JP6968347B2

JP6968347B2 - 肝細胞の製造方法

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Publication number: JP6968347B2
Application number: JP2018013302A
Authority: JP
Inventors: 平戴; 行正武田; 義規原田; 潤一松本; あゆみ草鹿
Original assignee: KYOTO PREFECTURAL UNIVERSITY OF MEDICINE; Kataoka Corp
Current assignee: KYOTO PREFECTURAL UNIVERSITY OF MEDICINE; Kataoka Corp
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2021-11-17
Anticipated expiration: 2038-01-30
Also published as: JP2019129733A

Description

本発明は、再生医療、ないし体細胞からのダイレクトリプログラミング（ＤｉｒｅｃｔＲｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）の技術分野に属する。本発明は、その技術分野において、低分子化合物により体細胞から肝細胞を直接製造する方法、及びかかる製造方法によって製造される低分子化合物誘導性肝細胞（ｃｉＨｅｐｓ：ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｄｕｃｅｄ−ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）に関するものである。本発明はさらに、当該肝細胞、及び当該肝細胞を製造する方法のために使用することができる組成物に関するものである。

近年の細胞関連研究の発展、特に多能性細胞に関する研究の発展により、治療用細胞を個体への移植に利用可能な品質及び量において入手することが可能になりつつある。幾つかの疾患については、治療に有効な細胞を患者に移植する試みが開始されている。

間葉系の細胞は、筋肉、骨、軟骨、骨髄、脂肪及び結合組織等の生体の各種器官を形成しており、再生医療の材料として有望である。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪組織、血液、胎盤及び臍帯等の組織に存在する未分化細胞である。間葉系に属す細胞への分化能を有しているため、間葉系幹細胞は、それらの細胞を製造する際の出発材料として注目されている。また、間葉系幹細胞自体を骨、軟骨、心筋等の再構築に利用する再生医療も検討されている。

一方、線維芽細胞のような体細胞を直接他の細胞に転換する方法も報告されている。例えば、線維芽細胞を化学物質と共に培養することにより神経細胞を得ることが知られている（非特許文献１）。
肝細胞については、マウス胎児線維芽細胞から、一因子の遺伝子ＨＮＦ１αとＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）、ＴＧＦ−β阻害剤（Ａ８３-０１）との低分子化合物の組み合わせによるダイレクトリプログラミングが報告されている（非特許文献２）。また、同様にマウス胎児線維芽細胞から、Ｆｏｘａ１、Ｆｏｘａ２、Ｆｏｘａ３のいずれか一因子の遺伝子とＨＤＡＣ阻害剤（ＶＰＡ）、ＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）、ＴＧＦ−β阻害剤（ＲｅｐＳｏｘ）、ｃＡＭＰ誘導剤（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）、ＬＳＤ１阻害剤（Ｐａｒｎａｔｅ）、ＥＺＨ２阻害剤（ＤＺＮｅｐ）、ＲＡＲアゴニスト（ＴＴＮＰＢ）との低分子化合物の組み合わせによるダイレクトリプログラミングが報告されている（非特許文献３）。

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１５年，５６巻，３号，１６６−１７０頁ＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ，２０１７年，１５巻，４号，８１４−８２９頁ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ，２０１７年，９巻，２号，４９９−５１２頁

非特許文献１に記載されている方法のように、遺伝子導入を行うことなく体細胞から所望の細胞への転換を直接行う方法は、治療用細胞を取得する手段として有効な選択肢となる場合がある。肝細胞についても、非特許文献２および非特許文献３に記載の発明のように、直接誘導している報告例はあるが、マウス線維芽細胞からの直接誘導であり、また一因子の遺伝子を必要とする。
本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、低分子化合物の組み合わせにより体細胞から肝細胞を直接誘導する方法、即ち、一定の低分子化合物の組成物により体細胞から肝細胞を直接製造することができる新たな製造方法を提供することを主な課題とする。

本発明者らは、鋭意検討した結果、一定の低分子阻害剤等の存在下で体細胞を培養することによって、体細胞を肝細胞に直接転換できることを見出し、本発明を完成するに到った。

