CN112384613A - 神经样细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的主要课题在于：提供一种无需人工导入基因的由体细胞制备神经样细胞的方法，或通过该方法制备的神经样细胞，或包含可用于该制备方法的化学物质的组合的组合物。关于本发明，举例而言，包括一种神经样细胞的制备方法或通过此方法制备的神经样细胞，所述方法包括在TGF‑β抑制剂和BMP抑制剂存在的基础上，再加入选自cAMP诱导剂、GSK3抑制剂、Erk抑制剂和p53抑制剂中的任意三种以上的条件下对体细胞进行培养的工序，其中所述TGF‑β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。通过本发明获得的神经样细胞可用于再生医学等方面。

Description

神经样细胞的制备方法
技术领域
本发明属于再生医学或体细胞的基因直接重组(Direct Reprogramming)的技术领域。在该技术领域中，本发明主要涉及使用低分子化合物，由体细胞直接制备神经样细胞的方法，以及通过这种制备方法制备的低分子化合物诱导性神经样细胞(CiNCs：Chemicalcompound-induced neuronal cells)。本发明还涉及所述神经样细胞和可用于所述制备神经样细胞的方法的组合物。
背景技术
近年细胞相关研究的发展，特别是与多能性细胞有关的研究，使得获得可用于移植到个体的治疗用细胞在质量和数量层面上成为可能。对于某些疾病，已经开始尝试将对治疗有效的细胞移植到患者体内。
间充质细胞形成生物的各种器官，例如肌肉、骨骼、软骨、骨髓、脂肪和结缔组织，有望用作再生医学的材料。间充质干细胞(mesenchymal stem cell：MSC)是存在于诸如骨髓、脂肪组织、血液、胎盘和脐带等组织中的未分化的细胞。由于其具有分化为间充质类的细胞的能力，因此间充质干细胞作为制造这些细胞的起始材料而受到关注。另外，利用间充质干细胞自身来重建骨骼、软骨、心肌等的再生医学也正在被探讨。
另一方面，将诸如成纤维细胞的体细胞直接转化为另一细胞的方法也已经被报道。例如，非专利文献1报道了通过将CHIR99021(GSK3抑制剂)、PD0325901(Erk抑制剂)、SB431542(TGF-β抑制剂)、LDN193189(BMP抑制剂)、Pifithrin-α(p53抑制剂)和毛喉素(Forskolin，cAMP诱导剂)这6种低分子化合物与成纤维细胞共同培养，可以获得神经样细胞。专利文献1公开了以下发明：除了在所述六个低分子化合物中，用多索吗啡(Dorsomorphin，AMPK抑制剂，BMP抑制剂)代替了Pifithrin-α(p53抑制剂)之外，其他以相同的方式，进行由成纤维细胞得到神经样细胞的基因直接重组。
此外，非专利文献2也报道了通过将丙戊酸(HDAC抑制剂)，CHIR99021(GSK3抑制剂)，来普索(TGF-β抑制剂)，毛喉素(cAMP诱导剂)，Y-27632(ROCK抑制剂)，SP600125(JNK抑制剂)和DMH1(BMP抑制剂)这样的低分子化合物组合，来进行由人肺成纤维细胞得到神经样细胞的基因直接重组。
现有技术文献
专利文件
专利文献1：国际公开第2018/062269号
非专利文件
非专利文献1：Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition，2015,Vol.56,No.3,pp.166-170。
非专利文献2：International Journal of Molecular Medicine,2018,Vol.41,pp.1463-1468。
发明内容
本发明所要解决的技术问题
直接由体细胞转化为所需细胞而不引入基因的方法作为获得治疗用细胞的手段有时是有效的选择。关于神经样细胞也是同样，如非专利文献1和专利文献1中所报道的，有直接由人成纤维细胞进行诱导的发明，但是这些方法的诱导大约需要2～3周，因此需要一种可以更快进行诱导的方法。
本发明是在不人工导入基因的情况下将体细胞更快速地直接地诱导成神经样细胞的方法，即以提供一种能够由体细胞更快地直接制备神经样细胞的方法为主要课题。
解决技术问题的技术手段
作为锐意研究的成果，本发明的发明人发现，通过使用选择性ALK5抑制剂作为TGF-β抑制剂，可更快速地进行由体细胞向神经样细胞的直接转化，从而完成了本发明。
本发明，举例而言，包括以下的内容。
项1.一种神经样细胞的制备方法，
其包括在TGF-β抑制剂和BMP抑制剂的存在下对体细胞进行培养的工序，其中所述TGF-β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。
项2.一种神经样细胞的制备方法，
其包括在TGF-β抑制剂和BMP抑制剂这两种和选自cAMP诱导剂、GSK3抑制剂、Erk抑制剂和p53抑制剂中的任意三种以上的存在下对体细胞进行培养的工序，其中所述TGF-β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。
项3.根据项1或2所述的神经样细胞的制备方法，其中，所述BMP抑制剂是ALK2·3抑制剂。
项4.根据项1至3中任一项所述的神经样细胞的制备方法，其中，所述TGF-β抑制剂是RepSox(CAS号：446859-33-2)，并且/或者所述BMP抑制剂是LDN193189(CAS号：1062368-24-4)和/或多索吗啡(CAS号：866405-64-3)。
项5.根据项1至4中任一项所述的神经样细胞的制备方法，其中，所述cAMP诱导剂是毛喉素(CAS号：66428-89-5)，所述GSK3抑制剂是CHIR99021(CAS号：252917-06-9)，所述Erk抑制剂是PD0325901(CAS号：391210-10-9)，或者所述p53抑制剂是Pifithrin-α(CAS号：63208-82-2)。
