CN111684059A - 心肌细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的主要课题在于提供不进行人工基因导入而由体细胞制备心肌细胞的方法、通过该制备方法得到的心肌细胞、或者包含可以用于该制备方法的化学物质的组合的组合物。作为本发明，可以举出例如：一种心肌细胞的制备方法，其是通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的方法，该方法包括：在MEK抑制剂及cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序；通过该制备方法得到的心肌细胞；以及一种用于由体细胞制备心肌细胞的组合物，其是用于通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的组合物，所述组合物包含MEK抑制剂及cAMP诱导剂。通过本发明得到的心肌细胞在再生医学方面是有用的。

Description

心肌细胞的制备方法
技术领域
(相关申请的相互参照)
本申请基于2018年1月30日提出申请的日本申请号第2018-13301号主张优先权，并将其公开内容全部导入本说明书的一部分。
本发明属于再生医学或由体细胞直接重编程(Direct Reprogramming)的技术领域。本发明涉及该技术领域中利用低分子化合物由体细胞直接制备心肌细胞的方法、以及利用所述制备方法制备的低分子化合物诱导性心肌细胞(ciCMs：chemical compoundinduced-Cardiomyocytes)。本发明还涉及该心肌细胞、以及可用于制备该心肌细胞的方法的组合物。
背景技术
随着近年来细胞相关研究的发展、特别是与多能细胞相关的研究的发展，以能够用于对个体进行移植的品质及量获得治疗用细胞正在变为可能。对于一些疾病，已经开始尝试将对治疗有效的细胞移植于患者。
间充质细胞形成了肌肉、骨、软骨、骨髓、脂肪及结缔组织等生物体的各种器官，有望作为再生医学的材料。间充质干细胞(mesenchymal stem cell：MSC)是存在于骨髓、脂肪组织、血液、胎盘及脐带等组织中的未分化细胞。由于具有分化为属于间充质系统的细胞的能力，因此间充质干细胞作为制备这些细胞时的起始材料而备受关注。另外，也正在研究利用间充质干细胞本身来重建骨、软骨、心肌等的再生医学。
另一方面，也报道了将成纤维细胞这样的体细胞直接转化为其它细胞的方法。例如，已知通过将成纤维细胞和化学物质一起进行培养而得到神经细胞(非专利文献1)。
对于心肌细胞，已知通过和包含GSK3抑制剂(CHIR99021)等的一定的化学物质一起进行培养，可由鼠胚胎成纤维细胞直接诱导(非专利文献2)。同样地，已知可以由人包皮成纤维细胞(HFF)或人胚肺成纤维细胞(HLF)直接诱导(非专利文献3)。
另外，专利文献1中记载了利用包含WNT激动剂、GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、细胞外信号调节激酶(ERK1)、Ras GTPase活性蛋白质抑制剂(Ras-GAP)、Oct-4激活剂、Rho相关的卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、铁螯合剂、KDM5B抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂、以及PDGF酪氨酸激酶抑制剂中的至少5种的组合物由人成纤维细胞直接诱导心肌细胞的发明。专利文献2中记载了通过在选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下、并且在cAMP激活剂、ALK5抑制剂(TGF-β抑制剂)及ERK抑制剂的存在下对体细胞进行培养，由人成纤维细胞直接诱导心肌细胞的发明。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2016/0186141号公报
专利文献2：国际公开第2018/062269号
非专利文献
非专利文献1：Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition,2015年，56卷，3号，166-170页
非专利文献2：Cell Research,2015年，25卷，1013-1024页
非专利文献3：Science,2016年，352卷，1216-1220页
发明内容
发明要解决的课题
如非专利文献1中记载的方法那样，不进行基因导入而直接进行由体细胞至希望细胞的转化的方法有时是作为获得治疗用细胞的方式的有效选项。对于心肌细胞，如上所述，实际上通过与一定的化学物质一起进行培养而直接诱导，但在非专利文献2所记载的发明中是由小鼠成纤维细胞进行的直接诱导，并不是由人成纤维细胞的直接诱导。另外，在非专利文献3中记载的发明中，由人成纤维细胞直接诱导了心肌细胞，但其需要由ES细胞分化而成的心肌细胞的上清。对于专利文献1、2中记载的发明，由人成纤维细胞直接诱导了心肌细胞。
本发明的主要课题在于提供不进行人工基因导入、而利用与专利文献1、2中记载的发明不同的低分子化合物的组合来由体细胞直接诱导心肌细胞的方法，即，提供可以利用一定的低分子化合物的组合物由体细胞直接制备心肌细胞的新制备方法。
解决课题的方法
本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过在一定的低分子抑制剂等的存在下对体细胞进行培养，可以将体细胞直接转化为心肌细胞，从而完成了本发明。
作为本发明，例如，可以列举下述内容。
[1]一种心肌细胞的制备方法，其是通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的方法，该方法包括：在MEK抑制剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
[2]根据上述[1]所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述工序是进一步在cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
[3]根据上述[1]或[2]所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述工序是进一步在选自TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂中的至少1种的存在下对体细胞进行培养的工序。
[4]根据上述[3]所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述工序是进一步在ERK抑制剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
[5]根据上述[1]～[3]中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述工序是在以下(1)～(6)中的任意组合的存在下对体细胞进行培养的工序。
(1)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及TGF-β抑制剂、
(2)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及PDE4抑制剂、
(3)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及GR激动剂、
(4)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂、
(5)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂、
