WO2019151098A1 - インスリン産生細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2019151098A1
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cells
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insulin
tgf
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平 戴
行正 武田
義規 原田
松本　潤一
あゆみ 草鹿
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株式会社片岡製作所
京都府公立大学法人
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    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts

Definitions

  • the present invention belongs to the technical field of regenerative medicine or direct reprogramming from somatic cells.
  • the present invention relates to a method for directly producing insulin-producing cells from somatic cells using low-molecular compounds, and low-molecular compound-induced insulin-producing cells (ciIPCs: chemical compound-induced insulin-) produced by such production methods. producing cells).
  • ciIPCs low-molecular compound-induced insulin-producing cells
  • the invention further relates to compositions that can be used for the insulin producing cells and methods for producing the insulin producing cells.
  • Mesenchymal cells form various biological organs such as muscle, bone, cartilage, bone marrow, fat, and connective tissue, and are promising as materials for regenerative medicine.
  • Mesenchymal stem cells are undifferentiated cells present in tissues such as bone marrow, adipose tissue, blood, placenta and umbilical cord. Since it has the ability to differentiate into cells belonging to the mesenchymal system, mesenchymal stem cells are attracting attention as a starting material for producing those cells.
  • regenerative medicine using mesenchymal stem cells themselves for reconstructing bone, cartilage, myocardium and the like is also being studied.
  • Non-patent Document 1 a method for directly converting somatic cells such as fibroblasts into other cells. For example, it is known to obtain nerve cells by culturing fibroblasts with a chemical substance (Non-patent Document 1).
  • pancreatic ⁇ cells that secrete insulin in addition to the reported induction of differentiation from iPS cells or ES cells to human pancreatic ⁇ cells, pancreatic ⁇ cells, pancreatic acinar cells, pancreatic ductal gland cells, small intestinal crypt cells.
  • endoderm cells such as hepatocytes and bile duct cells were directly induced into pancreatic ⁇ cells using Pdx1, Ngn3, and MafA, which are pancreatic ⁇ cell specific transcription factors (Non-patent Document 2).
  • Non-patent Documents 3 and 4 mouse embryonic fibroblasts
  • endoderm progenitor cells were prepared from mouse embryonic fibroblasts (MEFs) with low molecular weight compounds and differentiated from the cells into pancreatic endocrine cells (Non-patent Document 5).
  • a method of directly converting a somatic cell into a desired cell without introducing a gene may be an effective option as a means for obtaining a therapeutic cell.
  • pancreatic ⁇ cells as described above, methods for direct conversion from somatic cells have been reported. However, these inventions can be achieved by introducing specific genes into endoderm cells that are developmentally close in lineage. Being guided.
  • the present invention is a method for directly inducing insulin-producing cells from somatic cells by a combination of low-molecular compounds without artificial gene transfer, that is, insulin-producing cells from somatic cells by a composition of certain low-molecular compounds. It is a main subject to provide a new manufacturing method that can be directly manufactured.
  • somatic cells can be directly converted into insulin-producing cells by culturing somatic cells in the presence of certain small molecule inhibitors and the like, and the present invention has been completed. It was.
  • Examples of the present invention include the following.
  • a method for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells comprising a GSK3 inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor, a BMP inhibitor, a p53 inhibitor, a PI3K inhibitor, a Notch inhibitor, and A method for producing insulin-producing cells, comprising a step of culturing somatic cells in the presence of six or all selected from the group consisting of RAR agonists and a cAMP inducer.
  • [1] The method for producing insulin-producing cells according to [1]. [4] The method for producing insulin-producing cells according to [1] or [2] above, wherein the BMP inhibitor is LDN193189. [5] The GSK3 inhibitor is CHIR99021, the TGF- ⁇ inhibitor is SB431542, the p53 inhibitor is pifthrin, the PI3K inhibitor is LY294002, the Notch inhibitor is DAPT, the RAR agonist is retinoic acid, or the cAMP inducer is forskolin. The method for producing insulin-producing cells according to any one of [1] to [3] above.
  • a method for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells, in the presence of a GSK3 inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor, a PI3K inhibitor, a Notch inhibitor, and a cAMP inducer comprising a step of culturing cells.
  • a composition for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells which is a GSK3 inhibitor, TGF- ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, p53 inhibitor, PI3K inhibitor, Notch inhibition
  • a composition for producing insulin-producing cells from somatic cells comprising 6 or all selected from the group consisting of an agent and a RAR agonist, and a cAMP inducer.
  • composition described in [10] above comprising a GSK3 inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor, a p53 inhibitor, a Notch inhibitor, a RAR agonist, a PI3K inhibitor, and a cAMP inducer.
  • BMP inhibitor is LDN193189.
  • the GSK3 inhibitor is CHIR99021
  • the TGF- ⁇ inhibitor is SB431542
  • the p53 inhibitor is pifthrin
  • the PI3K inhibitor is LY294002
  • the Notch inhibitor is DAPT
  • the RAR agonist is retinoic acid
  • the cAMP inducer is forskolin.
  • a composition for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells comprising a GSK3 inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor, a PI3K inhibitor, a Notch inhibitor, and a cAMP inducer A composition for producing insulin-producing cells from somatic cells.
  • the GSK3 inhibitor is CHIR99021
  • the TGF- ⁇ inhibitor is SB431542
  • the PI3K inhibitor is LY294002
  • the Notch inhibitor is DAPT
  • the cAMP inducer is forskolin.
  • insulin-producing cells can be produced from somatic cells without introducing a gene.
  • the insulin-producing cells obtained by the present invention are useful in regenerative medicine and the like.
  • the left side represents the amount of insulin secreted into the supernatant
  • the right side represents the amount of insulin secreted in the cells.
  • the vertical axis represents the secretion amount ( ⁇ U / mg) per mg of total protein.
  • the ordinate shows the amount of secreted per 10 5 cells ( ⁇ U / 10 5 cells).
  • the result when the low molecular compound is added to the right column and the result when the low molecular compound is not added to the left column are shown.
  • the method for producing insulin producing cells according to the present invention is a method for producing insulin producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells. 6 or all selected from the group consisting of a GSK3 inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor, a BMP inhibitor, a p53 inhibitor, a PI3K inhibitor, a Notch inhibitor, and a RAR agonist, and a cAMP inducer. It includes the step of culturing somatic cells.
  • the above-mentioned step comprises five or all selected from the group consisting of a GSK3 inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor, a BMP inhibitor, a p53 inhibitor, a Notch inhibitor, and a RAR agonist, and a PI3K inhibitor and cAMP.
  • a GSK3 inhibitor a TGF- ⁇ inhibitor, a BMP inhibitor, a p53 inhibitor, a Notch inhibitor, and a RAR agonist, and a PI3K inhibitor and cAMP.
  • the production method of the present invention which is a step of culturing somatic cells in the presence of an inducer. More preferably, the above step is a step of culturing somatic cells in the presence of a GSK3 inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor, a p53 inhibitor, a Notch inhibitor, a RAR agonist, a PI3K inhibitor, and a cAMP inducer.
  • Invention manufacturing method is a step of culturing somatic cells in
  • the present invention also relates to a method for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells, the presence of a GSK3 inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor, a PI3K inhibitor, a Notch inhibitor, and a cAMP inducer.
  • a method for producing insulin-producing cells characterized in that it comprises a step of culturing somatic cells underneath.
  • this production method is also referred to as the production method of the present invention.
  • somatic cells may be cultured in the presence of at least one of the above combinations, and if necessary, somatic cells may be cultured in the presence of other inhibitors or inducers, and insulin. Production cells can be produced.
  • Each of the inhibitors and inducers may be used alone or in combination of two or more.
  • the specific inhibitor described above may have two or more types of inhibitory action and the like, but in that case, it can be considered that a plurality of inhibitors or the like are present alone.
  • Somatic cells Living cells can be classified into somatic cells and germ cells. Any somatic cell can be used as a starting material for the production method of the present invention.
  • the somatic cell is not particularly limited, and may be either a primary cell collected from a living body or a cell line established.
  • somatic cells in various stages of differentiation for example, terminally differentiated somatic cells (eg, fibroblasts, umbilical vein endothelial cells (HUVEC), hepatocytes (Biary cells), biliary cells), Pancreatic ⁇ cells (Pancreatic ⁇ cells), pancreatic acinar cells (Acinar cells), pancreatic ductal gland cells (Ductal cells), small intestinal crypt cells (Intestinal crypt cells), etc.
  • somatic cells on the way to final differentiation eg, between Leaf stem cells, neural stem cells, endoderm progenitor cells, etc.
