CN106337037A - 一种诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物及其用途。本发明在没有外源基因的条件下通过小分子化合物的组合实现了神经细胞非谱系间的转分化。且本发明家首次发现VCRFSGY处理的成纤维细胞早在3天的时候就快速地退出了细胞周期，这暗示从人成纤维细胞用化学诱导法诱导的神经元细胞可能绕过了增殖的中间态，极具临床和市场价值。此外，本发明还进一步发现，在VCRFSGY化合物组合基础上分别添加视黄酸Retinoic Acid或反苯环丙胺Parnate均可以很好地促进诱导效率。

Description

一种诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物及其 用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物及其用途。

背景技术

终末分化的体细胞可以通过强制表达一套特异的转录因子而被重编程为多能干细胞，表明细胞的命运是可逆转的(Ladewig et al.,2013；Takahashi and Yamanaka,2006；Yu et al.,2007)。而且不同谱系特异的转录因子的组合可以直接将人和鼠的体细胞绕过多能性的状态而直接转分化为心肌细胞(Ieda etal.,2010；Nam et al.,2013)，肝细胞(Du et al.,2014；Huang et al.,2014)以及神经细胞(Pang et al.,2011；Vierbuchenet al.,2010)。这为疾病模型的构建及再生医学提供了可供选择的途径。有趣的是这些转分化可以通过特定的转录因子组合在体内实现(Guo et al.,2014；Niu et al.,2013；Qianet al.,2012)，更进一步暗示了它的治疗潜能。然而，这种通过外源整合基因的方法却限制了它当下的治疗应用。因此控制外源基因的表达以及降低转录因子的使用数量迫切的需要被尝试(Dell'Anno et al.,2014；Ladewig et al.,2012；Wang et al.,2014)。细胞可渗透的小分子具备可以促进细胞的重编程的作用(Huangfu et al.,2008；Xu et al.,2008)。最近有研究表明单用小分子即可以将小鼠的成纤维细胞诱导到多能性的状态(Hou et al.,2013).。我们先前的研究也表明通过合适的化合物组合可以将小鼠和人的尿细胞诱导成神经祖细胞(Cheng et al.,2014)。而且，化合物促使的在人和鼠的不同细胞谱系间的转分化先前也被报道过(Pennarossa et al.,2013；Sayed et al.,2015)。

考虑到在体内无论是从胚胎干细胞还是诱导性多能干细胞分化为神经细胞的耗时及复杂性(Chambers et al.,2009；Zhang and Zhang,2010)，我们尝试了通过小分子化合物的组合绕过神经祖细胞的阶段直接将人的成纤维细胞转分化为神经细胞。

发明内容

本发明的目的在于公开一种诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物及其用途。

为实现本发明的目的及其他相关目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面，提供了一种诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物，主要药效成分含有VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632，且VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632的摩尔比为：(200-1000)：(0.5-5)：(1-20)：(1-20)：(1-20)：(1-20)：(1-20)。

优选地，所述药物组合物中，VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、、Go6983和Y-27632的摩尔比为：(200-1000)：(0.5-5)：(1-20)：(1-20)：(5-20)：(1-20)：(1-20)。

更优选地，所述药物组合物中，VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632的摩尔比为：500：3：1：10：10：5：5。

进一步优选地，每1000ml所述药物组合物中，含有0.2-1mmol VPA、0.5-5μmolCHIR-99021、1-20μmol RepSox、1-20μmol Forskolin、1-20μmol SP600125、1-20μmol、Go6983、1-20μmol Y-27632。

更优选地，每1000ml所述药物组合物中，含有0.2-1mmol VPA、0.5-5μmol CHIR-99021、1-20μmol RepSox、1-20μmol Forskolin、5-20μmol SP600125、1-20μmol Go6983、1-20μmol Y-27632。

更优选地，每1000ml所述药物组合物中，含有0.5mmol VPA、3μmol CHIR-99021、1μmol RepSox、10μmol Forskolin、10μmol SP600125、5μmol Go6983、5μmol Y-27632。

进一步地，前述诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物中，主要药效成分含有VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632，以及视黄酸Retinoic Acid。

优选地，每1000ml所述药物组合物中，含有视黄酸Retinoic Acid 0.1～10umol。

进一步地，前述诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物中，主要药效成分含有VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632，以及反苯环丙胺Parnate。

优选地，每1000ml所述药物组合物中，含有反苯环丙胺Parnate 0.1～10umol。

上述VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、、Go6983、Y-27632、RetinoicAcid、Parnate均可通过市售途径获得。其中，VPA：丙戊酸，CAS号：99-66-1。CHIR-99021：6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶 -3-甲腈，CAS号：252917-06-9。RepSox：2-(3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶，CAS号：446859-33-2。Forskolin：佛司可林，CAS号：66575-29-9。SP600125：吡唑蒽酮，CAS号：129-56-6。Go6983：3-(1-(3-(二甲基氨基)丙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)-4-(1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二，CAS号：133053-19-7。Y-27632：反式-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸，CAS号：129830-38-2。

进一步的，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

术语“包含”指“含有”和“由﹍构成”，例如“包含”X的组合物可以完全由X构成，或者可以含有X之外的物质，例如X-Y。本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果例如可通过化学标记或抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减轻。对于某一对象的精确有效剂量取决于该对象的体型和健康状况，病症的性质或程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的症状而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

所述药学上可接受的赋形剂(或运载体)指用于治疗剂给药的赋形剂，其本身及其用量不应诱导接受该组合物的个体产生有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。药学上可接受的赋形剂通常包括无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包裹材料或任何常规类型的制剂辅助物。合适的赋形剂包括但不仅限于水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇或其组合。所述赋形剂还包含有其他试剂如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强制剂效力的佐剂。其他材料如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂和类似试剂可根据需要添加。脂质体也包括在药学上可接受的赋形剂的定义中。

通常，可将药物组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬浮液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

本发明的第二方面，提供了前述药物组合物在体外诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化中的用途。

本发明的第三方面，提供了一种诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的方法，所述方法包括步骤：将前述药物组合物施用于成纤维细胞。

进一步的，所述方法为体外诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的方法。

优选地，所述成纤维细胞为人成纤维细胞。

更优选地，所述人成纤维细胞选自健康人的人成纤维细胞或家族性阿尔茨海默病患者的人成纤维细胞。

优选地，所述药物组合物中，主要药效成分含有VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632，且VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632的摩尔比为：(200-1000)：(0.5-5)：(1-20)：(1-20)：(1-20)：(1-20)：(1-20)。

优选地，所述药物组合物中，VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、、Go6983和Y-27632的摩尔比为：(200-1000)：(0.5-5)：(1-20)：(1-20)：(5-20)：(1-20)：(1-20)。