项6.根据项1至5中任一项所述的神经样细胞的制备方法，其中，所述工序是在不存在生长因子和/或细胞因子的情况下对体细胞进行培养的工序。
项7.根据项1至6中任一项所述的神经样细胞的制备方法，其中，所述工序是在不存在与组蛋白相关的成分的情况下对体细胞进行培养的工序。
项8.根据项1至7中任一项所述的神经样细胞的制备方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
项9.一种神经样细胞，其通过项1至8中任一项所述的神经样细胞的制备方法而制备。
项10.一种用于由体细胞制备神经样细胞的组合物，其包含TGF-β抑制剂和BMP抑制剂，其中所述TGF-β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。
项11.一种用于由体细胞制备神经样细胞的组合物，其包含TGF-β抑制剂和BMP抑制剂，以及选自cAMP诱导剂、GSK3抑制剂、Erk抑制剂和p53抑制剂中的任意三种以上，其中，所述TGF-β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。
项12.根据项10至11所述的组合物，其中，所述BMP抑制剂是ALK2·3抑制剂。
项13.根据项10至12中任一项所述的组合物，其中，所述TGF-β抑制剂是RepSox(CAS号：446859-33-2)，并且/或者所述BMP抑制剂是LDN193189(CAS号：1062368-24-4)和/或多索吗啡(CAS号：866405-64-3)。
项14.根据项10至13中任一项所述的组合物，其中，所述cAMP诱导剂是毛喉素(CAS号：66428-89-5)，所述GSK3抑制剂是CHIR99021(CAS号：252917-06-9)，所述Erk抑制剂是PD0325901(CAS号：391210-10-9)，或者所述p53抑制剂是Pifithrin-α(CAS号：63208-82-2)。
项15.根据项10至14中任一项所述的组合物，其中，所述所述体细胞为成纤维细胞。
发明效果
根据本发明，可在比非专利文献1、专利文献1中记载的制备方法更短的时间内由体细胞(特别是成纤维细胞)制备神经样细胞。通过本发明获得的神经样细胞可用于再生医学等。
附图说明
图1是培养后的人成纤维细胞的照片。Day4、6和11分别显示培养开始后第4、6和11天的结果。
图2是培养开始后第4天的细胞照片。
图3是培养开始后第8天的细胞照片。
图4是培养后的人成纤维细胞的抗体染色照片。左两个图显示了开始培养后第14天的比较例2的结果，右两个图显示了开始培养后第7天的实施例1的结果。
图5是培养后的人成纤维细胞的照片。上面的3张图显示了比较例4的结果，中间的3张图显示了比较例2的结果，下面的3张图显示了实施例8的结果。左边的3张图显示了开始培养后第5天(Day5)的结果，中间的3张图显示了开始培养后第8天(Day8)的结果，右边的3张图显示了开始培养的第11天(Day11)的结果。
本发明的具体实施方式
在下文中，将详细说明本发明。
1制备神经样细胞的方法
根据本发明的神经样细胞的制备方法(以下称为“本发明的制备方法”)，其包括在TGF-β抑制剂和BMP抑制剂存在的条件下对体细胞进行培养的工序，其中该TGF-β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。或者，本发明的制备方法包括在TGF-β抑制剂和BMP抑制剂这2种抑制剂存在的基础上，再加入选自cAMP诱导剂、GSK3抑制剂、Erk抑制剂和p53抑制剂这四种中的任何三种以上的条件下培养体细胞的工序，其中TGF-β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。
在本发明的制备方法中，BMP抑制剂为ALK2·3抑制剂较为理想。此外，在本发明的制备方法中，TGF-β抑制剂是RepSox(CAS号：446859-33-2)，并且/或者BMP抑制剂是LDN193189(CAS号：1062368-24-4)和/或多索吗啡(CAS号：866405-64-3)更为理想，另外，cAMP诱导剂是毛喉素(CAS号：66428-89-5)，GSK3抑制剂是CHIR99021(CAS号：252917-06-9)，Erk抑制剂是PD0325901(CAS号：391210-10-9)，或者p53抑制剂Pifithrin-α(CAS号:63208-82-2)更为理想。
在本发明的制备方法中，只需要在所述抑制剂和诱导剂中的任意一种组合的条件下培养体细胞即可，并且如果需要，可任意添加其他的抑制剂和诱导剂来培养体细胞以制备神经样细胞。
所述抑制剂和诱导剂可以单独使用或组合使用两种以上。
特定的所述抑制剂可能具有两种以上的抑制作用，在这种情况下，可以认为存在多种抑制剂。
1.1关于体细胞
生物的细胞可分为体细胞和生殖细胞。任何体细胞都可以用作本发明的制备方法的原料。体细胞没有特别限制，可以是从活体收集的原代细胞或既定的细胞。在本发明的制备方法中，可使用处于分化的各个阶段的体细胞，例如最终分化的体细胞，处于最终分化前过程中的体细胞或已经被重编程并获得了多能性的体细胞。可在本发明的制备方法中使用的体细胞包括任何体细胞，例如造血细胞(各种淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞、骨髓细胞等)、器官来源的细胞(肝细胞、脾细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞等)、肌肉组织细胞(骨骼肌细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、心肌细胞等)、成纤维细胞、神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、间质细胞、脂肪细胞(白色脂肪细胞等)、胚胎干细胞(ES细胞等)等。另外，本发明的制备方法可以应用于这些细胞的前体细胞和癌细胞。使用成纤维细胞较为理想。
