CN105121633B - 一种建立神经上皮干细胞的培养基、方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

提供一种建立神经上皮干细胞的培养基、方法及其应用。所述培养基包括用于将多能干细胞诱导分化为初级神经上皮干细胞的分化培养基及用于使初级神经上皮干细胞扩增的扩增培养基。

Description

一种建立神经上皮干细胞的培养基、方法及其应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域,具体而言,涉及一种建立神经上皮干细胞的培养基、方法及其应用。
背景技术
神经性疾病是危险人类健康的重大疾病,这些疾病大多数是由于神经细胞发生了不可替代的损失而所致,传统的治疗方法很难进行治疗,而神经干细胞的修复再生为治愈这些疾病提供了可能。
神经干细胞在脑部的发育过程中主要经过两个不同的发育阶段,即神经上皮干细胞(neuroepithelial stem cells)、放射胶质前体细胞(radial glial progenitorcells)。神经上皮干细胞是最早期的神经干细胞,具有更强的分化多能性,能分化发育为整个脑部细胞。而且神经上皮干细胞具有很强的增值能力,产生高纯度的神经元,具有重要的科学和临床应用价值。
但是,在相关技术中,传统的神经干细胞培养方法主要采用生长因子bFGF和EGF组合而成,这种培养体系只能培养发育后期的神经前体细胞(放射胶质前体细胞),而不能长期稳定培养神经上皮干细胞,并且培养的放射胶质前体细胞随着培养时间的延长,细胞特性以及分化的多能性产生显著的变化,失去神经细胞的分化能力,因此不能进行干细胞的规模化生产,限制了其临床干细胞替代治疗、疾病机制以及药物筛选中的应用。
综上,通过体外培养建立一种能够稳定传代的神经上皮干细胞是本领域亟待解决的一个技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种建立神经上皮干细胞的培养基、方法及其应用,以解决上述的问题。
在本发明的实施例中提供了一种建立神经上皮干细胞的培养基,包括;
用于将多能干细胞诱导分化为初级神经上皮干细胞的分化培养基以及用于使所述初级神经上皮干细胞扩增的扩增培养基;所述分化培养基包括:Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、bFGF、Wnt信号通路的激动剂(GSK3的抑制剂)、TGF-β信号通路的抑制剂、Notch信号通路抑制剂、ALK2以及ALK3信号通路的抑制剂;所述扩增培养基包括:Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、bFGF、Wnt信号通路的激动剂(GSK3抑制剂)、TGF-β信号通路的抑制剂和白血病抑制因子。
本发明提供的这种建立神经上皮干细胞的培养基,包括分化培养基和扩增培养基,分化培养基中含有多种可供多能干细胞分化为初级神经上皮干细胞所需的营养成分;其中,bFGF可以促进神经干细胞的早期分化和增殖,Wnt信号通路的激活(通过Wnt信号通路的激动剂)有利于神经干细胞的增殖,抑制TGF-β信号通路促进多能干细胞往神经细胞的定向分化,Notch信号通路的抑制能够快速的促进多能干细胞往神经细胞以及神经干细胞往神经元的定向分化,ALK2和ALK3信号通路的抑制将抑制BMP4信号通路,促进多能干细胞往神经细胞以及神经干细胞往神经元的定向分化。
因此,通过含有上述组成的分化培养基即可使得多能干细胞分化成为初级神经上皮干细胞;然而初级神经上皮干细胞虽然具备神经上皮干细胞的机能,但是其在传统的培养条件下,仍然不能长期稳定的扩增,因此,其再通过扩增培养基进行长期稳定培养,其中,扩增培养基中所含的bFGF、Wnt信号通路的激动剂(GSK3抑制剂)、TGF-β信号通路的抑制剂均具备使初级神经上皮干细胞保持其特性并稳定扩增的功能;此外,白血病抑制因子具有调节细胞增殖和分化的功能。通过扩增培养基即可将初级神经上皮干细胞培养成稳定扩增和存活的,以及能够规模化生产的神经上皮干细胞。
