JP7406196B2 - 神経様細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、体細胞から神経様細胞をより速やかに直接誘導する方法、即ち、体細胞から神経様細胞をより速やかに直接製造することができる新たな製造方法を提供することを主な課題とする。
[1]TGF-β阻害剤及びBMP阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含み、当該TGF-β阻害剤が選択的ALK5阻害剤であることを特徴とする、神経様細胞の製造方法。
[2]TGF-β阻害剤及びBMP阻害剤の2種、並びにcAMP誘導剤、GSK3阻害剤、Erk阻害剤、及びp53阻害剤からなる4種群から選択されるいずれか3種以上の存在下で体細胞を培養する工程を含み、当該TGF-β阻害剤が選択的ALK5阻害剤であることを特徴とする、神経様細胞の製造方法。
[3]前記BMP阻害剤がALK2・3阻害剤である、上記[1]又は[2]に記載の神経様細胞の製造方法。
[4]前記TGF-β阻害剤がレプソックス(CAS No.:446859-33-2)、並びに/又は前記BMP阻害剤がLDN193189(CAS No.:1062368-24-4)及び/若しくはドルソモルフィン(CAS No.:866405-64-3)である、上記[1]~[3]のいずれか一項に記載の神経様細胞の製造方法。
[5]前記cAMP誘導剤がフォルスコリン(CAS No.:66428-89-5)、前記GSK3阻害剤がCHIR99021(CAS No.:252917-06-9)、前記Erk阻害剤がPD0325901(CAS No.:391210-10-9)、又は前記p53阻害剤がピフィスリン-α(CAS No.:63208-82-2)である、上記[1]~[4]のいずれか一項に記載の神経様細胞の製造方法。
[6]前記工程が、成長因子及び/又はサイトカインの非存在下で体細胞を培養する工程である、上記[1]~[5]のいずれか一項に記載の神経様細胞の製造方法。
[7]前記工程が、ヒストンに関与する成分の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記[1]~[6]のいずれか一項に記載の神経様細胞の製造方法。
[8]前記体細胞が線維芽細胞である、上記[1]~[7]のいずれか一項に記載の神経様細胞の製造方法。
[9]上記[1]~[8]のいずれか一項に記載の神経様細胞の製造方法から製造される、神経様細胞。
[11]TGF-β阻害剤及びBMP阻害剤の2種、並びにcAMP誘導剤、GSK3阻害剤、Erk阻害剤、及びp53阻害剤からなる4種群から選択されるいずれか3種以上を含み、当該TGF-β阻害剤が選択的ALK5阻害剤であることを特徴とする、体細胞から神経様細胞を製造するための組成物。
[12]前記BMP阻害剤がALK2・3阻害剤である、上記[10]又は[11]に記載の組成物。
[13]前記TGF-β阻害剤がレプソックス(CAS No.:446859-33-2)、並びに/又は前記BMP阻害剤がLDN193189(CAS No.:1062368-24-4)及び/若しくはドルソモルフィン(CAS No.:866405-64-3)である、上記[10]~[12]のいずれか一項に記載の組成物。
[14]前記cAMP誘導剤がフォルスコリン(CAS No.:66428-89-5)、前記GSK3阻害剤がCHIR99021(CAS No.:252917-06-9)、前記Erk阻害剤がPD0325901(CAS No.:391210-10-9)、又は前記p53阻害剤がピフィスリン-α(CAS No.:63208-82-2)である、上記[10]~[13]のいずれか一項に記載の組成物。
[15]前記体細胞が線維芽細胞である、上記[10]~[14]のいずれか一項に記載の組成物。
本発明に係る、神経様細胞の製造方法(以下、「本発明製法」という。)は、TGF-β阻害剤及びBMP阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含み、当該TGF-β阻害剤が選択的ALK5阻害剤であることを特徴とする。あるいは、本発明製法は、TGF-β阻害剤及びBMP阻害剤の2種、並びにcAMP誘導剤、GSK3阻害剤、Erk阻害剤、及びp53阻害剤からなる4種群から選択されるいずれか3種以上の存在下で体細胞を培養する工程を含み、当該TGF-β阻害剤が選択的ALK5阻害剤であることを特徴とする。
上記阻害剤や誘導剤は、それぞれにおいて、1種を用いても2種以上を併用してもよい。
具体的な上記阻害剤等においては、2種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等が存在しているとみなすことができる。
生物の細胞は、体細胞と生殖細胞とに分類できる。本発明製法には、その出発材料として任意の体細胞を使用することができる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、又は株化された細胞の何れでもよい。本発明製法では、分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞、最終分化への途上にある体細胞、又は初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明製法に使用できる体細胞としては、任意の体細胞、例えば、造血系の細胞(各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等)、臓器由来の細胞(肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等)、筋組織系の細胞(骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等)、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞(白色脂肪細胞等)、胚性幹細胞(ES細胞)等が挙げられる。また、これらの細胞の前駆細胞、癌細胞にも本発明製法を適用できる。好ましくは、線維芽細胞を使用することができる。