本発明として、例えば、下記のものを挙げることができる。
［１］ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される３種又は全部、及びＢＭＰ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、肝細胞の製造方法。
［２］前記工程が、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＴＧＦ−β阻害剤、並びにＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］に記載の肝細胞の製造方法。
［３］ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＴＧＦ−β阻害剤がＳＢ４３１５４２若しくはＡ８３−０１、ＢＭＰ阻害剤がＬＤＮ１９３１８９、ｐ５３阻害剤がピフィスリン、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、上記［１］又は［２］に記載の肝細胞の製造方法。
［４］前記体細胞が線維芽細胞である、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の肝細胞の製造方法。
［５］上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載の肝細胞の製造方法から製造される、肝細胞。

［６］ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される３種又は全部、及びＢＭＰ阻害剤を含むことを特徴とする、体細胞から肝細胞を製造するための組成物。
［７］ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＴＧＦ−β阻害剤、並びにＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を含む、上記［６］に記載の組成物。
［８］ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＴＧＦ−β阻害剤がＳＢ４３１５４２若しくはＡ８３−０１、ＢＭＰ阻害剤がＬＤＮ１９３１８９、ｐ５３阻害剤がピフィスリン、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、上記［６］又は［７］に記載の組成物。
［９］前記体細胞が線維芽細胞である、上記［６］〜［８］のいずれか一項に記載の組成物。

本発明によれば、遺伝子導入を行うことなく、体細胞から肝細胞を製造することができる。本発明により得られた肝細胞は、再生医療などにおいて有用である。

実施例１についてのヒト線維芽細胞の培養写真である。Ｄａｙ０は、培養開始時点でのヒト線維芽細胞を表す。Ｄａｙ６、９、１５、１６、及び２０は、それぞれ培養開始後６日目、９日目、１５日目、１６日目、及び２０日目の結果を示す。培養開始後１０日目におけるヒト線維芽細胞の培養写真である。培養開始後１４日目におけるヒト線維芽細胞の培養写真である。培養開始後２０日目におけるヒト線維芽細胞の培養写真（左端）、当該細胞についての肝細胞用マーカーＨＮＦ４αによる免疫染色写真（中間）、及びそのＤＡＰＩ染色写真である。

以下、本発明について詳細に説明する。

１肝細胞の製造方法
本発明に係る、肝細胞の製造方法（以下、「本発明製法」という。）は、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される３種又は全部、及びＢＭＰ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。

好ましくは、上記工程が、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＴＧＦ−β阻害剤、並びにＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である本発明製法である。より好ましくは、上記工程が、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である本発明製法である。本発明製法においては、特にＢＭＰ阻害剤の存在下で体細胞を培養することが好ましい。

本発明製法においては、少なくとも上記いずれかの組み合わせの存在下で体細胞を培養すればよく、必要に応じて、任意にさらに他の阻害剤や誘導剤等を存在させて体細胞を培養し肝細胞を製造することができる。
上記阻害剤や誘導剤は、それぞれにおいて、１種を用いても２種以上を併用してもよい。
具体的な上記阻害剤等においては、２種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等が存在しているとみなすことができる。

１．１体細胞について
生物の細胞は、体細胞と生殖細胞とに分類できる。本発明製法には、その出発材料として任意の体細胞を使用することができる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、又は株化された細胞の何れでもよい。本発明製法では、分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞、最終分化への途上にある体細胞、又は初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明製法に使用できる体細胞としては、任意の体細胞、例えば、造血系の細胞（各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等）、臓器由来の細胞（肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等）、筋組織系の細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等）、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞（白色脂肪細胞等）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等が挙げられる。また、これらの細胞の前駆細胞、癌細胞にも本発明製法を適用できる。好ましくは、線維芽細胞を使用することができる。

上記の体細胞の供給源としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、これらに限定されるものではない。体細胞の供給源としては、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい。ヒトへの投与を目的として本発明製法により肝細胞を製造する場合、好ましくは、レシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された体細胞を使用することができる。レシピエント自身より採取された体細胞を肝細胞の製造に供してもよい。