(6)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂。
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述工序是进一步在选自RAR激动剂、RXR激动剂、以及PDK1激活剂中的至少1种的存在下对体细胞进行培养的工序。
[7]根据上述[1]～[6]中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，MEK抑制剂为PD0325901。
[8]根据上述[2]～[7]中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，cAMP诱导剂为毛喉素(forskolin)。
[9]根据上述[3]～[8]中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，TGF-β抑制剂为RepSox，PDE4抑制剂为咯利普兰(rolipram)，或者GR激动剂为地塞米松(dexamethasone)。
[10]根据上述[4]～[9]中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，ERK抑制剂为GDC-0994。
[11]一种心肌细胞的制备方法，其是通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的方法，该方法包括：在cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
[12]根据上述[11]所述的心肌细胞的制备方法，其中，cAMP诱导剂为毛喉素，TGF-β抑制剂为RepSox，PDE4抑制剂为咯利普兰，GR激动剂为地塞米松，或者ERK抑制剂为GDC-0994。
[13]根据上述[1]～[12]中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述体细胞为成纤维细胞。
[14]一种心肌细胞，其是通过上述[1]～[13]中任一项所述的心肌细胞的制备方法制备的。
[15]一种用于由体细胞制备心肌细胞的组合物，其是用于通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的组合物，所述组合物包含MEK抑制剂。
[16]根据上述[15]所述的组合物，其进一步包含cAMP诱导剂。
[17]根据上述[15]或[16]所述的组合物，其进一步包含选自TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂中的至少1种。
[18]根据上述[17]所述的组合物，其进一步包含ERK抑制剂。
[19]根据上述[15]～[18]中任一项所述的组合物，其包含以下(1)～(6)中的任意组合。
(1)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及TGF-β抑制剂、
(2)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及PDE4抑制剂、
(3)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及GR激动剂、
(4)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂、
(5)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂、
(6)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂。
[20]根据上述[15]～[19]中任一项所述的组合物，其进一步包含选自RAR激动剂、RXR激动剂、以及PDK1激活剂中的至少1种。
[21]根据上述[15]～[20]中任一项所述的组合物，其中，MEK抑制剂为PD0325901。
[22]根据上述[16]～[21]中任一项所述的组合物，其中，cAMP诱导剂为毛喉素。
[23]根据上述[17]～[22]中任一项所述的组合物，其中，TGF-β抑制剂为RepSox，PDE4抑制剂为咯利普兰，或者GR激动剂为地塞米松。
[24]根据上述[18]～[23]中任一项所述的组合物，其中，ERK抑制剂为GDC-0994。
[25]一种用于由体细胞制备心肌细胞的组合物，其是用于通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的组合物，所述组合物包含cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂。
[26]根据上述[25]所述的组合物，其中，cAMP诱导剂为毛喉素，TGF-β抑制剂为RepSox，PDE4抑制剂为咯利普兰，GR激动剂为地塞米松，或者ERK抑制剂为GDC-0994。
[27]根据上述[15]～[26]中任一项所述的组合物，其中，所述体细胞为成纤维细胞。
发明的效果
根据本发明，可以不进行基因导入而由体细胞制备自发搏动的心肌细胞。通过本发明得到的心肌细胞在再生医学等方面是有用的。
附图说明
图1是细胞培养的照片。在各照片中，左侧表示培养第7天的结果，右侧表示培养开始后第10天的结果。
图2是细胞培养的照片。在各照片中，左侧表示培养第7天的结果，右侧表示培养第10天的结果。
图3是细胞培养的照片。在各照片中，左侧表示培养第7天的结果，右侧表示培养第10天的结果。
图4是细胞培养的照片。在各照片中，左侧表示培养第7天的结果，右侧表示培养第13天的结果。
图5是细胞培养的照片。在各照片中，左侧表示培养第7天的结果，右侧表示培养第13天的结果。
图6是细胞培养的照片。上面2张照片表示实施例7中各部位的培养第13天的结果，下面2张照片表示实施例A中各部位的培养第17天的结果。
图7表示mRNA的相对表达量。左图表示基于各组合抑制剂等的心肌祖细胞(myocardial progenitor cell)特异性基因Tbx1的表达量，右图表示基于各组合抑制剂等的心肌细胞特异性基因Tnnt2的表达量。在各图中，纵轴表示该mRNA量相对于内标基因量(Tbp)的相对值。
图8表示mRNA的相对表达量。左图表示基于各组合抑制剂等的心肌祖细胞特异性基因的表达量，右图表示基于各组合抑制剂等的心肌特异性基因的表达量。在各图中，纵轴表示该mRNA量相对于内标基因量(Tbp)的相对值。
图9的左侧是用Alpha Actinin/DAPI将细胞染色后的免疫染色照片。右侧是使亮视场的图像与左侧照片重合的免疫染色照片。
图10是细胞培养的照片。上行3张照片表示培养第13天的结果，下行3张照片表示培养第19天的结果。
图11是细胞培养的照片。上行4张照片表示培养第7天的结果，下行4张照片表示培养第12天的结果。
具体实施方式
以下，对本发明详细地进行说明。
1心肌细胞的制备方法
本发明的心肌细胞的制备方法(以下称为“本发明制法”)是通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的方法，该方法包括：在MEK抑制剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
可以优选举出上述工序为进一步在cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序的本发明制法。可以更优选举出上述工序为进一步在选自TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂中的少1种的存在下对体细胞进行培养的工序的本发明制法。另外，可以进一步优选举出上述工序为进一步在ERK抑制剂的存在下对体细胞进行培养的工序的本发明制法。特别优选上述工序为在以下(1)～(6)中的任意组合的存在下对体细胞进行培养的工序的本发明制法。