所述体细胞来源的实例包括人类、非人类哺乳动物和非哺乳动物(鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类等)，但不限于此。作为体细胞的来源，人类和非人类哺乳动物较为理想，人类更加理想。当通过本发明的方法制备神经样细胞用于人类给药时，使用从与接受者的组织相容性抗原类型相同或相似的捐献者收集的体细胞较为理想。从接受者本人收集的体细胞可以通过本发明的制备方法用于制备神经样细胞。
1.2关于本发明的抑制剂等
1.2.1 TGF-β抑制剂(选择性ALK5抑制剂)
几乎所有细胞都产生三种类型的TGF-β(transforming growth factor-β，转化生长因子β)，TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。TGF-β涉及多种细胞功能，例如抑制包括上皮细胞在内的许多细胞的增殖等对细胞增殖、转化、分化、发育、凋亡的调控。
在以上三种类型的TGF-β中，ALK5也称为TGF-β1受体。ALK5是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，当与TGFβ结合时会与II型TGFβ受体形成异二聚体复合物，并将TGFβ信号从细胞表面传递至细胞质。
在本发明中，TGF-β抑制剂选择使用选择性ALK5抑制剂，因此，“在TGF-β抑制剂存在条件下”与“在选择性ALK5抑制剂存在条件下”同义。
“在选择性ALK5抑制剂存在条件下”是指能够特异抑制ALK5的培养条件，对其手段没有特别限制，可以使用任何特异抑制ALK5的方法。在本发明中，可以使用直接作用于ALK5并抑制其功能的物质(例如，抗ALK5抗体或其他药物)，特异性地抑制ALK5自身产生的药物等。此外，如果可以特异抑制ALK5，则也可以在其上游抑制涉及ALK5的信号传输。
因此，即使是TGF-β抑制剂，除ALK5外，还广泛地抑制ALK4和7的抑制剂例如SB431542(CAS号：301836-41-9)，A83-01(CAS号：909910-43-6)不在本发明的TGF-β抑制剂的范围内。
可用于本发明的选择性ALK5抑制剂只要能够发挥其功能即可，没有特别限制，举例而言，如以下的RepSox。
RepSox(ALK5 Inhibitor，CAS号：446859-33-2)
[化学式1]
Figure BDA0002881788590000061
在本发明中，可以适当地确定选择性ALK5抑制剂的浓度，没有特别限制，例如可以是0.1μmol/L至30μmol/L，在0.5μmol/L至10μmol/L的范围内使用较为理想。
1.2.2 BMP抑制剂
BMP(Bone Morphogenetic Protein，骨形成蛋白)是属于TGF-β超家族的生长因子，并且控制胚胎和组织发育，细胞分化，细胞死亡等。BMP与细胞膜上的I型和II型受体结合形成异源四聚体，并通过转录因子SMAD的磷酸化将BMP信号传递到细胞核中。大多数BMP抑制剂是通过与BMP结合而被激活的I型受体ALK(Activin receptor-like kinase)-2,3,6来抑制SMAD的磷酸化。
在所述ALK中，ALK2是ALK家族成员的受体丝氨酸/苏氨酸激酶，位于SMAD蛋白特别是SMAD1/5/8涉及的信号传导途径的上游。内皮糖蛋白可通过ALK2-Smad1途径的激活降低前列腺癌细胞的运动能力。ALK2基因是参与渐进性骨化性纤维异常增生(FOP)的主要基因，渐进性骨化性纤维异常增生是一种罕见的常染色体显性先天性疾病，特征是在肌肉组织中渐进性形成异位骨。
ALK3是跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员。ALK3基因在PTEN(phosp hatase andtensin homologue deleted on chromosome 10)突变阴性的考登氏病中起到次要敏感性基因的作用。ALK3转运在FOP病变形成中起重要作用，并且还参与人类T细胞的分化。
“在BMP抑制剂存在条件下”是指能够抑制BMP信号传导途径的培养条件，对方法没有特别限定，可以使用任意能够抑制BMP信号传导途径的方法。在本发明中，可以使用直接作用于BMP和BMP受体并抑制其功能的物质(例如，抗BMP抗体或其他药物)或抑制其表达的药物。另外通过抑制位于涉及BMP的信号转导的下游的SMAD转录因子的表达及其翻译后修饰也可以抑制BMP信号通路。
在本发明中，在BMP抑制剂存在条件下培养体细胞，但是在BMP抑制剂中，选择在ALK2·3抑制剂存在条件下培养体细胞比较理想。
“在ALK2·3抑制剂的存在下”是指能够同时抑制ALK2和3的培养条件，对其手段没有特别限定，只要能够同时抑制ALK2和3，可以使用任何方法。在本发明中，可以使用直接作用于ALK2和3并抑制其功能的物质(例如，抗ALK2·3抗体或其他药物)，抑制ALK2和3自身产生的药物等。此外，如果可以同时抑制ALK2和3，则也可以直接抑制涉及ALK2和3的信号转导的上游。
可用于本发明的BMP抑制剂或ALK2·3抑制剂没有特别限制，只要其能够发挥其功能即可，举例而言包括以下化合物。比较理想的有例如ALK2·3抑制剂LDN193189、多索吗啡。
LDN193189(CAS号：1062368-24-4)
[化学式2]
Figure BDA0002881788590000081
多索吗啡(Dorsomorphin)(AMPK Inhibitor，也称为Compound C)(CAS号：866405-64-3)