可选的,在所述分化培养基中,所述Wnt信号通路的激动剂和GSK3的抑制剂均为CHIR99021;所述TGF-β信号通路的抑制剂为SB431542;所述Notch信号通路抑制剂为Compound E;所述ALK2以及ALK3信号通路的抑制剂为LDN193189;
和/或在所述扩增培养基中,所述Wnt信号通路的激动剂和所述GSK3抑制剂均为CHIR99021;所述TGF-β信号通路的抑制剂为SB431542。
可选的,在所述分化培养基中,所述bFGF的浓度为3-100ng/ml;所述CHIR99021的浓度为0.3-30μM/l,所述SB431542的浓度为2-50μM/l;所述Compound E的浓度为0.05-10μM/l;所述LDN193189的浓度为0.1-10μM/l;
和/或在所述扩增培养基中,所述bFGF的浓度为3-100ng/ml,所述CHIR99021的浓度为0.3-30μM/l;所述SB431542的浓度为5-50μM/l;所述白血病抑制因子的浓度为50-5000U/L。
本发明还提供了一种利用上述培养基获得神经上皮干细胞的方法,包括以下步骤:
将多能干细胞经过胶原酶消化成细胞团块;
将所述细胞团块悬浮在所述分化培养基中并进行悬浮培养,使其分化为初级神经上皮干细胞;
将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养,获得能够稳定传代的神经上皮干细胞。
可选的,在所述步骤将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养,获得能够稳定传代的神经上皮干细胞之后,还包括:
将所述神经上皮干细胞进行稀释,得到单个神经上皮干细胞;
将所述单个神经上皮干细胞利用所述扩增培养基培养14-15天,得到该单个神经上皮干细胞自我组装成的神经管。
可选的,在所述步骤将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养,获得能够稳定传代的神经上皮干细胞之后,还包括:将所述神经上皮干细胞在含有Neurobasal培养基、B27、非必需氨基酸以及谷氨酰胺的神经元分化培养基上培养并使其分化,得到纯度为40%-100%的神经元。
可选的,在所述将多能干细胞经过胶原酶消化成细胞团块的步骤中:所述消化时间为5-40分钟。
可选的,在所述将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养,获得能够稳定传代的神经上皮干细胞的步骤之后,还包括:将所述神经上皮干细胞利用0.05%的胰酶进行消化传代,获得稳定的神经上皮干细胞系。
一种根据上述方法建立的神经上皮干细胞以及利用该神经上皮细胞培养产生的细胞系。
一种根据权上述神经上皮干细胞以及利用该神经上皮细胞培养产生的细胞系在细胞替代治疗、疾病机制以及药物筛选中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例2的多能干细胞定向诱导分化为神经上皮干细胞的示意图;
图2为本发明实施例2的神经上皮干细胞培养经过长期规模化培养,并保持干细胞自我组装为神经管的结构以及产生高纯度的神经元的示意图;
图3为本发明实施例2的单个的神经上皮干细胞自我组装为神经管结构示意图;
图4为本发明实施例2的神经上皮干细胞自我组装为神经管结构以及转化为放射胶质前体细胞机制的示意图;
图5为本发明实施例2中利用单个的神经上皮干细胞模拟人的神经管疾病,分化为大脑皮层神经细胞以及进行神经替代治疗的示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,基于本发明中的具体实施方式,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式,都属于本发明所保护的范围。
实施例一
本实施例提供一种建立神经上皮干细胞的培养基,包括:用于将多能干细胞诱导分化为初级神经上皮干细胞的分化培养基以及用于使所述初级神经上皮干细胞扩增的扩增培养基;
