 함유할 수 있다. 인트론은 핵 또는 일차 전사물로부터 제거되거나 "스플라이스 아웃"된다; 따라서 인트론은 메신저 RNA(mRNA) 전사물에 존재하지 않는다. mRNA는 번역 동안 초기 폴리펩티드에서 아미노산의 서열 또는 순서를 특정하는 기능을 한다.
본 발명에서 사용되는 "유전자 발현"이라는 용어는 유전자의 "전사"를 통해(즉, RNA 폴리머라아제의 효소 작용을 통해) 유전자에 인코딩된 유전 정보를 RNA(예로, mRNA, rRNA, tRNA, 또는 snRNA)로, 그리고 단백질 인코딩 유전자에 있어서는 mRNA의 "번역"을 통해 단백질로 전환하는 절차를 나타낸다. 유전자 발현은 절차 중 여러 단계에서 조절될 수 있다. "상향 조절" 또는 "활성화"는 유전자 발현 산물(즉, RNA 또는 단백질)의 생산을 증가시키는 조절을 나타내는 반면, "하향 조절" 또는 "억제"는 생산을 감소시키는 조절을 나타낸다. 상향 조절 또는 하향 조절에 관여하는 분자(예로, 전사 인자)는 종종 각각 "활성화제" 및 "억제물질"로 불린다.
본 발명에서 사용되는 "인코딩하는 핵산 분자", "인코딩하는 DNA 서열", "인코딩하는 DNA", "인코딩하는 RNA 서열" 및 "인코딩하는 RNA"라는 용어는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산의 사슬을 따른 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 나타낸다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드(단백질) 사슬을 따른 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서 DNA 또는 RNA 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.
"단리된 올리고뉴클레오티드" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"에서와 같이 핵산에 대해 사용될 때 "단리된"이라는 용어는 그 천연원에 보통 연관되는 오염물 또는 적어도 하나의 성분으로부터 분리되고 확인된 핵산 서열을 나타낸다. 단리된 핵산은 자연에서 발견되는 것과 상이한 형태 또는 설정으로 존재한다. 대조적으로 핵산, 예컨대 DNA 및 RNA와 같은 단리되지 않은 핵산은 이들이 자연에 존재하는 상태로 발견된다. 예를 들어, 주어진 DNA 서열(예로, 유전자)은 주변 유전자와 인접한 숙주 세포 염색체 상에서 발견된다; RNA 서열, 예컨대 특정 단백질을 인코딩하는 특정 mRNA 서열은 여러 단백질을 인코딩하는 여러 다른 mRNA와의 혼합물로 세포에서 발견된다. 그러나 주어진 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산에는, 예로써 그 핵산이 천연 세포의 것과 다른 염색체 위치에 있거나 자연에서 발견되는 것과 상이한 핵산 서열이 측면에 놓인 주어진 단백질을 보통 발현하는 세포에 있는 핵산이 포함된다. 단리된 핵산, 올리고뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드는 단일쇄 또는 이중쇄 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 단백질을 발현하는데 사용되는 경우, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 최소한 센스 또는 코딩 사슬을 포함할 것이지만(즉 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단일쇄일 수 있음) 센스 및 안티센스 사슬을 모두 포함할 수도 있다(즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이중쇄일 수 있음).
본 발명에서 사용되는 "키트"라는 용어는 재료를 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 나타낸다. 세포 분화의 맥락에서, 키트는 줄기 세포를 접촉시키기 위한 재료의 조합을 나타낼 수 있고, 이러한 전달 시스템에는 적절한 용기(예컨대 튜브 등)에서 하나의 위치에서 다른 위치로 반응 시약 및/또는 지지 재료(예로 완충액, 세포 분화 수행을 위한 서면 지침 등) (예로, 화합물, 단백질, 검출 제제(예컨대 티로신 히드록실라아제(TH), FOXA2(forkhead box protein A2), LIM 호메오박스 전사 인자 1, 알파(LMX1A) 등) 등의 보관, 수송, 또는 전달을 허용하는 시스템이 포함된다. 예를 들어, 키트에는 신호전달 경로를 억제하기 위한 관련 반응 시약, 예를 들어 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달을 낮추기 위한 억제제, 예컨대 SB431542(또는 SB431542 대체물) 등, SMAD 신호전달을 낮추기 위한 억제제, LDN-193189(또는 LDN-193189 대체물) 등, 글리코겐 합성효소 키나아제 3β(GSK3β)를 낮추기 위한, 한 예를 들어 WNT 신호전달 활성화제(WNT 작용제)로도 알려져 있는 wingless(Wnt 또는 Wnts) 신호전달의 활성화를 위한 억제제, 예컨대 CHIR99021(또는 CHIR99021 대체물 등) 등, SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 활성화제(예컨대 SMO(Smoothened) 수용체 소분자 작용제), 예를 들어 SHH(Sonic hedgehog) C25II 분자, 푸르모르파민 등, 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8) 활성을 갖는 분자, 예컨대 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8) 등, 및 뉴런 성숙 분자, 예를 들어 뇌유래 신경영양 인자(BDNF), 아스코르브산(AA), 신경아교 세포주 유래 신경영양 인자, 디부티릴 cAMP 및 전환 성장 인자 유형 β3과 이들 성분을 대체할 수 있는 분자 및/또는 지지 재료를 포함하는 하나 이상의 인클로저(예로 상자 또는 가방, 시험관, 에펜도르프 튜브, 모세관, 멀티웰 플레이트 등)가 포함된다. 한 구현예에서 키트 중의 시약은 용액일 수도 있고, 냉동될 수도 있고, 동결건조될 수도 있다. 한 구현예에서 키트 중의 시약은 개별 용기 중에 있을 수도 있고, 또는 특정 조합으로, 예컨대 LSB(LDN-193189와 SB431542), SHH(Sonic hedgehog) C25II 분자와 푸르모르파민, SHH(Sonic hedgehog) C25II 분자와 푸르모르파민과 CHIR99021 또는 푸르모르파민과 CHIR99021, 뉴런 성숙 분자 등의 조합으로 제공될 수도 있다.
본 발명은 줄기 세포 생물학 분야, 특히 다능성 또는 다중능성 줄기 세포의 계통 특이적 분화에 관한 것으로, 여기에는 비배아 인간 유도 다능성 줄기 세포(hiPSC), 체세포 줄기 세포, 질환이 있는 환자의 줄기 세포 또는 계통 특이적 분화가 가능한 임의의 다른 세포에 부가하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)가 비제한적으로 포함될 수 있다. 특히 신규한 배양 조건을 이용하여 hESC 및/또는 hiPSC의 바닥 플레이트 중뇌 선조체 세포로, 이어서 중뇌 운명을 가진 FOXA2+LMX1A+TH+ 도파민(DA) 뉴런의 큰 모집단으로의 계통 특이적 분화를 지시하는 방법이 기재된다. 본 발명의 방법을 이용하여 제조되는 중뇌 운명을 가진 FOXA2+LMX1A+TH+ 도파민(DA) 뉴런은 시험관내 약물 탐색 분석, 신경학 연구에서, 그리고 환자에서 도파민 뉴런의 부족 질환이나 이에 대한 손상을 역전시키기 위한 치료로서의 용도를 비제한적으로 포함하는 다양한 용도에 대해 추가 고려된다. 또한, 질환 모델링, 특히 파킨슨 질환에서 사용하기 위한 인간 다능성 줄기 세포로부터 중뇌 운명을 가진 FOXA2+LMX1A+TH+ 도파민(DA) 뉴런을 분화시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
본 발명은 환자의 뇌에서 중뇌 도파민(mDA) 뉴런의 선택적 퇴화를 포함하는 파킨슨 질환(PD)의 특징에 관한 것이다. PD 증상은 주로 배쪽 중뇌의 흑색질에서 DA 뉴런의 선택적 손실에 기인하므로, PD는 치료를 위한 세포 대체 치료 전략에 대해 가장 적합한 질환 중 하나로 여겨진다. 따라서 중뇌 도파민(mDA) 뉴런의 기능 손실을 대체하기 위해 환자의 뇌 내로 세포를 이식하려는 여러 시도가 수행되었다. 그러나 이들 실험은 성공적이지 못했으며, 환자에 이용되는 현재의 대증 치료는 성공 변동성이 크다. 따라서 뉴런 기능의 손실을 늦추기 위해 PD 환자에 대한 새로운 치료가 필요하다.
인간 다능성 줄기 세포(hPSC)는 재생 의약에서의 적용을 위한 세포원이다. 본 발명의 방법 이외의 방법에 의한 분화로 생성되는 특화된 세포, 예컨대 척추 운동뉴런(Li et al., Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 또는 중뇌 도파민(DA) 유사 뉴런으로의 hPSC의 지정 분화. 본 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 같이 본 명세서에서 도파민(DA)-유사 뉴런으로 불리는 종래의 도파민(DA) 뉴런(즉 In Perrier et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)이 본 발명의 진정한 중뇌 도파민(DA) 뉴런이 아님을 발견하였다(도 3, 10, 13 및 16 참조). 따라서 본 발명자들은 공개된 방법으로 제조된 도파민 생성 뉴런과는 달리 본 발명의 "진정한" 도파민 생성 뉴런을 설치류 및 영장류 내로 이식하는 경우 이들은 신경 과성장 및 테라토마 형성으로 인한 간섭이 적고 파킨슨-유사 신경학적 상태를 역전시키므로, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 바닥 플레이트 유래 도파민 생성 뉴런, 즉 본 발명의 도파민 생성 뉴런을 "진정한" 것으로 표지하였다. 또한, 도파민 생성 뉴런을 제조하는 종래의 방법과는 달리, 본 발명의 "진정한" 도파민 생성 뉴런은 출발 모집단으로부터 더 높은 백분율로 생성되며, 배양 중 수 개월 동안 생착 가능성을 보유한다.
따라서 본 명세서에 기재된 분화 방법을 이용하여 진정한 중뇌 DA 뉴런을 제조하는 방법을 발견하였다. 그러나 세포 치료를 위한 hPSC의 효과적 사용은 세포 배양 진보에 비해 훨씬 더 뒤떨어져 있다. 마우스 PSC 유래 DA 뉴런이 파킨슨 질환(PD) 모델에서 유효성을 나타냈으나(Tabar et al., Nature Med. 14, 379-381 (2008); Wernig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 5856-5861 (2008), 모두 인용에 의해 본 명세서에 포함됨), 인간 PSC에서 유래되는 DA 뉴런은 일반적으로 불량한 생체내 성능을 나타낸다(Lindvall and Kokaia, J. Clin. Invest 120, 29-40 (2010), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 뉴런 기능의 내인성 손실에 대해 보상하지 못하는 것에 부가하여, hPSC 유래 뉴런이 이식을 위해 사용되고 테라토마 형성 또는 신경 과성장에 대한 이들의 가능성에 관련된 경우 심각한 안전성 우려가 존재한다(Roy et al., Nature Med. 12, 1259-1268 (2006); Elkabetz et al., Genes Dev. 22, 152-165 (2008), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨).
이식을 위해 또 다른 가능한 세포원은 인간 ESC 유래의 DA 뉴런이다. 설치류 PD 모델 내로 이식된 인간 배아 줄기 세포(hESC) 유래의 DA 유사-중뇌 뉴런인 것으로 나타난 분화 세포를 제조하기 위한 출발 세포 모집단으로 이들 세포를 이용하는 종래의 시도들은 이식 후 이식물의 불량한 생체내 생존으로 이어졌다. 이러한 실패는 중뇌 DA 뉴런인 것으로 나타났으나 생착으로 소실된 뉴런 기능을 대체할 수 없었던 세포를 만드는 불완전한 시험관내 중뇌 DA 뉴런 분화에 기인할 가능성이 가장 높은 것으로 고려되었다. 사실, 본 발명자들은 이들의 실험실에서 이전에 제조되고 간행물에 기재된 DA 유사 뉴런이 본 발명의 바닥 플레이트 중뇌 DA 뉴런 세포와 동일한 세포 유형도 아니고 유사한 기능 또는 생착 능력을 갖지도 않는 것을 나타낸다. 예를 들어 도 16 및 17 참조. 따라서 본 발명자들은 또한 세포가 다수의 적절히 기능하는 뉴런을 함유하는 세포 모집단을 생성하기 위해 실험실에서 지정 분화를 겪기 위해서는 세포가 세포 기반 대체 치료를 위해 적합한 대체 세포 모집단이 되기 위해 특정한 발생 단계를 거칠 필요가 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 적어도 본 발명의 생착가능한 DA 뉴런을 얻기 위해서는 특정 발생 단계, 예컨대 11일에 FOX2A/LIM1A+ 중간체가 존재해야 함을 발견하였다. 이러한 발생 단계가 존재하지 않는 경우, 본 발명자들은 생성 DA 유사 뉴런이 11일에 FOX2A/LIM1A+ 중간체에서 유래된 본 발명의 중뇌 DA 뉴런과 동일한 기능적 능력을 갖지 않음을 발견하였다.
종래의 관찰과는 대조적으로, 생체내에서 효율적으로 생착된 인간 DA 뉴런의 유도를 위한 바닥 플레이트 세포 유도-기반 전략에 관련된 신규한 배양 기법이 본 명세서에 기재된다. 따라서 주로 본 발명의 수임된 DA 뉴런(즉, 효율적 생착이 가능한 FOX2A+ 및 LIM1A+ DA 뉴런)을 포함하는 세포 모집단을 얻는데 있어서의 과거의 실패는 DA 유사 뉴런의 생착이 실패한 이유, 즉 DA 유사 세포의 불완전한 특화에 기인하는 것으로 고려되었다. 종래의 가설은 이식 실패가 세포의 특정한 취약성에 기인한다, 즉 DA 유사 배양 뉴런이 이식 스트레스를 견딜 수 없다는 것이었다. 본 명세서에 기재된 것과 같이, 중뇌 FOXA2+/LMX1A+ 바닥 플레이트 전구체는 SHH(Sonic hedgehog) 및 정준 WNT 신호전달의 소분자 활성화제에 대한 노출 후 11일에 hPSC에서 유도되었다. FOXA2+ 및 LMX1A+에 대해 이중 양성인 이들 11일의 세포는 25일에 추가 소분자와 접촉되어 TH+ FOXA2+ 및 LMX1A+에 대해 양성인 생착가능한 중뇌 DA 뉴런으로의 추가 분화를 유도한다. 이러한 성숙한 바닥 플레이트 중뇌 DA 뉴런은 시험관내에서 수 개월 동안 유지될 수 있다. 광범위한 시험관내 분자 프로파일링, 생화학적 및 전기생리학적 데이터로 발생학적 진행을 정의하고 hPSC 유래 중뇌 DA 뉴런의 정체성을 확인하였다. 세 숙주 종들에서 PD 동물 모델에서 생체내 생존 및 기능이 드러났다. 6-OHDA-병소의 마우스 및 래트에서의 장기간의 생착은 중뇌 DA 뉴런의 강력한 생존, 암페타민-유도 회전 거동의 완전 복구 및 앞다리 사용 및 운동불능 검사에서의 개선을 나타낸다. 마지막으로 파킨슨 원숭이 내로의 이식에 의한 확장성이 드러난다. 평가된 세 동물 모델에서의 뛰어난 DA 뉴런 생존, 기능 및 신경 과성장의 부재는 본 발명의 조성물 및 방법에 기반한 PD에서의 세포 기반 치료의 개발을 위한 전망을 시사한다.
따라서 본 발명자들은 이들 발견의 주요 용도를 전임상 및 임상 치료 용도를 위해 적합한 완전 기능을 갖춘 바닥 플레이트 유래 중뇌 DA 뉴런의 무제한 공급을 제공할 수 있는 능력으로 고려한다. 구체적으로 본 발명자들은 설치류 및 인간에서 단리된 적어도 다능성인 세포 모집단(인간 배아 줄기 세포(hESC) 및 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC))로부터 mDA 뉴런의 효율적인 분화를 위한 새로운 프로토콜을 발견하였다. 이들 연구에는 파킨슨 질환의 유전적 형태를 겪는 인간 환자 유래의 PINK1 돌연변이체 iPS 세포주가 포함되었다(Seibler et al., The Journal of Neuroscience, 2011, 31(16):5970-5976, 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 인간 줄기 세포 모집단(hESC 또는 hiPSC)은 중뇌 표현형으로 분화되었으며, 이는 뉴런 성숙 분자와의 접촉 후 더 진정한 생착가능한 DA 뉴런을 만들었다. 상기 프로토콜을 이용하여 주요 전사 인자, 예로 추가 분화 시 추가적인 주요 단백질, 예로 TH를 생성하는 TH, FoxA2 및 LMX1A의 발현을 포함하는 중뇌 DA(mDA) 뉴런 표현형으로의 지정 분화의 11일에 hESC 자손의 높은 수율을 나타내었다. 이들 hESC 유래 mDA 뉴런의 면역저하 설치류 및 영장류 숙주로의 이식은 종래의 시험관내 유래 DA 뉴런과는 달리, 거동 결손의 기능적 복구와 함께 그래프트된 세포의 우수한 생체내 생존을 나타내었다.
다른 방법에 비해 DA 뉴런 세포의 생성을 위한 본 발명의 방법을 이용하는 장점은 부분적으로는 하기 정보로부터 자명하다. 생체내에서 효율적으로 생착되는 진정한 중뇌 DA 뉴런을 생성하는 목적으로 다른 방법에서의 체세포 줄기 세포 및 신경 줄기 세포의 사용은 성공적이지 않았다(리뷰로 Kriks & Studer, Protocols for generating ES cell-derived dopamine neurons in Development and engineering of dopamine neurons(eds. Pasterkamp et al.)(Landes Biosciences, 2008, 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 참조). 이어서 다능성 줄기 세포, 예컨대 ES 세포가 생착가능한 세포의 생성을 위한 원천으로 사용되었다. 마우스 ES 세포를 이용한 1990년대의 초기 연구는 뉴런을 포함하는 시험관내 다능성 세포부터의 특정 계통 유도의 타당성을 나타내었다(Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102 (1996); Bain et al., Dev. Biol. 168v342-357 (1995), 모두 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 사실, 중뇌 DA 뉴런은 초기 이식물(explant) 연구(Ye et al., Cell 93:755-766 (1998), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)로부터의 개발 식견에 기반한 지정 분화 전략을 이용하여 생성되었다(Lee et al., Nat. Biotechnol. 18v675-679 (2000), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 다른 지정 분화 전략이 다른 뉴런 유형, 예컨대 체세포 운동뉴런(Wichterle et al., Cell 110, 385-397 (2002), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)의 생성에 사용되었다. 그러나 이러한 시도는 높은 백분율의 중뇌 DA 뉴런 또는 뉴런 기능을 생체내 복구할 수 있는 세포를 함유하는 세포 모집단을 생성하지 못했다. 사실, 생성 모집단은 중뇌 DA 뉴런에 부가하여 세포 유형의 혼합물을 함유하였다. 본 발명자들도 부분적으로는 중뇌 DA 뉴런을 제조하는 다른 방법을 개발했으나(하기 참조), 이들 세포 모집단도 세포 유형의 혼합물이었으며 뉴런 기능을 복구하는데 실패하였다. 특히 인간 ES 세포는 신경 로제트로 불리는 초기 신경상피 세포로 분화된 뒤 로제트 단계 세포를 중뇌 DA 뉴런 전구체 및 분화된 마커를 발현하는 세포로 유도하였다. 이들 세포는 전기생리학, 시험관내 DA 방출 및 TH-면역골드 양성 시냅스 접촉의 형성에 의해 기능적인 뉴런의 특징을 나타내었다(Perrier et al., From the Cover: Derivation of mibraine dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 그러나 이러한 유망한 시험관내 데이터에도 불구하고, 6OHDA 병소의 쥐과 숙주에서 세포의 이식은 매우 적은 수의 생존하는 도파민성 뉴런으로 이어졌다. 이는 마우스 ES 유래 DA 뉴런의 생체내 기능성의 강력한 증거(Barberi et al., Nat. Biotechnol. 21:1200-1207 (2003); Tabar et al., Nature Med. 14:379-381 (2008); Bjorklund et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:2344-2349 (2002); Kim et al., Nature 418:50-56 (2002), 모두 인용에 의해 본 명세서에 포함됨), 인간 ES 유래 DA 뉴런의 강력한 시험관내 기능 특징(Perrier et al., From the Cover: Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 및 인간 태아 DA 뉴런이 줄무늬체(striatum) 이종이식물로 생존할 수 있다는 명확한 증거(Brundin et al., Exp. Brain Res. 70:192-208 (1988); Bjorklund et al., Neuronal replacement by intracerebral neural implants in animal models of neurodegenerative disease. Raven. Press., New. York. 455-492 (1988), 모두 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)를 볼 때 놀라운 음성 결과였다. 인간 ES 세포 유래 DA 뉴런 그래프팅의 최초 실패 시도 후 거의 8년 동안 이 분야에서는 거의 진전이 없었다. 영장류 다능성 줄기 세포원(Sanchez-Pernaute et al., Long-term survival of dopamine neurons derived from parthenogenetic primate embryonic stem cells(Cynol) in rat and primate striatum. Stem Cells 23:914-922 (2005), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨), FGF20 또는 Wnt5A로 전처리된 세포 또는 불멸화 중뇌 별아교세포에서 분비되는 인자의 존재 하에 분화된 인간 ES 세포(Roy et al., Nature Med. 12:1259-1268 (2006), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)를 이용하여 일부 제한된 개선이 관찰되었다. 그러나 종래의 전략 중 어느 것도 생체내 뉴런 기능을 복구하기 위한 생착 절차에 사용하기 위한 본 발명의 DA 뉴런의 농축된 모집단 생성에 성공하지 못했다.
Ⅰ. 뉴런 전구체(계통) 세포를 유도하기 위한 세포 배양 방법: 인간 다능성 줄기 세포와 SB431542 및 LDN-193189의 접촉으로 분화된 신경 계통 세포가 얻어졌다.
하기 실시예는 본 발명의 개발 동안 사용하기 위한 신경 계통 세포를 제공하기 위한 예시적 방법을 설명한다.
이중 SMAD 억제는 종래에 hPSC로부터 신경 계통 세포의 한 유형을 유도하기 위한 신속하고 매우 효과적인 방법으로 사용되었다(Chambers et al., Nat Biotechnol 27, (2009), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). Noggin을 포함하는 분자에 의해 유도된 이들 신경 계통 세포는 중추 신경계 세포, 즉 신경 세포 운명으로의 발생을 허용하는 기본 경로를 가졌다. 후속 연구는 적어도 부분적으로 동일하지는 않지만 유사한 분화 세포를 생성하며 그 주요 차이가 배양의 일관성인 Noggin을 대신한 소분자 DM(dorsomorphin)의 사용을 보고하였다(Kim et al., Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev 6, 270-281, (2010); Zhou et al., High-Efficiency induction of Neural Conversion in hESCs and hiPSCs with a Single Chemical inhibitor of TGF-beta Superfamily Receptors. Stem Cells, 504, (2010), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨).
본 발명자들은 Noggin을 이용하여 생성된 세포가 LDN 처리 세포와 동일한 발생 단계를 나타내고, 거의 동일한 마커를 발현하며, 다양한 신경계를 만드는 유사한 발생 가능성을 가질 수 있음에도 불구하고, LDN을 이용하여 유도된 신경 세포에 비해 앞쪽-뒤쪽 축에서 더 앞쪽인 것과 같은(즉 더 전뇌이며, 더 많은 세포가 FOXG1을 발현하는 등) 차이를 나타냄을 관찰하였다. 따라서 LDN이 다른 신호전달 경로 중에서 BMP를 억제하기 위해 Noggin 대신 사용되었지만, Noggin 및 LDN은 BMP 억제와 상이한 다른 유형의 활성을 가질 수 있다.
부분적으로는 Noggin 이용의 높은 비용으로 인해, 본 발명자들은 BMP 억제제의 사용이 신경 세포 운명의 세포 분화에서 Noggin을 대체할 수 있음을 고려하였다. 따라서 소분자 BMP 억제제 LDN-193189(Yu et al., Nat Med 14, 1363-1369, (2008), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)를 사용하여 본 발명의 개발 동안 신경 세포 운명을 가진 세포, 즉 CNS 세포를 hPSC로부터 원시 신경외배엽을 생성하기 위해 SB431542와 조합하여 Noggin을 대체할 수 있음을 발견하였다(도 2의 A). 상기 조합 처리는 이들 두 억제제 LDN-193189 및 SB431542의 조합에 대해 LSB로 명명되었다.
일반적으로 세포 분화는 고융합성 단층 hES 또는 hiPS와 SMAD 신호전달의 이중 억제의 처리로 개시되었다. 바람직한 구현예는 50%-100% 융합성, 가장 바람직한 구현예는 70%-80% 융합성 백분율을 이용한다. 본 기술분야의 기술자에게는 본 발명의 바람직한 융합성을 달성하는데 필요한 초기 플레이팅 밀도가 본 기술분야의 기술자 측면에서 부당한 실험 없이 실험적으로 결정될 수 있는 세포 유형, 크기, 플레이팅 효율, 생존, 부착 및 다른 파라미터에 근거할 것임이 자명할 것이다. SMAD의 이중 억제는 Noggin, SB431542, LDN-193189, Dorsomorphin 또는 TGFβ, BMP, 및 액티빈/노달 신호전달을 차단하는 다른 분자를 포함하는 다양한 화합물로 달성될 수 있다. 바람직한 구현예는 0.1 μM-250 μM, 또는 더 바람직한 1-25 μM, 또는 가장 바람직한 10 μM 농도의 SB431542 및 10-5000 nM, 또는 가장 바람직하게는 100-500 nM 농도의 LDN-193189로 SB431542 및 LDN-193189(LSB로 총칭)를 포함하는 조성물을 이용한다.
Ⅱ. hESC로부터 로제트 세포 중간체를 통한 DA 뉴런의 유도 및 이들 DA 유사 뉴런을 사용한 이식 연구 결과.
본 발명자들은 종래에 DA 유사 뉴런을 함유하는 세포 모집단을 생성하는 여러 다른 지정 분화 방법을 이용하였다. 이들 DA 유사 뉴런은 치료 용도를 위한 이들 세포의 추가 사용에 대한 우려를 낳은 이식 연구에서 사용되었다. 예를 들어, MS5 신경 유도를 포함하는 [Perrier et al., 2004 및 Fasano et al., 2010]에 기재된 절차는 로제트 세포 형성으로 이어졌고, 11일에 전구체를 제조하는데 사용되었다(예를 들어 DA 유사 뉴런을 유도하는데 추가 사용된 도 2, 16 및 17 참조). 이들 뉴런은 생성 11일에 세포 모집단에서 적은 백분율의 전구체 세포에서 생성되었다. 이들 뉴런을 사용한 이식 연구는 성장 조절의 손실과 함께 테라토마의 발생으로 이어진 부적절한 신경 유형의 이식 후 발생 관찰에 부가하여 불량한 이식물 생활성 및 DA 유사 뉴런 표현형의 손실을 나타내었다. 도 16 및 17 참조.
구체적으로, P0에서 hESC는 MS5 영양세포를 이용하여 Oct4+ 세포의 로제트 세포로의 신경 유도 개시를 위한 분자와 접촉되었다(Perrier et al., 2004). P1 단계에서 로제트 세포는 세포를 Pax2+/En1+ DA 선조체 세포를 포함하는 특정 발현 패턴을 가지며 TH+/En1+ DA 뉴런으로 추가 분화된 P2 단계의 세포로 분화시키기 위한 추가 분자와 세포의 접촉에 의해 증식되었다. 이들 세포는 시클로스포린 A로 면역억제된 6OHDA 병소의 래트에서 생착을 위해 사용되었다. 이들 이식 연구는 불량한 생체내 생활성, TH+ 표현형의 손실, 원치 않고 치명적일 수 있는 세포, 즉 테라토마로의 추가 성장 및 환자의 추가적인 의학 문제를 야기할 부적절한 신경 유형으로의 세포 성장에 대한 우려를 나타내었다.
로제트 유래 DA 뉴런 전구체로부터의 그래프트에서 이식(< 50 TH+ 세포/동물) 후 4.5개월에 생존 TH+ 뉴런의 수는 매우 적었다(도 16의 A). 그러나 TH+ 세포와는 대조적으로, GFP 표지 세포(GFP는 편재 프로모터에 의해 유도되었음)는 이식 후에도 매우 잘 생존하였다. 이는 이식 후 대부분의 생존 세포가 비-DA 뉴런 정체성의 신경 세포였음을 제시한다(16B). 소수의 그래프트 유래 세포(hNA+(녹색)가 TH(빨강색)를 동시-발현)는 다시 대부분의 그래프트된 인간 세포가 비-DA 뉴런 표현형을 채용함을 제시한다(도 16의 C). 패널 16의 D-E는 D-E가 매우 불량한 생체내 생존에도 불구하고, 소수의(적지만 매우 귀중한) 거동 분석, 예컨대 암페타민 유도 회전(D), 실린더 테스트 및 자발 회전(E)에서 일부 개선이 있었음을 나타낸다. 무-영양세포 신경 유도가 전술된 바와 같이 수행되었으나(Chambers et al., 2009, 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 추가 개질되어 바닥 플레이트 세포를 생성하였다(Fasano et al., 2010, 인용에 의해 본 명세서에 포함됨).
다능성 세포를 바닥 플레이트 세포로 분화시키기 위한 개질 이중-SMAD 억제 방법에서, 본 발명자들은 이전에 고농도의 SHH가 11일에 FP 유도를 위해 필요함을 발견하였다. 예를 들어 일부 구현예에서, Sonic C25II가 200 ng/㎖로 첨가되었다. 일부 실험에서, DKK-1(R&D; 100 ng/㎖) FGF8(R&D; 50 ng/㎖), Wnt-1(Peprotech; 50 ng/㎖) 및 레티노산(R&D; 1 mM)이 첨가되었다(도 17 참조). 그러나 종래의 방법을 이용해서는 11일에 생성 세포 모집단이 본 발명의 방법을 이용한 높은 백분율의 FOXA2+/LMX1A+ 중뇌 바닥 플레이트 선조체 세포를 함유하지 않았다.
Ⅲ. 지정 분화에 사용하기 위한 화합물: 본 발명의 뉴런 계통 세포를 이용한 소분자 스크리닝으로 세포를 배양 11일에 FOX2A+ 및 LIMX1A+ 뉴런 세포로 분화시키는 화합물을 얻었다.
하기 실시예는 소분자 후보 화합물을 스크리닝하고 이들의 사용이 이중-SMAD 억제제와의 초기 접촉 후 11일에 높은 백분율의 중뇌 바닥 플레이트 뉴런을 함유하는 세포 모집단의 지정 분화를 일으킬 것인지에 대해 섹션 I의 예시적 세포를 사용하여 기재된다. 본 스크리닝의 결과는 처음에 SHH 활성화 분자와 FGF8 및 Wnt의 활성화가 분화 11일에 hESC로부터 FOXA2+/LMX1A+ 양성 중뇌 바닥 플레이트 세포의 효율적인 유도를 야기했음을 나타내었다. 본 발명자들은 어느 분자가 필요하며 11일에 원하는 FOXA2+/LMX1A+ 양성 세포 모집단을 유도하기 위한 최적 접촉 시간을 정의하는 예시적 실험의 결과를 본 명세서에 나타낸다.
최근의 마우스의 유전적 연구는 중뇌 DA 뉴런 발생 및 생존에서 전사 인자 FOXA2의 중요한 역할을 나타내었다. 발생 중뇌의 독특한 특징은 바닥 플레이트 마커 FOXA2 및 루프 플레이트 마커 LMX1A의 동시-발현이다. 보통 바닥 플레이트 및 루프 플레이트 세포는 이들의 유도를 위해 정반대로 배치된 패턴화 요건을 가지며 CNS에서 별개의 위치(배쪽 대 등쪽)에 존재한다. 개질된 이중-SMAD 억제 프로토콜을 이용한 hESC로부터의 영역-특이적 바닥 플레이트 전구체의 유도가 최근 설명되었다. 정준 Wnt 신호전달은 루프 플레이트 기능 및 중뇌 DA 뉴런 발생 모두를 위해 중요하였다.
A. CHIR99021(CHIR)은 배양 11일에 고수율의 중뇌 DA 뉴런 전구체 운명을 유도하였다. 본 명세서에 기재된 것과 같은, WNT 신호전달을 강하게 활성화하는 것으로 알려진 강력한 GSK3β 억제제인 CHIR99021(CHIR)에 대한 노출이 FOXA2+ 바닥 플레이트 전구체에서 LMX1A를 유도하였다(도 1의 a). CHIR은 LMX1A 발현 유도에서 재조합 Wnt3A 또는 Wnt1보다 더 강력하였다. LMX1A 유도의 효율은 3-11일에 최대 효과를 가지며 CHIR 노출 시기에 의존하였다(도 5). CHIR은 FOXA2/LMX1A의 동시-발현을 유도한 반면, 다른 인자, 예컨대 FGF8은 약간의 효과만을 가졌다(도 6). FOXA2/LMX1A 동시-발현의 유도에는 소분자 작용제인 푸르모르파민 단독 또는 재조합 SHH와의 조합을 이용한 SHH의 강한 활성화를 필요로 하였다(도 7).
CHIR99021의 부재 하 SHH 작용제(푸르모르파민 + SHH) 및 FGF8(S/F8)을 이용한 처리는 11일에 FOXA2의 훨씬 더 적은 발현 및 LMX1A 발현의 완전 부재를 나타내었다(도 1의 a 및 b). 이중-SMAD 억제(LDN-193189 + SB431542 = "LSB"에 대한 노출)는 FOXA2-발현 세포를 생성하지 않았으나 LMX1A+ 세포 서브세트를 생성하였다(도 1의 a 및 b). 앞쪽 마커 OTX2는 LSB 및 LSB/S/F8/CHIR 처리 배양에서 강하게 유도되었으나, LSB/S/F8 조건 하에서는 그렇지 않았다(도 1의 a 및 c). 세 배양 조건의 체계적 비교(도 1의 d)를 전반적인 시간적 유전자 발현 프로파일링을 이용하여 수행하였다. 상이하게 발현된 유전자의 계통 클러스터링으로 분화 11일에 세 처리 조건을 구분하였다(도 8의 a). FOXA1, FOXA2 및 PTCH1을 포함하는 몇몇 다른 SHH 하류 표적은 LSB/S/F8/CHIR 대 LSB 처리 세트에서 가장 상이하게 조절되는 전사체에 속했다(도 1의 e). LMX1A, NGN2, 및 DDC의 발현은 11일에 이미 중뇌 DA 뉴런 전구체 운명의 확립을 시사하였다(도 1의 e 및 f). 대조적으로 LSB 배양은 등쪽 전뇌 전구체 마커, 예컨대 HES5, PAX6, LHX2, 및 EMX2에 대해 농축되었다. LSB/S/F8/CHIR 대 LSB/S/F8 처리(도 1의 f)의 직접 비교는 LSB/S/F8/CHIR군에서 중뇌 DA 전구체 마커의 선택적 농축을 확인시켰으며, RAX1, SIX3, 및 SIX6의 상이한 발현에 기반한 LSB/S/F8 처리 배양에서의 시상하부 전구체 정체성을 제시하였다(또한 하기 도 2의 d에서 POMC, OTP 발현을 참조). 표 1, 2 및 유전자 존재 분석도 8b(DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov)의 상이하게 발현되는 전사체의 전체 목록은 CHIR 처리 시 정준 WNT 신호전달에 대한 농축을 확인시켰다. 원본 데이터는 아직 GEO에서 이용할 수 없다(worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ accession#: [TBD]). 중뇌 DA 전구체 마커(도 1의 g) 대 앞쪽 및 배쪽 비-DA 뉴런 운명의 마커(도 1h)에 대한 유전자 발현의 시간적 비교 분석은 세 유도 조건을 다음으로 나누었다: ⅰ) LSB: 등쪽 전뇌; ⅱ) LSB/S/F8: 배쪽/시상하부 및 ⅲ) LSB/S/F8/CHIR: 중뇌 DA 전구체 정체성.
본 발명의 개발 동안 유도된 프로토콜로 생성된 세포를 종래의 방법에서 유도된 세포와 비교하였다. 본 발명의 SHH/FGF8+CHIR 처리 세포에 대한 예시적 시각 비교를 위해 도 2 및 도 18을 참조. 도 19의 A는 LSB/S/F8/CHIR 처리(상부 패널) 및 TH, Nurr1 및 LMX1A로 공동 표지된 F0XA2(하부 패널) 후 FOXA2/Tuj1 이중 표지된 세포의 예를 나타낸다. 이들 마커 조합은 초기 단계 중뇌 DA 뉴런 전구체를 진단한다. 도 19의 B는 주요 도파민 뉴런 전구체 마커에 대한 유전자 발현 데이터를 나타낸다(도 2의 E에 대한 비교를 위해).
일반적으로 본 명세서에서 사용된 재료 및 방법이 기재된다: 인간 ESC(H9, H1) 및 iPSC 주(2C6 및 SeV6)에 개질 이중 SMAD-억제(Chambers et al., Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 기반 바닥 플레이트 유도(Fasano et al., Cell Stem Cell 6:336-347 (2010), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 프로토콜을 거쳤다. SHH C25II, 푸르모르파민, FGF8 및 CHIR99021에 대한 노출을 중뇌 바닥 플레이트 및 DA 뉴런의 신규 모집단의 수율에 대해 최적화하였다(도 1의 d 참조). 바닥 플레이트 유도 후, DA 뉴런 생존 및 성숙 인자(Perrier et al., Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨), 예컨대 AA, BDNF, GDNF, TGFβ3 및 dbcAMP(상세 내용에 대해서는 전체 방법을 참조)의 존재 하에 Neurobasal/B27에 기반한 분화 배지 중에서 추가 성숙(배양 중 11-25일 또는 25일 이상에서 배양 중 적어도 100일까지)을 수행하였다. 생성 DA 뉴런 모집단에 도파민 검출 및 시험관내 전기생리학적 기록을 위한 면역세포화학, qRT-PCR, 전체적 유전자 발현 프로파일링, HPLC 분석을 통해 광범위한 표현형 특성분석을 수행하였다. 반-파킨슨 설치류(동물 뇌의 한 쪽에 6OHDA 독소를 주입한 마우스 또는 래트)에서 생체내 연구를 수행하였다. 연구는 종래에 기재된 것과 같이 독소의 정위적 주입에 의해 6-히드록시도파민 병소를 얻게 된 성체 NOD-SCID IL2Rgc 마우스(Jackson labs) 및 성체 스프라그 도울리 래트(Taconic Farms)뿐만 아니라 MPTP의 한쪽 경동맥 주입으로 처리된 두 마리의 성체 레서스 원숭이에서 수행하였다.
DA 뉴런을 동물의 줄무늬체에 정위적으로(마우스에서 150×103 세포, 래트에서 250×103 세포) 및 원숭이에서 전체 7.5×106 세포(6 트랙으로 분포됨; 뇌 각 측에 3개씩) 주입하였다. 그래프트 후 월별 간격으로 암페타민 매개 회전 분석뿐만 아니라 국소 운동불능("보행 테스트") 및 다리 사용(실린더 테스트) 테스트를 포함하는 거동 분석을 수행하였다. 래트 및 마우스는 그래프팅 후 18-20주 및 영장류는 1개월에 희생시켰다. 세포수 및 그래프트 부피의 입체적 분석을 통해서 뿐만 아니라 면역조직화학을 통한 포괄적 표현형 특성분석으로 그래프트의 특성분석을 수행하였다.
미분화 인간 ES 세포의 배양. hESC 주 H9(WA-09, XX, 10/2009부터 27-55계대), H1(WA-01, XY, 6/2010부터 30-40계대) 및 iPS 세포주 2C6(Kim et al., Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)(XY, 20-30계대) 및 SeV6(XY, 20-30계대; 비통합 4 인자 Sendai 벡터 시스템(Ban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011) 108(34):14234-14239:10.1073/pnas.1103509108, 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)을 이용한 MRC-5 배아 섬유아세포 유래)을 세포가 클러스터되는 경향을 갖는 인간 ES 세포 기반의 0.5×103/㎠ 내지 100×103/㎠ 범위로 추정되는 플레이팅 농도로 최적 20% 녹아웃(knockout) 혈청 대체물(KSR, Invitrogen, Carlsbad, California)-함유 인간 ES 세포 배지(종래에 기재된 것과 같이(Kim et al., Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 중에서 마우스 배아 섬유아세포 상에 유지하였다(MEF, Global Stem, Rockville, MD). 녹아웃 혈청 대체물의 사용은 0% 내지 40% 범위일 수 있다.
신경 유도. 바닥 플레이트-기반 중뇌 도파민 뉴런 유도를 위해, 개질된 버전의 이중-SMAD 억제(Chambers et al., Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 및 바닥 플레이트 유도(Fasano et al., Cell Stem Cell 6:336-347 (2010), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 프로토콜을 LDN-193189(100 nM(0.5-50 μM 농도 범위), Stemgent, Cambridge, Massachusetts), SB431542(10 μM(0.5-50 μM 농도 범위), Tocris, Ellisville, MI), SHH C25II(100 ng/㎖(10-2000 ng/㎖ 농도 범위), R&D, Minneapolis, MN), 푸르모르파민(2 μM(10-500 ng/㎖ 농도 범위), Stemgent), FGF8(100 ng/㎖(10-500 ng/㎖ 농도 범위), R&D) 및 CHIR99021(CHIR; 3 μM(0.1-10 μM 농도 범위), Stemgent)에 대한 시간이 정해진 노출에 근거해서 이용하였다.
바닥 플레이트 유도 프로토콜에 있어서, "SHH" 처리는 노출, 즉 세포의 SHH C25II 100 ng/㎖ + 푸르모르파민(2 μM)의 조합으로의 접촉을 나타낸다. 세포를 플레이팅하고(35-40×103 세포/㎠) DMEM, 15% 녹아웃 혈청 대체물, 2 mM L-글루타민 및 10- μM(1-25 μM 농도 범위) β-메르캅토에탄올을 함유하는 녹아웃 혈청 대체 배지(KSR) 중에서 매트리겔 또는 겔트렉스(구매하여 사용)(BD, Franklin Lakes, New Jersey) 상에 11일 동안 배양하였다. KSR 배지를 종래에 기재된 것과 같이(Chambers et al., Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 5-6일에 75%(KSR):25%(N2), 7-8일에 50%(KSR):50%(N2) 및 9-10일에 25%(KSR):75%(N2)의 비로 혼합하여 분화 5일부터 시작해서 N2 배지로 점진적으로 변경하였다. 11일에 배지를 CHIR(13일까지) 및 BDNF(뇌유래 신경영양 인자, 5 내지 100 범위의 20 ng/㎖; R&D), 아스코르브산(AA; 0.2 mM(0.01-1 mM 농도 범위), Sigma, St Louis, MI), GDNF(신경아교 세포주 유래 신경영양 인자, 20 ng/㎖(1-200 ng/㎖ 농도 범위); R&D), TGFβ3(전환 성장 인자 유형 β3, 1 ng/㎖(0.1-25 ng/㎖ 농도 범위); R&D), 디부티릴 cAMP(0.5 mM(0.05-2 mM 농도 범위); Sigma), 및 DAPT(10 nM(0.5-50 nM 농도 범위); Tocris)로 보강된 배지(NB/B27; Invitrogen)를 함유하는 Neurobasal 배지/B27 배지(1:50 희석)/L-Glut(유효 범위 0.2-2 mM)로 9일 동안 교환하였다. 20일에, 세포를 Accutase®(Innovative Cell Technology, San Diego, California)를 이용하여 해리하고 주어진 실험을 위해 원하는 성숙 단계까지 분화 배지(NB/B27 + BDNF, AA, GDNF, dbcAMP(본 명세서에 기재된 것과 같은 농도 범위), TGFβ3 및 DAPT(본 명세서에 기재된 것과 같은 농도 범위) 중에서 폴리오르니틴(PO); 15 ㎍/㎖(1-50 ㎍/㎖ 농도 범위)/라미닌(1 ㎍/㎖)(0.1-10 ㎍/㎖ 농도 범위)/피브로넥틴(2 ㎍/㎖(0.1-20 ㎍/㎖ 농도 범위))으로 사전 코팅된 디쉬 상에 높은 세포 밀도 조건(예를 들어 300-400k 세포/㎠) 하에 재플레이팅하였다.
로제트-기반 DA 뉴런 유도를 위해, 초기 신경 유도 단계를 가속화하기 위해 이중-SMAD 억제를 이용한 적어도 한 예외를 포함하여 종래에 기재된 프로토콜을 부분적으로 따랐다(Perrier et al., Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 요약하면, 2-8일부터 SB431542 및 Noggin(250 ng/㎖(10-1000 ng/㎖ 농도 범위); R&D)이 그리고 분화 6-11일부터 SHH+FGF8이 보강된 KSR 중에 hESC를 조사된 MS5 세포와 공동 배양하여 신경 운명으로 유도하였다. KSR 중에서 11일 후, 신경 로제트를 수동으로 단리하고 종래에 기재된 것과 같이(Perrier et al., Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) SHH, FGF8, BDNF 및 AA가 보강된 N2 배지 중에서 배양하였다(P1 단계). P1 단계에서 5-7일 후, 로제트를 다시 기계적으로 수확하고 1h 동안 무-Ca2/Mg2 Hanks 균형 염 용액(HBSS) 중에서의 인큐베이션 후 분쇄하고 폴리오르니틴(PO)/라미닌/피브로넥틴 코팅 플레이트 상에 재플레이팅하였다. SHH/FGF8을 이용한 패턴화를 P2 단계에 7일 동안 계속한 뒤 주어진 실험에 대해 원하는 성숙 단계까지(전형적으로 이식 연구를 위해서는 5-7일 또는 시험관내 기능 연구를 위해서는 32일) 상술된 바와 같이 BDNF, AA, GDNF, TGFβ3 및 dbcAMP의 존재 하에 최종 분화시켰다.
유전자 발현 분석. 전체 RNA를 분화 동안 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 25일에 RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 대조군 LSB, LSB/SHH/FGF8 및 LSB/SHH/FGF8/CHIR의 각 조건으로부터 추출하였다. 마이크로어레이 분석을 위해, 전체 RNA를 MSKCC 게놈 코어 시설에서 처리하고 제조업체의 명세에 따라 Illumina 인간 ref-12 비드 어레이 상에서 혼성화하였다. Bioconductor(worldwideweb.bioconductor.org)의 LIMMA 패키지를 이용하여 각각의 날과 조건 간에 비교를 수행하였다. 유전자들은 조정된 P-값 < 0.05를 갖는 것으로 나타났으며, 2 이상의 배율 변화가 유의미한 것으로 간주되었다. 시판 소프트웨어 패키지(Partek Genomics Suite(version 6.10.0915))를 이용하여 일부 기술적 마이크로어레이 데이터 분석 및 프레젠테이션을 수행하였다. qRT-PCR 분석을 위해, 각 조건의 25일에 전체 RNA를 역전사하고(Quantitech, Qiagen) 증폭된 재료를 시판 Taqman 유전자 발현 분석(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)을 이용하여 검출하고 데이터를 HPRT에 대해 표준화하였다. 각각의 데이터 포인터는 3개의 독립적인 생물학적 표본의 9개 기술적 복제물을 나타낸다. 마이크로어레이 연구의 원본 데이터는 아직 GEO에서 이용할 수 없다(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).
동물 수술. 설치류 및 원숭이 절차는 NIH 가이드라인에 따라 수행되었으며 현지 기관 동물 케어 및 사용 위원회(IACUC), 기관 생물안전성 위원회(IBC)뿐만 아니라 배아 줄기 세포 연구 위원회(ESCRO)의 승인을 받았다.
