CN111684060B - 产胰岛素细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的主要课题在于提供不进行人工基因导入而由体细胞制备产胰岛素细胞的方法。作为本发明，可以举出例如：一种产胰岛素细胞的制备方法，其是通过直接分化诱导由体细胞制备产胰岛素细胞的方法，该方法包括：在选自GSK3抑制剂、TGF‑β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的6种或全部、以及cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序。通过本发明得到的产胰岛素细胞在再生医学等方面是有用的。

Description

产胰岛素细胞的制备方法
技术领域
(相关申请的相互参照)
本申请基于2018年1月30日提出申请的日本申请号第2018-13303号主张优先权，并将其公开内容全部导入本说明书的一部分。
本发明属于再生医学或由体细胞直接重编程(Direct Reprogramming)的技术领域。本发明涉及该技术领域中利用低分子化合物由体细胞直接制备产胰岛素细胞的方法、以及利用所述制备方法制备的低分子化合物诱导性产胰岛素细胞(ciIPCs：chemicalcompound-induced Insulin-producing cells)。本发明还涉及该产胰岛素细胞、以及可用于制备该产胰岛素细胞的方法的组合物。
背景技术
随着近年来细胞相关研究的发展、特别是与多能细胞相关的研究的发展，以能够用于对个体进行移植的品质及量获得治疗用细胞正在变为可能。对于一些疾病，已经开始尝试将对治疗有效的细胞移植于患者。
间充质细胞形成了肌肉、骨、软骨、骨髓、脂肪及结缔组织等生物体的各种器官，有望作为再生医学的材料。间充质干细胞(mesenchymal stem cell：MSC)是存在于骨髓、脂肪组织、血液、胎盘及脐带等组织中的未分化细胞。由于具有分化为属于间充质系统的细胞的能力，因此间充质干细胞作为制备这些细胞时的起始材料而备受关注。另外，也正在研究利用间充质干细胞本身来重建骨、软骨、心肌等的再生医学。
另一方面，也报道了将成纤维细胞这样的体细胞直接转化为其它细胞的方法。例如，已知通过将成纤维细胞和化学物质一起进行培养而得到神经细胞(非专利文献1)。
对于分泌胰岛素的胰腺β细胞，除了报告了由iPS细胞或ES细胞分化诱导人胰腺β细胞以外，还报告了使用作为胰腺β细胞特异性转录因子的Pdx1、Ngn3及MafA由胰腺α细胞、胰腺腺泡细胞、胰腺导管细胞、小肠隐窝细胞、肝细胞、胆管细胞这样的内胚层细胞直接诱导胰腺β细胞(非专利文献2)。另外，还报告了使用山中4因子等由鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、人皮肤成纤维细胞直接诱导胰腺β细胞(非专利文献3、4)。此外，还报告了利用低分子化合物由鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)制备内胚层祖细胞，并由该细胞分化成胰腺内分泌细胞(非专利文献5)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition，2015年，56卷，3号，166-170页
非专利文献2：Current Pathobiology Reports，2016年，3卷，57-65页非专利文献3：Cell Stem Cell，2014年，14卷，228-236页
非专利文献4：Nature Communications，2016年，7卷，10080页
非专利文献5：Journal of Biological Chemistry，2017年，292卷，19122-19132页
发明内容
发明要解决的课题
如非专利文献1中记载的方法那样，不进行基因导入而直接进行从体细胞至希望细胞的转化的方法有时是作为获得治疗用细胞的方式的有效选项。对于胰腺β细胞，如上所述，报告了由细胞进行直接转化的方法，但这些发明通过向胚胎学上系统接近的内胚层系统的细胞导入特定的基因来进行诱导。
本发明的主要课题在于提供不进行人工基因导入、而利用低分子化合物的组合由体细胞直接诱导产胰岛素细胞的方法，即，提供可以利用一定的低分子化合物的组合物由体细胞直接制备产胰岛素细胞的新制备方法。
解决课题的方法
本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过在一定的低分子抑制剂等的存在下对体细胞进行培养，可以将体细胞直接转化为产胰岛素细胞，从而完成了本发明。
作为本发明，例如，可以列举下述内容。
[1]一种产胰岛素细胞的制备方法，其是通过直接分化诱导由体细胞制备产胰岛素细胞的方法，该方法包括：在选自GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的6种或全部、以及cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
[2]根据上述[1]所述的产胰岛素细胞的制备方法，其中，所述工序是在选自GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的5种或全部、以及PI3K抑制剂及cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
[3]根据上述[1]所述的产胰岛素细胞的制备方法，其中，所述工序是在GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、p53抑制剂、Notch抑制剂、RAR激动剂、PI3K抑制剂、以及cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
[4]根据上述[1]或[2]所述的产胰岛素细胞的制备方法，其中，BMP抑制剂为LDN193189。