1.2.1 TGF-β阻害剤(選択的ALK5阻害剤)
TGF-β(transforming growth factor-β、形質転換増殖因子β)には、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3の3種類が存在し、ほぼ全ての細胞から生産されている。TGF-βは、上皮細胞をはじめ、多くの細胞の増殖を抑制するなど細胞増殖、形質転換、分化、発生、アポトーシスの制御等の多種多様な細胞機能に関与している。
「選択的ALK5阻害剤の存在下」とは、ALK5をほぼ限定的に阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ALK5をほぼ限定的に阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ALK5に限定的に直接作用してその機能を阻害する物質(例えば、抗ALK5抗体やその他の薬剤)、ALK5自体の産生を限定的に抑制する薬剤等を利用することができる。また、ALK5を限定的に阻害することができるのであれば、ALK5が関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもよい。
BMP(Bone Morphogenetic Protein、骨形成タンパク質)は、TGF-βスーパーファミリーに属する成長因子であり、胚や組織の発生、細胞の分化、細胞死などを制御している。BMPは細胞膜上のI型受容体とII型受容体に結合してヘテロ四量体を形成し、転写因子SMADのリン酸化を経て核内にBMPシグナルを伝達する。BMP阻害剤の多くは、BMPの結合によって活性化されたI型受容体であるALK(Activin receptor-like kinase)-2,3,6によるSMADのリン酸化を阻害する。
「ALK2・3阻害剤の存在下」とは、ALK2及び3の両方を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ALK2及び3の両方を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ALK2及び3の両方に直接作用してその機能を阻害する物質(例えば、抗ALK2・3抗体やその他の薬剤)、ALK2及び3自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ALK2及び3の両方を阻害することができるのであれば、ALK2及び3が関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもよい。
Dorsomorphin dihydrochloride(CAS No.:1219168-18-9)
DMH1(CAS No.:1206711-16-1)
K02288(CAS No.:1431985-92-0)
LDN212854(CAS No.:1432597-26-6)
LDN193189 HCl(CAS No.:1062368-62-0)
ML347(CAS No.:1062368-49-3)
LDN214117(CAS No.:1627503-67-6)
cAMP(環状アデノシン1リン酸)は、セカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。cAMPは、細胞内ではアデニル酸シクラーゼ(adenylate cyclase)によりアデノシン3リン酸(ATP)が環状化されることで生成する。
NKH477(CAS No.:138605-00-2)
PACAP1-27(CAS No.:127317-03-7)
PACAP1-38(CAS No.:137061-48-4)
GSK3(glycogen synthase kinase-3、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3)は、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして見いだされた。哺乳類では、GSK3は51kDaのα(GSK3α)と47kDaのβ(GSK3β)の二つのアイソフォームに分類される。GSK3は種々のタンパク質をリン酸化する活性を有しており、グリコーゲン代謝のみならず、細胞分裂、細胞増殖等の生理現象にも関わっている。
Kenpaullone(CAS No.:142273-20-9)
A1070722(CAS No.:1384424-80-9)
SB216763(CAS No.:280744-09-4)
CHIR98014(CAS No.:556813-39-9)
TWS119(CAS No.:601514-19-6)
Tideglusib(CAS No.:865854-05-3)
SB415286(CAS No.:264218-23-7)