  • somatic cells that have been reprogrammed and have acquired pluripotency can be used.
  • somatic cells examples include arbitrary somatic cells such as hematopoietic cells (various lymphocytes, macrophages, dendritic cells, bone marrow cells, etc.), organ-derived cells (hepatocytes, spleen cells, Pancreatic cells, kidney cells, lung cells, etc.), muscle tissue cells (skeletal muscle cells, smooth muscle cells, myoblasts, cardiomyocytes, etc.), fibroblasts, neurons, osteoblasts, chondrocytes, endothelial cells , Stromal cells, fat cells (brown fat cells, white fat cells, etc.) and the like.
  • the production method of the present invention can also be applied to precursor cells and cancer cells of these cells.
  • fibroblasts or mesenchymal stem cells can be used.
  • somatic cell supply source examples include, but are not limited to, humans, mammals other than humans, and animals other than mammals (birds, reptiles, amphibians, fish, etc.).
  • somatic cells humans and mammals other than humans are preferable, and humans are particularly preferable.
  • somatic cells collected from a donor whose histocompatibility antigen type matches or similar to that of the recipient can be used. Somatic cells collected from the recipient itself may be used for the production of insulin-producing cells.
  • GSK3 glycogen synthase kinase-3
  • GSK3 ⁇ a protein kinase that phosphorylates and inactivates glycogen synthase. I found it. In mammals, GSK3 is classified into two isoforms, 51 kDa ⁇ (GSK3 ⁇ ) and 47 kDa ⁇ (GSK3 ⁇ ). GSK3 has an activity to phosphorylate various proteins, and is involved not only in glycogen metabolism but also in physiological phenomena such as cell division and cell proliferation.
  • GSK3 inhibitor refers to a culture condition capable of inhibiting GSK3, and the means thereof is not particularly limited, and substances that inhibit the activity of GSK3, such as anti-GSK3 antibody and GSK3 GSK3 signal inhibition means such as inhibitors can be utilized.
  • GSK3 loses its activity when its specific site is phosphorylated, the above-described means for promoting phosphorylation can also be used for inhibition of GSK3 signal.
  • the GSK3 inhibitor for example, the following compounds can be used.
  • CHIR99021 can be used.
  • BIO ((2′Z, 3′E) -6-Bromoindrubin-3′-oxime) (CAS No .: 667463-62-9) Kenpaulone (CAS No .: 142273-20-9) A1070722 (CAS No .: 1384424-80-9) SB216673 (CAS No .: 280744-09-4) CHIR98014 (CAS No .: 55613-39-9) TWS119 (CAS No .: 601514-19-6) Tideglusib (CAS No .: 865854-05-3) SB415286 (CAS No .: 264218-23-7) Bikinin (CAS No .: 188011-169-0) IM-12 (CAS No .: 1129669-05-1) 1-Azakenpaulone (CAS No .: 676596-65-9) LY20903314 (CAS No .: 603288-22-8) AZD1080 (CAS No .: 612487-72-6) AZD
  • the concentration of the GSK3 inhibitor may be determined as appropriate and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.1 ⁇ mol / L to 20 ⁇ mol / L, preferably 0.5 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L.
  • TGF- ⁇ inhibitors There are three types of TGF- ⁇ (transforming growth factor- ⁇ , transforming growth factor ⁇ ): TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, and TGF- ⁇ 3. It is produced from cells. TGF- ⁇ is involved in various cell functions such as cell growth, transformation, differentiation, development, and control of apoptosis, such as inhibiting the growth of many cells including epithelial cells.
  • TGF- ⁇ inhibitor refers to a culture condition capable of inhibiting TGF- ⁇ , and the means thereof is not particularly limited, and any means capable of inhibiting TGF- ⁇ . Means can be used.
  • a substance that directly acts on TGF- ⁇ and inhibits its function for example, an anti-TGF- ⁇ antibody or other drug
  • a drug that suppresses the production of TGF- ⁇ itself, or the like can be used.
  • TGF- ⁇ can also be inhibited by inhibiting signal transduction involving TGF- ⁇ upstream thereof.
  • TGF- ⁇ inhibitor for example, the following compounds can be used.
  • SB431542 or lepsox can be used.
  • LY364947 (CAS No .: 396129-53-6) SB525334 (CAS No .: 356559-20-1) SD208 (CAS No .: 627536-09-8) Galunisertib (LY2157299) (CAS No .: 7000874-72-2) LY2109761 (CAS No .: 7000877-11-1) SB505124 (CAS No .: 694433-59-5) GW788388 (CAS No .: 452342-67-5) EW-7197 (CAS No.:1352608-82-2)
  • the concentration of the TGF- ⁇ inhibitor may be determined as appropriate and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.1 ⁇ mol / L to 30 ⁇ mol / L, preferably 0.5 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L. .
  • BMP Inhibitor BMP (Bone Morphogenic Protein) is a growth factor belonging to the TGF- ⁇ superfamily and regulates embryonic and tissue development, cell differentiation, cell death, etc. . BMP binds to type I and type II receptors on the cell membrane to form a heterotetramer, and transmits a BMP signal into the nucleus via phosphorylation of the transcription factor SMAD. Many BMP inhibitors inhibit phosphorylation of SMAD by ALK (Activin receptor-like kinase) -2, 3, 6 which is a type I receptor activated by binding of BMP.
  • ALK Activin receptor-like kinase
  • BMP inhibitor refers to a culture condition capable of inhibiting the BMP signaling pathway, and the means thereof is not particularly limited, and any means capable of inhibiting the BMP signaling pathway. Means can be used.
  • substances that directly act on BMP and BMP receptors to inhibit their functions for example, anti-BMP antibodies and other drugs
  • drugs that suppress their expression and the like can be used.
  • the BMP signaling pathway can also be inhibited by inhibiting the expression of SMAD transcription factors located downstream of signaling involving BMP and its post-translational modification.
  • the BMP inhibitor for example, the following compounds can be used.
  • LDN193189 can be used.
  • the concentration of the BMP inhibitor may be determined as appropriate and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.1 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L, preferably 0.5 ⁇ mol / L to 5 ⁇ mol / L.
  • p53 inhibitor p53 is one of the most important tumor suppressor genes and suppresses cell proliferation and plays an important role in suppressing cancer. In addition, it activates target genes in response to various stresses, and serves as a starting point for cell cycle arrest, apoptosis, DNA repair, cell aging, and the like.
  • “In the presence of a p53 inhibitor” refers to a culture condition capable of inhibiting p53, and the means thereof is not particularly limited, and any means capable of inhibiting p53 may be used. it can.
  • a substance that directly acts on p53 and inhibits its function for example, anti-p53 antibody, other drugs
  • a drug that suppresses the production of p53 itself, and the like can be used. It is also possible to inhibit p53 by inhibiting signal transduction involving p53 upstream thereof.
  • the following compounds can be used.
  • Pifisulin or Pifislin- ⁇ can be used.
  • Pifisulin- ⁇ (CAS No .: 51296-88-1) Pifisulin- ⁇ (CAS No .: 64984-31-2) NSC66811 (CAS No .: 6964-62-1) Nultin-3 (CAS No .: 548472-68-0)
  • the concentration of the p53 inhibitor may be determined as appropriate and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.5 ⁇ mol / L to 30 ⁇ mol / L, preferably 1 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L.
  • cAMP inducer cAMP (cyclic adenosine monophosphate) is a substance involved in various intracellular signal transduction as a second messenger. cAMP is produced in cells by adenosine triphosphate (ATP) being cyclized by adenylate cyclase.
  • ATP adenosine triphosphate
  • “In the presence of a cAMP inducer” refers to a culture condition capable of inducing cAMP, and the means thereof is not particularly limited. For example, any means capable of increasing intracellular cAMP concentration. Can be used. Substances that can be induced by acting directly on adenylate cyclase, an enzyme involved in cAMP production, substances that can promote the expression of adenylate cyclase, substances that inhibit phosphodiesterase, an enzyme that degrades cAMP, etc. Can be used as a means of increasing intracellular cAMP concentration. Dibutyryl cAMP (dibutylyl cAMP), which is a structural analog of cAMP having the same action as cAMP in cells, can also be used.
  • dibutyryl cAMP dibutylyl cAMP
  • examples of cAMP inducers include, for example, forskolin (CAS No .: 66575-29-9) and forskolin derivatives (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-2002). 348243) and the following compounds.
  • forskolin can be used.