(1)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及TGF-β抑制剂、
(2)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及PDE4抑制剂、
(3)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及GR激动剂、
(4)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂、
(5)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂、
(6)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂。
另外，作为本发明，也可以举出如下心肌细胞的制备方法，其是通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的方法，该方法包括：在cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂的存在下对体细胞进行培养的工序。以下，包括这些制备方法也称为本发明制法。
对于本发明制法而言，在上述工序中，可以进一步在选自RAR激动剂、RXR激动剂、以及PDK1激活剂中的至少1种的存在下对体细胞进行培养。
在本发明制法中，只要在至少上述任意组合的存在下对体细胞进行培养即可，根据需要，还可以任意存在其它抑制剂、诱导剂等对体细胞进行培养来制备心肌细胞。
上述抑制剂、诱导剂等分别可以使用1种，可也以组合使用2种以上。
在具体的上述抑制剂等中，可以是具有2种以上抑制作用等的抑制剂，在该情况下，可以视为一个抑制剂中存在多种抑制剂等。
1.1关于体细胞
生物的细胞可以分类为体细胞和生殖细胞。本发明制法中可以使用任意的体细胞作为其起始材料。体细胞没有特别限定，可以是从生物体采集到的原代细胞、或已确立的细胞中的任一种。在本发明制法中，可以使用处于分化的各种阶段的体细胞，例如，可以使用最终分化成的体细胞(例如，成纤维细胞、脐带静脉内皮细胞(HUVEC)、肝细胞(Hepatocytes)、胆管细胞(Biliarycells)、胰腺α细胞(Pancreaticαcells)、胰腺腺泡细胞(Acinar cells)、胰腺导管细胞(Ductal cells)、小肠隐窝细胞(Intestinal cryptcells)等)、处于最终分化的过程中的体细胞(例如，间充质干细胞、神经干细胞、内胚层祖细胞等)、或者被初始化而获得多能性的体细胞。作为本发明制法中可使用的体细胞，可以列举例如：造血系统的细胞(各种淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、骨髓细胞等)、器官来源的细胞(肝细胞、脾细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞等)、肌肉组织系统的细胞(骨骼肌细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、心肌细胞等)、成纤维细胞、神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、间质细胞、脂肪细胞(棕色脂肪细胞、白色脂肪细胞等)等任意的体细胞。另外，这些细胞的祖细胞、癌细胞也可以用于本发明制法。可以优选使用成纤维细胞。
作为上述的体细胞的供给源，可以示例出人、除人以外的哺乳动物、以及除哺乳动物以外的动物(鸟类、爬行动物类、两栖动物类、鱼类等)，但并不限定于此。作为体细胞的供给源，优选为人、以及除人以外的哺乳动物，特别优选为人。在以向人施用为目的而通过本发明制法制备心肌细胞的情况下，可以优选使用从组织相容性抗原类型与受体一致或类似的供体采集到的体细胞。可以将从受体本身采集到的体细胞供于心肌细胞的制备。
1.2关于本发明的抑制剂等
1.2.1 MEK抑制剂
MEK(MAPK/ERK激酶)是属于通过EGF(表皮生长因子)等生长因子而激活的MAPK信号转导通路的磷酸化酶(phosphoenzyme)，在哺乳类中存在由2个基因编码的MEK1和MEK2。MEK被上游的RAF磷酸化，由此被激活的MEK通过将ERK磷酸化而进一步向下游转导信号。通过利用MEK抑制剂抑制ERK的磷酸化，可以抑制MEK介导的MAPK信号转导通路。
“MEK抑制剂的存在下”是指可以抑制MEK、优选抑制MEK1或MEK2的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用抑制MEK活性的物质，例如，可以利用抗MEK抗体、MEK抑制剂这样的MEK信号抑制方式。另外，在MEK抑制中也可以利用抑制与MEK的激活相关的蛋白质、例如抑制位于比MAPK信号转导通路的MEK更靠上游的EGFR等细胞膜受体、低分子量GTP结合蛋白质RAS、磷酸化酶RAF等的方式。
在本发明中，作为MEK抑制剂，例如可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用PD0325901、曲美替尼(Trametinib)。
PD0325901(CAS No.：391210-10-9)
[化学式1]
Figure BDA0002609685650000091
曲美替尼(CAS No.：871700-17-3)
[化学式2]
Figure BDA0002609685650000092
U0126-EtOH(CAS No.：1173097-76-1)
TAK-733(CAS No.：1035555-63-5)
BI-847325(CAS No.：1207293-36-4)
和厚朴酚(Honokiol)(CAS No.：35354-74-6)
杨梅黄酮(Myricetin)(CAS No.：529-44-2)
AS703026(CAS No.：1236699-92-5)
AZD8330(CAS No.：869357-68-6)
CI-1040(CAS No.：212631-79-3)
Cobimetirlib(CAS No.：934660-93-2)
GDC-0623(CAS No.：1168091-68-6)
MEK162(CAS No.：606143-89-9)
PD318088(CAS No.：391210-00-7)
PD98059(CAS No.：167869-21-8)
瑞法替尼(Refametinib)(CAS No.：923032-37-5)
司美替尼(Selumetinib)(CAS No.：606143-52-6)
SL327(CAS No.：305350-87-2)
MEK抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如可以在0.1μmol/L～10μmol/L、优选为0.5μmol/L～5μmol/L的范围使用。
1.2.2cAMP诱导剂
cAMP(环状单磷酸腺苷)是作为第二信使而参与各种细胞内信号转导的物质。cAMP是在细胞内通过腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)使三磷酸腺苷(ATP)环化而生成的。
“cAMP诱导剂的存在下”是指能够诱导cAMP的培养条件下，其方式没有特别限定，例如，可以利用能够使细胞内cAMP浓度增加的任意方式。可以使用能够与作为cAMP生成相关酶的腺苷酸环化酶直接作用而进行诱导的物质、可促进腺苷酸环化酶的表达的物质、以及抑制作为分解cAMP的酶的磷酸二酯酶的物质等作为使细胞内cAMP浓度增加的方式。也可以使用在细胞内具有与cAMP相同作用的作为cAMP结构类似物的双丁酰cAMP(dibutyrylcAMP)、8-bromo-cAMP等膜透过性cAMP类似物。