Bikinin(CAS No.:188011-69-0)
IM-12(CAS No.:1129669-05-1)
1-Azakenpaullone(CAS No.:676596-65-9)
LY2090314(CAS No.:603288-22-8)
AZD1080(CAS No.:612487-72-6)
AZD2858(CAS No.:486424-20-8)
AR-A014418(CAS No.:487021-52-3)
TDZD-8(CAS No.:327036-89-5)
Indirubin(CAS No.:479-41-4)
Erkは、EGF(上皮増殖因子)、血清刺激又は酸化ストレスなどによって活性化されるMAPKのサブファミリーで、Erkはその関わるシグナル伝達経路の違いからERK1/2、ERK5、ERK7、ERK8に分けられる。上皮増殖因子受容体(EGFR)などのチロシンキナーゼ受容体にリガンドが結合することでシグナルが流れた結果、Erkの活性化ループに存在するTEYモチーフがリン酸化されて活性化する。
AZD8330(CAS No.:869357-68-6)
BIX02188(CAS No.:334949-59-6)
BIXO2189(CAS No.:1265916-41-3)
CI-1040(CAS No.:212631-79-3)
Cobimetirlib(CAS No.:934660-93-2)
GDC-0623(CAS No.:1168091-68-6)
MEk162(CAS No.:606143-89-9)
PD318088(CAS No.:391210-00-7)
PD98059(CAS No.:167869-21-8)
Refametinib(CAS No.:923032-37-5)
RO4987655(CAS No.:874101-00-5)
SCH772984(CAS No.:942183-80-4)
Selumetinib(CAS No.:606143-52-6)
SL327(CAS No.:305350-87-2)
Trametinib(CAS No.:871700-17-3)
ARRY-142886(CAS No.:606143-52-6)
XL518(CAS No.:934660-93-2)
RDEA119(CAS No.:923032-38-6)
p53は、最も重要な癌抑制遺伝子の一つであり、細胞増殖を抑制し、がんの抑制に重要な役割を担っている。また種々のストレスに応答して標的遺伝子を活性化し、細胞周期の停止、アポトーシス、DNA修復、細胞老化などに対する起点となっている。
ピフィスリン-μ(CAS No.:64984-31-2)
NSC66811(CAS No.:6964-62-1)
Nultin-3(CAS No.:548472-68-0)
本発明においては特に限定されないが、製造工程において、成長因子及び/又はサイトカインの非存在下で体細胞を培養することが好ましい。成長因子及び/又はサイトカインの非存在下とは、成長因子及び/又はサイトカインが実質的に存在しないことを意味し、成長因子及び/又はサイトカインが全く存在しない場合だけでなく、成長因子及び/又はサイトカインが痕跡量で存在する場合を包含するものとする。成長因子及び/又はサイトカインの非存在下で体細胞を培養することの利点としては、安価に神経様細胞を製造できることが挙げられる。
成長因子とは、生体内において特定の細胞の増殖や分化を促進する内因性タンパク質の総称である。サイトカインとは、免疫系細胞から分泌されるタンパク質で、標的細胞は特定されない情報伝達を担う。サイトカインとしては、免疫や炎症に関係したものが多く、細胞の増殖、分化、細胞死、又は創傷治癒に関係するものもある。なお、成長因子にはサイトカインに含まれるものもあり、互いに排他的な概念ではない。
本発明製法における体細胞の培養は、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種の阻害剤(及び、場合により誘導剤ないし活性化剤)の存在下において実施すればよい。培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるMEM(最少必須培地)、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)、DMEM/F12、又はこれらを改変した培地に、適切な成分(血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等)を添加して使用することができる。
本発明製法においては、上記した各種の阻害剤等を含む培地において体細胞を培養することにより、一段階の培養によって体細胞から神経様細胞を製造することができる。
上記した本発明製法により、神経様細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明製法により製造される神経様細胞も本発明の範囲内である。本発明製法で製造される神経様細胞としては、特に限定されないが、神経細胞(ニューロン)、グリア細胞(アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア)、シュワン細胞などが例示される。上記した最終分化した細胞の他、神経様細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。
本発明製法で製造される神経様細胞は、さらに神経様細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。