  • Isoproterenol (CAS No .: 7683-59-2) NKH477 (CAS No.:138605-00-2) PACAP1-27 (CAS No .: 127317-03-7) PACAP1-38 (CAS No .: 137061-48-4)
  • the concentration of the cAMP inducer may be appropriately determined and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.2 ⁇ mol / L to 50 ⁇ mol / L, preferably 1 ⁇ mol / L to 30 ⁇ mol / L.
  • PI3K Phosphoinoside 3-kinase
  • PI3K Phosphoinoside 3-kinase
  • LY294002 is an inhibitor selective for PI3K and inhibits activation of the PDK1 / AKT signaling pathway by suppressing the production of phosphoinositide.
  • PI3K inhibitor refers to a culture condition capable of inhibiting PI3K, and the means thereof is not particularly limited, and any means capable of inhibiting PI3K may be used. it can.
  • a substance that directly acts on PI3K and inhibits its function for example, anti-PI3K antibody, other drugs
  • PI3K can also be inhibited by inhibiting signal transduction involving PI3K upstream thereof.
  • PI3K inhibitor for example, the following compounds can be used.
  • LY294002 can be used.
  • Bupalisib (CAS No .: 944396-07-0) TGR-1202 (CAS No .: 15325533-67-7) PI-103 (CAS No .: 371935-74-9) IC-87114 (CAS No .: 371242-69-2) Wortmannin (CAS No .: 19545-26-7) ZSTK474 (CAS No .: 475110-96-4) AS-605240 (CAS No .: 648450-29-7) PIK-90 (CAS No .: 677338-12-4) AZD6482 (CAS No .: 1173900-33-8) Duvelisib (CAS No .: 1201438-56-3) TG100-115 (CAS No .: 677297-51-7) CH5132799 (CAS No .: 1007207-67-1) CAY10505 (CAS No .: 1218777-13-9) PIK-293 (CAS No .: 900185-1-01-5) CZC24832 (CAS No .
  • the concentration of the PI3K inhibitor may be determined as appropriate and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.1 ⁇ mol / L to 20 ⁇ mol / L, preferably 0.5 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L.
  • Notch is a single-transmembrane receptor that is cleaved by ⁇ -secretase and translocates the intracellular region to the nucleus and functions as a transcription factor.
  • DAPT is an inhibitor of ⁇ -secretase, and functions as an inhibitor of Notch signal by inhibiting Notch cleavage.
  • “In the presence of a Notch inhibitor” means a culture condition capable of inhibiting Notch, and the means thereof is not particularly limited, and any means capable of inhibiting Notch can be used. it can.
  • a substance that directly acts on Notch and inhibits its function for example, an anti-Notch antibody, other drugs
  • Notch can also be inhibited by inhibiting signal transduction involving Notch.
  • a Notch inhibitor for example, the following compounds can be used.
  • DAPT can be used.
  • RO4929097 (CAS No .: 847925-91-1) FLI-06 (CAS No .: 313967-18-9) Semagasstat (CAS No .: 425386-60-3) Divenzazepine (CAS No .: 209984-56-5) PF-03084014 (CAS No .: 1290543-63-3) IMR-1 (CAS No .: 310456-65-6)
  • the concentration of the Notch inhibitor may be determined appropriately and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.2 ⁇ mol / L to 30 ⁇ mol / L, preferably 1 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L.
  • RAR retinoic acid receptor, retinoic acid receptor
  • RAR belongs to the nuclear receptor superfamily, and its transcriptional activity is activated with retinoic acid as a ligand. Since RAR has various functions in vivo, and is particularly closely related to cell differentiation, many artificial synthetic agonists have been developed.
  • “In the presence of a RAR agonist” means that the culture conditions are such that RAR can be activated, and the means thereof is not particularly limited, and any means that can activate RAR can be used. .
  • a substance that directly acts on RAR to activate its function a drug that promotes the expression of RAR itself, and the like can be used.
  • the function of RAR can also be controlled by regulating transcription factors or transcription coupling factors that interact with RAR, and their expression and post-translational modifications.
  • RAR agonist for example, the following compounds can be used.
  • retinoic acid, CH55, AM580 can be used.
  • Retinoic acid (CAS No .: 302-79-4) CH55 (CAS No .: 110368-33-7) AM580 (CAS No .: 102121-60-8) Tretinoin (CAS No .: 302-79-4)
  • Adapalene (CAS No .: 1066885-40-9) Bexarotene (CAS No .: 153559-49-0) Tazarotene (CAS No .: 118292-40-3) Tamibarotene (CAS No .: 94497-51-5)
  • the concentration of the RAR agonist may be appropriately determined, and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.05 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L, preferably 0.5 ⁇ mol / L to 5 ⁇ mol / L.
  • the somatic cell culture in the production method of the present invention is carried out by selecting the medium, temperature, and other conditions according to the type of somatic cell to be used, and various inhibitors described above (and possibly inducers). Or in the presence of an activator).
  • the medium can be selected from a known medium or a commercially available medium.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • DMEM / F12 or a medium in which these are modified are added to a common medium (serum, protein, amino acid, sugar, vitamins, Fatty acids, antibiotics, etc.) can be added and used.
  • culture conditions general cell culture conditions may be selected.
  • the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 are exemplified.
  • it is preferable to change the medium at an appropriate interval preferably once every 1 to 7 days, more preferably once every 3 to 4 days.
  • insulin-producing cells appear in 8 to 10 days to 3 weeks at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Cell culture containers such as plates, dishes, cell culture flasks, and cell culture bags can be used for somatic cell culture.
  • a cell culture bag a gas permeable bag is suitable.
  • a large culture tank may be used. Culturing can be carried out in either an open system or a closed system. However, when the obtained insulin-producing cells are to be administered to humans, it is preferable to carry out the culture in a closed system.
  • insulin-producing cells can be produced from somatic cells by one-stage culture by culturing somatic cells in a medium containing the various inhibitors described above.
  • Insulin-producing cells According to the above-mentioned production method of the present invention, a cell population containing insulin-producing cells can be obtained. Insulin producing cells produced by the production method of the present invention are also within the scope of the present invention. Insulin-producing cells produced by the production method of the present invention may be progenitor cells that are destined to differentiate into hepatocytes, as well as terminally differentiated cells. The insulin-producing cells produced by the production method of the present invention are so-called low-molecular-weight compound-induced insulin-producing cells (ciIPCs) that are directly induced from somatic cells by low-molecular compounds, and are induced to differentiate from ES cells or iPS cells. Differentiated from insulin producing cells.
  • ciIPCs low-molecular-weight compound-induced insulin-producing cells
  • Insulin-producing cells produced by the method of the present invention are detected, confirmed and separated using, for example, morphological changes of cells, characteristic properties of insulin-producing cells and specific markers (eg, anti-insulin antibodies). be able to.
  • quarantine methods detection by antibodies
  • protein molecules may be detected by quantifying their mRNA amounts.
  • An antibody that recognizes a specific marker of insulin-producing cells is also useful for isolating and purifying insulin-producing cells obtained by the method of the present invention.
  • the insulin-producing cells produced by the production method of the present invention can be used, for example, for tissue repair or improvement of blood insulin concentration.
  • a pharmaceutical composition for tissue repair or the like can be produced.
  • pancreatic transplantation or pancreatic islet transplantation has become a radical treatment for alleviation and cure of the symptoms.
  • transplantation of pancreatic ⁇ cells secreting insulin can be an effective treatment.
  • methods for producing insulin-producing cells and methods for transplanting insulin-producing cells have been developed.
  • insulin-producing cells are expected to be used for treatment of severe pancreatic diseases (diabetes, etc.) by transplanting under the renal capsule or transplanting to the liver via the portal vein.
  • the insulin-producing cells produced by the method of the present invention are used as a pharmaceutical composition
  • the insulin-producing cells are suitable for administration to an individual by mixing the insulin-producing cells with a pharmaceutically acceptable carrier by a conventional method.
  • the preparation may be in the form.
  • the carrier include physiological saline, distilled water for injection made isotonic by adding glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • storage You may mix
  • the insulin-producing cells produced by the production method of the present invention can also be made into a composition combined with other cells and components effective for exerting the function of the insulin-producing cells and improving the engraftment.
  • the insulin-producing cells produced by the method of the present invention can also be used for screening for drug candidate compounds that act on insulin-producing cells and for evaluating the safety of drug candidate compounds.
  • Insulin producing cells are an important tool for assessing the toxicity of drug candidate compounds. According to the production method of the present invention, since many insulin-producing cells can be obtained by a single operation, it becomes possible to obtain reproducible research results without being affected by the difference in cell lots.