更优选地，所述药物组合物中，VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632的摩尔比为：500：3：1：10：10：5：5。

进一步优选地，每1000ml所述药物组合物中，含有0.2-1mmol VPA、0.5-5μmolCHIR-99021、1-20μmol RepSox、1-20μmol Forskolin、1-20μmol SP600125、1-20μmol、Go6983、1-20μmol Y-27632。

更优选地，每1000ml所述药物组合物中，含有0.2-1mmol VPA、0.5-5μmol CHIR-99021、1-20μmol RepSox、1-20μmol Forskolin、5-20μmol SP600125、1-20μmol GO6983、1-20μmol Y-27632。

更优选地，每1000ml所述药物组合物中，含有0.5mmol VPA、3μmol CHIR-99021、1μmol RepSox、10μmol Forskolin、10μmol SP600125、5μmol GO6983、5μmol Y-27632。

进一步地，所述药物组合物中，主要药效成分含有VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632，以及视黄酸Retinoic Acid。

优选地，每1000ml所述药物组合物中，含有视黄酸Retinoic Acid 0.1～10umol。

进一步地，所述药物组合物中，主要药效成分含有VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632，以及反苯环丙胺Parnate。

优选地，每1000ml所述药物组合物中，含有反苯环丙胺Parnate 0.1～10umol。

优选地，所述药物组合物的作用时长为4～8天。更优选6～8天。最优选8天。

本发明的有益效果为：

本发明在没有外源基因的条件下通过小分子化合物的组合实现了神经细胞非谱系间的转分化。我们首次发现VCRFSGY处理的成纤维细胞早在3天的时候就快速地退出了细胞周期(图5H)，这暗示从人成纤维细胞用化学诱导法诱导的神经元细胞可能绕过了增殖的中间态。

在我们的化合物组合策略的转换过程伴随成纤维细胞特异性基因的下调，和内源性神经元转录因子表达的增加。同样的，我们的芯片分析结果也表明，相比于成纤维细胞，诱导的神经细胞(hciNs)中相关的信号传导途径中的基因表达模式更类似于阳性对照的神经元。因此，通过协调多个信号通路，VCRFSGY中的七个小分子通过调节神经元的转录因子的基因表达从而促进人成纤维细胞向神经元细胞的过渡。

多个信号通路的适当微调是用化合物将人成纤维细胞成功诱导为神经元细胞的关键。化学鸡尾酒VCRFSGY删除了原始细胞成纤维细胞特异性基因的表达，特异的上调了神经基因表达，并促进了人成纤维细胞向神经细胞(图8)的转换。

本发明还进一步发现，在VCRFSGY化合物组合基础上分别添加视黄酸RetinoicAcid或反苯环丙胺Parnate均可以很好地促进诱导效率。

附图说明

图1：通过小分子化合物诱导人神经元细胞，其中，图1A为诱导方案，初始成纤维细胞接种于DMEM培液的这一天被称作“Day-1”。1天后，更换为诱导性培液加上化合物组合培养8天，接着更换成熟性培液补充神经营养因子相关的化学物培养2-3周；V，VPA；C，CHIR-99021；R，RepSox；F,Forskolin；S，SP600625；G，Go6983；Y，Y-27632；D，Dorsomorphin；图1B：人成纤维细胞(左)或神经细胞(hciNs)图像第7天(中)和第14天(右)的相差明场图，比例尺：100μm左右；图1C：神经细胞(hciNs)显示双极神经元形态并表达DCX(绿色)，TUJ1(红色)和MAP2(绿色)第7天，比例尺：20微米；图1D-G：神经细胞(hciNs)细胞染色的NeuN(D)，Tau(E)，SYN(F)和VGLUT1(G)，比例尺：20μm左右；图1H：神经细胞(hciNs)细胞的诱导效率是被诱导为TUJ1⁺DCX⁺，TUJ1 ⁺MAP2⁺或TUJ1⁺NeuN⁺阳性神经细胞相对于初始种植细胞的百分比(means±SEM，n＝20，从三次独立重复试验中随机选择20个的20倍视野中随机选择)；图1I：诱导呈现TUJ1⁺DCX ⁺TUJ1⁺MAP2⁺或TUJ1⁺的NeuN⁺阳性神经细胞相对于总细胞的比例(means±SEM，n＝20从三次独立重复试验中随机选择20个的20倍视野中随机选择)；另请参见图5和表2。

图2：诱导的神经细胞具有功能性的神经元的电生理特性，其中，(A)从成纤维细胞诱导来的神经细胞(hciNs)细胞电流钳记录显示的代表性的动作电位(上图)，阶梯电流从注入-10pA至80Pa 6pA的增量(下图)；(B)典型的电压钳记录诱导第14天的神经细胞(hciNs)在豚毒素敏感的快速内向电流模式的痕迹，河豚毒素(1μM)处理抑制电压依赖性钠电流(右图)；细胞从-20mV去极化至70毫伏以10mV的幅度递增；(C)10μML-谷氨酸(左图)或10μMGABA(右图)诱导内向膜电流的应用；(D)由从GFP标记的成纤维细胞诱导生成神经细胞(hciNs)产生典型的自发突触后电流；GFP标记的成纤维细胞用化合物组合进行1周的处理，然后与高密度纯的星形胶质细胞共培养共培养2-3周后，对有着复杂的神经元形态的GFP标记的神经细胞(hciNs)细胞进行了记录，记录的配置如图(顶面板)，该插入显示了两种不同类型的sPSCs：快速衰减的sEPSCs(红色竖线表示)和慢衰变sIPSCs(绿色竖线表示)；放大sEPSC(红色线)和sIPSC(绿色线)进行标准化。比例尺：20μm左右；(E)典型的APs在6个不同的细胞系中(FS090609-C1FS090609-C2-iPS；FS090609，SF002和IMR90的hCiNs；FS090609-TF-INS)；(F-H)人iPS细胞的内在电生理特性(两种细胞系，FS090609-C1统计，FS090609-C2)，hCiNs(三种细胞系，FS090609，SF002和IMR90)和TF-INs(FS090609)；F，AP幅度；G，AP阈值；H，静息膜电位(RMP)；(I)钙指示剂Cal520处理的hCiNs的荧光染色及DIC图像；神经元，红色通道，细胞的数量被指示(1-27)；星形胶质细胞，绿色通道，数量为28-30；(J)在图2I中典型的自发钙瞬变痕迹；黑色竖条表示在启动钙瞬变的时间；星形胶质细胞钙瞬变的上升阶段(绿线)比神经细胞(红色线)的要慢得多；(K)图2I自发钙瞬变的栅格图；(L)定量神经元呈现自发钙瞬变的百分比；总共，分析得到的22影像和1249假定的神经细胞(FS090609-C1 iPS细胞，3影像中的138细胞；FS090609-C2 iPS细胞，3影像中的650细胞；FS090609hCiNs，5影像中的108细胞；SF002 hCiNs，5影像中的170细胞；IMR90 hCiNs，6影像中的183细胞)；也可以看看图6。