[5]根据上述[1]～[3]中任一项所述的产胰岛素细胞的制备方法，其中，GSK3抑制剂为CHIR99021，TGF-β抑制剂为SB431542，p53抑制剂为pifithrin，PI3K抑制剂为LY294002，Notch抑制剂为DAPT，RAR激动剂为视黄酸、或者cAMP诱导剂为毛喉素。
[6]一种产胰岛素细胞的制备方法，其是通过直接分化诱导由体细胞制备产胰岛素细胞的方法，该方法包括：在GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂、以及cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
[7]根据上述[6]所述的产胰岛素细胞的制备方法，其中，GSK3抑制剂为CHIR99021，TGF-β抑制剂为SB431542，PI3K抑制剂为LY294002，Notch抑制剂为DAPT，或者cAMP诱导剂为毛喉素。
[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的产胰岛素细胞的制备方法，其中，所述体细胞为成纤维细胞。
[9]一种产胰岛素细胞，其是通过上述[1]～[8]中任一项所述的产胰岛素细胞的制备方法制备的。
[10]一种用于由体细胞制备产胰岛素细胞的组合物，其是用于通过直接分化诱导由体细胞制备产胰岛素细胞的组合物，所述组合物包含选自GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的6种或全部，并且包含cAMP诱导剂。
[11]根据上述[10]所述的组合物，其包含选自GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的5种或全部，并且包含PI3K抑制剂及cAMP诱导剂。
[12]根据上述[10]所述的组合物，其包含GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、p53抑制剂、Notch抑制剂、RAR激动剂、PI3K抑制剂、以及cAMP诱导剂。
[13]根据上述[10]或[11]所述的组合物，其中，BMP抑制剂为LDN193189。
[14]根据上述[10]～[12]中任一项所述的组合物，其中，GSK3抑制剂为CHIR99021，TGF-β抑制剂为SB431542，p53抑制剂为pifithrin，PI3K抑制剂为LY294002，Notch抑制剂为DAPT，RAR激动剂为视黄酸，或者cAMP诱导剂为毛喉素。
[15]一种用于由体细胞制备产胰岛素细胞的组合物，其是通过直接分化诱导由体细胞制备产胰岛素细胞的组合物，所述组合物包含GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂、以及cAMP诱导剂。
[16]根据上述[15]所述的组合物，其中，GSK3抑制剂为CHIR99021，TGF-β抑制剂为SB431542，PI3K抑制剂为LY294002，Notch抑制剂为DAPT，或者cAMP诱导剂为毛喉素。
[17]根据上述[10]～[16]中任一项所述的组合物，其中，所述体细胞为成纤维细胞。
发明的效果
根据本发明，可以不进行基因导入而由体细胞制备产胰岛素细胞。通过本发明得到的产胰岛素细胞在再生医学等方面是有用的。
附图说明
图1是细胞培养的照片。左侧的5张照片表示添加了实施例4的组合化合物时的结果，右侧的5张照片表示未添加该化合物时的结果。第3天、第6天、第10天、第12天、以及第17天分别表示添加该化合物进行培养后第3天、第6天、第10天、第12天、以及第17天。
图2是添加该化合物培养后第17天的细胞的培养照片(相差，Phase contrast)及其免疫染色照片。左侧的4张照片表示添加了实施例4的组合化合物时的结果，右侧的4张照片表示未添加该化合物时的结果。
图3是添加该化合物培养后第19天的细胞的培养照片(相差，Phase contrast)及其免疫染色照片。
图4是添加该化合物培养后第19天的细胞的培养照片(相差，Phase contrast)及其免疫染色照片。
图5的左侧表示分泌至上清的胰岛素分泌量，右侧表示残留在细胞内的胰岛素分泌量。在各图中，纵轴表示每1mg总蛋白质的分泌量(μU/mg)。在各图中，右侧的柱表示添加了低分子化合物时的结果，左侧的柱表示未添加该低分子化合物时的结果。
图6的各图中纵轴表示每105个细胞的分泌量(μU/105cells)。在各图中，右侧的柱表示添加了该低分子化合物时的结果，左侧的柱表示未添加该低分子化合物时的结果。
具体实施方式
以下，对本发明详细地进行说明。
1产胰岛素细胞的制备方法
本发明的产胰岛素细胞的制备方法(以下，称为“本发明制法”)是通过直接分化诱导由体细胞制备产胰岛素细胞的方法，该方法包括：在选自GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的6种或全部、以及cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序。
优选上述工序是在选自GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的5种或全部、以及PI3K抑制剂及cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序的本发明制法。更优选上述工序是在GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、p53抑制剂、Notch抑制剂、RAR激动剂、PI3K抑制剂、以及cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序的本发明制法。在本发明制法中，特别优选在cAMP诱导剂、或cAMP诱导剂和PI3K抑制剂的存在下对体细胞进行培养。