  • composition of the present invention is a composition for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells, and comprises a GSK3 inhibitor, It includes 6 or all selected from the group consisting of TGF- ⁇ inhibitors, BMP inhibitors, p53 inhibitors, PI3K inhibitors, Notch inhibitors, and RAR agonists, and cAMP inducers.
  • the composition of the present invention comprises a GSK3 inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor, a p53 inhibitor, a Notch inhibitor, a RAR agonist, a PI3K inhibitor, and a cAMP inducer.
  • a cAMP inducer or a PI3K inhibitor it is particularly preferable to include a cAMP inducer or a PI3K inhibitor.
  • the present invention also provides a composition for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells, including a GSK3 inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor, a PI3K inhibitor, a Notch inhibitor, and cAMP induction.
  • a composition for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells including a GSK3 inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor, a PI3K inhibitor, a Notch inhibitor, and cAMP induction.
  • the composition for manufacturing an insulin producing cell from a somatic cell characterized by including an agent can also be mentioned.
  • this composition is also referred to as the composition of the present invention.
  • composition of the present invention only needs to contain at least one of the above combinations, and can optionally further contain other inhibitors, inducers, and the like as necessary.
  • Each of the inhibitors and inducers may be used alone or in combination of two or more.
  • Specific examples of the inhibitor may have two or more types of inhibitory action. In that case, it can be considered that one inhibitor contains a plurality of inhibitors.
  • Specific examples and preferred examples of the above-mentioned inhibitors and inducers are as defined above.
  • composition of the present invention can be used as a composition for producing insulin-producing cells from somatic cells.
  • composition of the present invention can also be used as a medium for producing insulin-producing cells from somatic cells.
  • a basal medium produced by mixing components necessary for cell culture, and GSK3 inhibitor, TGF- ⁇ inhibitor, BMP inhibitor as active ingredients 6 or all selected from the group consisting of p53 inhibitor, PI3K inhibitor, Notch inhibitor, and RAR agonist, and a medium containing a cAMP inducer.
  • the active ingredient may be contained at a concentration effective for the production of insulin-producing cells, and the concentration can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the basal medium can be selected from a known medium or a commercially available medium. For example, MEM (minimum essential medium), DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium), DMEM / F12, RPMI1640, or a medium obtained by modifying these can be used as a basal medium.
  • the medium may be further added with known medium components described above in the present specification, such as serum, protein (albumin, transferrin, growth factor, etc.), amino acids, saccharides, vitamins, fatty acids, antibiotics, etc. Good.
  • a substance effective for inducing differentiation into insulin-producing cells as described above in the present specification may be added to the medium.
  • the present invention for example, six or all selected from the group consisting of GSK3 inhibitor, TGF- ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, p53 inhibitor, PI3K inhibitor, Notch inhibitor, and RAR agonist, and Insulin producing cells can also be produced from somatic cells in vivo by administering a cAMP inducer to the living body. That is, according to the present invention, for example, six or all selected from the group consisting of GSK3 inhibitor, TGF- ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, p53 inhibitor, PI3K inhibitor, Notch inhibitor, and RAR agonist And a method for producing insulin-producing cells from somatic cells in vivo, comprising administering a cAMP inducer to the living body.
  • Preferred combinations of the inhibitor and the like to be administered to a living body are as described in this specification.
  • the living body include humans, mammals other than humans, and animals other than mammals (birds, reptiles, amphibians, fish, etc.), and humans are particularly preferable.
  • 6 or all selected from the group consisting of GSK3 inhibitor, TGF- ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, p53 inhibitor, PI3K inhibitor, Notch inhibitor, and RAR agonist, and cAMP inducer in vivo Insulin-producing cells can be produced from somatic cells at the specific site.
  • Example Production of insulin-producing cells ⁇ Direct induction from human fibroblasts to insulin-producing cells> (1) Human fibroblasts Human fibroblasts as materials were purchased from DS Pharma Biomedical Co., Ltd. It is a fibroblast derived from 38-year-old human skin.
  • the human fibroblast dish medium described above was prepared using 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone), ITS-X (Cat #: 51500056, Gibco), non-essential amino acids (NEAA: Non-essential amino acids).
  • Glutamine manufactured by Gibco; final concentration 2 mmol / L
  • nicotinamide manufactured by Sigma-Aldrich; final concentration 10 mmol / L
  • Exendin-4 Cat #: av120214, manufactured by Abcam; final concentration 100 ng / mL), 100 U / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin, and DMEM / F12 (manufactured by Gibco) supplemented with the following low molecular weight compounds were exchanged. Thereafter, while the medium was exchanged to media of the same composition every 3 days, 37 ° C., and cultured under 5% CO 2.
  • Results Table 1 shows the results of the culture according to (2) above. In the table, “+” indicates that the compound is present in the medium, and “ ⁇ ” indicates that the compound is not present in the medium.
  • FIG. 1 After adding and culturing with the low molecular weight compound group, cells with a more spherical and smaller size that clearly differed from the fibroblasts appeared. As shown in FIG. 2, a certain number of these cells showed Insulin staining, and a stronger staining was observed in the cytoplasm rather than in the cell nucleus stained with DAPI. These cells did not show clear autofluorescence overlapping with green Insulin staining. As is apparent from Table 1, FIG. 3, and FIG. 4, it was found that forskolin (a cAMP inducer) or LY294002 (a PI3K inhibitor) is particularly important for the conversion into cells expressing Insulin. As shown in FIG. 5, both the secreted amount of Insulin in the supernatant and the residual amount of intracellular Insulin after the measurement increased in the cells to which the compound was added.
  • forskolin a cAMP inducer
  • LY294002 a PI3K inhibitor
  • Test Example The following low molecular weight compound combinations were added in the same manner as in the above Examples, and cell culture was performed.
  • the left figure shows the result using a 0-year-old fibroblast
  • the middle figure shows the result using a 38-year-old fibroblast
  • the right figure shows the result using a 49-year-old fibroblast.
  • “no compound” indicates a result when none of the following low molecular compounds are added
  • “5C” indicates a result when all of the following low molecular compounds are added.
  • Error bars represent standard deviation
  • asterisks represent significant differences (* P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01) by Student's t test.
  • the secreted amount of Insulin in the supernatant of any fibroblast increased in the cells to which the low molecular compound group (5C) was added.