１．２本発明に係る阻害剤等について
１．２．１ＧＳＫ３阻害剤
ＧＳＫ３（ｇｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈａｓｅｋｉｎａｓｅ−３、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３）は、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして見いだされた。哺乳類では、ＧＳＫ３は５１ｋＤａのα（ＧＳＫ３α）と４７ｋＤａのβ（ＧＳＫ３β）の二つのアイソフォームに分類される。ＧＳＫ３は種々のタンパク質をリン酸化する活性を有しており、グリコーゲン代謝のみならず、細胞分裂、細胞増殖等の生理現象にも関わっている。

「ＧＳＫ３阻害剤の存在下」とは、ＧＳＫ３を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＧＳＫ３の活性を阻害する物質、例えば、抗ＧＳＫ３抗体やＧＳＫ３阻害剤のようなＧＳＫ３シグナル阻害手段を利用することができる。また、ＧＳＫ３は自身の特定の部位がリン酸化されると活性を失うことから、上記のリン酸化を促進する手段も、ＧＳＫ３シグナルの阻害に利用することができる。

本発明では特に限定されないが、ＧＳＫ３阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１を使用することができる。

ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳＮｏ．：２５２９１７−０６−９）

ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ）（ＣＡＳＮｏ．：６６７４６３−６２−９）
Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳＮｏ．：１４２２７３−２０−９）
Ａ１０７０７２２（ＣＡＳＮｏ．：１３８４４２４−８０−９）
ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳＮｏ．：２８０７４４−０９−４）
ＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳＮｏ．：５５６８１３−３９−９）
ＴＷＳ１１９（ＣＡＳＮｏ．：６０１５１４−１９−６）
Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ（ＣＡＳＮｏ．：８６５８５４−０５−３）
ＳＢ４１５２８６（ＣＡＳＮｏ．：２６４２１８−２３−７）
Ｂｉｋｉｎｉｎ（ＣＡＳＮｏ．：１８８０１１−６９−０）
ＩＭ−１２（ＣＡＳＮｏ．：１１２９６６９−０５−１）
１−Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳＮｏ．：６７６５９６−６５−９）
ＬＹ２０９０３１４（ＣＡＳＮｏ．：６０３２８８−２２−８）
ＡＺＤ１０８０（ＣＡＳＮｏ．：６１２４８７−７２−６）
ＡＺＤ２８５８（ＣＡＳＮｏ．：４８６４２４−２０−８）
ＡＲ−Ａ０１４４１８（ＣＡＳＮｏ．：４８７０２１−５２−３）
ＴＤＺＤ−８（ＣＡＳＮｏ．：３２７０３６−８９−５）
Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ（ＣＡＳＮｏ．：４７９−４１−４）

ＧＳＫ３阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

１．２．２ＴＧＦ−β阻害剤
ＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−β、形質転換増殖因子β）には、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３の３種類が存在し、ほぼ全ての細胞から生産されている。ＴＧＦ−βは、上皮細胞をはじめ、多くの細胞の増殖を抑制するなど細胞増殖、形質転換、分化、発生、アポトーシスの制御等の多種多様な細胞機能に関与している。

「ＴＧＦ−β阻害剤の存在下」とは、ＴＧＦ−βを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＴＧＦ−βを阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＴＧＦ−βに直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＴＧＦ−β抗体やその他の薬剤）、ＴＧＦ−β自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＴＧＦ−βが関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＴＧＦ−βを阻害することができる。

本発明では特に限定されないが、ＴＧＦ−β阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３−０１、レプソックスを使用することができる。

ＳＢ４３１５４２（ＣＡＳＮｏ．：３０１８３６−４１−９）

Ａ８３−０１（ＣＡＳＮｏ．：９０９９１０−４３−６）

レプソックス（ＣＡＳＮｏ．：４４６８５９−３３−２）

ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳＮｏ．：３９６１２９−５３−６）
ＳＢ５２５３３４（ＣＡＳＮｏ．：３５６５５９−２０−１）
ＳＤ２０８（ＣＡＳＮｏ．：６２７５３６−０９−８）
Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）（ＣＡＳＮｏ．：７００８７４−７２−２）
ＬＹ２１０９７６１（ＣＡＳＮｏ．：７００８７４−７１−１）
ＳＢ５０５１２４（ＣＡＳＮｏ．：６９４４３３−５９−５）
ＧＷ７８８３８８（ＣＡＳＮｏ．：４５２３４２−６７−５）
ＥＷ−７１９７（ＣＡＳＮｏ．：１３５２６０８−８２−２）