图3：在化合物组合诱导的重编程过程中的HciN细胞的基因表达谱；采用Fluidigm公司的BioMark平台进行单细胞(A)基因表达分析；在第21天使用FACS方法收集化合物处理的神经细胞；表达水平(表示为Ct值)颜色编码显示在底部(色标)；H1-20表示神经细胞(hciNs)细胞样本，F1-20表明成纤维细胞样本，并T1-20表示TF-iNs样本；(B)热图及基因微阵列数据的层次聚类；样品：成纤维细胞，神经细胞(hciNs)细胞(第3天，7天，14-1天和14-2天)和对照神经元(衍生自人胚胎干细胞)进行比较；显示在神经细胞(hciNs)(14日)与被选择的倍数变化≥±10成纤维细胞；相比于成纤维细胞，在热图中绿色表示表达下降，而红色代表表达增加；(C)成对的基因表达的比较显示，大多数的神经元分子标记(左图)是增加的，而神经胶质分子标记(中图)不激活，一些成纤维细胞特异性基因(右图)是逐渐沉默的。黑线表示样品之间2倍的变化；(D)基因本体(GO)分析在神 经细胞(hciNs)(14日-1和14日-2)和阳性神经细胞与人成纤维细胞相比时≥2倍的重叠基因，也见图7和图8。

图4：从家族性阿尔兹海默症病人成纤维细胞诱导产生神经细胞(hciNs)细胞；(A)从家族性阿尔兹海默症病人成纤维细胞(家族性阿尔兹海默症病人109和家族性阿尔兹海默症病人131)产生神经细胞(hciNs)的特征；(B-D)细胞培养物中的Aβ水平在家族性阿尔兹海默症病人神经细胞(hciNs)和TF-及WT神经细胞(hciNs)的对比；(E)磷酸化tau和总tau在P109神经细胞(hciNs)s和TF-细胞中的水平；三次独立实验的数据显示为平均值±标准误表示；比例尺：20μm左右；*，P<0.05；**P<0.01；***，P<0.001；与对照神经细胞(hciNs)细胞的对比。

图5：图1相关；筛查神经细胞的诱导的化合物及诱导过程hcin细胞的鉴定；(A)原代人成纤维细胞是神经元标记阴性的。人胚胎干细胞衍生的神经元表达神经元标志物DCX，TUJ1和MAP2，但这些神经元标记物在原代人成纤维细胞是不存在的；刻度条：100m；(B)在不同的化学处理，在第7天，诱导的神经元细胞的检测。Tuj1阳性神经元细胞百分率的诱导效率(means±SEM，每组随机抽取10X20视野，取自三份样品)；V，VPA；C，CHIR-99021；R，RepSox；F，forskolin；S1，SB202190；S2，sp600625；S3，SB431542；P，pd013252；G，Go6983；Y，Y-27632；(C)化合物治疗期间的hcin细胞诱导条件的优化；化合物处理期为4天到3周；诱导效率均为在对应时间的定量比初始铺种细胞数(平均值±SEM。，N＝10，每组随机抽取10X20视野，取自三份样品)MAP2+神经元细胞的百分比；(D)定量在Tuj或MAP2的hcin中不同亚型神经元阳性细胞所占百分比；对hcin细胞进行gabanergic神经元标记GAD67，胆碱能神经元Chat和多巴胺能神经元TH的标记(左图的)染色的代表照片。刻度条：20m；(E)通过小分子诱导多种人成纤维细胞hcin细胞；诱导效率均量化为在时间(14天)MAP2+神经元细胞占诱导初始铺种细胞的百分比；(平均值±SEM；N＝10，每组随机抽取10X20视野，取自三份样品)；(F-G)hcin细胞的诱导可能绕过神经祖细胞阶段；在神经元转化过程中，没有神经祖细胞标志Sox2，Pax6或FOXG1的表达(F)；所有的样本数据进行归一化，D0，是1；三个独立的实验数据，显示平均值±SEM；在神经元转化过程中免疫荧光染色显示神经祖细胞特异分子标记物中没有检测到(G)，人胚胎干细胞来源的神经祖细胞样品作为阳性对照，刻度条：100m；(H)，vcrfsgy处理后3天退出细胞周期；vcrfsgy处理3天并进行增殖标记物Ki67染色；刻度条：50m；(I)7个个体来源的成纤维细胞(顶面)中未检测到磷酸化Tau和总Tau的水平；磷酸化GSK-3β和总gsk3-3β的水平在fad109成纤维细胞中略高于其他个体的成纤维细胞(底 部)；7个人的成纤维细胞的细胞裂解物进行免疫印迹检测；OE-tau，tau蛋白过度表达的293样品。

图6：图2相关；sEPSCs和sIPSCs性质和药物动力学；(A)sEPSCs(红圈)和sIPSCs(绿圈)的衰变时间排序；(B)荷包牡丹碱(BIC，50μm)选择性阻断慢衰减sIPSCs；(C)神经元表现出诱导的动作电位的百分比。

图7：图3相关；单细胞基因表达分析和全基因组表达谱的分析，细胞的制备；hcin细胞在第3天，7和14天，对照神经元的cDNA微阵列分析；(A)TF-iNs的鉴定：HAFs染色泛神经元标记物TuJ1和MAP2在Ascl1、Neurog2感染后21天为阳性；刻度条：20m；(B)形态和纯化后hcins的染色；刻度条：左面板100μm，右面板20μm；(C)流式细胞仪检测过程数据分析；细胞进行染色，然后anti-cd24-pe-cy7，CD24阳性细胞进行分选；(D)对选定的神经元亚群，胶质细胞和成纤维细胞特异性基因的热图；(E和F)两两基因表达的比较表明，在hcin细胞3天和7天中，神经细胞标志物的表达水平增加(E)，而成纤维细胞特异性基因的表达水平沉默(F)；黑色线条表示样本对2倍之间变化；(G)基因本体(GO)分析处理14天的两个hciN细胞样品和对照神经元，都与成纤维细胞相比，大于两倍基因水平改变的分析；(H)示意图说明神经元转化的可能机制。

