JP6383436B2 - 神経系細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
神経系疾患もその例外ではなく、脊髄損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症等の疾患について、胚性幹細胞(ES細胞)や人工多能性幹細胞(iPS細胞)に由来する神経系の細胞もしくは神経前駆細胞を使用した治療の可能性について検討が行われている。
[1]神経系細胞を製造する方法であって、Smadシグナル及びp53シグナルの阻害下に体細胞を培養する工程を包含する方法、
[2]Smadシグナルがトランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤又は骨形成タンパク質シグナル阻害剤により阻害される[1]の方法。
[3]p53シグナルがp53阻害剤により阻害される[1]の方法、
[4]さらにグリコーゲン合成酵素キナーゼ3βシグナルの阻害下、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナルの阻害下、細胞内cAMP濃度を増加させる条件下から選択される培養条件下に体細胞の培養が実施される[1]の方法、
[5]トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤及びp53阻害剤と、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3βシグナル阻害剤、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル阻害剤、アデニル酸サイクラーゼ活性化剤からなる群より選択される物質とを含有する培地中で体細胞の培養が実施される[4]の方法、
[6]さらにグリコーゲン合成酵素キナーゼ3βシグナル及び分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナルの阻害下、かつ細胞内cAMP濃度を増加させる条件下に体細胞の培養が実施される[1]の方法、
[7]トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、p53阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3βシグナル阻害剤、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤を含有する培地中で体細胞の培養が実施される[6]の方法、
[8]体細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に接触させる工程を含まないことを特徴とする[1]の方法、
[9]体細胞が分化した細胞である[1]の方法、
[10]体細胞が線維芽細胞である[9]の方法、
[11]体細胞がヒト細胞である[10]の方法、
[12][1]〜[11]いずれかの方法で得られる神経系細胞、及び
[13][12]の細胞を有効成分として含有する、神経系疾患治療用の組成物、
に関する。
本発明は、Smadシグナル及びp53シグナルの阻害下に体細胞を培養する工程を包含する、神経系細胞の製造方法に関する。
上記の、本発明の神経系細胞の製造方法により、神経系細胞を含有する細胞集団を得ることができる。
1) ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はDSファーマバイオメディカル株式会社から購入した。使用した4つの細胞の背景情報を表1に示す。
表1に示したヒト繊維芽細胞を、それぞれ35mm ディッシュに8×104個ずつ撒き、10%FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを添加したDMEM high glucose培養液で、37℃、5% CO2の条件下で2日間インキュベートした。各細胞は下記の継代数で培養に供した。
細胞1: Passage 5(P5)とP20
細胞2: P5とP21
細胞3: P5とP17
細胞4: P5とP15
a)神経細胞マーカーの細胞免疫染色
3週間培養したヒト線維芽細胞は、形態的に神経細胞に類似していた。この細胞を2% PFA(パラホルムアルデヒド)で固定した後、免疫染色を行った。細胞免疫染色で使用した抗体は、次の通りである。Tuj1について、陽性となった細胞(神経系細胞)の存在比を表2に示す。
マウス抗βIII−tubulin[Tuj1](Covance社製;MMS−435P)
ウサギ抗βIII−tubulin[Tuj1](Covance社製;PRB−435P)
ウサギ抗MAP2(Millipore社製)
上記a)同様の操作により固定した細胞を下記の各抗体を用いた免疫染色に供し、神経細胞の機能を評価した。
マウス抗βIII−tubulin[Tuj1](Covance社製;MMS−435P)
ウサギ抗vGLUT1(Synaptic Systems社製)
ウサギ抗GABA(Sigma−Aldrich社製)
ウサギ抗Tyrosine Hydroxylase(Millipore社製)
実施例1で使用された6種の物質を含有する神経細胞培地、ならびにこれら6種類の物質のそれぞれ1つを欠いた神経細胞培地を使用して線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導を行った。また、対照として6種の物質すべてを含有しない神経細胞培地での培養も実施した。
実施例1記載の細胞2(P5)を、実施例1に記載された6種の物質を含有する神経細胞培地中で、実施例1と同じ条件で培養した。前記培地での培養開始から1週間後、2週間後、3週間後、4週間後に細胞の一部を採取して2% PFAで固定し、それぞれマウス抗βIII−tubulinを用いた免疫染色を行ってTuj1陽性細胞を定量した。この結果を表4に示す。
1)神経系細胞の誘導
実施例1と同じ操作でヒト繊維芽細胞(48歳女性skin/labia由来)から神経系細胞を誘導した。4週間の培養で誘導した神経系細胞を0.25%トリプシン(和光純薬)を用いて剥離し、神経細胞培地[1%(v/v) N2 サプリメント(ライフテック社製)を含んだDMEM/F12と、2%(v/v) B27 サプリメント(ライフテック社製)を含んだNeurobasal Medium(ライフテック社製)の1:1混合物]に懸濁した。
神経細胞活動電位の測定にはマイクロエレクトロード・アレイシステム(MED64−Basic system:アルファメッドサイエンティフィック株式会社)を使用した。使用に先立って、電極を備えたMEDプローブの表面をコラーゲンでコートした。まず、神経細胞培地でコラーゲン(セルマトリックス Type I−C:新田ゼラチン)の10倍希釈液を調製した。このコラーゲン溶液をMEDプローブに添加して10分間放置した後にコラーゲン溶液をプローブから除去し、クリーンベンチ内で紫外線を照射しながらプローブを風乾した。
実施例1で使用された6種の物質を含有する神経細胞培地に、さらにDorsomorphin(BMPシグナル阻害剤:和光純薬)を終濃度5μMとなるように添加した。この培地を使用して線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導を行った。
Claims (4)
- 神経系細胞を製造する方法であって、トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤及びp53阻害剤を含有する培地中で体細胞を10日間以上培養する工程を包含する方法であって、体細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に接触させる工程を含まないこと、および人為的な遺伝子導入工程を含まないことを特徴とし、ここに、該体細胞がヒト線維芽細胞であり、該神経系細胞がグルタミン酸作動性神経細胞及び抑制性神経細胞である、方法。
- トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤及びp53阻害剤と、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3βシグナル阻害剤、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル阻害剤、アデニル酸サイクラーゼ活性化剤からなる群より選択される物質とを含有する培地中で体細胞の培養が実施される請求項1記載の方法。
- トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、p53阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3βシグナル阻害剤、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤を含有する培地中で体細胞の培養が実施される請求項2記載の方法。
- 請求項1〜3のいずれか記載の方法により神経系細胞を製造し、該神経系細胞を有効成分として含有させることを含む、神経系疾患治療用の組成物の製造方法。
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