JP6968347B2 - 肝細胞の製造方法 - Google Patents
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肝細胞については、マウス胎児線維芽細胞から、一因子の遺伝子HNF1αとGSK3阻害剤(CHIR99021)、TGF−β阻害剤(A83-01)との低分子化合物の組み合わせによるダイレクトリプログラミングが報告されている(非特許文献2)。また、同様にマウス胎児線維芽細胞から、Foxa1、Foxa2、Foxa3のいずれか一因子の遺伝子とHDAC阻害剤(VPA)、GSK3阻害剤(CHIR99021)、TGF−β阻害剤(RepSox)、cAMP誘導剤(Forskolin)、LSD1阻害剤(Parnate)、EZH2阻害剤(DZNep)、RARアゴニスト(TTNPB)との低分子化合物の組み合わせによるダイレクトリプログラミングが報告されている(非特許文献3)。
本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、低分子化合物の組み合わせにより体細胞から肝細胞を直接誘導する方法、即ち、一定の低分子化合物の組成物により体細胞から肝細胞を直接製造することができる新たな製造方法を提供することを主な課題とする。
[1]GSK3阻害剤、TGF−β阻害剤、p53阻害剤、及びcAMP誘導剤からなる群から選択される3種又は全部、及びBMP阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、肝細胞の製造方法。
[2]前記工程が、GSK3阻害剤及び/又はTGF−β阻害剤、並びにBMP阻害剤、p53阻害剤、及びcAMP誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記[1]に記載の肝細胞の製造方法。
[3]GSK3阻害剤がCHIR99021、TGF−β阻害剤がSB431542若しくはA83−01、BMP阻害剤がLDN193189、p53阻害剤がピフィスリン、又はcAMP誘導剤がフォルスコリンである、上記[1]又は[2]に記載の肝細胞の製造方法。
[4]前記体細胞が線維芽細胞である、上記[1]〜[3]のいずれか一項に記載の肝細胞の製造方法。
[5]上記[1]〜[4]のいずれか一項に記載の肝細胞の製造方法から製造される、肝細胞。
[7]GSK3阻害剤及び/又はTGF−β阻害剤、並びにBMP阻害剤、p53阻害剤、及びcAMP誘導剤を含む、上記[6]に記載の組成物。
[8]GSK3阻害剤がCHIR99021、TGF−β阻害剤がSB431542若しくはA83−01、BMP阻害剤がLDN193189、p53阻害剤がピフィスリン、又はcAMP誘導剤がフォルスコリンである、上記[6]又は[7]に記載の組成物。
[9]前記体細胞が線維芽細胞である、上記[6]〜[8]のいずれか一項に記載の組成物。
本発明に係る、肝細胞の製造方法(以下、「本発明製法」という。)は、GSK3阻害剤、TGF−β阻害剤、p53阻害剤、及びcAMP誘導剤からなる群から選択される3種又は全部、及びBMP阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。
上記阻害剤や誘導剤は、それぞれにおいて、1種を用いても2種以上を併用してもよい。
具体的な上記阻害剤等においては、2種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等が存在しているとみなすことができる。
生物の細胞は、体細胞と生殖細胞とに分類できる。本発明製法には、その出発材料として任意の体細胞を使用することができる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、又は株化された細胞の何れでもよい。本発明製法では、分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞、最終分化への途上にある体細胞、又は初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明製法に使用できる体細胞としては、任意の体細胞、例えば、造血系の細胞(各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等)、臓器由来の細胞(肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等)、筋組織系の細胞(骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等)、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞(白色脂肪細胞等)、胚性幹細胞(ES細胞)等が挙げられる。また、これらの細胞の前駆細胞、癌細胞にも本発明製法を適用できる。好ましくは、線維芽細胞を使用することができる。
1.2.1 GSK3阻害剤
GSK3(glycogen synthase kinase−3、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3)は、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして見いだされた。哺乳類では、GSK3は51kDaのα(GSK3α)と47kDaのβ(GSK3β)の二つのアイソフォームに分類される。GSK3は種々のタンパク質をリン酸化する活性を有しており、グリコーゲン代謝のみならず、細胞分裂、細胞増殖等の生理現象にも関わっている。
Kenpaullone(CAS No.:142273−20−9)
A1070722(CAS No.:1384424−80−9)
SB216763(CAS No.:280744−09−4)