另外，作为本发明，还可以举出产胰岛素细胞的制备方法，其是通过直接分化诱导由体细胞制备产胰岛素细胞的方法，该方法包括在GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂、以及cAMP诱导剂的存在下对体细胞进行培养的工序。以下，包括所述制造方法也称为本发明制法。
在本发明制法中，可以在至少上述任意组合的存在下对体细胞进行培养，根据需要，可以任意地进一步存在其它抑制剂、诱导剂等而对体细胞进行培养来制备产胰岛素细胞。
上述抑制剂、诱导剂可以分别使用1种，或组合使用2种以上。
在具体的上述抑制剂等中，可以是具有2种以上抑制作用等的抑制剂，在该情况下，可以视为一个抑制剂中存在多种抑制剂等。
1.1关于体细胞
生物的细胞可以分类为体细胞和生殖细胞。本发明制法中可以使用任意的体细胞作为其起始材料。体细胞没有特别限定，可以是从生物体采集到的原代细胞、或已确立的细胞中的任一种。在本发明制法中，可以使用处于分化的各种阶段的体细胞，例如，可以使用最终分化成的体细胞(例如，成纤维细胞、脐带静脉内皮细胞(HUVEC)、肝细胞(Hepatocytes)、胆管细胞(Biliary cells)、胰腺α细胞(Pancreaticαcells)、胰腺腺泡细胞(Acinar cells)、胰腺导管细胞(Ductal cells)、小肠隐窝细胞(Intestinal cryptcells)等)、处于最终分化的过程中的体细胞(例如，间充质干细胞、神经干细胞、内胚层祖细胞等)、或者被初始化而获得多能性的体细胞。作为本发明制法中可使用的体细胞，可以列举例如：造血系统的细胞(各种淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、骨髓细胞等)、器官来源的细胞(肝细胞、脾细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞等)、肌肉组织系统的细胞(骨骼肌细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、心肌细胞等)、成纤维细胞、神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、间质细胞、脂肪细胞(棕色脂肪细胞、白色脂肪细胞等)等任意的体细胞。另外，这些细胞的祖细胞、癌细胞也可以用于本发明制法。可以优选使用成纤维细胞或间充质干细胞。
作为上述的体细胞的供给源，可以示例出人、除人以外的哺乳动物、以及除哺乳动物以外的动物(鸟类、爬行动物类、两栖动物类、鱼类等)，但并不限定于此。作为体细胞的供给源，优选为人、以及除人以外的哺乳动物，特别优选为人。在以向人施用为目的而通过本发明制法制备产胰岛素细胞的情况下，可以优选使用从组织相容性抗原类型与受体一致或类似的供体采集到的体细胞。可以将从受体本身采集到的体细胞供于产胰岛素细胞的制备。
1.2关于本发明的抑制剂等
1.2.1GSK3抑制剂
发现GSK3(glycogen synthase kinase-3、糖原合成酶激酶3)是将糖原合成酶磷酸化并失活的蛋白激酶。在哺乳类中，GSK3可以分类为51kDa的α(GSK3α)和47kDa的β(GSK3β)这两种同工型。GSK3具有将各种蛋白质磷酸化的活性，不仅涉及糖原代谢，还涉及细胞分裂、细胞增殖等生理现象。
“GSK3抑制剂的存在下”是指能够抑制GSK3的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用抑制GSK3的活性的物质，例如，可以利用抗GSK3抗体、GSK3抑制剂这样的GSK3信号抑制方式。另外，GSK3的自身的特定部位被磷酸化时会失去活性，因此，促进上述磷酸化的方式也可以用于GSK3信号的抑制。
在本发明中，作为GSK3抑制剂，例如可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用CHIR99021。
CHIR99021(CAS No.：252917-06-9)
[化学式1]
BIO((2’Z,3’E)-6-Bromoindirubin-3’-oxime)(CAS No.：667463-62-9)
肯帕罗酮(Kenpaullone)(CAS No.：142273-20-9)
A1070722(CAS No.：1384424-80-9)
SB216763(CAS No.：280744-09-4)
CHIR98014(CAS No.：556813-39-9)
TWS119(CAS No.：601514-19-6)
Tideglusib(CAS No.：865854-05-3)
SB415286(CAS No.：264218-23-7)
Bikinin(CAS No.：188011-69-0)
IM-12(CAS No.：1129669-05-1)
1-Azakenpaullone(CAS No.：676596-65-9)
LY2090314(CAS No.：603288-22-8)
AZD1080(CAS No.：612487-72-6)
AZD2858(CAS No.：486424-20-8)
AR-A014418(CAS No.：487021-52-3)
TDZD-8(CAS No.：327036-89-5)
Indirubin(CAS No.：479-41-4)
GSK3抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如可以在0.1μmol/L～20μmol/L、优选为0.5μmol/L～10μmol/L的范围使用。
1.2.2TGF-β抑制剂
TGF-β(transforming growth factor-β、转化生长因子β)中存在TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3这3种，由基本上所有的细胞产生。TGF-β涉及抑制以上皮细胞为代表的多种细胞的增殖等的细胞增殖、转化、分化、产生、凋亡的控制等多种细胞功能。