图8：图3相关。由化学物鸡尾酒法去单个除小分子的诱导的基因表达谱；在化学诱导过程中，7天内成纤维细胞特异基因表达上调，化合物处理7天的HAFs，所有的样本数据进行归一化，D0，是1；人原代神经元(Science Cell,#1525)作为对照；三个独立的实验数据显示平均值±SEM；在化学诱导过程中，7天内成纤维细胞特异性基因表达上调；化合物处理7天的HAFs；所有的样本数据进行归一化，D0，是1；人原代神经元(Science Cell,#1525)作为对照；2个独立的实验数据显示为平均值±SEM。

图9：在VCRFSGY化合物组合基础上添加其他化合物或小分子以促进诱导效率，其中A：比较VCRFSGY化合物组合基础上添加不同小分子对于诱导Tuj1阳性细胞的影响；B：VCRFSGY化合物组合基础上添加不同小分子对于Tuj1阳性细胞诱导效率的统计结果。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发 明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

基本实验方法：

1.细胞培养

原代成人纤维细胞(fs090609；Jin Ying博士提供)是从健康捐赠者包皮组织中收集，由上海仁济医院建立(Ma等人。，2012)。原代成人成纤维细胞(sf001和sf002；由裴端卿博士提供)是广州生物医药与健康研究院从健康人组织取样获得(Huang等人，2014年皮肤活检获得；Liu et al。，2013年)。IMR90购自ATCC(ccl-186)。FAD病人的成纤维细胞(fad109，fad131，fad132和fada16)是来自家族性阿尔茨海默病患者的皮肤活检，收集自湖南湘雅医 院。上海仁济医院、广州省生物医药卫生研究院和湖南湘雅医院的伦理委员会批准了人类样本的采集和使用。所有受试者均知情同意。原代成纤维细胞培养，都根据标准方法采用活组织切片建立(Li等，2009)。这些人成纤维细胞的详细信息见表3。人成纤维细胞被培养在DMEM(Life Technologies，c11965)辅以10％胎牛血清(ausbian，vs500t)，1mmglutamax(Life Technologies，35050-061)，0.1微摩的非必需氨基酸(NEAA，Millipore，tms-001-c)和青霉素/链霉素在37℃，5％的CO₂条件下。H9的人胚胎干细胞(WiCell，来自章小清博士)，在mTeSR1(Stemcell)培养，传代用中性蛋白酶或用EDTA消化成团块。神经干细胞诱导如前所述，是从胚胎干细胞开始诱导，通过双重抑制Smad信号的方法(Chambers等人，2009)。胚胎干细胞衍生的NPC诱导神经元分化实在BDNF，GDNF，IGF(10ng/ml，PeproTech)，cAMP(1μM，Sigma-Aldrich公司)和Ascorbic acid(200ng/毫升，Sigma-Aldrich公司)条件进行(Zhang and Zhang，2010年)。

2.hcin细胞的生成

(1)试剂：

VPA，0.5mM(Calbiochem公司，676380，1M的储液，H2O)；

CHIR-99021，3μM(Axon，1386，10mM的储液，DMSO)

RepSox，1μM(biovison，1894，10mM的储液，DMSO)

Forskolin，10μM(Cayman，66575-29-9，50mM的储液，DMSO)

SP600125，10μM(Sigma-Aldrich，s5567，25mM的储液，DMSO)

Go6983，5μM(Sigma-Aldrich，g1918，10mM的储液，DMSO)

Y-27632，5μM(Sigma-Aldrich，y0503，20mM的储液，DMSO)

Dorsomorphin，1μM(Cayman，11967，10mM的储液，DMSO)

cAMP，100μM(Sigma-Aldrich，d0260，100mM储液，H2O)

bFGF，20ng/ml(Invitrogen公司，phg0024，100μg/mL储液在H2O)

BDNF，20ng/ml(PeproTech，450-02，100μg/mL储液在H2O)

GDNF，20ng/ml(PeproTech，450-10，100μg/mL储液在H2O)

NT3，20ng/ml(PeproTech，450-03，100μg/mL储液在H2O)

(2)培养基：

成纤维细胞培液：DMEM(Life Technologies，c11965)加10％胎牛血清(ausbian，vs500t)，1mm glutamax(Life Technologies，35050-061)，0.1微摩的非必需氨基酸(NEAA，Millipore，tms-001-c)和青霉素/链霉素。

神经感应培液：(DMEM/F12，Life Technologies，11330-032)：(Neurobasal，LifeTechnologies，21103-049)(1:1)，0.5％N-2(Invitrogen公司，17502048)，1％B-27(Invitrogen公司，17504044)，100μM cAMP和20ng/mL bFGF和青霉素/链霉素

神经元成熟培养基：DMEM/F12：Neurobasal(1:1)，0.5％N-2，1％B-27，100μMcAMP，20ng/mL bFGF，20ng/mlBDNF，20ng/ml GDNF，20ng/ml NT3和青霉素/链霉素

神经培液：DMEM/F12(1:1)：Neurobasal，0.5％n2，1％B-27，BDNF，GDNF，NT3各20ng/ml和青霉素/链霉素。

(3)步骤：

1)24孔或6-wells板包被0.1％明胶超过半小时(有或无盖玻片)。

2)初始细胞接种在明胶包被的培养板(10000-20000细胞/，24孔板)和体外培养的成纤维细胞培养基中24小时。

3)细胞密度是40-60％，然后细胞在加了vcrfsgy的神经元的诱导培养基中培养。使用的化合物的浓度是：VPA，0.5mM；CHIR-99021，3μm；RepSox，1μm；forskolin，10μM；SP600125，10μM；Go6983，5μM；Y-27632，5μM

4)含化合物的培养基每四天更换一次。

5)经过八天(IMR90细胞是4天)，细胞在加了CFD(CHIR-99021，3μm；forskolin，10μm；dorsomorphin，1μm)的培养基中培养。

6)神经元成熟培养基每两天换一次。

7)2周后，hciNs在神经元培养基中培养，促进神经元的存活和成熟。

8)此后，细胞在神经元培养基中每隔一天换一半，直到细胞进行进一步的分析。

3.基于转录因子(TF)的神经诱导

TF(Ascl1+Neurog2)准备如前所述，稍作修改(Ladewig et al.,2012)。Tet-o-fuw-ascl1和cag-ngn2-ires-dsred被用来表达ASCL1和Neurong2。慢病毒颗粒包装，HEK-293T细胞共转染包装质粒PAX2，VSVG和tet-o-fuw-ascl1慢病毒载体质粒。对于逆转录病毒颗粒的生产，HEK-293T细胞共转染包装质粒GAG-POL，VSVG和cag-ngn2-ires-dsred逆转录病毒载体质粒和质粒。所有的病毒颗粒通过离心浓缩。成纤维细胞在这些病毒颗粒加6μg/ml polybrene的条件下被感染。过夜培养后，成纤维细胞的培养基中加入强力霉素(1μg/ml，Selleck)。一天后，这些细胞培养在含有DMEM/F12(1％(体积/体积)，N2，Invitrogen公司)和Neurobasal(2％(体积/体积)B27，Invitrogen公司)按1:1的比例混合，camp(100ng/ml，Sigma-Aldrich)和多西环素(1μ克/毫升，Selleck)sb-431542(10μM，Sigma- Aldrich)，noggin(100ng/ml PeproTech)，ldn-193189(0.5μM，Selleck)和CHIR-99021(2μM，轴突)。培液每三天换一次。两周后，神经元通过添加10ng/ml的脑源性神经营养因子(BDNF)，2ng/mlGDNF，10ng/mlNT3(PeproTech)和0.5μMdcAMP(Sigma-Aldrich公司)来促进神经元生长。