마우스. NOD-SCID IL2Rgc 눌 마우스(체중 20-35g; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)를 케타민(90 ㎎/kg; Akorn, Decatur, IL) 및 자일라진(4 ㎎/kg; Fort Dodge, IA)으로 마취하였다. 6-히드록시도파민(10 ㎍(1-20 ㎍ 농도 범위) 6-OHDA(Sigma-Aldrich)를 하기 좌표에서(밀리미터들) 줄무늬체 내로 정위적으로 주사하였다: AP, 0.5(정수리점; 두개 봉합을 정위적 수술에 대한 참조로 이용하였다); ML, -2.0; DV, -3.0(참조로 사용되는 뇌를 덮는 경질막으로부터). 성공적인 병소(> 평균 6회전/분)를 갖는 마우스가 이식을 위해 선택되었다. 전체 150×103 세포를 다음 좌표(㎜)에서 줄무늬체 내로 1.5 ㎕의 부피로 주사하였다: AP, 0.5; ML, -1.8; DV, 3.2. 마우스를 이식 후 18주에 희생시켰다.
래트. 성체 자성 스프라그 도울리(Taconic, Hudson, NY) 래트(180-230g)를 수술 절차 동안 케타민(90 ㎎/kg) 및 자일라진(4 ㎎/kg)으로 마취하였다. 흑질-줄무늬체 경로의 한쪽의 안쪽 전뇌 다발 병소들은 두 부위에서 6-OHDA(0.2% 아스코르브산 및 0.9% 식염수 중 3.6 ㎎/㎖, Sigma)의 정위적 주사에 의해 확립하였다(Studer et al., Nature Neurosci. 1:290-295 (1998), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 래트들은 주사 후 6-8주에 암페타민-유도 회전이 6회전/분을 넘어서는 경우 이식을 위해 선택되었다. 250×103 세포를 각 동물의 줄무늬체 내로 이식하였다(좌표: AP +1.0 ㎜, ML -2.5 ㎜ 및 V-4.7 ㎜; 투쓰바(toothbar)는 -2.5에 설정됨). 대조군 래트들은 대신 PBS를 주사받았다. 수술 절차들은 전술되었다(Studer et al., Nature Neurosci. 1:290-295 (1998), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 시클로스포린 15 ㎎/kg(Bedford Labs, Bedford, OH)의 매일의 복강 내 주사를 세포 그래프팅 전 24시간부터 시작하여 세포 그래프팅 후 20주에 희생시킬 때까지 계속하였다. 영장류. 두 성체(17-18세령; 10-12kg; 자성) 레서스 원숭이를 경정맥 MPTP 투여를 통해 반파킨슨증으로 만든 후 주 1회 I.V. MPTP 투여로 양쪽성 파킨슨 증후군을 일으켰다(Kordower et al., Science 290:767-773 (2000), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 두 동물 모두 구부정한 자세, 다리 끌기 및 경련 증상들(운동의 비유연성), 무시(한쪽 지배 자극에 대한 운동 인지) 및 운동완만증(느린 운동 개시)를 포함하는 거동 분석에 기반한 중등도-중증도 병소와 일치하는 파킨슨 증상을 나타내었다. 이들 파라미터를 개질된 파킨슨 임상 등급 척도(CRS)를 이용하여 원숭이에서 평가하였다. 이식 수술 당일에 동물을 케타민(3.0 ㎎/kg, IM) 및 덱스도미토르(0.02-0.04 ㎎/kg, IM)로 진정시키고, 안정한 기도를 유지하기 위해 삽관하고 이소플루란으로 마취했다. 이어서 이들을 수술을 위해 정위 프레임 내에 놓았다. 두 레서스 원숭이에 정위 좌표에 기반한 인간 바닥 플레이트 유래 DA 배양물의 3회 두개 내 주사로 단회 수술을 거쳤다(Paxinos et al., The Rhesus Monkey Brain in Stereotaxic Coordinates(Academic Press, 2000), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 세포(10 ㎕/주사; 125,000세포/㎕)의 양쪽 주사를 반구 별로 30 ㎕의 전체 부피에 대해 3개 부위(1-뒤쪽 미상엽, 2-교차 앞 조가비궁 및 백질 덮개)에서 수행하였다. 정위 미세조작장치에 부착된 주입 펌프를 이용하여 세포를 28G 바늘을 갖는 50 ㎕ 해밀턴 주사기를 통해 1 ㎕/분의 속도로 세포를 전달하였다. 주사를 완료한 후, 바늘을 추가 2-5분 동안 자리에 두어 주입물이 주사기로 느리게 되돌아오기 전에 바늘 팁에서 확산하도록 했다. 수술 직후, 동물에 수술 후 72시간까지 진통제(부프레넥스, 0.01 ㎎/kg, IM, 수술 후 72시간 동안 BID; 멜록시캄, 0.1 ㎎/kg SQ, 수술 후 72시간 동안 SID)뿐만 아니라 항생제(세파졸린, 25 ㎎/kg IM, BID)를 수여했다. 동물은 수술 전 48시간부터 시작해서 이식 후 1개월에 희생시킬 때까지 1일 1회 경구로(30 ㎎/kg부터 15 ㎎/kg까지 줄이며) 시클로스포린 A(Neoral, Sandimmune)를 수여받았다.
거동 분석. 암페타민-유도 회전(마우스 및 래트) 및 보행 테스트(래트)를 이식 전 및 이식 후 4, 8, 12, 18주에 수행하였다. 마우스에서의 회전 거동을 d-암페타민(10 ㎎/kg, Sigma)의 i.p. 주사 후 10분에 기록하고 30분 동안 기록하였다. 래트에서의 회전 거동을 d-암페타민(5 ㎎/kg)의 i.p. 주사 후 40분에 기록하고 TSE VideoMot2 시스템(Germany)으로 자동 평가하였다. 데이터를 분 당 평균 회전수로 나타내었다. 보행 테스트는 모두 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 [Blume et al., Exp. Neurol. 219:208-211 (2009)] 및 [Crawley et al., What's Wrong With My mouse: Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice(Wiley- Liss, 2000)]에서 개질되었다. 요약하면, 각각의 래트를 편평한 표면 상에 두었다; 꼬리를 가볍게 위로 들어서 그 뒷다리를 들어올려 앞발만 테이블을 터치할 수 있도록 했다. 실험자는 일정한 페이스로 래트를 뒤로 1미터 당겼다. 대측성(contralateral) 및 동측성(ipsilateral) 앞발 모두의 조정 단계수를 계수하였다. 데이터를 대측성/(대측성 + 동측성) 조정 단계의 백분율로 나타내었다. 각 동물을 유리 실린더에 넣고 전술된 바와 같이 실린더 벽에 대한 동측성 대 대측성 발 터치의 수를(20터치 중에서) 계수하여 실린더 테스트를 수행하였다(Tabar et al., Nature Med. 14:379-381 (2008), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 설치류 및 영장류에 대한 조직 처리는 다음에 기재된다.
마우스 및 래트: 동물(마우스 및 래트)에 과량의 벤토바르비탈을 복강 내(50 ㎎/kg) 투여하여 깊은 마취를 유도하고 4% 파라포름알데히드(PFA) 중에서 관류시켰다. 뇌를 추출하고, 4% PFA 중에 후-고정한 뒤 2-5일 동안 30% 수크로오스 용액 중에 침지시켰다. 이들을 O.C.T. 화합물(Sakura-Finetek, Torrance, California) 중에 임베딩한 뒤 저온유지장치 상에서 절편 절개하였다.
영장류: 헤파린 첨가 0.9% 식염수에 이어 신선한 저온 4% PFA 고정제(pH 7.4)를 이용한 심장 관류를 통해 케타민(10 ㎎/kg, 근육내(IM)) 및 펜토바르비탈(25 ㎎/kg, 정맥내(IV))로 깊은 마취 하에 동물을 희생시켰다. 일차 고정 직후 뇌를 두개에서 제거하고 4% PFA 중에 후-고정하고, 24-36시간 동안 자유 부유시켰다. 이어서 이들을 헹구고 4℃의 저속 진탕기 상에서 10% 수크로오스 중에 재현탁하여 "가라앉도록" 놔두었다. 이어서 20% 수크로오스, 이어서 30% 수크로오스로 절차를 반복하였다. 전뇌를 냉동 슬레지 마이크로톰 상에서 40 ㎛ 연속 절편들로 관상 절단하고 섭씨 -20℃에서 냉동 보존 배지 중에 자유 부유하도록 보관하였다.
면역조직화학: 세포를 4% PFA 중에 고정하고 0.3% Triton 함유 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단하였다. 뇌 조직 절편을 저온 PBS 중에 세척하고 유사하게 처리하였다. 일차 항체를 1-5% BSA 또는 일반 염소 혈청 중에 희석하고 제조업체의 권고사항에 따라 인큐베이션하였다. 항체 및 공급원의 종합 목록을 표 6에 제공한다. 적절한 Alexa488, Alexa555 및 Alexa647-공액 이차 항체(Molecular Probes, Carlsbad, California)를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 핵 카운터염색(Thermo Fisher, Rockford, Illinois)과 함께 이용하였다. 일부 분석을 위해 바이오틴화 이차 항체를 이용한 뒤 DAB(3,3'-디아미노벤지딘) 색소원으로 가시화하였다.
HPLC 분석. 도파민, 호모바니린산(HVA) 및 DOPAC(3,4-디히드록시-페닐아세트산) 수준을 측정하기 위한 전기화학적 검출과 역상 HPLC를 전술된 바와 같이 수행하였다(Roy et al., Nature Med. 12:1259-1268 (2006); Studer et al., Brain Res. Bull. 41:143-150 (1996), 이들 모두가 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 배양 표본을 분화 65일에 과염소산 중에 수집하였다. 일부 실험을 위해, 동일한 검출 시스템을 이용하지만 전술된 바와 같은 시판 키트를 이용하여(Studer et al., Brain Res. Bull. 41:143-150 (1996), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 도파민 및 그 대사물질의 알루미늄 추출 후 DA를 배지 중에서 직접 측정하였다.
전기생리학적 기록: 배양물을 40X수침 대물렌즈(Eclipse E600FN; Nikon)가 장착된 업라이트 현미경 상의 기록 챔버로 옮겼다; 배양물을 하기 mM을 함유하는 식염수로 관류하였다: 125 NaCl, 2.5 KCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 2 CaCl, 1 MgCl2, 및 25 글루코오스(34℃; 95% O2-5% CO2로 포화됨; pH 7.4; 298mOsm/L). 식염수 유속은 인라인 히터(TC-324B 컨트롤러를 포함하는 SH-27B; Warner Instruments)를 통해 흐르는 2-3 ㎖/분이었다. 뉴런을 냉각-CCD 디지털 카메라(CoolSNAP ES2, Photometries, Roper Scientific, Tucson, Arizona)를 이용한 비디오 현미경으로 가시화하였다. 전기생리학적 기록을 위해 선택된 세포는 미세 분기 신경돌기를 갖는 뉴런 유사 형태들을 가졌다. MultiClamp 700B 증폭기(Molecular Devices)로 전류 클램프 구성에서 체세포 전세포 패치 클램프 기록을 수행하였다. 신호를 1-4kHz에서 필터링하고 Digidata 1440A(Molecular Devices)로 5-20kHz에서 디지털화하였다. 기록 패치 전극을 Flaming-Brown 당김장치(P-97, Sutter Instruments) 상에서 당긴 필라멘트화 보로실리케이트 유리(Sutter Instruments)로 제작하였고, 조 내에서 4-6MΩ의 저항을 가졌다. 전극에 하기 mM을 함유하는 내부 용액을 충전하였다: 135 K-MeSO4, 5 KCl, 5 HEPES, 0.25 EGTA, 10 포스포크레아틴-디(트리스), 2 ATP-Mg, 및 0.5 GTP-Na(pH 7.3, 290-300mOsm/L로 조정된 삼투압). 증폭기 가교 회로를 전극 저항을 보상하도록 조정하고 모니터링하였다. 전기 정전용량을 보상하였다. 증가된 저항은 기록 동안 부분적인 기술적 실패를 제시하였으므로, 기록 동안 직렬 저항이 >20% 증가하면 데이터를 폐기하였다.
세포 계수 및 정위적 분석. 바닥 플레이트(11일)의 마커 양성 세포 백분율. 도 1, 중뇌 도파민 뉴런 전구체(25일), 도 2 및 성숙한 DA 뉴런 단계(50일 또는 그 이후). 도 3 및 도 11은 각각 적어도 3개의 독립적 실험에서 유래한 표본에서 결정하였다. 정량을 위한 이미지를 먼저 균일한 무작위 방식으로 선택하였고, 각 이미지를 DAPI-양성 핵의 수에 대해 점수매긴 뒤 관심 마커를 발현하는 세포의 수를 계수하였다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다. 그래프트가 확인 가능한 10개 절편들마다 그래프트 내의 인간 세포(항-hNA로 확인) 및 TH+ 뉴런의 정량을 수행하였다. [Tabar et al., Nat. Biotechnol. 23:601-606 (2005), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨]에 전술된 바와 같이 Stereo Investigator 소프트웨어(MBF bioscience, Vermont)를 이용하여 광학 분할기 탐침 및 Cavalieri 평가자를 이용해서 세포 계수 및 그래프트 부피를 결정하였다. 데이터는 추산된 전체 세포 수 및 전체 그래프트 부피±평균의 표준 편차(SEM)로 나타낸다.
하기 제형은 본 발명의 구현예들의 개발에 사용하기 위한 예시적 세포 배양 배지를 설명한다.
유지용 hESC 배지(1 리터): 800 ㎖ DMEM/F12, 200 ㎖ 녹아웃 혈청 대체물, 5 ㎖의 200 mM L-글루타민, 5 ㎖ Pen/Strep, 10 ㎖의 10 mM MEM 최소 비필수 아미노 15 산 용액, 55 μM 13-메르캅토에탄올, 및 bFGF(최종 농도는 4 ng/㎖).
hESC 분화용 KSR 배지(1 리터): 820 ㎖ 녹아웃 DMEM, 150 ㎖ 녹아웃 혈청 대체물, 10 ㎖의 200 mM L-글루타민, 10 ㎖ Pen/Strep, 10 ㎖의 10 mM MEM, 및 55 μM 13-메르캅토에탄올.
hESC 분화용 N2 배지(1 리터): 985 ㎖의 DMEM/F12 분말 함유 증류수, 1.55g 글루코오스(Sigma, cat. no. G7021), 2.00g 나트륨 비카르보네이트(Sigma, cat. no. S5761), 푸트레신(100 ㎖ 증류수에 용해된 1.61g의 분취량 100 ㎕; Sigma, cat. no. P5780), 프로게스테론(100 ㎖ 100% 에탄올에 용해된 0.032g의 분취량 20 ㎕; Sigma, cat. no. P8783), 나트륨 셀레나이트(증류수에 용해된 0.5 mM 용액의 분취량 60 ㎕; Bioshop Canada, cat. no. SEL888), 및 100 ㎎ 트랜스페린(Celliance/Millipore, cat. no. 4452-01), 및 10 ㎖의 5 mM NaOH 중 25 ㎎ 인슐린(Sigma, cat. no. 16634).
PMEF(일차 마우스 배아 섬유아세포(PMEF) 영양세포) 제조용 10% FBS 함유 Dulbecco의 개질 Eagles 배지(DMEM)(1 리터): 885 ㎖ DMEM, 100 ㎖ FBS, 10 ㎖ Pen/Strep, 및 5 ㎖ L-글루타민.
MS-5 영양세포 배지 제조용 10% FBS 함유 알파 최소 필수 배지(MEM)(1 리터): 890 ㎖ 알파 MEM, 100 ㎖ FBS, 10 ㎖ Pen/Strep 젤라틴 용액(500 ㎖): 0.5g 젤라틴을 따뜻한(50-60℃) Milli-Q수 500 ㎖ 중에 용해시킨다. 실온으로 냉각한다.
일반적으로 다음은 그래프팅에 사용하기 위한 성숙한 DA 뉴런의 생성을 모니터링하는 예시적 방법의 간략한 요약이다(또한 표 7에 나타낸 조건 참조). 13일은 FOXA2/LMX1A의 동시-발현을 특징으로 하는 중뇌 바닥 플레이트 단계이다. FOXA2 및 LMX1A의 발현에 부가하여, OCT4 발현 상실 및 전뇌 마커 PAX6 및 FOXG1의 유도 부재가 확인된다. 25일은 FOXA2/LMX1A의 연속적 발현 및 뉴런(TUJ1) 및 DA 마커(NURR1, TH)의 발현을 특징으로 하는 중뇌 DA 뉴런 전구체 단계이다. 그 마커들이 바람직하지 않은 증식하는 Ki67+ 세포 및 PAX6 및 FOXG1 전뇌 신경 전구체의 수를 모니터링한다. 면역형광 데이터의 편향되지 않은 신속한 정량을 위해, Operetta(Perkin Elmer) 하이 컨텐츠 현미경을 측정에 이용하였다. 또한 면역형광 데이터를 확인하기 위해 각 마커에 대해 qRT-PCR 분석을 이용하였다. 일부 구현예에서, 이들 예비 시험관내 평가를 통과한 세포주(배양물)를 생착에 사용한다(표 7 참조). 일부 구현예에서, 성숙한 DA 뉴런을 생착에 사용하기 위해 해동할 때까지 배양 배지 + 7% DMSO(3%-12% 범위) 중에서 25일에(20일-25일 범위) 혈청 없이 동결보존하였다. 일부 구현예에서, 세포 표본을 액체 질소 중에 보관한다. 일부 구현예에서, 세포를 저온 냉동고에 보관한다. 다른 구현예에서, 동결보존제, 예컨대 미오이노시톨, 폴리비닐 알코올, 혈청 대체물, 카스파아제 억제 화합물이 DMSO에 부가하여 사용에 고려된다. 해동 후 세포를 생착에 사용하기 전에 생활성, 마커 발현 등에 대해 평가한다. 일부 구현예에서, 해동된 세포를 냉동 및 보관 조건을 모니터링하기 위해 장기간 시험관내 및 생체내 분석에서의 기능 유지에 대해 평가하였다.
B. 기능성 DA 뉴런의 생성을 위한 추가 인자를 확인하기 위한 연구. 조직 배양 성분에 대한 추가 "배제" 및 "첨가" 실험이 본 발명의 세포 생성에 사용하기 위해 고려된다. 예를 들어, FGF8은 그 사용이 본 발명의 세포를 생성하였지만 이들 세포의 생성에 필수적이지 않은 것으로 나타났다. 이들 실험은 본 발명의 DA 뉴런 세포를 생성한 네 가지 "코어 분자", 즉 ⅰ) Alk4/5/7("TGFβ-)억제제(SB431542), ⅱ) Alk2/3("BMP")-억제제(LDN-193189), ⅲ) Smoothened("SHH")-작용제(푸르모르파민), 및 ⅳ) GSK3β-억제제(CHIR99021)와 함께 세포 배양물에 대한 첨가제로서의 추가 시약, 예컨대 표 8에 기재된 것들로 확장될 것이다.
본 명세서에 기재된 것과 같이, SB431542 및 LDN193189의 사용은 다능성 줄기 세포의 효율적인 신경 전환을 나타낸 반면, 이들 세포에 대한 푸르모르파민 및 CHIR99021의 첨가는 중뇌 바닥 플레이트 유도를 나타내었다. 장기적인 영양 지원을 제공하고/하거나 분화를 가속화하기 위해 다른 화학물질 및 재조합 단백질이 사용되었거나 사용될 수 있다. 이들 화합물 중 일부가 본 명세서에 기재된 세포 분화에서 이들의 역할을 정의하기 위해 추가 평가에서 이용될 것이다.
이들 실험을 위해, 다른 화합물의 성능을 DA 뉴런 분화를 위한 예시적 제한(표 7) 대 4-코어 인자의 사용(표 8)에 대해 비교할 것이다.
이들 유형의 실험은 본 발명의 진정한 DA 뉴런 세포를 생성하는데 필요한 최소 수의 인자를 정의하기 위해 고려된다.
C. 증식 오염물(다능성 hESC, 신경 로제트)의 가능성에 대한 용량 반응 곡선의 구축을 위한 구현예. 본 발명의 개발 동안, 생체내에서 적어도 5개월 생존 시까지 그래프트 내에서 테라토마 또는 과도한 과성장은 관찰되지 않았다. 인간에서 그래프트의 고려 수명을 반영하기 위한 장기간 연구에 대한 안전성을 모니터링하기 위해, 문제성 세포 유형, 예컨대 상당한 증식이 가능한 테라토마 또는 원시 신경외배엽 전구체로 발생할 수 있는 미분화 hESC의 임상적으로 관련된 오염 제한을 결정하기 위해 세포 수 역치를 고려한다. 따라서 일부 구현예는 그래프트에 사용하기 위한 세포에서 도파민성 뉴런의 추가 농축, 즉 생착 전 오염 세포 유형의 결핍을 고려한다(예시적 제한에 대해서는 표 7 참조).
하기에서는 증강 전략의 검증을 위한 분석 중 추가물의 예시적 표준화 세트를 기재한다. hESC에 있어서, 미분화 (Oct4+/Nanog+) 세포와 hES 유래 DA 뉴런의 소정 혼합물을 이용하여 동물 실험에서 질량 효과 및/또는 동물 사망을 제시하는 임상적 증상을 모니터링할 것이다. 10,000 hESC 유래 DA 세포 당 하나의 hES 세포의, 1/5000, 1/1000 및 1/100의 hES 세포의 용량 반응을 수행할 것이다. 세포를 줄무늬체 내로 주사하고 동물에게 면역억제제를 수여할 것이다. 래트는 면밀히 모니터링되고 최대 6개월 또는 신경학적 증상의 발현 시 희생될 것이다. 뇌를 본 명세서에 기재된 것과 같은 그래프트 부피 및 조성에 대해 분석할 것이다. 테라토마의 출현에 대해 명확한 생체내 역치가 구축될 때까지 세포 비를 조정할 것이다. 원시 신경외배엽 전구체의 오염 수준을 결정하기 위해, 유사한 전략을 따를 것이다. 초기 신경 전구체의 존재는 중추신경계 뿐만 아니라 말초신경계(PNS) 운명으로의 분화 및 증식에 대해 상당한 가능성을 가진다. 그래프트 분석은 로제트 세포(PLZF 발현), 이들의 CNS 자손(Nestin/Sox2를 발현하는 신경 전구체 또는 FoxG1을 발현하는 전뇌 전구체)에 대한 IHC뿐만 아니라 그래프트 부피 및 증식 지수(전체 생존 세포의 Ki67+%)로 구성될 것이다.
Ⅳ. 파킨슨 질환
파킨슨 질환(PD)은 두 번째로 가장 흔한 신경퇴행성 질병이며, 전세계적으로 410만 내지 460만 명의 환자에 영향을 미치는 것으로 추정되고, 그 수는 2030년까지 2배 이상 될 것으로 예측된다. 이것은 알츠하이머 질환 다음으로 두 번째 가장 흔한 신경퇴행성 질병이며, 미국에서 대략 100만 명의 환자에 영향을 미치고, 매년 60,000명의 새로운 환자가 진단된다. 상기 질환은 주된 사회경제적 충격을 갖고, 심각한 이환율 및 사망률을 초래하며, 건강 관리 비용 및 수입의 손실을 포함하는 PD의 직간접적인 비용을 조합하면 미국에서만 매년 대략 250억 달러가 될 것으로 추정된다. 현재, 파킨슨 질환(PD), 연령-관련 점진적 장애에 대한 치료는 없다. PD는 병리학적으로 흑색질에서의 중뇌 DA 뉴런의 선택적 손실에 의해 특정된다. 따라서, PD의 근본적인 특성은 중뇌 도파민(DA) 뉴런의 점진적이고, 심각하며, 비가역적으로 손실되어 최종적으로 모터 기능장애(dysfunction)의 장애가 생기는 것이다. PD에 대한 약리학적, 운동 기반의, 유전자 및 외과 치료가 개발되었지만, 이들 접근법 중 어느 것도 올바른 DA 뉴런 기능을 회복시킬 수 없다. 환자에서 모터 증상을 장기간 조절하는 것은 종종 차선으로 남아 있고, 중요한 점진적 비-도파민 반응성 모터 및 비-모터 증상을 인식하지만, 장기간 도파민-반응성 증상 조절의 근본적인 이슈는 비판적인 치료가 필요한 영역으로 남아 있다. 중추 및 말초 신경계 모두에 영향을 미치는 광범위한 병리학이 PD에서 인식되며, PD의 가장 중요한 특징(운동완만증, 경직 및 부분적 경련)은 근본적으로 DA 뉴런 세포의 손실과 연관되고, 도파민-반응성이다. 따라서, PD는 상기 질환의 대부분의 모터 증상에 대한 원인이 되는 중뇌 DA 뉴런의 다소 선택적인 결실로 인하여 뉴런 세포 교체를 이용한 처리가 고려된다. 건강한 인간 뇌는 대략 백만 개의 DA 뉴런을 갖고 있다. 따라서, 한 구현예에서, DA 뉴런 교체는 CNS에서의 대부분의 다른 질병과 비교하여 상대적으로 적은 수의 살아있는 세포를 필요로 한다고 생각된다.
PD에 대한 세포 기반의 치료를 개발하는 한 도전과제(challenge)는 뉴런 교체에 사용하기 위한 적절한 세포 공급원을 확인하는 것이었다. 상기 검색은 30년 이상 동안 수행되어 왔으며, DN 뉴런 교체를 위한 많은 잠재적인 공급원이 제안되었다(Kriks, Protocols for generating ES cell-derived dopamine neurons in Development and engineering of dopamine neurons (eds. Pasterkamp, R.J., Smidt, & Burbach)(Landes Biosciences, 2008; Fitzpatrick, et al., Antioxid. Redox. Signal. 11:2189-2208 (2009)). 과거에는 부신 수질 유래 카테콜아민성 세포(Madrazo, et al., N. Engl. J. Med. 316, 831-834 (1987)), 카로티드체(carotid body) 이식(Arjona, et al., Neurosurgery 53:321-328 (2003)), 또는 캡슐화된 망막 색소 상피 세포(Spheramine trial Bakay, et al., Front Biosci. 9, 592-602 (2004))를 포함하는 이들 공급원 중 몇몇이 초기 단계의 임상 시험으로 진전되었다. 그러나, 이러한 시험은 대부분 임상적 효능을 보이는데 실패하였으며, 불량한 장기 생존 및 이식된 세포로부터의 낮은 DA 방출을 나타내었다. 다른 접근법은 전세계적으로 300명 이상의 환자에게 수행된 태아 중뇌 DA 뉴런의 이식이었다(Brundin, et al., Prog. Brain Res. 184, 265-294 (2010); Lindvall, & Kokaia, J. Clin. Invest 120:29-40 (2010)). 상기 환자들에서 인간 태아 조직을 이용하는 치료는 일부 환자에서 이식 후 10 또는 20년까지 DA 뉴런의 생존 및 생체내 DA 방출의 증거를 보여주었다. 그러나, 많은 환자에서, 태아 조직 이식은 DA 뉴런의 기능을 교체하는데 실패하였다. 또한, 태아 조직 이식은 다양한 임상적 결과에 기여하는 일부 인자들인 공여 조직의 낮은 양과 질, 조직의 획득을 둘러싼 윤리적 및 실용적 이슈들 및 이식된 세포들의 양호하게 정의되지 않은 이질적 본성을 포함하는 복수의 도전과제에 의해 어려움을 겪어 왔다. 태아 이식의 예들은 하기 문헌들에 개시되어 있다; Mendez, et al. Nature Med. (2008); Kordower, et al. N. Engl. J. Med. 332:1118-1124 (1995); Piccini, et al. Nature Neuroscience 2:1137-1140 (1999). 그러나, 상기 임상적 결과는 초기의 개방-표지(open-label) 연구에서 일부 긍정적 데이터와 뒤섞였다(Lindvall, et al. Science 247:574-577 (1990); Widner, et al. N. Engl. J. Med. 327:1556-1563 (1992); Brundin, et al. Brain 123:1380-1390 (2000); Freed, et al. N. Engl. J. Med. 327:1549-1555 (1992); Freeman, et al. Bilateral fetal nigral transplantation into the postcommissural putamen in Parkinson's disease. Ann Neurol 38:379-388 (1995)). 그러나, 보통의 결과는 미국에서 NIH에 의해 후원된 2개의 큰 위약-조절된 임상 시험에서 발견되었다(Freed, et al. N. Engl. J. Med. 344, 710-719 (2001); Olanow, et al. Ann. Neurol. 54:403-414 (2003)). 인간 태아 이식 시험에서 관찰된 제한된 효능에 대해서는 태아 이식은 최적의 치료 유익을 위한 올바른 발달 단계에 있는 충분한 수의 세포를 제공하지 않을 수 있음을 포함하는 많은 가설들이 있다. 아울러, 태아 조직은 세포 형태에 의해 매우 빈약하게 정의되고, 각 조직 샘플의 단계 및 양과 관련하여 다양하다(Bjorklund, et al. Lancet Neurol. 2, 437-445 (2003). Another contributing factor may be a low-level inflammatory host response to the graft (Bjorklund, et al. Lancet Neurol. 2, 437-445 (2003)). 다른 기여 인자는 이식에 대한 낮은 레벨의 염증성 숙주 반응일 수 있다(Bjorklund, et al., Lancet Neurol. 2, 437-445 (2003)).
이와 대조적으로, 이식용 세포의 제공에 사용하기 위한 줄기 세포 유래의 세포 공급원 또는 다른 유형의 일관된 세포 유형은 태아 조직 이식과 연관된 많은 도전과제를 극복하고, 이식을 위한 최적 단계의 DA 뉴런의 무제한적 공급원을 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 다양한 잠재적 줄기 세포 공급원을 이용한 거의 20년의 시도 후, 본 발명자들은 설치류 동물 및 유인원에서 신경학적 결함을 되돌릴 수 있는 다능성 줄기 세포로부터 진정한 인간 중뇌 DA 뉴런을 입수하는데 성공하였다. 상기 신규한 분화 전략은 매우 효과적이며, 전임상 데이터에 의해 뒷받침되는 것과 같이 세포의 강력한 생체내 생착, 질환의 PD 모델에서 기능 회복의 유도, 및 부적절한 세포 증식과 같은 부작용의 부재를 유도한다. PD를 치료하기 위한 인간 ES 세포 기반의 전략에 대해 FDA가 승인할 것으로 생각되는데, 그 이유는 FDA는 척수 손상(Strauss, Nat. Biotechnol. 28:989-990 (2010)) 및 황반변성(Schwartz, et al. Lancet 379:713-720 (2012))에서 다른 인간 ES 세포 유도체의 테스트를 승인하였기 때문이다.
세포의 순도를 조절하기 위한 "향상(enhancement)" 전략을 포함하는 추가적인 구현예는 축삭섬유의 성장을 촉진하며, 이식 전략에서의 신규한 안전성/조절성 특징을 포함하는 것이 고려된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 세포 정제 방법은 관심있는 세포 유형(예컨대, CD142)에 대한 단순한 표면 마커 스크린으로부터 출발하여 특정 뉴런 유형에 대한 의미있는 농축 전략을 지향하는 것을 나타내었다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간에서 사용하기 위한 세포를 제공하는데 사용하는 것이 고려된다. 또한, 다른 구현예에서, PSA-NCAM의 조작된 발현이 생체내 뉴런 복구에서 사용하기 위한 축삭 성장을 향상하기 위해 고려된다. 이러한 적용은 운동뉴런 질환, 헌팅턴 질환 또는 투사 뉴런에 주된 영향을 미치는 다른 질병을 치료하기 위한 먼 거리의 축삭 성장의 촉진을 포함한다. 추가적인 구현예는 GMP 제한적(qualified) 다능성 세포 공급원 등에 대해 고려된다. 본 명세서에 기재된 상기 생착 방법은 소량의 DA 뉴런을 필요로 하고, DA 뉴런 유도를 위해 개발된 상대적으로 단순하고 비용-효과적인 소분자 방법에 기초하기 때문에, DA 뉴런 교체 치료는 환자 기준으로 합리적인 비용일 것으로 생각된다.
PD에서의 이식 접근법의 한 잠재적인 생물학적 제한요소는 PD에서의 뉴런의 퇴화가 진행되어 특히 상기 질환의 말기에 중뇌 도파민 뉴런 이외의 많은 세포 유형에 영향을 미친다는 사실이다. 사실, 장기간의 연구에서 비-DA 반응성 증상은 후기 PD에서 우세하고, 연하곤란, 낙상(falls), 치매 및 다른 심각한 이환율을 유도한다. 그러나, 일부 비-모터 증상은 도파민성 기능을 회복함으로써 유익한 것으로 생각된다. 또한, 상기 질환의 초기 단계에 hESC 유래 DA 뉴런을 사용하면 줄무늬체의 도파민 수용성 모집단의 퇴화를 포함하는 일부 2차 PD 증상을 방지할 것으로 생각된다. 그러나, 상기 질환의 비-DA 반응성 증상에 영향을 주지 않더라도, 줄무늬체의 장기간의 기능성 도파민성 복원은 현재 치유할 수 없는 질병에 대한 주요 성취일 것이다. 파킨슨 질환의 경우, 약물 기반의 전략과 뇌심부자극술과 같은 수술적 접근을 포함하는 몇 가지 대안적인 치료가 이용가능하다. 일부 구현예에서, 회복 효능은 대안적 치료에서 달성되는 레벨에 필적하거나 그 이상인 것으로 생각된다. 다른 구현예에서, 상기 성숙한 DA 뉴런 세포 생착 치료를 이용하면 환자의 특정 서브세트에 대해 특히 유익할 것으로 생각된다. 다른 구현예에서, 상기 성숙한 DA 뉴런 세포 생착 치료의 이용은 현존하는 약물 및 외과적 유형의 접근법에 추가로 사용하는 것이 고려된다. 본 발명의 성숙한 DA 뉴런 세포 생착 치료를 사용하는 한 주된 이점은 생착 후의 독특한 신경회복 본성, 즉 약물 치료를 점진적으로 하지 않기 위해 환자에서 사용하기 위하여 고려되는 뉴런 기능의 장기간의 회복이다. 세포 이식은 약물 및 다른 치료에 대해 반응하는 것과는 상이한 스펙트럼의 DA-관련 증상에 영향을 미치는 것으로 생각된다. 따라서, 한 구현예에서, 성숙한 DA 뉴런 이식은 DBS와 함께 사용하는 것이 고려된다. 다른 구현예에서, 성숙한 DA 뉴런은 치료와 함께 사용하는 것이 고려된다.
A) 파킨슨 질환 및 현재의 치료. PD의 가족성 형태에 기여하는 희귀한 유전자 변화의 확인에 있어서 큰 진전이 있었다. 그러나, 대부분의 PD 사건의 경우, 임의의 잠재적 유전적 성향의 기여는 명확하지 않은 채로 남아 있다. PD에서의 전통적인 치료 전략은 임상적 증상이 시작될 때 흑색질 내의 모든 DA 뉴런의 30-70%가 비가역적으로 퇴화되었다는 사실로 인해 한계가 있다. 한 치료 옵션은 DA 뉴런 결핍을 DA 전구체인 L-Dopa를 이용하여 약리학적으로 교체하는 것이다. 그러나, 일부 PD 환자가 L-Dopa 치료에 대해 극적인 초기 반응을 보임에도 불구하고, 장기간의 임상적 결과는 불량한 채로 남아 있고, 후기 질환에서 모터 변동 및 이상운동증(dyskinesias)을 포함하는 L-Dopa 치료의 심각한 부작용이 빈번하게 일어난다. L-Dopa의 박동성(pulsatile) 운반은 상기 후기 모터 합병증의 발달에 주된 역할을 하며, 따라서 예컨대 본 발명의 생착된 세포로부터 도파민이 "부드럽게" 보다 생리학적으로 운반되면 매우 바람직할 것이다. 약리학적 전략에 더하여 몇 가지 외과적 처리 옵션이 있다. 이들은 하시상부 핵 또는 GPi(globus pallidus pars interna)를 표적화함으로써 담창구절제술(pallidotomy) 또는 뇌심부자극을 통해 기저핵 내에서 세포를 절제하거나 기능적으로 불활성화시키는 것을 포함한다. 이러한 외과적 옵션은 일부 환자에서는 대안적이지만, 이들은 상기 질환의 증상 경감은 제공하지만, 정상 DA 기능을 회복하지는 않는다. 아울러, 하드웨어 고장, 감염증, 뇌졸중, 출혈 등을 포함하는 외과적 및 비-외과적 부작용이 보고되었다. 다른 처리 옵션은 직접 실질내 주입하거나, 또는 유전자 치료에 의한 바이러스 발현을 이용하여 GDNF 또는 뉴투린(Neurturin)과 같은 성장 인자를 운반하는 것을 포함한다. PD에서 초기의 개방 표지 연구(open label study)는 GDNF에 대한 희망적인 결과를 보여주었지만, 이후의 더 큰 세트의 환자에서의 조절된 시험은 어떠한 유익도 확인하는데 실패했으며, 환자의 서브세트에서 항-GDNF 항체가 생산됨으로 인해 잠재적인 안전성 문제를 야기시켰다. 또한, GDNF와 연관된 분자인 뉴투린의 AAV 기반의 운반도 큰 위약-조절된 멀티센터 시험에서 임의의 유의한 임상적 유익을 보여주는데 실패했다. 시상하부 핵 내로 AAV 유래 글루탐산 디카르복실라아제(GAD)를 주사하는 임상 2상 시험의 초기 데이터가 최근 보고되었다(Lancet Neurology, April 2011). 그러나, 상기 연구에서 임상적 유익은 기껏해야 보통이었다. 신경영향성 인자 기반의, 또는 대안적인 신경보호 전략에 대한 노력이 환자에 일시적인 경감을 줄 수 있지만, 이들 중 어느 것도 세포 교체 치료의 주된 목표인 상기 질환으로 인해 이미 손실된 DA 뉴런을 다시 되돌리거나 교체할 수 없다.
B) PD에서의 세포 치료. 임상 증상은 줄무늬체 도파민의 70-80% 및 흑색질 도파민 뉴런의 약 50%가 손실된 후 PD에서 명확하게 된다. 그러나, 중뇌 도파민 뉴런은 수정 후 8.5주까지 발달되고, 나머지 일생에 걸쳐서 도파민 뉴런 교체의 증거는 거의 없다. 따라서, 질환 개시 시간까지 도파민 뉴런은 이들 세포를 교차하는 자연적 메카니즘 없이 수십 년의 나이가 되고, 따라서 세포 이식은 PD 환자의 뇌 내의 이들 세포를 교체하기 위해 필요할 수 있다. PD에서의 DA 뉴런의 교체는 1980년대에 부신 수질 유래의 크롬친화성 세포의 이용에 기초하여 수행되었다. 상기 호르몬 생성 세포는 이소성으로(ectopically) CNS 내에 위치할 때 신경전달물질의 표현형을 아드레날린에서 DA로 전환시키는 것으로 나타났다. 전세계적으로 수백 명의 PD 환자가 상기 접근법을 이용하여 이식되었지만, 이식된 세포는 아주 조금만 생존하였고, 기껏해야 일시적인 효과만 있다는 것이 시간이 지날수록 명확해졌다. 따라서, 상기 접근법은 임상에서 이용하는 것이 즉시 포기되었다. 이와 대조적으로, 태아 중뇌 조직 이식을 사용하는 것은 DA 연관성 행동 분석의 패널에 걸쳐서 설치류의 장기간 생착 및 기능적 개선을 보여주는 설치류 모델에서의 보다 광범위한 전임상 연구에 기반하였다. 상기 전임상 데이터에 자극되어, 태아 이식은 1980년대 말과 1990년대 초에 복수의 센터에서 진행되었다. 상기 연구는 연관되지 않은 원인에 의해 사망한 일부 환자에서 플루오로도파(Fluorodopa) PET과 이후의 병리학적 연구에 의해 측정될 때 이식된 영역에서 증가된 DA 방출과 함께 기능적인 장기간의 생착이 있다는 명확한 증거를 보여주었다. 그러나, 태아 이식을 사용하는 것은 세포 기반의 치료적 접근법과 함께 2가지 잠재적인 문제를 일으켰다. 첫 번째로, 태아 이식의 예기치 않은 문제는 약 15%의 환자에서 이식-유도성 이상운동증(GID)이 유도되는 것이다. GID의 메카니즘은 논란이 남아 있지만, 최근의 증거는 세로토닌성 뉴런은 DA를 부적절하게 저장 및 방출할 수 있음을 나타내었다. 다른 잠재적인 메카니즘은 GID는 DA 뉴런의 불균등한 분포로서, 즉 DA 방출의 핫스팟(hot spot)을 초래함을 설명할 것을 제안하였다. 이와 대조적으로, 본 발명의 개발 과정에서, GID의 발병을 줄이게 되는 세로토닌성 뉴런의 검출 및 감소 방법을 발견하였다. 또한, 성숙한 DA 뉴런을 주사하면 숙주 줄무늬체 내의 연장된 도파민성 섬유 말단을 포함하는 성숙한 뉴런의 균일한 분포를 제공할 것이다. 태아 이식 처리의 다른 문제는 적절한 발달 단계에 있는 태아 중뇌 조직의 제한된 이용가능성 이었다(및 이다). 태아 돼지 유래 DA 뉴런을 이용함으로서 제한된 공급 문제를 해소하기 위한 대안적인 전략이 임상적으로 시도되었다. 그러나, 이러한 이종이식에서의 DA 뉴런의 생존은 불량하였고, 전체적인 접근법은 포기되었다. 또한, 망막 색소 상피를 이용한 최근의 시험은 어떠한 유익을 보이는데도 실패하였다. 이와 대조적으로, 이식 세포의 공급원으로 인간 ES 세포를 사용하면 이식에 사용하기 위한 도파민 뉴런을 만들기 위한 세포의 무제한적 공급원을 제공하는 것으로 생각된다.
Ⅴ. FOXA2+ 및 LMX1A+ 양성의 뉴런 전구체 세포를 본 발명의 중뇌 DA(mDA) 뉴런으로 직접 분화시키기 위한 화합물 및 배양 방법이 발견되었다.
본 발명자들은 본 발명의 개발 과정에서 CHIR99021의 노출 시간이 FOXA2/LMX1A 중뇌 바닥 플레이트 전구체의 유도를 결정하다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 분화 11일에 LSB/S/F8(즉, LSB, S, 즉, SHH 및 FGF8(F8))을 단독으로 또는 d(day)0-d11, d1-d11, d3-d11, d5-d11, d7-d11의 다양한 시점에서 출발하여 CHIR과의 조합으로 처리하여 FOXA2/LMX1A의 면역세포화학 분석에 대해 테스트하였고, CHIR 처리가 없는 2중 배양 세포와 비교하였다. 이후, 상기 면역세포화학 분석에서 개시된 것과 같은 상이한 CHIR 노출 개시 후의 분화 11일에 FOXA2+, LMX1A+ 및 이중 표지된 세포의 백분율의 정량화를 결정하였다.
A. CHIR99021(C)는 헷지호그 및 푸르모르파민의 활성화제와 접촉한 LSB 배양된 세포로부터 11일에 FOXA2+/LMX1A+ 세포를 유도하기 위한 인자이다. 하기 예는 mDA 뉴런의 직접적인 뉴런 분화를 유도하기 위한 각각의 화합물의 효능을 테스트하기 위한 예시적인 방법의 이용에 대해 개시한다.
상기 예는 본 발명의 FOXA2+LMX1A+ DA 뉴런의 직접적인 분화를 제공하기 위한 소분자 및 접촉 시간의 발견을 개시한다. 다음은 본 명세서에 기재된 일부 실험적 발견의 간략한 요약이다: 이중-SMAD 억제된 세포에 SHH 작용제(agonist)(purmorphamine + SHH) 및 FGF8(S/F8)을 CHIR99021의 부재 하에 처리하면 11일에 현저하게 낮은 FOXA2의 발현과 LMX1A 발현의 완전한 억제를 보여주었다(도 1의 a 및 b). 앞선 마커인 OTX2는 LSB 및 LSB/S/F8/CHIR 처리된 배양물에서 강력하게 유도되었지만, LSB/S/F8 조건 하에서는 그렇지 않았다(도 1의 a 및 c).
본 발명자들은 다능성 세포를 함유하는 세포 모집단을 출발 모집단으로 선택하였고, 0일에 플레이팅하였다. 분화시키기 전에 세포를 거의 포화되게(confluency) 성장시킨다(60-100% 사이의 포화도). 0일에 상기 세포를 이중 SMAD 억제제에 노출시켰다(즉, LDN-193189 + SB431542 = "LSB")에 노출시켰다. 본 발명자들은 11일까지 세포 모집단에 신선한 LSB를 함유하는 정규 급여를 따랐으며, 일부 남아있는 세포가 LMX1A+였지만 FOXA2를 발현하지는 않았음을 발견하였다(도 1의 a 및 b). 본 발명자들은 이중으로 출발 세포 모집단을 플레이팅한 후, 다음의 임의의 SHH 작용제(푸르모르파민 + SHH) 및 FGF8(S/F8)을 함유하는 혼합물과 접촉시킨 후, 상기 세포를 상이한 노출 요법(regimen)으로 접촉, 즉 0일, 또는 1일, 또는 2일, 등에 특정한 양의 시간, 즉 24시간, 48시간, 등 동안 접촉시켜 세포 유형(즉, 유전자/단백질 발현 패턴)에 대해 테스트하였다. 테스트된 3가지 1차적인 예시적 배양 조건은 1) 세포를 0일에 LDN/SB(LSB)와 접촉시킨 후, 5일까지 신선한 LSB와 접촉시키고, 5일에 세포를 SB 없이 11일까지 신선한 LDN과 접촉시키고, 2) 세포를 0일에 LDN/SB(LSB)와 접촉시킨 후, 5일까지 신선한 LSB와 접촉시키고, 5일에 세포를 SB 없이 11일까지 신선한 LDN과 접촉시키고, 이 기간 동안 세포를 7일까지 추가적으로 신선한 푸르모르파민, SHH 및 FGF8과 접촉시키고, 및 3) 세포를 0일에 LDN/SB(LSB)와 접촉시킨 후, 5일까지 신선한 LSB와 접촉시키고, 5일에 세포를 SB 없이 11일까지 신선한 LDN과 접촉시키고, 이 기간 동안 세포를 7일까지 추가적으로 신선한 푸르모르파민, SHH 및 FGF8과 접촉시키면서, 세포 유형의 최적 수율을 결정하기 위하여 상기 1차적인 조건에 몇 가지 변화를 주면서 추가적으로 배양 3일에 시작하여 11일까지 신선한 CHIR과 접촉시켰다.
B. 다른 기술로 생성된 DA 전구체 세포와 비교하여 상기 바닥 플레이트의 중뇌 영역으로부터 유래된 FOXA2+/LMX1A+ 세포의 시험관내 특성. 세계적인 일시적 유전자 발현 프로파일링을 이용하여 상기 3가지 배양 조건의 체계적인 비교를 수행하였다(도 1의 d). 상이하게 발현된 유전자의 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)은 11일까지의 분화의 3가지 처리 조건을 구분하였다(도 8의 a). FOXA1, FOXA2 및 PTCH1을 포함하는 몇 가지 다른 SHH 하류 표적이 LSB/S/F8/CHIR 대 LSB 처리 세트에서 가장 상이하게 조절되는 전사체였다(도 1의 e 및 f). 이와 대조적으로, LSB 배양은 HES5, PAX6, LHX2 및 EMX2와 같은 등쪽 전뇌 전구체 마커에 대해 농축되었다. LSB/S/F8/CHIR 대 LSB/S/F8 처리의 직접적인 비교(도 1의 f)는 LSB/S/F8/CHIR 군 내의 중뇌 DA 전구체 마커에 대한 선택적인 농축을 확인하였고, RAX1, SIX3 및 SIX6의 상이한 발현에 기초하여 LSB/S/F8 처리된 배양물 내의 시상하부 전구체의 정체성을 제시하였다(또한 하기 도 2의 d에서의 POMC, OTP 발현 참조). 상이하게 발현되는 전사체의 예시적인 목록은 예컨대 표 1 및 표 2 및 11일에 대한 유전자 온톨로지(ontology) 분석에 나타나 있으며, 도 8의 b(DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov)는 CHIR 처리 시 정규(canonical) WNT 신호전달(signaling)에 대해 농축되어 있음을 확인하였다. 미가공 데이터(raw data)는 GEO(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/accession#:[TBD])에서 아직 이용가능하지 않다. 중뇌 DA 전구체 마커(도 1의 g) 대 앞쪽 및 배쪽 비-DA 뉴런 운명의 마커(도 1의 h)에 대한 유전자 발현의 비교 시간적 분석(comparative temporal analysis)은 상기 3가지 유도 조건을 ⅰ) LSB: 등쪽 전뇌; ⅱ) LSB/S/F8: 배쪽/시상하부, 및 ⅲ) LSB/S/F8/CHIR: 중뇌 DA 전구체 정체성으로 분할하였다.