“TGF-β抑制剂的存在下”是指可以抑制TGF-β的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用能够抑制TGF-β的任意的方式。在本发明中，可以利用直接作用于TGF-β而抑制其功能的物质(例如，抗TGF-β抗体、其它药物)、抑制TGF-β自身的产生的药物等。另外，通过在其上游抑制与TGF-β相关的信号转导，也可以抑制TGF-β。
在本发明中，作为TGF-β抑制剂，例如可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用SB431542、RepSox。
SB431542(CAS No.：301836-41-9)
[化学式2]
A83-01(CAS No.：909910-43-6)
[化学式3]
RepSox(CAS No.：446859-33-2)
[化学式4]
LY364947(CAS No.：396129-53-6)
SB525334(CAS No.：356559-20-1)
SD208(CAS No.：627536-09-8)
Galunisertib(LY2157299)(CAS No.：700874-72-2)
LY2109761(CAS No.：700874-71-1)
SB505124(CAS No.：694433-59-5)
GW788388(CAS No.：452342-67-5)
EW-7197(CAS No.：1352608-82-2)
TGF-β抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如，可以在0.1μmol/L～30μmol/L、优选为0.5μmol/L～10μmol/L的范围使用。
1.2.3BMP抑制剂
BMP(Bone Morphogenetic Protein、骨形成蛋白)是属于TGF-β超家族的成长因子，控制胚、组织的发生、细胞的分化、细胞死亡等。BMP与细胞膜上的I型受体和II型受体结合而形成异源四聚体，经过转录因子SMAD的磷酸化而向核内转导BMP信号。多数BMP抑制剂抑制由ALK(激活素受体样激酶，Activin receptor-like kinase)-2,3,6引起的SMAD的磷酸化，所述ALK-2,3,6是通过BMP的结合而激活的I型受体。
“BMP抑制剂的存在下”是指能够抑制BMP信号转导通路的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用能够抑制BMP信号转导通路的任意方式。在本发明中，可以利用直接作用于BMP及BMP受体而抑制其功能的物质(例如，抗BMP抗体、其它药物)、或者抑制它们的表达的药物等。另外，通过抑制位于BMP相关信号转导下游的SMAD转录因子的表达及其翻译后修饰，也可以抑制BMP信号转导通路。
在本发明中，作为BMP抑制剂，例如可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用LDN193189。
LDN193189(CAS No.：1062368-24-4)
[化学式5]
DMH1(CAS No.：1206711-16-1)
K02288(CAS No.：1431985-92-0)
LDN212854(CAS No.：1432597-26-6)
LDN193189HCl(CAS No.：1062368-62-0)
ML347(CAS No.：1062368-49-3)
LDN214117(CAS No.：1627503-67-6)
BMP抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如可以在0.1μmol/L～10μmol/L、优选为0.5μmol/L～5μmol/L的范围使用。
1.2.4p53抑制剂
p53是最重要的抑癌基因之一，抑制细胞增殖，在癌的抑制方面起到重要的作用。而且，响应各种应激而激活靶基因，成为细胞周期的停滞、凋亡、DNA修复、细胞衰老等的起点。
“p53抑制剂的存在下”是指能够抑制p53的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用能够抑制p53的任意方式。在本发明中，可以利用直接作用于p53而抑制其功能的物质(例如，抗p53抗体、其它药物)、抑制p53本身产生的药物等。另外，通过在其上游抑制p53相关的信号转导，也可以抑制p53。
在本发明中，作为p53抑制剂，例如可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用pifithrin或pifithrin-α。
pifithrin-α(CAS No.：63208-82-2)
[化学式6]
pifithrin-β(CAS No.：511296-88-1)
pifithrin-μ(CAS No.：64984-31-2)
NSC66811(CAS No.：6964-62-1)
Nultin-3(CAS No.：548472-68-0)
p53抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如可以在0.5μmol/L～30μmol/L、优选为1μmol/L～10μmol/L的范围使用。
1.2.5cAMP诱导剂
cAMP(环状单磷酸腺苷)是作为第二信使而参与各种细胞内信号转导的物质。cAMP是在细胞内通过腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)使三磷酸腺苷(ATP)环化而生成的。
