JP6383436B2 - 神経系細胞の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は体細胞を材料として神経系の細胞を製造する方法に関する。本発明はまた、前記方法により得られる神経系細胞、当該細胞を有効成分として含有する神経系疾患治療用の組成物に関する。

近年の細胞関連研究の発展、とくに多能性細胞に関する多くの研究成果は、個体への移植に利用可能な品質、量の治療用細胞の入手に道を開いた。すでにいくつかの疾患についてはその治療に有効な形質を有する細胞を患者に移植する試みが開始されている。
神経系疾患もその例外ではなく、脊髄損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症等の疾患について、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来する神経系の細胞もしくは神経前駆細胞を使用した治療の可能性について検討が行われている。

神経系疾患の再生医療においても、治療用細胞を入手、作製する手段は課題とされている。非自己ドナー由来の細胞、胚性幹細胞から分化させた細胞は拒絶反応のおそれがあるため、自己の細胞より多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）を作製し、これを適切な神経系細胞に分化させたものが治療用細胞として期待されている。この方法では、ｉＰＳ細胞の作製（リプログラミング）、神経系細胞への分化の双方のステップで高い転換効率を得ることが必要である。また、神経系細胞を得るために数カ月に及ぶ期間を要するため、治療等への使用において適用可能な疾患が限られるという問題も有していた。

一方、線維芽細胞のような体細胞を直接神経系の細胞に転換する方法も報告されており、体細胞への遺伝子の導入により実施する方法［非特許文献１］、化学物質と共に体細胞を培養する方法、両者を組み合わせた方法が知られている。細胞に人為的に遺伝子を導入した場合、導入法やその他の条件が細胞内での遺伝子発現に影響を与える場合がある。したがって、遺伝子導入を行わずに体細胞から神経系細胞への転換を行う方法はより有効な選択肢である可能性がある。

Ｔｈｏｍａらは、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるバルプロ酸で処理した線維芽細胞を、複数のキナーゼの活性を阻害する化合物（化合物Ｂ）、トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）−βシグナル阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤を含有する培地中で培養することにより、シュワン細胞を取得できると報告している［非特許文献２］。また、Ｃｈｅｎｇらは、バルプロ酸、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地中、低酸素条件で繊維芽細胞を培養することにより、神経前駆細胞が得られることを報告している［非特許文献３］。

実験医学、２０１２年、第３０巻、１８９−１９６頁 ステム セル リポーツ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ）、２０１４年、第３巻、５３９−５４７頁 セル リサーチ（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１４年、第２４巻、第６６５−６７９頁

本発明の目的は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、体細胞から短期間に直接かつ効率よく神経系の細胞を誘導する方法を提供することにある。

本発明者らは、治療その他の用途に使用できる神経系細胞を得る方法について鋭意研究を重ねた結果、体細胞を培養する際にＳｍａｄシグナル並びにｐ５３シグナルを阻害することにより、高効率で神経系の細胞を誘導できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、
［１］神経系細胞を製造する方法であって、Ｓｍａｄシグナル及びｐ５３シグナルの阻害下に体細胞を培養する工程を包含する方法、
［２］Ｓｍａｄシグナルがトランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤又は骨形成タンパク質シグナル阻害剤により阻害される［１］の方法。
［３］ｐ５３シグナルがｐ５３阻害剤により阻害される［１］の方法、
［４］さらにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナルの阻害下、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナルの阻害下、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下から選択される培養条件下に体細胞の培養が実施される［１］の方法、
［５］トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤及びｐ５３阻害剤と、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル阻害剤、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル阻害剤、アデニル酸サイクラーゼ活性化剤からなる群より選択される物質とを含有する培地中で体細胞の培養が実施される［４］の方法、
［６］さらにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル及び分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナルの阻害下、かつ細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下に体細胞の培養が実施される［１］の方法、
［７］トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、ｐ５３阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル阻害剤、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤を含有する培地中で体細胞の培養が実施される［６］の方法、
［８］体細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に接触させる工程を含まないことを特徴とする［１］の方法、
［９］体細胞が分化した細胞である［１］の方法、
［１０］体細胞が線維芽細胞である［９］の方法、
［１１］体細胞がヒト細胞である［１０］の方法、
［１２］［１］〜［１１］いずれかの方法で得られる神経系細胞、及び
［１３］［１２］の細胞を有効成分として含有する、神経系疾患治療用の組成物、
に関する。