ＴＧＦ−β阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜３０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

１．２．３ＢＭＰ阻害剤
ＢＭＰ（ＢｏｎｅＭｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃＰｒｏｔｅｉｎ、骨形成タンパク質）は、ＴＧＦ-βスーパーファミリーに属する成長因子であり、胚や組織の発生、細胞の分化、細胞死などを制御している。ＢＭＰは細胞膜上のＩ型受容体とＩＩ型受容体に結合してヘテロ四量体を形成し、転写因子ＳＭＡＤのリン酸化を経て核内にＢＭＰシグナルを伝達する。ＢＭＰ阻害剤の多くは、ＢＭＰの結合によって活性化されたＩ型受容体であるＡＬＫ（Ａｃｔｉｖｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ-ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅ）-２，３，６によるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する。

「ＢＭＰ阻害剤の存在下」とは、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＢＭＰおよびＢＭＰ受容体に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＢＭＰ抗体、その他の薬剤）、あるいはこれらの発現を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＢＭＰが関わるシグナル伝達の下流に位置するＳＭＡＤ転写因子の発現およびその翻訳後修飾を阻害することによってもＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することができる。

本発明では特に限定されないが、ＢＭＰ阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＬＤＮ１９３１８９を使用することができる。

ＬＤＮ１９３１８９（ＣＡＳＮｏ．：１０６２３６８−２４−４）

ＤＭＨ１（ＣＡＳＮｏ．：１２０６７１１−１６−１）
Ｋ０２２８８（ＣＡＳＮｏ．：１４３１９８５−９２−０）
ＬＤＮ２１２８５４（ＣＡＳＮｏ．：１４３２５９７−２６−６）
ＬＤＮ１９３１８９ＨＣｌ（ＣＡＳＮｏ．：１０６２３６８−６２−０）
ＭＬ３４７（ＣＡＳＮｏ．：１０６２３６８−４９−３）
ＬＤＮ２１４１１７（ＣＡＳＮｏ．：１６２７５０３−６７−６）

ＢＭＰ阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

１．２．４ｐ５３阻害剤
ｐ５３は最も重要な癌抑制遺伝子の一つであり、細胞増殖を抑制し、がんの抑制に重要な役割を担っている。また種々のストレスに応答して標的遺伝子を活性化し、細胞周期の停止、アポトーシス、ＤＮＡ修復、細胞老化などに対する起点となっている。

「ｐ５３阻害剤の存在下」とは、ｐ５３を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ｐ５３を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ｐ５３に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ｐ５３抗体、その他の薬剤）、ｐ５３自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ｐ５３が関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもｐ５３を阻害することができる。

本発明では特に限定されないが、ｐ５３阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ピフィスリンないしピフィスリン−αを使用することができる。

ピフィスリン−α（ＣＡＳＮｏ．：６３２０８−８２−２）

ピフィスリン−β（ＣＡＳＮｏ．：５１１２９６−８８−１）
ピフィスリン−μ（ＣＡＳＮｏ．：６４９８４−３１−２）
ＮＳＣ６６８１１（ＣＡＳＮｏ．：６９６４−６２−１）
Ｎｕｌｔｉｎ−３（ＣＡＳＮｏ．：５４８４７２−６８−０）

ｐ５３阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．５μｍｏｌ／Ｌ〜３０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

１．２．５ｃＡＭＰ誘導剤
ｃＡＭＰ（環状アデノシン１リン酸）は、セカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。ｃＡＭＰは、細胞内ではアデニル酸シクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅ）によりアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）が環状化されることで生成する。