CHIR98014(CAS No.:556813−39−9)
TWS119(CAS No.:601514−19−6)
Tideglusib(CAS No.:865854−05−3)
SB415286(CAS No.:264218−23−7)
Bikinin(CAS No.:188011−69−0)
IM−12(CAS No.:1129669−05−1)
1−Azakenpaullone(CAS No.:676596−65−9)
LY2090314(CAS No.:603288−22−8)
AZD1080(CAS No.:612487−72−6)
AZD2858(CAS No.:486424−20−8)
AR−A014418(CAS No.:487021−52−3)
TDZD−8(CAS No.:327036−89−5)
Indirubin(CAS No.:479−41−4)
TGF−β(transforming growth factor−β、形質転換増殖因子β)には、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3の3種類が存在し、ほぼ全ての細胞から生産されている。TGF−βは、上皮細胞をはじめ、多くの細胞の増殖を抑制するなど細胞増殖、形質転換、分化、発生、アポトーシスの制御等の多種多様な細胞機能に関与している。
SB525334(CAS No.:356559−20−1)
SD208(CAS No.:627536−09−8)
Galunisertib(LY2157299)(CAS No.:700874−72−2)
LY2109761(CAS No.:700874−71−1)
SB505124(CAS No.:694433−59−5)
GW788388(CAS No.:452342−67−5)
EW−7197(CAS No.:1352608−82−2)
BMP(Bone Morphogenetic Protein、骨形成タンパク質)は、TGF-βスーパーファミリーに属する成長因子であり、胚や組織の発生、細胞の分化、細胞死などを制御している。BMPは細胞膜上のI型受容体とII型受容体に結合してヘテロ四量体を形成し、転写因子SMADのリン酸化を経て核内にBMPシグナルを伝達する。BMP阻害剤の多くは、BMPの結合によって活性化されたI型受容体であるALK(Activin receptor-like kinase)-2,3,6によるSMADのリン酸化を阻害する。
K02288(CAS No.:1431985−92−0)
LDN212854(CAS No.:1432597−26−6)
LDN193189 HCl(CAS No.:1062368−62−0)
ML347(CAS No.:1062368−49−3)
LDN214117(CAS No.:1627503−67−6)
p53は最も重要な癌抑制遺伝子の一つであり、細胞増殖を抑制し、がんの抑制に重要な役割を担っている。また種々のストレスに応答して標的遺伝子を活性化し、細胞周期の停止、アポトーシス、DNA修復、細胞老化などに対する起点となっている。
ピフィスリン−μ(CAS No.:64984−31−2)
NSC66811(CAS No.:6964−62−1)
Nultin−3(CAS No.:548472−68−0)
cAMP(環状アデノシン1リン酸)は、セカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。cAMPは、細胞内ではアデニル酸シクラーゼ(adenylate cyclase)によりアデノシン3リン酸(ATP)が環状化されることで生成する。
NKH477(CAS No.:138605−00−2)
PACAP1−27(CAS No.:127317−03−7)
PACAP1−38(CAS No.:137061−48−4)
本発明製法における体細胞の培養は、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種の阻害剤(及び、場合により誘導剤ないし活性化剤)の存在下において実施すればよい。培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるMEM(最少必須培地)、IMDM(イスコフ改変ダルベッコ培地)、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)、DMEM/F12、RPMI1640培地、又はこれらを改変した培地に、適切な成分(血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等)および種々の成長因子(EGF、bFGF、BMP4、HGF、OSMなど)を添加して使用することができる。
本発明製法においては、上記した各種の阻害剤等を含む培地において体細胞を培養することにより、一段階の培養によって体細胞から肝細胞を製造することができる。
上記した本発明製法により、肝細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明製法により製造される肝細胞も本発明の範囲内である。本発明製法で製造される肝細胞は、最終分化した細胞の他、肝細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。
本発明製法により製造される肝細胞は、低分子化合物により体細胞から直接誘導される、いわゆる低分子化合物誘導性肝細胞(ciHeps)であって、ES細胞やiPS細胞から分化誘導される肝細胞とは区別される。
本発明製法で製造される肝細胞は、さらに、肝細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。