所述分化培养基包括:Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、bFGF、Wnt信号通路的激动剂、GSK3的抑制剂、TGF-β信号通路的抑制剂、Notch信号通路抑制剂、ALK2以及ALK3信号通路的抑制剂;所述扩增培养基包括:Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、bFGF、Wnt信号通路的激动剂、GSK3抑制剂、TGF-β信号通路的抑制剂和白血病抑制因子。
本发明提供的这种建立神经上皮干细胞的培养基,包括分化培养基和扩增培养基,分化培养基中含有多种可供多能干细胞分化为初级神经上皮干细胞所需的营养成分;其中,bFGF可以促进神经干细胞的早期分化和增殖,Wnt信号通路的激活(通过Wnt信号通路的激动剂)有利于神经干细胞的增殖,抑制TGF-β信号通路促进多能干细胞往神经细胞的定向分化,Notch信号通路的抑制能够快速的促进多能干细胞往神经细胞以及神经干细胞往神经元的定向分化,ALK2和ALK3信号通路的抑制将抑制BMP4信号通路,促进多能干细胞往神经细胞以及神经干细胞往神经元的定向分化。
因此,通过含有上述组成的分化培养基即可使得多能干细胞分化成为初级神经上皮干细胞;然而初级神经上皮干细胞虽然具备神经上皮干细胞的机能,但是其在传统的培养条件下,仍然不能长期稳定的扩增,因此,其再通过扩增培养基进行长期稳定培养,其中,扩增培养基中所含的bFGF、Wnt信号通路的激动剂(GSK3抑制剂)、TGF-β信号通路的抑制剂均具备使初级神经上皮干细胞保持其特性并稳定扩增的功能;此外,白血病抑制因子具有调节细胞增殖和分化的功能。通过扩增培养基即可将初级神经上皮干细胞培养成稳定扩增和存活的,以及能够规模化生产的神经上皮干细胞。
更优选的,在本实施例的分化培养基中,所述Wnt信号通路的激动剂和GSK3的抑制剂均为CHIR99021;所述TGF-β信号通路的抑制剂为SB431542;所述Notch信号通路抑制剂为Compound E;所述ALK2以及ALK3信号通路的抑制剂为LDN193189;
在扩增培养基中,所述Wnt信号通路的激动剂和所述GSK3抑制剂均为CHIR99021;所述TGF-β信号通路的抑制剂为SB431542。
更具体的,在所述分化培养基中,所述bFGF的浓度为3-100ng/ml;所述CHIR99021的浓度为0.3-30μM/l,所述SB431542的浓度为2-50μM/l;所述Compound E的浓度为0.55-10μM/l;所述LDN193189的浓度为0.1-10μM/l;在所述扩增培养基中,所述bFGF的浓度为3-100ng/ml,所述CHIR99021的浓度为0.3-30μM/l;所述SB431542的浓度为5-50μM/l;所述白血病抑制因子的浓度为50-5000U/l。
以下为本实施例的分化培养基和扩增培养基的具体实例,对于分化培养基:
实例1:Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、3ng/mlbFGF、0.3μM/lCHIR99021、2μM/lSB431542、0.05μM/l Compound E和0.1μM/l LDN193189;
实例2:Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、100ng/mlbFGF、30μM/lCHIR99021、50μM/l SB431542、10μM/l Compound E和10μM/l LDN193189;
实例3:Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、10ng/mlbFGF、3μM/lCHIR99021、5μM/l SB431542、0.2μM/l Compound E和0.1μM/l LDN193189。
对于扩增培养基:
实例1:Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、3ng/mlbFGF、0.3μM/lCHIR99021、5μM/l SB431542和50U/L白血病抑制因子;