4.转换效率

按先前描述的转换效率(vierbuchen等人，2010)。简要地说，我们随机选择10-20个观察领域，每个样品在奥林巴斯ix-51显镜，在指定的时间点，并计数细胞总数，以及Tuj1+/DCX+，Tuj1+/MAP2+和Tuj1+/NEUN+细胞与神经元的形态。计算为Tuj1+/DCX+，Tuj1+/MAP2+或Tuj1+/NeuN+hcin细胞初始铺种的细胞的比值为转换效率。纯度代表诱导Tuj1+/DCX+，Tuj1+/MAP2+或Tuj1+/NEUN+神经元细胞在总细胞DAPI染色所占比例。定量数据都是指至少有三个独立重复的实验。

5.免疫荧光显镜

以前描述的细胞免疫组化(Hu等，2013)。总之，细胞接种于盖玻片，在室温固定，4％PFA溶液中10分钟。然后细胞封闭液孵育(1％牛血清白蛋白在PBS中)(有或无0.5％Triton X-100)30分钟室温(RT)。后来，样品孵育抗体在4℃过夜，然后用适当的荧光探针标记的二次抗体孵育1h，用DAPI复染细胞核。图片是用荧光显镜拍摄(奥林巴斯ix-51)或徕卡sp-8共焦显镜。初级抗体：DCX(1:200，Abcam)，Tuj1(1:500，Covance)，MAP2(1:500，Millipore)，NeuN(1:500，Millipore)，SYN1(1:500，Millipore)，VGLUT1(1:500，Synapticsystem)，GAD67(1:500，Millipore)，Chat(1:200，Millipore)，TH(1:1000，Sigma-Aldrich公司)，Nestin(1:1000，Millipore)，SOX2(1:50，R&D)。

6.电生理分析

全细胞膜片钳记录进行了正如我们以前的报告(Cheng等人，2014)。记录使用multiclamp 700b放大器(分子器件)。包含神经元的玻片始终保持在32-34℃且有新鲜的人工脑脊液(ACSF)中。ACSF包含126mM NaCl，3mM KCl，1.25mM KH₂PO₄ 1.3mM MgSO₄，3.2mMCaCl₂，26mM NaHCO₃和10mM的葡萄糖，用95％O₂和5％CO₂吹出气泡。信号在10kHz with a2kHz low-pass过滤器中进行采样。全细胞电容被全补偿。。在RA＞50m或波动＞20％的记录被排除在外。细胞内液包含93mM K-gluconate，16mM KCl，2mM MgCl2，10mM HEPES 4mMATP-Mg，0.3mM GTP-Na₂，10mM creatine phosphate,0.5％Alexa Fluor 568hydrazide(Invitrogen)(pH 7.25,290/300mOsm)，0.4％neurobiotin(Invitrogen)。膜电位为-83mV,左右。动作电位记录在电流钳而钠电流记录在电压钳。10mV的递进电压增量被注 入引起向内钠电流。为了阻断钠电流，采用1μM TTX。TTX应用后10分钟跨步电压注入再次观察TTX敏感电流，。γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(各10μM，Sigma-Aldrich公司)是溶解在ACSF，装成一个吸管，使用10psi和1s时间间隔，用picosprizer III(Parker Instrument)打到hcin细胞。吸管是～10MΩ，放在离所记录的神经元胞体～10μm远。记录突触电流，我们将hcin标记上慢病毒编码GFP和单层星形胶质细胞的共培养。铺板后两周，GFP标记的hcin并且具有复杂神经元形态的细胞我们进行了全细胞膜片钳记录。兴奋性突触后电流被NBQX阻断剂(10μM)阻断，而IPSPs抑制被荷包牡丹碱(10～50μm)阻断。数据分析采用pclamp10(Clampfit)和Mini analysis(synaptosoft)

7.钙成像

除去培养基，细胞培养在22.5μM cal520(AAT BioQuest)，4.8％的DMSO，0.1％的Pluronic F-127(Life technologies)和0.05％Cremophor EL(Sigma-Aldrich公司)的正常ACSF溶液中，都是mM计(126NaCl，3KCl，1.25KH2PO4，1.3MgSO4，2.4CaCl2，26NaHCO3，10葡萄糖，在室温下30分钟。细胞轻轻地用ACSF溶液洗，在ACSF孵育额外的2分钟。钙成像数据(X20放大)在15.6赫兹使用Hamamatsu ORCA-ER digitalcamera，采用488nm(FITC)滤波器，奥林巴斯BX51WI显微镜中获得。始终保持在32℃且有新鲜的人工脑脊液(ACSF)中。在每个感兴趣的区域，在winfluor中，4000帧的延时图像依次获得。总共有22个小电影的自发钙瞬变，对1249个假定的神经元进行了分析。

8.FACS分选

hiN细胞和TF-iNs被消化和收获。温和的吹打后，细胞通过1000转离心分离沉淀，悬浮于200uL染色缓冲液(PBS，2％胎牛血清的[牛])。根据制造商的协议细胞进行染色pe-cy7-conjugated anti-cd24抗体。根据对照组的设置分选阈值。

9.单细胞基因表达分析

化合物处理3周后，hcin细胞被收集并进行细胞流式分选收集。单细胞使用Fluidigm C1单细胞自动制备系统在微流控C1集成流体通路(IFCS)中进行捕获。扩增产物用Fluidigm C1模块和单细胞CT试剂盒(Life Technologies)进行扩增。产物再进行靶基因特异反转录，然后用靶基因特异(STA)的引物的混合物进行预扩增。所使用的引物，如先前报道(Victor et al.,2014；Zhang et al.,2013)。成纤维细胞特异基因的引物，CTGF，COL1A1基因序列，DKK3和THY1可见表4.Single-cell基因表达谱使用Fluidigm生物标志物高清系统执行。STA的产物在生物标志物动态数组IFCS(Fluidigm)上进行了实时PCR分析。聚类分析是使用统计软件R针对相应基因的CT值进行的。根据中位数CT，对每一个感兴趣的基因的Ct 值进行归一化；不表达的基因即没有检测到CT值，为了计算需要，在最大检测Ct值基础上加4。