Ⅵ. 11일의 FOXA2+/LMX1A+ 세포를 25일의 중뇌 DA 뉴런으로의 추가적인 분화 및 65일까지의 유지.
추가적인 분화를 위하여, 전구체 FOXA2+/LMX1A+ 세포를 뉴런 성숙을 촉진하는 배지(BAGCT, 실시예 1 참조) 내에 유지하였다. 비교를 위하여, 2개의 다른 기술을 사용하여 DA 뉴런 전구체 세포를 생성하였다. 종래의 방법의 결과인 분화된 세포의 모집단들과 본 발명의 방법들 사이에 다음 유형의 비교를 수행하였다: A) TH에 대하여 분화 50일에 면역세포화학적 분석을 LMX1A, FOXA2 및 NURR1과 비교함; B) 총 세포로부터 TH+, FOXA2+, LMX1+ 및 NURR1+ 세포를 정량하여 로제트 유래 대 바닥 플레이트 유래(LSB/S/F8/CHIR) 배양을 비교함; C) 50일에 바닥 플레이트 및 로제트 유래 DA 뉴런 배양에서 세로토닌+(5-HT) 및 GABA+ 뉴런 서브타입(비-DA 뉴런 오염물)의 백분율의 정량화함; 및, D) HPLC 분석으로 도파민 및 대사물(metabolite)을 측정함: 바닥 플레이트 대 로제트 유래 배양 사이의 DA, DOPAC 및 HVA 레벨의 비교.
25일까지, 상기 3가지 전구체 세포 모집단은 Tuj1+ 뉴런(도 2의 a) 및 DA의 합성에서 속도-제한(rate-limiting) 효소인 TH를 발현하는 세포를 생성하였다. 그러나, LSB/S/F8/CHIR을 처리하면 LMX1A 및 FOXA2를 함께 발현하고 핵 수용체 NURR1(NR4A2)의 강한 유도를 보여주는 TH+ 세포를 생성하였다(도 2의 a 및 b). 13일 대 25일 배양에서 유전자 발현을 비교하여 다른 유사분열후(postmitotic) DA 뉴런 마커의 강력한 유도를 확인하였다(도 2의 c). 25일에 LSB 및 LSB/S/F8 처리된 배양과 비교해 DA 뉴런 정체성을 특성분석하여 공지된 중뢰 DA 뉴런의 전사체의 농축을 확인하였고, 복수의 신규한 후보 마커를 확인하였다(도 2의 d, 표 3 내지 표 5, 도 8의 b). 예를 들면, LSB/S/F8/CHIR(중뇌 DA 군)가 가장 많이 농축된 전사체는 이전에는 중뇌 DA 뉴런 분화와 연관되지 않았고 인간 흑색질에서 높게 발현된 유전자인 TTF3였다(도 8의 c; Allen Brain Atlas: http://human.brain-map.org).
간에서 FOXA2의 공지된 전사 표적인 TTR 뿐만 아니라 EBF-1, EBF-3에서도 유사한 데이터가 얻어졌다(도 8의 c). 본 발명의 분화 과정에서 얻어진 데이터는 중뇌 DA 전구체 세포에서 몇 가지 PITX 유전자가 농축됨을 나타낸다. 또한, 중뇌 DA 뉴런의 고전적인 마커인 PITX3는 분화 25일에 강력하게 발현되었다(도 2의 e). 마지막으로, 중뇌 바닥 플레이트 및 DA 뉴런의 유도 모두 독립적인 hESC 및 hiPSC 주에서 즉시 재생산될 수 있었다(도 9). 본 명세서에 기재된 상기 데이터는 다른 테스트된 프로토콜과 대조적으로 상기 LSB/S/F8/CHIR 프로토콜은 중뇌 DA 뉴런의 운명과 일치하는 마커 프로필을 발현하는 세포를 생성함을 보여주었다.
바닥 플레이트 유래 DA 뉴런의 시험관내 및 생체내 특성을 신경의 로제타 중간체를 통해 얻은 DA-유사 뉴런과 비교하였다(도 10 및 도 16). 신경 로제타의 패터닝은 hPSC로부터 DA 뉴런을 유도하기 위해 현재 가장 널리 사용되는 전략을 나타낸다. 바닥 플레이트 및 로제타 기반의 프로토콜 모두 장기간 시험관내에서 생존할 수 있는 TH+ 뉴런의 생성에 효과적이었다(50일의 분화; 도 3a의 a). 그러나, TH+ 세포의 백분율은 바닥 플레이트 유래 배양에서 현저하게 높았다(도 3a의 b). 양쪽 프로토콜 모두에서 TH+ 세포는 NURR1의 동시-발현을 나타내었지만, 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런은 FOXA2 및 LMX1A를 동시-발현하였다(도 3a의 a, b 및 도 3b).
GABA 및 세로토닌(5-HT)-양성의 뉴런은 거의 관찰되지 않았다(도 3a의 c). DA 및 그 대사물인 DOPAC 및 HVA는 각각의 프로토콜에서 생성된 배양 내에 존재하였지만, DA 레벨은 바닥 플레이트 배양에서 대략 8배 더 높았다(도 3a의 d 및 e). 중뇌 DA 뉴런은 광범위한 섬유의 성장과 시냅신, 도파민 트랜스포터(DAT) 및 G-단백질 커플링된 내측 정류 칼륨 채널(SNpc(substantia nigra pars compacta) DA 뉴런에서 발현되고 GIRK2로도 불리는 Kir3.2)을 포함하는 성숙한 뉴런 마커의 강력한 발현을 나타내었다(도 3a의 f, 도 11). SNpc DA 뉴런은 생체내에서 이들을 뇌 속의 대부분의 다른 뉴런들과 구분짓는 전기생리학적 표현형을 나타낸다. 특히, 이들은 느린(1-3 Hz) 속도로 자연스럽게 스파이크된다. 또한, 이러한 느린 스파이킹은 느린 역치이하(sub-threshold) 진동 포텐셜과 동반된다. 시험관내에서 2-3주 후, 이들 동일한 생리학적 특징들은 초기 출생후 마우스로부터 배양된 SNpc DA 뉴런에 의해 나타난다. hESC로부터 분화된 상기 DA 뉴런은 일관되게(4/4 테스트) 이러한 구별되는 생리적 표현형을 나타내었다(도 3a의 g 내지 i).
65일에 시험관내에서 mDA 뉴런을 유지하면 TH 양성 뉴런이 여전히 FoxA2 및 mDA 뉴런의 전형적인 연장된 긴 섬유를 발현함을 보여주었다. 도 3a의 j. HPLC에 의해 측정된 DA 방출은 65일령의 TH+ 뉴런이 시험관내에서 기능적임을 보여주었다(도 3a의 k).
요약하면, 중뇌 바닥 플레이트 전구체의 신경성 전환과 최적화된 바닥 플레이트 중뇌 DA 뉴런 분화 프로토콜의 개발이 본 명세서에 기재되어 있다. 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런은 인간 ES 세포로부터 초기 분화 단계 과정에서 SHH 및 정규 WNT 신호전달의 소분자에 기초한 활성화에 의해 얻어졌다(도 3b). 상기 hES 세포는 FOXA2/LMX1A 이중 양성 중뇌 바닥 플레이트 단계로부터 FOXA2/LMX1A를 동시-발현하는 Tuj1+ 미성숙 뉴런으로 진행한 후, 강력한 DA 방출과 자율적 보조조정 활성(도 3b의 c)을 포함하는 SNpc(substantia nigra pars compacta; A9-유형) 중뇌 DA 뉴런에 특징적인 전기생리학적 특징을 갖는 성숙한 DA 뉴런으로 진행된다(도 3b의 a 및 b). 놀랍게도, 이것은 배양 접시 내 세포의 절반 이상이 성숙한 중뇌 마커 프로필을 채용하는 매우 효과적인 방법이었다(도 3b의 b 참조).
Ⅶ. 생착된 뉴런으로서 바닥 플레이트 유래 중뇌 도파민 뉴런의 생체내 특성분석.
하기 실시예는 치료적 세포 교체에 사용하기 위하여 본 발명의 예시적인 방법을 이용하는 것을 개시한다. 상기 분야에서의 한 주된 도전과제는 신경이 과성장하거나, 비-중뇌 뉴런으로 부적절하게 분화하거나, 테라토마로 발생할 위험없이 기능적으로 생체내에 생착되는 hPSC 유래 중뇌 DA 뉴런을 생성하는 능력이다. 태아 조직 이식 연구에 기초하여, 본 발명자들은 NURR1의 발현에 의해 표시되는 세포 사이클 탈출의 시간(대략 25일의 분화, 도 2)이 이식을 위한 적합한 단계일 수 있음을 생각하였다. 비-병소성 성체 마우스 내에서 25일의 세포를 이용한 초기 연구는 이식 후 6주에 hPSC 유래 FOXA2+/TH+ 뉴런의 강력한 생존을 보여주었다(도 12). 신경 과성장이 없는 파킨슨병 숙주에서의 FOXA2+/TH+ 세포의 장기간의 생존을 테스트하였다. 상기 목적을 위하여, 6-히드록시-도파민(6-OHDA) 병소(Tabar, et al., Nature Med. 14:379-381 (2008); 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)를 드문 종양형성 세포의 노출에 대해 특히 민감하고 이종이식의 생존을 효율적으로 지지하는 스트레인(strain)인 NOD-SCID IL2Rgc 눌 마우스 내에 만들었다(Quintana, et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature 456:593-598 (2008), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 증식 가능성이 높은 세포로 오염될 가능성을 나타내기 위하여 바닥 플레이트 및 로제타 유래 DA 뉴런 배양을 미리 정제하지 않고 모두 그래프트하였다(150×103 세포/동물). 이식 후 4.5개월에 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런 이식물은 FOXA2 및 인간 특이적 마커 hNCAM을 동시-발현하는 TH+ 세포로 이루어지는 잘-정의된 그래프트 코어를 보였다(도 4의 a 내지 c). 기능적 분석은 암페타민-유도성 회전 거동이 완전히 없어졌음을 보여주었다. 이와 대조적으로, 로제타 유래 뉴런 그래프트는 일부 TH+ 세포를 보여주었고, 회전 거동에서 현저한 감소를 보여주지 않았으며(도 4의 d), 거대한 신경 과성장을 보여주었다(이식 부피 > 20 ㎣; 도 13). 본 명세서에서 기재된 것과 같은 그래프트에 사용된 로제타 유래 뉴런 세포의 광범위한 과성장은 본 발명자 그룹(Kim, et al. miR-371-3 Expression Predicts Neural Differentiation Propensity in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 및 타인들(Hargus, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107:15921-15926 (2010), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)로부터 로제타 유래 DA 그래프트를 이용한 이전의 연구에 필적하였다. 상기 과성장은 더 긴 생존 기간(4.5개월 대 6주), 이식 전 FACS 정제의 부재 및 NOD-SCID IL2Rgc 눌 숙주(null host)의 선택으로 인한 것일 수 있다. 증식하는 Ki67+ 세포의 수는 바닥 플레이트 유래 그래프트에서 최소였지만(총 세포의 < 1%), 로제트 유래 그래프트는 증식하는 신경 전구체의 포켓을 보유하였다. 신경 과성장은 상기 그래프트 내 원시 전방 신경외배엽 세포에 의해 초래되는 것으로 생각된다(Elkabetz, et al. Genes Dev. 22:152-165 (2008); Aubry, et al. Proc. Natl Acad. Sci. U. SA 105:16707-16712 (2008), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 상기 가설은 전뇌 마커 FOXG1이 로제트 유래 그래프트에서는 발현되지만 바닥 플레이트 유래 그래프트에서는 발현되지 않음에 의해 지지되었다. 대부분의 GFAP+ 세포는 숙주 기원을 나타내는 인간 마커에 대해 음성이었지만, 작은 백분율의 성상교세포(astroglial cell)가 바닥 플레이트 및 로제트 유래 그래프트 모두에서 존재하였다(도 13).
본 명세서에 기재된 NOD-SCID IL2Rgc 눌 마우스에서의 결과는 강력한 장기간의 FOXA2+/TH+ 뉴런의 생존과, 암페타민-유도성 회전 거동의 완전한 되돌림과, 신경 과성장의 어떠한 징후도 없음을 보여주었다. 그러나, 상기 결과 중 일부는 NOD-SCID IL2Rgc 눌 마우스의 특별한 사용으로 인한 것일 수 있었다. 상기 가설을 테스트하기 위하여, 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런 배양물(250×103 세포)을 시클로스포린 A를 이용하여 약리학적으로 면역억제된 성체 6-OHDA 병소성 래트에 이식하였다. 이식 5개월 후, FOXA2(도 4의 g) 및 인간 핵 항원(hNA)(도 4의 e)을 동시-발현하는 평균 15,000 TH+ 세포 이상으로 그래프트 생존율은 강력했다(도 4의 e 내지 h); TH+/hNCAM+ 섬유는 상기 그래프트 코어로부터 주위 숙주 줄무늬체로 뻗어나갔다(도 4의 f). FOXA2에 더하여, TH+ 세포는 중뇌 DA 뉴런 마커 PITX3 및 NURR1을 발현하였다(도 4의 h 내지 j). 거동 분석은 개선을 보이지 않았던 샴-이식된 동물과 대조적으로 암페타민-유도성 회전 불균형이 완전히 사라졌음을 보여주었다(도 4의 k). 또한, 그래프트된 동물은 DA 시스템의 약리학적 자극에 의존하지 않는 분석인 앞다리 운동불능을 측정하는 보행 테스트(도 4의 l) 및 실린더 테스트(도 4의 m)에서 개선을 보여주었다. 인간 DA 뉴런에 대해서는 회복의 개시가 늦을 것(대략 이식 후 3-4개월)이 예상되며, DAT 발현의 레벨(도 4의 n)과 같은 생체내 성숙 속도에 의존한다. Kir3.2 채널(GIRK2) 또는 칼빈딘을 발현하는 TH+ 세포의 존재는 SNpc(A9) 및 배쪽 피개 영역(ventral tegmental area, A10) DA 뉴런 모두가 상기 그래프트 내에 존재함을 나타낸다(도 4의 o 및 p).
마우스에서와 같이(도 13), 래트 세포에서 숙주 유래 GFAP+ 교세포의 대부분(총 세포의 7%)인 세로토닌성 및 GABA성 세포는 드물었다(총 세포의 <1%)(도 14). 그래프트에서는 세로토닌+ 뉴런이 일부 검출되었지만, 숙주 유래 세로토닌성 섬유일 수 있는 hNCAM-음성 세포가 관찰되었다(도 14).
마우스, 래트 및 원숭이에서 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런의 생착은 설치류 및 유인원 종에서 뉴런 기능의 놀라운 회복을 나타내었다. 단기간(6주) 생존 분석은 6OHDA 병소성 면역손상된(immunocompromised) 숙주 마우스의 마우스 줄무늬체 내로 이식된 후 5개월까지의 놀라운 장기간 생존으로 연장되었다. 사실, DA 뉴런을 만드는 전통적인 로제트 기반의 방법(Perrier, et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004))과 본 명세서에 기재된 신규한 바닥 플레이트 기반의 DA 뉴런 분화 프로토콜과 비교한 직접적인 비교는 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런은 장기간의 DA 뉴런 생착을 할 수 있지만, 로제트 기반의 뉴런은 그러하지 않음을 보여주었다(도 4의 a 내지 c).
특히, 바닥 플레이트(fp) 유래(파랑선) 뉴런 및 로제타 유래(빨강선) DA 뉴런(도 4의 d)으로 이식된 6-OH 병소성 마우스에서 암페타민-유도성 회전에서 거동 회복이 강력하게 유도되는 것은 fp 유래의 뉴런이 더 높은 회복 속도를 가짐을 보여주었다. 바닥 플레이트 유래의 DA 뉴런으로 이식된 마우스는 암페타민 점수에서 거의 완전한 회복을 보여주었다. 로제트 유래 DA 뉴런으로 이식된 동물은 거동이 덜 개선되었고, 일부는 시간이 지나면 처음의 높은 회전수로 되돌아간 것을 보여주었다.
또한, 6OHDA 병소성 래트 모델에서는 강력한 이식 기능이 발견되었다. PD 마우스와 달리, 래트는 보다 복잡한 거동 분석을 허용하며, 이종이식 세팅에서 DA 뉴런 생존후 약리학적 면역억제(인간 이식 프로토콜을 보다 가깝게 모방하는 치료)를 다룬다. 뛰어난 이식 생존, DA 섬유 성장의 증거 및 중뇌 특이적 전사 인자 발현의 유지는 진정한 중뇌 DA 뉴런 마커를 발현하는 바닥 플레이트 유래 뉴런의 장기간의 생존을 확인하였다(도 4의 e 내지 j). 수많은 기능 분석은 약물 유도성(암페타민-유도성 회전) 및 자연적 거동 테스트(실린더 및 보행 테스트) 모두에서 현저한 개선을 보여주었다.
본 명세서에 기재된 결과들은 2개의 독립적인 설치류 모델에서 뛰어난 그래프트 생존 및 거동 결과를 보여주었다. 그러나, 마우스 또는 래트 뇌에서 필요로 하는 DA 뉴런의 수는 유인원 및 원숭이에서 생착하기 위해 필요한 큰 수의 세포의 작은 일부를 나타낸다. 상기 프로토콜의 확장성(scalability)을 테스트하기 위하여, 2마리의 성체 MPTP 병소성 레서스 원숭이에서 파일럿 그래프팅 연구를 수행하였다.
추가적으로, 처음에는 본 명세서에 기재된 방법 및 세포가, 상기 방법 및 세포를 인간에서 사용할 수 있음을 지지하기 위해 사용될 수 있는 정보인, 유인원에서 뉴런의 기능을 복원할 것인지 여부는 알려져 있지 않았다. 따라서, 초기 연구 세트는 유인원 뇌에서 중뇌 DA 뉴런 표현형의 생체내 생존 및 유지를 단기간(4-6주) 테스트하기 위하여 적어도 2마리 원숭이에서 수행되었다. 본 발명에서 개시된 연구들은 TH/FOXA2 양성 중뇌 DA 뉴런의 강력한 생존과 숙주 줄무늬체의 재-신경분포의 증거를 보여주었다(도 4의 q 내지 t). 많은 수의 세포를 이식한 결과, 미래의 인간 이식 연구에서 요구되는 수 범위의 추정치와 유사하게, 강력한 중뇌 DA 뉴런의 생존으로 나타났다. 상기 단기간 데이터에 더하여, 레서스 원숭이에서 한 세트의 장기간 연구를 수행하여 세포의 3개월 생존 및 매일 CellCept, Prograf 및 Prednisone의 최적화된 면역억제 요법(3중 조합 치료로 사용됨)을 평가하였다. 놀랍게도, 초기 이식 연구에서 관찰된 강한 숙주 미세아교세포 반응과 비교하여 상기 이식에 대해 크게 감소된 염증성 숙주 반응과 함께, 유인원 뇌에서 인간 ES 유래 중뇌 DA 뉴런이 강력하게 3개월 생존하는 것이 발견되었다(도 15 참조).
구체적으로, 원숭이 연구와 연관된 방법은 50×106의 이식가능한 DA 뉴런 전구체의 배치(batch)가 상기 바닥 플레이트 기반의 프로토콜을 사용하여 분화 25일까지 얻어지는 것을 포함하였다. 고전적인 용량(dose)은 목동맥 내로 주사된 3 ㎎ MPTP-HCL였다(범위 0.5-5 ㎎). 이 후 MPTP 0.2 ㎎/㎏의 MPTP를 정맥내로 전신 주사하였다. 세포는 뇌의 각각의 측(총 6 트랙, 1.25×106 세포/트랙)에서 3군데 위치에서 주사하였고(후방 미상핵(posterior caudate) 및 전교련 피각(precommissural putamen)), 동물은 시클로스포린-A로 면역억제하였다. 뇌의 한 측은 H9의 GFP 발현 서브클론 유래의 DA 전구체로 주사하였고, 다른 측은 마킹되지 않은 H9 세포 유래의 세포로 생착하였다. 계속적으로 FOX2A를 발현하고 TH를 생산하는 레서스 원숭이에서 뉴런의 생착을 보여주는 결과는 도 4의 q 내지 t에 나타나 있다. 이식 1달 후, GFP(도 15) 및 인간 특이적 세포질 마커(SC-121)(도 4의 q)의 발현에 기초하여 중뇌 DA 뉴런의 강력한 생존이 관찰되었다. 각각의 그래프트 코어는 숙주 내로 3 ㎜까지 연장된 TH+ 섬유의 무리(halo)에 의해 둘러싸였다(도 4의 r). 상기 그래프트 코어는 SC-121(도 4의 s) 및 FOXA2(도 4의 t)를 동시-발현하는 TH+ 뉴런으로 이루어져 있었다. 상기 그래프트 내의 SC-121 및 GFP 음성 영역은 Iba1+ 숙주 미세아교세포를 함유하였는데(도 15), 이는 불완전한 면역억제를 나타낸다.
요약하면, 유인원, 즉 95% 이상이 심각하게 손실된 내인성(endogenous) 중뇌 DA 뉴런을 포함하는 성체 PMPTP(3 ㎎의 MPTP-HCL(1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘; 0.5-5 ㎎ MPTP-HCl의 농도 범위) 병소성 레서스 원숭이에서의 신규한 DA 뉴런 세포 모집단의 생착이 개시된다. MPTP 노출은 인간에서의 파킨슨 질환과 유사한 관찰가능한 변화 및 증상을 초래하였다.
요약하면, 중뇌 DA 뉴런 발생을 충실하게 재현하는 신규한 바닥 플레이트 기반의 hPSC 분화 프로토콜이 발견되었다. 중뇌 DA 뉴런의 기본적 특성을 갖는 세포에 접근하는 것은 기초 발생 연구, 고성능 약물 발견 및 PD-iPSC 기반의 질환 모델링과 같은 넓은 범위의 생물의학에 적용할 수 있게 할 것이다. 중요한 것은, 상기 연구는 마지막으로 신경 이식을 위한 FOXA2+/TH+ 뉴런의 확장가능한 공급원을 얻는 수단(PD에 대한 세포 기반의 치료를 고려하는 경로에서의 주된 단계)을 확립하였다.
또한, hESC 유래의 진정한 중뇌 DA 뉴런의 도출은 이식 시점에서 뛰어난 생체내 성능(도 4 참조), DA 뉴런 수율을 보여주었다(분화 25-30일에 모집단 내에서 대략 40% 성숙한 뉴런으로서, 인간 태아 배쪽 중뇌 조직의 절개 후 얻은 백분율(전형적으로 대략 10%)을 상회함. (Sauer, et al., Restor. Neurol. Neurosci. 2:123-135 (1991)).
다음은 생착 후 2가지 주된 파라미터의 평가에 사용하기 위한 물질 및 방법의 간략한 설명이다: 생존 기간 및 거동 평가의 정도. 단기간 연구, 예컨대 세포 생존 또는 표현형 조성을 확인하기 위한 목적의 경우, 거동 평가가 고려되며, 동물은 이식 약 4-8주 후 생존에 대해 테스트될 것이다. 장기간 연구는 이식 후 거동 평가 및 이식 후 적어도 5개월 동안의 동물의 생존을 포함할 것이다. PSA-NCAM 변형과 같은 향상 전략을 분석할 때, 거동 평가는 숙련된 앞발의 사용을 위한 계단 테스트와 같은 보다 복잡한 파라미터를 포함하는 것이 고려된다.
생체내 성능의 평가를 위한 예시적인 프로토콜은 적어도 4개의 주된 성분을 가지며, 다음의 ⅰ-병소 유도, ⅱ-코어 거동 분석, ⅲ-이식, 및 ⅳ-조직 분석을 포함한다. 상기 절차는 래트에서 사용되었지만, 일부 구현예에서는 상기 절차는 다른 종에서 사용될 수 있다.
ⅰ-병소 유도. 정중 전뇌 관속(median forebrain bundle, MFB) 내의 6-히드록시도파민(6-OHDA)의 편측(unilateral) 주사는 래트에서 파킨슨-유사 증상을 유도하기 위한 한 표준 접근법이다. 6-OHDA는 MFB 내에서 흑색질선상체(nigrostriatal) 경로를 통해 흑색질로 다시 역으로(retrogradely) 전달되는 신경독소로서, 미토콘드리아 호흡 효소의 손상을 통해 뉴런 세포가 죽게 된다. 표적화된 뉴런은 SNC(substantia nigra compacta) 내의 A9 도파민성 뉴런뿐만 아니라 배쪽 패개 영역 내의 A10 뉴런을 포함한다. 상기 병소 모델은 널리 연구되어 있으며, CPU(caudate-putamen complex) 내에서 도파민의 광범위한 편측 고갈이 일어나게 하므로, 후기(advanced) PD의 신경화학 및 거동 결과의 연구를 위한 뛰어난 전임상 모델로 받아들여진다. 또한, 상기 거동 결과는 잘 기술되어 있으며, 자연적 및 약물-유도성 회전뿐만 아니라 팔 사용에서의 손상을 포함한다(아래 참조). 파킨슨증의 양측 모델은 인간 질환을 더 잘 모방할 수 있지만, 래트에서는 무음증(adipsia) 및 연하불능(aphagia)이 일어나게 된다.
상기 절차는 마취된 동물에서 정중 전뇌 관속을 따라 2 위치에서 입체정위적 주사(stereotactic injection)를 통해 수행되었다(케타민/자일라진). 완전한 병소 유도의 효과는 시술자의 경험에 매우 의존적이며, 본 발명의 개발 동안에 60-80% 범위였다. 상기 동물이 회복하게 둔 후, 수술 2주 후에 시작하여 수많은 거동 테스트의 거쳤다.
ⅱ-코어 거동 분석. 거동 분석은 수술 2주 후에 개시되며, 이식 후 동물이 희생될 때까지 계속된다. 그 목적은 1) 상기 병소를 안정하고 완전하게 확립하고, 부분적으로 병소된 동물에서 보여지는 현상인 동물이 상기 증상으로부터 자연적으로 되돌아가지 않도록 하는 것, 및 2) 확립된 거동 파라미터에 대한 도파민 뉴런의 이식 영향을 설명하는 것이다.
a-회전 거동. 래트는 자연적 회전 및 D-암페타민-유도성(동측성) 회전(10 ㎎/㎏)에 대해 관찰된다. 유의미한 병소에 대한 지표로서 분당 > 6 회전의 역치가 요구된다. 또한, 아포몰핀-유도성 회전이 분석될 수 있지만, 양성 결과는 미상핵-피각(caudate-putamen)에서 도파민 신경분포의 < 80-90% 고갈을 필요로 하는 것으로 생각되고, CPU 병소와 비교하여 MFB 병소에서 덜 일관된다. 2주 간격으로 3개의 데이터 세트가 얻어지고, 평균을 낸다. < 6의 회전 점수를 갖는 래트는 본 연구에 포함되지 않는다.
b-보행 테스트. 이것은 앞다리 운동불능에 대한 테스트이다. 래트를 실험자가 한 손으로 잡고 뒷다리를 고정하고(몸통을 약간 든다), 다른 손으로 모티터링하지 않는 앞다리를 고정한다. 이 방식으로, 다른 앞발이 체중을 견뎌야 한다. 래트를 포핸드(forehand) 및 백핸드(backhand) 위치 모두로 천천히 옆으로 이동시킨다. 양쪽 방향 및 양쪽 발에 대한 보행 조정 회수를 카운트한다.
c-실린더 테스트. 이것은 앞다리 이용 비대칭에 대한 테스트이다. 래트를 투명한 실린더 내에 위치시킨다. 5분의 기간 동안, 래트의 부양 거동(rearing behavior)에 점수를 매겼다. 부양 및 랜딩(landing) 동안에 상기 거동을 분석한다. 이들 동작 동안에 발들을 동시 및 비대칭 이용하는 백분율을 결정한다. 이것은 컴퓨터화 비디오 모니터링 시스템을 통해 수행될 수 있다. 이 테스트에서의 음성 결과는 도파민 고갈과 연관있음이 알려져 있고, 그 결과는 본 명세서에 기재된 것과 같은 회복성 이식 후에 개선되는 것으로 나타났다.
ⅲ-이식. 거동 테스트가 정확한 병소를 확인한다면, 동물은 파킨슨증-유도성 병소 3주 후에 줄무늬체 내로 도파민 뉴런의 정위적 주사를 받는다. 주사 좌표는 널리 확립되어 있다. 이식 후, 동일한 세트의 거동 테스트를 다양한 기간 동안 격월로 수행한다(안정한 거동 회복을 달성하기 위해서는 평균 5개월이 필요함).
ⅳ-조직 분석. 동물을 마취 및 관류시킨다. 뇌를 절편화하고, 면역화학염색 및 입체 분석 처리한다. 항체는 도파민 뉴런의 확인 및 기능을 위한 TH, FoxA2, Pitx3, Nurr1, Lmx1a, Girk2, DAT; 세로토닌성 뉴런의 확인을 위한 5-HT; 인간 확인을 위한 인간 NCAM 또는 인간 핵 항원; 신경 전구체를 위한 네스틴(Nestin), Sox2; 증식을 위한 Ki-67; 다능성 마커를 위한 Oct4, Nanog; 알파-페토프로틴; 마이오신; 테라토마 형성을 배제하기 위한 복수계통(multilineage) 마커를 위한 사이토케라틴을 포함한다. 정량적 파라미터는 이식 부피(Cavalieri estimator), 총 세포 카운트 및 도파민성 세포 카운트(TH/FoxA2 이중 표지 뉴런을 이용함) 및 증식성 지수(% Ki67+)를 포함한다. 나열된 항체는 상업적으로 입수할 수 있으며, 본 발명의 개발 동안에 사용된다.
일부 구현예에서, 인간 상황에 보다 적합하게 하기 위하여 스프라그-돌리(Sprague-Dawley, SD) 래트를 사용하는 것이 고려된다. SD 래트는 이식 하루 전부터 시작하여 희생될 때까지 매일 시클로스포린(15 ㎎/㎏)의 복강내 주사를 받을 것이다. 시클로스포린의 수성 형태(Neoral, 인간에서 사용되는 경구 용액)를 장기간 주사해도 이환율은 무시해도 될 정도이다.
일부 구현예에서, mDA 뉴런 배양의 규모를 키우기 위한 예시적인 방법이 제공된다(표 9 참조). 특정 구현예에서, 이러한 방법은 임상적 이용을 위해 GMP 레벨 배양을 제조하기 위해 사용하는 것이 고려된다.
평가 파라미터. 이식 유효성의 단기간 및 장기간 방법에 사용하기 위한 생체내 테스트가 고려되었다. 본 발명의 개발 동안에 얻어진 결과는 양쪽 경우에서 조직 특성분석이 동일함을 보여주었으며, 이식된 전구체의 분화로 인해 장기간 생존자에서 TH+ 세포의 비율이 증가할 것으로 예상되었다.
평균 250,000 세포 당 15,000 TH+/FoxA2+ 뉴런이 이식될 때, 상기 동물은 이식 후 5개월 동안 생존하였다. 단기간 생존에서는 현저하게 적은 이중 표지된 세포가 생존 및 카운트되었다. 따라서, 표 9에 나타낸 것과 같은 생체내 수율은 보존적 추정값(conservative estimate)인 것으로 생각된다. 이식 조성 결과에 대한 Pass/Fail 상태를 평가하기 위해 사용되는 예시적인 파라미터는 표 10에 나타나 있다.
장기간 이식에서, 거동 평가는 hES 주 생성물의 성능의 필수적인 성분이다. 기능 상실 및 회복을 정의하는 지침은 암페타민 회전에 대해 가장 잘 기술되어 있으며, 강력한 이식은 상기 거동을 정상화시키고, 때때로 DA 불균형으로 인해 대측성 이동으로 나타나야 한다. 표 11에 나열된 한계는 본 발명의 개발 동안에 결정된 것과 같은 예시적인 지침이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 분화 방법에서 사용하기 위한 세포 공급원은 WA09, ACT(M09), Bio-Time 및 Roslin 세포주를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 분화 방법에서 사용하기 위한 세포 공급원은 GMP 등급의 주를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 분화 방법에서 사용하기 위한 세포 공급원은 단기간 생착 생존 분석에 사용하기 위한 성숙한 DA 뉴런의 생산을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 분화 방법에서 사용하기 위한 세포 공급원은 거동 평가를 포함하는 생착 실험에서 사용하기 위한 성숙한 DA 뉴런의 생산을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 대조군은 Research Grade WA09 및 샴 생리식염수 군으로 이루어질 것이다.
A. 줄무늬체 재신경분포의 정도를 평가하기 위한 복합 거동 분석. 표준 거동 테스트(본 명세서에 기재한 것과 같은)는 이식물 내에서 생존하는 도파민 뉴런의 수와 직접적인 연관성을 나타내었다. 본 발명의 성숙한 DA 뉴런 세포로 처리된 래트에서, 거동 테스트는 암페타민-유도성 회전을 감소시키기 위해 요구되는 약 30% DA 뉴런 회복의 추정값으로 최대 회복됨을 보여준다. 따라서, 숙주에서 DA 뉴런의 생존을 위핸 역치(래트 모델에서 800-1200 DA 뉴런의 추정값)에 일단 도달하면, 개선 전략을 반영하는 거동의 차이를 구별하기가 어려울 수 있다. 큰 이식물과 대조적으로 줄무늬체에 걸쳐서 복수의 작은 이식물을 두게 되는 결과인 미세이식 접근법이 개시되어 있다. 이식된 DA 세포의 총 수에 대해 조절하면서, 2개의 군을 비교할 때 거동 결과에서의 차이점이 발견되었다: 복수의 작은 이식물을 갖는 래트는 하나의 큰 이식물을 갖는 동물과 비교할 때 약물-유도성 회전 및 보행 테스트에서 더 이르고 더 광범위한 거동 회복을 나타내었고, 동일한 수의 DA 뉴런 및 동일한 양의 도파민 방출을 나타내었다. 놀랍게도, 앞다리의 능숙한 사용에서 구별되는 차이점이 있었는데, 작은 널리 분포된 이식물을 갖는 동물은 개선을 나타내었지만, 표준 이식물을 갖는 래트는 그렇지 않았다. 앞다리의 능숙한 사용은 DA 방출에 대한 시공간적 조절과, 따라서 이식된 뉴런과 숙주 줄무늬체 사이의 올바른 연결성을 필요로 하는 일인 것으로 생각된다. 따라서, 일부 구현예에서, 생착 절차에서 본 발명의 성숙한 DA 뉴런을 사용하면 앞다리 사용을 회복하게 된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 성숙한 DA 뉴런은 상기 줄무늬체의 한 위치에 투여된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 성숙한 DA 뉴런은 상기 줄무늬체 내의 적어도 2 이상의 위치에 투여된다.
B. 앞다리의 능숙한 사용(또는 계단) 테스트. 앞다리 테스트는 앞다리의 뻗기와 쥐기를 분석하며, 병소 전후 및 이식 후에 수행하였다. 동물은 테스트 전에 48시간 동안 먹이를 주지 않았고, 병소 전 매일 5일 동안 테스트한 후, 병소 후 3주 간격으로 2회 테스트하였다. 이식 후, 상기 테스트를 3월 및 5월에 2회 더 반복하였다. 이중 계단이 장착된 플렉시글라스 챔버 내에 위치시켰다. 이식전 테스트의 경우 먹이 펠렛은 양측으로, 이식 후에는 단측으로(회전에 대측성인 영향을 받은 다리 측) 5 발걸음에 위치하였다. 동물을 시간 프레임 세트(예컨대, 10분)에 대해 테스트하였고, 먹은 펠렛(성공적으로 도달함) 및 취해진 펠렛의 수와 비를 계산하였고, 개별 동물의 병소전 성능과 비교하였다. 상기 테스트에는 반복의 수 및 테스트의 타이밍을 포함하는 몇 가지 변화가 있었다.
Ⅷ. 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 분화된 세포는 인 시투(in situ)에서 DA 세포와 유사한 전기생리학적 반응을 보였다.
하기 실시예는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 분화되어 나온 중뇌 DA 뉴런의 기능적 능력을 결정하기 위한 본 발명의 예시적인 방법의 이용을 개시한다. 생체내 SNpc(substantia nigra pars compacta) DA 뉴런은 뇌 속의 대부분의 다른 뉴런으로부터 이들을 구분짓는 전기생리학적 표현형을 나타낸다. 특히, 이들은 느린(1-3 Hz) 속도로 자연스럽게 스파이크된다. 또한, 이러한 느린 스파이킹은 느린 역치이하 진동 포텐셜과 동반된다. 시험관내에서 2-3주 후, 이들 동일한 생리학적 특징들은 초기 출생후 마우스로부터 배양된 SNpc DA 뉴런에 의해 나타난다. 본 발명의 mDA 뉴런이 필적하는 전기생리학적 표현형을 보이는지 여부를 결정하기 위하여, 본 발명의 mDA 뉴런의 전기 반응 시그니처(signature)를 테스트하였다. 배양 80-100일에 본 발명의 중뇌 DA 뉴런을 단일 세포 기록에 의해 테스트하였다. hESC로부터 분화된 상기 mDA 뉴런은 일관되게(4/4 테스트) 특정한 자율적 스파이킹 거동 및 진동 막 전위 변화를 보임으로써 이러한 구별되는 생리적 표현형을 나타내었다(도 3의 g 내지 i). 상기 거동은 자율적 보조조정 활성으로 알려져 있으며, 중뇌 DA 뉴런의 구체적인 특성 및 특히 중뇌 도파민 뉴런의 서브타입(흑색질 유형 중뇌 DA 뉴런)이 파킨슨 질환에 대해 가장 관련이 있다.
즉, 생착된 영역의 생검으로부터 급성 슬라이스(slice)의 제조에 사용하기 위해 전기생리학적 측정이 고려된다. 한 구현예에서, A9 대 A10 유형의 그래프트 유래 DA 뉴런은 PD에서 가장 영향을 받는 A9 유형의 도파민 뉴런에 특이적인 자율적 보조조정 활성에 대한 테스트에 기반하여 생체내에서 확인될 것이다. 달리 말하면, A10 유형 뉴런은 보조조정 활성을 갖지 않는다.
급성 슬라이스 제조물에서 인간 다능성 줄기 세포 유래의 DA 뉴런의 생체내 기록을 위한 조건이 확립되었다(도 26 참조). 구체적으로, 다능성 줄기 세포로부터 유래된 그래프트된 인간 DA 뉴런의 전기생리학적 특징에 대해 측정하였고, 마우스 SNpc(substantia nigra pars compacta)에서 보여지는 것들의 전형적인 전기생리학적 특징을 갖는 것으로 발견되었다. 도 26의 A는 이식된 영역 내의 보조조정 뉴런의 재구성을 보여주는 상면도이다. 아래는 hES 유래 뉴런이 9개월 전에 주사되었던 래트로부터 취한 예시적인 뇌 슬라이스의 현미경사진을 보여준다; 상기 그래프트는 윤곽이 나타나 있다; 고 배율 이미지는 아래에 삽도로 나타나 있다. 상기 슬라이스는 티로신 히드록실라아제로 처리하였으며, 위에 하얗게 나타나 있다(도 26의 B). 또한, 상기 상면도는 상기 그래프트 내의 잠재적인 DA 뉴런으로부터 기록하는 예시적인 세포-부착 패치를 보여준다; 아래는 동일한 세포로부터 기록하는 예시적인 전체 세포를 보여준다. 기록은 시냅스 입력을 제거하기 위하여 글루타메이트 및 GABA 수용체 길항제(50 μM AP5, 10 μM CNQX 및 10 μM GABAzine)의 존재 하에 수행되었다. 상기 기록은 PS 유래의 뉴런은 보통의 내부체세포성(intrasomatic) 전압 궤적(trajectory)을 갖는 자율적 보조조정제임을 보여주었다. 그래프트 샘플 내에 기록된 다른 뉴런은 유사한 특성을 가졌다(도 26의 C). 비교를 위하여, 성체 마우스의 SNpc 내의 도파민성 뉴런 유래의 세포-부착 및 전체 세포 기록이 나타나 있다. 약어는 다음과 같다: CTx=피질, STr=줄무늬체, SNpc=substantia nigra pars compacta, DA=도파민성. 상기 데이터는 그래프트된 래트 줄무늬체에서 이식 몇 개월 후의 생체내 기능 연구를 보여준다. 따라서, 일부 구현예에서, 그래프트된 조직에 대한 생체내 기능 연구는 SNpc(substantia nigra pars compacta)의 회복을 나타낸다.
Ⅸ. PINK1 돌연변이체 유전적 PD-iPS 세포(PINK1 돌연변이)의 DA 뉴런으로의 방향성(directed) 분화는 성숙한 DA 뉴런에서 파킨슨-유사 이상(abnormality)을 나타내었다.
본 실시예는 배아가 파괴되지 않게 되는 방식으로 얻어진 PD 환자의 세포주, 즉 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 세포가 본 발명의 FOXA2/LIM1XA/TH+ DA 뉴런을 얻기 위한 세포 모집단으로 사용될 때 PD 환자 뉴런의 특징을 갖는 중뇌 DA 뉴런의 많은 모집단이 발생되었다는 발견을 개시하고 있다.
한 구현예에서, 본 발명자들은 시험관내에서 진정한 DA 뉴런을 만드는 방법에서 사용하기 위해 환자로부터 출발 세포 모집단을 단리하는 것을 생각하였으며, 상기 환자는 파킨슨 질환(PD)의 증상을 갖고, 시험관내 테스트에서 상기 처리된 세포를 사용하는 잠재적인 이점은 1) 신경학적 증상을 갖지 않는 인간 유래의 진정한 DA 뉴런과 비교하여 분화 또는 기능 이상을 관찰하고, 이후 2) 상기 이상을 되돌리기 위한 치료적 처리를 개발하기 위해 관찰된 이상을 이용하며, 및 3) 파킨슨 질환의 증상을 줄이기 위하여, 즉 되돌리기 위하여 상기 환자를 치료적 처리로 처리하는 것이다.
한 구현예에서, 본 발명자들은 이식 치료에 사용하기 위해 진정한 DA 뉴런을 끌어내기 위하여 동일한 환자로부터 출발 세포 모집단을 단리하는 것을 생각하였으며, 상기 환자는 파킨슨 질환(PD)의 증상을 갖고, 면역학적 거부, 즉 이식 거부를 감소시키는 잠재적인 이점을 갖는다. 다른 구현예에서, 이식 거부의 감소는 주요 조직적합성 복합체(MHC)가 일치하는 인간(즉, 쌍둥이) 또는 이식을 위한 허용가능한 MHC 조직 일치를 갖는 인간(예컨대, 부모의 친척 또는 중첩하는 MHC 분자를 발현하는 비연관 인간)으로부터 단리된 시작 세포 공급원을 이용하는 것이 생각된다.
A. 방향성 분화는 유전적 PD-iPS 세포인 PINK1 세포가 중뇌 유사 DA 뉴런으로 발생하는 능력을 갖고 있음을 보여주었다. 도 20 내지 도 25 참조. PINK1 Q456X 돌연변이체 PD-iPSC 주는 본 발명의 신규한 바닥 플레이트 기반의 중뇌 DA 뉴런 프로토콜(방법)을 이용하여 분화되었으며, H9 주로 분화된 신규한 바닥 플레이트 기반의 중뇌 DA 뉴런 프로토콜로부터 얻어진 것들에 필적하는 분화 프로필을 발현하는 중뇌 DA 뉴런을 생성하였다(도 20). 상기 실시예는 배아를 파괴하지 않게 되는 방식으로 얻어진 PD 환자의 세포주, 즉 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 세포가 본 발명의 FOXA2/LIM1XA/TH+ DA 뉴런을 얻기 위한 세포 모집단으로 사용될 때 PD 환자의 뉴런의 특징을 갖는 중뇌 DA 뉴런의 많은 모집단이 발생한다는 발견을 개시하였다.
PINK1 Q456X 돌연변이체 PD-iPSC 주는 본 발명의 신규한 바닥 플레이트 기반의 중뇌 DA 뉴런 프로토콜(방법)을 이용하여 분화되었으며, iPSC H9 주로부터 얻어진 것들에 필적하는 중뇌 분화 프로필을 생성하였다(도 20). A-C) 분화 11일(중뇌 전구체 단계)에 FOXA2(빨강색), LMX1A(녹색) 및 DAPI(파랑색)(A) 및 분화 25일(초기 유사분열후 DA 뉴런 단계)에 FOXA2(빨강색) 및 TH(녹색)(B) 및 NURR1(빨강색) 및 TH(녹색)(C)에 대한 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 주의 면역세포화학 분석. D-F) 분화 11일에 FOXA2(빨강색), LMX1A(녹색) 및 DAPI(파랑색)(D) 및 분화 25일에 FOXA2(빨강색) 및 TH(녹색)(E) 및 NURR1(빨강색) 및 TH(녹색)(F)에 대한 H9 유래 세포를 이용하여 수행된 동일한 세트의 면역세포화학 분석.
B. 유전적 PD-iPSC는 단백질 응집의 PD 유사 표현형을 발현하였다. 도 21 내지 도 24. 본 발명자들은 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC가 신규한 바닥 플레이트 기반의 중뇌 DA 뉴런 유도 프로토콜을 이용한 분화 55일에 TH+ DA 뉴런의 세포질에서 α-시누클레인(PD 환자에 대한 루이 바디(Lewy body)의 주요 성분) 발현의 증거를 보여준다는 것을 발견하였다(도 21의 a 및 b). A, B) 분화 55일에 α-시누클레인(LB509, 빨강색), TH(녹색) 및 병합된 이미지(A) 및 α-시누클레인(빨강색) 및 유비퀴틴(녹색)(B)에 대한 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 주의 면역세포화학 분석. 또한, 상기 α-시누클레인 양성 세포는 높은 유비퀴틴(고전적인 루이 바디 마커) 발현을 보여주었다. 이와 대조적으로, 대조군인 iPS 주로부터 유래된 DA 뉴런은 정상 시냅스성(세포질성과 반대됨) α-시누클레인 발현과 매우 낮은 레벨의 유비퀴틴의 발현을 보여주었다(도 21의 c 및 d). C, D) 분화 55일에 α-시누클레인(빨강색), TH(녹색)(C) 및 α-시누클레인(빨강색) 및 유비퀴틴(녹색)(D)에 대한 대조군인 iPSC 주의 면역세포화학 분석.
C. 응집된 형태의 α-시누클레인의 발현. PD 환자 뇌에서, 다이머화된 불용성 형태의 α-시누클레인이 루이 바디에서의 응집을 이끈다. 상기 다이머화된 형태의 α-시누클레인은 α-시누클레인 상의 세린 129의 인산화를 보여준다. 동일한 분화 일에 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 유래 세포는 매우 낮은 레벨의 발현을 보이는 대조군 iPSC 유래 세포와 비교하여 Ser129 인산화된 α-시누클레인에 대한 강한 발현을 보여주었다(도 22).
PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 유래 세포는 매우 낮은 레벨의 발현을 보이는 대조군 iPSC 유래 세포와 비교하여 Ser129 인산화된 α-시누클레인에 대한 강한 발현을 보여주었다. A, B) 분화 55일에 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 유래 세포(A) 및 매치된(matched) 대조군 iPSC 유래 세포(B)에서 Ser129 인산화된 α-시누클레인(녹색) 및 DAPI(파랑색)에 대한 면역세포화학 분석.