实例2:Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、100ng/mlbFGF、30μM/lCHIR99021、50μM/l SB431542和5000U/L白血病抑制因子;
实例3:Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、10ng/mlbFGF、3μM/lCHIR99021、5μM/l SB431542和1000U/l白血病抑制因子。
为了使得本发明实施例一的培养基得到更好的应用,更加有效应用到神经上皮干细胞以及细胞系的建立中,本发明还在上述实施例一的基础之上提供了实施例二,实施例二根据实施例一培养基建立神经上皮干细胞的方法现做详细的阐述和解释,请参考图1-图5:
实施例二
一种利用权利要求1所述培养基获得神经上皮干细胞的方法,包括以下步骤:
1、将多能干细胞经过胶原酶消化成细胞团块;
具体的,在该步骤中,将培养的饲养层或无饲养层培养的多能干细胞经过胶原酶消化(5-40分钟)成小块的干细胞团块(50-100个细胞)。另外,在本实施例中,多能干细胞,包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。
2、将所述细胞团块悬浮在所述分化培养基中并进行悬浮培养,使其分化为初级神经上皮干细胞;
具体的,将悬浮细胞团块在分化的培养基中,在低贴附的培养皿中进行悬浮培养,进行连续6天的分化,每2天换液。在分化的第4天开始,拟胚体出现两层样的神经上皮结构,请参考图1。将分化第6天的神经上皮结构收集(静置5-10分钟,去掉上清液)。
在图1中,示出了多能干细胞定向诱导分化为高纯度的神经上皮干细胞过程。其中,(A)为多能干细胞在分化培养基中分化第2天后形成典型的拟胚体;(B-C)在分化的第5-6天,拟胚体形成神经上皮结构,表达Nestin。(D-L)分别对分化后第2、5以及6天的拟胚体进行冰冻切片,然后分别进行Oct4、Sox2、Nestin和Pax6的染色后显示的阳性细胞染色结果。(M)为在拟胚体分化过程中Sox2、Oct4和Pax6阳性细胞数量的定量变化(**P>0.01表示显著变化)。(N)为分化的第6天和第12天拟胚体以及扩增的第6代的神经上皮干细胞样品的RT-PCR(mRNA反转录PCR),表明多能干细胞很快失去了多能性,转化为神经上皮干细胞。(O-T)为长期培养的神经上皮干细胞表达干细胞的标志蛋白,如Sox2、Pax6、Nestin和N-cadherin,但不表达放射胶质前体细胞的标志蛋白GFAP、神经元蛋白Tuj1(S)以及人和猴发育的大脑皮层侧脑室外侧区域的前体细胞标志蛋白Tbr2(如图1中T所示)。
3、将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养,获得能够稳定传代的神经上皮干细胞;
在该步骤中,通过扩增培养基将分化获得的初级神经上皮干细胞培养之后,细胞长满之后则会得到神经上皮干细胞。
另外,为了获得能够使培养的细胞能自我组装成神经管的结构:可进行如下操作:神经上皮干细胞需要在培养板上连续培养7-8天,而不进行传代。这些传代的细胞保持了指数生长,甚至到50代后,仍然保持旺盛的生长速度,其生长能力没有受到任何的影响。通过流式细胞仪检测这些细胞,发现在长期的培养过程其稳定表达干细胞的标志蛋白,如Nestin和Sox2。并且,这些长期传代培养的细胞保持了分化为高纯度神经细胞的特性以及形成神经管结构的特性。请参考图2:
在图2中,示出了神经上皮干细胞培养体系能够长期规模化培养神经上皮干细胞,并保持干细胞自我组装为神经管的结构以及高纯度神经元的产生。其中,(A)为第6天的拟胚体当培养在铺有laminin的板上,3天后形成一个双层的神经上皮结构。(B)为低密度情况下分化获得的神经上皮干细胞形成玫瑰花环(neural rosettes)结构。(C)为在高密度的情况下神经上皮干细胞形成神经管结构。(D-E)长期培养的神经上皮干细胞保持了神经管形成能力,并表达神经上皮干细胞标志蛋白Nestin和ZO-1。(F-G)为分裂期标志蛋白phospho-vimentin(p-vimentin)染色显示分裂的细胞主要位于神经管的表面,而BrdU标记的DNA合成期(S期)的细胞位于神经管的背面,显示存在细胞分裂的核位移(interkinetic nuclearmigration)。(H)为神经上皮干细胞的生长曲线,表现为随着细胞的传代呈现指数生长。(I-J)为流式细胞分选显示第18代和第36代的细胞表达相似的高比例Sox2和Nestin。(K)为扩增96代后的神经上皮干细胞仍然具有正常的核型。(L-M)为随着细胞的长期培养,保持了稳定高效的(>80%)Tuj1神经元分化比率,而缺乏GFAP星型胶质细胞。
4、将所述神经上皮干细胞利用0.05%的胰酶进行消化传代,获得稳定的神经上皮干细胞系;
优选的,在该步骤中,具体可以利用0.05%的胰酶进行消化传代,传代比例为1:8-1:16。培养板事先用浓度5-50μg/ml的laminin进行包被2小时以上,通过上述消化传代的操作,即可得到神经上皮干细胞系。
此外,可通过单个神经上皮干细胞自我组装为神经管结构,具体的,可以按照如下操作:将长期培养的单个神经上皮干细胞进行有限稀释,分别培养在铺有laminin的96孔板的孔里,一个细胞/孔,培养基采用上述的扩增培养基进行培养,每隔2-3天换液,直到第14-15天,单个的细胞自我组装为一系列的神经管结构。这些单个细胞产生的神经管结构表达Sox2、Nestin、Pax6、ZO-1和N-cadherin。BrdU标记显示这些神经管结构具有很强的增值能力,并拥有细胞分裂时的核位移(interkinetic nuclear migration)功能。如图3。
在图3中,示出了单个的神经上皮干细胞自我组装为神经管结构。其中,(A)为单个神经上皮干细胞自我组装为神经管结构的连续克隆示意图。(B)显示一个神经上皮干细胞在96孔板上。(C-D)为一个代表性的单个神经上皮细胞所产生的神经管集落。D显示的是高倍镜下的单个神经管结构。(E-H)为单个的神经上皮干细胞来源的神经管结构表达神经上皮干细胞标志蛋白,如Pax6、Nestin、N-cadherin和ZO-1。(I)BrdU标记显示单个细胞来源的神经管结构仍然保持很强的增值能力。(J)显示出活细胞动态成像技术表示神经上皮干细胞具有相似于体内的核位移(interkinetic nuclear migration),并表现出水平的对称分裂。(K)为神经上皮干细胞长期培养过程中,存活的克隆比率和形成神经管的极性克隆比例的变化,其结果显示随着神经上皮干细胞传代时间的增加,细胞产生这两种类型集落的比例越高。(L)为在连续的克隆过程中,接种细胞存活的细胞集落率以及存活的集落形成神经管极性比率的比较。结果显示第一次克隆和第二次克隆之间没有显著的差异(P>0.05)。
此外,在本实施例中,为了检测整个培养系统哪些关键性因素对神经管的发育和产生所必需的,可利用单细胞形成神经管结构的特性,通过在培养基中每次去掉一个成分进行一系列的单细胞培养实验,评价哪些成分对神经上皮干细胞的自我更新和神经管形成所必需的。
研究发现去掉SB431542不会影响细胞形成神经管的能力。单独去掉白血病抑制因子和bFGF将导致显著减少神经管的形成能力以及细胞的增值能力,相反去掉CHIR99021没有一个细胞能够产生神经管样的结构。如果采用SU5402抑制FGFR(成纤维生长因子受体)信号通路,所有的细胞都失去了产生神经管的能力。因此,通过实验说明,Wnt和FGFR信号是单个神经上皮干细胞形成神经管结构所必需的。通过连续的二次克隆,我们发现白血病抑制因子是保持细胞连续产生神经管结构所必需的。请参考图4:
在图4中,显示出了神经上皮干细胞自我组装为神经管结构以及转化为放射胶质前体细胞的机制。(A)为单个神经上皮干细胞在不同培养条件下,细胞存活以及形成极性神经管比率的比较。*P值<0.05表示显著差异,**P值<0.01表示极显著差异。(B)为单个神经上皮干细胞在不同实验条件下,细胞随着培养时间的延长,其增值能力差异的比较。*P值<0.05表示显著差异。(C-J)为Wnt信号通路的激活是神经上皮干细胞形成神经管所必需的,而其失活将丢失神经管形成的能力,并转化为放射胶质前体细胞。(K-N)显示了内源的FGFR信号通路是神经管形成所必需的。SU5402是FGF受体的抑制剂。箭头所指的是单个神经上皮干细胞在含有SU5402的神经上皮干细胞扩增培养基中形成小的神经管结构。(O)为神经上皮干细胞自我组装为神经管结构以及转化为放射胶质前体细胞的模型。