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Abstract

本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、体細胞からインスリン産生細胞を製造する方法などを提供することを主な課題とする。　本発明として、例えば、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される６種又は全部、並びにｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の製造方法などを挙げることができる。　本発明により得られたインスリン産生細胞は、再生医療などにおいて有用である。

Description

インスリン産生細胞の製造方法
（関連出願の相互参照）
　この出願は、２０１８年１月３０日に出願された日本国出願番号第２０１８－１３３０３号を基礎とする優先権を主張し、その開示内容は全て本明細書の一部に組み込まれる。
　本発明は、再生医療、ないし体細胞からのダイレクトリプログラミング（Ｄｉｒｅｃｔ　Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）の技術分野に属する。本発明は、その技術分野において、低分子化合物により体細胞からインスリン産生細胞を直接製造する方法、及びかかる製造方法によって製造される低分子化合物誘導性インスリン産生細胞（ｃｉＩＰＣｓ：ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ）に関するものである。本発明はさらに、当該インスリン産生細胞、及び当該インスリン産生細胞を製造する方法のために使用することができる組成物に関するものである。
　近年の細胞関連研究の発展、特に多能性細胞に関する研究の発展により、治療用細胞を個体への移植に利用可能な品質及び量において入手することが可能になりつつある。幾つかの疾患については、治療に有効な細胞を患者に移植する試みが開始されている。
　間葉系の細胞は、筋肉、骨、軟骨、骨髄、脂肪及び結合組織等の生体の各種器官を形成しており、再生医療の材料として有望である。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪組織、血液、胎盤及び臍帯等の組織に存在する未分化細胞である。間葉系に属す細胞への分化能を有しているため、間葉系幹細胞は、それらの細胞を製造する際の出発材料として注目されている。また、間葉系幹細胞自体を骨、軟骨、心筋等の再構築に利用する再生医療も検討されている。
　一方、線維芽細胞のような体細胞を直接他の細胞に転換する方法も報告されている。例えば、線維芽細胞を化学物質と共に培養することにより神経細胞を得ることが知られている（非特許文献１）。
　インスリンを分泌する膵臓β細胞については、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞からヒト膵β細胞への分化誘導が報告されていることに加えて、膵α細胞、膵腺房細胞、膵管腺細胞、小腸腺窩細胞、肝細胞、胆管細胞といった内胚葉系細胞から膵β細胞特異的転写因子であるＰｄｘ１、Ｎｇｎ３、及びＭａｆＡを用いて膵β細胞へ直接誘導したことが報告されている（非特許文献２）。また、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）やヒト皮膚線維芽細胞から山中４因子などを用いて膵β細胞へ直接誘導したことが報告されている（非特許文献３、４）。更にはマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）から低分子化合物により内胚葉前駆細胞を作製し、当該細胞から膵臓内分泌細胞へ分化させたことが報告されている（非特許文献５）。
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１５年，５６巻，３号，１６６－１７０頁 Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１６年，３巻，５７－６５頁 Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２０１４年，１４巻，２２８－２３６頁 Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１６年，７巻，１００８０頁 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１７年，２９２巻，１９１２２－１９１３２頁
　非特許文献１に記載されている方法のように、遺伝子導入を行うことなく体細胞から所望の細胞への転換を直接行う方法は、治療用細胞を取得する手段として有効な選択肢となる場合がある。膵臓β細胞についても、上記の通り、体細胞から直接転換する方法は報告されているが、これらの発明は、発生学的に系統の近い内胚葉系の細胞へ特定の遺伝子を導入することで誘導されている。
　本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、低分子化合物の組み合わせにより体細胞からインスリン産生細胞を直接誘導する方法、即ち、一定の低分子化合物の組成物により体細胞からインスリン産生細胞を直接製造することができる新たな製造方法を提供することを主な課題とする。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、一定の低分子阻害剤等の存在下で体細胞を培養することによって、体細胞をインスリン産生細胞に直接転換できることを見出し、本発明を完成するに到った。
　本発明として、例えば、下記のものを挙げることができる。
［１］体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される６種又は全部、並びにｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
［２］前記工程が、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される５種又は全部、並びにＰＩ３Ｋ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
［３］前記工程が、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＲＡＲアゴニスト、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
［４］ＢＭＰ阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である、上記［１］又は［２］に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
［５］ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＴＧＦ－β阻害剤がＳＢ４３１５４２、ｐ５３阻害剤がピフィスリン、ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴ、ＲＡＲアゴニストがレチノイン酸、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
［６］体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
［７］ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＴＧＦ－β阻害剤がＳＢ４３１５４２、ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴ、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、上記［６］に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
［８］前記体細胞が線維芽細胞である、上記［１］～［７］のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
［９］上記［１］～［８］のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法から製造される、インスリン産生細胞。
［１０］体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される６種又は全部、並びにｃＡＭＰ誘導剤を含むことを特徴とする、体細胞からインスリン産生細胞を製造するための組成物。
［１１］ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される５種又は全部、並びにＰＩ３Ｋ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤を含む、上記［１０］に記載の組成物。
［１２］ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＲＡＲアゴニスト、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を含む、上記［１０］に記載の組成物。
［１３］ＢＭＰ阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である、上記［１０］又は［１１］に記載の組成物。
［１４］ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＴＧＦ－β阻害剤がＳＢ４３１５４２、ｐ５３阻害剤がピフィスリン、ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴ、ＲＡＲアゴニストがレチノイン酸、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、上記［１０］～［１２］のいずれか一項に記載の組成物。
［１５］体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を含むことを特徴とする、体細胞からインスリン産生細胞を製造するための組成物。
［１６］ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＴＧＦ－β阻害剤がＳＢ４３１５４２、ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴ、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、上記［１５］に記載の組成物。
［１７］前記体細胞が線維芽細胞である、上記［１０］～［１６］のいずれか一項に記載の組成物。
　本発明によれば、遺伝子導入を行うことなく、体細胞からインスリン産生細胞を製造することができる。本発明により得られたインスリン産生細胞は、再生医療などにおいて有用である。
細胞の培養写真である。左側の５写真は、実施例４の組み合わせ化合物を添加した場合の結果を、右側の５写真は、当該化合物を添加しなかった場合の結果を、それぞれ表す。Ｄａｙ３、６、１０、１２、及び１７は、それぞれ当該化合物を添加して培養後３日目、６日目、１０日目、１２日目、及び１７日目を示す。 当該化合物を添加して培養後１７日目における細胞の培養写真（Ｐｈａｓｅ　ｃｏｎｔｒａｓｔ）及びその免疫染色写真である。左側の４写真は、実施例４の組み合わせ化合物を添加した場合の結果を、右側の４写真は、当該化合物を添加しなかった場合の結果を、それぞれ表す。 当該化合物を添加して培養後１９日目における細胞の培養写真（Ｐｈａｓｅ　ｃｏｎｔｒａｓｔ）及びその免疫染色写真である。 当該化合物を添加して培養後１９日目における細胞の培養写真（Ｐｈａｓｅ　ｃｏｎｔｒａｓｔ）及びその免疫染色写真である。 左側が上清へのインスリン分泌量を、右側が細胞内に残存するインスリン分泌量を、それぞれ表す。各図において、縦軸は総タンパク質１ｍｇ当たりの分泌量（μＵ／ｍｇ）を示す。各図において、右カラムが低分子化合物を添加した場合の結果を、左カラムが当該低分子化合物を添加しなかった場合の結果を、それぞれ示す。 各図において、縦軸は１０５個の細胞当たりの分泌量（μＵ／１０５ cells）を示す。各図において、右カラムが当該低分子化合物を添加した場合の結果を、左カラムが当該低分子化合物を添加しなかった場合の結果を、それぞれ示す。
　以下、本発明について詳細に説明する。
１　インスリン産生細胞の製造方法
　本発明に係る、インスリン産生細胞の製造方法（以下、「本発明製法」という。）は、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される６種又は全部、並びにｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。
　好ましくは、上記工程が、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される５種又は全部、並びにＰＩ３Ｋ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である本発明製法である。より好ましくは、上記工程が、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＲＡＲアゴニスト、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である本発明製法である。本発明製法においては、特にｃＡＭＰ誘導剤又はそれとＰＩ３Ｋ阻害剤との存在下で体細胞を培養することが好ましい。
　また、本発明として、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法も挙げることができる。以下、かかる製造方法も含めて本発明製法という。
　本発明製法においては、少なくとも上記いずれかの組み合わせの存在下で体細胞を培養すればよく、必要に応じて、任意にさらに他の阻害剤や誘導剤等を存在させて体細胞を培養しインスリン産生細胞を製造することができる。
　上記阻害剤や誘導剤は、それぞれにおいて、１種を用いても２種以上を併用してもよい。
　具体的な上記阻害剤等においては、２種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等が存在しているとみなすことができる。
１．１　体細胞について
　生物の細胞は、体細胞と生殖細胞とに分類できる。本発明製法には、その出発材料として任意の体細胞を使用することができる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、又は株化された細胞の何れでもよい。本発明製法では、分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞（例、線維芽細胞、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、肝細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）、胆管細胞（Ｂｉｌｉａｒｙ　ｃｅｌｌｓ）、膵α細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　α　ｃｅｌｌｓ）、膵腺房細胞（Acinar cells）、膵管腺細胞（Ductal cells）、小腸腺窩細胞（Intestinal crypt cells）など）、最終分化への途上にある体細胞（例、間葉系幹細胞、神経幹細胞、内胚葉前駆細胞など）、又は初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明製法に使用できる体細胞としては、任意の体細胞、例えば、造血系の細胞（各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等）、臓器由来の細胞（肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等）、筋組織系の細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等）、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞（褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞等）等が挙げられる。また、これらの細胞の前駆細胞、癌細胞にも本発明製法を適用できる。好ましくは、線維芽細胞又は間葉系幹細胞を使用することができる。
　上記の体細胞の供給源としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、これらに限定されるものではない。体細胞の供給源としては、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい。ヒトへの投与を目的として本発明製法によりインスリン産生細胞を製造する場合、好ましくは、レシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された体細胞を使用することができる。レシピエント自身より採取された体細胞をインスリン産生細胞の製造に供してもよい。