在本发明中，作为cAMP诱导剂(腺苷酸环化酶激活剂)，可以列举例如：毛喉素(forskolin：CAS No.：66575-29-9)、以及毛喉素衍生物(例如日本特开2002-348243号公报)、以下的化合物等，但没有特别限定。可以优选使用毛喉素。
毛喉素(CAS No.：66428-89-5)
[化学式3]
Figure BDA0002609685650000101
异丙肾上腺素(CAS No.：7683-59-2)
NKH477(CAS No.：138605-00-2)
PACAP1-27(CAS No.：127317-03-7)
PACAP1-38(CAS No.：137061-48-4)
cAMP诱导剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如，可以在0.2μmol/L～50μmol/L、优选为1μmol/L～30μmol/L的范围使用。
1.2.3TGF-β抑制剂
TGF-β(transforming growth factor-β、转化生长因子β)中存在TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3这3种，由基本上所有的细胞产生。TGF-β涉及抑制以上皮细胞为代表的多种细胞的增殖等的细胞增殖、转化、分化、产生、凋亡的控制等多种细胞功能。
“TGF-β抑制剂的存在下”是指可以抑制TGF-β的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用能够抑制TGF-β的任意的方式。在本发明中，可以利用直接作用于TGF-β而抑制其功能的物质(例如，抗TGF-β抗体、其它药物)、抑制TGF-β自身的产生的药物等。另外，通过在其上游抑制与TGF-β相关的信号转导，也可以抑制TGF-β。
在本发明中，作为TGF-β抑制剂，例如可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用RepSox。
A83-01(CAS No.：909910-43-6)
[化学式4]
Figure BDA0002609685650000111
RepSox(CAS No.：446859-33-2)
[化学式5]
Figure BDA0002609685650000112
SB431542(CAS No.：301836-41-9)
[化学式6]
Figure BDA0002609685650000121
LY364947(CAS No.：396129-53-6)
SB525334(CAS No.：356559-20-1)
SD208(CAS No.：627536-09-8)
Galunisertib(LY2157299)(CAS No.：700874-72-2)
LY2109761(CAS No.：700874-71-1)
SB505124(CAS No.：694433-59-5)
GW788388(CAS No.：452342-67-5)
EW-7197(CAS No.：1352608-82-2)
TGF-β抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如，可以在0.1μmol/L～30μmol/L、优选为0.5μmol/L～10μmol/L的范围使用。
1.2.4PDE4抑制剂
PDE4(Phosphodiesterase-4)是磷酸二酯酶超家族之一。磷酸二酯酶是水解磷酸二酯键的酶，特别是PDE4将作为信号转导通路的第二信使的cAMP的环状磷酸二酯键水解，在其细胞内浓度的调节方面起到重要的作用。PDE4存在于免疫细胞、脑/神经细胞等。
“PDE4抑制剂的存在下”是指能够抑制PDE4的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用能够抑制PDE4的任意方式。在本发明中，可以利用直接作用于PDE4而抑制其功能的物质(例如，抗PDE4抗体、其它药物)、抑制PDE4本身产生的药物等。另外，通过在其上游抑制PDE4相关的信号转导，也可以抑制PDE4。
在本发明中，作为PDE4抑制剂，例如，可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用咯利普兰、其光学异构体(例如，R(-)体、S(+)体)。
咯利普兰(CAS No.：61413-54-5)
[化学式7]
Figure BDA0002609685650000131
罗氟司特(Roflumilast)(CAS No.：162401-32-3)
西洛司特(Cilomilast)(CAS No.：153259-65-5)
GSK256066(CAS No.：801312-28-7)
阿普斯特(Apremilast)(CC-10004)(CAS No.：608141-41-9)
PDE4抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如，可以在0.1μmol/L～20μmol/L、优选为0.5μmol/L～10μmol/L的范围使用。
1.2.5GR激动剂
GR(Glucocorticoid Receptor、糖皮质激素受体)属于核受体超家族，与作为甾体激素的糖皮质激素结合，作为调节其转录活性的转录因子而发挥作用。GR在人的全身中广泛表达，由于其功能上的重要性，已经开发了地塞米松等大量的合成激动剂。
“GR激动剂的存在下”是指能够增强GR的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用能够激活GR的任意方式。在本发明中，可以利用直接作用于GR而增强其功能的物质、促进GR本身的表达的药物等。另外，也可以通过与GR相互作用的转录因子或转录偶联因子、以及对它们的表达、翻译后修饰等进行调节来控制GR的功能。
在本发明中，作为GR激动剂，例如，可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用地塞米松。
地塞米松、倍他米松、泼尼松龙、泼尼松、甲泼尼龙、曲安西龙、倍氯米松、布地奈德、氢化可的松、醋酸可的松、GSK9027、氟替卡松、莫米松等甾体化合物。
可以分类为选择性糖皮质激素受体修饰物质或选择性糖皮质激素受体激动剂的非甾体化合物。
GR激动剂分浓度可以适当确定，没有特别限定，例如，可以在0.01μmol/L～10μmol/L、优选为0.05μmol/L～2μmol/L的范围使用。
1.2.6RAR激动剂、RXR激动剂
RAR(Retinoic acid receptor、视黄酸受体)属于核受体超家族，将视黄酸作为配体激活其转录活性。RAR在生物体内具有各种功能，特别是与细胞的分化密切相关，因此开发了大量的人工合成激动剂。
RXR(retinoid X receptor、类视黄醇X受体)属于核受体超家族，与RAR同样地将视黄酸等作为配体来调节其转录活性。RXR与以RAR为代表的各种核受体形成异源二聚体，通过与特定的碱基序列结合、募集转录偶联因子等，对作为伴侣的核受体的转录活性进行了复杂调节。
“RAR激动剂或RXR激动剂的存在下”是指能够增强RAR或RXR的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用能够增强RAR或RXR的任意方式。在本发明中，可以利用直接作用于RAR或RXR而增强其功能的物质、促进RAR或RXR本身表达的药物等。另外，可以通过与RAR或RXR相互作用的转录因子或转录偶联因子、以及对它们的表达及翻译后修饰等进行调节来控制RAR或RXR的功能。
在本发明中，作为RAR激动剂或RXR激动剂，例如可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用TTNPB、视黄酸、CH55、AM580。
TTNPB(芳维甲酸、CAS No.：71441-28-6)