10.微阵列分析

RNA是从0.5-1×10⁶细胞中提取。总RNA，反转录，并根据按照制造商的指示与PrimeView^TMHuman Gene Expression Array(Affymetrix)进行杂交。上海欧易生物科技有限公司进行芯片杂交和全基因组表达分析，Affymetrix GeneChip Command Console(version 4.0,Affymetrix)用于分析阵列图像来获得原始数据。接下来，用GeneSpring软件(版本12.5，安捷伦科技)来完成原始数据的基本分析。聚类分析是采用欧氏距离矩阵和完全连锁聚类方法显示出hcin细胞(14天)比成人成纤维细胞HAFs高10倍的选定的基因。后来，≥2倍的差异表达基因的表达水平的变化应用DAVIDBioinformatics Resources进行GO生物信息学分析。

11.实时定量聚合酶链反应

总RNA样品，用Trizol(西格玛奥德里奇)根据制造商的指示抽提。1μg RNA用于每个反应，用随机引物和逆转录酶cDNA(Promega)进行反转录。加入2x HotStart SYBR GreenqPCR Master Mix和SYBR绿色(EXCELL，mb000-3013)，实时定量PCR的特异性引物，在mx3000p Stratagene的PCR仪进行qpCR。相对表达水平用内参基因(HPRT)进行归一。引物信息见表4。

12.酶联免疫分析法

对细胞培养基中的人Aβ40积累和Aβ42根据制造商的指示，用ELISA试剂盒进行定量(Invitrogen)。培养14天收获培液。对从三个独立的实验中收集的样品进行了测量，并显示数据平均值±标准误。

13.Western免疫印迹

细胞hcin和TF-iNs用冷PBS洗涤和Laemmli缓冲裂解，然后细胞裂解物在SDS-PAGE上进行跑胶分离，并转移至硝酸纤维素膜上。初级抗体分别如下：兔anti-p-gsk-3β(1:1000，Cell signaling Technology)，鼠标anti-t-gsk-3β(1:1000，Cell signalingTechnology)，鼠标anti-p-tau(1:1000，at-180，Thermo Scientific)，鼠标anti-t-tau(1:1000，Thermo Scientific)和兔抗肌动蛋白(1:1000，sigma)。膜检测是由二抗结合到一个cw800荧光探针(Rockland)上，使用红外成像系统(奥德赛，LI-COR)进行检测。

14.统计分析

所有量化的数据进行统计分析，并显示数据平均值±标准误。单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验被用于进行统计学意义P值计算，除非另有说明。

实施例1小分子化合物诱导人成年成纤维细胞为神经细胞

初始的人纤维细胞(HAFs，FS090609，来自一个28岁的男性包皮)没有发现有神经细胞的污染(如图5A所示)。

然后我们在神经元诱导培液中用VCR来处理，发现：单纯采用VCR作用于初始的人纤维细胞，没有检测到任何类似神经元的细胞。亦即，单纯采用VCR作用于初始的人纤维细胞，是不能够将其诱导分化为神经细胞的。所述VCR的组成及含量为：VPA，0.5mM(Calbiochem公司，676380，1M的储液，H₂O)；CHIR-99021，3μM(Axon，1386，10mM的储液，DMSO)；RepSox，1μM(Biovison，1894，10mM的储液，DMSO)。

于是我们采用所述VCR加上如表1所示的化合物构成化合物组合物，来处理HAFs(初始的人纤维细胞，FS090609)。

表1

结果发现，VCRF(VCR+Foskolin)处理诱导出双极的类似神经元的细胞形态。这些VCRF处理以后获得的双极类似神经元的细胞甚至能够在第7天的时候表达Tuj1(如图5B所示)。但是，细胞圆形凸起的胞体并不像典型的神经元形态暗示这一转变只是部分的并且不高效的。

因此，我们又加入了其他化合物，构成新的组合物来促进神经元转化。我们发现小分子SP600125(S)、Go6983(G)and Y-27632(Y)能够在VCRF基础上帮助神经元转化，且导致产生具有类似神经元形态的Tuj1阳性细胞。形成的新的化合物组合物VCRFSGY处理在诱导HAFs产生神经细胞过程中显示最高的潜能。VCRFSGY诱导7天以后我们发现明显有一部分活细胞表现出典型的神经元形态并且表达Dcx,Tuj1和Map2的神经元标记(如图1A-1C所示)。

大多数的诱导的神经元细胞存活到10-12天，便停止发展更为成熟的神经元。然后，我们筛选了其他的化学物，促进神经元的存活和成熟。

当我们将诱导培养基替换成神经元的成熟培养基，并添加CHIR-99021(C)，Forskolin(F)和Dorsomorphin(D)和额外的神经营养因子(BDNF，GDNF和NT3)，神经元细胞的存活和发育均明显改善。在2周或3周，诱导神经细胞染色阳性神经元标记物NeuN和成 熟蛋白突触素(Syn)(如图1D-1I所示)。所得到的人-化合物-诱导的-神经细胞，我们简称他们为hcin细胞。

表2

我们优化了每个小分子的剂量(表2)，发现当VCRFSGY中，V的终浓度为0.2-1mM； C的终浓度为：0.5-5μM；R的终浓度为1-20μM；F的终浓度为1-20μM，S的终浓度为1-20μM,G的终浓度为1-20μM,Y的终浓度为1-20μM时，均能取得良好的诱导效果。更优选，VCRFSGY的组成及各个成分的终浓度为：V的终浓度为0.2-1mM；C的终浓度为：0.5-5μM；R的终浓度为1-20μM；F的终浓度为1-20μM，S的终浓度为5-20μM,G的终浓度为1-20μM,Y的终浓度为1-20μM。0.5mM VPA的剂量，3μM CHIR-99021，1μM RepSox，10μM forskolin，10μM SP600125，5μMGo6983，5μM Y-27632能诱导～8％Tuj1阳性hcin细胞(表2)。此外，化学处理的时程也进行了优化。发现处理时长为4～8天时，诱导效果均可以。优选，6～8天。但是，8天VCRFSGY治疗导致诱导率最高(如图5C所示)。超过80％TUJ1阳性细胞表达阳性，而GABA能，胆碱能和多巴胺能神经元较少见(如图1G和图5D所示)。我们把VCRFSGY的诱导方法应用于8个来自不同性别，年龄和代数的人成纤维细胞(表3)。每个人的成纤维细胞的转化效率相当如图5E和表3。这些结果表明，我们的化合物组合物可以重复诱导人成纤维细胞产生神经细胞。