“cAMP诱导剂的存在下”是指能够诱导cAMP的培养条件下，其方式没有特别限定，例如，可以利用能够使细胞内cAMP浓度增加的任意方式。可以使用能够与作为cAMP生成相关酶的腺苷酸环化酶直接作用而进行诱导的物质、可促进腺苷酸环化酶的表达的物质、以及抑制作为分解cAMP的酶的磷酸二酯酶的物质等作为使细胞内cAMP浓度增加的方式。也可以使用在细胞内具有与cAMP相同作用的作为cAMP结构类似物的双丁酰cAMP(dibutyrylcAMP)。
在本发明中，作为cAMP诱导剂(腺苷酸环化酶激活剂)，可以列举例如：毛喉素(forskolin：CAS No.：66575-29-9)、以及毛喉素衍生物(例如日本特开2002-348243号公报)、以下的化合物等，但没有特别限定。可以优选使用毛喉素。
毛喉素(CAS No.：66428-89-5)
[化学式7]
异丙肾上腺素(CAS No.：7683-59-2)
NKH477(CAS No.：138605-00-2)
PACAP1-27(CAS No.：127317-03-7)
PACAP1-38(CAS No.：137061-48-4)
cAMP诱导剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如可以在0.2μmol/L～50μmol/L、优选为1μmol/L～30μmol/L的范围使用。
1.2.6PI3K抑制剂
PI3K(磷酸肌醇3-激酶，Phosphoinositide 3-kinase)是将肌醇磷脂磷酸化的酶，产生的磷酸肌醇将PDK1激活。PDK1进一步将AKT磷酸化，激活PDK1/AKT信号通路。LY294002是对PI3K选择性的抑制剂，通过抑制磷酸肌醇的产生来抑制PDK1/AKT信号通路的激活。
“PI3K抑制剂的存在下”是指能够抑制PI3K的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用能够抑制PI3K的任意方式。在本发明中，可以利用直接作用于PI3K而抑制其功能的物质(例如，抗PI3K抗体、其它药物)、抑制PI3K本身产生的药物等。另外，通过在其上游抑制PI3K相关的信号转导，也可以抑制PI3K。
在本发明中，作为PI3K抑制剂，例如可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用LY294002。
LY294002(CAS No.：154447-36-6)
[化学式8]
Buparlisib(CAS No.：944396-07-0)
TGR-1202(CAS No.：1532533-67-7)
PI-103(CAS No.：371935-74-9)
IC-87114(CAS No.：371242-69-2)
渥曼青霉素(Wortmannin)(CAS No.：19545-26-7)
ZSTK474(CAS No.：475110-96-4)
AS-605240(CAS No.：648450-29-7)
PIK-90(CAS No.：677338-12-4)
AZD6482(CAS No.：1173900-33-8)
Duvelisib(CAS No.：1201438-56-3)
TG100-115(CAS No.：677297-51-7)
CH5132799(CAS No.：1007207-67-1)
CAY10505(CAS No.：1218777-13-9)
PIK-293(CAS No.：900185-01-5)
CZC24832(CAS No.：1159824-67-5)
Pilaralisib(CAS No.：934526-89-3)
AZD8835(CAS No.：1620576-64-8)
PI3K抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如可以在0.1μmol/L～20μmol/L、优选为0.5μmol/L～10μmol/L的范围使用。
1.2.7Notch抑制剂
Notch是单次跨膜受体，被γ分泌酶切断，从细胞内区域转移核中作为转录因子而发挥功能。DAPT是γ分泌酶的抑制剂，通过抑制Notch的切断而作为Notch信号的抑制剂发挥功能。
“Notch抑制剂的存在下”是指能够抑制Notch的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用能够抑制Notch的任意方式。在本发明中，可以利用直接作用于Notch而抑制其功能的物质(例如，抗Notch抗体、其它药物)、抑制Notch本身表达的药物等。另外，通过抑制Notch相关的信号转导，也可以抑制Notch。
在本发明中，作为Notch抑制剂，例如可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用DAPT。
DAPT(CAS No.：208255-80-5)
[化学式9]
RO4929097(CAS No.：847925-91-1)
FLI-06(CAS No.：313967-18-9)
Semagacestat(CAS No.：425386-60-3)
Dibenzazepine(CAS No.：209984-56-5)
PF-03084014(CAS No.：1290543-63-3)
IMR-1(CAS No.：310456-65-6)
Notch抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如可以在0.2μmol/L～30μmol/L、优选为1μmol/L～10μmol/L的范围使用。
1.2.8RAR激动剂
RAR(Retinoic acid receptor、视黄酸受体)属于核受体超家族，以视黄酸为配体激活其转录活性。RAR在生物体内具有各种功能，特别是与细胞的分化密切相关，因此开发了大量的人工合成激动剂。
“RAR激动剂的存在下”是指能够增强RAR的培养条件下，其方式没有特别限定，可以利用能够增强RAR的任意方式。在本发明中，可以利用直接作用于RAR而增强其功能的物质、促进RAR本身表达的药物等。另外，可以通过与RAR相互作用的转录因子或转录偶联因子、以及对它们的表达及翻译后修饰等进行调节来控制RAR的功能。