[化学式8]
Figure BDA0002609685650000141
视黄酸(CAS No.：302-79-4)
维甲酸(Tretinoin)(CAS No.：302-79-4)
阿达帕林(Adapalene)(CAS No.：106685-40-9)
贝沙罗汀(Bexarotene)(CAS No.：153559-49-0)
他扎罗汀(Tazarotene)(CAS No.：118292-40-3)
他米巴罗汀(Tamibarotene)(CAS No.：94497-51-5)
CH55(CAS No.：110368-33-7)
AM580(CAS No.：102121-60-8)
RAR激动剂或RXR激动剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如，可以在0.05μmol/L～10μmol/L、优选为0.5μmol/L～5μmol/L的范围使用。
1.2.7 PDK1激活剂
PDK1(phosphoinositide-dependent protein kinase-1、磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1)是将AKT磷酸化并激活的磷酸化酶，作为肌醇磷脂介导的信号转导通路的中心而发挥功能。该PDK1/AKT信号通路对于细胞的生存、增殖、糖及脂质代谢等起到极其重要的作用。作为PDK1激活剂的PS48与PDK1直接结合，使AKT磷酸化，激活该信号通路。
“PDK1激活剂的存在下”是指能够激活PDK1的培养条件下，其方式没有特别限定，例如可以利用能够使细胞内PDK1浓度增加的任意方式。另外，PDK1被磷脂酰肌醇3磷酸激活，所述磷脂酰肌醇3磷酸通过以酪氨酸激酶受体、细胞因子受体、G蛋白偶联受体为代表的各种受体激活磷酸肌醇3-激酶(PI3K)而产生，因此，使这些受体激活的物质、或诱导磷脂酰肌醇3磷酸产生的其它刺激也可以成为使PDK1激活的方式。
在本发明中，作为PDK1激活剂，例如可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用PS48。
PS48((2Z)-5-(4-Chlorophenyl)-3-phenyl-2-pentenoic acid、CAS No.：1180676-32-7)
OSU-03012(AR-12)(CAS No.：742112-33-0)
BX795(CAS No.：702675-74-9)
BX912(CAS No.：702674-56-4)
PHT-427(CAS No.：1191951-57-1)
PDK1激活剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如可以在0.5μmol/L～30μmol/L、优选为1μmol/L～10μmol/L的范围中使用。
1.2.8关于ERK抑制剂
ERK(Extracellular Signal-regulated Kinase、细胞外信号调节激酶)是被EGF(表皮生长因子)、血清刺激或氧化应激等激活的MAPK的子家族，ERK根据其涉及的信号转导通路的不同而分为ERK1/2、ERK5、ERK7、ERK8。通过配体与表皮生长因子受体(EGFR)等酪氨酸激酶受体结合，信号流通，结果是ERK的激活环中存在的TEY模体被磷酸化而激活。
“ERK抑制剂的存在下”是指能够抑制ERK的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用抑制ERK活性的物质，例如可以利用抗ERK抗体、ERK抑制剂这样的ERK信号抑制方式。另外，抑制与ERK的激活相关的酶、例如抑制ERK激酶、ERK激酶激酶等的方式也可以用于ERK抑制。
在本发明中，作为ERK抑制剂，可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用GDC-0994(Ravoxertinib)。
GDC-0994(CAS No.：1453848-26-4)
[化学式9]
Figure BDA0002609685650000161
SCH772984(CAS No.：942183-80-4)
MK-8353(SCH900353)(CAS No.：1184173-73-6)
Magnolin(CAS No.：31008-18-1)
LY3214996(CAS No.：1951483-29-6)
FR 180204(CAS No.：865362-74-9)
AZD0364(CAS No.：2097416-76-5)
ERK抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如可以在0.1μmol/L～10μmol/L、优选为0.2μmol/L～5μmol/L的范围使用。
1.3体细胞的培养
本发明制法中的体细胞的培养可以在根据待使用的体细胞的种类选择培养基、温度、其它条件，并在上述的各种抑制剂(以及根据情况加入的诱导剂或激活剂)的存在下实施。培养基可以从公知的培养基或市售的培养基中选择。例如，可以在作为通常的培养基的MEM(最少必需培养基)、DMEM(杜氏改良Eagle培养基，Dulbecco’s Modified EagleMedium)、DMEM/F12、或对它们进行了改良的培养基中添加适当的成分(血清、蛋白质、氨基酸、糖类、维生素类、脂肪酸类、抗生素等)来使用。
作为培养条件，可以选择通常的细胞培养的条件。可示例出37℃、5％CO2的条件等。优选在培养中以适当的间隔(优选为1天至7天1次、更优选为3天至4天1次)更换培养基。在以成纤维细胞作为材料来实施本发明制法的情况下，在37℃、5％CO2的条件下从5～8天至3周内出现心肌细胞。通过选择容易培养的细胞作为待使用的体细胞，也可以将预先增加了细胞数量的体细胞转化为心肌细胞。因此，扩大的心肌细胞的制备也是容易的。
体细胞的培养可以使用板、培养皿、细胞培养瓶、细胞培养袋等细胞培养容器。需要说明的是，作为细胞培养袋，具有透气性的培养袋是合适的。在需要大量细胞的情况下，可以使用大型培养槽。培养可以在开放系统或封闭系统中的任一种中实施，在以将得到的心肌细胞施用于人等为目的的情况下，优选在封闭系统中进行培养。
在本发明制法中，通过在包含上述的各种抑制剂等的培养基中对体细胞进行培养，可以通过一步培养而由体细胞制备心肌细胞。
本发明制法中，由体细胞制备心肌细胞。已知5-氮杂胞苷、血管紧张素II、BMP-2(Bone Morphogenetic Protein 2，骨形态发生蛋白-2)、二甲基亚砜(DMSO)等对于诱导向心肌细胞的分化是有效的物质。作为对于诱导向心肌细胞的分化的有效物质，例如，也可以使用市售的物质作为分化诱导剂。在本发明中，可以在上述物质的存在下对体细胞进行培养。
1.4心肌细胞
通过上述的本发明制法，可以得到含有心肌细胞的细胞群。通过本发明制法制备的心肌细胞也在本发明的范围内。通过本发明制法制备的心肌细胞除了最终分化成的细胞以外，还可以是将要分化成心肌细胞的祖细胞。
通过本发明制法制备的心肌细胞是利用低分子化合物由体细胞直接诱导的所谓的低分子化合物诱导性心肌细胞(ciCMs)，且与由ES细胞、iPS细胞分化诱导的心肌细胞相区别。另外，根据使用的低分子化合物的不同，也与专利文献1等记载的低分子化合物诱导性心肌细胞相区别。
通过本发明制法制备的心肌细胞例如可以利用细胞的形态变化、心肌细胞的特征性质、特异性标志物来进行检测、确认及分离。
心肌细胞具有自主地搏动这样其它细胞所没有的特征，可以通过显微镜下的观察而与其它细胞相区别。另外，作为心肌细胞的特异性标志物，可以列举：心肌肌钙蛋白C(cTnT)、α肌球蛋白重链、α肌动蛋白等，但并不限定于此。
特异性标志物的检测可以利用检疫的方法(基于抗体的检测)，关于蛋白质分子，可以通过其mRNA量的定量来实施检测。识别心肌细胞的特异性标志物的抗体在对通过本发明制法得到的心肌细胞进行分离及纯化方面是有用的。