D. α-시누클레인 발현 패턴에서의 차이는 분화 프로토콜 의존적으로 관찰된다. 본 발명자들은 바닥 플레이트 유래 "진정한" 중뇌 DA 뉴런은 PD 특이적 취약성(vulnerability)과 대응하는 특이적인 시험관내 표현형을 보인다고 생각하였다. 고전적인 MS5 기질성 피더(stromal feeder) 기반의 분화 프로토콜(Perrier et al., PNAS 2004, 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)을 이용하여 얻은 DA 뉴런은 많은 수의 TH+ 뉴런을 생성하였다. 그러나, 본 발명의 발생 동안에 얻어진 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 MS5 기반의 TH+ 세포는 진정한 바닥 플레이트 유래 중뇌 DA 뉴런이 아니었음을 보였다. 상기 MS5 프로토콜을 통해 분화된 배양에서, 많은 α-시누클레인 양성 세포가 있었다. 그러나, 상기 세포들은 TH를 동시-발현하지 않았다. 또한, 상기 MS5 분화 전략을 사용할 때, PD-iPSC 및 대조군 iPSC 사이에 발현 패턴에서의 차이는 없었다(도 23의 a 및 b). 상기 데이터는 α-시누클레인은 다른 비-DA 세포 유형에서도 발현되며, 이러한 비-DA α-시누클레인은, 특히 표준 MS5 분화 프로토콜을 이용할 때, 질환 대 대조군 iPSC 유래 세포에서 변화되지 않음을 나타낸다. DA-유사 로제트 유래 뉴런이 문헌에 보고되어 있다(예컨대, Perrier PNAS 2004). 상기 MS5 기반의 TH+(=DA-유사) 세포를 도 3, 10, 13 및 16에서 비교용으로 사용한다. 상기 데이터는 α-시누클레인이 다른 비-DA 세포 유형에서도 발현되며, 이러한 비-DA α-시누클레인은, 특히 표준 MS5 분화 프로토콜을 이용할 때, 질환 대 대조군 iPSC 유래 세포에서 변화되지 않음을 나타낸다. 마지막으로, 본 명세서에 기재된 새로운 바닥 플레이트 기반의 분화 프로토콜은 α-시누클레인을 동시-발현하는 많은 수의 TH+ 세포를 생성하였다. 상기 TH+ 세포는 세포질 발현 패턴으로 α-시누클레인을 발현한다. 도 24. A, B) 60일에 MS5 기반의 분화(A) 및 대조군 iPSC(B)의 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 주의 α-시누클레인(LB509, 빨강색), TH(녹색)에 대한 면역세포화학 분석. C) 바닥 플레이트 기반의 분화 55일에 α-시누클레인(빨강색), TH(녹색)에 대한 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 주의 면역조직화학 분석.
E. 유전적 PD-iPSC 세포로부터 유래된 DA 뉴런은 독성 자극에 대해 보다 취약하다. 도 24 및 도 25. 바닥 플레이트 기반의 프로토콜을 통해 유래된 PD-iPSC 유래 TH+ DA 뉴런은 대조군 iPSC 유래 세포보다 독소 유발접종(발리노마이신: 미토콘드리아 이오노포어, 5 μM(1-10 μM의 농도 범위), 48시간)에 대해 보다 취약하였다. 이와 대조적으로, 고전적인 MS5 기반의 프로토콜을 통해 유래된 TH+ 뉴런은 PD 대 대조군 유래 세포 사이에 상이한 취약성을 보이지 않았다(도 24). 또한, 발리노마이신 처리 48시간 후에 알라마르-블루를 이용한 전체 세포의 생존능 분석은 PD-iPSC 및 대조군 iPSC와 비교시 독소 유발접종에 대해 특정 용량 범위(5 및 10 μM)에서 상이한 세포 생존을 보였다(도 25). PD 및 대조군 iPSC 유래 배양 모두의 정상 조건은 MS5 기반의 프로토콜(D, PD-iPSC 유래 세포가 나타남), PD-iPSC에서의 독소 유발접종 후의 TH+ 뉴런(E) 및 MS5 프로토콜을 통해 얻어진 대조군 iPSC 유래 배양(F)을 통해 얻었다. G-H) 분화 60일에 바닥 플레이트 기반의 프로토콜에 의한 Tuj1(빨강색) 및 TH(녹색)에 대한 면역세포화학의 저배율 이미지: 정상(G) 대 독소 유발접종(H) 조건의 PD-iPSC 및 정상(I) 대 독소 유발접종(J) 조건의 대조군 iPSC. K-N) 분화 60일에 MS5 기반의 프로토콜에 의한 Tuj1(빨강색) 및 TH(녹색)에 대한 면역세포화학의 저배율 이미지: 정상(K) 대 독소 유발접종(L) 조건의 PD-iPSC 및 정상(M) 대 독소 유발접종(N) 조건의 대조군 iPSC.
세포 생존능의 예시적인 정량화 - 독소 유발접종에 대한 용량 반응 분석. 발리노마이신 처리 48시간 후에 알라마르-블루를 이용한 세포의 생존능 분석은 PD-iPSC 및 대조군 iPSC와 비교시 독소 유발접종에 대해 특정 용량 범위(5 및 10 μM)에서 상이한 세포 생존을 보였다(바닥 플레이트 기반의 분화 60일). 주: 상기 분석은 전체 세포사를 테스트하며, 가장 극적인 효과는 구체적으로 DA 뉴런에서 관찰되었다(도 14 참조). 따라서, 알라마르 블루 기반의 정량화는 DA 뉴런 계통에서 관찰되는 상이한 효과의 정도를 과소평가하기 쉬울 것이다.
Ⅹ. 예시적인 mDA 뉴런을 제공하기 위한 본 발명의 조성물 및 방법을 이용한 대규모 배양의 고려
본 명세서의 개시는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 의해 분화되어 생성된 mDA 뉴런 세포의 대규모 생산을 위한 예시적인 방법 및 이용을 보여준다. 확장가능한 제조(즉, 상대적으로 적은 수의 세포를 함유하는 배양으로부터 mDA 뉴런 세포를 제조하기 위해 성공적인 것으로 생각되는 방법)는 25일에 이식가능한 mDA 뉴런의 세포 모집단을 생성하는 것으로 나타났다(특히, PINK iPSC 세포의 경우. 표 9 참조).
XI. 중뇌 DA 뉴런의 농축 방법
본 발명의 개발 이전 및 그 동안에 다능성 줄기 세포를 오염시키는 것을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 오염성 세포 모집단을 고갈시킴으로써와 같이 문제들을 극복함으로써 중뇌 DA 뉴런 전구체에 대한 세포 모집단을 농축하는 목표로 몇 가지 방법이 개발 및 테스트되었다. 초기 연구는 1차 배아성 마우스 뉴런, 배아성 래트 뉴런 및 마우스 ESC 유래 모집단을 이용하여 수행되었다. DA 뉴런 농축에 사용하기 위해 신경 모집단을 증가시키는 목표를 갖는 것에 더하여, 상기 마우스 ESC 연구는 이전의 절차에서 문제시되었던 테라토마 형성을 방지하기 위한 절차를 개발하는 것을 포함하였다. 이러한 전략은 신경 마커(NCAM)를 발현하는 세포의 양성 선택(positive selection)과 함께 다능성 세포(예컨대, SSEA1)에 발현되는 세포 표면 마커에 대한 음성 선택(negative selection)을 포함하였다. 마우스 세포를 이용함으로써, DA 뉴런 이식 패러다임에서 신경 세포에 대한 농축을 확인하는데 사용하기 위한 몇 가지 유전적 리포터 전략이 제안되었다(예를 들면, SOX1, Corin/Lmx1a, Ngn2, TH, Pitx 또는 DAT를 발현하는 세포를 확인하는 것). 기능적 테스트는 Ngn2-리포터 마우스(Thomposon et al., Exp Neurol. 198(1):183-98 (2006)) 및 코린(Corin)에 대해 분류된 Lmx1A-리포터 마우스(Jonsson, Exp Neurol. 219(1):341-54 (2009)) 유래의 1차 세포에서 수행되었다. 마우스 ESC 유래 모집단의 경우, 연구는 SOX1(Barraud et al., Eur J Neurosci. 2005 22(7):1555-69), TH(Kelly et al., Minerva Endocrinol. 1991 16(4):203-6), Pitx3(Hedlund et al., Stem Cells. 2008 26(6):1526-36) 및 DAT(Zhou et al., Stem Cells. 2009 27(12):2952-61) 마우스 ESC 리포터 주를 이용하여 수행되었다. 추가적으로, 본 발명의 개발 동안에, 본 발명자들은 DA 뉴런 발생의 순차적인 단계를 대표하는 3가지 정제된 마우스 ESC 유래 모집단의 생체내 성능을 직접 비교하는 포괄적인 이식 연구를 수행하였다: 중뇌 전구체(Hes5::GFP), 초기 유사분열후 세포(Nurr1::GFP) 및 성숙한 DA 뉴런(Pitx3::YFP). 상기 연구는 Nurr을 발현하는 DA 발생이 이식을 위해 특히 적합함을 확인하였으며, 정제된 DA 뉴런이 생체내에서 효과적으로 생착할 수 있음을 나타내었다. 또한, 상기 결과는 PD의 마우스, 래트 및 레서스 원숭이 모델로 hESC-DA 뉴런을 이식하는데 사용하기 위하여 분화 25일(Nurr1 발현의 개시)에 세포를 선택하는데 사용되었다.
본 발명의 개발 동안에, hESC로부터의 진정한 중뇌 DA 뉴런의 생산은 뛰어난 생체내 성능을 보였으며(도 4 참조), 본 명세서에 기재된 프로토콜을 사용하면 이식 시점에 대략 40%의 DA 뉴런을 생성하게 된다. 상기 백분율은 인간 태아 배쪽 중뇌 조직의 절개 후 얻어진 DA 뉴런의 백분율(전형적으로는 대략 10%)을 상회한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 것과 같은 DA 뉴런의 hESC 기반의 공급원을 사용하면 세포 정제 전략을 사용할 때 순도에서 훨씬 추가적으로 개선될 것으로 생각된다. 추가적으로, Nurr1::GFP 주와 같은 인간 세포주를 포함하는, 마우스 연구에서 사용된 것과 유사한 hESC와 함께 사용하기 위한 유전적 리포터 주가 개발되었다. 그러나, GFP는 인간에서 면역원이기 때문에 인간에서의 번역 사용의 경우에는 유전적 리포터를 사용하는 것이 문제의 소지가 있을 수 있으며, 따라서 인간에서 사용하기에는 적합하지 않다. 또한, FACS 분류는, 각 이식에 대해 필요로 하는 대략 109 세포의 배치(batch)를 분류하기 위해 상당한 시간이 요구될 뿐만 아니라 잠재적으로 높은 비용 및 보관으로부터 회복한 후의 낮은 세포 수율로 인하여, 임상적 등급의 DA 뉴런 마스터 세포 은행을 확립하기 위해서는(즉, 이식에 사용하기 위한 인간 DA 뉴런의 동결 스톡(stock)의 개발) 문제의 소지가 있을 수 있다.
유전적 리포터 시스템 및 FACS 기반의 세포 단리와 대조적으로, 본 발명자들은 PD 환자에서 사용하기 위해 고려된 세포 분리 기술에 대한 대안적인 전략을 이용한 표면 마커 발현에 기반한 DA 뉴런의 단리를 생각하였다. 예를 들면, 자성 비드(magnetic bead) 분류(예컨대, CliniMACS® 시스템)가 FDA-승인된 세포 기반의 적용분야에 널리 사용되었으며, GMP-순응(compliant) 조건, 즉 인간에서 사용하기 위한 세포 단리에 대해 승인된 조건 하에 1010 세포까지 빠르고 비용-효과적인 단리를 허용하였다. 따라서, 일부 구현예에서, 성숙한 DA 뉴런의 농축을 위하여 예를 들면, 이식에 사용하기 위한 Nurr1+ 뉴런의 농축을 위하여 자성 비드에 부착된 CD142를 이용하는 자성 비드 분류가 고려된다.
XⅡ. 성숙한 DA 뉴런을 제공하는 방법에서 사용하기 위한 세포 표면 마커의 확인
본 발명의 개발 동안에 수집된 세포 표면 마커 발현 데이터는 중뇌 DA 뉴런에 발현되는 몇 가지 신규한 세포 표면 마커의 확인을 보여 주었다. 구체적으로, 추가적으로 세포, 예컨대 DA뉴런으로 성숙되는 특정한 세포, 본 발명의 성숙한 DA 뉴런 및 A9 세포를 확인하기 위한 마커가 발견되었다. 이러한 표면 마커를 확인하기 위하여 2가지 주된 전략이 사용되었다: 첫 번째는 유전적 리포터 주에서의 비편파적(unbiased) 유전자 발현 스크린(도 27의 a)은 CD142 및 중뇌 DA 뉴런에서 선택적으로 발현되고 A9-유형의 DA 뉴런을 특이적으로 마킹하는 것으로 보이는 DCSM1으로 명명된 마커를 포함하는 몇 가지 후보 마커를 보여주었다(도 27의 b). 두 번째 전략은 hESC 유래 DA 뉴런에서 96 웰 포맷에서 242개의 상업적으로 입수가능한 항체에 대해 테스트한 CD 세포 표면 마커 스크린을 사용하는 것이었다(도 27의 c 및 d). 이러한 예시적인 스크린의 결과(도 27의 e), Nurr1+ DA 뉴런 단계를 선택적으로 마킹하는 마커인 CD142(도 27의 f) 뿐만 아니라 CD63, CD99 및 DCSM1을 포함하는 중뇌 DA 뉴런에서 농축된 적어도 5개의 적합한 마커를 확인하게 되었다.
구체적으로, 도 27에 예시된 것과 같이, 분화 25일에 WA09 유래 DA 뉴런에 대한 CD 표면 마커 스크린을 242개까지의 개별 항체에 대해 테스트하였다. 상기 결과를 비교하기 위하여, 넓은 범위의 다른 WA09 유래 신경 세포 유형(예컨대, hESC 유래 HB9::GFP+ 모터뉴런, hESC 유래 피질 뉴런, hESC 유래 Nkx2.1::GFP+ 배쪽 전뇌 전구체 및 몇 가지 다른 hESC 유래 뉴런 유형)의 이중 스크리닝을 하였다. 이후, 결과적인 표면 마커 발편 프로필의 데이터베이스를 사용하여 중뇌 DA 뉴런과 같은 임의의 해당 서브타입에서 선택적으로 농축된 후보 CD 마커를 선택하였다(도 27). hESC DA 뉴런의 분화와 연관된 것으로 발견된 마커들 중 하나는 CD142였다. 세포를 CD142로 선별하면 다른 뉴런 서브타입은 고갈되면서 Nurr1+ 단계에서 hESC 유래 DA 뉴런에 대해 특이적으로 농축하였다. 일부 구현예에서, CD142는 Nurr1+ 이전에 발현된다. 일부 구현예에서, CD142에 대해 분류된 중뇌 DA 뉴런 세포 모집단은 Nurr1+ 및 Nurr1- 세포를 갖는다. 일부 구현예에서, CD142에 대해 분류된 중뇌 DA 뉴런 세포 모집단은 Nurr1- 세포를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양된 Nurr1- CD142+ 분류된 중뇌 DA 뉴런 세포 모집단은 분류 후 2일 내에 Nurr1의 발현을 시작한다(즉, Nurr1+가 된다).
CD142에 더하여, CD63 및 CD99는 hESC 유래 DA 뉴런에서 농축된 마커였다. 따라서, 일부 구현예에서, DA 뉴런 배양물은 CD142, CD63, CD99, DCSM1, Nurr1+ 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 마커로부터 분류 또는 선택함으로써 DA 뉴런에 대해 농축된다. CD142는 전형적으로 분화 25일에 대략 30%의 총 세포 모집단을 마크한다(도 28의 a). Nurr1+ DA 뉴런 단계에 대한 CD142의 선택성은 복수의 독립적인 hESC 및 hiPCS 주에서 확인되었다(도 28의 b). 중요한 것은, DA 뉴런에 대해 농축하는 것에 더하여, CD142는 GABA 및 세로토닌성 뉴런과 같은 다른 뉴런 서브타입을 선택적으로 고갈시킨다(도 28의 c 내지 f). CD142가 검출가능한 오염성 GABA 및 세로토닌성 뉴런 없이 고순도의 DA 뉴런 그래프트가 생기게 하는 능력을 보여주는 생체내 연구가 수행되었다. 세로토닌성 뉴런은 인간 태아 조직 이식에서 이식-유도성 이상운동증의 잠재적인 공급원으로 생각되어 온 세포 유형이다. 정제되지 않은 세포를 사용하는 본 명세서에 기재된 그래프팅 방법에서 이미 일부 세로토닌성 뉴런이 생성되었지만, CD142를 사용하면 상기 위험을 추가로 감소시킬 수 있다.
A. A9 유형의 성숙한 mDA 뉴런을 확인하기 위한 마커. A9 유래 대 A10 유래 DA 뉴런은 중줄무늬(mesostriatal) 대 중변연(mesolimbic) 기능에서의 이들의 역할에 특이적인 구별되는 시험관내 및 생체내 기능 특성 및 신경분포 패턴을 갖는 것으로 나타났다. 본 발명의 개발 동안에, 본 발명자들은 본 발명의 방법에 의해 생산된 진정한 mDA 뉴런(도 4)이 A10 보다 A9 특징을 더 갖는 뉴런을 생기게 함을 발견하였다. 특히, 적어도 부분적으로 TH+인 진정한 mDA 뉴런은 A9 유형 DA 뉴런을 정의하기 위해 사용되는 마커인 Girk2를 발현하였다. 추가적으로, 많은 성숙한 DA 뉴런은 A9에는 존재하지만 A10 유형의 DA 뉴런에서는 존재하지 않는 기능적 특성인 자율적인 보조조정 활성을 나타내었다. 그러나, 시험관내에서 생성된 일부 TH+ 세포는 A9 정체성이 아니었다. 따라서, 본 발명자들은 인간 A9 유형의 진정한 mDA 뉴런(대 A10 뉴런)의 정제된 모집단을 제공하기 위하여 본 명세서에 기재되어 있는 것과 같은 농축 절차를 고려하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 A9 유형의 뉴런에 특이적인 적어도 2개의 마커 및 적어도 A10 유형의 뉴런에 특이적인 적어도 2개의 마커를 발견하였다. 따라서, 일부 구현예에서, A9 유형은 뉴런은 (Girk2, Aldh1)에 의해 A10 (Calbindin, Otx2) 마커에 대해 확인된다.
B. A9 서브타입을 갖는 중뇌 DA 뉴런의 수율을 향상시키는 마커 세트의 정의. A9 특이적 표면 마커를 정의하기 위한 적어도 2가지 전략이 고려되었다: 후보 마커는 본 명세서에 기재된 것과 같은 유전자 발현 스크린으로부터 얻었고, 후보 CD-항체는 본 명세서에 기재된 것과 같은 표면 마커 스크린으로부터 얻었다. 다른 방법에서, 마우스 ESC의 정제된 모집단에서의 세계적인 전사체 분석은 구별되는 분화 단계에서 mDA 뉴런을 도출하였다(BAC 형질전환(transgenic) 기술을 이용함; 도 27의 a 및 b 참조). 표면 마커는 다음의 예시적인 방법을 이용하여 WA09 RCB로부터 유래된 DA 뉴런 상의 표면 마커 프로필 내에서 발견되었다. 분화 25일에 RCB WA09 유래의 DA 뉴런이 분리되었으며, 96 웰 플레이트에 다시 플레이팅한 후, 242 CD 항체에 노출하였고, 오페레타(Operetta) 고 콘텐트 스캐너를 이용하여 데이터를 분석하였다. 상기 스크린에서 확인된 CD 마커(예를 들면, CD142, CD63 및 CD99)에 결합하는 적어도 5가지 추가적인 항체에 대해 DA-농축의 양을 테스트하였다. FOXA2/TH 및 TH/Nurr1의 발현을 포함하는 DA QC 분석을 이용하여 후보 CD-양성 대 CD-음성 세포를 평가하였다(표 7 참조). 일부 구현예에서, 세계적인 유전자 발현 프로필이 CD142+ 세포로 분류되지 않은 세포와의 비교를 위해 고려된다. 일부 구현예에서, 원하는 마커의 발현으로 분류/분리된 세포가 본 명세서에 기재된 것과 같은 단기간 및 장기간의 생체내 연구에 사용되었다. 본 연구에서 확인된 DA 뉴런 특이적인 마커 중에는 DCSM1(DA cell surface marker 1)으로 명명된 표면 마커 유전자가 있다. 인시투 발현 데이터에 기초하여, 발생하는 및 성체 마우스의 뇌 양쪽 모두 및 인간 성인의 뇌에서(도 27) 배쪽 중뇌에서의 발현뿐만 아니라 더욱 놀랍게는 적어도 부분적으로 A9 선택적인 발현이 발견되었다. hESC 유래 DA 뉴런에서 DCSM1 발현을 발현하는 많은 세포가 관찰되었다. A9 대 A10 정체성에 대한 시험관내 분석은 마커+ 세포의 장기간의 분화(분화 50일 및 75일)를 포함하였고, (ⅰ) 성숙한 뉴런에서 A9 (Girk2, Aldh1) 대 A10(Calbindin, Otx2) 마커에 대한 발현, (ⅱ) Netrin-1 및 Sema3에 대한 차등적인(differential) 축삭 유도 반응, 및 (ⅲ) A9 농축 뉴런의 분석은 전기생리학 테스트에 의해 평가되었다. A9 DA 뉴런은 본 명세서에 기재된 것과 같이 hESC 유래 A9 뉴런에 대해 특이적인 기능적 특성을 나타내었다. ⅰ) A9(Girk2, Aldh1) 대 A10(Calbindin, Otx2) 마커 발현, ⅱ) 이식 DA 섬유 성장, 및 ⅲ) 상기 이식된 세포의 스라이스 제조시의 전기생리학적 A9 특성을 확인하기 위하여 DCSM1 및 다른 마커를 발현하는 세포에 대한 생체내 연구가 수행되었다.
XⅢ. 폴리시알산(PSA) 및 폴리시알릴트랜스퍼라아제(PST) 효소의 이용
이식 통합(integration) 및 DA 섬유 성장의 정도는 PD 환자에서의 태아 이식 연구를 포함하는 이식 방법에서의 도전과제이다. 이식 조직 및 세포를 이용할 때 직면하는 한 문제는 환자를 치료할 때 상기 이식물로부터의 섬유의 성장이 제한적이라는 것이다. 상기 문제는 인간의 경우에 특히 결정적인데, 그 이유는 환자의 회복은 광범위한 줄무늬체의 재신경분포를 필요로 하기 때문이다. 종래의 방법에서, 조직 이식 후에 올바른 재신경분포를 얻는 것은 상기 줄무늬체를 가로질러 세포 디포짓(deposit)을 복수로 주사하는 것을 필요로 한다. 각각의 주사는 다른 외과적 위험과 함께 줄무늬체의 손상 및 염증을 초래할 수 있다. 이러한 위험은 잠재적으로 환자에게 뇌졸중 또는 발작을 유도할 수 있는, 세포 주사 동안의 혈관의 손상을 포함한다. PSA는 (폴리시알릴화) 신경 세포 부착 분자(NCAM), NCAM (CD56) 등과 같은 다른 세포 표면 분자의 (폴리시알릴트랜스퍼라아제(PST) 효소의 작용을 통한) 번역후 변형으로 확인되어 있는 자연적인 세포 표면 시알산 호모폴리머(즉, 알파2,8-결합된 시알산)이다. PSA는 세포 이동 및 축삭 성장을 포함하는 세포-세포 상호작용시에 변화를 필요로 하는 일부 세포 거동의 가소성(plasticity)을 조절하는 기능을 하는 것으로 보인다. 배아에서는 높게 발현되지만, PSA는 성체 조직에서 구조적 및 생리학적 가소성을 유지하는 국소화된 CNS 영역(예컨대, 해마, 시신경교차상핵(suprachiasmatic nucleus), SVZ) 이외에는 하향조절되었다. 따라서, 일부 구현예에서, 폴리시알산(PSA)을 생착된 세포의 섬유 성장을 촉진하기 위해 사용하는 것이 고려된다. 다른 세포 유형에서 PSA를 사용한 예는 인용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함되는 WO 2006/042105에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명자들은 진정한 DA 뉴런을 본 명세서에 기재된 것과 같은 PSA와 조합하여 사용하는 것을 생각한다.
A. PD 환자에서 사용하기 위한 DA 뉴런에서의 증가된 PSA. 작은 동물 모델을 이용하는 종래의 결과에 기초하여 방법 및 세포를 제공하기 위해서는 이식된 세포의 제한된 생존 및 숙주 조직의 불량한 섬유 신경분포를 포함하는 주요 도전과제가 남아 있다. 상기 제한사항들의 영향은 보다 큰 인간 줄무늬체에서 더욱 심각할 것으로 생각되며, 따라서 ES 유래 DA 뉴런의 효과적인 임상 적용을 위해서는 증가된 생존 및 신경분포가 필요하다. 적어도 한 번 이상 몇 번까지의 주사를 사용하는 것을 포함하는 동물 모델에서의 부적절한 섬유의 성장 및 이식 통합은 생체내에서 DA 뉴런의 복수의 주사 또는 불량한 분포와 연관되는 위험을 감소를 나타내는 것으로 생각된다.
폴리시알산(PSA)에 의한 세포 상호작용의 조절은 척추동물의 발생 동안에 세포 분포, 축삭 성장 및 표적 신경분포를 촉진하는 한 인자이다(예를 들면, Rutishauser, "Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system", Nat Rev Neurosci 9, 36-35 (2008) 참조). PSA는 세포-세포 상호작용을 약화시켜서 조직의 가소성을 촉진하는 신경 세포 부착 분자(NCAM)에 부착된 탄수화물 폴리머였다. 신경교(glial) 흉터에서, 성인 뇌에서의 PSA의 증가된 발현은 하부뇌실질(subventricular) 구역으로부터 피질 내로의 뉴런 전구체의 이동 및 개선된 축삭 성장을 촉진하였다(El et al., "Use of polysialic acid in repair of the central nervous system", Proc Natl Acad Sci USA 103, 16989-16994 (2006)). 본 명세서에 기재된 것과 같이, 정제된 마우스 ES 유래 DA 뉴런에 대한 조작된 증가된 PSA 발현은 개선된 이식 세포 카운트, 숙주 줄무늬체 내로의 광범위한 DA 뉴런 섬유 성장, 및 놀랍게도 파킨슨증 마우스에서의 향상된 거동 회복을 일으키게 된다. 또한, 증가된 세포 표면 PSA 레벨에 대해 유전적으로 조작된 ESC 유래 DA 뉴런은 생체내 생존 및 숙주 줄무늬체 내로의 섬유 성장을 동시에 증가시켰다. 포유동물, 즉 마우스 또는 인간의 PST 유전자을 이용하는 한 예시적인 구현예는 도 29에 나타나 있다. 박테리아 PST, 즉 PSTnm을 사용하는 다른 예시적인 구현예는 도 29에 나타나 있다. 구체적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 성숙한 DA 뉴런에 기반한 세포 치료를 위하 사용된 세포에 대한 증가된 PAS는 PD의 치료에 사용하기 위한 것으로 생각된다.
B. 증가된 PSA 발현을 위한 마우스 PST의 이용. 생체내 결과는 마우스 PST-세포 변형 이식물을 받은 6-OHDA 마우스에서의 증가된 신경돌기성 확장(neuritic extension) 및 암페타민 유도성 회전의 현저한 되돌림을 나타내었지만, PTS 변형되지 않은 동일한 수의 세포는 동일한 효과를 달성하는데 실패하였다(도 33). 또한, 작은(대략 50,000 세포의 주사) PSA 양성 세포가 이식될 때 이들이 이식 통합 및 큰(100,000 이상의 세포) 비교 이삭을 사용한 것과 비교하여 대략 70%의 면적이 덮혀 있는 섬유 성장을 제공하는 것과 같이, PD 마우스 모델에서 향상된 거동 결과와 일치되게 개선된 DA 섬유 신경분포가 관찰되었다. PSA-향상된 대 대조군 처리된 ES 유래 DA 뉴런 이식물을 나란히 비교하면 PSA 군에서는 거동 회복을 보여주었으나(이식이 각각 55,000 세포의 이식에 기반하였을 때), 대조군 세포에서는 관찰되지 않았다. 마우스 뇌에서의 100,000 ES 유래 DA 뉴런을 이식하면 PSA-처리된 및 대조군-처리된 ES 유래 DA 뉴런 모두에서 거동 회복을 보여주었는데, 이는 100,000 세포로부터 유래되는 이식은 PSA 향상없이도 마우스 뇌를 재신경분포하기에 충분함을 제시한다. 따라서, 다른 구현예에서, 진정한 DA 뉴런의 표면에 대한 PSA 발현의 조작된 발현은 PD를 갖는 환자의 치료를 위한 절차에 사용하기 위한 것으로 생각된다. PSA가 본 발명의 뉴런 세포에 유도되었을 때, 이것은 뇌 세포에서 자연적으로 발생한 PSA 폴리머와 동일하였고, 따라서 치료적 세포 유형을 조작하기 위한 다른 세포 표면 분자를 사용하는 것과 달리, PSA 발현에 대해 조작된 세포는 인간에서의 생착 절차를 위해 세포에 사용될 때 생체내에서 항원성을 거의 갖지 않는다고 생각된다. 아울러, 생착된 세포에 대한 PSA 레벨이 높으면, 내인성 신경 전구체(Battista et al., J Neurosci. 30(11):3995-4003 (2010)), 슈반 세포(Ghosh et al., Glia. 60(6):979-92 (2012)) 및 본 발명의 ES 유래 DA 뉴런 중 어느 것도 다양한 성체 설치류 모델에서 사용될 때 검출가능한 부작용을 초래하지 않았다. 효과적인 레벨로의 PSA의 조작된 발현은 그 유일한 생성물이 상기 구별되는 글리코폴리머인 단일 폴리실릴트랜스퍼라아제(PST) 효소의 작용을 포함하였다. 놀랍게도, 발현된 단백질의 양 및 효소적 생성물의 본성은 놀랄만큼 일정하며, 배아 조직에서 자연적으로 발견되는 PSA와 매우 비슷하다.
본 명세서에서 기재된 것과 같이, 조작된 PSA 발현은 뉴런 세포를 생착 절차에 사용하기 위한 것으로 생각된다. 특히, PSA는 다른 유형의 유도된 세포 표면 마커 발현을 이용할 때 직면하는 문제들을 극복함으로써 치료적 용도로 세포를 제조하는데 사용하기 위한 것으로 생각된다. 또한, PSA 발현을 사용하면 척추동물 종들을 교차하는 프로토콜(예컨대, 인간 세포에서 발현되는 마우스 PST 유전자를 사용하는 것)에서 재생가능하였는데, 그 이유는 그 수용체가 또한 종들 간에 구조가 일치하였고, 대부분 세포 표면에서 발견되기 때문이다. PST 유전자를 hESC 내로 조작하면 DA 뉴런에 대한 PSA를 증가시킨다. 인간 폴리시알릴트랜스퍼라아제(hPST)를 암호화하는 유전자는 본 명세서에 기재된 것과 같이 렌티바이러스 벡터(pLenty, Invitrogen)를 이용하여 hESC 주(WA01) 내로 도입되었다. 20개의 선별된 클론을 확장하였고, PST 발현에 대해 분석하였다. PST-발현 hESC 클론을 분화시켜 PST가 DA 뉴런에서 사일런스(silence)하지 않음을 확인하였다. 상이한 분화 단계(0, 11, 25 및 50일)에서 PSA-NCAM의 정량화를 FACS 분석 및 면역형광(Operetta)을 이용하여 수행하였다. 양성 클론을 표 7에 개략적으로 나타낸 DA 뉴런 QC 파라미터의 스위트(suite)를 거쳤다. 분화 동안에 높고 균일한 레벨의 PSA-NCAM을 유지하고 QC 파라미터에서 성능이 좋은(표 7) 적어도 3개의 클론은 PST-과발현 hESC 유래 DA 뉴런에서의 신경돌기 성장의 평가를 진행하였다. 선택된 대조군 및 PST-과발현 hESC 클론을 본 명세서에 기재된 표준 프로토콜을 이용하여 DA 뉴런으로 분화시킨 후, 25 및 50일에 세포 고정 및 분석을 수행하였다. 이러한 배양에서의 TH-양성 섬유의 수 및 길이를 오페레타 고 콘텐트 현미경(Operetta High Content Microscope)을 이용하여 정량화하였다. 하모니 소프트웨어 3.0에서의 신경돌기 분석 모듈이 PST를 갖거나 갖지 않는 신경돌기의 수와 길이를 정량화하였으며, 상기 데이터를 이원 ANOVA를 이용하여 분석하였다. 상기 시험관내 연구로부터 진행된 PST-과발현 및 대조군 hESC 클론을 다시 DA 뉴런으로 분화시켰고, 래트의 PD 모델 내로 이식하였다. 생존을 결정하기 위한 단기간 그래프트(4-6주), PSA-NCAM 발현 및 신경돌기 성장을 수행하였다. 단기간의 생체내 파라미터를 통과한 각각의 클론에 대해 장기간 그래프팅 연구를 거쳤다. 상기 연구를 위하여, 동물들은 표준(200×103) 용량의 세포의 절반 또는 1/4을 받았다. 상기 연구는 증가된 PSA가 증가된 이식 후 장기간 생존(5개월)을 유도하는지 여부, 및 작은 수의 DA 뉴런이 표준 세포 용량에서 이식된 비-PST 그래프트의 기능적 용량을 일치 또는 과수행할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 것이었다(도 27). 아울러, 줄무늬체 신경분포의 정도에 민감한 복합 거동 분석을 모니터링하여 PST- 대 대조군 DA 뉴런 그래프트의 기능적 잠재력을 추가로 구별하였다. 거동 분석의 종료 후 상기 동물을 희생시켰고, 인간 특이적 항체인 NCAM 및 SC121 및 TH에 대한 항체를 이용하여 섬유 성장을 정량화하였다(도 29 참조). 상기 hNCAM+, SC121+ 및 TH+ 그래프트의 강도 및 퍼짐뿐만 아니라 DA 뉴런 마커(TH, FOXA2) 및 PSA를 동시-발현하는 인간 세포의 백분율을 측정하였다. 상기 그래프트로부터 나오는 신경돌기의 NCAM/TH+ 무리의 밀도를 상이한 거리에서 정량화하였다. 본페로니 사후 검증(Bonferroni post-hoc test)과 함께 이원 ANOVA를 이용하여 군들 간에 데이터를 비교하였다. 또한, 정성적 변화에 대해 절편들을 조사하였다(예컨대, 분지화, 두께, 이식 분포 및 형태). 아울러, 일부 그래프트는 A9 표현형, 숙주 줄무늬체와의 시냅스 형성뿐만 아니라 내인성 구심성(endogenous afferents)의 관점에서 슬라이스 전기생리학적 평가에 대해 처리하였다(도 26 참조).
다음의 실시예는 파킨슨증 마우스에서 ES 유래 도파민 뉴런 그래프트의 기능을 개선하는 폴리시알산 발현의 향상을 보여준다.
Nurr1 프로모터의 조절 하에 GFP를 발현하는 ES 세포(Nurr1::GFP ES 세포)는 폴리시알릴트랜스퍼라아제(PST)를 어디서나(ubiquitously) 발현하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 안정적으로 형질도입되었다. 형질도입된 세포는 대조군과 비교할 때 PST mRNA의 극적인 증가를 보여주었다(도 30의 A). PST의 발현은 NCAM에서 PSA를 합성하기에 충분한 것으로 관찰되었다. 따라서, PSA-NCAM 발현은 DA 뉴런 분화의 14일에 PST-변형된 세포에서 크게 증가되었다(도 30의 B 내지 E). ES 유래 DA 뉴런 상의 내인성 및 유도성 세포 표면 PSA는 모두 PSA의 독특한(unique) 알파-2,8-결합된 시알산 폴리머를 특이적으로 절단하는 파지(phage) 엔도뉴라미니다아제(endoneuraminidase, endoN)에 의해 제거될 수 있었다(도 30의 E). 놀랍게도, PST 형질도입은 GFP 정제된 DA 뉴런에서 뉴런 또는 중뇌 마커의 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다(도 30의 F).
6OHDA 병소의 헤미파킨슨증 마우스에서의 다른 연구는 강력한 기능 회복을 생성하기 위해서는 암페타민-향상된 회전 테스트에서 측정된 것과 같이 대략 100,000 ES 유래 DA 뉴런 전구체의 이식을 필요로 함을 보여주었다. 본 연구에서, 향상된 PSA 발현으로 인한 증대(augmentation)를 평가할 수 있기 위한 차선의 세포 수를 구하였다. 오염성 다능성 세포가 고갈된 매우 농축된 DA 뉴런 모집단을 이식하기 위하여, 분화 14일에 FACS-정제된 배양물을 Nurr1-구동성(driven) GFP의 발현 및 SSEA-1 발현의 부재에 대해 조사하였다(도 31). PST 과발현이 없는 경우, 최소한으로 효과적인 그래프트의 크기가 절반으로 감소되면(55,000 Nurr1+ DA 세포) 검출가능한 거동 회복을 생산하는데 실패하였다. 이와 대조적으로, PSA 발현이 향상되면, 동일한 수의 Nurr1/PST DA 뉴런이 PD 거동 손상을 현저하게 정정하게 되었고(p<0.01; 이원 ANOVA), 대략 수술 5주 후 완전히 회복되었다(도 32의 A). endoN 처리가 Nurr1/PST로 얻어진 기능적 복구를 부분적으로 되돌린다는 점에서, endoN을 이용한 인큐베이션에 의한 이식 전의 PSA 제거는 PSA 향상의 특이도를 나타내었다(도 32의 A).
그래프트된 세포의 특성을 조사하기 위하여, 동물을 이식 2개월 후 면역조직화학에 대해 처리하였다. PST-형질도입된 주로 그래프트된 동물은 대조군 세포로 그래프트된 동물보다 평균 2배 많은 GFP+ 세포를 가진다는 점에서(PST 대 대조군 샘플에서 각각 그래프트 당 9,300±1,400 대 4,230±1,010 GFP+ 세포; 도 32의 B, p<0.05, 스튜던트 테스트), 생존한 Nurr1+ 뉴런의 수에서 차이가 있었다. 또한, Nurr1/PST 그래프트는 또한 생체내에서 PSA 발현의 레벨이 더 높게 나타났다(도 32의 C 및 D). 그러나, 상기 그래프트 코어 내에서 중뇌 DA 마커 TH 및 FoxA2를 발현하는 세포의 비율은 상기 Nurr1 및 Nurr1/PST 세포에서 비슷하였다(각각 TH: 62.0%±8.0 대 51.3%±7.0, p=0.33; FoxA2: 63.2%±8.6 대 55.4%±2.0, p=0.3; 도 32의 E).
상기 Nurr1 및 Nurr1/PST 세포로부터 나오는 뉴런의 프로세스는 비슷한 레벨의 TH, Girk2(G-단백질-커플링된, 내측 정류 칼륨 채널) 및 시냅신을 보여주었다(도 33의 A). 이식된 슈반 세포를 이용한 다른 연구들과 달리(Ghosh, et al. Glia 60, 979-992 (2012)), 향상된 PSA 발현은 그래프트된 부위로부터의 DA 세포의 이동에는 영향이 적었다. 그러나, 신경돌기 성장에서는 명확하게 변화되었다. 도 33의 B에 나타낸 바와 같이, Nurr1+ 대조군과 비교할 때 Nurr1/PST 세포로부터 더 많은 DA 뉴런 프로세스가 나왔다. GFP 및 TH 면역형광의 강도가 상기 이식물로부터 5번의 연속적인 100 ㎛ 구역 밖에서 정량화될 때, Nurr1/PST 그래프트는 훨씬 큰 상대적인 프로세스 밀도를 보였다(도 33의 C 및 D; GFP 및 TH 모두에 대해 p<0.01, 이원 ANOVA). 상기 효과를 정량화할 때, 그래프트 코어 가까이에 있는 가장 근접한 구역에서 관찰된 밀도에 대한 상대적인 프로세스 밀도로 정상화된다. 이러한 정상화는 상기 Nurr1/PST 그래프트 내의 많은 수의 생존 세포에 대해 상쇄하고, 신경돌기 성장에 대한 PSA의 특이적인 효과를 확인하기 위해 필요하다. 또한, 특이도는 그래프팅 전에 endoN 처리에 의해 세포 표면 PSA가 제거될 때 설명되었다. 따라서, endoN으로 전처리하면 먼 섬유의 성장을 대조군 레벨로 뒤로 감소시켰다(도 33의 E).
상기 발견은 그래프트 기능에 대한 PSA의 적어도 일부 효과는 줄무늬체의 향상된 섬유 신경분포로부터 나온다는 것을 보여주었다. 따라서, 그래프트 기능과 예컨대 구역 Ⅳ로의 GFP-양성 섬유의 성장의 상대적인 정도 사이에 강한 상관관계가 있었다(도 33의 F; p<0.001, r2=0.65, n=17). 놀랍게도, 상기 섬유의 성장/거동 상관관계는 실험군들(대조군, PSA 향상군 및 endoN 처리군)에 대해 일치하였는데, 이는 그래프트-숙주 신경분포가 마우스 파킨슨증 모델에서 거동 회복을 위한 파라미터임을 나타낸다. 상기 그래프트 코어를 캡슐화하는 활성형 신경교 구역의 향상된 투과, 증가된 스프라우팅(sprouting) 능력, 주위 숙주 조직 내로의 개선된 성장(예컨대, 용이한 성장 콘의 전좌(translocation)) 및 상기 그래프트 코어에 인접한 숙주 조직과의 미성숙한 연결의 방지와 같은 몇 가지 인자가 증가된 섬유 성장에 기계론적으로 기여하였다. 예시적인 메커니즘은 정상 발생 동안 및 성체 신경계에서의 프로세스 성장을 촉진하는 PSA의 역할과 일치한다.
본 명세서에 기재된 실험은 DA 뉴런 그래프팅에서의 조작된 PSA의 용도를 나타내며, 다른 유형의 세포 유래의 그래프트와 비교할 때 뛰어난 결과를 제공하였다. 데이터는 PSA 향상이 그래프트된 DA 뉴런이 숙주 줄무늬체를 신경분포시키고 PD 기능의 결손을 약화시키는 능력을 현저하게 연장시킨다는 것을 명확하게 나타낸다. 따라서, 임상적으로 번역하게 되면 이식 전에 세포를 제공하기 위한 본 발명의 DA 뉴런을 포함하는 것으로 생각된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 PSA를 발현시키기 위하여 유전적으로 취급될 것이다. 일부 구현예에서, PST는 이식 전에 시험관내에서 정제된 효소 및 기질에 노출됨으로써 세포에 직접 운반될 것이다. 일부 구현예에서, PD 그래프팅에서 인간 번역을 위한 PSA 전략은 복수의 주사에 대한 필요성을 최소화하여 상기 복수의 주사로부터 나오는 외과적 위험성을 감소시키는 것이라고 생각된다.
다른 구현예에서, 상기 기술은 다른 세포 유형 및 종에 대해 사용하는 것, 예를 들면 척수 손상의 부위에 축삭을 재성장시키기 위해 브릿지(bridge)(예를 들면, 세포-세포 소통(communication))를 생성하는 그래프트된 슈반 세포의 이동을 연장하는 것이라고 생각된다.
다음은 본 실시예에서 사용되는 예시적인 물질 및 방법이다.
동물: 6주령의 129S3/SVImJ 마우스(Jackson Laboratory)를 먹이와 물을 자유롭게 주면서 조절된 온도 하에 유지하였다. NIH 및 연구소 동물 사용 지침에 따라 실험 절차를 수행하였고, 지역 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 IBC(Institutional Biosafety Committee)의 승인을 받았다.
6OHDA 주사 및 암페타민 유도 테스트: 동물을 나트륨 펜토바비탈(10 ㎎/㎏)로 마취시켰고, 2 ㎕의 6OHDA(생리식염수 내의 4 ㎍/㎕, 0.5% 아스코르브산)로 오른쪽 줄무늬체에 주사하였다. 상기 주사는 해밀턴 주사기로 다음의 좌표에서 수행하였다: 0.5 ㎜ 후방, 브레그마(bregma)에 대해 1.8 ㎜ 상대적으로 측방 및 뇌 표면에 대해 2.5 ㎜ 배쪽. 수술 전에, 동물은 1회의 복강내 데시프라민 주사(desipramine)(25 ㎎/㎏, Sigma)를 맞았다. 수술 2주 후, 암페타민 유도성 회전 테스트에서 동물에 점수를 매겼다. 동물을 30 ㎝ 직경의 투명한 플라스틱 실린더에 30분 동안 위치시켰고, 여기서 동물에 1회의 복강내 암페타민 주사(10 ㎎/㎏, Sigma)를 맞았다. 20분 후, 다른 20분 동안 동측성/대측성 회전의 수를 점수매겼다. 동물을 7주 동안 주 1회 점수매긴 후, 깊게 마취시켰고, 심장을 통해 PBS 및 0.1 M 포스페이트 버퍼(PB, pH 7.4) 내의 4% 파라포름알데히드를 관류시켰다. 뇌를 제거하였고, 4% 파라포름알데히드 내에서 4℃에서 밤새 후고정시킨 후, 40 ㎛ 두께의 시상단면(sagittal section)으로 비브라톰(Pelco-101, Ted Pella) 슬라이스하였다.
세포 분화 및 이식: Nurr1::GFP BAC 형질전환 BAC 마우스 ES 리포터 세포주(즉, GFP 발현이 Nurr1 프로모터에 의해 구동됨)를 CMV 프로모터의 조절 하에 마우스 PST 유전자를 함유하는 렌티바이러스(pLenti, Invitrogen)를 이용하여 형질도입하였다. ES 세포를 10% FBS(HyClone), 1,400 유닛/㎖ LIF(ESGRO; Invitrogen), 2 mM L-글루타민, 1 mM β-메르캅토에탄올, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(Invitrogen)으로 보충된 DMEM(Invitrogen) 내의 마이토신 C- 처리된 MEF(StemCell Technologies)에 대해 증식시켰다. DA 분화는 바베리 등(Barberi et al., Nat Biotechnol 21, 1200-1207 (2003))에 따라 이를 변형시켜 유도하였다. 간략하게, 세포를 젤라틴 코팅된 접시(10,000 세포/10 ㎝ 접시)에서 MS5 피더(feeder) 세포에 대해 분화시켰고, 혈청 대체물 배지(SRM)에 대해 4일 동안 배양하였다. 4일에, 음파 헷지호그(SHH, 200 ng/㎖) 및 FGF8(100 ng/㎖)을 첨가하였다. 분화 7일에, 배지를 SHH, FGF8 및 bFGF(10 ng/㎖)로 보충된 N2로 교체하였다. 11일에, SHH, FGF8 및 bFGF를 제외하고 아스코르브산(AA, 200 μM) 및 BDNF(20 ng/㎖)를 첨가함으로써 최종 분화가 유도되었다.
14-15일에 45분 동안 어큐테이즈(accutase)로 처리하여 세포를 수확하였고, N2로 1회 세척하였으며, AlexaFluor-647 접합된 항-SSEA-1 항체(BD Pharmingen)로 25분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 N2로 1회 세척하였고, 0.1% BSA를 갖는 HEPES 버퍼에 재현탁시켰다. DAPI를 첨가하여 생존능을 평가하였다. MoFlo 세포 분류기로 FACS를 수행하였고, 관심있는 모집단을 GFP 형광(Nurr1)에 대해 분류하였다. AlexaFluor-647(SSEA-1)에 대해 양성인 모집단을 음성적으로 분류하였다. GFP 음성 대조군의 경우, 나이브(naive) J1 마우스 ES-세포를 동일한 분화 단계에서 사용하였다.