本発明の方法によれば、材料に使用する体細胞の給源の年齢や背景によらず、高い効率で、かつ短期間で神経系細胞を直接誘導できる。また、細胞への外来遺伝子の挿入のリスクもなく、より安全性の高い神経系細胞の取得が可能となる。

本発明の方法で得られた神経系細胞の活動電位の測定結果を示す。 本発明の方法で得られた神経系細胞の活動電位のデータから抽出されたスパイク様波形を示す。

（１）本発明の神経系細胞の製造方法
本発明は、Ｓｍａｄシグナル及びｐ５３シグナルの阻害下に体細胞を培養する工程を包含する、神経系細胞の製造方法に関する。

生物の細胞は体細胞と生殖細胞に大きく二分される。本発明の神経系細胞の製造方法には、その出発材料として任意の体細胞が使用できる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、株化された細胞のいずれでもよい。本発明には分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞、最終分化への途上にある体細胞、初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明に使用できる体細胞としては、特に本発明を限定するものではないが、神経系細胞に属しない任意の体細胞、例えば造血系の細胞（各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等）、臓器由来の細胞（肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等）、筋組織系の細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等）、繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞が挙げられる。またこれら細胞の前駆細胞、癌細胞、各種の幹細胞（造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞等）にも本発明の方法を適用できる。

上記の体細胞の給源としては、ヒトもしくは非ヒト動物が例示されるがこれらに限定されるものではない。ヒトへの投与を目的として本発明の方法により神経系細胞を製造する場合、好ましくはレシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された体細胞が材料とされる。より好ましくはレシピエント自身より採取された体細胞が神経系細胞の誘導に供される。

本発明の方法で得られる神経系細胞にも特に限定はなく、神経細胞（ニューロン）、グリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア）、シュワン細胞が例示される。以上の最終分化した細胞の他、それらに分化することが運命づけられた種々の前駆細胞も本発明における神経系細胞に包含される。

ＳｍａｄはＴＧＦ−βスーパーファミリーの細胞内シグナル伝達を担っている一群の分子である。ＴＧＦ−βファミリーのサイトカインが結合したレセプターによりリン酸化を受けると、核内に移行して転写活性化因子として機能する。Ｓｍａｄにより伝達されるシグナルは細胞の増殖、分化、アポトーシスの制御に関わっている。

本発明の方法における「Ｓｍａｄシグナルの阻害下」の培養条件を達成するための手段には特に限定はなく、Ｓｍａｄシグナルを阻害することができる公知の手段を利用することができる。本発明にはＳｍａｄに直接作用してその機能を阻害する物質（例えば抗Ｓｍａｄ抗体やその他の薬剤）や、Ｓｍａｄ自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、Ｓｍａｄが関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＳｍａｄシグナルを阻害することができる。すなわち、ＴＧＦ−βファミリーのサイトカイン及び／又はそのレセプターの機能を阻害することにより、本発明を実施することができる。当該方法には、抗サイトカイン抗体、抗サイトカインレセプター抗体（アンタゴニスト抗体）、サイトカインレセプター阻害剤等が使用できる。本発明では、特に本発明を限定するものではないが、阻害剤として作用する物質でＴＧＦ−β及び／又は骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）が関わるシグナル伝達を阻害することにより、Ｓｍａｄシグナルを阻害することが好適である。

本発明に使用できるＴＧＦ−βシグナル阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ Ｎｏ． ３０１８３６−４１−９）、ＲｅｐＳｏｘ［Ｅ−６１６４５２］（ＣＡＳ Ｎｏ． ４４６８５９−３３−２）、Ａ−８３−０１（ＣＡＳ Ｎｏ． ９０９９１０−４３−６）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ Ｎｏ． ３９６１２９−５３−６）、ＳＤ２０８（ＣＡＳ Ｎｏ． ６２７５３６−０９−８）が例示される。また、本発明に使用できるＢＭＰシグナル阻害剤としては、ＬＤＮ−１９３１８９（ＣＡＳ Ｎｏ． １０６２３６８−２４−４）、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＣＡＳ Ｎｏ． ８６６４０５−６４−３）、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ：Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５， Ｖｏｌ． １５， ｐ６０７７−８４）が例示される。神経系細胞の誘導に有効なＴＧＦ−βシグナル阻害剤、ＢＭＰシグナル阻害剤の濃度は適宜決定すればよい。特に本発明を限定するものではないが、例えば、ＳＢ４３１５４２は０．２μＭ〜２０μＭ、ＬＤＮ−１９３１８９は０．１μＭ〜１０μＭの範囲で、それぞれ本発明の方法に使用することができる。