通过本发明制法制备的心肌细胞例如可以用于组织修复等。使用通过本发明制法制备的心肌细胞，可以制造用于组织修复等的医药组合物。作为心力衰竭或心肌梗塞等心脏疾病的治疗方式，进行了心肌细胞的制备方法、以及心肌细胞的移植方法的开发。例如，通过将心肌细胞和内皮细胞等层叠而形成的心肌片显示出优异的治疗效果和移植活性，因此期望用于重症心力衰竭的治疗。
在将通过本发明制法制备的心肌细胞制成医药组合物的情况下，可以通过通常方法将心肌细胞与药学上可接受的载体混合等而制成适合对个体施用的形式的制剂。作为载体，可以列举例如：生理盐水、葡萄糖、加入其它佐剂(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)而等张的注射用蒸馏水。另外，也可以配合缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂、抗氧化剂等。
通过本发明制法制备的心肌细胞也可以进一步制成与对心肌细胞的功能发挥、移植活性提高有效的其它细胞、成分组合而成的组合物。
此外，通过本发明制法制备的心肌细胞可以用于作用于心肌细胞的药物候选化合物的筛选、药物候选化合物的安全性评价。心肌细胞是用于评价药物候选化合物的心脏毒性的重要工具。根据本发明制法，可以通过一次操作获得大量的心肌细胞，因此能够不受细胞批次差异影响地得到具有重现性的研究结果。
2组合物
本发明的组合物(以下，称为“本发明组合物”)是用于通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的组合物，其特征在于包含MEK抑制剂。
优选可以举出进一步包含cAMP诱导剂的本发明组合物。更优选可以举出进一步包含选自TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂中的至少1种的本发明组合物。另外，进一步优选可以举出还包含ERK抑制剂的本发明组合物。
特别优选为包含以下(1)～(6)中的任意组合的本发明组合物。
(1)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及TGF-β抑制剂、
(2)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及PDE4抑制剂、
(3)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及GR激动剂、
(4)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂、
(5)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂、
(6)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂。
另外，作为本发明，可以举出用于由体细胞制备心肌细胞的组合物，其是用于通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的组合物，所述组合物包含cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂。以下，包括所述组合物也称为本发明组合物。
本发明组合物可以进一步包含选自RAR激动剂、RXR激动剂、以及PDK1激活剂中的至少1种。
在本发明组合物中，可以包含至少上述的任意组合，可以根据需要还任意包含其它抑制剂、诱导剂等。
上述抑制剂、诱导剂等可以使用1种，也可以组合使用2种以上。
在具体的上述抑制剂等中，可以是具有2种以上抑制作用等的抑制剂，在该情况下，可以视为一个抑制剂中存在多种抑制剂等。
上述的抑制剂、诱导剂等的具体例子、优选的例子等与上述含义相同。
本发明组合物可以作为用于由体细胞制备心肌细胞的组合物而使用。另外，本发明组合物也可以作为用于由体细胞制备心肌细胞的培养基而使用。
作为用于由体细胞制备心肌细胞的培养基，可以示例出在将细胞培养所需要的成分混合而制造的基础培养基中含有MEK抑制剂及cAMP诱导剂等作为有效成分的培养基。可以以对制备心肌细胞有效的浓度含有上述的有效成分，本领域技术人员可以适当确定浓度。基础培养基可以从公知的培养基或市售的培养基中选择。例如，可以使用作为通常的培养基的MEM(最少必需培养基)、DMEM(杜氏改良Eagle培养基，Dulbecco’s Modified EagleMedium)、DMEM/F12、或对它们进行了改良的培养基作为基础培养基。
此外，培养基中可以添加本说明书中上述说明的公知的培养基成分，例如可以添加血清、蛋白质(白蛋白、转铁蛋白、成长因子等)、氨基酸、糖类、维生素类、脂肪酸类、抗生素等。
另外，培养基中可以添加本说明书中上述说明的对于诱导向心肌细胞的分化有效的物质。
另外，在本发明中，通过对生物体施用MEK抑制剂及cAMP诱导剂等，也可以在生物体内由体细胞制备心肌细胞。即，根据本发明，可以提供在生物体内由体细胞制备心肌细胞的方法，该方法包括：向生物体施用MEK抑制剂及cAMP诱导剂等。对生物体施用的抑制剂等的优选组合如本说明书中的记载所述。另外，作为生物体，可以示例出：人、除人以外的哺乳动物、以及除哺乳动物以外的动物(鸟类、爬行动物类、两栖动物类、鱼类等)，特别优选为人。通过对生体内的特定部位施用MEK抑制剂及cAMP诱导剂等，可以在上述特定部位由体细胞制备心肌细胞。
实施例
以下，通过实施例、试验例对本发明具体地进行说明，但本发明并不限定于下述实施例等所记载的范围。
实施例心肌细胞的制备
＜由人成纤维细胞直接诱导心肌细胞＞
(1)人成纤维细胞
作为材料的人成纤维细胞由DS PHARMA BIOMEDICAL公司购入，是38岁的人皮肤来源的成纤维细胞。
(2)由人成纤维细胞直接诱导心肌细胞
将人成纤维细胞以8×104个分别接种于涂布有明胶(Cat#:190-15805，和光纯药工业株式会社制)的35mm培养皿，用添加了10％胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM高葡萄糖培养基(Gibco公司制)在37℃、5％CO2条件下培养2天(汇合至80-90％以上)。需要说明的是，DMEM表示杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)。
将上述的人成纤维细胞的培养皿的培养基更换为添加了20％胎牛血清(FBS)、2％B27-supplement(Gibco公司制)、1％N2(Gibco公司制)、非必需氨基酸(NEAA：Non-essential amino acids；Gibco公司制)、β巯基乙醇(Nacalai Tesque公司制；最终浓度0.1mmol/L)、2-phospho ascorbic acid(Sigma-Aldrich公司制；最终浓度50μg/mL)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、以及下述低分子化合物的DMEM(高葡萄糖)(具有L-谷氨酰胺酚红、丙酮酸钠(Gibco公司制))。然后，每3天更换为相同组成的培养基，并且在37℃、5％CO2条件下进行培养。
＜低分子化合物＞
2μM PD0325901(Cat#：162-25293，Wako)
15μM毛喉素(Cat#：063-02193，Wako)
5μM RepSox(Cat#：1894-25，BioVision)
3μM咯利普兰(Cat#：180-01411，Wako)
1μM地塞米松(Cat#：047-18863，Wako)
1μM视黄酸(Cat#：186-01114，Wako)
2μM TTNPB(Cat#：16144，Cayman Chemical)
10μM PS48(Cat#：164-25011，Wako)
(3)结果