생존능에 대해 Nurr1::GFP 분류된 세포를 분석하였고, BDN 및 AA를 갖는 N2 내에 55,000 세포/㎕의 최종 농도로 재현탁시켰다. 50 ㎛ 팁의 미세한 유리 모세관을 이용하여 다음의 좌표에서 1 ㎕를 병소의 마우스 줄무늬체 내로 주사하였다: 0.3 ㎜ 후방, 브레그마로부터 1.5 ㎜ 측방 및 뇌 표면에 대해 2.2 ㎜ 배쪽. 추가적인 특성분석을 위하여 당량의 세포 현탁액을 마트리겔(magrigel) 코팅된 6 ㎜ 접시에 다시 플레이팅하였다.
면역형광 분석을 위하여, 세포를 4℃에서 10분 동안 파라포름알데히드로 고정하였고, PBS로 2회 세척하였으며, 5% BSA(PBS 내의 0.1% Triton X-100)로 블로킹하였고, 1차 항체로 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다: 토끼 항-GFP(1:1000, Invitrogen), 마우스 IgM 항-PSA(1:2000, 5A5), 마우스 항-NeuN(1:800, Chemicon) 마우스 항-TH(1:1000, Sigma), 염소 항-FoxA2(1:800, Santa Cruz), 염소 항-Engrailed(1:800, Santa Cruz). 이후, 세포를 Cy-접합된 2차 항체(1:1000, Jackson)로 인큐베이션하였다.
EndoN 처리: NCAM으로부터 PSA를 제거하기 위하여, 수확하기 전날 밤에 세포를 PSA 7-9를 특이적으로 제거하는 파지 효소인 20 유닛의 endoN으로 처리하였다. 이후, 세포를 수확하였고, BDNF 및 AA 및 5 유닛의 endoN을 갖는 N2 내에 재현탁한 것을 제외하고는 전술한 것과 같이 주사하였다. 본 발명자들은 미리 동일한 양의 endoN을 단독으로 병소의 마우스에 주사하는 것으로는 동물의 거동을 개선하지 못한다는 것을 평가하였다.
시험관내에서의 PST mRNA 및 PSA-NCAM 분석: 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 세포를 WB 버퍼(1% NP40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 추출 직전에 첨가된 1x 프로테아제/포스파타제 억제제를 갖는 PBS, pH 7.4)로 처리하였고, 5초 동안 2회 초음파 처리하였으며, 원심분리 및 래믈리 버퍼(Laemli buffer, LB) 내에 재현탁하였다. LB가 없는 당량을 단백질 결정을 위해 보관하였다. 동일한 양의 단백질을 6% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 겔(BioRad) 내에 로딩하였다. 전기영동에 의해 단백질을 폴리비닐리덴 막(Millipore)으로 전달하였다. 상기 막을 5% 탈지 건조 우유를 갖는 0.1% Triton X-100 TBS(TBS-T) 내에서 1-6시간 동안 블록시켰고, 5% 우유를 갖는 TBS-T 내에서 항-NCAM 항체(1:10,000, Santa Cruz)로 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 블롯을 퍼옥시다아제-접합된 2차 항체(1:10,000, Jackson)로 인큐베이션하였고, ECL 검출 방법으로 검출하였다(Amersham Pharmacia Biotech). ImageJ 소프트웨어를 이용하여 단백질 레벨을 정량화하였다.
qRT-PCR 분석을 위하여, Trizol(Sigma)을 이용하여 총 RNA를 추출하였고, 역전사하였으며(Qiagen), 최종 부피 20 ㎕의 10 ㎕의 2×SYBR 반응 혼합물 및 0.2 μM의 정방향 및 역방향 프라이머로 증폭시켰다. PSA-NCAM FACS 분석을 위하여, 어큐테이즈로 45분 동안 처리하여 세포를 수확하였고, 1회 세척하였으며, 마우스 IgM 항-PSA(1:250, 5A5)로 얼음 위에서 25분 동안 인큐베이션하였고, N2 배지로 1회 세척하였으며, Cy3-접합된 항-마우스-IgM(1:250, Jackson)으로 얼음 위에서 다시 25분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 N2로 1회 세척하였고, 7AAD를 갖는 0.1% BSA로 재현탁하였으며, FACS Calibur 세포 분류기로 분석하였다. 대조군으로서, 1차 항체를 넣지 않았다.
면역조직학적 및 입체학적 절차: 실온에서 30분 동안 PBS 내의 0.1% Triton X-100, 5% 당나귀 혈청 내에서 자유 부유 관상 절편(free floating coronal section)을 블로킹하였고, 상이한 항체로 4℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다: 토끼 항-GFP(1:300), 닭 항-GFP(1:200, Chemicon), 마우스 항-TH(1:200), 마우스 IgM 항-PSA(1:1000), 마우스 항-NeuN(1:400), 염소 항-FoxA2(1:300), 토끼 항-Girk2(1:300, Allomone Labs), 마우스 항-시냅신(1:200, BD Transduction Laboratories). 이후, 절편들을 세척하였고, 2차 항체로 인큐베이션하였다: Cy2, Cy3 및 Cy5-접합된 당나귀 항체(1:400, Jackson). PSA의 경우, Cy5-접합된 당나귀 항-IgM을 사용하였다(1:500, Jackson). 실온에서 2시간 동안 인큐베이션을 수행하였다. 절편들을 PBS로 2회 세척하였고, Mowiol(Calbiochem) 내에 마운트하였다. 각각의 면역표지(immunolabeling)에 대해 뇌의 관상 절편의 3개 중 하나(one-in-three)를 분석하였다. c-Apochromat 40x 대물렌즈(water-immersion)가 장착되고 3개의 레이저(Argon 488, HeNe 543 및 HeNe 633)를 갖는 Zeiss LSM 510 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 의해 디지털 이미지를 수집하였다. 40x 대물렌즈 내에서 전체 뇌를 아우르는 3개 중 하나 절편 내의 GFP+ 및 TH+ 세포의 수를 카운트하였고, 세포의 총 수/그래프트를 추정하였다. 전체 z-축을 통해 단일 광학 판 내에서 이중-표지된 세포를 분석하였다.
GFP/TH+ 및 GFP/FoxA2+ 표지된 세포의 백분율의 분석을 위하여, 각각의 마커에 대해 100개의 GFP+ 세포를 분석하였다. 프로세스 성장 분석을 위하여, 40x 대물렌즈 하에 1 ㎛의 핀홀(pinhole)로 전체 z-축(20-40 ㎛)에 걸쳐서 0.8 ㎛ 간격으로 공초점 z-스캔을 수행하였다. 프로세스가 관찰되지 않을 때까지 주사 부위로부터 측면으로 절편들을 스캔하였다. 스캔된 전체 영역을 아우르는 3-D 프로젝션을 순차적으로 일치시켰다. GFP 및 TH 강도 분석을 위하여, 스캔된 전체 영역을 이식물로부터 나오는 5개의 연속적인 100 ㎛ 구역으로 나누고, ImageJ 소프트웨어를 이용하여 강도를 측정하였다. 그래프트 크기에서의 임의의 잠재적인 차이를 위하여 대조군에 대해 그래프트(구역 I)에 가장 가까운 구역 내의 강도에 대해 데이터를 정상화하였다.
통계적 분석: 데이터는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 나타낸다. 스튜던트 t 테스트 또는 이원 ANOVA(analysis of variance)와 이후의 본페로니 사후 검증을 이용하여 비교를 수행하였다. 선형 회귀 분석을 수행하였고, 피어슨 상관관계(Pearson correlation)를 이용하여 정량화하였다.
C. 인간 PST 유전자(폴리시알릴 트랜스퍼라아제)의 과발현
병소의 동물 군은 야생형 세포 또는 PST를 발현하거나 PST 효소로 전처리된 세포의 3 용량 중 하나를 받았다. 이들을 표 11에 논의된 패러다임(암페타민 회전, 실린더 테스트, 보행 테스트)에 따라 거동 테스트에 대해 처리하였다. 선택된 용량(예를 들면, 200k, 100k, 50k 세포)은 마우스에서 성공적으로 사용되었고, 그 결과 마우스 PST 유전자에 대해 본 명세서에서 기재된 것과 같은 결과를 보여주는 뉴런이 생성되었다.
D. 정제된 PST 효소를 세포에 직접 투여. 달리 말하면, PSA 유도의 비-형질전환 방법. PST 효소로 세포를 전처리하면 폴리시알릴화 및 표면 PSA의 발현이 증가하게 된다. 포유동물의 PST는 골지체에서 작동을 하는 풍부하지 않은 막 단백질이지만, 정제된 네이세리아 메닝기티드(Neisseria meningitides) α2,8-폴리시알릴트랜스퍼라아제(PSTnm)는 상업적으로 입수가능한 비독성 기질(즉, CMP-시알산)을 이용할 때 세포외 환경에서 작동하였고, 포유동물 PSA와 화학저으로 동일한 폴리머를 생산하였다. 한 예로서, 상기 효소의 활성 단편(fragment)은 시험관내에서 치료적 단백질에 PSA를 부가하여 생체내 약물동역학을 연장시키는데 효과적이었다. CMP 시알산의 존재시, PSA는 시험관내에서 PSTnm에 의해 마우스 및 인간 ESC를 포함하는 다양한 세포 유형의 표면에 직접 합성되었다(도 35의 A 내지 E). 생체내에 PSTnm과 기질을 직접 주사하면, 대뇌 피질, 줄무늬체 및 척수를 포함하는 성인 뇌 영역 내의 세포 표면에 증가된 PSA 축적을 촉발한다(도 35의 G 및 H). PSTnm에 의해 제조된 PSA는 유도된 PSA를 제거하는 endoN에 의해 분해되었는데(도 35의 B), 이는 PSTnm에 의해 제조된 PSA는 내인성 PSA에 필적하는 기능적 특성을 가짐을 나타낸다(도 35의 A, C 및 D). PSTnm을 통한 PSA 발현은 1시간 이내에 일어났으며, 이는 느린 PST 이식유전자(transgene) 유도를 극복한 것이다. 발현은 생체내에서 수 주 동안 지속되었고, 그 후 PSA 마커는 감소되었으며, 따라서 PST 이식유전자의 장기적인 유도로 인한 부작용을 극복하였다. 따라서, 시험관내에서 PSTnm + 기질에 대한 세포의 노출을 이용하는 것이 hESC 유래 DA 뉴런 및 생착 절차에 사용하기 위한 다른 세포 유형에서 증가된 PSA 레벨을 촉발하는 간단한 대안적인 전략으로 고려된다. 부분적으로, 이식을 위한 상기 대안적인 접근, 즉 인간 생착 절차에 사용하는 것은 비-침투성 본성의 이점, 즉 형질전환 방법의 사용을 회피하고(상기 절차에는 임상적 이용 프로토콜을 충족시키기 위하여 GMP-등급의 시약이 사용됨), 생착을 위해 가공된 세포를 이용하는 일부 위험한 부작용을 피하기 위해 필요한 그래프트 코어를 떠나 숙주의 뇌로 들어가는 DA 섬유에 대한 예상되는 시간 프레임과 일치하는 생화학적으로 생성된 PSA 발현의 일시적 본성을 갖는다는 이점을 갖는다.
다음의 실시예는 이식 효능을 향상시키기 위하여 정제된 박테리아 폴리시알릴트랜스퍼라아제인 PSTnm를 이용하여 hESC 유래 DA 뉴런에 대한 효소적으로 조작된 PSA를 보여준다.
효과적이기는 하지만, PST 유전자 전달감염은 폴리시알릴화 동안에 걸쳐서 제한된 조절로 hESC의 유전자 변형을 필요로 한다. 상기 실시예는 유전자 운반 대신에 외부 PSTnm 유도성 PSA를 발견한 것을 개시한다(도 35 참조). 도 35의 A에서, PST 처리된 슈반 세포(SC)(초록선-가운데선)은 증가된 부착 시간을 가졌지만, PSTnm-제조된 PSA는 부착을 억제하였다. 특히, (A) PSTnm-제조된 PSA는 현탁액 내에서 강요된(forced) PST 발현에 의해 제조된 PSA(초록선-가운데선)보다 훨씬 더 효과적으로 슈반 세포가 슈반 세포 단일층(monolayer)으로 부착하는 것을 억제하였다(빨강선-가장아래선). (B) ESC 유래 HB9 운동뉴런에서의 PSA 면역블롯은 PSTnm이 단독으로 처리된 대조군 샘플은 PSA 레벨이 검출가능하지 않았음을 보여준다. PSTnm + CMP-시알산 기질로 인큐베이션하면 많은 PSA 밴드를 생성하고, 이것은 endoN 처리에 의해 제거된다. (C, D) 상기 PST 유전자로 얻은 효과와 유사하게, 분화 동안에 PSTnm 및 기질에 의한 상기 세포의 폴리시알릴화는 신경돌기 성장 및 세포의 이동을 향상시킨다(화살촉). (E) 30일 hESC 유래 DA 뉴런의 PSA 면역염색. (F) 상기 염색은 PSTnm 및 기질의 처리 후 현저하게 증가된다. (G) PSTnm을 단독으로 생체내 주사하는 것은 효과가 없지만, 그 기질과 동시 투여하면 마우스 줄무늬체 내에서 많은 양의 PSA 발현을 생성한다(H).
따라서, PSTnm으로 외부적으로 처리된 성숙한 DA 뉴런은 생착을 위한 세포의 제조에 사용하는 것이 고려된다. 포유류 PST 및 PSTnm 모두 화학적으로 동일한 PSA 사슬을 생성하였다. hESC 유래 DA 뉴런에 대한 증가된 PSA(도 35의 F)는 DA 섬유가 그래프트 코어를 벗어나기에 충분한 수 주 동안 지속되어야 한다. PSTnm은 그래프팅 전에 제거되기 때문에, 상기 그래프트된 세포를 오염시키는 상기 효소의 면역원성은 인자가 되지 않는다.
PSTnm은 향상된 용해도와 활성 특성을 갖는 조작된 단편으로부터 제조되었다(Willis et al., "Characterization of the alpha-2,8-polysialyltransferase from Neisseria meningitidis with synthetic acceptors, and the development of a self-priming polysialyltransferase fusion enzyme". Glycobiology 18, 177-186 (2008)). PSTnm 노출 전, 기질에 노출 전, 또는 이들 모두 전에 hESC의 배양물을 DA 뉴런으로 분화하도록 유도하였다. 상이한 노출 시점(10분 내지 6시간)에 정량적 면역형광(Operetta) 및 웨스턴 블롯에 의해 배양물을 조사하여 폴리시알릴화의 속도 및 레벨을 결정하였다. 따라서, 25일 분화된 hESC 유래 DA 뉴런은 본 명세서에 기재된 조건을 이용함으로써 최적 농도의 PSTnm 및 기질로 인큐베이션될 것이다. PSA+ mDA 뉴런은 본 명세서 및 도 29에 기재된 것과 같은 단기간 및 장기간 분석에서 이식될 것이다.
E. 척수 손상에 대한 적용. 본 명세서에 기재된 것과 같은 인간 환자에서의 궁극적인 용도 및 전략을 목표로 하는 몇 가지 연구는 축삭 재생 및 내인성 전구체의 이동을 촉진하기 위하여 PST를 직접 CNS 내로 발현하는 렌티바이러스 벡터를 주사함으로써 PST 유전자를 운반하는 것을 포함하는 절차의 넓은 잠재력을 보여주었다. 인간 절차에서 사용하기 위한 이러한 한 전략은 척수 손상을 표적으로 한다. 한 유형의 척수 재생 절차에 있어서, 생체내 축삭 재생에 사용하기 위한 세포 브리지를 재건하기 위한치료의 일부로서 슈반 세포 이식이 사용되었다. 그러나, 미세한 근육 조정을 포함하는 환자의 운동력 기능 회복은 임의의 치료적 중재에 대해 저항하였다. 본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 운동력 기능을 증가시키는 극적인 효과를 추가로 얻게 되는 생착을 위해 사용된 슈반 세포에 대한 PSA 발현을 향상시키면 슈반 세포 이동이 향상하게 된다(도 30의 A 내지 D). 따라서, 일부 구현예에서, 시험관내에서 슈반 세포에 대한 PSA 발현의 증가는 척수 손상을 갖는 인간에서의 생착 절차에 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 인간 절차에서 PST 유전자의 증가된 발현에 의해 PSA의 조작된 발현을 사용하기 위한 다른 전략은 HB9 ESC 유래 노터뉴런을 포함하였으며, 렌티바이러스 벡터 기반의 유전자 발현을 통해 상기 뉴런에 PST 유전자를 도입하면 배양물 및 기계적으로 유도된 좌골 신경 손상을 복구하기 위해 마우스에 이식된 후 모두에서 축삭의 성장을 극적으로 증가시키게 되었다. 후자는 근육 조직에 대한 개선된 및 특이적인 표적이 되었다(도 30의 E 내지 H). 따라서, 다른 구현예에서, ESC 유래 모터뉴런의 표면에 대한 PSA 발현의 조작된 발현이 상기 좌골 신경의 기능을 회복시키기 위해 사용된다.
XⅣ. DA 뉴런 이식의 증가된 안전성
본 발명의 세포를 제조하는 방법에 사용하기 위하여 환자에 대한 건강 위험성을 추가로 감소시키기 위해 고려되는 구현예가 하기 개시되어 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 세포는 환자에 대한 위험성을 감소시키기 위한 특징을 나타내었지만, 추가적인 구현예는 생착된 세포를 받은 환자의 건강에 대한 위험성의 가능성을 추가로 감소시키는 것으로 생각된다. hESC 기반의 세포 치료 절차에 대한 몇 가지 관심사 중 하나는 분화에 대해 저항하였고 생착 후의 조건 하에 환자에게 해를 일으키는 세포로 발생하는 오염성의 비분화된 세포의 도입에 대한 가능성이다. 다능성 세포의 경우에 있어서, 한가지 해로운 결과는 환자의 생명을 위협하는 테라토마의 형성이다. hESC 유래 세포를 이용한 테라토마의 형성은 자연적 세포 분화에 기반한 단기간 신경 분화 프로토콜 후 보고되었다. 그러나, 본 발명자들의 인간 ES 유래 신경 세포 유형을 사용하면, 그 마우스 유래 대응물(counterpart)과 달리, 본 발명에 기재된 것과 같은 적절한 신경 분화 전략(즉, 단층 배양, 이중-SMAD-억제 프로토콜 및 증식을 촉진하지 않는 사이토카인에서의 성장) 후에 테라토마가 거의 형성되지 않게 되었다. 사실, 지난 10년에 걸쳐서 다양한 뉴런 분화 전략을 이용하여 인간 세포 이식물을 이용해 수 백개의 동물을 분석한 결과, 테라토마 형성은 관찰되지 않았다. 또한, 테라토마는 그래프트를 위해 인간 세포를 이용하는 본 발명의 PD 이식 절차에서 관찰되지 않았다. 인간에서 사용하기 위한 생착 절차를 위하여 인간 대 마우스 세포를 사용하는 것의 차이는 인간 대 마우스 ESC에서 포획된 다능성의 상이한 단계와 관련이 있다고 생각되며, 인간 세포는 상이한 발생 단계일 수 있는 마우스 ESC와 달리 Epi-SC로 기재된 다능성 단계의 특성과 일치하는 것으로 생각된다.
그러나, 이전의 이식 연구에서 세포를 사용하는 적어도 하나의 문제는 페리어 등(Perrier et al., PNAS 2004)에서 개시되어 있는 신경 과성장의 지속적인 위험성이었으며, 본 발명의 성숙한 DA 뉴런 및 이식 방법을 사용할 때에는 놀랍게도 유사한 프로토콜에서 존재하지 않았다. 또한, 이전의 연구에서 생착 테스트에서 발견된 다른 문제는 생체내에서 지속적으로 증식하는 hESC 유래 신경상피 구조(neuroepithelial structure)(즉, 시경 로제트-유형)의 형성이었다. 상기 그래프트된 신경상피 세포의 생체내 확장은 설치류 파킨슨 및 헌팅턴 질환 모델에서의 hESC 유래 DA 뉴런 이식 연구를 포함하는 다양한 신경 이식 패러다임에서 관찰되었다. 상기 "신경 로제트-유형" 증식 세포는 높은 고유한(intrinsic) 성장 잠재력을 가져서 그래프트된 동물 내에 이소성의(ectopic), 대부분 피질-유형의 조직으로 이루어지는 큰 그래프트가 되는 비-형질전환 1차 세포를 나타내었다. 본 명세서에 기재된 것과 같이, 그래프팅의 시점에 오염성의 다능성 또는 신경상피 세포를 제거하기 위한 몇 가지 전략이 사용되었다(예컨대, SSEA-4(다능성 마커) 또는 Forse-1(신경상피 마커)에 대한 선별). 상기 전략은 로제트 기반의 분화 전략을 사용할 때 부분적으로 성공적이었으며, 신경 과성장은 Forsel에 대해 분류되거나 SSEA-4에 대해 음성적으로 분류된 그래프트의 서브세트에서 여전히 관찰되었다. 놀랍게도, 상기 로제트 기반이 아니라 바닥 플레이트 기반의 DA 뉴런 분화 절차를 개발함으로써, 신경상피 과성장의 문제는 극복되었다. 기능성 hESC 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런 그래프트 내에서 그래프트 유래의 증식하는 세포는 드물게 관찰되었다.
다른 생착 절차와 반대되는 결과에 기초하여, 인간에 DA 뉴런 그래프트를 이용하는 다른 안전성 문제는 이식 시도에서 태아 조직을 받은 환자의 약 15%에서 관찰되는 그래프트 유도성 이상운동증(GID)의 발생과 같은 치료의 부작용이다. 그러나, 본 명세서에 기재된 것과 같이, 그래프트 유래 세로토닌성 세포가 거의 완전히 없다는 것은, 원하지 않는 세포 유형을 추가적으로 고갈시킬 가능성을 갖는 보다 일관된 세포 공급원을 사용하는 것(도 28과 관련된 문맥 참조) 및 생체내 DA 섬유 분포를 조절할 가능성과 함께(도 29 참조; 즉, L-Dopa 및 다른 화합물을 분비하는 뉴런 클러스터의 "핫스팟(hot spot)"을 방지함), 다른 방법들에 비해 생착 절차에서 사용하기 위한 세포를 제공하기 위한 본 발명의 방법을 사용하는 주된 이점이다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용하면 환자에 대한 위험성을 최소화한다고 생각된다.
XⅤ. 임상적 이식을 위한 인간 ESC의 사용
바람직한 구현예에서, 인간 ESC는 인간에서의 생착 절차를 위한 세포의 제조 및 이용을 위한 방법, 달리 말하면, PD의 치료용 세포 치료에 사용하기 위한 것으로 생각된다. 특히, 인간 ESC는, 한 예를 들면, PD 세포 치료와 같은 용도를 위해 생착가능한 중뇌 DA 뉴런을 제공하는데 사용하기 위한 것과 같은 본 발명의 방법에서 인간 iPSC를 이용하는 것보다 많은 이점을 갖는다. 특히, 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)를 DA 뉴런 유도를 위한 세포 공급원으로서 사용하면 각각의 환자에 대해 유전적으로 일치하는 세포 공급원을 제공하는 것과 같은 몇 가지 이점을 갖는다. 그러나, 다수의 최근의 연구는 iPSC의 안전성 및 완전한 유전자 호환성과 관련한 불확실성을 나타내었다. 재프로그램된 세포는 임상적 이용성을 위해서는 바람직하지 않은 잠재적으로 위험한 유전적 및 유전자외적(epigenetic) 이상을 갖는다는 것을 보여주었다. 또한, 마우스 iPSC에서의 연구는 iPSC 유래 세포가 인간 이식에서의 이용을 뒷받침하기 위한 주된 논쟁인 완전히 면역호환성인 것은 아님을 보여주었다. 또한, 생착을 위해 oPSC를 사용하는 FDA 승인된 절차는 없다. 마지막으로, 각각의 개별 환자에 대한 GMP-순응성(compliant) 및 완전히 QC 조절된 세포 은행의 생성을 예상하는 것은 비실용적이고 비용금지적(cost-prohibitive)일 것이다. 이와 대조적으로, hESC와 비교한 hiPSC의 유전적 안정성은 광범위하게 연구되었다. 배양에서는 hESC가 시간이 지남에 따라 돌연변이가 생기는 것으로 관찰되었지만, 이러한 돌연변이의 시간과 속도는 hiPSC와 상이한 것으로 보이며, hESC는 일반적으로 iPSC보다 유전적으로 더 안정한 것으로 간주되었다(예를 들면, Hussein, et al., Nature 471, 58-62 (2011); Mayshar, et al. Cell Stem Cell 7, 521-531 (2010); Lister, et al. Nature 471, 68-73 (2011); Laurent, et al. Cell Stem Cell 8, 106-118 (2011)). 추가적으로, 세포 및 유전자 치료 생성물에 대해 FDA에 의해 요구되는 엄격한 안전성 테스트를 만족시키는 몇 가지 hESC 주에 대한 표준 구동 절차가 고안되었다. 상기 FDA는 미국에서 임상적 용도로 hESC 기반의 세포 치료를 진행하기 위한 2개의 군을 승인하였다. 예를 들면, 제론사(Geron Corporation)는 hESC 유래 올리고덴드로사이트 전구체 세포(GRNOPC1)를 이용한 임상 1상에 진입하였고, 어드밴스드 셀 테크놀로지(ACT) 사는 현재 스타르가르트의 황반 이영양증(Stargardt's Macular Dystrophy)(trial NCT01345006) 및 어드밴스드 드라이 에이지 연관 황반 변성(Advanced Dry Age Related Macular Degeneration)(trial NCT01344993)을 치료하기 위하여 hESC 유래 망막 색소 상피 세포를 이용한 2개의 임상 Ⅰ/Ⅱ 시험을 갖고 있다.
마지막으로, FDA 승인된 hESC 기반의 2개의 임상 시험 모두 신경계 질병을 표적으로 하고 있다는 사실은 신경계 질환 및 손상을 치료하기 위한 생착 물질을 제공하기 위하여 hESC 기반의 방법을 이용하는 것의 이점을 보여준다. 상기 신경계는 말초에 위치한 동일한 그래프트와 비교할 때 외부 조직(알로그래프트(allograft))이 약한 면역 반응을 유발하기 때문에 면역 특권 부위(immuno-privileged site)인 것으로 간주된다. 사실, 태아 세포를 인간 뇌로 이식한지 25년 후, 일부 동종성 뉴런이 일시적인 면역억제와 함께 인간 뇌에서 16년까지 생존했음이 밝혀졌다. 따라서, 세포 공급원과 그래프트 수용체 사이의 동일한 항원성 일치는 본질적이지 않은 것으로 보인다. 따라서, hESC는 다른 신경계 질환, 질병 및 손상에 더하여 PD를 치료하기 위한 DA 뉴런의 보편적인 동종성 공급원인 것으로 생각된다. 본 발명의 세포를 받은 환자는 PD의 임상적 진단을 갖는 것으로 생각된다. 진정한 DA 뉴런 그래프트는 레보도파(levodopa), 부속 약물 등과 같은 이용가능한 약물을 이용한 증상의 조절이 불충분한 환자를 포함하는 초기 치료(early intervention) 및 중도 내지 중증 PD에서 사용하기 위한 것으로 생각된다. 일부 구현예에서, 뉴런 그래프트를 받는 것으로 생각되는 환자는 초기 PD에서의 미세한 징후(예컨대, 도파민성 결핍을 검출하기 위한 뉴로이미징(neuroimaging), FDG-PET의 사용에 의해) 및 이상운동증의 징후 등을 갖는다. UDysRS(Unified Dyskinesia Rating scale)에 의해 측정된 것과 같은 이상운동증(Goetz, et al., Mov Disord. 23, 2398-2403 (2008))은 생착 전후에 환자의 모니터링에 사용하기 위한 것으로 생각된다. 또한, 환자는 "도파민성 결핍의 정거 없는 스캔(scans without evidence of dopaminergic deficits, SWEDDS)"을 가질 수 있으며, 이들 중 일부는 근육긴장이상(dystonia) 또는 경련을 가질 수 있다. 파킨슨증에 기여하는 다른(비 dopa) 인자를 갖는 환자를 확인하기 위하여 뇌 MRI가 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 레보도파에 양성의 반응을 가질 것이다. 모터 평가, 비-모터 평가, 삶의 질과 같은 대상 모니터링을 위한 이식 전후의 파라미터 및 종말점(endpoint) 및 뉴로이미징 및 다른 바이오마커의 사용을 결정한다. 모터 기능: PD 모터 증상을 측정하기 위하여 상기 UPDRS 및 새롭게 평가된 MDS-UPDRS(Goetz, et al., Mov Disord. 23, 2129-2170 (2008))가 널리 사용된다. 그러나, 다른 테스트는 10 m 걷기 또는 6분 걷기 테스트, TUG(timed up and go), 기능적 걸음걸이 평가, 기능적 팔뻗기(reach)를 포함하며, 다른 것들은 보다 환자-지향적인 결과 측정을 위한 것으로 생각된다. 환자는 "오프" 뿐만 아니라 "온" 상태에서 테스트될 것이며, 등급 규모는 "오프" 타임(예를 들면, 확인된 마모현상(wearing off) 규모(Antonini, et al. Mov Disord. 26, 2169-2175 (2011)) 및 이상운동증 등급 규모(예를 들면, UdysRS(Goetz, et al., Mov Disord. 23, 2398-2403 (2008)))의 임상계측(clinimetric) 특성에 기반한 다음의 Movement Disorder Society의 권고사항)에 대해서도 포함될 것이다. "온" 및 "오프" 상태 모두에서의 비디오녹화 표준화된 환자 조사가 고려된다. 비-모터 기능: 측정은 1차적으로 생착 전후의 인지, 우울증, 화냄, 무관심, 수면, 피로, 정신병 및 다른 비-모터 증상을 다루는 것에 더하여 인지적인 정신의학적 결과 및 자율신경실조증(dysautonomia)을 표적으로 할 것이다. 삶의 질: PD-특이적 질문표(PD-QUALIF) 및/또는 SF-36과 같은 잘-인증된 삶의 질 규모가 환자의 결과를 모니터링하기 위하여 고려된다.
뉴로이미징 및 다른 바이오마커: 기능적 이미징이 외과적 PD 시도에서 널리 사용되었다. 도파민 기반의 이미징(예컨대, FDOPA-PET)이 그래프트 유지의 조사에 사용하는 것으로 생각되지만, 예를 들면 염증을 표적으로 하는 이미징 기반의 마커, 및 탐구적 데이터 수집(exploratory data collection)과 같은 비-이미징 시스템 마커를 포함하는 다른 리간드를 이용한 뉴로이미징 기술이 사용되는 것으로 생각된다. 이미징은 예컨대 기저핵(basal ganglia) 내의 DA 고갈의 정도 및 위치 및 각 환자에 대한 외과적 계획을 맞추는데 있어서 PET 데이터를 포함하는 것과 같이 수술전 계획을 짜는데 있어서의 용도를 발견할 것이다. 그래프트 부위의 위치 및 세포 증착의 수. 일부 구현예에서, 피곡(putamen)(Freed, et al. N. Engl. J. Med. 344, 710-719 (2001); Lindvall, et al. Prog. Brain Res. 82, 729-734 (1990)) 및 교련후(postcommissural) 피곡(Olanow, et al. Ann. Neurol. 54, 403-414 (2003))이 세포 생착(투여)의 부위이다. 일부 구현예에서, 상이한 외과적 트랙을 통한 복수의 위치가 고려된다. 궤도 경로의 실시간 이미징 및 시각화 및 정확한 표적화를 제공하는 클리어포인트(clearpoint) 시스템을 갖는 MRI가 생착된 세포의 모니터링을 위해 고려된다. 상기 시스템은 PD 환자에서 뇌심부 자극(Deep Brain Stimulation) 전극 대신에 사용된다. 그래프트의 세포 수 및 조성. 태아를 이용한 시도는 많은 세포 유형을 갖는 태아 그래프트 물질을 사용하였기 때문에 본질적으로 미지의 수의 DA 뉴런을 이용하여 수행되었다. 본 명세서에제공된 데이터에 기초하여, 100,000-200,000개로 추정되는 생존하는 TH+ 뉴런이 DA 뉴런의 기능을 회복하는 것으로 생각된다.
면역억제: 일부 구현예에서, 적어도 6개월부터 환자의 수명까지 그래프트된 환자의 면역억제가 고려된다. 일부 구현예에서, 환자는 생착된 조직을 가질 목적으로 면역억제되지는 않을 것이다.
[표 1] 대조군 LSB 처리된 모집단에 대해 SHH/FGF8/Chir 처리된 바닥 플레이트 기반의 모집단에서 분화 11일에 현저하게 상향조절 또는 하향조절된 유전자의 유전자 발현 어레이 데이터
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[표 2] SHH/FGF8만 처리된 모집단에 대해 SHH/FGF8/Chir 처리된 바닥 플레이트 기반의 모집단에서 분화 11일에 현저하게 상향조절 또는 하향조절된 유전자의 유전자 발현 어레이 데이터
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[표 3] SHH/FGF8/Chir 처리된 바닥 플레이트 기반의 모집단에서 분화 13일에 대해 25일에 현저하게 상향조절 또는 하향조절된 유전자의 유전자 발현 어레이 데이터
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[표 4] 대조군 LSB 처리된 모집단에 대해 SHH/FGF8/Chir 처리된 바닥 플레이트 기반의 모집단에서 분화 25일에 현저하게 상향조절 또는 하향조절된 유전자의 유전자 발현 어레이 데이터
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[표 5] SHH/FGF8만 처리된 모집단에 대해 SHH/FGF8/Chir 처리된 바닥 플레이트 기반의 모집단에서 분화 25일에 현저하게 상향조절 또는 하향조절된 유전자의 유전자 발현 어레이 데이터
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[표 6] 사용된 항체의 농도(즉, 희석) 및 항체의 예시적인 공급원을 포함하여 마커로서 사용된 항체의 예시적인 리스트를 보여줌. 일부 구현예에서, 결합된 항체는 임의의 Alexa488, Alexa555 및 Alexa647-접합된 2차 항체(Molecular Probes, Carlsbad, California)를 이용하여 확인되었다. 일부 구현예에서, 바이오틴화 2차 항체를 사용하여 결합된 1차 항체를 확인한 후, DAB(3,3'-디아미노벤지딘) 크로모겐(chromogen)을 통해 시각화하였다.
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[표 7] 세포 유형 제한에 의한 DA 뉴런으로의 예시적으로 고려되는 분화.
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[표 8] DA 뉴런을 제조하기 위한 어떤 인자들의 역할을 결정하기 위한 예시적인 실험.
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[표 9] 특히 임상에서 사용하기 위한 GMP 레벨 배양물의 제조에 사용하기 위해 mDA 뉴런 배양의 규모를 키우기 위한 예시적인 방법.
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[표 10] hES 주 생성물의 예시적인 생체내 평가 - 그래프트 조성.
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[표 11] hES 주 생성물의 예시적인 생체내 평가 - 거동 분석.
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도 1은 CHIR990221 부가에 따른 인간 ES 세포 유래 중뇌 바닥 플레이트 전구체의 예시적 유도 및 신경발생 전환을 나타낸다. a) FOXA2(빨강색), NESTIN(녹색, 상부 패널), LMX1A(녹색, 중앙 패널) 및 OTX2(녹색, 하부 패널) 발현에 대한 분화 11일의 면역세포화학 분석. b,c) (a)에 나타낸 데이터의 정량. 데이터는 3회씩 각각 수행된 3개의 독립적 실험에서 얻는다(평균±SEM). 개별 마커에 대한 유의 수준을 LSB만 처리한 것에 대비하여 나타낸다: ANOVA; Dunnett 테스트: *** p < 0.001; ** p < 0.01; p < 0.05). d) 세 처리 조건에 대해 이용된 배양 조건의 모식적 예시. e, f) LSB(e) 또는 LSB/S/F8(f)를 포함하는 LSB/S/F8/CHIR 조건을 비교하는 11일의 선택된 상이하게 발현되는 유전자 목록. g,h) 중뇌 DA 전구체 정체성(identity)(g), 전뇌 및 배쪽 비-DA 전구체 정체성(h)에 특징적인 선택된 마커의 시간적 유전자 발현 분석. 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
도 2는 LSB/S/F8/CHIR 처리에서의 중뇌 DA 뉴런 운명 대 LSB/S/F8(배쪽/시상하부) 및 LSB(등쪽 전뇌) 운명의 예시적인 면역세포화학 및 분자적 분석을 나타낸다. a) Tuj1(빨강색)/LMX1A(녹색)(상부 패널) 및 NURR1(빨강색)/TH(녹색)(하부 패널)와 조합된 FOXA2(파랑색)의 25일의 면역세포화학 분석. b) LSB/S/F8/CHIR 처리 배양에서의 정량적 동시-발현 분석. 데이터는 3회씩(평균±SEM) 각각 수행된 3개의 독립적 실험에서 얻는다. c,d) 전체적 유전자 발현 분석을 25일에 수행하였다(모든 세 조건에 대해 3개씩의 표본). LSB/S/F8/CHIR 조건(c)에서 13일 대 25일을 비교하는 그리고 LSB/S/F8/CHIR 처리 대 LSB(d, 왼쪽 패널) 및 LSB/S/F8(d, 오른쪽 패널)을 비교하는 가장 상이하게 발현된 유전자의 선택된 목록, e) 주요 중뇌 DA 뉴런 마커에 대해 표준화된 상이한 유전자 발현 분석. 개별 마커에 대한 유의 수준을 LSB만 처리한 것에 대비하여 나타낸다: ANOVA; Dunnett 테스트: *** p < 0.001; ** p < 0.01; p < 0.05). 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
도 3a 및 도 3b는 바닥 플레이트 유래 대 로제트(rosette) 유래 중뇌 DA 뉴런의 예시적 시험관내 성숙, 특성분석 및 기능 평가를 나타낸다. 도 3a: 예시적으로 나타냄: a) LMX1A(녹색, 왼쪽 패널), FOXA2(파랑색, 왼쪽 패널) 및 NURR1(녹색, 오른쪽 패널)과 조합된 TH(빨강색)의 분화 50일의 면역세포화학 분석, b) 로제트 유래 대 바닥 플레이트 유래(LSB/S/F8/CHIR) 배양에서 전체 세포 중 TH+, FOXA2+, LMX1+ 및 NURR1+ 세포의 정량, c) 바닥 플레이트 및 로제트 유래 DA 뉴런 배양에서 50일에 세로토닌+(5-HT), 및 GABA+ 뉴런 서브타입의 정량. d,e) DA 및 대사물질을 측정하기 위한 HPLC 분석 d) 바닥 플레이트 유래 배양의 표본 중 DA의 전기화학적 검출을 위한 대표적 크로마토그램. e) 바닥 플레이트 대 로제트 유래 배양 간 DA, DOPAC 및 HVA 수준의 비교. f) TH(빨강색) 및 시냅신(녹색)에 대한 바닥 플레이트 유래 배양(80일)의 면역세포화학 분석. g-ⅰ) DA 뉴런 분화 80일의 바닥 플레이트 배양의 전기생리학적 분석. 패치된 뉴런의 위상차 이미지(g) 및 대응 측정(h). ⅰ) DA 뉴런 정체성에 특징적인 막 전위 오실레이션을 보여주는 파워 분석(2 내지 대략 5Hz). 개별 마커(패널 b, c, e)에 대한 유의 수준은 FP- 대 로제트 유래 배양의 비교로 나타낸다: Student T-테스트: *** p < 0.001; ** p < 0.01 ; p < 0.05). 축적 막대는 (a)에서 50 ㎛, (f, 상부 패널)에서 20 ㎛, (f, 하부 패널)에서 5 ㎛, 그리고 (g)에서 20 ㎛에 해당한다. j: 시험관내 mDA 뉴런의 성숙(d65). TH 양성 뉴런은 여전히 FoxA2를 발현하고 있으며 mDA 뉴런에 전형적인 장섬유를 연장한다, 그리고 k: HPLC에 의한 DA 방출 측정: d65령 TH+ 뉴런은 시험관내에서 기능을 수행한다. 도 3b: 본 명세서에 기재된 것과 같은 바닥 플레이트 기반 중뇌 DA 뉴런 프로토콜에 의해 생성되는 세포의 예시적 요약을 나타낸다. a) 기존 전략(예를 들어, Perrier, A.L. et al., Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004))과는 대조적으로, 본 명세서에 기재된 신규 프로토콜은 LMX1A/FOXA2 양성 중뇌 바닥 플레이트(왼쪽 패널)의 생성 후 뉴런 전환(중앙 패널) 및 DA 뉴런 성숙(오른쪽 패널)에 기반한다. 성숙한 바닥 플레이트 생성 DA 뉴런 세포는 FOXA2/LMX1A 발현을 보유한다.
도 4는 마우스, 래트 및 원숭이 PD 모델 숙주 뇌에서 바닥 플레이트 유래 인간 DA 뉴런의 예시적 생체내 생존 및 기능을 나타낸다. a-d) 6-OHDA 병소의(lesioned) 성체 마우스(NOD-SCID IL2Rgc 눌 스트레인(null strain))에서 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런의 이식. a) 이식 후 4.5개월의 TH 발현 및 그래프트(graft) 형태. b) 인간 특이적 마커(hNCAM, 파랑색), TH(녹색), 및 FOXA2(빨강색)의 발현. c) 바닥 플레이트 유래 그래프트에서 FOXA2+, TH+ 및 이중-표지 세포의 정량(평균±SEM, n=4, 그래프팅 후 4.5개월), d) 바닥 플레이트 유래(파랑색) 대 로제트 유래(녹색) 그래프트에서 암페타민-유도 회전 분석. 축적 막대는 (a)에서 500 ㎛, (b)에서 100 ㎛ 및 (4c)에서 40 ㎛에 해당한다. e-p) 6-OHDA 병소의 성체 래트 내로의 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런의 이식. TH(녹색) 및 인간 특이적 마커(빨강색) hNA(e) 및 hNCAM(4f)의 동시-발현에 대한 면역조직화학 분석. g) 전체(hNA+) 세포, TH+ 세포 및 FOXA2를 동시-발현하는 TH+ 세포수의 입체적 정량. 평균 그래프트 부피는 2.6 ±0.6 ㎣였다. h-j) TH(녹색)와 중뇌 특이적 전사 인자 FOXA2, PITX3 및 NURR1(빨강색)의 동시-발현을 나타내는 하이 파워 이미지. k-m) 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런 그래프트로 처리된 동물 대 헛-처리 동물의 거동 분석. k) 암페타민-유도 회전 비대칭. l) 보행 테스트: 환부 대 비환부측의 앞다리 운동불능 측정. m) 실린더 테스트: 양육 시 동측성 대 대측성 발 선호도 측정. 그래프트된 동물은 적어도 3개 테스트에서 유의미한 개선을 나타내었다(p < 0.01, 4.5 - 5개월; n=각각 4-6), n-p) TH(녹색) 및 DAT(n), GIRO(o) 및 칼빈딘(calbindin)(p)과의 동시-발현(빨강색)에 대한 면역조직화학 분석. 유의 수준은(패널 d, k, l, m) 다음과 같다: ** p < 0.01; p < 0.05). 축적 막대는 (e)에서 200 ㎛, (f)에서 50 ㎛, (h-j)에서 20 ㎛, 및 (n-p)에서 40 ㎛에 해당한다. q-t) 성체 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘(MPTP) 병소의 레서스(rhesus) 원숭이 내로의 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런의 이식, q) 인간 특이적 세포질 마커 SC-121(녹색)의 발현으로 표시되는 이식 후 1개월의 대표적 그래프트 부위의 개요, r) TH+ 섬유(화살표)의 주변 후광을 갖는 그래프트 중 TH 발현, s) 그래프트 코어 중 SC-121(빨강색)과 TH(녹색)의 동시-발현 분석, t) TH+ 뉴런(녹색)에서 FOXA2(빨강색)의 동시-발현 분석. 축적 막대는 (q)에서 2 ㎜, (r)에서 500 ㎛, (s)에서 200 ㎛, 및 (t)에서 50 ㎛에 해당한다. u) 숙주 줄무늬체 내로의 그래프트 유래 섬유 증식(huNCAM+), v) 그래프트 유래 세포는 신경아교 세포로 분화되지 않는다. 그러나 그래프트는 TH+ 세포 모집단에 부가하여 소수의 세로토닌성(serotonergic) 섬유를 함유하였다.
도 5는 CHIR99021 노출의 예시적 시기가 FOXA2/LMX1A 중뇌 바닥 플레이트 전구체의 유도를 결정함을 나타낸다. a) 나타낸 다양한 시점에서 시작하여 LSB/S/F8 처리 단독 또는 CHIR과의 조합 처리 후 분화 11일에 FOXA2(빨강색)/LMX1A(녹색)의 면역세포화학 분석. b) (a)에 기재된 것과 같이 CHIR 노출의 상이한 개시 후 분화 11일의 FOXA2+, LMX1A+ 및 이중 표지된 세포 백분율의 정량. 개별 마커에 대한 유의 수준은 비 CHIR 조건에 비교하여 나타낸다: ANOVA; Dunnett 테스트: *** p < 0.001; ** p < 0.01 ; p < 0.05). 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
도 6은 예시적 FGF8 노출이 FOXA2/LMX1A 중뇌 바닥 플레이트 전구체의 유도에서 주요 역할을 수행하지 않음을 나타낸다. 분화 11일에 면역세포화학에 의한 FOXA2(빨강색)/LMX1A(녹색) 발현의 대표적 이미지. 세포는 SHH(푸르모르파민 + SHH C25II) 및 FGF8의 존재 또는 부재 하에 LSB/CHIR에 노출되었다. 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
도 7은 고용량의 SHH 및/또는 smoothened 소분자 작용제(푸르모르파민)에 대한 예시적 노출이 CHIR99021의 존재 하에 효율적인 중뇌 바닥 플레이트 유도를 위해 필요함을 나타낸다. 분화 11일에 FOXA2(빨강색)/LMX1A(녹색) 면역세포화학의 대표적 이미지. 세포는 다양한 농도의 SHH(SHH-C25II) 및 smoothened 작용제 푸르모르파민의 존재 하에 LSB/F8/CHIR로 처리되었다. 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
도 8은 분화 11일 및 25일에 LSB/S/F8/CHIR 처리 대 LSB 및 LSB/S/F8 처리 배양에서 상이하게 발현된 유전자의 예시적 분석을 나타낸다. a) 0, 1, 3, 5, 7, 11 및 13일에 3 조건에서 얻어진 전체적 유전자 발현 데이터의 계통적 클러스터링(표본은 각각의 조건 및 각각의 날에 3회씩 평가되었다). b) DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov 를 이용한 GO 클래스에 따른 유전자 농축 분석. 11일의 비교는 정준 WNT 신호전달의 CHIR99021 매개 활성화와 일치하는 LSB/S/F8/CHIR 조건에서 SHH 및 WNT 신호전달 모두의 농축을 드러낸다. 11일 및 25일에 대안적 세포 운명, 예컨대 "전뇌 발생" 및 "간뇌"뿐만 아니라 "호메오박스"가 고도로 농축된 다른 GO 기간이다. c) 중뇌 DA 뉴런 조건(LSB/S/F8/CHIR)에서 농축된 후보 마커에 대한 Allen 유전자 인간 발현 데이터베이스(http://human.brain-map.org)를 이용하는 온라인 검증. TTF3, EBF1, EBF3 및 TTR은 이용 가능한 인간 뇌 영역 특이적 마이크로어레이 데이터에 근거하여 발현되었다. FOXA2의 전통적 전사 표적인 TTR은 성체 흑색질에서 약하게만 발현되어 그 주요 역할이 발생 동안일 수 있거나 또는 SHH 처리가 시험관내 분화 동안 인공적으로 높은 TTR 발현을 야기할 수 있음을 제시한다.