Dorsomorphin dihydrochloride(CAS号：1219168-18-9)
DMH1(CAS号：1206711-16-1)
K02288(CAS号：1431985-92-0)
LDN212854(CAS号：1432597-26-6)
LDN193189HCl(CAS号：1062368-62-0)
ML347(CAS号：1062368-49-3)
LDN214117(CAS号：1627503-67-6)
在本发明中，BMP抑制剂或ALK2·3抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如为0.1μmol/L～10μmol/L，在0.5μmol/L～5μmol/L范围内使用较为理想。
1.2.3cAMP诱导剂
cAMP(环状单磷酸腺苷)是参与各种细胞内信号转导的物质，是第二信使。cAMP通过用腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)环化三磷酸腺苷(ATP)而在细胞中产生。
“在cAMP诱导剂的存在下”是指能够诱导cAMP的培养条件，其方法没有特别限定，例如，可以提高细胞内cAMP浓度的任何方法都可以使用。可以直接作用并诱导与cAMP产生有关的腺苷酸环化酶的物质，可以促进腺苷酸环化酶表达的物质，抑制降解cAMP的磷酸二酯酶的物质等，都可用作提高细胞内cAMP浓度的手段。也可以使用二丁酰基cAMP(dibutyryl cAMP)，它是cAMP的结构类似物，在细胞中的作用与cAMP相同。
关于可以在本发明中使用的cAMP诱导剂，只要是能够发挥其功能的物质，就没有特别限定，例如可以使用毛喉素(forskolin，CAS号：66575-29-9)和毛喉素衍生物(例如，特开2002-348243号公报)或者以下化合物等。使用毛喉素比较理想。
毛喉素(CAS号：66428-89-5)
[化学式3]
Figure BDA0002881788590000091
异丙肾上腺素(CAS号：7683-59-2)
NKH477(CAS号：138605-00-2)
PACAP1-27(CAS号：127317-03-7)
PACAP1-38(CAS号：137061-48-4)
在本发明中，cAMP诱导剂的浓度可以适当地确定，没有特别限制，例如可以在0.2μmol/L～50μmol/L的范围内使用，在1μmol/L～30μmol/L的范围内使用较为理想。
1.2.4GSK3抑制剂
GSK3(glycogen synthase kinase-3，糖原合酶激酶3)被认为是使糖原合酶磷酸化并使之失活的蛋白激酶。在哺乳动物中，GSK3被分为两种同工型，即51kDaα(GSK3α)和47kDaβ(GSK3β)。GSK3具有磷酸化各种蛋白质的活性，不仅参与糖原代谢，而且还参与诸如细胞分裂和细胞增殖等生理现象。
“在GSK3抑制剂存在条件下”是指能够抑制GSK3的培养条件，对其手段没有特别限定，可使用抑制GSK3活性的物质如抗GSK3抗体、和GSK3抑制剂这样的GSK3信号抑制手段。另外，由于当其特定位点被磷酸化时，GSK3失去活性，因此促进所述磷酸化的手段也可用于抑制GSK3信号。
可用于本发明的GSK3抑制剂没有特别限制，只要其能够发挥其功能，就没有特别限定，举例而言包括以下化合物。CHIR99021较为理想。
CHIR99021(CAS号：252917-06-9)
[化学式4]
Figure BDA0002881788590000092
BIO((2’Z，3’E)-6-Bromoindirubin-3’-oxime)(CAS号：667436-62-9)
Kenpaullone(CAS号：142273-20-9)
A1070722(CAS号：1384424-80-9)
SB216763(CAS号：280744-09-4)
CHIR98014(CAS号：556813-39-9)
TWS119(CAS号：601514-19-6)
Tideglusib(CAS号：856854-05-3)
SB415286(CAS号：264218-23-7)
Bikinin(CAS号：188011-69-0)
IM-12(CAS号：1129669-05-1)
1-Azakenpaullone(CAS号：676596-65-9)
LY2090314(CAS号：603288-22-8)
AZD1080(CAS号：612487-72-6)
AZD2858(CAS号：486424-20-8)
AR-A014418(CAS号：487021-52-3)
TDZD-8(CAS号：327036-89-5)
Indirubin(CAS号：479-41-4)
在本发明中，可以适当地确定GSK3抑制剂的浓度，没有特别的限制，例如，可以在0.1μmol/L至20μmol/L的范围内使用，0.5μmol/L至10μmol/L的范围较为理想。
1.2.5关于Erk抑制剂
Erk是被EGF(上皮生长因子)，血清刺激或者氧化应激等激活的MAPK的一个亚家族，根据涉及的信号传导途径的不同，Erk分为ERK1/2，ERK5，ERK7和ERK8。上皮生长因子受体(EGFR)之类的酪氨酸激酶受体与配体结合导致信号传递，进而导致Erk激活环中存在的TEY Motif基序磷酸化并激活。
“在Erk抑制剂的存在下”是指能够抑制Erk的培养条件，对其方式没有特别限定，可使用抑制Erk活性的物质如Erk抗体、Erk抑制剂等抑制Erk信号的方法。另外，也可以选择抑制涉及Erk激活的酶例如Erk激酶和Erk激酶激酶的方法来抑制Erk。
可以在本发明中使用的Erk抑制剂没有特别限制，只要其可以发挥功能即可，其实例包括以下化合物。PD0325901较为理想。
PD0325901(CAS号：391210-10-9)
[化学式5]
Figure BDA0002881788590000111