通过附图4可知,白血病抑制因子、FGF和Wnt信号通路在神经管自我组装过程中的作用。外源bFGF和白血病抑制因子能促进神经上皮干细胞的自我更新以及增加神经管结构的形成,而内源FGFR和Wnt信号通路是神经管形成所必需的。另外,在Wnt信号通路失活的情况下,神经上皮干细胞转化为放射胶质前体细胞,失去形成神经管的能力。此外,早期转化的放射胶质前体细胞在Wnt信号通路重新激活的情况下,能转化为神经上皮干细胞,而传代后的放射胶质前体细胞则不能重新转化为神经上皮干细胞。
在步骤3之后,可选的,还可以利用神经上皮干细胞以及单个的神经干细胞分化为高纯度的神经元。利用长期培养的神经上皮干细胞以及单个细胞产生的稳定神经上皮干细胞系,在去掉bFGF、CHIR99021、SB431542和LIF的条件下进行自发的分化,神经元的分化培养基为Neurobasal培养基、B27、非必需氨基酸(含量可为1%)和谷氨酰胺(浓度可为1mM)。分化细胞分别经过放射性胶质干细胞(第0-3天)、中间神经前体细胞(第4-6天)的发育阶段,分化为高纯度的神经元,这些神经元包括兴奋性谷氨酰胺能、抑制性γ-氨基丁酸(GABA)以及大脑皮层的II-IV层、V-VI层的神经元、大脑皮层的中间神经元,如图4中的D-J。
最后,将含有GFP的慢病毒加到神经上皮干细胞的扩增培养基里面,感染培养的神经上皮干细胞,4小时后用PBS洗去病毒,换成新鲜的培养基。将GFP标记的神经上皮干细胞以及单个GFP标记的神经干细胞通过上述的单细胞扩增方法产生的细胞系通过立体定位仪的方式,在麻醉的情况下,移植到食蟹猴的大脑脑部。3个月后,将大脑进行固定,进行组织切片,发现移植细胞能够整合到食蟹猴的大脑脑部,分化为神经元,这些神经元在3个月内,生长出长的轴突,并广泛的分布于大脑皮层,部分的神经轴突往脑部的深层迁移。因此该细胞具有重要的临床价值,可为将来的神经系统性疾病的干细胞治疗提供重要的供体细胞来源。如图5中L-O。
在图5中,示出了利用单个神经上皮干细胞模拟人的神经管疾病,并分化为大脑皮层神经细胞进行神经细胞替代治疗。(A-C)示出了单个神经上皮干细胞转化为神经管能够模拟神经管发育缺陷疾病。其中,DHFR、SHMT1、MTRR、MTHFD1L、MTR以及CBS是叶酸代谢中的关键酶(A)。这些酶高表达在神经上皮干细胞中(B),并且叶酸的浓度与神经管的形成呈正相关,而与集落的凋亡呈负相关(C)。(D-J)为单个的神经上皮干细胞来源的稳定细胞系能分化产生大脑皮层神经元。这些分化的神经元包括兴奋性谷氨酰胺能和抑制性γ-氨基丁酸(GABA)神经元(D-G)。定量统计结果显示三株不同的单细胞系分化的神经元比例没有显著的差异(H)。而且这些细胞系能够产生大脑皮层II-IV层的Brn2神经元和V-VI层的Ctip2神经元,如I-J。(K-O)示出单个神经上皮细胞来源的神经上皮干细胞移植到猴的视觉皮层后,能够整合到大脑皮层(K);这些移植的细胞整合到大脑皮层的最外层(L-L”)和II-IV层(M-M”),并分化为神经元。而且这些分化的神经元生长出很长的轴突,这些轴突分布在大脑皮层的多个位点,并往大脑皮层的深部延伸,如图5中O所述。
此外,通过本实施例的方法建立的神经上皮干细胞以及利用该神经上皮细胞培养产生的细胞系;以及神经上皮干细胞和利用该神经上皮细胞培养产生的细胞系在细胞替代治疗、疾病机制以及药物筛选中的应用也属于本发明的保护范围。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种建立神经上皮干细胞的培养基,所述神经上皮干细胞自我组装为神经管结构,所述培养基包括:
用于将多能干细胞诱导分化为初级神经上皮干细胞的分化培养基以及用于使所述初级神经上皮干细胞扩增的扩增培养基;