ｐ５３タンパク質はがん抑制遺伝子として知られているｐ５３遺伝子の産物であり、細胞周期調節やアポトーシス制御に関わっている。その機能はＤＮＡとの特異的結合並びに遺伝子発現制御を通じて発揮されている。

本発明における「ｐ５３シグナルの阻害下」の培養条件を達成するための手段には特に限定はなく、ｐ５３シグナルを阻害することができる公知の手段を利用すればよい。ｐ５３タンパク質の活性は細胞やＤＮＡのダメージの影響を受けることが知られており、適切な物理的、化学的処理を細胞に施すことでｐ５３シグナルを阻害することができる。前記の物理的処理としては振動、可視光もしくは放射線の照射、温度刺激等が挙げられる。また、抗ｐ５３タンパク質抗体や公知のｐ５３シグナル阻害剤も本発明に好適である。本発明に使用できるｐ５３阻害剤としては、ピフィスリン（Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ）−α（ＣＡＳ Ｎｏ． ６３２０８−８２−２）、ピフィスリン−β（ＣＡＳ Ｎｏ． ５１１２９６−８８−１）、ピフィスリン−μ（ＣＡＳ Ｎｏ． ６４９８４−３１−２）、ＮＳＣ６６８１１（ＣＡＳ Ｎｏ． ６９６４−６２−１）、Ｎｕｔｌｉｎ−３（ＣＡＳ Ｎｏ． ５４８４７２−６８−０）が例示される。神経系細胞の誘導に有効なｐ５３阻害剤の濃度は適宜決定すればよい。特に本発明を限定するものではないが、例えば、ピフィスリンは０．５μＭ〜５０μＭの範囲で本発明の方法に使用することができる。

本発明によれば、Ｓｍａｄシグナル及びｐ５３シグナルの阻害下で体細胞を培養することにより、神経系細胞を誘導することができる。さらに、ＧＳＫ３βシグナルの阻害下、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：ＭＡＰＫ）シグナルの阻害下、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件、のいずれかの培養条件、もしくはこれらを組合せた培養条件で培養することにより、体細胞からの神経系細胞の誘導効率を向上させることができる。

ＧＳＫ３βはグリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして見いだされた。本酵素は種々のタンパク質をリン酸化する活性を有しており、グリコーゲン代謝のみならず、細胞分裂、細胞増殖他の生理現象にも関わっている。

本発明の方法における「ＧＳＫ３βシグナルの阻害下」の培養条件には特に限定はなく、ＧＳＫ３βの活性を阻害する物質、例えば抗ＧＳＫ３β抗体やＧＳＫ３β阻害剤のようなＧＳＫ３βシグナル阻害手段を利用することができる。また、ＧＳＫ３βは自身の特定の部位がリン酸化されると活性を失うことから、当該リン酸化を促進する手段もＧＳＫ３βシグナルの阻害に利用することができる。本発明に使用できるＧＳＫ３βシグナル阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ Ｎｏ． ２５２９１７−０６−９）、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ；ＣＡＳ Ｎｏ． ６６７４６３−６２−９）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ Ｎｏ． １４２２７３−２０−９）、Ａ１０７０７２２（ＣＡＳ Ｎｏ． １３８４４２４−８０−９）が例示される。本発明の方法に有効なＧＳＫ３βシグナル阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１は０．１μＭ〜１０μＭの範囲で本発明の方法に使用することができる。

ＭＡＰＫはリン酸化を介したシグナル伝達に関わるプロテインキナーゼである。ＭＡＰＫは自身がリン酸化されると核内に移行し、主に転写活性化因子をリン酸化／活性化することにより、細胞質のシグナルを核内に伝える役割を担っている。