Olomocine(CAS号：101622-51-9)
[化学式6]
Figure BDA0002881788590000112
Aminopurvalanol A(CAS号：220792-57-4)
[化学式7]
Figure BDA0002881788590000113
AS703026(CAS号：1236699-92-5)
AZD8330(CAS号：869357-68-6)
BIX02188(CAS号：334949-59-6)
BIXO2189(CAS号：1265916-41-3)
CI-1040(CAS号：212631-79-3)
Cobimetrilib(CAS号：934660-93-2)
GDC-0623(CAS号：1168091-68-6)
MEk162(CAS号：606143-89-9)
PD318088(CAS号：391210-00-7)
PD98059(CAS号：167869-21-8)
Refametinib(CAS号：923032-37-5)
RO4987655(CAS号：874101-00-5)
SCH772984(CAS号：942183-80-4)
Selumetinib(CAS号：606143-52-6)
SL327(CAS号：305350-87-2)
曲美替尼(Trametinib，CAS号：871700-17-3)
ARRY-142886(CAS号：606143-52-6)
XL518(CAS号：934660-93-2)
RDEA119(CAS号：923032-38-6)
在本发明中，可以适当地确定Erk抑制剂的浓度，没有特别限制，例如可以在0.1μmol/L至10μmol/L的范围内使用，在0.2μmol/L至5μmol/L的范围内较为理想。
1.2.6p53抑制剂
P53是最重要的癌症抑制基因之一，它抑制细胞增殖，在癌症控制中发挥重要作用。此外，应答各种压力并激活靶基因，是细胞周期停滞，凋亡，DNA修复，细胞衰老等的起点。
“在p53抑制剂存在下”是指能够抑制p53的培养条件，对其手段没有特别限定，可以使用能够抑制p53的任何方法。在本发明中，可以使用直接作用于p53并抑制其功能的物质(例如，抗p53抗体或其他药物)，抑制p53自身表达的药物等。另外，还可以通过在上游抑制涉及p53的信号转导来抑制p53。
作为在本发明中可使用的p53抑制剂，只要可以发挥其功能，则没有特别限定，例如可以使用以下的化合物。Pifithrin-α较为理想。
Pifithrin-α(CAS号:63208-82-2)
[化学式8]
Figure BDA0002881788590000131
Pifithrin-β(CAS号：511296-88-1)
Pifithrin-μ(CAS号：64984-31-2)
NSC66811(CAS号：6964-62-1)
Nultin-3(CAS号：548472-68-0)
在本发明中，可以适当地确定p53抑制剂的浓度，没有特别限制，例如，可以在0.5μmol/L至30μmol/L的范围内使用，在1μmol/L至10μmol/L的范围内较为理想。
1.3其他理想条件
尽管在本发明中没有特别限制，但是在制备过程中，在不存在生长因子和/或细胞因子的情况下培养体细胞较为理想。不存在生长因子和/或细胞因子是指实质上不存在生长因子和/或细胞因子，不仅指完全不存在生长因子和/或细胞因子的情况，也包括生长因子和/或细胞因子以极其微量存在的情况。作为在不存在生长因子和/或细胞因子的情况下培养体细胞的优点，可举出可廉价地制备神经样细胞。
生长因子是促进体内特定细胞增殖、分化的内源性蛋白质的总称。细胞因子是由免疫系统细胞分泌的蛋白质，负责无特定靶细胞的信号传递。许多细胞因子与免疫、炎症有关，有些与细胞增殖，分化，细胞死亡或伤口愈合有关。需要说明的是，一些生长因子也包含在细胞因子中，并不是相互排斥的概念。
生长因子包括上皮生长因子(Epidermal Growth Factor：EGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor：IGF)、转化生长因子(Transforming Growth Factor：TGF)、神经生长因子(Nerve Growth Factor：NGF)、血管内皮细胞增殖因子(VisualEndotherial GrowtFactor：VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast GrowthFactor：bFGF)和肝细胞增殖因子(basic Fibroblast Growth Factor：HGF)等。
细胞因子包括白介素(Interleukin：IL)、干扰素(Interferon：IFN)、瘦素(leptin)等。
尽管在本发明中没有特别限制，但是在制备过程中在不存在与组蛋白有关的成分的条件下培养体细胞较为理想。不存在与组蛋白有关的成分的条件下是指与组蛋白有关的成分实质上不存在，不仅指与组蛋白有关的成分完全不存在的情况，还包括与组蛋白有关的成分微量存在的情况。与组蛋白有关的成分有例如组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(如丙戊酸)等。在不使用被认为通过核重编程因子促进重编程的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的情况下，诱导可能导致意外分化的多能细胞的风险会降低。
1.4体细胞培养
本发明的制备方法中的体细胞培养，选择与体细胞的类型对应的培养基、温度和其他条件，并在所述各种抑制剂(在某些情况下还包括诱导剂或活化剂)的存在下实施即可。培养基可以选择公认的培养基或可商购的培养基。例如，作为普通培养基的MEM(最低必需培养基)，DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基，Dulbecco's Modified Eagle Medium)，DMEM/F12，又或者是对这些改良的培养基加入适当的成分(血清，蛋白质，氨基酸，糖，维生素，脂肪酸，抗生素等)来使用。