「ｃＡＭＰ誘導剤の存在下」とは、ｃＡＭＰを誘導することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させることができる任意の手段を利用することができる。ｃＡＭＰの生成に関わる酵素であるアデニル酸シクラーゼに直接作用して誘導することができる物質、アデニル酸シクラーゼの発現を促進しうる物質の他、ｃＡＭＰを分解する酵素であるホスホジエステラーゼを阻害する物質等を、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる手段として使用することができる。細胞内でｃＡＭＰと同じ作用を持つ、ｃＡＭＰの構造類似体であるジブチリルｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｒｙｌｃＡＭＰ）を使用することもできる。

本発明では特に限定されないが、ｃＡＭＰ誘導剤（アデニル酸シクラーゼ活性化剤）としては、例えば、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ：ＣＡＳＮｏ．：６６５７５−２９−９）、及びフォルスコリン誘導体（例えば特開２００２−３４８２４３号公報）や以下の化合物などが挙げられる。好ましくは、フォルスコリンを使用することができる。

フォルスコリン（ＣＡＳＮｏ．：６６４２８−８９−５）

イソプロテレノール（ＣＡＳＮｏ．：７６８３−５９−２）
ＮＫＨ４７７（ＣＡＳＮｏ．：１３８６０５−００−２）
ＰＡＣＡＰ１−２７（ＣＡＳＮｏ．：１２７３１７−０３−７）
ＰＡＣＡＰ１−３８（ＣＡＳＮｏ．：１３７０６１−４８−４）

ｃＡＭＰ誘導剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．２μｍｏｌ／Ｌ〜５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ〜３０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

１．３体細胞の培養
本発明製法における体細胞の培養は、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種の阻害剤（及び、場合により誘導剤ないし活性化剤）の存在下において実施すればよい。培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０培地、又はこれらを改変した培地に、適切な成分（血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等）および種々の成長因子（ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＨＧＦ、ＯＳＭなど）を添加して使用することができる。

培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ_２の条件などが例示される。培養中は適切な間隔（好ましくは１日から７日に１回、より好ましくは３日から４日に１回）で培地を交換することが好ましい。線維芽細胞を材料として本発明製法を実施する場合、３７℃、５％ＣＯ_２の条件では７ないし１０日間から３週間で肝細胞が出現する。使用する体細胞として培養が容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させた体細胞を肝細胞に転換することも可能である。従って、スケールアップした肝細胞の製造も容易である。

体細胞の培養には、プレート、ディッシュ、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養容器を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができるが、得られた肝細胞のヒトへの投与等を目的とする場合には、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
本発明製法においては、上記した各種の阻害剤等を含む培地において体細胞を培養することにより、一段階の培養によって体細胞から肝細胞を製造することができる。

１．４肝細胞
上記した本発明製法により、肝細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明製法により製造される肝細胞も本発明の範囲内である。本発明製法で製造される肝細胞は、最終分化した細胞の他、肝細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。
本発明製法により製造される肝細胞は、低分子化合物により体細胞から直接誘導される、いわゆる低分子化合物誘導性肝細胞（ｃｉＨｅｐｓ）であって、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から分化誘導される肝細胞とは区別される。

本発明製法で製造される肝細胞は、例えば、細胞の形態的変化（多角形状、多核細胞、間葉上皮移行（ＭＥＴ））、肝細胞の特徴的性質や特異的マーカー（例、抗ＨＮＦ４α抗体）を利用して、検出、確認及び分離を行うことができる。

特異的マーカーの検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。肝細胞の特異的マーカーを認識する抗体は、本発明製法により得られた肝細胞を単離及び精製する上でも有用である。

本発明製法で製造される肝細胞は、例えば、組織修復等のために使用することができる。本発明製法で製造される肝細胞を使用して、組織修復等のための医薬用組成物を製造することができる。肝癌、肝硬変等の慢性肝不全の根治治療のためには、肝細胞あるいは肝組織の移植が最も有効な手段であると考えられており、種々の幹細胞あるいは体細胞からより安全性の高い方法で肝細胞の製造方法の開発が盛んに行なわれている。

本発明製法で製造される肝細胞を医薬用組成物とする場合には、常法により、肝細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
本発明製法で製造される肝細胞は、さらに、肝細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。

さらに、本発明製法で製造される肝細胞は、肝細胞に作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。肝細胞は、医薬候補化合物の肝毒性を評価するための重要なツールである。本発明製法によれば、一度の操作で多くの肝細胞を取得することができることから、細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能になる。