将按照上述(2)培养的结果示于表1、表2、以及图1～6。在表中，“+”表示在培养基中存在该化合物，“－”表示在培养基中不存在该化合物。
表1
化合物 功能 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6 比较例1
PD0325901 抑制MEK + + + + + + －
毛喉素 诱导cAMP + + + + + + +
RepSox 抑制TGF-β + － + + + + +
咯利普兰 抑制PDE4 + + － + + + +
地塞米松 增强GR + + + － + + +
视黄酸 增强RAR + + + + － + +
TTNPB 增强RAR、RXR + + + + － + +
PS48 激活PDK1 + + + + + － +
诱导效率 形态、搏动 ◎ 〇 〇 △ 〇 ◎ ×
表2
化合物 功能 比较例2 实施例A 实施例7 实施例8 实施例9 实施例10 实施例11 实施例12
PD0325901 抑制MEK － + + + + + + +
毛喉素 诱导cAMP + － + + + + + +
RepSox 抑制TGF-β － － － + － － － +
咯利普兰 抑制PDE4 － － － － + － + +
地塞米松 增强GR － － － － － + + +
诱导效率 形态、搏动 × △ 〇 〇 〇 〇 ◎ 〇
(4)心肌细胞的评价
在本实验中，从添加低分子化合物进行培养后5天左右起出现了心肌样的细胞。这可以通过在显微镜下观察自发且周期性地收缩的细胞块(cell clump)来进行评价。细胞的照片(图1～6)是在添加该低分子化合物培养7天后和10天后(图1～3)、7天后和13天后(图4、5)、或13天后和17天后(图6)分别拍摄的。
另外，对于表2的低分子化合物的组合的一部分，从添加该低分子化合物培养17天后的细胞提取总RNA，通过实时PCR对心肌祖细胞特异性基因Tbx1及心肌细胞特异性基因Tnnt2的表达量进行了定量。将其结果示于图7。图中的Tbp表示作为内标的基因，通过基于该mRNA量的相对值评价了Tbx1及Tnnt2的mRNA量。图中的各符号的组合化合物如下所述。
C：对照(无该低分子化合物)
M：实施例A
F：比较例2
MF：实施例7
MF+Rep：实施例8
MF+Roli：实施例9
MF+Dex：实施例10
MF+Rep+Roli+Dex：实施例12
根据表1、图1～3的照片表明，特别是在从化合物的组合中排出PD0325901(MEK抑制剂)的情况下，基本上没有出现自发收缩的细胞块。另外，根据表2、图4～6的照片表明，通过以低频率添加PD0325901(MEK抑制剂)和毛喉素(cAMP诱导剂)或仅添加PD0325901(MEK抑制剂)，出现了心肌样的细胞块。另外，如图6的照片所示，确认了不仅在一个部位，而且在多个部位产生了自发活动的细胞块。
根据图7可知，与未加入该低分子化合物时的细胞的表达量相比，利用各化合物的组合，这些对心肌细胞特异性的基因已被激活。特别是对于3种化合物(PD0325901(MEK抑制剂)、毛喉素(cAMP诱导剂)、RepSox(TGF-β))及5种化合物(PD0325901(MEK抑制剂)、毛喉素(cAMP诱导剂)、RepSox(TGF-β)、咯利普兰(PDE4抑制剂)、地塞米松(GR激动剂))的组合而言，这两种基因的表达大幅升高。
根据本实验结果可知，MEK抑制剂对心肌细胞的诱导是很重要的化合物，通过在至少MEK抑制剂(例如PD0325901)、或其与cAMP诱导剂(例如毛喉素)的存在下进行培养，可得到诱导效率良好的心肌细胞。另外，在MEK抑制剂及cAMP诱导剂、以及TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂及GR激动剂的存在下进行培养时，该特定的基因的表达显著。
试验例1
(1)心肌细胞的基因表达
对于PD0325901(MEK抑制剂)、毛喉素(cAMP诱导剂)、RepSox(TGF-β)、以及咯利普兰(PDE4抑制剂)这4种(4C)化合物的组合、或者在其中加入了地塞米松(GR激动剂)的5种化合物的组合，与上述实施例同样地添加进行细胞培养，从培养18天后的细胞中提取总RNA，利用实时PCR对心肌祖细胞特异性基因Hand2及Tbx1、以及心肌细胞特异性基因Tnnt2、Nppa及Nkx2.5的表达量进行定量。将其结果示于图8。图中的Tbp表示作为内标的基因，通过基于该mRNA量的相对值评价了各基因的mRNA量。图中，“无化合物”表示该化合物一种也没有添加时的结果，“4C+Dex”表示添加上述全部5种化合物时的结果。
根据图8表明，通过添加4C或在4C中加入了地塞米松(GR激动剂)的化合物组进行培养，进行了由人皮肤成纤维细胞直接诱导心肌细胞。
(2)免疫染色
在上述(1)中，对于添加了在4C中加入地塞米松(GR激动剂)的化合物组进行培养的细胞，在培养后第18天将细胞用4％多聚甲醛固定后，进行了免疫染色。染色使用了抗Sarcomeric Alpha Actinin抗体(ab9465、Abcam公司制；以200倍稀释使用)。将其结果示于图9。图中，红色表示α-辅肌动蛋白(Alpha Actinin)的染色结果，蓝色表示基于DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)的核染色。需要说明的是，图9以灰色显示，因此未显示出红色和蓝色等，但实际的原始照片中显示出了红色和蓝色等。
如图9所示，在添加该化合物组进行培养后，在一定数量的心肌样细胞中观察到α-辅肌动蛋白的染色，相对地，不是在用DAPI染色的细胞核中而是在细胞质中观察到了染色。在一部分细胞中观察到了作为心肌细胞标志物的α-辅肌动蛋白的表达，因此，根据免疫染色的结果表明，通过添加该化合物组进行培养，进行了由人皮肤成纤维细胞直接诱导心肌样细胞。
试验例2
对于下述低分子化合物的组合，与上述实施例同样地添加并进行了细胞培养。将添加该化合物组进行培养后第13天和第19天的细胞的状态示于图10。
在图10中，“5C”表示下述6种低分子化合物中除曲美替尼(Trametinib)以外的5种化合物的组合，左侧2张照片表示添加该化合物组的培养结果。“5C-M”表示从5C的化合物组中排除了PD0325901(MEK抑制剂)的化合物组，中间2张照片表示添加该化合物组的培养结果。“5C-M+曲美替尼”表示从5C的化合物组中排除了PD0325901(MEK抑制剂)、并加入了作为其它MEK抑制剂的曲美替尼的化合物组，右侧2张照片表示添加该化合物组的培养结果。
＜低分子化合物＞
2μM PD0325901(Cat#：162-25293，Wako)
15μM毛喉素(Cat#：063-02193，Wako)
5μM RepSox(Cat#：1894-25，BioVision)
3μM咯利普兰(Cat#：180-01411，Wako)
1μM地塞米松(Cat#：047-18863，Wako)
3μM曲美替尼(Cat#：HY-10999，MedChem Express)
根据图10表明，在从人皮肤成纤维细胞直接诱导心肌细胞中，MEK抑制剂是很重要的。
试验例3
对于下述低分子化合物的组合，与上述实施例同样地添加并进行了培养。将添加该低分子化合物进行培养后第7天和第12天的细胞的状态示于图11。
在图11中，“5C”表示下述6种低分子化合物中除GDC-0994以外的5种化合物的组合，左侧2张照片表示添加该化合物组的培养结果。“5C-M”表示从5C的化合物组中排除了PD0325901(MEK抑制剂)的化合物组，从左侧起第2位的2张照片表示添加该化合物组的培养结果。“5C-M+GDC-0994”表示从5C的化合物组中排除了PD0325901(MEK抑制剂)、并且加入了GDC-0994(ERK抑制剂)来代替的化合物组，从右侧起第2位的2张照片表示添加该化合物组的培养结果。“5C+GDC-0994”表示在5C的化合物组中加入了GDC-0994(ERK抑制剂)的化合物组，右侧2张照片表示添加该化合物组的培养结果。