１．２　本発明に係る阻害剤等について
１．２．１　ＧＳＫ３阻害剤
　ＧＳＫ３（ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ－３、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３）は、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして見いだされた。哺乳類では、ＧＳＫ３は５１ｋＤａのα（ＧＳＫ３α）と４７ｋＤａのβ（ＧＳＫ３β）の二つのアイソフォームに分類される。ＧＳＫ３は種々のタンパク質をリン酸化する活性を有しており、グリコーゲン代謝のみならず、細胞分裂、細胞増殖等の生理現象にも関わっている。
　「ＧＳＫ３阻害剤の存在下」とは、ＧＳＫ３を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＧＳＫ３の活性を阻害する物質、例えば、抗ＧＳＫ３抗体やＧＳＫ３阻害剤のようなＧＳＫ３シグナル阻害手段を利用することができる。また、ＧＳＫ３は自身の特定の部位がリン酸化されると活性を失うことから、上記のリン酸化を促進する手段も、ＧＳＫ３シグナルの阻害に利用することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＧＳＫ３阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１を使用することができる。
ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５２９１７－０６－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６７４６３－６２－９）
Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１４２２７３－２０－９）
Ａ１０７０７２２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３８４４２４－８０－９）
ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２８０７４４－０９－４）
ＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５５６８１３－３９－９）
ＴＷＳ１１９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０１５１４－１９－６）
Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６５８５４－０５－３）
ＳＢ４１５２８６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２６４２１８－２３－７）
Ｂｉｋｉｎｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１８８０１１－６９－０）
ＩＭ－１２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１２９６６９－０５－１）
１－Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６７６５９６－６５－９）
ＬＹ２０９０３１４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０３２８８－２２－８）
ＡＺＤ１０８０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６１２４８７－７２－６）
ＡＺＤ２８５８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４８６４２４－２０－８）
ＡＲ－Ａ０１４４１８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４８７０２１－５２－３）
ＴＤＺＤ－８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３２７０３６－８９－５）
Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４７９－４１－４）
　ＧＳＫ３阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～２０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．２　ＴＧＦ－β阻害剤
　ＴＧＦ－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β、形質転換増殖因子β）には、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３の３種類が存在し、ほぼ全ての細胞から生産されている。ＴＧＦ－βは、上皮細胞をはじめ、多くの細胞の増殖を抑制するなど細胞増殖、形質転換、分化、発生、アポトーシスの制御等の多種多様な細胞機能に関与している。
　「ＴＧＦ－β阻害剤の存在下」とは、ＴＧＦ－βを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＴＧＦ－βを阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＴＧＦ－βに直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＴＧＦ－β抗体やその他の薬剤）、ＴＧＦ－β自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＴＧＦ－βが関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＴＧＦ－βを阻害することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＴＧＦ－β阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＳＢ４３１５４２やレプソックスを使用することができる。
ＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０１８３６－４１－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Ａ８３－０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９０９９１０－４３－６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
レプソックス（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４４６８５９－３３－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９６１２９－５３－６）
ＳＢ５２５３３４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３５６５５９－２０－１）
ＳＤ２０８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６２７５３６－０９－８）
Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７００８７４－７２－２）
ＬＹ２１０９７６１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７００８７４－７１－１）
ＳＢ５０５１２４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６９４４３３－５９－５）
ＧＷ７８８３８８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４５２３４２－６７－５）
ＥＷ－７１９７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３５２６０８－８２－２）
　ＴＧＦ－β阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．３　ＢＭＰ阻害剤
　ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、骨形成タンパク質）は、ＴＧＦ-βスーパーファミリーに属する成長因子であり、胚や組織の発生、細胞の分化、細胞死などを制御している。ＢＭＰは細胞膜上のＩ型受容体とＩＩ型受容体に結合してヘテロ四量体を形成し、転写因子ＳＭＡＤのリン酸化を経て核内にＢＭＰシグナルを伝達する。ＢＭＰ阻害剤の多くは、ＢＭＰの結合によって活性化されたＩ型受容体であるＡＬＫ（Ａｃｔｉｖｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ-ｌｉｋｅ　ｋｉｎａｓｅ）-２，３，６によるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する。
　「ＢＭＰ阻害剤の存在下」とは、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＢＭＰおよびＢＭＰ受容体に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＢＭＰ抗体、その他の薬剤）、あるいはこれらの発現を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＢＭＰが関わるシグナル伝達の下流に位置するＳＭＡＤ転写因子の発現およびその翻訳後修飾を阻害することによってもＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＢＭＰ阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＬＤＮ１９３１８９を使用することができる。
ＬＤＮ１９３１８９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６２３６８－２４－４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
ＤＭＨ１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２０６７１１－１６－１）
Ｋ０２２８８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１４３１９８５－９２－０）
ＬＤＮ２１２８５４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１４３２５９７－２６－６）
ＬＤＮ１９３１８９　ＨＣｌ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６２３６８－６２－０）
ＭＬ３４７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６２３６８－４９－３）
ＬＤＮ２１４１１７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６２７５０３－６７－６）
　ＢＭＰ阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．４　ｐ５３阻害剤
　ｐ５３は最も重要な癌抑制遺伝子の一つであり、細胞増殖を抑制し、がんの抑制に重要な役割を担っている。また種々のストレスに応答して標的遺伝子を活性化し、細胞周期の停止、アポトーシス、ＤＮＡ修復、細胞老化などに対する起点となっている。
　「ｐ５３阻害剤の存在下」とは、ｐ５３を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ｐ５３を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ｐ５３に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ｐ５３抗体、その他の薬剤）、ｐ５３自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ｐ５３が関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもｐ５３を阻害することができる。
　本発明では特に限定されないが、ｐ５３阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ピフィスリンないしピフィスリン－αを使用することができる。
ピフィスリン－α（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６３２０８－８２－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
ピフィスリン－β（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５１１２９６－８８－１）
ピフィスリン－μ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６４９８４－３１－２）
ＮＳＣ６６８１１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６９６４－６２－１）
Ｎｕｌｔｉｎ－３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５４８４７２－６８－０）
　ｐ５３阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．５μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．５　ｃＡＭＰ誘導剤
　ｃＡＭＰ（環状アデノシン１リン酸）は、セカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。ｃＡＭＰは、細胞内ではアデニル酸シクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ）によりアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）が環状化されることで生成する。
　「ｃＡＭＰ誘導剤の存在下」とは、ｃＡＭＰを誘導することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させることができる任意の手段を利用することができる。ｃＡＭＰの生成に関わる酵素であるアデニル酸シクラーゼに直接作用して誘導することができる物質、アデニル酸シクラーゼの発現を促進しうる物質の他、ｃＡＭＰを分解する酵素であるホスホジエステラーゼを阻害する物質等を、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる手段として使用することができる。細胞内でｃＡＭＰと同じ作用を持つ、ｃＡＭＰの構造類似体であるジブチリルｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ　ｃＡＭＰ）を使用することもできる。
　本発明では特に限定されないが、ｃＡＭＰ誘導剤（アデニル酸シクラーゼ活性化剤）としては、例えば、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ：ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６５７５－２９－９）、及びフォルスコリン誘導体（例えば特開２００２－３４８２４３号公報）や以下の化合物などが挙げられる。好ましくは、フォルスコリンを使用することができる。
フォルスコリン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６４２８－８９－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
イソプロテレノール（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７６８３－５９－２）
ＮＫＨ４７７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３８６０５－００－２）
ＰＡＣＡＰ１－２７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２７３１７－０３－７）
ＰＡＣＡＰ１－３８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３７０６１－４８－４）
　ｃＡＭＰ誘導剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．２μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．６　ＰＩ３Ｋ阻害剤
　ＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ　３－ｋｉｎａｓｅ）は、イノシトールリン脂質をリン酸化する酵素であり、産生されるホスホイノシチドはＰＤＫ１を活性化する。ＰＤＫ１はさらにＡＫＴをリン酸化し、ＰＤＫ１／ＡＫＴシグナル経路が活性化される。ＬＹ２９４００２は、ＰＩ３Ｋに選択的な阻害剤であり、ホスホイノシチドの産生を抑えることでＰＤＫ１／ＡＫＴシグナル経路の活性化を阻害する。
　「ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下」とは、ＰＩ３Ｋを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＰＩ３Ｋを阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＰＩ３Ｋに直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＰＩ３Ｋ抗体、その他の薬剤）、ＰＩ３Ｋ自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＰＩ３Ｋが関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＰＩ３Ｋを阻害することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＰＩ３Ｋ阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＬＹ２９４００２を使用することができる。
ＬＹ２９４００２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１５４４４７－３６－６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Ｂｕｐａｒｌｉｓｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９４４３９６－０７－０）
ＴＧＲ－１２０２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１５３２５３３－６７－７）
ＰＩ－１０３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３７１９３５－７４－９）
ＩＣ－８７１１４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３７１２４２－６９－２）
Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１９５４５－２６－７）
ＺＳＴＫ４７４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４７５１１０－９６－４）
ＡＳ－６０５２４０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６４８４５０－２９－７）
ＰＩＫ－９０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６７７３３８－１２－４）
ＡＺＤ６４８２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１７３９００－３３－８）
Ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２０１４３８－５６－３）
ＴＧ１００－１１５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６７７２９７－５１－７）
ＣＨ５１３２７９９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１００７２０７－６７－１）
ＣＡＹ１０５０５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２１８７７７－１３－９）
ＰＩＫ－２９３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９００１８５－０１－５）
ＣＺＣ２４８３２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１５９８２４－６７－５）
Ｐｉｌａｒａｌｉｓｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９３４５２６－８９－３）
ＡＺＤ８８３５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６２０５７６－６４－８）
　ＰＩ３Ｋ阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～２０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．７　Ｎｏｔｃｈ阻害剤
　Ｎｏｔｃｈは、１回膜貫通型の受容体であり、γセクレターゼによって切断され細胞内領域が核に移行し転写因子として機能する。ＤＡＰＴは、γセクレターゼの阻害剤であり、Ｎｏｔｃｈの切断を阻害することで、Ｎｏｔｃｈシグナルの阻害剤として機能する。
　「Ｎｏｔｃｈ阻害剤の存在下」とは、Ｎｏｔｃｈを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、Ｎｏｔｃｈを阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、Ｎｏｔｃｈに直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗Ｎｏｔｃｈ抗体、その他の薬剤）、Ｎｏｔｃｈ自体の発現を抑制する薬剤等を利用することができる。また、Ｎｏｔｃｈが関わるシグナル伝達を阻害することによってもＮｏｔｃｈを阻害することができる。
　本発明では特に限定されないが、Ｎｏｔｃｈ阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＤＡＰＴを使用することができる。
ＤＡＰＴ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２０８２５５－８０－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
ＲＯ４９２９０９７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８４７９２５－９１－１）
ＦＬＩ－０６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３１３９６７－１８－９）
Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４２５３８６－６０－３）
Ｄｉｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２０９９８４－５６－５）
ＰＦ－０３０８４０１４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２９０５４３－６３－３）
ＩＭＲ－１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３１０４５６－６５－６）
　Ｎｏｔｃｈ阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．２μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．８　ＲＡＲアゴニスト
　ＲＡＲ（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、レチノイン酸受容体）は、核内受容体スーパーファミリーに属し、レチノイン酸をリガンドとしその転写活性が活性化される。ＲＡＲは、生体内で様々な機能を有しており、特に細胞の分化に密接に関わっていることから、人工の合成アゴニストが多数開発されている。
　「ＲＡＲアゴニストの存在下」とは、ＲＡＲを作動することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＲＡＲを作動することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＲＡＲに直接作用してその機能を作動する物質、ＲＡＲ自体の発現を促進する薬剤等を利用することができる。また、ＲＡＲと相互作用する転写因子あるいは転写共役因子、またこれらの発現および翻訳後修飾などを調節することによってもＲＡＲの機能を制御することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＲＡＲアゴニストとしては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、レチノイン酸、ＣＨ５５、ＡＭ５８０を使用することができる。
レチノイン酸（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０２－７９－４）
ＣＨ５５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１０３６８－３３－７）
ＡＭ５８０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０２１２１－６０－８）
Ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０２－７９－４）
Ａｄａｐａｌｅｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６６８５－４０－９）
Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１５３５５９－４９－０）
Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１８２９２－４０－３）
Ｔａｍｉｂａｒｏｔｅｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９４４９７－５１－５）
　ＲＡＲアゴニストの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．０５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．３　体細胞の培養
　本発明製法における体細胞の培養は、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種の阻害剤（及び、場合により誘導剤ないし活性化剤）の存在下において実施すればよい。培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地に、適切な成分（血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等）を添加して使用することができる。
　培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ２の条件などが例示される。培養中は適切な間隔（好ましくは１日から７日に１回、より好ましくは３日から４日に１回）で培地を交換することが好ましい。線維芽細胞を材料として本発明製法を実施する場合、３７℃、５％ＣＯ２の条件では８ないし１０日間から３週間でインスリン産生細胞が出現する。使用する体細胞として培養が容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させた体細胞をインスリン産生細胞に転換することも可能である。従って、スケールアップしたインスリン産生細胞の製造も容易である。
　体細胞の培養には、プレート、ディッシュ、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養容器を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができるが、得られたインスリン産生細胞のヒトへの投与等を目的とする場合には、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
　本発明製法においては、上記した各種の阻害剤等を含む培地において体細胞を培養することにより、一段階の培養によって体細胞からインスリン産生細胞を製造することができる。
１．４　インスリン産生細胞
　上記した本発明製法により、インスリン産生細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明製法により製造されるインスリン産生細胞も本発明の範囲内である。本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、最終分化した細胞の他、肝細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。
　本発明製法により製造されるインスリン産生細胞は、低分子化合物により体細胞から直接誘導される、いわゆる低分子化合物誘導性インスリン産生細胞（ｃｉＩＰＣｓ）であって、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から分化誘導されるインスリン産生細胞とは区別される。
　本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、例えば、細胞の形態的変化、インスリン産生細胞の特徴的性質や特異的マーカー（例、抗インスリン抗体）を利用して、検出、確認及び分離を行うことができる。
　特異的マーカーの検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。インスリン産生細胞の特異的マーカーを認識する抗体は、本発明製法により得られたインスリン産生細胞を単離及び精製する上でも有用である。
　本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、例えば、組織修復や血中インスリン濃度の改善等のために使用することができる。本発明製法で製造されるインスリン産生細胞を移植することにより、組織修復等のための医薬用組成物を製造することができる。インスリンがほとんど分泌できない１型糖尿病の患者では、その症状の軽減および根治のためには、膵臓移植あるいは膵島の移植が抜本的な治療法となっている。また、２型糖尿病の患者は国内外で今後さらに増加し、医療費高騰の原因となることが予測されているが、インスリンを分泌する膵β細胞の移植は有効な治療法となり得る。このような糖尿病等の膵臓疾患の治療手段として、インスリン産生細胞の製造方法、及びインスリン産生細胞の移植方法の開発が行なわれている。例えば、インスリン産生細胞を腎皮膜下へ移植を行ったり、門脈を介して肝臓へ移植することで、重度の膵臓疾患（糖尿病等）の治療への利用が期待されている。
　本発明製法で製造されるインスリン産生細胞を医薬用組成物とする場合には、常法により、インスリン産生細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
　本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、さらに、インスリン産生細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。
　さらに、本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、インスリン産生細胞に作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。インスリン産生細胞は、医薬候補化合物の毒性を評価するための重要なツールである。本発明製法によれば、一度の操作で多くのインスリン産生細胞を取得することができることから、細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能になる。
２　組成物
　本発明に係る組成物（以下、「本発明組成物」という。）は、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される６種又は全部、並びにｃＡＭＰ誘導剤を含むことを特徴とする。
　好ましくは、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される５種又は全部、並びにＰＩ３Ｋ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤を含む本発明組成物である。より好ましくは、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＲＡＲアゴニスト、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を含む本発明組成物である。本発明組成物においては、特にｃＡＭＰ誘導剤又はそれとＰＩ３Ｋ阻害剤とを含むことが好ましい。