도 9는 대표적인 독립적 hESC 및 hiPSC 라인에서 바닥 플레이트 유도 및 중뇌 DA 뉴런 발생을 위한 예시적 분화 프로토콜을 나타낸다. hESC 라인 H1 및 hiPSC 라인 2C6(산발성 PD 환자로부터) 및 SeV6(센다이 기반, 도입 없음)으로부터의 데이터를 나타낸다. 도 1의 d 및 도 10에 기재된 바닥 플레이트 기반 프로토콜을 이용한 뒤 분화 11일에 FOXA2(빨강색) 및 분화 25일에 TH(녹색)/FOXA2(빨강색)의 발현을 분석하였다.
도 10은 바닥 플레이트 유래 및 로제트 유래 DA 뉴런 배양에 이용되는 분화 조건들의 예시적 모식적 요약을 나타낸다. 신경 운명 획득을 가속화하기 위해 두 프로토콜 모두 이중(dual)-SMAD 억제를 이용하였다. LDN이 바닥 플레이트 프로토콜에서 BMP 억제를 위해 사용된 반면, 전통적 noggin 유도가 로제트 배양을 위해 사용되었다. 약어는 다음과 같다: LDN: LDN-193189, SB: SB431542, SHH(푸르모르파민 + SHH C25II), FGF8: FGF8, BAGCT: BDNF + 아스코르브산 + GDNF + dbcAMP + TGFβ3. 로제트 프로토콜에서의 SHH/FGF8은 푸르모르파민의 부재 하에 SHH C25I를 단독 사용한 후 로제트 유래 DA 뉴런 배양의 패턴화를 위한 최초 권장사항을 따랐다. 주: 로제트 단계에서의 푸르모르파민 처리는 바닥 플레이트 세포의 패턴화를 위해 적합한 농도에서 독성을 나타낸다. BASF: BDNF + 아스코르브산 + SHH/FGF8.
도 11은 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런 배양의 예시적 시험관내 성숙을 나타낸다. a) DAT 발현(빨강색; 80일)에 대한 바닥 플레이트 유래 TH 뉴런(녹색)의 면역세포화학 분석. b) 광범위한 Tuj1+(빨강색) 섬유 관이 > 2 ㎜의 거리에 걸쳐 연장되어 분화 60일까지 관찰되었다. c) 분화 80일에, TH+ 뉴런(녹색)에서 GIRK2(빨강색)의 동시-발현. 축적 막대는 (a)에서 20 ㎛, (b)에서 100 ㎛ 및 (c)에서 20 ㎛에 해당한다.
도 12는 성체의 온전한(병소가 없는) 마우스 줄무늬체(NOD-SCID IL2Rgc 눌 스트레인)에서 단기간(6주) 생체내 생존 연구의 예시적 면역조직화학 분석을 나타낸다. 바닥 플레이트 유래 그래프트(25일의 세포; 150×103 세포/동물)의 분석. a) TH+ 숙주 섬유에 둘러싸인 TH+ 세포를 나타내는 그래프트 코어의 대표적 이미지. 평균 6,200 TH+ 세포(n=3)가 이식 후 6주의 그래프트에 존재하였다. b) FOXA2 발현 세포(빨강색)는 그래프트에서만 발견되었고 주변 숙주 줄무늬체에서는 발견되지 않아 그래프트의 기원 및 세포의 중뇌 정체성을 나타내었다. 거의 모든 TH+ 뉴런(녹색)이 FOXA2(빨강색)를 동시-발현하였다. 그러나 상당한 비율의 FOXA2+ 세포는 TH를 동시-발현하지 않아 이들 세포가 아직 성숙한 DA 표현형을 획득하지 않았거나 DA 뉴런 마커에 대해 음성인 또 다른 FOXA2+ 뉴런 모집단을 나타냄을 제시한다. 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
도 13은 바닥 플레이트 대 로제트 유래 그래프트에 거동을 비교하는 장기간(4.5개월) 그래프트된 6-OHDA 병소의 마우스(NOD-SCID IL2Rgc 눌 스트레인)의 예시적 조직학적 분석을 나타낸다. 바닥 플레이트 유래 그래프트의 분석. a) 가장 큰 바닥 플레이트 유래 그래프트의 일례. 그래프트는 잘 제한된 hNCAM+(빨강색) 세포구조를 보유한다. b) 강력한 hNCAM+ 섬유 증식이 그래프트 주변에서 관찰되었다. c) 그래프트 중 세로토닌성(5-HT+) 섬유(녹색)는 hNCAM(빨강색)에 대해 대부분 음성이어서 숙주 기원을 제시한다. d) 그래프트 중 GABA성 뉴런 및 섬유(녹색). 로제트 유래 그래프트의 분석: e) 숙주 뇌 조직의 압축을 동반한 신경 과성장. 대부분의 세포는 NCAM(빨강색) 및 DCX(녹색) 모두에 대해 양성이어서 뉴런 운명을 제시하였다. f) NCAM+/DCX+ 섬유는 뇌의 비이식된 반대쪽으로 연장되었다. g) 그래프트 코어 내에서 다중 DCX+ 클러스터가 관찰되었다. h) 그래프트 주변에서는 TH+ 세포(녹색) 및 섬유가 거의 관찰되지 않았고 생체내 거의 모든 로제트 유래 TH+ 세포는 FOXA2(파랑색)에 대해 음성이었다. 4.5개월의 바닥 플레이트 유래 대 로제트 유래 그래프트의 면역조직화학 분석. 증식 마커 Ki67(빨강색) 및 신경 전구체 마커 PAX6(녹색)(i)의 발현, FOXA2/DCX(j), FOXG1/hNCAM(j, 삽입물), 및 별아교세포 마커 GFAP(녹색)(k)의 발현에 대한 대표적 이미지를 나타낸다. 축적 막대는 (a)에서 500 ㎛, (b-d)에서 50 ㎛, (e)에서 500 ㎛, (g-h)에서 50 ㎛, (i)에서 50 ㎛, (j)에서 40 ㎛ 및 (k)에서 20 ㎛에 해당한다.
도 14는 장기간(5개월) 그래프트된 6-OHDA 병소의 SD 래트의 예시적 조직학적 분석을 나타낸다. a) 상당히 대부분의 hNA+(빨강색) 세포는 Tuj1(녹색)을 발현하여 뉴런 운명을 가진 정체성을 시사하였다. b) 그래프트 내의 GFAP+ 섬유(녹색)는 hNA(빨강색)를 동시-발현하지 않아 숙주 기원을 제시하였다. c) 약간의 인간 세로토닌성(5-HT+) 세포체(녹색)가 관찰된 반면 대부분의 세로토닌성 섬유는 마우스 숙주에서의 데이터와 유사하게 숙주 유래였다(도 13의 C). d) 그래프트 내의 TH+ 뉴런(녹색)의 추가 예가 숙주 뇌에서 세포의 인간 정체성을 확인시키는 hNCAM(빨강색)의 발현에 대해 분석되었다. 축적 막대는 패널에서 25 ㎛에 해당한다.
도 15는 영장류 뇌에서 바닥 플레이트 유래 그래프트의 예시적 조직학적 분석을 나타낸다. H9 hESC 및 H9-GFP hESC(25일령 배양; 1.25×106 세포/트랙, 3 트랙/반구, 전체 6 트랙)에서 유래된 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런은 성체 MPTP 병소의 레서스 원숭이(=2)의 줄무늬체 내로 그래프트하였다. a) 상부 왼쪽 및 오른쪽 패널: 대표적 그래프트 부위(이식 후 1개월)의 고해상도 이미지 재구성. 그래프트 세포구조를 인간 특이적 마커 SC-121(비인간 영장류 조직과 교차 반응성 없음)에 대한 면역조직화학으로 나타낸다. 하부 왼쪽 패널: 그래프트 코어에서 연장되는 SC-121+ 섬유. 하부 오른쪽 패널: 뉴런 전구체 형태를 나타내는 SC-121+ 세포의 더 높은 고해상도 이미지. b) 그래프트 코어에서의 GFP 발현 분석은 SC-121 데이터를 보완하는 세포의 인간 정체성을 더 확인시켰다. 주: 두 동물에 있어서, 각각 하나의 반구에는 표지되지 않은 H9 유래 세포를 그래프트된 반면, 다른 반구에는 H9-GFP 세포(EF1a 프로모터의 조절 하에 GFP 발현) 유래 세포를 그래프트하였다. c) DAB 검출을 이용한 GFP+ 그래프트의 더 높은 고해상도 이미지는 신경모세포 형태를 나타내는 그래프트 주변에서 여러 GFP+ 세포를 나타낸다. d) GFP 및 SC-121에 대해 음성인 그래프트 코어 내 영역의 면역조직화학 분석. 이들 영역은 Iba1 발현(빨강색) 뿐만 아니라 ED1+ 대식세포(파랑색)에 근거하여 다수의 숙주 미세아교세포(microglia)를 함유하여 시클로스포린 면역억제에도 불구하고 지속적인 염증을 제시하였다. 축적 막대는 (a, 상부 패널)에서 500 ㎛, (a, 하부 왼쪽 패널)에서 50 ㎛, (a, 하부 오른쪽 패널)에서 20 ㎛, (b)에서 2 ㎜, (c, 왼쪽 패널)에서 500 ㎛, (c, 상부 오른쪽 패널)에서 50 ㎛, (c, 하부 오른쪽 패널)에서 100 ㎛, (d)에서 100 ㎛에 해당한다.
도 16은 로제트 세포 중간체를 통해 DA 뉴런-유사 세포로 분화된 세포인 종래의 MS5 영양세포 기반 방법을 이용하는 hESC로부터의 TH+ 세포의 예시적 유도를 나타낸다. 상부) P0에서 hESC를 MS5 영양세포를 이용하여 Oct4+ 세포의 로제트 세포로의 신경 유도를 시작하기 위해 분자와 접촉시켰다(Perrier et al., 2004). P1 단계에서 세포를 단계 P2에서 TH+/En1+ DA 뉴런으로 추가 분화된 Pax2+/En1+ DA 선조체 세포를 포함하는 특정 발현 패턴을 갖는 세포로 분화시키기 위해 추가 분자와 접촉시켜 로제트 세포를 증식시켰다. 이들 세포를 시클로스포린 A 처리를 통해 면역저해된 6OHDA 병소의 래트에서 생착에 사용하였다. 이들 이식 연구는 TH+ 표현형의 상실을 포함하는 DA 유사 뉴런의 매우 불량한 생체내 생활성을 나타내었으며, 그래프트된 동물에 대해 원치 않고 치명적일 수 있는 세포의 추가 성장, 즉 테라토마, 및 환자에게 추가적인 의학적 문제들을 야기할 부적절한 신경 유형으로의 세포 성장에 대한 우려를 드러내었다. A: 로제트 유래 DA 뉴런 전구체로부터 그래프트 중 이식 후 4.5개월에 생존하는 TH+ 뉴런의 수가 매우 적었다(< 50 TH+ 세포/동물). 그러나 TH+ 세포와는 대조적으로, GFP 표지 세포(GFP는 편재 프로모터에 의해 유도되었음)는 이식 후 상당히 잘 생존하였다. 이는 이식 후 대부분의 생존 세포가 비-DA 뉴런 정체성의 신경 세포였음을 제시한다(16B). 도 16의 C: 매우 적은 그래프트 유래 세포(hNA+(녹색))가 TH(빨강색)를 동시-발현하여 대부분의 그래프트된 인간 세포가 비-DA 뉴런 표현형을 채용함을 제시한다. 패널 16의 D-E는 D-E가 매우 불량한 생체내 생존에도 불구하고 소수의 거동 분석, 예컨대 암페타민 유도 회전(D), 실린더 테스트 및 자발적 회전(E)에서 일부(비록 매우 중등 정도이고 매우 가변적이지만) 개선이 있었음을 보여준다.
도 17은 소수의 바닥 플레이트 세포의 유도를 위한 예시적 프로토콜을 나타낸다. 개질된 이중-SMAD 억제 프로토콜로 바닥 플레이트(fb) 세포를 생성하였다. 고농도의 SHH가 FoxA2+ fp 세포의 유도에 필요했으며 운화화 패터닝 단서, 예컨대 FGF8, Wnt1 또는 RA의 첨가는 FOXA2 발현을 감소시키지 않았으나 영역 정체성을 변화시켰다. A) 왼쪽 패널: NSB(Noggin/SB431542)로의 처리 후 분화 11일의 세포; 왼쪽 중앙 패널: NSB+SHH(Sonic C25II) 처리; 중앙 패널: NSB+SHH+RA; 중앙 오른쪽 패널: NSB+SHH+Wnt1; NSB+SHH+FGF8; 주: NSB만의 처리는 FoxA2 발현을 유도하지 않았다. FoxA2+ 바닥 플레이트 세포는 고용량의 SHH의 존재 하에서만 유도된다. RA, Wnt1 및 FGF8의 첨가는 FoxA2 유도를 억제하지 않는다. B) 대부분의 앞쪽 바닥 플레이트 유사 세포를 표지하는 SIX6 발현의 동시적 하향조절과 함께 RA 또는 FGF로의 처리 후 FOXA2의 발현 유지(또는 심지어 증가)를 나타내는 FOXA2 및 SIX6의 유전자 발현에 대한 qRT-PCR 분석. C) FGF8 및 Wnt1의 존재 하에 중뇌 전구체 및 중뇌 바닥 플레이트 마커에 대한 유전자 발현의 유도.
도 18은 도 16 및 도 17에 이용된 절차로 제조된 세포 중에서의 낮거나 없는 수준에 비해 높은 수준의 중뇌 특징을 나타내는 바닥 플레이트 세포의 유도를 위한 예시적 프로토콜을 나타낸다. A: 고수준의 SHH, FGF8 및 CHIR와 접촉된 세포 모집단 중 중뇌 바닥 플레이트 유도는 도들 16 및 17에 나타낸 두 다른 절차에 기재된 분자(각각 N/SB 및 SHH/FGF8)와 접촉된 세포와는 대조적으로 분화 11일에 중뇌 마커 LMX1A 및 Otx2와 FoxA2의 동시-발현을 일으켰다. B: 본 발명의 세 번째 절차를 포함하는 각각의 세 절차로 분자(LDN/SB, SHH/FGF8, LSB/SHH/FGF8/CHIR)와 접촉된 세 군의 세포를 비교하는 11일의 전체적 유전자 발현 분석. 차트 B는 세 처리 조건 간에 공통적인 유전자 대 각각의 개별 조건에 독특한 유전자를 구체적으로 나타낸다. 차트 B는 도 1에 나타낸 마이크로어레이 결과를 위해 이용된 예비 분석이다. C: 중뇌 마커 FoxA2, LMX1A의 mRNA 수준은 SHH/FGF-처리군에 비해 LSB/SHH/FGF8/CHIR-처리군에서 고도로 농축된다.
도 19는 바닥 플레이트의 중뇌 영역에서 유래된 도파민 뉴런의 예시적인 시험관내 특성분석을 나타낸다. A: 분화 d25에 FoxA2+ 뉴런과 mDA 뉴런 마커 TH, Nurr1 및 LMX1A의 공동 표지. B: LDN/SB + SHH/FGF8 + SHH/FGF8+CHIR 처리군에서 mDA 뉴런 마커뿐만 아니라 다른 중뇌 세포 유형의 QRT-PCR에 의한 mRNA 발현 수준.
도 20은 PINK1 돌연변이체 PD-iPS 세포 대 야생형 hES(또는 iPS) 세포의 중뇌 DA 뉴런 운명에 대한 예시적인 대등한 분화 가능성을 나타낸다. PINK1 Q456X 돌연변이체 PD-iPSC 주는 본 발명의 신규한 바닥 플레이트 기반 중뇌 DA 뉴런 방법을 이용하여 분화되어 H9 주에서 얻어진 것과 대등한 중뇌 분화 프로필을 생성하였다. A-C) FOXA2(빨강색), LMX1A(녹색) 및 DAPI(파랑색)에 대해 분화 11일에(중뇌 전구체 단계)(A), FOXA2(빨강색) 및 TH(녹색)에 대한 분화 25일(초기 감수분열 후 DA 뉴런 단계)(B) 및 NURR1(빨강색) 및 TH(녹색)(C)의 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 주의 면역세포화학 분석. D-F) FOXA2(빨강색), LMX1A(녹색) 및 DAPI(파랑색)에 대해 분화 11일에(D), FOXA2(빨강색) 및 TH(녹색)에 대한 분화 25일에(E) 및 NURR1(빨강색) 및 TH(녹색)에 대해(F) H9 유래 세포를 이용하여 수행된 동일한 세트의 면역세포화학 분석.
도 21은 예시적 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC가 시험관내 장기간 분화 및 성숙 후 단백질 응집의 PD 유사 표현형을 나타내었음을 보여준다. 분화 55일에, PINK1 돌연변이체 PD-iPSC는 TH+ DA 뉴런의 세포질에서 α-시누클레인(PD 환자에서 레비 소체 형성의 주요 성분) 발현 증거를 나타내었다. 세포는 또한 유비퀴틴(ubiquitin)(전통적인 레비 소체 마커)의 높은 발현을 나타내었다. 대조적으로, 대조군 iPS 주에서 유래된 DA 뉴런은 정상적인 시냅스(세포질에 대비되어) α-시누클레인 발현 및 매우 낮은 수준의 유비퀴틴 발현을 나타내었다. A, B) α-시누클레인(LB509, 빨강색), TH(녹색) 및 병합 이미지(A) 및 α-시누클레인(빨강색) 및 유비퀴틴(녹색)(B)에 대한 분화 55일의 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 주의 면역세포화학 분석. C, D) α-시누클레인(빨강색) 및 TH(녹색)(C) 및 α-시누클레인(빨강색) 및 유비퀴틴(녹색)(D)에 대한 분화 55일의 대조군-iPSC 주의 면역세포화학 분석.
도 22는 α-시누클레인의 응집 형태의 예시적 발현을 나타낸다. PD 환자의 뇌에서, α-시누클레인의 이량체화 불용성 형태는 레비 소체의 응집으로 이어진다. α-시누클레인의 이량체화 형태는 α-시누클레인에서 세린 129의 인산화를 나타낸다. ΡINK1 돌연변이체 PD-iPSC 유래 세포는 매우 낮은 수준의 발현을 나타낸 대조군-iPSC 유래 세포와는 대조적으로 Ser129 인산화된 α-시누클레인의 강력한 발현을 나타내었다. A, B) 분화 55일의 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 유래 세포(A) 및 매칭된 대조군-iPSC 유래 세포(B)에서 Ser129 인산화된 α-시누클레인(녹색) 및 DAPI(파랑색)에 대한 면역세포화학 분석.
도 23은 분화 프로토콜에 따라 관찰되는 α-시누클레인 발현 패턴에서의 예시적 차이를 나타낸다. 본 발명자들은 '진정한' 중뇌 DA 뉴런이 PD 특이적 취약성을 가지며 이에 따라 특정한 시험관내 표현형을 가짐을 나타낸다. 전통적 MS5 기질 영양세포 기반 분화 프로토콜(Perrier et al., PNAS 2004, 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)을 이용하여 얻어지는 DA 뉴런은 다수의 TH+ 뉴런을 생성할 수 있다. 그러나 본 발명의 데이터에 근거하여, 전통적 MS5 기질 영양세포 프로토콜에 의한 분화로 생성되는 TH+ 세포는 진정한 중뇌 DA 뉴런이 아니다. MS5 프로토콜을 통해 분화된 배양에서는 다수의 α-시누클레인 양성 세포가 있었다. 그러나 이들 세포는 TH를 동시-발현하지 않았다. 또한 MS5 분화 전략을 이용하는 경우 PD-iPSC 및 대조군-iPSC 간에는 발현 패턴의 차이가 없었다. 이들 데이터는 α-시누클레인이 다른 비-DA 세포 유형에서도 발현되며 이러한 비-DA α-시누클레인은 특히 표준 MS5 분화 프로토콜을 이용하는 경우 질환 대 대조군-iPSC 유래 세포에서 변화하지 않음을 시사한다. 마지막으로 본 발명의 새로운 바닥 플레이트 기반 분화 프로토콜은 α-시누클레인을 동시-발현하는 다수의 TH+ 세포를 생성한다. 이들 TH+ 세포는 세포질 발현 패턴에서 α-시누클레인을 발현한다. A, B) MS5 기반 분화 60일의 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 주(A) 및 대조군-iPSC(B)의 α-시누클레인(LB509, 빨강색), TH(녹색)에 대한 면역세포화학 분석. C) α-시누클레인(빨강색), TH(녹색)에 대한 바닥 플레이트 기반 분화 55일의 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 주의 면역세포화학 분석.
도 24는 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC에서 유래된 예시적 DA 뉴런이 독소 자극에 더 취약함을 나타낸다. 본 발명의 바닥 플레이트 기반 프로토콜을 통해 유래된 PD-iPSC 유래 TH+ DA 뉴런은 대조군-iPSC 유래 세포에 비해 독소 유발접종(challenge)(발리노마이신: 미토콘드리아 이오노포어(ionophore), 5 μM, 48시간)에 더 취약하였다. 대조적으로, 전통적인 MS5 기반 프로토콜을 통해 유래된 TH+ 뉴런은 PD- 대 대조군 유래 세포 간에 상이한 취약성을 나타내지 않았다. A-F) 분화 60일의 대표적 TH 면역세포화학: 바닥 플레이트 기반 프로토콜을 통해 얻어진 PD- 및 대조군-iPSC 유래 세포 모두에 대한 정상 조건(독소 처리 없음)(A, PD-iPSC 유래 세포를 나타냄), 독소 처리 후 PD-iPSC에서 TH+ DA 뉴런의 거의 완전한 퇴화(B), 대조군-iPSC로부터의 부분적으로 퇴화된 TH+ DA 뉴런(C), MS5 기반 프로토콜을 통해 얻어진 PD- 및 대조군-iPSC 유래 배양물 모두의 정상 조건(D, PD-iPSC 유래 세포를 나타냄), PD-iPSC에서 독소 유발접종 후의 TH+ 뉴런(E), 및 MS5 프로토콜을 통해 얻어진 대조군-iPSC 유래 배양물(F). G-H) 분화 60일에 바닥 플레이트 기반 프로토콜에 의한 Tuj1(빨강색) 및 TH(녹색)에 대한 면역세포화학의 저 파워 이미지: PD-iPSC의 정상(G), 대 독소 유발접종(H) 조건 및 대조군 iPSC의 정상(I), 대 독소 유발접종(J) 조건. K-N) 분화 60일에 MS5 기반 프로토콜에 의한 Tuj1(빨강색) 및 TH(녹색)에 대한 면역세포화학의 저 파워 이미지: PD-iPSC의 정상(K), 대 독소 유발접종(L) 조건 및 대조군 iPSC의 정상(M), 대 독소 유발접종(N) 조건.
도 25는 독소 유발접종에 대한 세포 생활성-용량 반응 분석의 예시적 정량을 나타낸다. 발리노마이신 처리 48hr 후 알라마르-블루를 이용한 세포 생활성 분석은 PD-iPSC 및 대조군 iPSC(본 발명의 바닥 플레이트 기반 분화 60일)와 비교할 때 독소 유발접종(5 및 10 μM) 에 대해 특정 용량 범위에서 상이한 세포 생존을 나타내었다. 주: 상기 분석은 전체적인 세포사에 대해 평가한 반면, 가장 현저한 효과는 DA 뉴런에서 특이적으로 관찰되었다(도 14 참조). 따라서 알라마르-블루(alamar-blue) 기반 정량은 DA 뉴런 계통에서 관찰되는 상이한 효과의 범위를 하향 산정할 수 있다.
도 26은 다능성 줄기 세포에서 유래된 예시적으로 그래프트된 인간 DA 뉴런이 마우스 흑색질 치밀부(SNpc)에서 보이는 것에 전형적인 전기생리학적 특징을 가짐을 나타낸다. A) 상부-그래프트 영역에서 보조조정(pacemaking) 뉴런의 재구성. 하부-9개월 전에 hES 유래 뉴런을 주입한 래트에서 추출한 뇌 슬라이드의 현미경 사진; 그래프트의 윤곽을 나타낸다; 더 높은 배율의 이미지를 하부 삽입물에 나타낸다. 슬라이스를 티로신 히드록실라아제에 대해 처리하였다. 백색 영역을 참조. B). 상부-그래프트 중 추정 DA 뉴런의 세포-부착 패치 기록; 하부-동일한 세포의 전체 세포 기록. 기록은 시냅스 입력을 배제하기 위해 글루타메이트 및 GABA 수용체 길항제(antagonist)(50 μM AP5, 10 μM CNQX 및 10 μM GABAzine)의 존재 하에 수행했다. 이들 기록은 PS 유래 뉴런이 정상 체내 전압 궤도를 갖는 자율적 보조조정제였음을 나타낸다. 그래프트에서 기록된 또 다른 뉴런도 유사한 특성을 가졌다. C) 비교를 위해, 성체 마우스의 SNpc에서 도파민성 뉴런으로부터의 세포-부착 및 전체 세포 기록을 나타낸다. 약어(CTx = 피질, STr = 줄무늬체, SNpc = 흑색질 치밀부, DA = 도파민성).
도 27은 hPSC에서 예시적 A9 후보 표면 마커 및 CD-스크린을 나타낸다. a) FACS 정제 마우스 ESC 유래 mDA 뉴런으로부터의 트랜스크립톰 데이터의 벤 다이어그램. PITX3 및 Nurr1 간에 공유된 107 유전자 가운데 대부분은 중뇌 DA 뉴런의 공지된 마커였고, 신규한 마커가 배쪽 중뇌 내에서 발현되는 것으로 확인되었다: b) 이들 마커 중 하나는 mRNA 원 위치 발현 데이터에 기반하여 A9 영역 내에 농축된 것으로 나타나는 추정 표면 마커인 DCSM1이다(Allen Brain Atlas, Lein, E.S. et al., Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain, Nature 445:168-176 (2007)). c-f) CD 스크린: c) 대표적 96 웰 플레이트(3×96 플레이트 중 하나를 사용하여 전체 CD 패널을 스크리닝하였다). 진한 웰은 25일에 hESC DA 뉴런에서 고도로 발현되는 CD 마커를 표지한다. e) hESC 유래 DA 뉴런에서 CD 스크리닝 결과의 요약. f) 한 예시적 마커로, Nurr1+ 단계에서 DA 뉴런에 대해 특이적으로 농축되는 표면 마커인 CD142는 CD142+ 대 CD142- 세포의 FACS 매개 단리 및 분류 7일 후 분석에 따라 확인되었다.
도 28은 Nurr1+ 중뇌 DA 뉴런 단계에 대해 농축되고 GABA 및 세로토닌성 뉴런에 대해 결핍된 예시적 CD142를 나타낸다. a) 유세포 측정은 분화 25일에 대표적 CD142 발현을 나타내었다, b) 검사된 hESC(예로 WA09; 도 27의 f) 및 hiPSC 주(C29, 및 M3X는 분화 25일의 두 인간 iPSC 주를 나타냄)에서의 FOXA2/TH 중뇌 DA 뉴런 중 Nurr1+ 단계에 대해 농축된 CD142. c,d) CD142는 분류 25일 후 및 시험관내 배양에서 3주 동안 GABA성 및 세로토닌성 오염물에서 결핍된다. e,f) CD142는 이식 후 3개월에 생체내 GABA성 및 세로토닌성 뉴런에서 결핍된다. 세포는 25일에 CD142에 대해 분류되었다. 주: CD142 세포는 또한 TH 및 AADC가 농축되었다.
도 29는 PSA의 예시적으로 고려되는 실험적 용도를 나타낸다. PST-발현 및 PSTnm 노출 hESC 유래 DA 뉴런이 DA 표현형 및 섬유 증식에 대한 영향에 대해 시험관내에서 평가될 것이다. 유도된 PSA 발현을 갖는 적은 수의 DA 뉴런이 표준 그래프트의 거동 회복에 일치될 수 있는지, 그리고 hESC 유래 DA 뉴런에서 유도된 PSA 발현이 복잡한 운동 기능의 분석에서 회복을 유도할 수 있는지에 대해 평가될 것이다.
도 30은 PST의 예시적 용도를 나타낸다. 과발현(마우스 PST)은 분화 마우스 ES 세포에서 증가된 수준의 PSA-NCAM을 일으켰다. (A) 대조군 세포(Nurr1) 및 PST를 과발현하는 세포(Nurr1/PST)에서 qPCR에 의한 PST mRNA의 정량. 데이터는 Nurr1/PST 대 Nurr1 세포에서 PST 수준의 농축 배수로 표시된다. (B) 분화 14일의 DA 뉴런 배양에서 PSA 면역염색은 Nurr1/PST 세포에서 증가된 수준의 PSA를 나타낸다(축적 막대: 100 ㎛). (C) 분화된 세포에서 NCAM에 대한 웨스턴 블롯. Nurr1/PST 세포(레인 2)는 대조군(레인 1)에 비해 NCAM의 폴리시알릴화 형태의 증가된 수준을 나타낸다(도말, 브래킷). PSA는 endoN 처리 후 NCAM에서 제거된다(레인 3). (D) 임의 단위로 표시되는 PSA 도말의 강도 정량. (E) 분화 14일의 PSA FACS 분석. 분화 종료 24시간 전 20 유닛(unit)의 endoN을 이용한 세포 처리는 PST 효과를 제거하였다. (F) GFP 면역형광 및 DA 마커에 대해 Nurr1 및 Nurr1/PST 분화 세포를 비교하는 대표적 현미경 사진. GFP에 대해 분류되고 재플레이팅된 세포는 여전히 DA 표현형을 보유하였다(분류 후). 축적 막대: 100 ㎛.
도 31은 ES 유래 DA 뉴런의 예시적 FACS 분석을 나타낸다. GFP+ 및 SSEA-1-세포의 유세포 측정-기반 단리. 이중 음성 및 GFP 음성 대조군으로 J1 마우스 ES-세포를 사용하였다. 약 5 내지 10%의 세포가 양성으로 분류되었다.
도 32는 예시적 Nurr1/PST 그래프트가 6OHDA 마우스 모델에서 거동 회복 유도에 더 효과적이었음을 나타낸다. Nurr1::GFP 세포는 GFP+/SSEA-1-모집단에 대해 14일에 분화 및 분류되었다. endoN으로 처리된 세포를 20 유닛의 효소로 분류 전에 12시간 동안 배양하였다. 55,000 세포를 BDNF 및 AA를 함유하는 N2 배지 1 ㎖ 중에 그래프트하였다. (A) 동물은 그래프팅 전에 3주 동안, 그리고 이후 7주 동안 암페타민-유도 회전(20분 동안 회전/분)에 대해 점수를 매겼다. Nurr1/PST 세포는 Nurr1 대조군에 비해 결과를 현저히 개선한다(이원(two-way) ANOVA: p<0.01, Bonferroni 사후-테스트: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; 6마리 동물/군). endoN에 의한 PSA의 제거는 PST 효과를 제거하였다(p = 0.26). (B) 대조군에서에 비해 종결점에서 PST 그래프트에 더 많은 GFP+ 세포가 있었다(p < 0.05, t-테스트). (C) 코어에서 PSA/GFP 면역형광의 비. **p<0.01. Student t 테스트(n=5/그래프트 유형). (D) GFP, TH 및 PSA 면역형광. 축적 막대: 200 ㎛. (E) 그래프트된 세포는 DA 마커를 발현한다. 공초점 현미경의 개별 z-면을 나타낸다. 축적 막대: 20 ㎛. 값은 평균±SEM이다.
도 33은 ES 유래 DA 뉴런에 의해 숙주 줄무늬체 신경분포(innervation)를 증가시키는 예시적 PSA 증강을 나타낸다. PSA-NCAM 과발현은 돌기 증식을 증가시켰다. (A) 대조군에서 GFP/TH+, GFP/Girk2+ 및 GFP/시냅신+ 돌기의 대표적 현미경 사진. Nurr1/PST 표본에서의 염색도 유사하였다. 축적 막대: 20 ㎛. (B) Nurr1 및 Nurr1/PST 그래프트 모두에서 연장되어 나오는 GFP+ 돌기를 나타내는 대표적 z-적층 돌출부. Nurr1/PST 그래프트에서 뻗어 나오는 GFP+ 돌기가 더 많다(축적 막대: 50 ㎛). 삽입물은 동일 구획에서 GFP+/TH+ 돌기를 나타낸다. 화살표: 성장 방향. (C-E) 주입 부위에 가장 가까운 강도로 표준화된 그래프트 부위로부터 상이한 거리에 있는 GFP+(C, E) 및 TH+(D) 돌기의 강도 정량(영역은 ∼100 ㎛ 떨어진 5개 구역으로 나뉘었다. 표준화는 구역 I에 대한 것이다; 이원 ANOVA, GFP 및 TH 데이터 모두에 대해 p < 0.01, n=5/세포 유형; 값은 평균±SEM이다). Nurr1/PST 그래프트는 숙주 줄무늬체 내로 더 많은 신경돌기를 성장시키며, 이는 endoN 처리에 의해 부분적으로 억제되었다(E). (F) 동물 회복은 돌기 증식 정도와 연관되었다. 그래프는 구역 Ⅳ에서 GFP+ 신경돌기의 강도 그리고 미처리 및 endoN-처리 Nurr1 및 Nurr1/PST 그래프트된 동물에 대한 동물 회복 간의 연관성(선형 회귀 분석)을 나타낸다. 각각의 값은 하나의 동물을 나타낸다(r2=0.65, p<0.001, n=17).
도 34는 운동뉴런에서의 발현에 대해 그리고 척추 손상에 연관된 방법에서 PST의 예시적 용도를 나타낸다. 대조군 척추에서, 그래프트된 GFP 슈반 세포(Schwann cell, SC)는 숙주 흉터 조직에 의한 병소 부위로 제한되는 반면(A), PST-개질 SCs는 상당한 거리를 쉽게 이동한다(B). 상기 PSA 처리는 이동력(BBB 서브스코어; (C)에 나타낸 상부 라인 대 하부 라인 대조군) 및 뒷다리 기민성(그리드 보행 테스트; (D)에서의 하부 라인 대 상부 라인 대조군) 개선을 일으켰다. E, H): 시험관내에서 PST 도입이 섬유 발아 및 세포 이동(화살표 머리)을 증가시키는 HB9::GFP 마우스 ESC의 운동뉴런으로의 분화(E, F). 이러한 PST-세포의 좌골 신경으로의 그래프팅은 EDL 근육에서 신경근 접합부(화살표)의 수로 나타낸 바와 같이 더 우수한 표적 신경 분포를 일으킨다(G, H).
도 35는 PSTnm 효소의 예시적 용도를 나타낸다. (A) PSTnm-생성 PSA는 유도된 PST 발현(녹색 라인-중앙 라인)에 의해 생성된 PSA보다 더 효과적으로 슈반 세포 단층에 대한 현탁액 중 슈반 세포의 접착을 억제한다(빨강색 라인-최하부 라인). (B) ESC 유래 HB9 운동 뉴런에서의 PSA 면역블롯팅은 PSTnm으로 처리된 대조군 표본이 검출 불가능한 수준의 PSA를 갖는다는 것을 나타낸다. PSTnm + CMP-시알산 기질의 인큐베이션은 큰 PSA 밴드를 생성하며, 이는 endoN 처리로 제거된다. (C, D) PST 유전자로 얻어지는 효과와 유사하게, 분화 동안 PSTnm 및 기질에 의한 이들 세포의 폴리시알릴화는 신경돌기 증식 및 세포 이동(화살표 머리)을 증강시킨다. (E) 30일의 hESC 유래 DA 뉴런의 PSA 면역염색. (F) 상기 염색은 PSTnm 및 기질로의 처리 후 크게 증가된다. (G) PSTnm 단독의 생체내 주입은 효과가 없는 반면, 기질(H)과의 공동 투여는 마우스 줄무늬체에서 다량의 PSA 발현을 일으킨다.
다음의 실시예는 본 발명의 어떤 구현예 및 측면을 설명하기 위한 것이며, 그 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다. 다음의 실험적 개시에 있어서, 다음의 약자들이 적용된다: N(normal); M(molar); mM(millimolar); μM(micromolar); ㏖(moles); m㏖(millimoles); μ㏖(micromoles); n㏖(nanomoles); p㏖(picomoles); g(grams); ㎎(milligrams); ㎍(micrograms); ng(nanograms); pg(picograms); ℓ(liters); ㎖(milliliters); ㎕(microliters); ㎝(centimeters); ㎜(millimeters); ㎛(micrometers); ㎚(nanometers); U(units); min(minute); s 및 sec(second); deg(degree); pen(penicillin), strep(streptomycin) 및 ℃(degrees Centigrade/Celsius).
실시예 1. 물질 및 방법
방법 요약: 인간 ESC(H9, H1) 및 iPSC 주(2C6 및 SeV6)에 변형된 이중 SMAD-억제(Chambers, et al. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 프로토콜에 기반한 바닥 플레이트 유도(Fasano, et al., Cell Stem Cell 6:336-347 (2010), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)를 거쳤다. SHH C25II, 푸르모르파민, FGF8 및 CHIR99021에 대한 노출을 중뇌 바닥 플레이트 및 신규한 DA 뉴런의 모집단의 수율에 대해 최적화하였다(도 1의 d 참조). 바닥 플레이트 유도 후, AA, BDNF, GDNF, TGFβ3 및 dbcAMP(방법 전체를 상세히 참조)와 같은 DA 뉴런 생존 및 성숙 인자(Perrier, et al. Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)의 존재 하에 Neurobasal/B27에 기반한 분화 배지에서 추가적인 성숙(11-25일 또는 25일 이상의 배양에서 적어도 100일까지의 배양)을 수행하였다. 결과물인 DA 뉴런 모집단에 면역세포화학, qRT-PCR, 세계적인 유전자 발현 프로파일링, 도파민을 검출하기 위한 HLPC 분석 및 시험관내 전기생리학적 기록을 통한 광범위한 표현형 특성분석을 거쳤다. 반파킨슨증을 갖는 동물 뇌의 한 쪽에 6OHDA 독소가 주사된 설치류(마우스 또는 래트)에서 생체내 연구를 수행하였다. 본 연구는 전술한 것과 같이 독소를 주촉성(streotactic) 주사함으로써 6-히드록시도파민 병소를 받은 성체 NOD-SCID IL2Rgc 마우스(Jackson labs) 및 성체 스프라그 돌리 래트(Tacomic Farms) 뿐만 아니라 MPTP를 편측 카로티드 주사한 성체 레서스 원숭이에서 수행되었다. 동물(마우스에서 150×103 세포, 래트에서 250×103 세포) 및 원숭이(총 7.5×106 세포(6 트랙으로 분배됨; 뇌의 각 측에 3))의 줄무늬체 내에 주촉성으로 DA 뉴런을 주사하였다. 그래프트 후 1달 간격으로 암페타민 매개성 회전 분석뿐만 아니라 중심 운동불능(focal akinesia)에 대한 테스트("보행 테스트") 및 사지의 사용(실린더 테스트)을 포함하는 거동 분석을 수행하였다. 그래프트 후 18-20주에 래트 및 마우스를 희생시켰고, 유인원은 1개월 후에 희생시켰다. 세포 수 및 그래프트 부피의 입체학적 분석뿐만 아니라 면역조직화학을 통한 광범위한 표현형 특성분석을 통해 상기 그래프트의 특성분석을 수행하였다. 미분화된 인간 ES 세포의 배양. hESC 주 H9(WA-09, XX, 10/2009로부터 계대 27-55), H1(WA-01, XY, 6/2010으로부터 계대 30-40) 및 iPS 세포주 2C6(Kim, et al. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)(XY, 계대 20-30) 및 SeV6(XY, 계대 20-30; 비-인테그레이팅 4 인자 센다이 벡터 시스템(Ban, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011) 108(34):14234-14239: 10.1073/pnas.1103509108, 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)을 이용하여 MRC-5 배아 섬유아세포로부터 유래됨)을 최적 20% 녹아웃 혈청 대체물(KSR, Invitrogen, Carlsbad, California)-함유 인간 ES 세포 배지(종래 기재된 것과 같음(Kim, et al. Cell Stem Cells 8:695-706 (2011), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)에서 세포가 클러스터(MEF, Global Stem, Rockville, MD)하게 되는 인간 ES 세포에 기반하여 0.5×103/㎠ 내지 100×103/㎠의 범위로 추정되는 플레이팅 농도에서 마우스 배아 섬유아세포 상에 유지하였다. 녹아웃 혈청 대체물의 이용은 0% 내지 40%의 범위일 수 있다.
신경 유도. 바닥 플레이트 기반의 중뇌 도파민 뉴런 유도를 위하여, LDN-193189(100 nM(0.5-50 μM의 농도 범위, Stemgent, Cambridge, Massachusetts), SB431542(10 μM(0.5-50 μM의 농도 범위, Tocris, Ellisville, MI), SHH C25II(100 ng/㎖(10-2000 ng/㎖의 농도 범위, R&D, Minneapolis, MN), 푸르모르파민(2 μM(10-500 ng/㎖의 농도 범위), FGF8(100 ng/㎖(10-500 ng/㎖의 농도 범위, R&D) 및 CHIR99021(CHIR; 3 μM(0.1-10 μM의 농도 범위, Stemgent)에 시간에 맞춰 노출하는 것에 기반한 변형된 버전의 이중-SMAD 억제(Chambers, et al. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 및 바닥 플레이트 유도(Fasano, et al. Cell Stem Cell 6:336-347 (2010), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 프로토콜을 사용하였다. 주: 바닥 플레이트 유도 프로토콜의 경우, "SHH" 처리는 세포가 SHH C25II 100 ng/㎖ + 푸르모르파민(2 μM)의 조합에 노출, 즉 접촉하는 것을 나타낸다. 세포를 플레이팅(35-40×103 세포/㎠)하였고, DMEM, 15% 녹아웃 혈청 대체물, 2 mM L-글루타민 및 10 μM(1-25 μM의 농도 범위) β-메르캅토에탄올을 함유하는 녹아웃 혈청 대체물 배지(KSR) 내의 마트리겔 또는 겔트렉스(구매하여 사용)(BD, Franklin Lakes, New Jersey)에서 11일 동안 배양하였다. KRS 배지를 분화 5일에 시작하여 종래 기재된 것과 같이(Chambers, et al. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 5-6일에 75%(KRS):25%(N2), 7-8일에 50%(KRS):50%(N2) 및 9-10일에 25%(KRS):75%(N2)의 비로 혼합함으로써 N2 배지로 점진적으로 시프트(shift)하였다. 11일에, CHIR(13일까지) 및 BNDF(뇌 유래 향신경성 인자, 5 내지 100 범위의 20 ng/㎖; R&D), 아스코르브산(AA; 0.2 mM(0.01-1 mM의 농도 범위), Sigma, St Louis, MI), GDNF(신경교세포주 유래 향신경성 인자, 20 ng/㎖(1-200 ng/㎖의 농도 범위); R&D), TGFβ3(형질전환 성장 인자 유형 β3, 1 ng/㎖(0.1-25 ng/㎖의 농도 범위); R&D), 디부티릴 cAMP(0.5 mM(0.05-2 mM의 농도 범위); Sigma) 및 DAPT(10 nM(0.5-50 nM의 농도 범위); Tocris)로 보충된 배지를 Neurobasal 배지/B27 배지(1:50 희석)/L-Glut(0.2-2 mM의 효과 범위) 함유 배지(NB/B27; Invitrogen)로 9일 동안 교체하였다. 20일에, Accutase®(Innovative Cell Technology, San Diego, California)를 이용하여 세포를 떼어내었고, 해당 실험을 위한 원하는 성숙 단계에 도달할 때까지 분화 배지(NB/B27 + BDNF, AA, GDNF, dbcAMP(본 명세서에 기재된 것과 같은 농도 범위), TGFβ3 및 DAPT(본 명세서에 기재된 것과 같은 농도 범위)) 내의 폴리오르니틴(PO); 15 ㎍/㎖(1-50 ㎍/㎖의 농도 범위)/라미닌(1 ㎍/㎖)(0.1-10 ㎍/㎖의 농도 범위)/피브로넥틴(2 ㎍/㎖(0.1-20 ㎍/㎖의 농도 범위)으로 미리 코팅된 접시 위에서 높은 세포 밀도(예를 들면, 300-400k 세포/㎠) 조건 하에 다시 플레이팅하였다.
로제트 기반의 DA 뉴런 유도의 경우, 초기 신경 유도 단계를 가속화하기 위하여 이중-SMAD 억제가 사용되는 한 가지 예외를 제외하고는 종래에 기재된 프로토콜을 부분적으로 따랐다(Pirrier, et al. Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 간략하게, hESC를 분화 2-8일에는 SB431542 및 Noggin(250 ng/㎖(10-1000 ng/㎖의 농도 범위); R&D) 및 분화 6-11일에는 SHH+FGF8로 보충된 KSR 내의 조사된(irradiated) MS5 세포와 함께 배양함으로써 신경의 운명으로 향하도록 유도하였다. KRS 내에서 11일 후, 신경 로제트를 수동으로 단리하였고, 종래 기재된 것과 같이(Perrier, et al. Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) SHH, FGF8, BDNF 및 AA로 보충된 N2 배지 내에서 배양하였다(P1 단계). P1 단계에서 5-7일 후, 로제트를 다시 기계적으로 수확 및 저작한(triturate) 후, Ca2+/Mg2+-부재 행크 균형 염 용액(HBSS)에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, 폴리오르니틴(PO)/리미닌/피브로넥틴 코팅된 플레이트 상에 다시 플레이팅하였다. P2 단계에서 7일 동안 SHH/FGF8을 이용한 패터닝을 계속한 후, 전술한 것과 같이 해당 실험에 대한 원하는 성숙 단계가 될 때까지(전형적으로는 이식 연구의 경우 5-7일 또는 시험관내 기능 연구의 경우 32일) BDNF, AA, GDNF, TGFβ3 및 dbcAMP의 존재 하에 최종 분화시켰다.
유전자 발현 분석. 분화하는 동안 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 25일에 대조군 LSB, LSB/SHH/FGF8 및 LSB/SHH/FGF8/CHIR의 각각의 조건으로부터 RNeasy 키트(Qiagen, Valenci, CA)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 미세배열(microarray) 분석을 위하여, MSKCC 게놈 코어 시설에 의해 총 RNA를 처리하였고, 제조사의 명세서에 따라 일루미나 인간 ref-12 비드 어레이 상에 교잡하였다. 바이오콘덕터(www.bioconductor.org)사의 LIMMA 패키지를 이용하여 각각의 날짜 및 조건 간에 비교를 수행하였다. 조정된 P 값 < 0.05 및 2 이상의 배수 변화를 갖는 것으로 나타난 유전자들을 유의미한 것으로 간주하였다. 상업적으로 입수가능한 소프트웨어 피키지(Partek Genomics Suite(version 6.10.0915))를 이용하여 일부 설명적 미세배열 데이터 분석 및 제공을 수행하였다. qRT-PCR 분석을 위하여, 각각의 조건의 25일에 총 RNA를 역전사하였고(Quantitech, Qiagen), 상업적으로 입수가능한 Taqman 유전자 발현 분석(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)을 이용하여증폭된 물질을 검출하였으며, 데이터는 HPRT로 표준화하였다. 각각의 데이터 점은 3개의 독립적인 생물학적 샘플 유래의 9개의 기술적 복제물을 나타낸다. 미세배열 연구의 미가공(raw) 데이터는 GEO 홈페이지(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)로부터 아직 이용가능하지 않다. 동물 수술. NIH 지침에 따라 설치류 및 원숭이 절차를 수행하였고, 지역 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee), IBC(Institutional Biosafety Committee) 뿐만 아니라 ESCREO(Embryonic Stem Cell Research Committee)에 의해 승인되었다.