＜低分子化合物＞
2μM PD0325901(Cat#：162-25293，Wako)
15μM毛喉素(Cat#：063-02193，Wako)
5μM RepSox(Cat#：1894-25，BioVision)
3μM咯利普兰(Cat#：180-01411，Wako)
1μM地塞米松(Cat#：047-18863，Wako)
3μM GDC-0994(Cat#：21107，Cayman Chemical)
如图11所示，即使不存在MEK抑制剂，只要存在ERK抑制剂，就可以由人皮肤成纤维细胞直接诱导心肌细胞。另外可知，如果存在MEK抑制剂和ERK抑制剂这两者，则可以促进从人皮肤成纤维细胞直接诱导心肌细胞。

Claims (27)

1.一种心肌细胞的制备方法，其是通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的方法，该方法包括：在MEK抑制剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
2.根据权利要求1所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述工序是进一步在cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
3.根据权利要求1或2所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述工序是进一步在选自TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂中的至少1种的存在下对体细胞进行培养的工序。
4.根据权利要求3所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述工序是进一步在ERK抑制剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述工序是在以下(1)～(6)中的任意组合的存在下对体细胞进行培养的工序，
(1)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及TGF-β抑制剂、
(2)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及PDE4抑制剂、
(3)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及GR激动剂、
(4)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂、
(5)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂、
(6)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述工序是进一步在选自RAR激动剂、RXR激动剂、以及PDK1激活剂中的至少1种的存在下对体细胞进行培养的工序。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，MEK抑制剂为PD0325901。
8.根据权利要求2～7中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，cAMP诱导剂为毛喉素。
9.根据权利要求3～8中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，TGF-β抑制剂为RepSox，PDE4抑制剂为咯利普兰，或者GR激动剂为地塞米松。
10.根据权利要求4～9中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，ERK抑制剂为GDC-0994。
11.一种心肌细胞的制备方法，其是通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的方法，该方法包括：在cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
12.根据权利要求11所述的心肌细胞的制备方法，其中，cAMP诱导剂为毛喉素，TGF-β抑制剂为RepSox，PDE4抑制剂为咯利普兰，GR激动剂为地塞米松，或者ERK抑制剂为GDC-0994。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述体细胞为成纤维细胞。
14.一种心肌细胞，其是通过权利要求1～13中任一项所述的心肌细胞的制备方法制备的。
15.一种用于由体细胞制备心肌细胞的组合物，其是用于通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的组合物，所述组合物包含MEK抑制剂。
16.根据权利要求15所述的组合物，其进一步包含cAMP诱导剂。
17.根据权利要求15或16所述的组合物，其进一步包含选自TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂中的至少1种。
18.根据权利要求17所述的心肌细胞的制备方法，其中，所述工序是进一步在ERK抑制剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
19.根据权利要求15～18中任一项所述的组合物，其包含以下(1)～(6)中的任意组合，
(1)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及TGF-β抑制剂、
(2)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及PDE4抑制剂、
(3)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、以及GR激动剂、
(4)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂、
(5)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、以及GR激动剂、
(6)MEK抑制剂、cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂。
20.根据权利要求15～19中任一项所述的组合物，其进一步包含选自RAR激动剂、RXR激动剂、以及PDK1激活剂中的至少1种。
21.根据权利要求15～20中任一项所述的组合物，其中，MEK抑制剂为PD0325901。
22.根据权利要求16～21中任一项所述的组合物，其中，cAMP诱导剂为毛喉素。
23.根据权利要求17～22中任一项所述的组合物，其中，TGF-β抑制剂为RepSox，PDE4抑制剂为咯利普兰，或者GR激动剂为地塞米松。
24.根据权利要求18～23中任一项所述的组合物，其中，ERK抑制剂为GDC-0994。
25.一种用于由体细胞制备心肌细胞的组合物，其是用于通过直接分化诱导由体细胞制备心肌细胞的组合物，所述组合物包含cAMP诱导剂、TGF-β抑制剂、PDE4抑制剂、GR激动剂、以及ERK抑制剂。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中，cAMP诱导剂为毛喉素，TGF-β抑制剂为RepSox，PDE4抑制剂为咯利普兰，GR激动剂为地塞米松，或者ERK抑制剂为GDC-0994。
27.根据权利要求15～26中任一项所述的组合物，其中，所述体细胞为成纤维细胞。
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