在本发明中，由体细胞制备神经样细胞。脑源性神经营养因子(BDNF；Brain-Derived Neurotrophic Factor)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF：Glial cell-Derived Neurotrophic Factor)、cAMP、抗坏血酸、抗坏血酸-2-磷酸等是已知的对于诱导分化为神经样细胞有效的物质。作为诱导分化为神经样细胞的有效物质，例如，可使用市售的诱导剂作为分化诱导剂。在本发明中，也可以在所述物质的存在下培养体细胞。
作为培养条件，选择一般的细胞培养条件即可。以37℃和5％CO2的条件为例。在培养期间以适当的间隔(每1至7天一次较为理想，每3天至4天一次更为理想)更换培养基较为理想。当使用成纤维细胞作为材料进行本发明的制备方法时，在37℃和5％CO2的条件下4天至1周内出现神经样细胞。通过选择易于培养的体细胞，也可以将预先增加其细胞数量的体细胞转化为神经样细胞。因此，大量制备神经样细胞也很容易。
为了培养体细胞，可以使用细胞培养容器，例如板、皿、细胞培养瓶、细胞培养袋等。需要说明的是，关于细胞培养袋，具有透气性的袋较为理想。如果需要大量细胞，则可以使用大型培养箱。培养可以在开放系统或封闭系统中进行，但是当目的是将获得的神经样细胞施用于人时，在封闭系统中进行培养较为理想。
在本发明的制备方法中，通过在含有所述各种抑制剂等的培养基中培养体细胞，可以通过一步培养由体细胞制备神经样细胞。
1.5神经样细胞
通过本发明的所述制备方法，可获得含有神经样细胞的细胞集团。通过本发明的制备方法制备的神经样细胞也在本发明的范围内。通过本发明的制备方法制备的神经样细胞没有特别限制，举例而言包括神经细胞(神经元)，神经胶质细胞(星形胶质细胞，少突胶质细胞，小胶质细胞)和施万细胞等。除所述最终分化的细胞外，还包括旨在分化为神经样细胞的前体细胞。
通过本发明的制备方法制备的神经样细胞可以通过例如细胞的形态变化来确认。由于神经样细胞根据细胞的类型具有特征性的形态，因此通过比较培养前后的细胞形态可以判别神经样细胞的存在。此外，也可以通过检测神经样细胞的特征分子，例如酶，受体或低分子化合物，来确认神经样细胞的存在。具有神经样细胞特征的分子包括β3-微管蛋白、突触素I、囊泡型谷氨酸转运蛋白(vesicular glutamate transporter:vGULT)、微管相关产物(microtubule-associated protein：MAP)2、γ-氨基丁酸(GABA)、酪氨酸羟化酶等，且不限于此。
可以使用检疫方法(通过抗体检测)来检测所述分子，也可以通过定量蛋白质分子的mRNA的量来进行检测。识别神经样细胞特征分子的抗体也可用于分离和纯化通过本发明方法获得的神经细胞。
通过本发明的制备方法制备的神经样细胞可用于例如治疗神经系统疾病。神经系统疾病包括但不限于脊髓损伤，脑血管疾病(脑梗塞等)，帕金森氏病，阿尔茨海默氏病，肌萎缩性侧索硬化症等。可使用通过本发明的制备方法制备的神经样细胞来制备用于治疗神经系统疾病的药物组合物。
当通过本发明的制备方法制备的神经样细胞用作药物组合物时，根据常规方法，通过将神经样细胞与药学上可接受的载体混合来制备适于个体给药形态的制剂即可。载体举例而言包括通过加入生理盐水、葡萄糖或其他辅助剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)制成等渗的注射用蒸馏水。另外，可以和缓冲剂(例如磷酸盐缓冲剂、乙酸钠缓冲剂)、舒缓剂(例如苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因(Procaine Hydrochloride)等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂、抗氧化剂等混合。
通过本发明的制备方法制备的神经样细胞也可进一步与有效发挥神经样细胞功能和改善移植能力的其他细胞和成分组合制成组合物。
此外，通过本发明的制备方法制备的神经样细胞还可在筛选作用于神经样细胞的候选药物、候选药物的安全性评估中使用。根据本发明的制备方法，由于可以通过一次操作获得大量的神经样细胞，因此可以获得不受细胞批次差异影响的可再现的研究结果。
2组合物
本发明中的组合物(以下称为“本发明组合物”)是用于由体细胞制备神经样细胞的组合物，其包含TGF-β抑制剂和BMP抑制剂，其中该TGF-β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。或者，本发明组合物在包含TGF-β抑制剂和BMP抑制剂中的两种的基础上，再加入选自cAMP诱导剂、GSK3抑制剂、Erk抑制剂和p53抑制剂的四种中的任意三种以上的组合物，其中该TGF-β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。
在本发明组合物中，BMP抑制剂为ALK2·3抑制剂较为理想。此外，在本发明组合物中，TGF-β抑制剂是RepSox(CAS号：446859-33-2)，并且/或者BMP抑制剂是LDN193189(CAS号：1062368-24-4)和/或Dorsomorphin(CAS号：866405-64-3)较为理想。此外，cAMP诱导剂是毛喉素(CAS号：66428-89-5)，GSK3抑制剂是CHIR99021(CAS号：252917-06-9)，Erk抑制剂是PD0325901(CAS号：391210-10-9)，或者p53抑制剂为Pifithrin-α(CAS号:63208-82-2)较为理想。