本発明に係る組成物(以下、「本発明組成物」という。)は、体細胞から肝細胞を製造するための組成物であって、GSK3阻害剤、TGF−β阻害剤、p53阻害剤、及びcAMP誘導剤からなる群から選択される3種又は全部、及びBMP阻害剤を含むことを特徴とする。
上記阻害剤や誘導剤等は、それぞれにおいて、1種を用いても2種以上を併用してもよい。
具体的な上記阻害剤等においては、2種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等を含んでいるとみなすことができる。
上記した阻害剤や誘導剤等の具体例や好ましい例などは、前記と同義である。
<ヒト線維芽細胞から肝細胞への直接誘導>
(1)ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はDSファーマバイオメディカル株式会社から購入した。38才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。
ヒト線維芽細胞を、ゼラチン(Cat#:190−15805,和光純薬工業社製)でコーティングされた35mmディッシュに5×104個ずつ播種し、10%ウシ胎児血清(Fetal bovine serum;FBS)、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを添加したDMEM培地(Gibco社製)で、37℃、5%CO2条件下でコンフルエントになるまで培養した。なおDMEMは、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)を示す。
20ng/ml human HGF(Cat#:082−08721,Wako)
20ng/ml human OSM(Cat#:153−02101,Wako)
20ng/ml human EGF(Cat#:059−07873,Wako)
20ng/ml human FGF2(Cat#:068−05384,Wako)
20ng/ml human BMP4(Cat#:020−18851,Wako)
1μM CHIR99021(Cat#:13122,Cayman Chemical)
2μM SB431542(Cat#:198−16543,Wako)
1μM A83−01(Cat#:04−0014,Stemgent Inc.)
1μM LDN193189(Cat#:124−06011,Wako)
5μM ピフィスリン−α(Cat#:162−23133,Wako)
7.5μM フォルスコリン(Cat#:063−02193,Wako)
上記(2)に従って培養した結果を表1、及び図1〜3に示す。表中、「+」は培地中に当該化合物が存在することを示し、「−」は培地中に当該化合物が存在しないことを示す。
本実験において、培養開始後9日目程度から肝細胞様の細胞が出現し始めた。
また、実施例1を添加後20日目に細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、免疫染色を行った。染色には抗HNF4α抗体(sc-6556、Santa Cruz Biotechnology社製;200倍希釈で使用)を使用した。その結果を図4に示す。中間がHNF4αの染色結果、右端がDAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)による核染色を示す。なお、図4はグレー表示であるため緑色や青色などは表示されないが、実際のオリジナル写真では、中間のHNF4α染色写真は緑色、DAPI染色写真は青色で表示されている。
体細胞(線維芽細胞)から肝細胞への直接誘導には、BMP阻害剤(例、LDN193189)の存在が重要であることが分かった。
Claims (9)
- GSK3阻害剤、TGF−β阻害剤、p53阻害剤、及びcAMP誘導剤からなる群から選択される3種又は全部、及びBMP阻害剤の存在下でヒト体細胞を培養する工程を含み、かつ、遺伝子導入を行う工程を含まないことを特徴とする、終分化した肝細胞の製造方法。
- 前記工程が、GSK3阻害剤及び/又はTGF−β阻害剤、並びにBMP阻害剤、p53阻害剤、及びcAMP誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項1に記載の肝細胞の製造方法。
- GSK3阻害剤がCHIR99021、TGF−β阻害剤がSB431542若しくはA83−01、BMP阻害剤がLDN193189、p53阻害剤がピフィスリン、又はcAMP誘導剤がフォルスコリンである、請求項1又は2に記載の肝細胞の製造方法。
- 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の肝細胞の製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の肝細胞の製造方法から製造される、肝細胞。
- GSK3阻害剤、TGF−β阻害剤、p53阻害剤、及びcAMP誘導剤からなる群から選択される3種又は全部、及びBMP阻害剤を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の肝細胞の製造方法に用いるための組成物。
- GSK3阻害剤及び/又はTGF−β阻害剤、並びにBMP阻害剤、p53阻害剤、及びcAMP誘導剤を含む、請求項6に記載の組成物。
- GSK3阻害剤がCHIR99021、TGF−β阻害剤がSB431542若しくはA83−01、BMP阻害剤がLDN193189、p53阻害剤がピフィスリン、又はcAMP誘導剤がフォルスコリンである、請求項6又は7に記載の組成物。
- 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の組成物。
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