在本发明中，作为RAR激动剂，例如可以使用以下的化合物，但没有特别限定。可以优选使用视黄酸、CH55、AM580。
视黄酸(CAS No.：302-79-4)
CH55(CAS No.：110368-33-7)
AM580(CAS No.：102121-60-8)
维甲酸(Tretinoin)(CAS No.：302-79-4)
阿达帕林(Adapalene)(CAS No.：106685-40-9)
贝沙罗汀(Bexarotene)(CAS No.：153559-49-0)
他扎罗汀(Tazarotene)(CAS No.：118292-40-3)
他米巴罗汀(Tamibarotene)(CAS No.：94497-51-5)
RAR激动剂的浓度可以适当确定，没有特别限定，例如可以在0.05μmol/L～10μmol/L、优选为0.5μmol/L～5μmol/L的范围使用。
1.3体细胞的培养
本发明制法中的体细胞的培养可以在根据待使用的体细胞的种类选择培养基、温度、其它条件，并在上述的各种抑制剂(以及根据情况加入的诱导剂或激活剂)的存在下实施。培养基可以从公知的培养基或市售的培养基中选择。例如，可以在作为通常的培养基的MEM(最少必需培养基)、DMEM(杜氏改良Eagle培养基，Dulbecco’s Modified EagleMedium)、DMEM/F12、或对它们进行了改良的培养基中添加适当的成分(血清、蛋白质、氨基酸、糖类、维生素类、脂肪酸类、抗生素等)来使用。
作为培养条件，可以选择通常的细胞培养的条件。可示例出37℃、5％CO2的条件等。优选在培养中以适当的间隔(优选为1天至7天1次、更优选为3天至4天1次)更换培养基。在以成纤维细胞作为材料来实施本发明制法的情况下，在37℃、5％CO2的条件下从8～10天至3周内出现产胰岛素细胞。通过选择容易培养的细胞作为待使用的体细胞，也可以将预先增加了细胞数量的体细胞转化为产胰岛素细胞。因此，扩大的产胰岛素细胞的制备也是容易的。
体细胞的培养可以使用板、培养皿、细胞培养瓶、细胞培养袋等细胞培养容器。需要说明的是，作为细胞培养袋，具有透气性的培养袋是合适的。在需要大量细胞的情况下，可以使用大型培养槽。培养可以在开放系统或封闭系统中的任一种中实施，在以将得到的产胰岛素细胞施用于人等为目的的情况下，优选在封闭系统中进行培养。
在本发明制法中，通过在包含上述的各种抑制剂等的培养基中对体细胞进行培养，可以通过一步培养而由体细胞制备产胰岛素细胞。
1.4产胰岛素细胞
通过上述的本发明制法，可以得到含有产胰岛素细胞的细胞群。通过本发明制法制备的产胰岛素细胞也在本发明的范围内。通过本发明制法制备的产胰岛素细胞除了最终分化成的细胞以外，还可以是将要分化成产胰岛素细胞的祖细胞。
通过本发明制法制备的产胰岛素细胞是利用低分子化合物由体细胞直接诱导的所谓的低分子化合物诱导性产胰岛素细胞(ciIPCs)，且与由ES细胞、iPS细胞分化诱导的产胰岛素细胞相区别。
通过本发明制法制备的产胰岛素细胞例如可以利用细胞的形态变化、产胰岛素细胞的特征性质、特异性标志物(例如抗胰岛素抗体)来进行检测、确认及分离。
特异性标志物的检测可以利用检疫的方法(基于抗体的检测)，关于蛋白质分子，可以通过其mRNA量的定量来实施检测。识别产胰岛素细胞的特异性标志物的抗体在对通过本发明制法得到的产胰岛素细胞进行分离及纯化方面是有用的。
通过本发明制法制备的产胰岛素细胞例如可以用于组织修复、血中胰岛素浓度的改善等。通过移植由本发明制法制备的产胰岛素细胞，可以制造用于组织修复等的医药组合物。对于基本上无法分泌胰岛素的1型糖尿病的患者而言，为了减轻其症状并且根治，胰腺移植或胰岛的移植已成为根本性的治疗方法。另外，在日本和海外，预测2型糖尿病的患者将来进一步增加，成为医疗费用高涨的原因，而分泌胰岛素的胰腺β细胞的移植可以成为有效的治疗方法。作为这样的糖尿病等胰腺疾病的治疗方式，进行了产胰岛素细胞的制备方法、以及产胰岛素细胞的移植方法的开发。例如，期待通过将产胰岛素细胞移植至肾被膜下、通过门静脉移植至肝脏，从而用于严重的胰腺疾病(糖尿病等)的治疗。
在将通过本发明制法制备的产胰岛素细胞制成医药组合物的情况下，可以通过通常方法将产胰岛素细胞与药学上可接受的载体混合等而制成适合对个体施用的形式的制剂。作为载体，可以列举例如：生理盐水、葡萄糖、加入其它佐剂(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)而等张的注射用蒸馏水。另外，也可以配合缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂、抗氧化剂等。
通过本发明制法制备的产胰岛素细胞也可以进一步制成与对产胰岛素细胞的功能发挥、移植活性提高有效的其它细胞、成分组合而成的组合物。
此外，通过本发明制法制备的产胰岛素细胞可以用于作用于产胰岛素细胞的药物候选化合物的筛选、药物候选化合物的安全性评价。产胰岛素细胞是用于评价药物候选化合物的毒性的重要工具。根据本发明制法，可以通过一次操作获得大量的产胰岛素细胞，因此能够不受细胞批次差异影响地得到具有重现性的研究结果。
2组合物
本发明的组合物(以下，称为“本发明组合物”)是用于通过直接分化诱导由体细胞制备产胰岛素细胞的组合物，其特征在于包含选自GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的6种或全部，并且包含cAMP诱导剂。
优选包含选自GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的5种或全部、并且包含PI3K抑制剂及cAMP诱导剂的本发明组合物。更优选包含GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、p53抑制剂、Notch抑制剂、RAR激动剂、PI3K抑制剂、以及cAMP诱导剂的本发明组合物。在本发明组合物中，特别优选包含cAMP诱导剂、或cAMP诱导剂和PI3K抑制剂。