本発明の方法における「ＭＡＰＫシグナルの阻害下」の培養条件には特に限定はなく、ＭＡＰＫの活性を阻害する物質、例えば抗ＭＡＰＫ抗体やＭＡＰＫ阻害剤のようなＭＡＰＫシグナル阻害手段を利用することができる。また、ＭＡＰＫの活性化に関わる酵素、例えばＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）やＭＡＰＫキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）等を阻害する手段もＭＡＰＫシグナルの阻害に利用することができる。本発明に使用できるＭＡＰＫシグナル阻害剤としては、ＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ Ｎｏ． ３９１２１０−１０−９）、ＰＤ１８４３５２（ＣＡＳ Ｎｏ． ２１２６３１−７９−３）、ＰＤ９８０５９（ＣＡＳ Ｎｏ． １６７８６９−２１−８）、ＰＤ３３４５８１（ＣＡＳ Ｎｏ． ５４８７５６−６８−９）が例示される。本発明の方法に有効なＭＡＰＫシグナル阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、ＰＤ０３２５９０１は０．１μＭ〜１０μＭの範囲で本発明の方法に使用することができる。

環状アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）はセカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。ｃＡＭＰは、細胞内ではアデニル酸サイクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ）によりアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）が環状化されることで生成する。

本発明の方法における「細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下」の培養条件には特に限定はない。ｃＡＭＰの生成に関わる酵素であるアデニル酸サイクラーゼに直接作用して活性化できる物質、アデニル酸サイクラーゼの発現を促進しうる物質の他、ｃＡＭＰを分解する酵素であるホスホジエステラーゼを阻害する物質等を細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる手段として使用することができる。細胞内でｃＡＭＰと同じ作用を持つ、ｃＡＭＰの構造類似体であるジブチリルｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ ｃＡＭＰ）も本発明に使用できる、本発明に使用できるアデニル酸サイクラーゼ活性化剤としては、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ． ６６５７５−２９−９）やフォルスコリン誘導体（例えば特開２００２−３４８２４３）が例示される。本発明の方法に有効なアデニル酸サイクラーゼ活性化剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、フォルスコリンは０．５μＭ〜５０μＭの範囲で本発明の方法に使用することができる。

本発明による神経系細胞の製造では、Ｓｍａｄシグナル及びｐ５３シグナルが阻害された条件下で体細胞の培養が実施される。この際、ＧＳＫ３βシグナルを阻害する手段、ＭＡＰＫシグナルを阻害する手段、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる手段のいずれか、もしくはこれらの組合せを共存させてもよい。

本発明の好適な態様では、Ｓｍａｄシグナルを阻害する手段としてのトランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤ならびに骨形成タンパク質シグナル阻害剤、及びｐ５３シグナルを阻害する手段としてのｐ５３阻害剤に加え、ＧＳＫ３βシグナル阻害剤、ＭＡＰＫシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤から選択される１以上の物質を含有させた培地中で体細胞を培養することにより神経系細胞の誘導が実施される。前記の阻害剤、活性化剤は、神経系細胞の誘導に有効な濃度で培地に添加される。神経系細胞の誘導に有効な濃度は、適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μＭ〜５０μＭ程度である。

特に好適な態様においては、トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＧＳＫ３βシグナル阻害剤、ＭＡＰＫシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤のすべてを含有する培地中での一段階の培養で、体細胞から直接神経系の細胞が誘導される。

本発明の神経系細胞の製造方法の好適な態様では、体細胞を培養する工程においてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を使用しない。核初期化因子によるリプログラミングを促進すると言われるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を使用しない本発明の方法では、意図しない分化を起こしかねない多能性細胞が誘導されるリスクはより低いと言える。

本発明における体細胞の培養は、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、前記の各種シグナルに対する阻害手段等を発揮させて実施すればよい。培地は公知の培地や市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２やこれらを改変した培地に適切な成分（血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、脂肪酸類、抗生物質等）を添加して使用することができる。

培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ_２の条件が例示される。培養中は適切な間隔で培地の交換を実施することが好ましい。繊維芽細胞を材料として本発明の方法を実施する場合、この条件では１０日間〜３週間で神経系の細胞が出現する。使用する体細胞として培養の容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させた体細胞を神経系細胞に転換することも可能である。したがってスケールアップした神経系細胞製造も容易である。

前記の培養には、プレート、ディッシュ、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養用器材（容器）を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができるが、得られた神経系細胞のヒトへの投与等を目的とする場合には、閉鎖系で培養を実施することが好ましい。