本发明的组合物只需包含至少一种所述抑制剂，诱导剂等即可，并且如果需要的话可以任意进一步添加其他抑制剂，诱导剂等。
所述抑制剂和诱导剂可以单独使用或组合使用两种以上。
所述特定的抑制剂等有可能具有两种以上的抑制作用，在这种情况下，可以认为其一种相当于多种抑制剂。
所述抑制剂和诱导剂的具体例和理想例如上所述。
本发明的组合物是能用作由体细胞制备神经样细胞的组合物。本发明的组合物还可以用作由体细胞制备神经样细胞时所需的培养基。
用作由体细胞制备神经样细胞的培养基，举例而言，是在混合细胞培养所必需的成分而制备的基础培养基中，加入作为有效成分的TGF-β抑制剂的一种的选择性ALK5抑制剂和BMP抑制剂(ALK2·3抑制剂较为理想)，或再加入，选自cAMP诱导剂、GSK3抑制剂、Erk抑制剂和p53抑制剂这4种中的任意3种以上抑制剂而得到的培养基。所述有效成分的浓度只需达到对制备神经样细胞有效的浓度即可，可以由本领域技术人员适当确定。基础培养基可以选择周知的培养基或可商购的培养基。例如，可以使用MEM(最少必需培养基)，DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)，DMEM/F12，又或是改良自这些培养基的培养基。
此外，本说明书中所述已知的培养基组分，例如血清、蛋白质(白蛋白、转移酶、生长因子等)、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、抗生素等也可以添加到培养基中。
在培养基中，可以进一步添加在本说明书中以上所述的脑源性神经营养因子(BDNF；Brain-Derived Neurotrophic Factor)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF：Glial cell-Derived Neurotrophic Factor)、cAMP、抗坏血酸、抗坏血酸-2-磷酸等对于诱导分化为神经样细胞有效的物质。
此外，在本发明中，举例而言，也可通过将含有选择性ALK5抑制剂(TGF-β抑制剂的一种)和BMP抑制剂(ALK2·3抑制剂较为理想)，或者再加入选自cAMP诱导剂、GSK3抑制剂、Erk抑制剂和p53抑制剂的四种中的任意三种以上的组合物施用于活体，而在活体体内由体细胞制备神经样细胞。也就是说，根据本发明，举例而言，提供了一种包含将含有选择性ALK5抑制剂(TGF-β抑制剂的一种)和BMP抑制剂(ALK2·3抑制剂较为理想)，或者再加入选自cAMP诱导剂、GSK3抑制剂、Erk抑制剂和p53抑制剂组成的四种组中的任意三种以上的组合物施用于活体这一工序的，在活体内由体细胞制备神经样细胞的方法，施用于生物体的该抑制剂等的理想组合如本说明书中所述。
另外，作为生物体，可以包括人、人以外的哺乳动物、哺乳动物以外的动物(鸟、爬行动物、两栖动物、鱼类等)，其中人特别理想。举例而言，通过将含有选择性ALK5抑制剂(TGF-β抑制剂的一种)和BMP抑制剂(ALK2·3抑制剂较为理想)，或者再加入选自cAMP诱导剂、GSK3抑制剂、Erk抑制剂和p53抑制剂组成的四种组中的任意三种以上的组合物施用于活体中的特定部位，可以由特定部位的体细胞制备神经样细胞。
实施例
在下文中，将参考实施例来具体说明本发明，但是本发明不限于实施例的范围。
[实施例1]神经样细胞的制备
(1)人成纤维细胞
用作材料的人成纤维细胞购自DS Pharma Biomedical公司。是源自38岁人类皮肤的成纤维细胞。
(2)由人类成纤维细胞向神经样细胞的直接诱导
将8×104个人成纤维细胞接种到35mm皿中，在添加了10％牛血清(Fetal bovineserum；FBS)，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM高葡萄糖培养基(和光纯药工业有限公司)中，在37℃，5％CO2的条件下培养3天。需要说明的是，DMEM表示Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)。
将所述人成纤维细胞的培养皿的培养基与加入了5％牛胎血清(FBS，Hycrone公司制备)，ITS-X(产品目录号：51500056，Gibco公司制备)，非必需氨基酸(NEAA：Non-essential amino acids；产品目录号：111400050，Gibco公司制备)，尼古丁酰胺(产品目录号：72340-100G，Sigma-Aldrich公司制备；最终浓度5mmol/L)，地塞米松(产品目录号：047-18863，和光纯药工业有限公司制备；最终浓度0.1μmol/L)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，并添加了下记的细胞因子和低分子化合物的IMDM(产品目录号：12440053，Gibco公司制备)培养基进行更换，之后每3天更换一次具有相同组成的培养基，同时在37℃和5％CO2条件下进行培养。
将所述人成纤维细胞培养皿的培养基与加入了0.5％的N-2补充剂(ThermoFisher Scientific公司制备)、1％的B-27补充剂(Thermo Fisher Scientific公司制备)、50％DMEM/F12、50％Neurobasal培养基(Thermo Fisher Scientific公司制备)且依照表1和2添加了低分子化合物的培养基进行培养基交换，之后每3天更换一次具有相同组成的培养基，同时在37℃和5％CO2条件下进行培养。表1和2中列出的化合物的详细内容如本说明书所述。
[表1]
(表中数值单位为μmol/L)
Figure BDA0002881788590000191
[表2]
(表中数值的单位为μmol/L)