本発明に係る組成物(以下、「本発明組成物」という。)は、体細胞から神経様細胞を製造するための組成物であって、TGF-β阻害剤及びBMP阻害剤を含み、当該TGF-β阻害剤が選択的ALK5阻害剤であることを特徴とする。あるいは、本発明組成物は、TGF-β阻害剤及びBMP阻害剤の2種、並びにcAMP誘導剤、GSK3阻害剤、Erk阻害剤、及びp53阻害剤からなる4種群から選択されるいずれか3種以上を含み、当該TGF-β阻害剤が選択的ALK5阻害剤であることを特徴とする。
上記阻害剤や誘導剤は、それぞれにおいて、1種を用いても2種以上を併用してもよい。
具体的な上記阻害剤等においては、2種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等を含んでいるとみなすことができる。
上記した阻害剤や誘導剤等の具体例や好ましい例などは、前記と同義である。
(1)ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はDSファーマバイオメディカル株式会社から購入した。38才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。
ヒト線維芽細胞を35mmディッシュに8×104個ずつ播種し、10%ウシ胎児血清(Fetal bovine serum;FBS)、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを添加したDMEM high glucose培地(和光純薬工業社製)で、37℃、5%CO2条件下で3日間培養した。なおDMEMは、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)を示す。
上記(2)に従って培養した結果を図1~5に示す。
図1に示す通り、TGF-β阻害剤として選択的ALK5阻害剤を用いて培養した実施例1及び2は、6日目(Day6)にして、TGF-β阻害剤として広範囲のALK4、5、7阻害剤を用いて培養した比較例1~3における11日目(Day11)に匹敵する同等な神経様細胞の誘導効果を示した。
図4から明らかな通り、TGF-β阻害剤として選択的ALK5阻害剤を用いて培養した実施例1における培養開始7日後と、TGF-β阻害剤として広範囲のALK4、5、7阻害剤を用いて培養した比較例1における培養開始14日後とにおいて、ほぼ同等の神経様細胞が得られた。
Claims (9)
- 生体外において、皮膚線維芽細胞から直接分化誘導することにより神経様細胞を製造する方法であって、
(1)TGF-β阻害剤及びBMP阻害剤の2種、並びに
(2)cAMP誘導剤、GSK3阻害剤、Erk阻害剤、及びp53阻害剤の4種
の存在下で出発材料としての皮膚線維芽細胞を培養する工程を含み、当該TGF-β阻害剤が選択的ALK5阻害剤のレプソックス(CAS No.:446859-33-2)であることを特徴とする、神経様細胞の製造方法(但し、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の存在下の工程を含む製造方法を除く。)。 - 前記BMP阻害剤がALK2・3阻害剤である、請求項1に記載の神経様細胞の製造方法。
- 前記BMP阻害剤がLDN193189(CAS No.:1062368-24-4)及び/若しくはドルソモルフィン(CAS No.:866405-64-3)である、請求項1又は2に記載の神経様細胞の製造方法。
- 前記cAMP誘導剤がフォルスコリン(CAS No.:66428-89-5)、前記GSK3阻害剤がCHIR99021(CAS No.:252917-06-9)、前記Erk阻害剤がPD0325901(CAS No.:391210-10-9)、又は前記p53阻害剤がピフィスリン-α(CAS No.:63208-82-2)である、請求項1~3のいずれか一項に記載の神経様細胞の製造方法。
- 前記工程が、成長因子及び/又はサイトカインの非存在下で体細胞を培養する工程である、請求項1~4のいずれか一項に記載の神経様細胞の製造方法。
- 皮膚線維芽細胞から直接分化誘導することにより神経様細胞を製造するための組成物であって、
(1)TGF-β阻害剤及びBMP阻害剤の2種、並びに
(2)cAMP誘導剤、GSK3阻害剤、Erk阻害剤、及びp53阻害剤の4種
を含み、当該TGF-β阻害剤が選択的ALK5阻害剤のレプソックス(CAS No.:446859-33-2)であることを特徴とする、前記組成物(但し、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含むものを除く。)。 - 前記BMP阻害剤がALK2・3阻害剤である、請求項6に記載の組成物。
- 前記BMP阻害剤がLDN193189(CAS No.:1062368-24-4)及び/若しくはドルソモルフィン(CAS No.:866405-64-3)である、請求項6又は7に記載の組成物。
- 前記cAMP誘導剤がフォルスコリン(CAS No.:66428-89-5)、前記GSK3阻害剤がCHIR99021(CAS No.:252917-06-9)、前記Erk阻害剤がPD0325901(CAS No.:391210-10-9)、又は前記p53阻害剤がピフィスリン-α(CAS No.:63208-82-2)である、請求項6~8のいずれか一項に記載の組成物。
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