所述分化培养基包括:Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、bFGF、Wnt信号通路的激动剂、GSK3的抑制剂、TGF-β信号通路的抑制剂、Notch信号通路抑制剂、ALK2以及ALK3信号通路的抑制剂,其中,所述Notch信号通路抑制剂为Compound E;
所述扩增培养基包括:Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、bFGF、Wnt信号通路的激动剂、GSK3抑制剂、TGF-β信号通路的抑制剂和白血病抑制因子;
在所述分化培养基中,所述bFGF的浓度为3-100ng/ml;所述Compound E的浓度为0.05-10μM;
在所述扩增培养基中,所述bFGF的浓度为3-100ng/ml;所述白血病抑制因子的浓度为50-5000U/L。
2.根据权利要求1所述的建立神经上皮干细胞的培养基,其特征在于:
在所述分化培养基中,所述Wnt信号通路的激动剂和GSK3抑制剂均为CHIR99021;所述TGF-β信号通路的抑制剂为SB431542;所述Notch信号通路抑制剂为Compound E;所述ALK2以及ALK3信号通路的抑制剂为LDN193189;
和/或在所述扩增培养基中,所述Wnt信号通路的激动剂和所述GSK3抑制剂均为CHIR99021;所述TGF-β信号通路的抑制剂为SB431542。
3.根据权利要求2所述的建立神经上皮干细胞的培养基,其特征在于,在所述分化培养基中,所述CHIR99021的浓度为0.3-30μM,所述SB431542的浓度为2-50μM;所述LDN193189的浓度为0.1-10μM;
和/或在所述扩增培养基中,所述CHIR99021的浓度为0.3-30μM;所述SB431542的浓度为5-50μM。
4.一种利用权利要求1所述的培养基获得神经上皮干细胞的方法,所述神经上皮干细胞能自我组装为神经管结构,所述方法特征在于,包括以下步骤:
将多能干细胞经过胶原酶消化成细胞团块;
将所述细胞团块悬浮在所述分化培养基中并进行悬浮培养,使其分化为初级神经上皮干细胞;
将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养,获得能够稳定传代的神经上皮干细胞。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于;在所述步骤将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养,获得能够稳定传代的神经上皮干细胞之后,还包括:
将所述神经上皮干细胞进行稀释,得到单个神经上皮干细胞;
将所述单个神经上皮干细胞利用所述扩增培养基培养14-15天,得到该单个神经上皮干细胞自我组装成的神经管。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,在所述步骤将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养,获得能够稳定传代的神经上皮干细胞之后,还包括:
将所述神经上皮干细胞在含有Neurobasal培养基、B27、非必需氨基酸以及谷氨酰胺的神经元分化培养基上培养并使其分化,得到纯度为40%-100%的神经元。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,在所述将多能干细胞经过胶原酶消化成细胞团块的步骤中:
所述消化时间为5-40分钟。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,在所述将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养,获得能够稳定传代的神经上皮干细胞的步骤之后,还包括:
将所述神经上皮干细胞利用0.05%的胰酶进行消化传代,获得稳定的神经上皮干细胞系。
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