（２）本発明の方法により得られる神経系細胞
上記の、本発明の神経系細胞の製造方法により、神経系細胞を含有する細胞集団を得ることができる。

本発明による神経系細胞の誘導は、例えば細胞の形態的変化により確認することができる。神経系の細胞は、細胞の種類によって特徴的な形態をとることから、培養前後の細胞の形態を比較することによって神経系細胞の存在を知ることができる。また、神経系細胞に特徴的な分子、例えば酵素、レセプター、低分子化合物等を検出して神経系細胞を確認することもできる。神経系細胞に特徴的な分子としては、β３−チューブリン、シナプシンＩ、ベジクル型グルタミン酸トランスポーター（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ｖＧＵＬＴ）、微小管関連タンパク質（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＡＰ）２、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、チロシン水酸化酵素等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記の分子の検出には免疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。神経系細胞に特徴的な分子を認識する抗体は、本発明により得られた神経系細胞を単離、精製するうえでも有用である。

本発明の方法により得られる神経系細胞ならびに当該細胞を含有する組成物は、神経系疾患の治療に有用である。前記神経系細胞および前記組成物が治療に有効な神経系疾患としては脊髄損傷、脳血管障害（脳梗塞等）、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記神経系細胞は、神経系疾患の治療のための医薬用組成物を製造するために使用することもできる。

本発明の神経系細胞を医薬用の組成物とする場合には、常法により、当該細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。

本発明で得られる神経系細胞は、研究、例えば神経細胞分化に関する研究や神経系疾患の医薬スクリーニング、医薬候補化合物の効能・安全性評価等に使用することもできる。本発明によれば、一度の操作で多くの神経系細胞を取得することができることから、これまでのように細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能となる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。

実施例１ ヒト線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導（１）
１） ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。使用した４つの細胞の背景情報を表１に示す。

２） ヒト線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導
表１に示したヒト繊維芽細胞を、それぞれ３５ｍｍ ディッシュに８×１０^４個ずつ撒き、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培養液で、３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で２日間インキュベートした。各細胞は下記の継代数で培養に供した。
細胞１： Ｐａｓｓａｇｅ ５（Ｐ５）とＰ２０
細胞２： Ｐ５とＰ２１
細胞３： Ｐ５とＰ１７
細胞４： Ｐ５とＰ１５

Ｓｍａｄシグナルを阻害する２つの化合物、即ちＢＭＰシグナル阻害剤であるＬＤＮ−１９３１８９（和光純薬社製：終濃度１μＭ）とＴＧＦ−βファミリー阻害剤であるＳＢ−４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ社製：終濃度２μＭ）、ＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（和光純薬社製：終濃度１μＭ）、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤であるＰＤ０３２５９０１（和光純薬社製：終濃度１μＭ）、ｐ５３シグナルの阻害剤であるピフィスリン−α（和光純薬社製：終濃度５μＭ）並びにｃＡＭＰの生産促進剤であるフォルスコリン（和光純薬社製：終濃度７．５μＭ）を含む神経細胞培地を調製した。この神経細胞培地は１％（ｖ／ｖ） Ｎ２ サプリメント（ライフテック社製）を含んだＤＭＥＭ／Ｆ１２と、２％（ｖ／ｖ） Ｂ２７ サプリメント（ライフテック社製）を含んだＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテック社製）を１：１で混合したものである。前記の、２日間培養したヒト繊維芽細胞のディッシュの培地をこの神経細胞培地に置換し、３７℃、５％ ＣＯ_２の条件で３日毎に培地交換し培養を継続した。

３） 神経系細胞の評価
ａ）神経細胞マーカーの細胞免疫染色
３週間培養したヒト線維芽細胞は、形態的に神経細胞に類似していた。この細胞を２％ ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で固定した後、免疫染色を行った。細胞免疫染色で使用した抗体は、次の通りである。Ｔｕｊ１について、陽性となった細胞（神経系細胞）の存在比を表２に示す。
マウス抗βIII−ｔｕｂｕｌｉｎ［Ｔｕｊ１］（Ｃｏｖａｎｃｅ社製；ＭＭＳ−４３５Ｐ）
ウサギ抗βIII−ｔｕｂｕｌｉｎ［Ｔｕｊ１］（Ｃｏｖａｎｃｅ社製；ＰＲＢ−４３５Ｐ）
ウサギ抗ＭＡＰ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）