마우스. NOD-SCID IL2Rgc 눌 마우스(20-35 g의 체중; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)를 케타민(90 ㎎/㎏; Akorn, Decatur, IL) 및 자일라진(4 ㎎/㎏ Fort Dodge, IA)으로 마취시켰다. 6-히드록시도파민(10 ㎍(0.1-20 ㎍의 농도 범위)) 6-OHDA(Sigma-Aldrich)을 다음의 좌표(㎜ 단위)에서 주촉성으로 줄무늬체 내로 주사하였다: AP, 0.5(브레그마로부터; 주촉성 수술에 대한 참고자료로 사용된 두개골 봉합); ML, -2.0; DV, -3.0(경막으로부터, 참고자료로 사용된 뇌를 덮고 있는 막). 성공적인 병소를 갖는 마우스(평균 > 6 회전/분)를 이식을 위해 선택하였다. 총 150×103 세포를 1.5 ㎕의 주사 부피로 다음의 좌표(㎜ 단위)에서 줄무늬체 내로 주사하였다: AP, 0.5; ML, -1.8; DV, 3.2. 상기 마우스는 이식 후 18주에 희생시켰다.
래트. 수술 절차 동안에 성체 암컷 스프라그-돌리(Taconic, Hudson, NY) 래트(180-230 g)을 케타민(90 ㎎/㎏) 및 자일라진(4 ㎎/㎏)으로 마취시켰다. 2군데 위치(Studer, et al. Nature Neurosci. 1:290-295 (1998), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)에서 6-OHDA(0.2% 아스코르브산 및 0.9% 생리식염수 내의 3.6 ㎎/㎖, Sigma)를 입체정위적(stereotaxic) 주사함으로써 편측의 중앙 전뇌 번들 병소 흑색질선상체 경로를 확립하였다. 주사 후 6-8주까지 암페타민 유도성 회전이 6 회전/분을 넘으면 래트를 이식에 대해 선택하였다. 250×103 세포를 각각의 동물의 줄무늬체 내로 이식하였다(좌표: AP +1.0 ㎜, ML -2.5 ㎜ 및 V -4.7 ㎜; -2.5에서 투쓰바 세팅). 대조군 래트는 PBS를 대신 받았다. 상기 수술 절차는 종래에 개시되어 있다(Studer, et al. Nature Neurosci, 1:290-295 (1998), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 매일 15 ㎎/㎏(Bedford Labs, Bedford, OH)의 시클로스포린을 복강내 주사하는 것을 세포 그래프트 24시간 전에 시작하여 세포 그래프트 20주 후에 희생시킬 때까지 계속하였다.
유인원. 2마리의 성체(17-18년; 10-12 ㎏; 암컷) 레서스 원숭이를 매주 정맥내 MPTP 주사한 후 카로티드 MPTP 투여를 통해 반파킨슨증이 되게 하여 양측성 파킨슨증 증후군을 생성하였다(Kordower, et al. Science 290:767-773 (2000), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 2마리 동물은 구부러진 자세, 다리 끌기 및 경직(이동의 불요성(inflexibility)) 증상, 편측무시(neglect)(편측화 자극에 대한 모터 자각) 및 운동완만증(느린 이동 시작)을 포함하는 거동 분석에 기초한 보통-중증 병소와 일치하는 파킨슨증 증후군을 나타내었다. 상기 파라미터는 변형된 파킨슨증 임상 등급 규모(clinical rating scale, CRS)를 이용하여 원숭이에서 평가될 수 있다. 이식 수술하는 날에, 동물을 케타민(3.0 ㎎/㎏, IM) 및 덱스도미터(0.02-0.02 ㎎/㎏, IM)으로 안정시켰고, 삽관하여 안정한 기도를 유지하였으며, 이소플루란으로 마취시켰다. 이후, 이들을 수술을 위해 입체정위 프레임(frame) 내에 두었다. 2마리 레서스 원숭이 모두 인간 바닥 플레이트 유래 DA 배양물로 입체정위적 좌표에 기반하여 3회 두 개내 주사하여 단일 수술을 수행하였다(Paxinos, et al. The Rhesus Monkey Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press, 2000), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 세포의 양측성 주사(10 ㎕/주사; 125,000 세포/㎕)를 반구 당 30 ㎕의 총 부피로 3군데 위치(1-후방 미상핵, 2-전교련 피각 및 위에 놓인 백질)에서 수행하였다. 입체정위적 미세조작기에 부착된 인퓨전(infusion) 펌프를 이용하여 세포를 28 G 바늘을 갖는 50 ㎕ 해밀턴 주사기를 통해 1 ㎕/분의 속도로 운반하였다. 주사가 완료된 후, 바늘을 추가로 2-5분 동안 제자리에 두어 천천히 바늘을 철회하기 전에 상기 인퓨전물(infusate)이 바늘 끝을 확산해 나가도록 하였다. 수술 직후, 동물은 진통제(Buprenex, 0.01 ㎎/㎏ IM, 수술후 72시간 동안 BID; 0.1 ㎎/㎏ SQ, 수술 후 72시간 동안 SID) 및 항생제(cephazolin, 25 ㎎/㎏ IM, 수술후 72시간 동안 BID)를 받았다. 동물은 수술 48시간 전에 시작하여 이식 후 1달에 희생될 때까지 매일 1번 시클로스포린 A(Neoral, Sandimmune)를 경구로(30 ㎎/㎏에서 15 ㎎/㎏으로 점점 작게) 받았다.
거동 분석. 이식 전 및 이식 4, 8, 12 및 18주 후에 암페타민 유도성 회전(마우스 및 래트) 및 보행 테스트(래트)를 수행하였다. 마우스에서의 회전 거동은 d-암페타민(10 ㎎/㎏, Sigma)의 복강내 주사 후 10분에 기록하였고, 30분 동안 기록하였다. 래트에서의 회전 거동은 d-암페타민(5 ㎎/㎏, Sigma)의 복강내 주사 후 40분에 기록하였고, TSE VideoMot2 시스템(독일)에 의해 자동적으로 평가하였다. 상기 데이터는 분 당 평균 회전 수로 나타내었다. 상기 보행 테스트는 모두 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되어 있는 하기 문헌들의 내용을 변형하였다: Blume, et al. Exp. Neurol. 219:208-211 (2009) 및 Crawley, et al. What's Wrong With My Mouse: Behavioral Phenotypng of Transgenic and Knockout Mide (Wiley-Liss, 2000). 간략하게, 각각의 래트를 평평한 표면에 위치시켰다; 꼬리를 부드럽게 잡아 그 뒷다리를 들어서 앞발만 테이블에 접촉하도록 하였다. 실험자는 래트를 일정한 속도로 뒤로 1 미터 당겼다. 대측성 및 동측성 앞발 모두로부터 조정 발걸음 수를 카운트하였다. 데이터는 대측성 / (대측성 + 동측성) 조정 발걸음의 백분율로 나타내었다. 상기 실린더 테스트는 각각의 동물을 유리 실린더 내에 위치시키고 종래 개시된 것과 같이(Tabar, et al. Nature Med. 14:379-381 (2008), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 실린더의 벽에 동측성 대 대측성 발 접촉의 수(20번의 접촉 중에서)를 카운트함으로써 수행하였다. 조직 처리. 마우스 및 래트: 동물(마우스 및 래트)은 과용량의 펜토바비탈을 복강내(50 ㎎/㎏)로 받아 깊은 마취를 유도하였고, 4% 파리포름알데히드(PFA)로 관류시켰다. 뇌를 적출하였고, 4% PFA로 후고정시킨 후, 30% 수크로오스 용액 내에 2-5일 동안 침지시켰다. 이들을 O.C.T. 화합물(Sakura-Finetek, Torrance, California) 내에 임베딩시킨 후, 크라이오스탯(cryostat) 상에서 절편화하였다.
유인원: 동물을 케타민(10 ㎎/㎏, 근육내(IM)) 및 펜토바비탈(25 ㎎/㎏, 정맥내(IV))을 이용한 깊은 마취 하에 헤파린화 0.9% 생리식염수와 신선한 냉각된 4% FPA 고정액(fixative)(pH 7.4)을 이용한 심장 관류를 통해 희생시켰다. 1차 고정 직후, 뇌를 두개골로부터 제거하였고, 4% PFA에서 후고정한 후, 24-36시간 동안 자유 부유시켰다. 이후, 슬로우 쉐이커(slow shaker)에서 4℃에서 10% 수크로오스 내에 세척 및 재현탁시켜 "가라앉도록(sink)" 하였다. 이후, 상기 공정을 20% 수크로오스 내에서 반복한 후, 30% 스크로오스 내에서 반복하였다. 전체 뇌를 동결된 슬레지 마이크로톰(sledge microtome)에서 관상적으로(coronally) 40 ㎛의 일련의 절편으로 잘랐고, 섭씨 -20℃에서 냉동보존 배지에서 자유 부유 상태로 보관하였다.
면역조직화학: 세포를 4% FPA 내에 고정하였고, 0.3% Triton을 갖는 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 블록하였다. 뇌 조직 절편을 냉각된 PBS로 세척하였고, 유사하게 처리하였다. 1차 항체를 1-5% BSA 또는 보통 염소 혈청 내에 희석하였고, 제조사의 지침에 따라 인큐베이션하였다. 광범위한 항체 및 공급원의 리스트가 표 6에 개시되어 있다. 적절한 Alexa488, Alexa555 및 Alexa647-접합된 2차 항체(Molecular Probes, Carlsbad, California)을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 핵 대비염색(counterstain)(Thermo Fisher, Rockford, Illinois)과 함께 사용하였다. 일부 분석의 경우, 바이오틴화 2차 항체를 사용한 후, DAB(3,3'-디아미노벤지딘) 발색체(chromogen)를 통해 시각화하였다. HPLC 분석. 종래 개시된 것(Roy, et al. Nature Med. 12:1259-1268 (2006); Studer, et al. Brain Res. Bull. 41:143-150 (1996), 이들 모두는 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)과 같이 도파민, 호모바닐릭산(HVA) 및 DOPAC(3,4-디히드록시-페닐아세트산)의 레벨을 측정하기 위한 전기화학적 검출을 갖는 역상 HPLC를 수행하였다. 배양 샘플을 분화 65일에 과염소산 내에 수집하였다. 일부 실험의 경우, 종래 개시된 것(Studer, et al. Brain Res. Bull. 41:143-150 (1996), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)과 같이 상업적으로 입수가능한 키트를 이용하여 도파민 및 그 대사물의 알루미늄 추출한 후 동일한 검출 시스템을 사용하는 배지 내에서 DA를 직접 측정하였다. 전기생리학적 기록. 배양물을 40X 물-침지 대물렌즈(Eclipse E600FN; Nikon)가 장착된 수직으로 선 현미경 상의 기록 챔버로 전달하였다; 배양물을 하기 성분들을 mM로 함유하는 생리식염수로 관류시켰다: 125 NaCl, 2.5 KCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 2 CaCl, 1 MgCl2 및 25 글루코오스(34℃; 95% O2-5% CO2로 포화됨; pH 7.4; 298 mOsm/ℓ). 인라인(in-line) 가열기(TC-324B 조절기를 갖는 SH-27B; Warner Instruments)를 통해 흐르는 상기 생리식염수의 흐름 속도는 2-3 ㎖/분 이었다. 냉각된-CCD 디지털 카메라(CoolSNAP ES2, Photometrics, Roper Scientific, Tucson, Arizona)를 갖는 비디오 현미경에 의해 뉴런을 시각화하였다. 전기생리학적 기록을 위해 선택된 세포는 미세한 가지형 신경돌기와 함께 뉴런과 유사한 형태를 가졌다. 현재의 클램프 구성(clamp configuration) 내에서 체세포성 전체 세포 패치-클램프 기록을 MultiClamp 700B 증폭기(Molecular Devices)를 이용하여 수행하였다. 신호를 1-4 kHz에서 여과하였고, Digidata 1440A(Molecular Devices)로 5-20 kHz에서 디지털화하였다. Flaming-Brown 풀러(puller) 상에 당겨진 필라멘트화 보로실리케이트 유리(Sutter Instrument)로부터 기록 패치 전극을 제조하였으며, 조(bath) 내에서 4-6 MΩ의 저항을 가졌다. 전극은 하기 성분들을 mM로 함유하는 내부 용액으로 충진시켰다: 135 K-MeSO4, 5 KCl, 5 HEPES, 0.25 EGTA, 10 포스포크레아틴-디(트리스), 2 ATP-Mg 및 0.5 GTP-Na(pH 7.3, 삼투압은 290-300 mOsm/ℓ로 조정됨). 전극 저항을 상쇄하도록 상기 증폭 브릿지 회로를 조정하였고, 모니터링하였다. 전극 커패시턴스(capacitance)는 상쇄되었다. 기록하는 동안 일련의 저항이 >20% 증가될 때, 증가된 저항은 기록하는 동안의 부분적인 기술적 실패를 나타내기 때문에 그 데이터는 버렸다.
세포 카운트 및 입체학적 분석. 바닥 플레이트에서 마커 양성 세포의 백분율(11일)(도 1), 중뇌 도파민 뉴런 전구체(25일)(도 2) 및 성숙한 DA 뉴런 단계(50일 이후)(도 3 및 도 11)를 각각 3번의 독립적인 실험으로부터 유래된 동일한 샘플에서 측정하였다. 정량화용 이미지를 균일한 무작위 방식으로 선택하였고, 각각의 이미지를 먼저 DAPI-양성 핵의 수에 대해 점수를 매긴 후, 관심있는 마커를 발현하는 세포의 수를 카운트하였다. 데이터는 평균±SEM 으로 나타내었다. 그래프트가 확인가능한 매 10번째 절편에 대해 그래프트 내의 인간 세포(항-hNA로 확인됨) 및 TH+ 뉴런의 정량화를 수행하였다. 광학 분류기(fractionator)의 프로브 및 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 타바르 등(Tabar, et al. Nat. Biotechnol. 23:601-606 (2005))의 문헌에 종래 기재된 것과 같이 Stereo Investigator 소프트웨어(MBF bioscience, Vermont)를 이용한 카발리에리 어림자(Cavalieri estimator)를 이용하여 세포 카운트 및 그래프트 부피를 결정하였다. 데이터는 추정된 총 세포 수 및 총 그래프트 부피±평균의 표준 오차(SEM)로 나타내었다.
다음의 제형물(formulation)은 본 발명의 구현예를 개발하는데 사용하기 위한 예시적인 세포 배양 배지를 개시한다.
유지를 위한 hESC 배지(1 리터): 800 ㎖ DMEM/F12, 200 ㎖의 녹아웃 혈청 대체물, 5 ㎖의 200 mM L-글루타민, 5 ㎖의 Pen/Strep, 10 ㎖의 10 mM MEM 최소 비-필수 아미노 15 산 용액, 55 μM의 13-메르캅토에탄올 및 bFGF(최종 농도는 4 ng/㎖).
hESC 분화를 위한 KSR 배지(1 리터): 820 ㎖의 녹아웃 DMEM, 150 ㎖의 녹아웃 혈청 대체물, 10 ㎖의 200 mM L-글루타민, 10 m의 Pen/Strep, 10 ㎖의 10 mM MEM 및 55 μ의 13-메르캅토에탄올.
hESC 분화를 위한 N2(1 리터): DMEM/F12 분말을 갖는 985 ㎖의 증류된 H2O, 1.55 g의 글루코오스(Sigma, cat. no. G7021), 2.00 g의 나트륨 비카보네이트(Sigma, cat. no. S5761), 푸트레신(putrescine)(100 ㎖의 증류수에 용해된 100 ㎕ 당량의 1.61 g; Sigma, cat. no. P5780), 프로게스테론(100 ㎖의 100% 에탄올에 용해된 20 ㎕ 당량의 0.032 g; Sigma, cat. no. P8783), 나트륨 셀레나이트(증류수 내의 60 ㎕ 당량의 0.5 mM 용액; Bioshop Canada, cat. no. SEL888) 및 100 ㎎의 트랜스페린(Celliance/Millipore, cat. no. 4452-01) 및 10 ㎖의 5 mM NaOH 내의 25 ㎎의 인슐린(Sigma, cat. no. I6634).
PMEF((primary mouse embryo fibroblast, PMEF) 피더 세포)를 제조하기 위한 10% FBS를 갖는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)(1 리터): 885 ㎖의 DMEM, 100 ㎖의 FBS, 10 ㎖의 Pen/Strep 및 5 ㎖의 L-글루타민.
MS-5 피더 세포 배지를 제조하기 위한 10% FBS를 갖는 알파 최소 필수 배지(MEM)(1 리터): 890 ㎖의 알파 MEM, 100 ㎖의 FBS, 10 ㎖의 Pen/Srep 젤라틴 용액(500 ㎖): 500 ㎖의 따뜻한(50-60℃) Milli-Q 물 내에 0.5 g의 젤라틴을 녹임.
실시예 2.
본 실시예는 본 발명의 FOXA2+LMX1A+DA 뉴런의 직접 분화를 제공하기 위한 소분자 및 접촉 시간의 발견을 개시한다.
다음은 본 명세서에 기재된 일부 실험적 발견의 간략한 요약이다: CHIR99021 부재 하에 이중-SMAD 억제된 세포를 SHH 길항제(purmorphamine + SHH) 및 FGF8(S/F8)로 처리하면 11일까지 FOXA2의 발현이 현저하게 낮고 LMX1A 발현이 완전히 없어지는 것을 보여주었다(도 1의 a 및 b). 앞쪽 마커인 OTX2는 LSB 및 LSB/S/F8/CHIR 처리된 배양물에서 강하게 유도되었지만, LSB/S/F8 조건 하에서는 그렇지 않았다(도 1의 a 및 c).
본 발명자들은 이전에는 DA-유사 뉴런을 함유하는 세포 모집단으로 되는 몇 가지 다른 지향성 분화 방법을 사용하였다. 상기 DA-유사 뉴런을 이들 세포를 치료에 적용하기 위한 추가적인 용도에 관해 귀결되는 이식 연구에 사용하였다. 예를 들면, MS5 신경 유도를 포함하는 페리어 등(Perrier et al., 2004) 및 파사노 등(Fasano et al., 2010)에 개시되어 있는 절차는 로제트 세포의 형성으로 귀결되었고, 11일에 예를 들면 DA-유사 뉴런을 유도하기 위해 추가로 사용되는 전구체를 제조하기 위해 사용되었다(도 2, 도 16 및 도 17 참조). 상기 뉴런은 11일의 세포 모집단에서 낮은 백분율의 전구체 세포로부터 유래되었다. 상기 뉴런을 사용한 이식 연구는 빈약한 이식후 생존능 및 DA-유사 뉴런 표현형의 상실뿐만 아니라 이식후 성장 조절이 상실되어 테라토마가 발생하게 되는 부적절한 유형의 신경이 발생하는 것을 보여주었다(도 16 및 도 17 참조).
구체적으로, P0에서 hESC는 MS5 피더 세포를 이용하여 Oct4+ 세포가 로제트 세포로 신경 유도를 시작하기 위한 분자와 접촉하였다(Perrier et al., 2004). P1 단계에서, 로제트 세포는 Pax2+/En1+ DA 전구체 세포를 포함하는 특정 발현 패턴을 갖는 P2 단계로 세포를 분화시키기 위한 추가적인 분자와 세포를 접촉시킴으로써 확장되었고, TH+/En1+ DA 뉴런으로 추가로 분화되었다. 상기 세포를 시클로스포린 A로 면역억제된 6OHDA 병소의 래트 내에 생착하기 위해 사용하였다. 상기 이식 연구는 빈약한 생체내 생존능, TH+ 표현형의 상실, 원하지 않고 어쩌면 치명적인 세포, 즉 테라토마로의 추가적인 성장에 관한 사항 및 환자에게 추가적인 의학적 문제를 초래하게 되는 부적절한 신경 유형으로 세포가 성장하는 것을 보여주었다.
로제트 유래 DA 뉴런 전구체 유래의 그래프트 내에서 이식 후 4.5개월에 생존하는 TH+ 뉴런의 수는 매우 작았다(<50 TH+ 세포/동물)(도 16의 A). 그러나, TH+ 세포와 대조적으로, GFP 표지된 세포(GFP는 유비쿼터스(ubiquitous) 프로모터에 의해 발현됨)는 이식 후에 꽤 잘 생존하였다. 이는 이식 후 대부분의 생존하는 세포가 비-DA 뉴런 정체성의 신경 세포였음을 제시한다(도 16의 B). 일부 그래프트 유래 세포(hNA+)(녹색)가 다시 TH(녹색)를 함께 발현하는데, 이는 대부분의 그래프트된 인간 세포는 비-DA 뉴런 표현형을 채용한다는 것을 제시한다(도 16의 C). 도 16의 D-E 패널은 매우 빈약한 생체내 생존에도 불구하고 암페타민 유도성 회전(D), 실린더 테스트 및 자연적 회전(E)과 같은 몇 가지 거동 분석에서 일부(낮고 매우 가변적인) 개선이 있었음을 보여준다. 피더가 없는 신경 유도는 종래에 개시된 것(Chambers et al., 2009)과 같이 수행하였지만, 추가로 변형시켜 받가판 세포를 생성하였다(Fasano et al., 2010). 다능성 세포를 바닥 플레이트 세포로 분화시키기 위한 변형된 이중-SMAD 억제 방법에서, 본 발명자들은 이전에 11일까지 FP 유도하기 위해서는 고농도의 SHH가 필요함을 발견하였다. 예를 들면, 일부 구현예에서, Sonic C25II를 200 ng/㎖로 첨가하였다. 일부 구현예에서, DKK-1(R&D; 100 ng/㎖), FGF8(R&D; 50 ng/㎖), Wnt-1(Peprotech; 50 ng/㎖) 및 레티노산(R&D; 1 mM)을 첨가하였다(도 17 참조). 그러나, 11일에 종래의 방법을 이용한 결과물인 세포 모집단 어느 것도 본 발명의 방법의 이용한 FOXA2+/LMX1A+ 중뇌 바닥 플레이트 선조체 세포를 높은 백분율로 포함하지 않았다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 다능성 세포를 함유하는 세포 모집단을 출발 모집단으로 선택하였고, 0일에 플레이팅하였다. 분화 전에 세포를 거의 포화되게(confluency) 키웠다(60-100% 포화도(confluence)). 상기 세포를 0일에 이중 SMAD 억제제(즉, LDN-193189 + SB431542에 대한 노출 = "LSB")와 접촉시켰다. 본 발명자들은 11일까지 신선한 LSB를 함유하는 정규 피딩(feeding)을 이용하여 세포 모집단을 따랐고, 일부 남아있는 세포가 LMX1A+ 이지만 FOXA2를 발현하지 않는 것을 발견하였다(도 1의 a 및 b). 본 발명자들은 이중 출발 세포 모집단을 플레이팅한 후, 세포를 특정 시간, 즉 24시간, 48시간 등 동안 상이한 노출 요법, 즉 세포를 0일, 또는 2일, 또는 2일 등으로 접촉함으로써 임의의 다음의 SHH 길항제(purmorphamine + SHH) 및 FGF8(S/F8)을 함유하는 혼합물과 접촉한 후 세포 유형(즉, 유전자/단백질 발현 패턴)에 대해 테스트하였다. 테스트된 3가지 1차적인 예시적 배양 조건은 1) 세포를 0일에 LDN/SB(LSB)와 접촉시킨 후, 5일까지 신선한 LSB와 접촉시키고, 5일에 세포를 11일까지 SB가 없는 신선한 LDN와 접촉시켰다, 2) 세포를 0일에 LDN/SB(LSB)와 접촉시킨 후, 5일까지 신선한 LSB와 접촉시키고, 5일에 세포를 11일까지 SB가 없는 신선한 LDN와 접촉시키면서, 이 시간 동안 세포를 7일까지 추가적으로 신선한 푸르모르파민, SHH 및 FGF8과 접촉시켰다, 3) 세포를 0일에 LDN/SB(LSB)와 접촉시킨 후, 5일까지 신선한 LSB와 접촉시키고, 5일에 세포를 11일까지 SB가 없는 신선한 LDN와 접촉시키면서, 이 시간 동안 세포를 7일까지 추가적으로 신선한 푸르모르파민, SHH 및 FGF8과 접촉시키고, 세포 유형의 최적의 수율을 결정하기 위하여 상기 1차적 조건에 몇 가지 변화를 주면서 배양 3일부터 시작하여 11일까지 신선한 CHIR과 추가로 접촉시켰다. 세계적인 일시적 유전자 발현 프로필을 이용하여 3가지 배양 조건의 시스템적 비교(도 1의 d)를 수행하였다. 예시적인 도 8 및 표 1 내지 표 6 참조. 상이하게 발현되는 유전자들의 계층적 클러스터링으로 분화 11일까지 상기 3가지 처리 조건을 구분하였다(도 8의 a). FOXA1, FOXA2 및 PTCHI를 포함하는 몇 가지 다른 SHH 하류 표적은 LSB/S/F8/CHIR 대 LSB 처리 세트에서 가장 상이하게 조절되는 전사체 중 하나였다(도 1의 e). LMX1A, NGN2 및 DDC의 발현은 11일까지 이미 중뇌 DA 뉴런 전구체가 확립되었음을 나타내었다(도 1의 e 및 f). 이와 대조적으로, 11일까지의 LSB 배양은 HES5, PAX6, LHX2 및 EMX2와 같은 등쪽 전뇌 전구체 마커에 대해 농축되었다. LSB/S/F8/CHIR 대 LSB/S/F8, 처리의 직접적인 비교(도 1의 f)는 LSB/S/F8/CHIR 군에서 중뇌 DA 전구체 마커에 대한 선택적인 농축을 확인하였으며, RAX1, SIX3 및 SIX6의 상이한 발현에 근거하여 LSB/S/F8 처리된 배양물에서의 시상하부 전구체 정체성을 제시하였다(또한, 도 2의 d에서의 POMC, OTP 발현 참조).
11일 동안 상이하게 발현되는 전사체의 예시적인 목록은 표 1 및 표 2에 나타나 있고, 25일에는 표 3 내지 표 5에 나타나 있으며, 유전자 온톨로지(ontology) 분석(도 8의 b, DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov)은 CHIR 처리시 정규 WNT 신호전달에 대해 농축되어 있음을 확인하였다. 미가공 데이터는 GEO(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/accession#:[TBD])에서 아직 이용가능하지 않다. 중뇌 DA 전구체 마커(도 1의 g) 대 앞쪽 및 배쪽 비-DA 뉴런 운명의 마커(도 1의 h)에 대한 유전자 발현의 비교 시간적 분석은 상기 3가지 유도 조건을 ⅰ) LSB: 등쪽 전뇌; ⅱ) LSB/S/F8: 배쪽/시상하부, 및 ⅲ) LSB/S/F8/CHIR: 중뇌 DA 전구체 정체성으로 분할하였다.
실시예 3.
DA 뉴런의 분화. 추가적인 분화를 위하여, 전구체 세포를 뉴런의 성숙을 촉진하는 배지(BAGCT - 물질 및 방법 참조) 내에 유지하였다. 종래의 방법 및 본 발명의 방법으로부터 유래되는 분화된 세포의 모집단 사이에 하기 유형의 비교를 수행하였다: A) 분화 50일에 LMX1A, FOXA2 및 NURR1과 조합하여 TH에 대한 면역세포화학적 분석, B) 로제트 유래 세포 대 바닥 플레이트 유래(LSB/S/F8/CHIR) 배양을 비교하는 총 세포로부터의 TH+, FOXA2+, LMX1+ 및 NURR1+ 세포의 정량화, C) 바닥 플레이트 및 로제트 유래 DA 뉴런 배양에서 50일에 세로토닌+(5-HT) 및 GABA+ 뉴런 서브타입(비-DA 뉴런 오염물)의 백분율의 정량화, 및 D) 도파민 및 대사물을 측정하기 위한 HPLC 분석: 바닥 플레이트 대 로제트 유래 배양 사이의 DA, DOPAC 및 HVA 레벨의 비교. 25일까지, 3가지 전구체 세포 모집단은 Tuj1+ 뉴런(도 2의 a) 및 DA 합성에서의 속도-제한 효소인 TH를 발현하는 세포를 생성하였다. 그러나, LSB/S/F8/CHIR 처리는 LMX1A 및 FOXA2를 동시-발현하고 핵 수용체 NURR1(NR4A2)의 강한 유도를 나타내는 TH+ 세포를 생성하였다(도 2의 a 및 b). 13일 대 25일 배양에서의 유전자 발현을 비교하면 다른 유사분열후 DA 뉴런 마커의 강한 유도를 확인하였다(도 2의 c). LSB 및 LSB/S/F8 처리된 배양과 비교하여 25일에 DA 뉴런 정체성을 특정하면 공지된 중뇌 DA 뉴런 전사체의 농축을 확인하였고, 복수의 신규한 후보 마커들을 확인하였다(도 2의 d, 표 3 내지 표 5, 도 8의 b). 예를 들면, LSB/S/F8/CHIR(중뇌 DA 군)에서 가장 높게 농축된 전사체는 종래에는 DA 뉴런 발생과 연관되어 있지 않고 인간 흑색질에서 높게 발현되는 유전자인 TTF3 였다(도 8의 c, Allen Brain Atlas: http://human. brain-map.org).
유사한 데이터가 EBF-1, EBF-3(도 8의 c) 뿐만 아니라 간에서 FOXA2의 전사 표적으로 알려져 있는 TTR에 대해서도 얻어졌다. 본 발명의 발생 동안에 얻어진 데이터는 중뇌 DA 전구체 세포 내에 몇 가지 PITX 유전자의 농축을 나타내었다. 중뇌 DA 뉴런의 고전적인 마커인 PITX3 또한 분화 25일에 강하게 발현되었다(도 2의 e). 마지막으로, 중뇌 바닥 플레이트 및 DA 뉴런 유도 모두 독립적인 hESC 및 hiPSC 주에서 즉시 재생산될 수 있었다(도 9). 본 명세서에 기재된 상기 데이터는 다른 테스트된 프로토콜과 대조적으로 LSB/S/F8/CHIR 프로토콜은 중뇌 DA 뉴런 운명과 일치하는 마커 프로필을 발현하는 세포를 생성한다는 것을 보여주었다.
바닥 플레이트 유래 DA 뉴런의 시험관내 및 생체내 특성을 신경 로제트 중간체를 통해 얻어진 DA-유사 뉴런과 비교하였다(도 10 및 도 16). 신경 로제트의 패터닝은 hPSC로부터 DA 뉴런을 유도하기 위한 현재 가장 널리 사용되는 전략을 나타낸다. 바닥 플레이트 및 로제트 기반의 프로토콜 모두 장기간(분화 50일; 도 3의 a) 시험관내 생존할 수 있는 TH+ 뉴런의 생성에 효과적이었다. 그러나, TH+ 세포의 백분율은 바닥 플레이트 유래 배양에서 현저하게 높았다(도 3의 b). 상기 프로토콜들 모두에서 TH+ 세포는 NURR1의 동시-발현을 나타내었지만, 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런은 FOXA2 및 LMX1A를 동시발현하였다(도 3의 a 및 b). 일부 GABA 및 세로토닌(5-HT)-양성 뉴런이 관찰되었다(도 3의 c). DA 및 그 대사물인 DOPAC 및 HVA가 각각의 프로토콜을 이용하여 생성된 배양물에 존재하였지만, DA 레벨은 바닥 플레이트 배양물에서 대략 8배 더 높았다(도 3의 d 및 e). 중뇌 DA 뉴런은 강한 섬유 성장 및 시냅신, 도파민 트랜스포터(DAT) 및 G-단백질 커플링된 내측 정류 칼륨 채널(SNpc(substantia nigra pars compacta) DA 뉴런에서 발현되는 Kir3.2(GIRK2로도 불림))을 포함하는 중뇌 뉴런 마커의 강력한 발현을 나타내었다(도 3의 f, 도 11). SNpc DA 뉴런은 생체내에서 뇌에서 이들을 대부분의 다른 뉴런과 구분짓는 전기생리학적 표현형을 나타낸다. 특히, 이들은 느린(1-3 Hz) 속도로 자연스럽게 스파이크된다. 또한, 이러한 느린 스파이킹은 느린 역치이하 진동 포텐셜과 동반된다. 시험관내에서 2-3주 후, 이들 동일한 생리학적 특징들은 초기 출생후 마우스로부터 배양된 SNpc DA 뉴런에 의해 나타난다. hESC로부터 분화된 상기 DA 뉴런은 일관되게(4/4) 이러한 구별되는 생리적 표현형을 나타내었다(도 3a의 g 내지 i).
d65에 시험관내에서 mDA 뉴런을 유지하면 TH 양성 뉴런이 여전히 FoxA2를 발현하며, mDA 뉴런에 전형적인 긴 섬유를 연장한다는 것을 보여주었다. 도 3a. HPLC에 의해 측정된 DA 방출은 d65 일령의 TH+ 뉴런이 시험관내에서 기능적임을 보여주었다. 도 3b.
실시예 4.
손상된 뉴런을 포함하는 설치류, 즉 마우스 및 래트에서의 신규한 DA 뉴런 세포 모집단의 생착.
본 기술분야의 한 도전과제는 신경 과성장 또는 비-중뇌 뉴런으로의 부적절한 분화 또는 테라토마의 발생 위험없이 생체내에서 기능적으로 생착되는 hPSC 유래 중뇌 DA 뉴런을 생성하는 능력이다. 태아 조직 이식 연구에 기반하여, 본 발명자들은 NURR1의 발현에 의해 마크되는 세포 사이클 탈출의 시간이 그래프트를 위한 적합한 단계일 수 있다고 생각하였다(대략 분화 25일, 도 2). 비-병소성 성체 마우스에서 25일 세포를 이용한 초기 연구는 이식 후 6주에 hPSC 유래 FOXA1+/TH+ 뉴런의 강력한 생존을 보여주었다(도 12). 상기 목적을 위하여, 6-히드록시-도파민(6-OHDA) 병소(Tabar, et al. Nature Med. 14:379-381 (2008), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)를 드문 종양형성 세포의 노출에 대해 특히 민감하고 이종이식의 생존을 효율적으로 지지하는 스트레인인 NOD-SCID IL2Rgc 눌 마우스 내에 만들었다(Quintana, et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature 456:593-598 (2008), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 증식 가능성이 높은 세포로 오염될 가능성을 나타내기 위하여 바닥 플레이트 및 로제타 유래 DA 뉴런 배양을 미리 정제하지 않고 모두 그래프트하였다(150×103 세포/동물). 이식 후 4.5개월에 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런 그래프트는 FOXA2 및 인간 특이적 마커 hNCAM을 동시-발현하는 TH+ 세포로 이루어지는 잘-정의된 그래프트 코어를 보였다(도 4의 a 내지 c). 기능적 분석은 암페타민-유도성 회전 거동이 완전히 없어졌음을 보여주었다. 이와 대조적으로, 로제타 유래 뉴런 그래프트는 일부 TH+ 세포를 보여주었고, 회전 거동에서 현저한 감소를 보여주지 않았으며(도 4의 d), 거대한 신경 과성장을 보여주었다(이식 부피 > 20 ㎣; 도 13). 본 명세서에서 기재된 것과 같은 그래프트에 사용된 로제타 유래 뉴런 세포의 광범위한 과성장은 본 발명자 그룹(Kim, et al. miR-371-3 Expression Predicts Neural Differentiation Propensity in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 및 타인들(Hargus, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107:15921-15926 (2010), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)로부터 로제타 유래 DA 그래프트를 이용한 이전의 연구에 필적하였다. 상기 과성장은 더 긴 생존 기간(4.5개월 대 6주), 이식 전 FACS 정제의 부재 및 NOD-SCID IL2Rgc 눌 숙주의 선택으로 인한 것일 수 있다. 증식하는 Ki67+ 세포의 수는 바닥 플레이트 유래 그래프트에서 최소였지만(총 세포의 < 1%), 로제트 유래 그래프트는 증식하는 신경 전구체의 포켓을 보유하였다. 신경 과성장은 상기 그래프트 내 원시 전방 신경외배엽 세포에 의해 초래되는 것으로 생각된다(Elkabetz, et al. Genes Dev. 22:152-165 (2008); Aubry, et al. Proc. Natl Acad. Sci. U. SA 105:16707-16712 (2008), 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). 상기 가설은 전뇌 마커 FOXG1이 로제트 유래 그래프트에서는 발현되지만 바닥 플레이트 유래 그래프트에서는 발현되지 않음에 의해 지지되었다. 대부분의 GFAP+ 세포는 숙주 기원을 나타내는 인간 마커에 대해 음성이었지만, 작은 백분율의 성상교세포가 바닥 플레이트 및 로제트 유래 그래프트 모두에서 존재하였다(도 13).
본 명세서에 기재된 NOD-SCID IL2Rgc 눌 마우스에서의 결과는 강력한 장기간의 FOXA2+/TH+ 뉴런의 생존과, 암페타민-유도성 회전 거동의 완전한 되돌림과, 신경 과성장의 어떠한 징후도 없음을 보여주었다. 그러나, 상기 결과 중 일부는 NOD-SCID IL2Rgc 눌 마우스의 특별한 사용으로 인한 것일 수 있었다. 상기 가설을 테스트하기 위하여, 바닥 플레이트 유래 DA 뉴런 배양물(250×103 세포)을 시클로스포린 A를 이용하여 약리학적으로 면역억제된 성체 6-OHDA 병소성 래트에 이식하였다. 이식 5개월 후, FOXA2(도 4의 g) 및 인간 핵 항원(hNA)(도 4의 e)을 동시-발현하는 평균 15,000 TH+ 세포 이상으로 그래프트 생존율은 강력했다(도 4의 e 내지 h); TH+/hNCAM+ 섬유는 상기 그래프트 코어로부터 주위 숙주 줄무늬체로 뻗어나갔다(도 4의 f). FOXA2에 더하여, TH+ 세포는 중뇌 DA 뉴런 마커 PITX3 및 NURR1을 발현하였다(도 4의 h 내지 j). 거동 분석은 개선을 보이지 않았던 샴-이식된 동물과 대조적으로 암페타민-유도성 회전 불균형이 완전히 사라졌음을 보여주었다(도 4의 k). 또한, 그래프트된 동물은 DA 시스템의 약리학적 자극에 의존하지 않는 분석인 앞다리 운동불능을 측정하는 보행 테스트(도 4의 l) 및 실린더 테스트(도 4의 m)에서 개선을 보여주었다. 인간 DA 뉴런에 대해서는 회복의 개시가 늦을 것(대략 이식 후 3-4개월)이 예상되며, DAT 발현의 레벨(도 4의 n)과 같은 생체내 성숙 속도에 의존한다. Kir3.2 채널(GIRK2) 또는 칼빈딘을 발현하는 TH+ 세포의 존재는 SNpc(A9) 및 배쪽 피개 영역(A10) DA 뉴런 모두가 상기 그래프트 내에 존재함을 나타낸다(도 4의 o 및 p).
마우스에서와 같이(도 13), 래트 세포에서 숙주 유래 GFAP+ 교세포의 대부분(총 세포의 7%)인 세로토닌성 및 GABA성 세포는 드물었다(총 세포의 <1%)(도 14). 그래프트에서는 세로토닌+ 뉴런이 일부 검출되었지만, 숙주 유래 세로토닌성 섬유일 수 있는 hNCAM-음성 세포가 관찰되었다(도 14).
실시예 5.
손상된 뉴런을 포함하는 유인원에서의 신규한 DA 뉴런 세포 모집단의 생착.
본 명세서에 기재된 결과들은 2개의 독립적인 설치류 모델에서 뛰어난 그래프트 생존 및 거동 결과를 보여주었다. 그러나, 마우스 또는 래트 뇌에서 필요로 하는 DA 뉴런의 수는 유인원 및 원숭이에서 생착하기 위해 필요한 큰 수의 세포의 작은 일부를 나타낸다. 상기 프로토콜의 확장성을 테스트하기 위하여, 2마리의 성체 MPTP 병소성 레서스 원숭이에서 파일럿 그래프팅 연구를 수행하였다.
50×106 이식가능한 DA 뉴런 전구체의 배치를 상기 바닥 플레이트 기반의 프로토콜을 사용하여 분화 25일까지 얻었다. 파킨슨-유사 증상을 유도하기 위한 고전적인 용량은 목동맥 내로 주사된 3 ㎎ MPTP-HCL였다(범위 0.5-5 ㎎). 이 후 MPTP 0.2 ㎎/㎏의 MPTP를 정맥내로 전신 주사하였다. 세포는 뇌의 각각의 측(총 6 트랙, 1.25×106 세포/트랙)에서 3군데 위치에서 주사하였고(후방 미상핵 및 전교련 피각), 동물은 시클로스포린-A로 면역억제하였다. 뇌의 한 측은 H9의 GFP 발현 서브클론 유래의 DA 전구체로 주사하였고, 다른 측은 마킹되지 않은 H9 세포 유래의 세포로 생착하였다. 계속적으로 FOX2A를 발현하고 TH를 생산하는 레서스 원숭이에서 뉴런의 생착을 보여주는 결과는 도 4의 q 내지 t에 나타나 있다. 이식 1달 후, GFP(도 15) 및 인간 특이적 세포질 마커(SC-121)(도 4의 q)의 발현에 기초하여 중뇌 DA 뉴런의 강력한 생존이 관찰되었다. 각각의 그래프트 코어는 숙주 내로 3 ㎜까지 연장된 TH+ 섬유의 무리에 의해 둘러싸였다(도 4의 r). 상기 그래프트 코어는 SC-121(도 4의 s) 및 FOXA2(도 4의 t)를 동시-발현하는 TH+ 뉴런으로 이루어져 있었다. 상기 그래프트 내의 SC-121 및 GFP 음성 영역은 Iba1+ 숙주 미세아교세포를 함유하였는데(도 15), 이는 불완전한 면역억제를 나타낸다. 요약하면, 유인원, 즉 95% 이상이 심각하게 손실된 내인성 중뇌 DA 뉴런을 포함하는 성체 PMPTP(3 ㎎의 MPTP-HCL(1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘; 0.5-5 ㎎ MPTP-HCl의 농도 범위) 병소성 레서스 원숭이에서의 신규한 DA 뉴런 세포 모집단의 생착이 개시된다. MPTP 노출은 인간에서의 파킨슨 질환과 유사한 관찰가능한 변화 및 증상을 초래하였다.
실시예 6.
PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 세포 대 야생형 hES(또는 iPSC) 세포의 중뇌 DA 뉴런 운명을 향한 필적할만한 분화 잠재력.
본 실시예는 배아가 파괴되지 않게 되는 방식으로 얻어진 PD 환자의 세포주, 즉 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 세포가 본 발명의 FOXA2/LIM1XA/TH+ DA 뉴런을 얻기 위한 세포 모집단으로 사용될 때 PD 환자 뉴런의 특징을 갖는 중뇌 DA 뉴런의 많은 모집단이 발생되었다는 발견을 개시하고 있다.
PINK1 Q456X 돌연변이체 PD-iPSC 주는 본 발명의 신규한 바닥 플레이트 기반의 중뇌 DA 뉴런 프로토콜(방법)을 이용하여 분화되었으며, iPSC H9 주로부터 얻어진 것들에 필적하는 중뇌 분화 프로필을 생성하였다(도 20). A-C) 분화 11일(중뇌 전구체 단계)에 FOXA2(빨강색), LMX1A(녹색) 및 DAPI(파랑색)(A) 및 분화 25일(초기 유사분열후 DA 뉴런 단계)에 FOXA2(빨강색) 및 TH(녹색)(B) 및 NURR1(빨강색) 및 TH(녹색)(C)에 대한 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 주의 면역세포화학 분석. D-F) 분화 11일에 FOXA2(빨강색), LMX1A(녹색) 및 DAPI(파랑색)(D) 및 분화 25일에 FOXA2(빨강색) 및 TH(녹색)(E) 및 NURR1(빨강색) 및 TH(녹색)(F)에 대한 H9 유래 세포를 이용하여 수행된 동일한 세트의 면역세포화학 분석.
PINK1 돌연변이체 PD-iPSC는 시험관내에서 장기간의 분화 및 성숙 후 PD-유사 표현형의 단백질 응집을 보였다. 본 발명자들은 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC가 신규한 바닥 플레이트 기반의 중뇌 DA 뉴런 유도 프로토콜을 이용한 분화 55일에 TH+ DA 뉴런의 세포질에서 α-시누클레인(PD 환자에 대한 루이 바디의 주요 성분) 발현의 증거를 보여준다는 것을 발견하였다(도 21의 a 및 b). A, B) 분화 55일에 α-시누클레인(LB509, 빨강색), TH(녹색) 및 병합된 이미지(A) 및 α-시누클레인(빨강색) 및 유비퀴틴(녹색)(B)에 대한 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 주의 면역세포화학 분석. 또한, 상기 α-시누클레인 양성 세포는 높은 유비퀴틴(고전적인 루이 바디 마커) 발현을 보여주었다. 이와 대조적으로, 대조군인 iPS 주로부터 유래된 DA 뉴런은 정상 시냅스성(세포질성과 반대됨) α-시누클레인 발현과 매우 낮은 레벨의 유비퀴틴의 발현을 보여주었다(도 21의 c 및 d). C, D) 분화 55일에 α-시누클레인(빨강색), TH(녹색)(C) 및 α-시누클레인(빨강색) 및 유비퀴틴(녹색)(D)에 대한 대조군인 iPSC 주의 면역세포화학 분석.
응집된 형태의 α-시누클레인의 발현. PD 환자 뇌에서, 다이머화된 불용성 형태의 α-시누클레인이 루이 바디에서의 응집을 이끈다. 상기 다이머화된 형태의 α-시누클레인은 α-시누클레인 상의 세린 129의 인산화를 보여준다.
동일한 분화 일에 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 유래 세포는 매우 낮은 레벨의 발현을 보이는 대조군 iPSC 유래 세포와 비교하여 Ser129 인산화된 α-시누클레인에 대한 강한 발현을 보여주었다(도 22). PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 유래 세포는 매우 낮은 레벨의 발현을 보이는 대조군 iPSC 유래 세포와 비교하여 Ser129 인산화된 α-시누클레인에 대한 강한 발현을 보여주었다. A, B) 분화 55일에 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 유래 세포(A) 및 매치된 대조군 iPSC 유래 세포(B)에서 Ser129 인산화된 α-시누클레인(녹색) 및 DAPI(파랑색)에 대한 면역세포화학 분석.
α-시누클레인 발현 패턴에서의 차이는 분화 프로토콜 의존적으로 관찰된다. 본 발명자들은 바닥 플레이트 유래 "진정한" 중뇌 DA 뉴런은 PD 특이적 취약성과 대응하는 특이적인 시험관내 표현형을 보인다고 생각하였다. 고전적인 MS5 기질성 피더 기반의 분화 프로토콜(Perrier et al., PNAS 2004, 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)을 이용하여 얻은 DA 뉴런은 많은 수의 TH+ 뉴런을 생성하였다. 그러나, 본 발명의 발생 동안에 얻어진 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 MS5 기반의 TH+ 세포는 진정한 바닥 플레이트 유래 중뇌 DA 뉴런이 아니었음을 보였다. 상기 MS5 프로토콜을 통해 분화된 배양에서, 많은 α-시누클레인 양성 세포가 있었다. 그러나, 상기 세포들은 TH를 동시-발현하지 않았다. 또한, 상기 MS5 분화 전략을 사용할 때, PD-iPSC 및 대조군 iPSC 사이에 발현 패턴에서의 차이는 없었다(도 23의 a 및 b). 상기 데이터는 α-시누클레인은 다른 비-DA 세포 유형에서도 발현되며, 이러한 비-DA α-시누클레인은, 특히 표준 MS5 분화 프로토콜을 이용할 때, 질환 대 대조군 iPSC 유래 세포에서 변화되지 않음을 나타낸다. DA-유사 로제트 유래 뉴런이 문헌에 보고되어 있다(예컨대, Perrier PNAS 2004). 상기 MS5 기반의 TH+(=DA-유사) 세포를 도 3, 10, 13 및 16에서 비교용으로 사용한다. 상기 데이터는 α-시누클레인이 다른 비-DA 세포 유형에서도 발현되며, 이러한 비-DA α-시누클레인은, 특히 표준 MS5 분화 프로토콜을 이용할 때, 질환 대 대조군 iPSC 유래 세포에서 변화되지 않음을 나타낸다. 마지막으로, 본 명세서에 기재된 새로운 바닥 플레이트 기반의 분화 프로토콜은 α-시누클레인을 동시-발현하는 많은 수의 TH+ 세포를 생성하였다. 상기 TH+ 세포는 세포질 발현 패턴으로 α-시누클레인을 발현한다. 도 24. A, B) 60일에 MS5 기반의 분화(A) 및 대조군 iPSC(B)의 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 주의 α-시누클레인(LB509, 빨강색), TH(녹색)에 대한 면역세포화학 분석. C) 바닥 플레이트 기반의 분화 55일에 α-시누클레인(빨강색), TH(녹색)에 대한 PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 주의 면역조직화학 분석.