另外，作为本发明，还可以举出用于由体细胞制备产胰岛素细胞的组合物，其是用于通过直接分化诱导由体细胞制备产胰岛素细胞的组合物，所述组合物包含GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂、以及cAMP诱导剂。以下，包括所述组合物也称为本发明组合物。
在本发明组合物中，可以包含至少上述的任意组合，可以根据需要还任意包含其它抑制剂、诱导剂等。
上述抑制剂、诱导剂等可以使用1种，也可以组合使用2种以上。
在具体的上述抑制剂等中，可以是具有2种以上抑制作用等的抑制剂，在该情况下，可以视为一个抑制剂中存在多种抑制剂等。
上述的抑制剂、诱导剂等的具体例子、优选的例子等与上述含义相同。
本发明组合物可以作为用于由体细胞制备产胰岛素细胞的组合物而使用。另外，本发明组合物也可以作为用于由体细胞制备产胰岛素细胞的培养基而使用。
作为用于由体细胞制备产胰岛素细胞的培养基，可以示例出在将细胞培养所需要的成分混合而制造的基础培养基中含有选自GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的6种或全部、并且含有cAMP诱导剂作为有效成分的培养基。可以以对制备产胰岛素细胞有效的浓度含有上述的有效成分，本领域技术人员可以适当确定浓度。基础培养基可以从公知的培养基或市售的培养基中选择。例如，可以使用作为通常的培养基的MEM(最少必需培养基)、DMEM(杜氏改良Eagle培养基，Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、DMEM/F12、RPMI1640、或对它们进行了改良的培养基作为基础培养基。
此外，培养基中可以添加本说明书中上述说明的公知的培养基成分，例如可以添加血清、蛋白质(白蛋白、转铁蛋白、成长因子等)、氨基酸、糖类、维生素类、脂肪酸类、抗生素等。
另外，培养基中可以添加本说明书中上述说明的对于诱导向产胰岛素细胞的分化有效的物质。
另外，在本发明中，通过对生物体施用例如选自GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的6种或全部、以及cAMP诱导剂，也可以在生物体内由体细胞制备产胰岛素细胞。即，根据本发明，可以提供在生物体内由体细胞制备产胰岛素细胞的方法，该方法包括：向生物体施用例如选自GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的6种或全部、以及cAMP诱导剂。对生物体施用的该抑制剂等的优选组合如本说明书中的记载所述。另外，作为生物体，可以示例出：人、除人以外的哺乳动物、以及除哺乳动物以外的动物(鸟类、爬行动物类、两栖动物类、鱼类等)，特别优选为人。通过对生体内的特定部位施用例如选自GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、p53抑制剂、PI3K抑制剂、Notch抑制剂及RAR激动剂中的6种或全部、以及cAMP诱导剂，可以在上述特定部位由体细胞制备产胰岛素细胞。
实施例
以下，通过实施例、试验例对本发明具体地进行说明，但本发明并不限定于下述实施例等所记载的范围。
实施例产胰岛素细胞的制备
＜由人成纤维细胞直接诱导产胰岛素细胞＞
(1)人成纤维细胞
作为材料的人成纤维细胞从DS PHARMA BIOMEDICAL公司购入，是38岁的人皮肤来源的成纤维细胞。
(2)由人成纤维细胞直接诱导产胰岛素细胞
将人成纤维细胞以5×104个分别接种于涂布有明胶(Cat#：190-15805，和光纯药工业株式会社制)的35mm培养皿，用添加了10％胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基(Gibco公司制)在37℃、5％CO2条件下培养至汇合。需要说明的是，DMEM表示杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified EagleMedium)。
将上述的人成纤维细胞的培养皿的培养基更换为添加了10％胎牛血清(FBS、Hyclone公司制)、ITS-X(Cat#：51500056、Gibco公司制)、非必需氨基酸(NEAA：Non-essential amino acids；Cat#：11140050、Gibco公司制)、Glutamine(Gibco公司制；最终浓度2mmol/L)、烟酰胺(Cat#：72340-100G、Sigma-Aldrich公司制；最终浓度10mmol/L)、Exendin-4(Cat#：av120214、Abcam公司制；最终浓度100ng/mL)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、以及下述的低分子化合物的DMEM/F12(Gibco公司制)。然后，每3天更换为相同组成的培养基，并且在37℃、5％CO2条件下进行培养。
＜低分子化合物＞
1μM CHIR99021(Cat#：13122，Cayman Chemical)
2μM SB431542(Cat#：198-16543，Wako)
1μM LDN193189(Cat#：124-06011，Wako)
5μM pifithrin-α(Cat#：162-23133，Wako)
7.5μM毛喉素(Cat#：063-02193，Wako)
2.5μM LY294002(Cat#：70920，Cayman Chemical)
5μM DAPT(Cat#：sc-201315，Santa Cruz Biotechnology)
1μM视黄酸(Cat#：186-01114，Wako)
(3)结果
将按照上述(2)培养的结果示于表1。在表中，“+”表示在培养基中存在该化合物，“－”表示在培养基中不存在该化合物。