表3

接下来我们测试用我们的化合物诱导策略，是否诱导的hcin细胞，绕过了神经祖细胞 阶段。利用实时定量PCR和免疫组化分析对RNA表达分析表明，神经祖细胞基因Sox2，PAX6，Foxg1或nestin蛋白在细胞诱导过程中从未表达(如图1F和1G)。有趣的是，我们发现，增殖分子标记Ki67检测自第3天(如图5H所示)，这表明，我们的化学物诱导方法可能触发人成纤维细胞快速退出细胞周期，转化人成纤维细胞成hcin细胞可能是直接的，不需要经历神经祖细胞阶段的。

实施例2hcin细胞的生理特性

为了测试hciN是否具有基本电生理特性的神经元，如发放动作电位和膜电流，我们在第14天对化学处理的具有复杂的神经元形态hcin细胞进行了全细胞膜片钳记录。记录了88％hcin细胞(N＝89)膜去极化电流钳模式下产生的重复动作电位(图2A和图6C)。去极化电压的步骤在电压钳模式引起快钠内向电流(图2B；93％，n＝15)。此外，快速能被内向电流的钠通道阻断剂河豚毒素(TTX)完全阻断。为了测试是否hcin细胞有功能性的谷氨酸和GABA受体，我们给予hcin细胞外源谷氨酸(图2C，左面板；50％，n＝10)和γ-氨基丁酸(图2C，右面板；67％，n＝9)发现诱导的内向电流，指示功能性谷氨酸和GABA受体是存在于hcin细胞的。据报道星形胶质细胞共培养神经细胞，能促进神经元的成熟和突触的形成并提供神经营养因子(Chanda等人，2014)。因此，我们感染慢病毒编码的绿色荧光蛋白(GFP)并将GFP阳性细胞(vcrfsgy hcin处理后6天)种到一个单层星形胶质细胞培养。铺细胞两周后，我们进行了全细胞膜片钳记录GFP阳性的成熟神经元形态的hcin(图2D，顶部面板)。自发性突触后电流(spscs)记录(图2D；31％，n＝26)，表明hcin细胞可形成功能性突触。此外，对spscs动力学分析证明hcin细胞具有快速衰减sEPSCs和慢衰减sIPSCs(图2D，图6A)。荷包牡丹碱可选择性阻断慢衰减后sEPSCs(图2B)，而NBQX消除快速衰减sEPSCs(数据未显示)，表明GABA和谷氨酸在hcin细胞突触的存在。综上所述，这些结果表明小分子诱导hcin细胞为功能性神经元。

为了进一步检验我们的化学诱导方法的可靠性，我们记录更多hcins细胞系，比较hcin细胞，hiPSC衍生的神经元和TF诱导神经元的电生理特性(图2E-2H)。生理特性的差异不明显，关于AP振幅，AP阈值和静息膜电位(RMP)。虽然hiPSC衍生的神经元和TF诱导的神经元有一些细胞系之间的偏差，但均与hcin细胞的整体生理特性相似。

膜片钳分析仅定量了一小部分细胞。为了在立即监测大量的细胞的活动，我们把hcin细胞(单层星形胶质细胞共同培养)处理cal520，一个敏感的Ca²⁺指示剂(图2)。Hcins显示强大的自发钙瞬变(图2J-2K)，这表明hcin神经网络相当活跃。Hcins发放自发钙瞬 变率与衍生的神经元IPSC差异不显著(图2)。

实施例3hcin细胞具有神经元的基因表达特征

为了进一步表征hcin细胞类型，我们使用FluidigmBiomark定量分析25个神经元基因和7个非神经元的基因在单细胞水平的表达。TF诱导神经元(Ladewig et al.,2012)作为阳性对照(图7A)。在21天的细胞培养的hcin和TF-iN FACS分选(FACS纯化，图3B和7C)。热图分析表明，hcins主要神经元的基因，通道基因和突触的基因持续表达，但胶质特异基因和成纤维细胞特异性基因不表达(图3A)。hcin细胞与TF诱导的神经元的表达模式相似，但区别于初始成纤维细胞。

所用到的引物如表4所示。

我们进一步比较HES衍生神经元(对照神经元)，HAFS，pre-hcin细胞(Vcrfsgy处理HAFs，在第3天和第7天)和hcin细胞(诱导14天vcrfsgy)的微阵列分析的全基因表达模式。分层聚类分析的全基因组的热图显示hcin细胞及其初始细胞差异显著，而hcin细胞和对照神经元之间相似(图3B)。这里值得注意的是，许多代表神经元特异性基因的标记包括NCAM1，DCX，MAP2，ASCL1和NEFL强烈上调(图3C，左面板和图7D)，而胶质基因是几乎不变(图3C，中间面板)。有趣的是，观察vcrfsgy处理的HAFs早在第3和7天也上调了一些神经元的基因(图7E)。此外，成纤维细胞特异表达基因包括COL12A1，tgfb1i1，Thy1和CTGF的显著下调(图3C，右面板和3F)(Kim et al.,2010)。对超过两倍的变化的进行进一步的基因本体(GO)功能富集分析。我们发现，不同批次来源的HciN和对照神经元共同表达的核心集，主要与神经元分化，突触与突触传递相关(图3D)。另一方面，hcin细胞与HAFs相比，细胞外区域相关的基因表达，细胞外基质和细胞运动调节基因明显下调(图7G)。

我们进一步检测在我们的诱导方法中每个分子的下游分子事件，如图所示(图8A)，我们发现一些小分子可以提高神经元的基因表达和下调成纤维细胞特异基因的表达COL1A1，DKK3、THY1和ctgf。进一步，我们从我们的化学鸡尾酒分别删除每个小分子，我们发现，从化学鸡尾酒除去CHIR-99021或SP600125没有神经元的基因表达，但成纤维细胞的基因表达下调仍然可以被观察到，表明CHIR-99021和SP600125(图8B)参与神经元基因表达调控的关键过程。这些结果进一步说明，每个分子在化合物组合中协调运作促进一个成功的神经转换(图7H)。

实施例4通过小分子化合物将家族性阿尔兹海默症病人的成纤维细胞诱导成神经细胞(hciNs)