PINK1 돌연변이체 PD-iPSC 세포로부터 유래된 예시적인 DA 뉴런은 독성 자극에 대해 보다 취약하다. 바닥 플레이트 기반의 프로토콜을 통해 유래된 PD-iPSC 유래 TH+ DA 뉴런은 대조군 iPSC 유래 세포보다 독소 유발접종(발리노마이신: 미토콘드리아 이오노포어, 5 μM(1-10 μM의 농도 범위), 48시간)에 대해 보다 취약하였다. 이와 대조적으로, 고전적인 MS5 기반의 프로토콜을 통해 유래된 TH+ 뉴런은 PD 대 대조군 유래 세포 사이에 상이한 취약성을 보이지 않았다(도 24). A-F) 분화 60일에서의 대표적인 TH 면역세포화학: 바닥 플레이트 기반의 프로토콜을 통해 얻어진 PD 및 대조군 iPSC 유래 세포(A, PD-iPSC 유래 세포가 나타남) 모두에 대한 정상 조건(독소 처리 없음), 독소 처리 후 PD-iPSC에서 TH+ DA 뉴런이 거의 완전히 붕괴됨(B), 대조군-iPSC 유래 TH+ DA 뉴런이 부분적으로 붕괴됨(C). 또한, 발리노마이신 처리 48시간 후에 알라마르-블루를 이용한 전체 세포의 생존능 분석은 PD-iPSC 및 대조군 iPSC와 비교시 독소 유발접종에 대해 특정 용량 범위(5 및 10 μM)에서 상이한 세포 생존을 보였다(도 25).
PD 및 대조군 iPSC 유래 배양 모두의 정상 조건은 MS5 기반의 프로토콜(D, PD-iPSC 유래 세포가 나타남), PD-iPSC에서의 독소 유발접종 후의 TH+ 뉴런(E) 및 MS5 프로토콜을 통해 얻어진 대조군 iPSC 유래 배양(F)을 통해 얻었다. G-H) 분화 60일에 바닥 플레이트 기반의 프로토콜에 의한 Tuj1(빨강색) 및 TH(녹색)에 대한 면역세포화학의 저배율 이미지: 정상(G) 대 독소 유발접종(H) 조건의 PD-iPSC 및 정상(I) 대 독소 유발접종(J) 조건의 대조군 iPSC. K-N) 분화 60일에 MS5 기반의 프로토콜에 의한 Tuj1(빨강색) 및 TH(녹색)에 대한 면역세포화학의 저배율 이미지: 정상(K) 대 독소 유발접종(L) 조건의 PD-iPSC 및 정상(M) 대 독소 유발접종(N) 조건의 대조군 iPSC.
세포 생존능의 예시적인 정량화 - 독소 유발접종에 대한 용량 반응 분석. 발리노마이신 처리 48시간 후에 알라마르-블루를 이용한 세포의 생존능 분석은 PD-iPSC 및 대조군 iPSC와 비교시 독소 유발접종에 대해 특정 용량 범위(5 및 10 μM)에서 상이한 세포 생존을 보였다(바닥 플레이트 기반의 분화 60일). 주: 상기 분석은 전체 세포사를 테스트하며, 가장 극적인 효과는 구체적으로 DA 뉴런에서 관찰되었다(도 14 참조). 따라서, 알라마르 블루 기반의 정량화는 DA 뉴런 계통에서 관찰되는 상이한 효과의 정도를 과소평가하기 쉬울 것이다.
인용에 의해 본 명세서에 포함되는 참고문헌들: Li, et al. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005); Perrier, et al. Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004); Perrier, et al. Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004); Tabar, et al. Nature Med. 14, 379-381 (2008); Perrier, et al. Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004); Wernig, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 5856-5861 (2008); Lindvall, et al. J. Clin. Invest 120, 29-40 (2010); Roy, et al. Nature Med. 12, 1259-1268 (2006); Elkabetz, et al. Genes Dev. 22, 152-165 (2008); Kittappa, et al. PLoS. Biol. 5, e325 (2007); Ferri, et al. Development 134, 2761-2769 (2007); Roelink, et al. Cell 76, 761-775 (1994); Liem, et al. Cell 82, 969-979 (1995); Fasano, et al. Cell Stem Cell 6, 336-347 (2010); Chambers, et al. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009); Muroyama, et al. Genes Dev. 16, 548-553 (2002); Joksimovic et al. Nat Neurosci 12, 125-131 (2009); Lyashenko, et al. Nat. Cell Biol. 13, 753-761 (2011); VanDunk, et al. J. Neurosci. 31, 6457-6467 (2011); Huang, et al. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009); Costa, et al. Mol. Cell Biol. 9, 1415-1425 (1989); Elkabetz, et al. Genes Dev. 22, 152-165 (2008); Soldner, et al. Cell 136, 964-977 (2009); Guzman, et al. J. Neurosci. 29, 11011-11019 (2009); Nedergaard, et al. J. Physiol 466, 727-747 (1993); Ferrari, et al. Eur. J. Neurosci. 24, 1885-1896 (2006); Olanow, et al. Trends Neurosci. 19, 102-109 (1996); Zetterstrom, et al. Science 276, 248-250 (1997); Quintana, et al. nature 456, 593-598 (2008); Kim, et al. dicts Neural Differentiation Propensity in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 8, 695-706 (2011); Hargu, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 15921-15926 (2010); Aubry, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 16707-16712 (2008); Blume, et al., Exp. Neurol. 219, 208-211 (2009); Ban, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011); Studer, et al., Nature Neurosci. 1, 290-295 (1998); Kordower, et al., Science 290, 767-773 (2000); Paxinos, et al., The Rhesus Monkey Brain in Streotaxic Coordinates(Academic Press, 2000); Crawley, What's Wrong With My Mouse: Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice(Wiley-Liss, 2000); Studer, et al., Brain Res. Bull. 41, 143-150 (1996); Tabar, et al., Nat. Biotechnol. 23, 601-606 (2005); and Placantonakis, et al., Stem Cells 27, 521-532 (2009).
실시예 7.
급성 슬라이스 제조물에서 인간 다능성 줄기 세포 유래 DA 뉴런의 생체내 기록을 위한 예시적인 조건이 확립되었다; 도 26에 나타나 있는 예시적인 결과 참조.
즉, 생착된 영역의 생검으로부터 급성 슬라이스의 제조에 사용하기 위해 전기생리학적 측정이 고려된다. 한 구현예에서, A9 대 A10 유형의 그래프트 유래 DA 뉴런은 PD에서 가장 영향을 받는 A9 유형의 도파민 뉴런에 특이적인 자율적 보조조정 활성에 대한 테스트에 기반하여 생체내에서 확인될 것이다. 달리 말하면, A10 유형의 뉴런은 보조조정 활성을 갖지 않는다.
급성 슬라이스 제조물에서 인간 다능성 줄기 세포 유래 DA 뉴런의 생체내 기록을 위한 조건이 확립되었다, 도 26 참조. 구체적으로, 다능성 줄기 세포로부터 유래된 그래프트된 인간 DA 뉴런의 전기생리학적 특징에 대해 측정하였고, 마우스 SNpc(substantia nigra pars compacta)에서 보여지는 것들의 전형적인 전기생리학적 특징을 갖는 것으로 발견되었다. 도 26의 A는 이식된 영역 내의 보조조정 뉴런의 재구성을 보여주는 상면도이다. 아래는 hES 유래 뉴런이 9개월 전에 주사되었던 래트로부터 취한 예시적인 뇌 슬라이스의 현미경사진을 보여준다; 상기 그래프트는 윤곽이 나타나 있다; 고 배율 이미지는 아래에 삽도로 나타나 있다. 상기 슬라이스는 티로신 히드록실라아제로 처리하였으며, 위에 하얗게 나타나 있다. 도 26의 B. 또한, 상기 상면도는 상기 그래프트 내의 잠재적인 DA 뉴런으로부터 기록하는 예시적인 세포-부착 패치를 보여준다; 아래는 동일한 세포로부터 기록하는 예시적인 전체 세포를 보여준다. 기록은 시냅스 입력을 제거하기 위하여 글루타메이트 및 GABA 수용체 길항제(50 μM AP5, 10 μM CNQX 및 10 μM GABAzine)의 존재 하에 수행되었다. 상기 기록은 PS 유래의 뉴런은 보통의 내부체세포성 전압 궤적을 갖는 자율적 보조조정제임을 보여주었다. 그래프트 샘플 내에 기록된 다른 뉴런은 유사한 특성을 가졌다. 도 26의 C. 비교를 위하여, 성체 마우스의 SNpc 내의 도파민성 뉴런 유래의 세포-부착 및 전체 세포 기록이 나타나 있다. 약어(CTx=피질, STr=줄무늬체, SNpc=substantia nigra pars compacta, DA=도파민성). 상기 데이터는 그래프트된 래트 줄무늬체에서 이식 몇 개월 후의 생체내 기능 연구를 보여준다. 따라서, 일부 구현예에서, 그래프트된 조직에 대한 생체내 기능 연구는 SNpc(substantia nigra pars compacta)의 회복을 나타낸다.
실시예 8.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 세포 표면 마커를 확인하기 위한 예시적인 방법. 특히, 상기 방법을 이용하여 CD142가 확인되었다.
후보 표면 마커를 확인하기 위한 2가지 주된 전략: 중뇌 DA 뉴런에서 선택적으로 발현되고 A9-유형의 DA 뉴런(도 27의 b)을 특이적으로 마킹하는 것으로 보이는 DCSM1으로 명명된 마커를 포함하는 몇 가지 후보 마커를 발견한 유전적 리포터 주에서의 비편파적 유전자 발현 스크린(도 27의 a). 두 번째 전략은 hESC 유래 DA 뉴런에서 96 웰 포맷에서 242개의 상업적으로 입수가능한 항체에 대해 테스트한 CD 세포 표면 마커 스크린을 사용하는 것이다(도 27의 c 및 d). 이러한 스크린의 결과(도 27의 e), Nurr1+ DA 뉴런 단계를 선택적으로 마킹하는 마커인 CD142(도 27의 f)를 포함하는 중뇌 DA 뉴런에서 농축된 적어도 5개의 적합한 마커를 확인하게 되었다. 본 명세서에 기재된 DA 뉴런 세포 절차를 사용함으로써, CD142는 전형적으로 분화 25일에 대략 30%의 총 세포 모집단을 마크하였다(도 28의 a). Nurr1+ DA 뉴런 단계에 대한 CD142의 선택성은 복수의 독립적인 hESC 및 hiPCS 주에서 확인되었다(도 28의 b). DA 뉴런에 대해 농축하는 것에 더하여, CD142의 농축은 GABA 및 세로토닌성 뉴런과 같은 원하지 않는 뉴런 서브타입을 선택적으로 고갈시키게 된다(도 28의 c 내지 f). 생체내 연구는 CD142 양성 세포 모집단이 오염성 GABA 및 세로토닌성 뉴런의 문제를 극복하는 고순도의 DA 뉴런 그래프트가 생기게 하는 능력이 있음을 확인하였다. 정제되지 않은 세포를 사용하는 그래프팅 절차에서 이미 일부 세로토닌성 뉴런이 생성되었지만, CD142 기반의 전구체 세포 선별 방법을 사용하면 원하지 않는 태아 조직 그래프트 유도성 이상운동증의 잠재적인 근원으로서 실패한 인간 태아 조직 그래프팅에서의 오염성 세포 유형인 것으로 생각되는 세로토닌성 뉴런의 도입 위험을 추가로 감소시킬 것으로 생각된다.
실시예 9.
본 실시예는 PSA 세포 특이적 발현을 증가시키기 위한 인간 PST 유전자를 이용한 세포의 형질전환 방법을 개시한다. 또한, 본 실시예는 증가된 PSA 세포 표면 발현을 갖는 세포를 이용하는 예시적인 방법을 보여준다.
구체적으로, 본 실시예는 DA 뉴런 상에 PSA 발현을 증가시키기 위한 hESC 내로의 PST 유전자의 조작을 보여준다. 인간 폴리시알릴트랜스퍼라아제(hPST)를 암호화하는 유전자는 렌티바이러스 벡터(pLenty, Invitrogen)를 이용하여 hESC 주(WA01) 내로 도입되었다. 20개의 선별된 클론을 확장하였고, PST 발현에 대해 분석하였다. PST-발현 hESC 클론을 분화시켜 PST가 DA 뉴런에서 사일런스하지 않음을 확인하였다. 상이한 분화 단계(0, 11, 25 및 50일)에서 PSA-NCAM의 정량화를 FACS 분석 및 면역형광(Operetta)을 이용하여 수행하였다. 양성 클론을 표 7에 개략적으로 나타낸 DA 뉴런 QC 파라미터의 스위트를 거쳤다. 분화 동안에 높고 균일한 레벨의 PSA-NCAM을 유지하고 QC 파라미터에서 성능이 좋은(표 7) 적어도 3개의 클론은 PST-과발현 hESC 유래 DA 뉴런에서의 신경돌기 성장의 평가를 진행하였다. 선택된 대조군 및 PST-과발현 hESC 클론을 본 명세서에 기재된 표준 프로토콜을 이용하여 DA 뉴런으로 분화시킨 후, 25 및 50일에 세포 고정 및 분석을 수행하였다. 이러한 배양에서의 TH-양성 섬유의 수 및 길이를 오페레타 고 콘텐트 현미경을 이용하여 정량화하였다. 하모니 소프트웨어 3.0에서의 신경돌기 분석 모듈이 PST를 갖거나 갖지 않는 신경돌기의 수와 길이를 정량화하였으며, 상기 데이터를 이원 ANOVA를 이용하여 분석하였다. 상기 시험관내 연구로부터 진행된 PST-과발현 및 대조군 hESC 클론을 다시 DA 뉴런으로 분화시켰고, 래트의 PD 모델 내로 이식하였다. 생존을 결정하기 위한 단기간 그래프트(4-6주), PSA-NCAM 발현 및 신경돌기 성장을 수행하였다. 단기간의 생체내 파라미터를 통과한 각각의 클론에 대해 장기간 그래프팅 연구를 거쳤다. 상기 연구를 위하여, 동물들은 표준(200×103) 용량의 세포의 절반 또는 1/4을 받았다. 상기 연구는 증가된 PSA가 증가된 이식 후 장기간 생존(5개월)을 유도하는지 여부, 및 작은 수의 DA 뉴런이 표준 세포 용량에서 이식된 비-PST 그래프트의 기능적 용량을 일치 또는 과수행할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 것이었다(도 27).
아울러, 줄무늬체 신경분포의 정도에 민감한 복합 거동 분석을 모니터링하여 PST- 대 대조군 DA 뉴런 그래프트의 기능적 잠재력을 추가로 구별하였다. 거동 분석의 종료 후 상기 동물을 희생시켰고, 인간 특이적 항체인 NCAM 및 SC121 및 TH에 대한 항체를 이용하여 섬유 성장을 정량화하였다(도 29 참조). 상기 hNCAM+, SC121+ 및 TH+ 그래프트의 강도 및 퍼짐뿐만 아니라 DA 뉴런 마커(TH, FOXA2) 및 PSA를 동시-발현하는 인간 세포의 백분율을 측정하였다. 상기 그래프트로부터 나오는 신경돌기의 NCAM/TH+ 무리의 밀도를 상이한 거리에서 정량화하였다. 본페로니 사후 검증과 함께 이원 ANOVA를 이용하여 군들 간에 데이터를 비교하였다. 또한, 정성적 변화에 대해 절편들을 조사하였다(예컨대, 분지화, 두께, 이식 분포 및 형태). 아울러, 일부 그래프트는 A9 표현형, 숙주 줄무늬체와의 시냅스 형성뿐만 아니라 내인성 구심성의 관점에서 슬라이스 전기생리학적 평가에 대해 처리하였다.
실시예 10.
다음의 실시예는 파킨슨증 마우스에서 ES 유래 도파민 뉴런 그래프트의 기능을 개선하는 폴리시알산 발현의 향상을 보여준다.
*Nurr1 프로모터의 조절 하에 GFP를 발현하는 ES 세포(Nurr1::GFP ES 세포)는 폴리시알릴트랜스퍼라아제(PST)를 어디서나 발현하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 안정적으로 형질도입되었다. 형질도입된 세포는 대조군과 비교할 때 PST mRNA의 극적인 증가를 보여주었다(도 30의 A). PST의 발현은 NCAM에서 PSA를 합성하기에 충분한 것으로 관찰되었다. 따라서, PSA-NCAM 발현은 DA 뉴런 분화의 14일에 PST-변형된 세포에서 크게 증가되었다(도 30의 B 내지 E). ES 유래 DA 뉴런 상의 내인성 및 유도성 세포 표면 PSA는 모두 PSA의 독특한 알파-2,8-결합된 시알산 폴리머를 특이적으로 절단하는 파지 엔도뉴라미니다아제(endoN)에 의해 제거될 수 있었다(도 30의 E). 놀랍게도, PST 형질도입은 GFP 정제된 DA 뉴런에서 뉴런 또는 중뇌 마커의 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다(도 30의 F).
6OHDA 병소의 헤미파킨슨증 마우스에서의 다른 연구는 강력한 기능 회복을 생성하기 위해서는 암페타민-향상된 회전 테스트에서 측정된 것과 같이 대략 100,000 ES 유래 DA 뉴런 전구체의 이식을 필요로 함을 보여주었다. 본 연구에서, 향상된 PSA 발현으로 인한 증대를 평가할 수 있기 위한 차선의 세포 수를 구하였다. 오염성 다능성 세포가 고갈된 매우 농축된 DA 뉴런 모집단을 이식하기 위하여, 분화 14일에 FACS-정제된 배양물을 Nurr1-구동성 GFP의 발현 및 SSEA-1 발현의 부재에 대해 조사하였다(도 31). PST 과발현이 없는 경우, 최소한으로 효과적인 그래프트의 크기가 절반으로 감소되면(55,000 Nurr1+ DA 세포) 검출가능한 거동 회복을 생산하는데 실패하였다. 이와 대조적으로, PSA 발현이 향상되면, 동일한 수의 Nurr1/PST DA 뉴런이 PD 거동 손상을 현저하게 정정하게 되었고(p<0.01; 이원 ANOVA), 대략 수술 5주 후 완전히 회복되었다(도 32의 A). endoN 처리가 Nurr1/PST로 얻어진 기능적 복구를 부분적으로 되돌린다는 점에서, endoN을 이용한 인큐베이션에 의한 이식 전의 PSA 제거는 PSA 향상의 특이도를 나타내었다(도 32의 A).
그래프트된 세포의 특성을 조사하기 위하여, 동물을 이식 2개월 후 면역조직화학에 대해 처리하였다. PST-형질도입된 주로 그래프트된 동물은 대조군 세포로 그래프트된 동물보다 평균 2배 많은 GFP+ 세포를 가진다는 점에서(PST 대 대조군 샘플에서 각각 그래프트 당 9,300±1,400 대 4,230±1,010 GFP+ 세포; 도 32의 B, p<0.05, 스튜던트 테스트), 생존한 Nurr1+ 뉴런의 수에서 차이가 있었다. 또한, Nurr1/PST 그래프트는 또한 생체내에서 PSA 발현의 레벨이 더 높게 나타났다(도 32의 C 및 D). 그러나, 상기 그래프트 코어 내에서 중뇌 DA 마커 TH 및 FoxA2를 발현하는 세포의 비율은 상기 Nurr1 및 Nurr1/PST 세포에서 비슷하였다(각각 TH: 62.0%±8.0 대 51.3%±7.0, p=0.33; FoxA2: 63.2%±8.6 대 55.4%±2.0, p=0.3; 도 32의 E).
상기 Nurr1 및 Nurr1/PST 세포로부터 나오는 뉴런의 프로세스는 비슷한 레벨의 TH, Girk2(G-단백질-커플링된, 내측 정류 칼륨 채널) 및 시냅신을 보여주었다(도 33의 A). 이식된 슈반 세포를 이용한 다른 연구들과 달리(Ghosh, et al. Extensive cell migratio, axon regeneration, and improved cells after spinal cord injury. Glia 60, 979-992 (2012)), 향상된 PSA 발현은 그래프트된 부위로부터의 DA 세포의 이동에는 영향이 적었다. 그러나, 신경돌기 성장에서는 명확하게 변화되었다. 도 33의 B에 나타낸 바와 같이, Nurr1+ 대조군과 비교할 때 Nurr1/PST 세포로부터 더 많은 DA 뉴런 프로세스가 나왔다. GFP 및 TH 면역형광의 강도가 상기 이식물로부터 5번의 연속적인 100 ㎛ 구역 밖에서 정량화될 때, Nurr1/PST 그래프트는 훨씬 큰 상대적인 프로세스 밀도를 보였다(도 33의 C 및 D; GFP 및 TH 모두에 대해 p<0.01, 이원 ANOVA). 상기 효과를 정량화할 때, 그래프트 코어 가까이에 있는 가장 근접한 구역에서 관찰된 밀도에 대한 상대적인 프로세스 밀도로 정상화된다. 이러한 정상화는 상기 Nurr1/PST 그래프트 내의 많은 수의 생존 세포에 대해 상쇄하고, 신경돌기 성장에 대한 PSA의 특이적인 효과를 확인하기 위해 필요하다. 또한, 특이도는 그래프팅 전에 endoN 처리에 의해 세포 표면 PSA가 제거될 때 설명되었다. 따라서, endoN으로 전처리하면 먼 섬유의 성장을 대조군 레벨로 뒤로 감소시켰다(도 33의 E).
상기 발견은 그래프트 기능에 대한 PSA의 적어도 일부 효과는 줄무늬체의 향상된 섬유 신경분포로부터 나온다는 것을 보여주었다. 따라서, 그래프트 기능과 예컨대 구역 Ⅳ로의 GFP-양성 섬유의 성장의 상대적인 정도 사이에 강한 상관관계가 있었다(도 33의 F; p<0.001, r2=0.65, n=17). 놀랍게도, 상기 섬유의 성장/거동 상관관계는 실험군들(대조군, PSA 향상군 및 endoN 처리군)에 대해 일치하였는데, 이는 그래프트-숙주 신경분포가 마우스 파킨슨증 모델에서 거동 회복을 위한 파라미터임을 나타낸다. 상기 그래프트 코어를 캡슐화하는 활성형 신경교 구역의 향상된 투과, 증가된 스프라우팅 능력, 주위 숙주 조직 내로의 개선된 성장(예컨대, 용이한 성장 콘의 전좌) 및 상기 그래프트 코어에 인접한 숙주 조직과의 미성숙한 연결의 방지와 같은 몇 가지 인자가 증가된 섬유 성장에 기계론적으로 기여하였다. 예시적인 메커니즘은 정상 발생 동안 및 성체 신경계에서의 프로세스 성장을 촉진하는 PSA의 역할과 일치한다.
본 명세서에 기재된 실험은 DA 뉴런 그래프팅에서의 조작된 PSA의 용도를 나타내며, 다른 유형의 세포 유래의 그래프트와 비교할 때 뛰어난 결과를 제공하였다. 데이터는 PSA 향상이 그래프트된 DA 뉴런이 숙주 줄무늬체를 신경분포시키고 PD 기능의 결손을 약화시키는 능력을 현저하게 연장시킨다는 것을 명확하게 나타낸다. 따라서, 임상적으로 번역하게 되면 이식 전에 세포를 제공하기 위한 본 발명의 DA 뉴런을 포함하는 것으로 생각된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 PSA를 발현시키기 위하여 유전적으로 취급될 것이다. 일부 구현예에서, PST는 이식 전에 시험관내에서 정제된 효소 및 기질에 노출됨으로써 세포에 직접 운반될 것이다. 일부 구현예에서, PD 그래프팅에서 인간 번역을 위한 PSA 전략은 복수의 주사에 대한 필요성을 최소화하여 상기 복수의 주사로부터 나오는 외과적 위험성을 감소시키는 것이라고 생각된다.
다른 구현예에서, 상기 기술은 다른 세포 유형 및 종에 대해 사용하는 것, 예를 들면 척수 손상의 부위에 축삭을 재성장시키기 위해 브릿지(예를 들면, 세포-세포 소통)를 생성하는 그래프트된 슈반 세포의 이동을 연장하는 것이라고 생각된다.
다음은 본 실시예에서 사용되는 예시적인 물질 및 방법이다.
동물: 6주령의 129S3/SVImJ 마우스(Jackson Laboratory)를 먹이와 물을 자유롭게 주면서 조절된 온도 하에 유지하였다. NIH 및 연구소 동물 사용 지침에 따라 실험 절차를 수행하였고, 지역 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 IBC(Institutional Biosafety Committee)의 승인을 받았다.
6OHDA 주사 및 암페타민 유도 테스트: 동물을 나트륨 펜토바비탈(10 ㎎/㎏)로 마취시켰고, 2 ㎕의 6OHDA(생리식염수 내의 4 ㎍/㎕, 0.5% 아스코르브산)로 오른쪽 줄무늬체에 주사하였다. 상기 주사는 해밀턴 주사기로 다음의 좌표에서 수행하였다: 0.5 ㎜ 후방, 브레그마에 대해 1.8 ㎜ 상대적으로 측방 및 뇌 표면에 대해 2.5 ㎜ 배쪽. 수술 전에, 동물은 1회의 복강내 데시프라민(desipramine) 주사(25 ㎎/㎏, Sigma)를 맞았다. 수술 2주 후, 암페타민 유도성 회전 테스트에서 동물에 점수를 매겼다. 동물을 30 ㎝ 직경의 투명한 플라스틱 실린더에 30분 동안 위치시켰고, 여기서 동물에 1회의 복강내 암페타민 주사(10 ㎎/㎏, Sigma)를 맞았다. 20분 후, 다른 20분 동안 동측성/대측성 회전의 수를 점수매겼다. 동물을 7주 동안 주 1회 점수매긴 후, 깊게 마취시켰고, 심장을 통해 PBS 및 0.1 M 포스페이트 버퍼(PB, pH 7.4) 내의 4% 파라포름알데히드를 관류시켰다. 뇌를 제거하였고, 4% 파라포름알데히드 내에서 4℃에서 밤새 후고정시킨 후, 40 ㎛ 두께의 시상단면으로 비브라톰(Pelco-101, Ted Pella) 슬라이스하였다.
세포 분화 및 이식: Nurr1::GFP BAC 형질전환 BAC 마우스 ES 리포터 세포주(즉, GFP 발현이 Nurr1 프로모터에 의해 구동됨)를 CMV 프로모터의 조절 하에 마우스 PST 유전자를 함유하는 렌티바이러스(pLenti, Invitrogen)를 이용하여 형질도입하였다. ES 세포를 10% FBS(HyClone), 1,400 유닛/㎖ LIF(ESGRO; Invitrogen), 2 mM L-글루타민, 1 mM β-메르캅토에탄올, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(Invitrogen)으로 보충된 DMEM(Invitrogen) 내의 마이토신 C- 처리된 MEF(StemCell Technologies)에 대해 증식시켰다. DA 분화는 바베리 등(Barberi et al., Nat Biotechnol 21, 1200-1207 (2003))에 따라 이를 변형시켜 유도하였다. 간략하게, 세포를 젤라틴 코팅된 접시(10,000 세포/10 ㎝ 접시)에서 MS5 피더 세포에 대해 분화시켰고, 혈청 대체물 배지(SRM)에 대해 4일 동안 배양하였다. 4일에, 음파 헷지호그(SHH, 200 ng/㎖) 및 FGF8(100 ng/㎖)을 첨가하였다. 분화 7일에, 배지를 SHH, FGF8 및 bFGF(10 ng/㎖)로 보충된 N2로 교체하였다. 11일에, SHH, FGF8 및 bFGF를 제외하고 아스코르브산(AA, 200 μM) 및 BDNF(20 ng/㎖)를 첨가함으로써 최종 분화가 유도되었다.
14-15일에 45분 동안 어큐테이즈로 처리하여 세포를 수확하였고, N2로 1회 세척하였으며, AlexaFluor-647 접합된 항-SSEA-1 항체(BD Pharmingen)로 25분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 N2로 1회 세척하였고, 0.1% BSA를 갖는 HEPES 버퍼에 재현탁시켰다. DAPI를 첨가하여 생존능을 평가하였다. MoFlo 세포 분류기로 FACS를 수행하였고, 관심있는 모집단을 GFP 형광(Nurr1)에 대해 분류하였다. AlexaFluor-647(SSEA-1)에 대해 양성인 모집단을 음성적으로 분류하였다. GFP 음성 대조군의 경우, 나이브 J1 마우스 ES-세포를 동일한 분화 단계에서 사용하였다.
생존능에 대해 Nurr1::GFP 분류된 세포를 분석하였고, BDN 및 AA를 갖는 N2 내에 55,000 세포/㎕의 최종 농도로 재현탁시켰다. 50 ㎛ 팁의 미세한 유리 모세관을 이용하여 다음의 좌표에서 1 ㎕를 병소의 마우스 줄무늬체 내로 주사하였다: 0.3 ㎜ 후방, 브레그마로부터 1.5 ㎜ 측방 및 뇌 표면에 대해 2.2 ㎜ 배쪽. 추가적인 특성분석을 위하여 당량의 세포 현탁액을 마트리겔 코팅된 6 ㎜ 접시에 다시 플레이팅하였다.
면역형광 분석을 위하여, 세포를 4℃에서 10분 동안 파라포름알데히드로 고정하였고, PBS로 2회 세척하였으며, 5% BSA(PBS 내의 0.1% Triton X-100)로 블로킹하였고, 1차 항체로 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다: 토끼 항-GFP(1:1000, Invitrogen), 마우스 IgM 항-PSA(1:2000, 5A5), 마우스 항-NeuN(1:800, Chemicon) 마우스 항-TH(1:1000, Sigma), 염소 항-FoxA2(1:800, Santa Cruz), 염소 항-Engrailed(1:800, Santa Cruz). 이후, 세포를 Cy-접합된 2차 항체(1:1000, Jackson)로 인큐베이션하였다.
EndoN 처리: NCAM으로부터 PSA를 제거하기 위하여, 수확하기 전날 밤에 세포를 PSA 7-9를 특이적으로 제거하는 파지 효소인 20 유닛의 endoN으로 처리하였다. 이후, 세포를 수확하였고, BDNF 및 AA 및 5 유닛의 endoN을 갖는 N2 내에 재현탁한 것을 제외하고는 전술한 것과 같이 주사하였다. 본 발명자들은 미리 동일한 양의 endoN을 단독으로 병소의 마우스에 주사하는 것으로는 동물의 거동을 개선하지 못한다는 것을 평가하였다.
시험관내에서의 PST mRNA 및 PSA-NCAM 분석: 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 세포를 WB 버퍼(1% NP40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 추출 직전에 첨가된 1x 프로테아제/포스파타제 억제제를 갖는 PBS, pH 7.4)로 처리하였고, 5초 동안 2회 초음파 처리하였으며, 원심분리 및 래믈리 버퍼(LB) 내에 재현탁하였다. LB가 없는 당량을 단백질 결정을 위해 보관하였다. 동일한 양의 단백질을 6% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 겔(BioRad) 내에 로딩하였다. 전기영동에 의해 단백질을 폴리비닐리덴 막(Millipore)으로 전달하였다. 상기 막을 5% 탈지 건조 우유를 갖는 0.1% Triton X-100 TBS(TBS-T) 내에서 1-6시간 동안 블록시켰고, 5% 우유를 갖는 TBS-T 내에서 항-NCAM 항체(1:10,000, Santa Cruz)로 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 블롯을 퍼옥시다아제-접합된 2차 항체(1:10,000, Jackson)로 인큐베이션하였고, ECL 검출 방법으로 검출하였다(Amersham Pharmacia Biotech). ImageJ 소프트웨어를 이용하여 단백질 레벨을 정량화하였다.
qRT-PCR 분석을 위하여, Trizol(Sigma)을 이용하여 총 RNA를 추출하였고, 역전사하였으며(Qiagen), 최종 부피 20 ㎕의 10 ㎕의 2×SYBR 반응 혼합물 및 0.2 μM의 정방향 및 역방향 프라이머로 증폭시켰다. PSA-NCAM FACS 분석을 위하여, 어큐테이즈로 45분 동안 처리하여 세포를 수확하였고, 1회 세척하였으며, 마우스 IgM 항-PSA(1:250, 5A5)로 얼음 위에서 25분 동안 인큐베이션하였고, N2 배지로 1회 세척하였으며, Cy3-접합된 항-마우스-IgM(1:250, Jackson)으로 얼음 위에서 다시 25분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 N2로 1회 세척하였고, 7AAD를 갖는 0.1% BSA로 재현탁하였으며, FACS Calibur 세포 분류기로 분석하였다. 대조군으로서, 1차 항체를 넣지 않았다.
면역조직학적 및 입체학적 절차: 실온에서 30분 동안 PBS 내의 0.1% Triton X-100, 5% 당나귀 혈청 내에서 자유 부유 관상 절편을 블로킹하였고, 상이한 항체로 4℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다: 토끼 항-GFP(1:300), 닭 항-GFP(1:200, Chemicon), 마우스 항-TH(1:200), 마우스 IgM 항-PSA(1:1000), 마우스 항-NeuN(1:400), 염소 항-FoxA2(1:300), 토끼 항-Girk2(1:300, Allomone Labs), 마우스 항-시냅신(1:200, BD Transduction Laboratories). 이후, 절편들을 세척하였고, 2차 항체로 인큐베이션하였다: Cy2, Cy3 및 Cy5-접합된 당나귀 항체(1:400, Jackson). PSA의 경우, Cy5-접합된 당나귀 항-IgM을 사용하였다(1:500, Jackson). 실온에서 2시간 동안 인큐베이션을 수행하였다. 절편들을 PBS로 2회 세척하였고, Mowiol(Calbiochem) 내에 마운트하였다. 각각의 면역표지에 대해 뇌의 관상 절편의 3개 중 하나를 분석하였다. c-Apochromat 40x 대물렌즈(water-immersion)가 장착되고 3개의 레이저(Argon 488, HeNe 543 및 HeNe 633)를 갖는 Zeiss LSM 510 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 의해 디지털 이미지를 수집하였다. 40x 대물렌즈 내에서 전체 뇌를 아우르는 3개 중 하나 절편 내의 GFP+ 및 TH+ 세포의 수를 카운트하였고, 세포의 총 수/그래프트를 추정하였다. 전체 z-축을 통해 단일 광학 판 내에서 이중-표지된 세포를 분석하였다.
GFP/TH+ 및 GFP/FoxA2+ 표지된 세포의 백분율의 분석을 위하여, 각각의 마커에 대해 100개의 GFP+ 세포를 분석하였다. 프로세스 성장 분석을 위하여, 40x 대물렌즈 하에 1 ㎛의 핀홀로 전체 z-축(20-40 ㎛)에 걸쳐서 0.8 ㎛ 간격으로 공초점 z-스캔을 수행하였다. 프로세스가 관찰되지 않을 때까지 주사 부위로부터 측면으로 절편들을 스캔하였다. 스캔된 전체 영역을 아우르는 3-D 프로젝션을 순차적으로 일치시켰다. GFP 및 TH 강도 분석을 위하여, 스캔된 전체 영역을 이식물로부터 나오는 5개의 연속적인 100 ㎛ 구역으로 나누고, ImageJ 소프트웨어를 이용하여 강도를 측정하였다. 그래프트 크기에서의 임의의 잠재적인 차이를 위하여 대조군에 대해 그래프트(구역 I)에 가장 가까운 구역 내의 강도에 대해 데이터를 정상화하였다.
통계적 분석: 데이터는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 나타낸다. 스튜던트 t 테스트 또는 이원 ANOVA(analysis of variance)와 이후의 본페로니 사후 검증을 이용하여 비교를 수행하였다. 선형 회귀 분석을 수행하였고, 피어슨 상관관계를 이용하여 정량화하였다.
실시예 11.
다음의 실시예는 이식 효능을 향상시키기 위하여 정제된 박테리아 폴리시알릴트랜스퍼라아제인 PSTnm를 이용하여 hESC 유래 DA 뉴런에 대한 효소적으로 조작된 PSA를 보여준다.
효과적이기는 하지만, PST 유전자 전달감염은 폴리시알릴화 동안에 걸쳐서 제한된 조절로 hESC의 유전자 변형을 필요로 한다. 상기 실시예는 유전자 운반 대신에 외부 PSTnm 유도성 PSA를 발견한 것을 개시한다(도 35 참조). 도 35의 A에서, PST 처리된 슈반 세포(SC)(초록선-가운데선)은 증가된 부착 시간을 가졌지만, PSTnm-제조된 PSA는 부착을 억제하였다. 특히, (A) PSTnm-제조된 PSA는 현탁액 내에서 강요된 PST 발현에 의해 제조된 PSA(초록선-가운데선)보다 훨씬 더 효과적으로 슈반 세포가 슈반 세포 단일층으로 부착하는 것을 억제하였다(빨강선-가장아래선). (B) ESC 유래 HB9 운동뉴런에서의 PSA 면역블롯은 PSTnm이 단독으로 처리된 대조군 샘플은 PSA 레벨이 검출가능하지 않았음을 보여준다. PSTnm + CMP-시알산 기질로 인큐베이션하면 많은 PSA 밴드를 생성하고, 이것은 endoN 처리에 의해 제거된다. (C, D) 상기 PST 유전자로 얻은 효과와 유사하게, 분화 동안에 PSTnm 및 기질에 의한 상기 세포의 폴리시알릴화는 신경돌기 성장 및 세포의 이동을 향상시킨다(화살촉). (E) 30일 hESC 유래 DA 뉴런의 PSA 면역염색. (F) 상기 염색은 PSTnm 및 기질의 처리 후 현저하게 증가된다. (G) PSTnm을 단독으로 생체내 주사하는 것은 효과가 없지만, 그 기질과 동시 투여하면 마우스 줄무늬체 내에서 많은 양의 PSA 발현을 생성한다(H).
따라서, PSTnm으로 외부적으로 처리된 성숙한 DA 뉴런은 생착을 위한 세포의 제조에 사용하는 것이 고려된다. 포유류 PST 및 PSTnm 모두 화학적으로 동일한 PSA 사슬을 생성하였다. hESC 유래 DA 뉴런에 대한 증가된 PSA(도 35의 F)는 DA 섬유가 그래프트 코어를 벗어나기에 충분한 수 주 동안 지속되어야 한다. PSTnm은 그래프팅 전에 제거되기 때문에, 상기 그래프트된 세포를 오염시키는 상기 효소의 면역원성은 인자가 되지 않는다.
PSTnm은 향상된 용해도와 활성 특성을 갖는 조작된 단편으로부터 제조되었다(Willis et al., "Characterization of the alpha-2,8-polysialyltransferase from Neisseria meningitidis with synthetic acceptors, and the development of a self-priming polysialyltransferase fusion enzyme". Glycobiology 18, 177-186 (2008)). PSTnm 노출 전, 기질에 노출 전, 또는 이들 모두 전에 hESC의 배양물을 DA 뉴런으로 분화하도록 유도하였다. 상이한 노출 시점(10분 내지 6시간)에 정량적 면역형광(Operetta) 및 웨스턴 블롯에 의해 배양물을 조사하여 폴리시알릴화의 속도 및 레벨을 결정하였다. 따라서, 25일 분화된 hESC 유래 DA 뉴런은 본 명세서에 기재된 조건을 이용함으로써 최적 농도의 PSTnm 및 기질로 인큐베이션될 것이다. PSA+ mDA 뉴런은 본 명세서 및 도 29에 기재된 것과 같은 단기간 및 장기간 분석에서 이식될 것이다.
상기에 언급된 모든 공개문헌 및 특허들은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경은 본 발명의 범위 및 사상을 이탈하지 않으면서 본 기술분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 구현예와 관련되어 개시되었지만, 청구된 본 발명은 이러한 특정 구현예에 과도하게 한정되어서는 안된다는 점이 이해되어야 한다. 실제로, 세포생물학, 신경생물학, 암세포 생물학, 분자생물학, 생화학, 화학, 유기 합성 또는 관련 분야의 숙련자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위해 개시된 방법에 대한 다양한 변형들은 첨부된 청구항의 범위 내인 것으로 의도된다.

Claims (37)

  1. FOXA2(forkhead box protein A2) 및 LMX1A(LIM homeobox transcription factor 1 alpha) 모두를 발현하는 세포를 포함하는 제2 세포 집단으로부터 유래되는 시험관내 분화된 중뇌 도파민 뉴런의 제1 세포 집단으로서,
    상기 제2 세포 집단은 다능성 줄기 세포를 SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic) 신호전달의 적어도 하나의 억제제에 노출시키는 단계, 및 상기 세포를 SHH(Sonic hedgehog) 신호전달의 적어도 하나의 활성화제 및 Wnt(wingless) 신호전달을 활성화시키는 GSK3β(glycogen synthase kinase 3β) 신호전달의 적어도 하나의 억제제에 노출시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되고,
    상기 SHH 신호전달의 적어도 하나의 활성화제는 SHH 단백질, SAG(Smoothened agonist), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 세포는 세포가 상기 SMAD 신호전달의 적어도 하나의 억제제에 처음 노출된 후로부터 3일에 상기 GSK3β 신호전달의 적어도 하나의 억제제에 노출되는 세포 집단.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포는 세포가 상기 SMAD 신호전달의 적어도 하나의 억제제에 처음 노출된 후로부터 3일 내지 11일에 상기 GSK3β 신호전달의 적어도 하나의 억제제에 노출되는 세포 집단.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 FOXA2 및 LMX1A를 발현하는 세포는 중뇌 바닥 플레이트(floor plate) 전구체인 세포 집단.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 세포 집단은 FOXA2 및 LMX1A를 발현하는 세포를 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 70% 포함하는 세포 집단.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 세포 집단의 40% 이상이 티로신 히드록실라아제(TH)를 발현하는 세포 집단.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 중뇌 도파민 뉴런은 FOXA2, LIM 호메오박스 전사 인자 1, 도파민, 3,4-디히드록시-페닐아세트산(DOPAC), 호모바니린산(HVA), 티로신 히드록실라아제(TH), 핵 수용체 관련 1 단백질(NURR1), 뉴런-특이적 클래스 Ⅲ 베타-튜불린(Tuj1), 트레포일 인자 패밀리 3(TTF3), 페어드-유사 호메오도메인 3(PITX3), 아카에트-스쿠트 복합체(ASCL), 초기 B-세포 인자 1(EBF-1), 초기 B-세포 인자 3(EBF-3), 트랜스타이레틴(TTR), 시냅신, 도파민 전달체(DAT), G-단백질 커플링된 내측 정류 칼륨 채널(Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63, 및 CD99로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커를 발현하는 세포 집단.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 SMAD 신호전달의 적어도 하나의 억제제는 LDN-193189, SB431542, 노긴(Noggin), 도르소모르핀(Dorsomorphin), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 집단.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 SMAD 신호전달의 적어도 하나의 억제제는 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 적어도 하나의 억제제 및 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 적어도 하나의 억제제를 포함하는 세포 집단.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 적어도 하나의 억제제는 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542)를 포함하는 세포 집단.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 BMP 신호전달의 적어도 하나의 억제제는 LDN-193189를 포함하는 세포 집단.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 SHH 단백질은 재조합 SHH를 포함하는 세포 집단.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 재조합 SHH는 SHH C25II를 포함하는 세포 집단.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 SAG는 푸르모르파민을 포함하는 세포 집단.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 GSK3β 신호전달의 적어도 하나의 억제제는 CHIR99021, Wnt3A, Wnt1, 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 집단.
  15. 청구항 1에 있어서,
    상기 GSK3β 신호전달의 억제제는 CHIR99021을 포함하는 세포 집단.
  16. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 세포 집단은 PAX6, EMX2, 및 LHX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커를 발현하는 세포를 10% 이하로 포함하는 세포 집단.
  17. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 세포 집단은 PAX6을 발현하는 세포를 10% 이하로 포함하는 세포 집단.
  18. 청구항 1에 있어서,
    상기 다능성 줄기 세포는 세포가 상기 SMAD 신호전달의 적어도 하나의 억제제에 처음 노출된 후로부터 11일 내에 상기 FOXA2 및 LMX1A를 발현하는 세포로 분화되는 세포 집단.
  19. 청구항 1에 있어서,
    상기 SHH 신호전달의 적어도 하나의 활성화제에 대한 상기 세포의 처음 노출은 세포가 상기 SMAD 신호전달의 적어도 하나의 억제제에 처음 노출된 후로부터 24시간 및 36시간 사이에 일어나는 세포 집단.
  20. 청구항 1에 있어서,
    상기 SHH 신호전달의 적어도 하나의 활성화제에 대한 상기 세포의 노출은 144시간까지 일어나는 세포 집단.
  21. 청구항 1에 있어서,
    상기 GSK3β 신호전달의 적어도 하나의 억제제에 대한 상기 세포의 처음 노출은 세포가 상기 SHH 신호전달의 적어도 하나의 활성화제에 처음 노출된 후로부터 24시간 및 36시간 사이에 일어나는 세포 집단.
  22. 청구항 1에 있어서,
    상기 방법은 상기 세포를 섬유아세포 성장 인자(FGF) 패밀리 신호전달의 적어도 하나의 활성화제에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 세포 집단.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 FGF 패밀리 신호전달의 적어도 하나의 활성화제는 FGF8을 포함하는 세포 집단.
  24. 청구항 22에 있어서,
    상기 FGF 패밀리 신호전달의 적어도 하나의 활성화제에 대한 상기 세포의 처음 노출은 세포가 상기 SMAD 신호전달의 적어도 하나의 억제제에 처음 노출된 후로부터 24시간 및 36시간 사이에 일어나는 세포 집단.
  25. 청구항 22에 있어서,
    상기 FGF 패밀리 신호전달의 적어도 하나의 활성화제에 대한 상기 세포의 노출은 144시간까지 일어나는 세포 집단.
  26. 청구항 1에 있어서,
    상기 다능성 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 및 조작된(engineered) 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 집단.
  27. 청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항의 세포 집단을 포함하는 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 조성물은 적어도 1×109 세포를 포함하는 조성물.
  29. 중뇌 도파민 뉴런 기능의 감소를 특징으로 하는 신경학적 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 징후를 치료하는데 사용하기 위한 청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항의 세포 집단.
  30. 청구항 29에 있어서,
    상기 신경학적 장애는 파킨슨 질환 또는 파킨슨 플러스 증후군인 세포 집단.
  31. 청구항 29에 있어서,
    상기 신경학적 장애에 대한 징후는 경련, 운동완만증, 굽은 자세, 자세 불안정, 경직, 연하곤란, 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 집단.
  32. 생체내 생착에 사용하기 위한 청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항의 세포 집단.
  33. 청구항 32에 있어서,
    상기 생체내 생착은 뉴런 기능의 회복을 위한 것인 세포 집단.
  34. 중뇌 도파민 뉴런 기능의 감소를 특징으로 하는 신경학적 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 징후를 치료하는데 사용하기 위한 청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항의 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물로서,
    상기 신경학적 장애는 파킨슨 질환 또는 파킨슨 플러스 증후군인 약학적 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서,
    상기 신경학적 장애에 대한 징후는 경련, 운동완만증, 굽은 자세, 자세 불안정, 경직, 연하곤란, 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  36. 생체내 생착에 사용하기 위한 청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항의 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물.
  37. 청구항 36에 있어서,
    상기 생체내 생착은 뉴런 기능의 회복을 위한 것인 약학적 조성물.
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