表２に示す通り、６種の物質を含有する培地を使用した場合には、材料とした細胞の給源の違い（年齢、性別、細胞採取部位）にかかわらず、８０％を超える高い効率で神経系細胞マーカーであるＴｕｊ１陽性の細胞が出現した。また、どの細胞でも誘導開始前の継代数が誘導効率に影響を与えなかったことから、本発明の方法では細胞自体の老化の影響を受けないことも明らかとなった。さらに、得られた神経系細胞では成熟した神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２の発現も確認された。

以上のことから、上記６物質を培養時に使用することによって繊維芽細胞から神経系細胞への直接誘導が可能であることが示された。

ｂ）神経系細胞の機能的評価
上記ａ）同様の操作により固定した細胞を下記の各抗体を用いた免疫染色に供し、神経細胞の機能を評価した。
マウス抗βIII−ｔｕｂｕｌｉｎ［Ｔｕｊ１］（Ｃｏｖａｎｃｅ社製；ＭＭＳ−４３５Ｐ）
ウサギ抗ｖＧＬＵＴ１（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）
ウサギ抗ＧＡＢＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
ウサギ抗Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）

作製された神経系細胞はグルタミン酸作動性マーカーであるｖＧＬＵＴ−１を発現しており、また、抑制性神経伝達物質マーカーであるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の存在が確認されたが、ドーパミン作動性マーカーであるＴｙｒｏｓｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅの発現は確認できなかった。よって、本発明で作製した神経細胞はグルタミン酸作動性神経細胞と抑制性神経細胞の両面性を持っていると推測できる。

実施例２ ヒト線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導（２）
実施例１で使用された６種の物質を含有する神経細胞培地、ならびにこれら６種類の物質のそれぞれ１つを欠いた神経細胞培地を使用して線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導を行った。また、対照として６種の物質すべてを含有しない神経細胞培地での培養も実施した。

上記の各培地を使用し、実施例１記載の細胞２（Ｐ５）を実施例１に記載のように培養した。培養２週間後に細胞を２％ ＰＦＡで固定し、マウス抗βIII−ｔｕｂｕｌｉｎを用いた免疫染色を行った。この結果を表３に示す。表中、「６ｃ−［化合物名］」との記載は、６種の物質を含有する神経細胞培地から当該化合物を除いた培地が使用されていることを示す。

表３に示す通り、６種の物質を含有する培地を使用した場合には高効率で神経系細胞が誘導された。ピフィスリン−αを欠く培地、６種の物質をすべて含有しない培地では神経系細胞は出現しなかったが、他の培地では神経系培地の誘導が確認された。すなわち、このことから、線維芽細胞からの神経細胞直接誘導にはｐ５３シグナルを阻害することが必須であると推測された。

また、ＬＤＮ−１９３１８９とＳＢ−４３１５４２の２つを欠く培地、すなわちＳｍａｄシグナルを阻害する手段が存在しない状態で培養を行った場合にも神経系細胞の誘導は観察されなかった。

以上の結果より、培養時にｐ５３シグナルおよびＳｍａｄシグナルの２つの経路を阻害することが、線維芽細胞からの神経系細胞の直接誘導に必須であることが示された。

実施例３ ヒト線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導（３）
実施例１記載の細胞２（Ｐ５）を、実施例１に記載された６種の物質を含有する神経細胞培地中で、実施例１と同じ条件で培養した。前記培地での培養開始から１週間後、２週間後、３週間後、４週間後に細胞の一部を採取して２％ ＰＦＡで固定し、それぞれマウス抗βIII−ｔｕｂｕｌｉｎを用いた免疫染色を行ってＴｕｊ１陽性細胞を定量した。この結果を表４に示す。

表４に示す通り、６種の物質を含有する培地では、培養開始から２週間後に神経系細胞の割合は５０％を超えていた。また、神経系細胞の誘導はほぼ３週間で最高値にまで達することが示された。