为了检测我们的化合物组合诱导的方法产生的神经细胞(hciNs)是否可以用于神经性疾病模型的构建，我们将携带APP(V717I)突变和早老素(I167del,A434T or S169del)(Goate et al.,1991；Guo et al.,2010；Jiao et al.,2014；Kondo et al.,2013；Qianget al.,2013)的家族性阿尔茨 海默病(家族性阿尔兹海默症病人)病人的成纤维细胞诱导成神经细胞。这些由家族性阿尔兹海默症病人的成纤维细胞诱导而来的神经细胞(hciNs)细胞和由正常成纤维细胞诱导的神经细胞(hciNs)表现出相同的神经细胞特征(图4A)。诱导效率也相当(图5E)。

Muratore et al宣称携带APPV717I(FAD109)隐性突变的由诱导多能干细胞来源的神经元提升了Aβ42,Aβ38的水平以及Aβ42/40比例。但是Aβ40的水平与对照相比并没有显著性的上升。并能检测出了较高水平的总的tau和磷酸化tau的水平，但是p-S262(12E8)vs总的Tau水平只在分化晚期有上调(Muratore et al.,2014)。Terwel et al陈述了GSK3活跃水平在APPV717I老鼠脑内比其年龄相仿的对照小鼠要高，但是在人的突变的神经元内由于没有进一步的探索还不能预测(Terwel etal.,2008)。我们测量了由家族性阿尔兹海默症病人成纤维细胞诱导的神经细胞(hciNs)细胞的胞外水平的Aβ40and Aβ42水平，发现与TF-iNs相比与之前的研究相似，与由健康人诱导得来的神经细胞(hciNs)细胞相比由家族性阿尔兹海默症病人109(APP V717L)成纤维细胞诱导的神经细胞(hciNs)胞外Aβ42水平和Aβ42/Aβ40比例都有所上升(图4B-4D)。由新报道的在早老素上有突变(I167del orS169del)(Jiao et al.,2014)的家族性阿尔兹海默症病人诱导的神经细胞(hciNs)细胞的胞外Aβ42水平同样也有提升。然而对于家族性阿尔兹海默症病人132(PS1A434T)病人诱导的神经细胞(hciNs)胞外的Aβ水平我们没有观测到明显的变化。Aβ水平在成纤维细胞中明显比诱导神经元细胞要低得多。我们发现磷酸化的tau和总tau在原成纤维细胞的水平非常低(图5I)然而，磷酸化的tau在家族性阿尔兹海默症病人109神经细胞(hciNs)s中却比对照要高，反之，其他三个携带早老蛋白突变的家族性阿尔兹海默症病人神经细胞(hciNs)s(家族性阿尔兹海默症病人131，家族性阿尔兹海默症病人132和家族性阿尔兹海默症病人A16)磷酸化的tau和总tau并没有显示有明显变化(图4E)。令人惊奇的是，活跃的GSK-3β的量在所有四个家族性阿尔兹海默症病人神经细胞(hciNs)s和TF-INS与正常神经细胞(hciNs)s和TF-INS是类似的(图4E)。这些结果表明，该化合物诱导策略可能是生成患者特异性神经元细胞的可行性方法，这为神经系统疾病模型的构建，相关机制研究提供一个有用的可行的方法。

实施例5

为了进一步改良化合物诱导成纤维细胞向神经细胞的转化，在前述实施例中七个化合物VCRFSGY的基础上，我们通过分别添加其他小分子形成新的化合物组合来进一步优化诱导效率，这些小分子包括BIX01294；RG108；视黄酸Retinoic Acid；反苯环丙胺Parnate；Calcitrio；Hh-Ag,Kenpaullone；LDN193189；Noggin。在新的化合物组合中，所涉及小分 子，各自的工作终浓度如下：BIX(BIX01294)0.2μM；RG(RG108)10μM；RA(RetinoicAcid)1μM；PAR(Parnate)2μM；Cal(Calcitriol)10μM；Hg(Hh-Ag)0.5μM；Ken(Kenpaullone)0.5μM；LDN(LDN193189)0.25μM；Nog(Noggin)50ng/ml。

结果如图9所示，在VCRFSGY的基础上，分别加入反苯环丙胺Parnate、视黄酸Retinoic Acid所形成的组合物可以一定程度的提高转化的效率。

此外，还考察了在组合物中，视黄酸Retinoic Acid的终浓度为0.1uM和10uM时，也取得了当视黄酸Retinoic Acid的终浓度为1μM的诱导效率。因此，在组合物中，视黄酸Retinoic Acid的终浓度在0.1～10uM时，均能够取得很好的诱导效率。

此外，还考察了在组合物中，反苯环丙胺Parnate的终浓度为0.1uM和10uM时，也取得了当反苯环丙胺Parnate的终浓度为2μM的诱导效率。因此，在组合物中，反苯环丙胺Parnate的终浓度为0.1～10uM时，均能够取得很好的诱导效率。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (14)

1.一种诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物，主要药效成分含有VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632，且VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632的摩尔比为：(200-1000)：(0.5-5)：(1-20)：(1-20)：(1-20)：(1-20)：(1-20)。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、、Go6983和Y-27632的摩尔比为：(200-1000)：(0.5-5)：(1-20)：(1-20)：(5-20)：(1-20)：(1-20)。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632的摩尔比为：500：3：1：10：10：5：5。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，每1000ml所述药物组合物中，含有0.2-1mmol VPA、0.5-5μmol CHIR-99021、1-20μmol RepSox、1-20μmol Forskolin、1-20μmol SP600125、1-20μmol Go6983、1-20μmol Y-27632。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，每1000ml所述药物组合物中，含有0.2-1mmol VPA、0.5-5μmol CHIR-99021、1-20μmol RepSox、1-20μmol Forskolin、5-20μmol SP600125、1-20μmol Go6983、1-20μmol Y-27632。

6.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，每1000ml所述药物组合物中，含有0.5mmol VPA、3μmol CHIR-99021、1μmol RepSox、10μmol Forskolin、10μmol SP600125、5μmol Go6983、5μmol Y-27632。

7.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物中，主要药效成分含有VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632，以及Retinoic Acid。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，每1000ml所述药物组合物中，含有Retinoic Acid 0.1～10umol。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的药物组合物中，主要药效成分含有VPA、CHIR-99021、RepSox、Forskolin、SP600125、Go6983和Y-27632，以及Parnate。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在在于，每1000ml所述药物组合物中，含有Parnate 0.1～10umol。

11.根据权利要求1～10任一权利要求所述的药物组合物在体外诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化中的用途。

12.一种诱导成纤维细胞直接向神经细胞转化的方法，所述方法包括步骤：将如权利要求1～10任一权利要求所述的药物组合物施用于成纤维细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述成纤维细胞为人成纤维细胞。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述人成纤维细胞选自健康人的人成纤维细胞或家族性阿尔茨海默病患者的人成纤维细胞。