２組成物
本発明に係る組成物（以下、「本発明組成物」という。）は、体細胞から肝細胞を製造するための組成物であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される３種又は全部、及びＢＭＰ阻害剤を含むことを特徴とする。

好ましくは、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＴＧＦ−β阻害剤、並びにＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を含む本発明組成物である。より好ましくは、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を含む本発明組成物である。本発明組成物においては、特にＢＭＰ阻害剤を含むことが好ましい。

本発明組成物においては、少なくとも上記いずれかの組み合わせを含んでいればよく、必要に応じて、任意にさらに他の阻害剤や誘導剤等を含むことができる。
上記阻害剤や誘導剤等は、それぞれにおいて、１種を用いても２種以上を併用してもよい。
具体的な上記阻害剤等においては、２種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等を含んでいるとみなすことができる。
上記した阻害剤や誘導剤等の具体例や好ましい例などは、前記と同義である。

本発明組成物は、体細胞から肝細胞を製造するための組成物として使用することができる。本発明組成物は、また、体細胞から肝細胞を製造するための培地として使用することもできる。

体細胞から肝細胞の製造に使用される培地としては、細胞の培養に必要な成分を混合して製造した基礎培地に、有効成分として、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される３種又は全部、及びＢＭＰ阻害剤を含有させた培地を例示することができる。上記の有効成分は、肝細胞の製造に有効な濃度で含まれていればよく、濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、又はこれらを改変した培地を、基礎培地として使用することができる。

培地にはさらに、本明細書中で上記した公知の培地成分、例えば、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子（ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＨＧＦ、ＯＳＭなど）等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等を添加してもよい。

培地にはさらに、本明細書中で上記した、肝細胞への分化の誘導に有効な物質を添加してもよい。

さらに本発明においては、例えば、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される３種又は全部、及びＢＭＰ阻害剤を生体に投与することによって、生体内において体細胞から肝細胞を製造することもできる。即ち、本発明によれば、例えば、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される３種又は全部、及びＢＭＰ阻害剤を生体に投与することを含む、生体内において体細胞から肝細胞を製造する方法が提供される。生体に投与する当該阻害剤等の好ましい組み合わせは、本明細書中に記載した通りである。また、生体としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、ヒトが特に好ましい。例えば、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される３種又は全部、及びＢＭＰ阻害剤を生体内の特定部位に投与することによって、上記特定部位において、体細胞から肝細胞を製造することができる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。

実施例１肝細胞の製造
＜ヒト線維芽細胞から肝細胞への直接誘導＞
（１）ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。３８才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。

（２）ヒト線維芽細胞からの肝細胞への直接誘導
ヒト線維芽細胞を、ゼラチン（Ｃａｔ＃：１９０−１５８０５，和光純薬工業社製）でコーティングされた３５ｍｍディッシュに５×１０^４個ずつ播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で、３７℃、５％ＣＯ_２条件下でコンフルエントになるまで培養した。なおＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）を示す。

上記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、ＩＴＳ-Ｘ（Ｃａｔ＃：５１５０００５６、Ｇｉｂｃｏ社製）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ：Ｎｏｎ-ｅｓｓｅｎｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓ；Ｃａｔ＃：１１１４００５０、Ｇｉｂｃｏ社製）、ニコチンアミド（Ｃａｔ＃：７２３４０−１００Ｇ、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社製；終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｃａｔ＃：０４７−１８８６３、和光純薬工業社製；終濃度０．１μｍｏｌ／Ｌ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び下記のサイトカインや低分子化合物を添加したＩＭＤＭ（Ｃａｔ＃：１２４４００５３、Ｇｉｂｃｏ社製）に培地を交換した。その後、３日毎に同組成の培地へ培地交換を行いながら、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。