Figure BDA0002881788590000201
(3)结果
依照所述(2)进行培养的结果示于图1至5中。
如图1所示，用选择性ALK5抑制剂作为TGF-β抑制剂进行培养的实施例1和2，在第6天(Day6)显示出与使用ALK4，5，7抑制剂(广范围TGF-β抑制剂)进行培养的比较例1～3的第11天(day11)相当的诱导神经样细胞的效果。
此外，如图2和图3所示，当使用选择性ALK5抑制剂作为TGF-β抑制剂进行培养时，如实施例3的结果所示，不需要使用多索吗啡来抑制信号传递。此外，如图5所示，与在不存在53抑制剂的条件下培养的比较例4相比，存在p53抑制剂的条件下培养的比较例2有更高的诱导效率，但是当使用选择性ALK5抑制剂作为TGF-β抑制剂时，即使如实施例8在不存在p53抑制剂的条件下进行培养，也表现出了高诱导效率。
接下来，用神经细胞标记物进行抗体染色。比较例1的培养开始14天后，实施例1的培养开始7天后，将细胞用2％的多聚甲醛固定，然后进行免疫染色。使用抗神经元III类β-微管蛋白(TUJ1)抗体(小鼠抗Tuj1：MMS-435P；前Covans(现Funakoshi)；稀释1000倍)进行染色。结果在图4所示。需要说明的是，因为图4是灰度图，所以未显示绿色和蓝色，但是在实际的原始照片中，蓝色显示通过DAPI的核染色，绿色显示β3-微管蛋白染色。
从图4可以清楚地看出，在使用选择性ALK5抑制剂作为TGF-β抑制剂的实施例1的培养开始7天后和使用ALK4，5和7抑制剂(广范围TGF-β抑制剂)的比较例1的培养开始14天后，得到了几乎相同的神经样细胞。

Claims (15)

1.一种神经样细胞的制备方法，其包括：
在TGF-β抑制剂和BMP抑制剂的存在下对体细胞进行培养的工序，
其中所述TGF-β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。
2.一种神经样细胞的制备方法，其包括：
在TGF-β抑制剂和BMP抑制剂这两种和选自cAMP诱导剂、GSK3抑制剂、Erk抑制剂和p53抑制剂这四种中的任意三种以上的存在下对体细胞进行培养的工序，
其中所述TGF-β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的神经样细胞的制备方法，其中，
所述BMP抑制剂是ALK2·3抑制剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的神经样细胞的制备方法，其中，
所述TGF-β抑制剂是RepSox(CAS号：446859-33-2)，并且/或者所述BMP抑制剂是LDN193189(CAS号：1062368-24-4)和/或多索吗啡(CAS号：866405-64-3)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的神经样细胞的制备方法，其中，
所述cAMP诱导剂是毛喉素(CAS号：66428-89-5)，所述GSK3抑制剂是CHIR99021(CAS号：252917-06-9)，所述Erk抑制剂是PD0325901(CAS号：391210-10-9)，或者所述p53抑制剂是Pifithrin-α(CAS号：63208-82-2)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的神经样细胞的制备方法，其中，
所述工序是在不存在生长因子和/或细胞因子的情况下对体细胞进行培养的工序。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的神经样细胞的制备方法，其中，
所述工序是在不存在与组蛋白相关的成分的情况下对体细胞进行培养的工序。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的神经样细胞的制备方法，其中，
所述体细胞是成纤维细胞。
9.一种神经样细胞，其通过权利要求1至8中任一项所述的神经样细胞的制备方法而制备。
10.一种用于由体细胞制备神经样细胞的组合物，其包含TGF-β抑制剂和BMP抑制剂，其中所述TGF-β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。
11.一种用于由体细胞制备神经样细胞的组合物，其包含TGF-β抑制剂和BMP抑制剂这两种、以及选自cAMP诱导剂、GSK3抑制剂、Erk抑制剂和p53抑制剂这四种中的任意三种以上，其中，所述TGF-β抑制剂是选择性ALK5抑制剂。
12.根据权利要求10或11所述的组合物，其中，
所述BMP抑制剂是ALK2·3抑制剂。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中，
所述TGF-β抑制剂是RepSox(CAS号：446859-33-2)，并且/或者所述BMP抑制剂是LDN193189(CAS号：1062368-24-4)和/或多索吗啡(CAS号：866405-64-3)。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的组合物，其中，所述cAMP诱导剂是毛喉素(CAS号：66428-89-5)，所述GSK3抑制剂是CHIR99021(CAS号：252917-06-9)，所述Erk抑制剂是PD0325901(CAS号：391210-10-9)，或者所述p53抑制剂是Pifithrin-α(CAS号：63208-82-2)。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的组合物，其中，
所述体细胞为成纤维细胞。
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