実施例４ 活動電位の測定
１）神経系細胞の誘導
実施例１と同じ操作でヒト繊維芽細胞（４８歳女性ｓｋｉｎ／ｌａｂｉａ由来）から神経系細胞を誘導した。４週間の培養で誘導した神経系細胞を０．２５％トリプシン（和光純薬）を用いて剥離し、神経細胞培地［１％（ｖ／ｖ） Ｎ２ サプリメント（ライフテック社製）を含んだＤＭＥＭ／Ｆ１２と、２％（ｖ／ｖ） Ｂ２７ サプリメント（ライフテック社製）を含んだＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテック社製）の１：１混合物］に懸濁した。

２）活動電位の測定
神経細胞活動電位の測定にはマイクロエレクトロード・アレイシステム（ＭＥＤ６４−Ｂａｓｉｃ ｓｙｓｔｅｍ：アルファメッドサイエンティフィック株式会社）を使用した。使用に先立って、電極を備えたＭＥＤプローブの表面をコラーゲンでコートした。まず、神経細胞培地でコラーゲン（セルマトリックス Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｃ：新田ゼラチン）の１０倍希釈液を調製した。このコラーゲン溶液をＭＥＤプローブに添加して１０分間放置した後にコラーゲン溶液をプローブから除去し、クリーンベンチ内で紫外線を照射しながらプローブを風乾した。

コラーゲンでコートされたＭＥＤプローブを滅菌水で３回洗浄した後、実施例４−１）で得た神経系細胞の懸濁液をプローブに添加し、実施例４−１）で使用した培地中、３７℃で７日間培養した。その後、プローブをマイクロエレクトロード・アレイシステムに接続して活動電位を測定した。図１に、電位を経時的に測定して得られた波形の例を示す。図１中、横軸は経過時間、縦軸は電圧を示す。図２は活動電位のデータから抽出されたスパイク様波形を示す。この図では２０の波形を重ねあわせて表示したものであり、それらを平均した波形を実線で示している。このように、本発明の方法により得られた神経系細胞は活動電位を発生するものであることが確認された。

実施例５ ヒト線維芽細胞からの神経細胞直接誘導（４）
実施例１で使用された６種の物質を含有する神経細胞培地に、さらにＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＢＭＰシグナル阻害剤：和光純薬）を終濃度５μＭとなるように添加した。この培地を使用して線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導を行った。

実施例１と同様に１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地中で前培養したヒト線維芽細胞について、培地を前記の神経細胞培地に交換して３７℃、５％ ＣＯ_２の条件で３日毎に培地交換しながら培養を行った。１１日間の培養後の細胞について抗Ｔｕｊ１抗体、抗ＭＡＰ２抗体、抗ＳｎｙｎａｐｓｉｎＩ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた免疫染色を実施し、これらマーカーが陽性の神経系細胞が得られていることを確認した。また、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎの終濃度を１μＭ、１０μＭにそれぞれ変更して培養を行った場合も、ほぼ同様の結果が得られた。

このように、複数の化合物でＢＭＰシグナルを阻害することによっても神経系細胞を誘導することが可能であることが明らかとなった。また、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎを併用したことにより、神経系細胞の出現までの期間が短縮された。

本発明により、高い効率で、かつ短期間で神経系細胞を直接誘導可能な方法が提供される。本発明の方法は、材料に使用する体細胞の性質や背景の影響を受けないこと、スケールアップも容易であることから、安定した神経系細胞の供給を可能とする。本発明の方法により得られる神経系細胞は各種の研究、医療の分野において有用である。

Claims (4)

1. 神経系細胞を製造する方法であって、トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤及びｐ５３阻害剤を含有する培地中で体細胞を１０日間以上培養する工程を包含する方法であって、体細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に接触させる工程を含まないこと、および人為的な遺伝子導入工程を含まないことを特徴とし、ここに、該体細胞がヒト線維芽細胞であり、該神経系細胞がグルタミン酸作動性神経細胞及び抑制性神経細胞である、方法。
2. トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤及びｐ５３阻害剤と、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル阻害剤、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル阻害剤、アデニル酸サイクラーゼ活性化剤からなる群より選択される物質とを含有する培地中で体細胞の培養が実施される請求項１記載の方法。
3. トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、ｐ５３阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル阻害剤、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤を含有する培地中で体細胞の培養が実施される請求項２記載の方法。
4. 請求項１〜３のいずれか記載の方法により神経系細胞を製造し、該神経系細胞を有効成分として含有させることを含む、神経系疾患治療用の組成物の製造方法。

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