表1
然后，在添加低分子化合物培养后第17天用4％多聚甲醛固定细胞后，进行了免疫染色。染色使用了抗胰岛素(Insulin)抗体(sc-9168、Santa Cruz Biotechnology公司制造；以200倍稀释使用)。将其结果示于图2。图中，绿色表示胰岛素的染色结果，蓝色表示基于DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)的核染色。需要说明的是，图2以灰色显示，因此未显示出蓝色和绿色等，但实际的原始照片中显示出了蓝色和绿色等。
另外，如表1那样从实施例1的化合物的组合中一个一个地去除特定的化合物，评价了转化为表达胰岛素的细胞所需要的化合物的重要性(培养开始后第19天)。将其结果示于图3和4。然后，使用Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA Kit(Mercodia公司制)对24小时后的上清中的胰岛素的分泌量和测定后的细胞内胰岛素的残留量进行定量，计算出每1mg细胞总蛋白质的量。将其结果示于图5。图中的“8C-LDN,RA”表示从实施例1的组合化合物中排除了LDN193189和视黄酸的组合化合物。
(4)产胰岛素细胞的评价
如图1所示，在添加该低分子化合物组进行培养后，出现了与成纤维细胞明显形态不同的、更接近球形且小尺寸的细胞。如图2所示，在一定数量的这些细胞中观察到胰岛素的染色，相对地，不是在用DAPI染色的细胞核中而是在细胞质中观察到了更强的染色。另外，在这些细胞中没有观察到与绿色的胰岛素的染色重叠的清晰的自体荧光。根据表1及图3、图4可知，在向该表达胰岛素的细胞的转化中，毛喉素(cAMP诱导剂)或LY294002(PI3K抑制剂)是特别重要的。
如图5所示，在添加了化合物的细胞中，上清中的胰岛素的分泌量和测定后的细胞内胰岛素的残留量均升高。
试验例
对于下述低分子化合物的组合，与上述实施例同样地添加并进行了细胞培养。作为材料的人成纤维细胞是从DS PHARMA BIOMEDICAL公司购入的0岁、38岁或49岁的人皮肤来源的成纤维细胞。然后，使用Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA Kit(Mercodia公司制)对添加该化合物组24小时后中的上清中的胰岛素分泌量进行定量，计算出每105细胞的量(n＝3)。将其结果示于图6。左图表示使用了0岁的成纤维细胞的结果，中图表示使用了38岁的成纤维细胞的结果，右图表示使用了49岁的成纤维细胞的结果。在各图中，“无化合物”表示下述低分子化合物中的一种都没有添加时的结果，“5C”表示将下述低分子化合物全部添加时的结果。误差棒表示标准偏差，星号表示t检验(Student’s t-test)的显著性差异(*P＜0.05,**P＜0.01)。
＜低分子化合物＞
3μM CHIR99021(Cat#：13122，Cayman Chemical)
2μM SB431542(Cat#：198-16543，Wako)
7.5μM毛喉素(Cat#：063-02193，Wako)
5μM LY294002(Cat#：70920，Cayman Chemical)
5μM DAPT(Cat#：sc-201315，Santa Cruz Biotechnology)
如图6所示，对于在任意的成纤维细胞而言，在添加了该低分子化合物组(5C)的细胞中，上清中的胰岛素的分泌量均升高。

Claims (6)

1.一种产胰岛素细胞的制备方法，其是通过直接分化诱导由人成纤维细胞制备产胰岛素细胞的方法，该方法包括：在选自作为GSK3抑制剂的CHIR99021、作为TGF-β抑制剂的SB431542、作为BMP抑制剂的LDN193189、作为p53抑制剂的pifithrin-α、作为Notch抑制剂的DAPT及作为RAR激动剂的视黄酸中的5种或全部、以及作为PI3K抑制剤的LY294002和作为cAMP诱导剂的毛喉素的存在下，以人成纤维细胞为原料进行培养的工序。
2.根据权利要求1所述的产胰岛素细胞的制备方法，其中，所述工序是在所述GSK3抑制剂、所述TGF-β抑制剂、所述p53抑制剂、所述Notch抑制剂、所述RAR激动剂、所述PI3K抑制剂、以及所述cAMP诱导剂的存在下，对作为原料的人成纤维细胞进行培养的工序。
3.一种产胰岛素细胞的制备方法，其是通过直接分化诱导由人成纤维细胞制备产胰岛素细胞的方法，该方法包括：在作为GSK3抑制剂的CHIR99021、作为TGF-β抑制剂的SB431542、作为PI3K抑制剂的LY294002、作为Notch抑制剂的DAPT、以及作为cAMP诱导剂的毛喉素的存在下，对作为原料的人成纤维细胞进行培养的工序。
4.一种用于由作为原料的人成纤维细胞制备产胰岛素细胞的组合物，其是用于通过直接分化诱导由人成纤维细胞制备产胰岛素细胞的组合物，所述组合物包含选自作为GSK3抑制剂CHIR99021、作为TGF-β抑制剂的SB431542、作为BMP抑制剂的LDN193189、作为p53抑制剂的pifithrin-α、作为Notch抑制剂的DAPT及作为RAR激动剂的视黄酸中的5种或全部、以及作为PI3K抑制剤的LY294002和作为cAMP诱导剂的毛喉素。
5.根据权利要求4所述的组合物，其包含所述GSK3抑制剂、所述TGF-β抑制剂、所述p53抑制剂、所述Notch抑制剂、所述RAR激动剂、所述PI3K抑制剂、以及所述cAMP诱导剂。
6.一种用于由作为原料的人成纤维细胞制备产胰岛素细胞的组合物，其是通过直接分化诱导由成纤维细胞制备产胰岛素细胞的组合物，所述组合物包含作为GSK3抑制剂的CHIR99021、作为TGF-β抑制剂的SB431542、作为PI3K抑制剂的LY294002、作为Notch抑制剂的DAPT、以及作为cAMP诱导剂的毛喉素。
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