　また、本発明として、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を含むことを特徴とする、体細胞からインスリン産生細胞を製造するための組成物も挙げることができる。以下、かかる組成物も含めて本発明組成物という。
　本発明組成物においては、少なくとも上記いずれかの組み合わせを含んでいればよく、必要に応じて、任意にさらに他の阻害剤や誘導剤等を含むことができる。
　上記阻害剤や誘導剤等は、それぞれにおいて、１種を用いても２種以上を併用してもよい。
　具体的な上記阻害剤等においては、２種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等を含んでいるとみなすことができる。
　上記した阻害剤や誘導剤等の具体例や好ましい例などは、前記と同義である。
　本発明組成物は、体細胞からインスリン産生細胞を製造するための組成物として使用することができる。本発明組成物は、また、体細胞からインスリン産生細胞を製造するための培地として使用することもできる。
　体細胞からインスリン産生細胞の製造に使用される培地としては、細胞の培養に必要な成分を混合して製造した基礎培地に、有効成分として、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される６種又は全部、及びｃＡＭＰ誘導剤を含有させた培地を例示することができる。上記の有効成分は、インスリン産生細胞の製造に有効な濃度で含まれていればよく、濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、又はこれらを改変した培地を、基礎培地として使用することができる。
　培地にはさらに、本明細書中で上記した公知の培地成分、例えば、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等を添加してもよい。
　培地にはさらに、本明細書中で上記した、インスリン産生細胞への分化の誘導に有効な物質を添加してもよい。
　さらに本発明においては、例えば、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される６種又は全部、及びｃＡＭＰ誘導剤を生体に投与することによって、生体内において体細胞からインスリン産生細胞を製造することもできる。即ち、本発明によれば、例えば、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される６種又は全部、及びｃＡＭＰ誘導剤を生体に投与することを含む、生体内において体細胞からインスリン産生細胞を製造する方法が提供される。生体に投与する当該阻害剤等の好ましい組み合わせは、本明細書中に記載した通りである。また、生体としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、ヒトが特に好ましい。例えば、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される６種又は全部、及びｃＡＭＰ誘導剤を生体内の特定部位に投与することによって、上記特定部位において、体細胞からインスリン産生細胞を製造することができる。
　以下、実施例や試験例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例等に記載の範囲に限定されるものではない。
実施例　インスリン産生細胞の製造
＜ヒト線維芽細胞からインスリン産生細胞への直接誘導＞
（１）ヒト線維芽細胞
　材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。３８才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。
（２）ヒト線維芽細胞からのインスリン産生細胞への直接誘導
　ヒト線維芽細胞を、ゼラチン（Ｃａｔ＃：１９０－１５８０５，和光純薬工業社製）でコーティングされた３５ｍｍディッシュに５×１０４個ずつ播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で、３７℃、５％ＣＯ２条件下でコンフルエントになるまで培養した。なおＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）を示す。
　上記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、ＩＴＳ-Ｘ（Ｃａｔ＃：５１５０００５６、Ｇｉｂｃｏ社製）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ：Ｎｏｎ-ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ；Ｃａｔ＃：１１１４００５０、Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ社製；終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ニコチンアミド（Ｃａｔ＃：７２３４０－１００Ｇ、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社製；終濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｅｘｅｎｄｉｎ-４（Ｃａｔ＃：ａｖ１２０２１４、Ａｂｃａｍ社製；終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び下記の低分子化合物を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社製）に培地を交換した。その後、３日毎に同組成の培地へ培地交換を行いながら、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で培養した。
＜低分子化合物＞
１μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃａｔ＃：１３１２２，Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
２μＭ　ＳＢ４３１５４２（Ｃａｔ＃：１９８－１６５４３，Ｗａｋｏ）
１μＭ　ＬＤＮ１９３１８９（Ｃａｔ＃：１２４－０６０１１，Ｗａｋｏ）
５μＭ　ピフィスリン－α（Ｃａｔ＃：１６２－２３１３３，Ｗａｋｏ）
７．５μＭ　フォルスコリン（Ｃａｔ＃：０６３－０２１９３，Ｗａｋｏ）
２．５μＭ　ＬＹ２９４００２（Ｃａｔ＃：７０９２０，Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
５μＭ　ＤＡＰＴ（Ｃａｔ＃：ｓｃ－２０１３１５，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
１μＭ　レチノイン酸（Ｃａｔ＃：１８６－０１１１４，Ｗａｋｏ）
（３）結果
　上記（２）に従って培養した結果を表１に示す。表中、「＋」は培地中に当該化合物が存在することを示し、「－」は培地中に当該化合物が存在しないことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　そして、低分子化合物を添加して培養後１７日目に細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、免疫染色を行った。染色には抗Ｉｎｓｕｌｉｎ抗体（ｓｃ－９１６８、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製；２００倍希釈で使用）を使用した。その結果を図２に示す。図中、緑がＩｎｓｕｌｉｎの染色結果、青がＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）による核染色を示す。なお、図２はグレー表示であるため、青色と緑色等は表示されないが、実際のオリジナル写真では、青色と緑色等が表示されている。
　また、表１のように、実施例１の化合物の組み合わせから一つずつ特定の化合物を除き、Ｉｎｓｕｌｉｎを発現する細胞への変換に必要な化合物の重要性を評価した（培養開始後１９日目）。その結果を図３と４に示す。そして、Ｍｅｒｃｏｄｉａ　Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｉｎｓｕｌｉｎ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ社製）を用いて、２４時間後における上清中のＩｎｓｕｌｉｎの分泌量と、測定後の細胞内Ｉｎｓｕｌｉｎの残存量について定量し、細胞の総タンパク質１ｍｇあたりの量として計算した。その結果を図５に示す。図中の「８Ｃ－ＬＤＮ，ＲＡ」は、実施例１の組み合わせ化合物から、ＬＤＮ１９３１８９とレチノイン酸とを除いた組み合わせ化合物であることを示す。
（４）インスリン産生細胞の評価
　図１に示すように、当該低分子化合物群を添加して培養後、線維芽細胞とは明らかに形態の異なる、より球形かつ小さいサイズの細胞が現れた。図２に示すように、これらの細胞の中のある一定数でＩｎｓｕｌｉｎの染色が見られ、相対的にＤＡＰＩで染色された細胞核ではなく細胞質でより強い染色が観察された。またこれらの細胞に緑色のＩｎｓｕｌｉｎの染色とオーバーラップする明確な自家蛍光は見られなかった。表１及び図３、図４から明らかな通り、このＩｎｓｕｌｉｎを発現する細胞への変換には、フォルスコリン（ｃＡＭＰ誘導剤）またはＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）が特に重要であることが分かった。
　図５に示すように、上清中のＩｎｓｕｌｉｎの分泌量と測定後の細胞内Ｉｎｓｕｌｉｎの残存量は、ともに化合物を添加した細胞において上昇した。
試験例
　下記低分子化合物の組み合わせについて、前記実施例と同様に添加して細胞培養を行った。材料としたヒト線維芽細胞は、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した、０才、３８才、又は４９才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。そして、Ｍｅｒｃｏｄｉａ　Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｉｎｓｕｌｉｎ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ社製）を用いて、当該化合物群を添加して２４時間後における上清中のＩｎｓｕｌｉｎの分泌量を定量し、１０５細胞あたりの量として計算した（ｎ＝３）。その結果を図６に示す。左図は０才の線維芽細胞を用いた結果を、中図は３８才の線維芽細胞を用いた結果を、右図は４９才の線維芽細胞を用いた結果を、それぞれ表す。各図において、「化合物なし」は下記低分子化合物を一つも添加しなかった場合の結果であることを、「５Ｃ」は下記低分子化合物を全て添加した場合の結果であることを示す。エラーバーは標準偏差を表し、アスタリスクはスチューデントのt検定による有意差（＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１）を表す。
＜低分子化合物＞
３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃａｔ＃：１３１２２，Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
２μＭ　ＳＢ４３１５４２（Ｃａｔ＃：１９８－１６５４３，Ｗａｋｏ）
７．５μＭ　フォルスコリン（Ｃａｔ＃：０６３－０２１９３，Ｗａｋｏ）
５μＭ　ＬＹ２９４００２（Ｃａｔ＃：７０９２０，Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
５μＭ　ＤＡＰＴ（Ｃａｔ＃：ｓｃ－２０１３１５，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
　図６に示すように、いずれの線維芽細胞においても上清中のＩｎｓｕｌｉｎの分泌量は、当該低分子化合物群（５Ｃ）を添加した細胞において上昇した。

Claims (17)

  1. 体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される６種又は全部、並びにｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
  2. 前記工程が、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される５種又は全部、並びにＰＩ３Ｋ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
  3. 前記工程が、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＲＡＲアゴニスト、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
  4. ＢＭＰ阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である、請求項１又は２に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
  5. ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＴＧＦ－β阻害剤がＳＢ４３１５４２、ｐ５３阻害剤がピフィスリン、ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴ、ＲＡＲアゴニストがレチノイン酸、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、請求項１～３のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
  6. 体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
  7. ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＴＧＦ－β阻害剤がＳＢ４３１５４２、ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴ、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、請求項６に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
  8. 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法から製造される、インスリン産生細胞。
  10. 体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される６種又は全部、並びにｃＡＭＰ誘導剤を含むことを特徴とする、体細胞からインスリン産生細胞を製造するための組成物。
  11. ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びＲＡＲアゴニストからなる群から選択される５種又は全部、並びにＰＩ３Ｋ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤を含む、請求項１０に記載の組成物。
  12. ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＲＡＲアゴニスト、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を含む、請求項１０に記載の組成物。
  13. ＢＭＰ阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である、請求項１０又は１１に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
  14. ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＴＧＦ－β阻害剤がＳＢ４３１５４２、ｐ５３阻害剤がピフィスリン、ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴ、ＲＡＲアゴニストがレチノイン酸、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を含むことを特徴とする、体細胞からインスリン産生細胞を製造するための組成物。
  16. ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＴＧＦ－β阻害剤がＳＢ４３１５４２、ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２、Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴ、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の組成物。
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