＜サイトカイン＞
２０ｎｇ／ｍｌｈｕｍａｎＨＧＦ（Ｃａｔ＃：０８２−０８７２１，Ｗａｋｏ）
２０ｎｇ／ｍｌｈｕｍａｎＯＳＭ（Ｃａｔ＃：１５３−０２１０１，Ｗａｋｏ）
２０ｎｇ／ｍｌｈｕｍａｎＥＧＦ（Ｃａｔ＃：０５９−０７８７３，Ｗａｋｏ）
２０ｎｇ／ｍｌｈｕｍａｎＦＧＦ２（Ｃａｔ＃：０６８−０５３８４，Ｗａｋｏ）
２０ｎｇ／ｍｌｈｕｍａｎＢＭＰ４（Ｃａｔ＃：０２０−１８８５１，Ｗａｋｏ）

＜低分子化合物＞
１μＭＣＨＩＲ９９０２１（Ｃａｔ＃：１３１２２，ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ）
２μＭＳＢ４３１５４２（Ｃａｔ＃：１９８−１６５４３，Ｗａｋｏ）
１μＭＡ８３−０１（Ｃａｔ＃：０４−００１４，ＳｔｅｍｇｅｎｔＩｎｃ．）
１μＭＬＤＮ１９３１８９（Ｃａｔ＃：１２４−０６０１１，Ｗａｋｏ）
５μＭピフィスリン−α（Ｃａｔ＃：１６２−２３１３３，Ｗａｋｏ）
７．５μＭフォルスコリン（Ｃａｔ＃：０６３−０２１９３，Ｗａｋｏ）

（３）結果
上記（２）に従って培養した結果を表１、及び図１〜３に示す。表中、「＋」は培地中に当該化合物が存在することを示し、「−」は培地中に当該化合物が存在しないことを示す。

（４）肝細胞の評価
本実験において、培養開始後９日目程度から肝細胞様の細胞が出現し始めた。
また、実施例１を添加後２０日目に細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、免疫染色を行った。染色には抗ＨＮＦ４α抗体（ｓｃ-６５５６、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製；２００倍希釈で使用）を使用した。その結果を図４に示す。中間がＨＮＦ４αの染色結果、右端がＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）による核染色を示す。なお、図４はグレー表示であるため緑色や青色などは表示されないが、実際のオリジナル写真では、中間のＨＮＦ４α染色写真は緑色、ＤＡＰＩ染色写真は青色で表示されている。

図１（Ｄａｙ２０）に示されている肝細胞様の細胞を観察すると、肝細胞を含む内胚葉系の細胞に特徴的な、細胞同士が接着するＥｐｉｔｈｅｌｉｕｍ（上皮）の状態に似ており、いわゆるＭＥＴ（ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｏＥｐｉｔｈｅｌｉｕｍｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）が生じている可能性がある。図４に示されているように、肝細胞のマーカーであるＨＮＦ４αの染色が観察されており、ＤＡＰＩで染色されていることから分かるように細胞核に局在していた。
体細胞（線維芽細胞）から肝細胞への直接誘導には、ＢＭＰ阻害剤（例、ＬＤＮ１９３１８９）の存在が重要であることが分かった。

Claims

ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される３種又は全部、及びＢＭＰ阻害剤の存在下でヒト体細胞を培養する工程を含み、かつ、遺伝子導入を行う工程を含まないことを特徴とする、終分化した肝細胞の製造方法。
前記工程が、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＴＧＦ−β阻害剤、並びにＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１に記載の肝細胞の製造方法。
ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＴＧＦ−β阻害剤がＳＢ４３１５４２若しくはＡ８３−０１、ＢＭＰ阻害剤がＬＤＮ１９３１８９、ｐ５３阻害剤がピフィスリン、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、請求項１又は２に記載の肝細胞の製造方法。
前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の肝細胞の製造方法。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の肝細胞の製造方法から製造される、肝細胞。
ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される３種又は全部、及びＢＭＰ阻害剤を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の肝細胞の製造方法に用いるための組成物。
ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＴＧＦ−β阻害剤、並びにＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を含む、請求項６に記載の組成物。
ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＴＧＦ−β阻害剤がＳＢ４３１５４２若しくはＡ８３−０１、ＢＭＰ阻害剤がＬＤＮ１９３１８９、ｐ５３阻害剤がピフィスリン、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、請求項６又は７に記載の組成物。
前記体細胞が線維芽細胞である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組成物。