WO2016117139A1 - 神経系細胞の製造方法 - Google Patents

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平 戴
哲郎 高松
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タカラバイオ株式会社
京都府公立大学法人
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    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing neural cells using somatic cells as a material.
  • the present invention also relates to a nervous system cell obtained by the above method and a composition for treating nervous system disease containing the cell as an active ingredient.
  • Nervous system diseases are no exception.
  • diseases such as spinal cord injury, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and amyotrophic lateral sclerosis, they are derived from embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • pluripotent stem cells for example, iPS cells
  • iPS cells pluripotent stem cells
  • Non-patent Document 1 a method for directly converting somatic cells such as fibroblasts into cells of the nervous system has also been reported, a method carried out by introducing genes into somatic cells [Non-patent Document 1], somatic cells together with chemical substances.
  • a method of culturing and a method combining both are known.
  • the introduction method and other conditions may affect gene expression in the cell. Therefore, a method of converting from somatic cells to neural cells without gene transfer may be a more effective option.
  • fibroblast treated with a histone deacetylase inhibitor valproic acid a compound that inhibits the activity of multiple kinases (compound B), a transforming growth factor (TGF) - ⁇ .
  • TGF transforming growth factor
  • Schwann cells can be obtained by culturing in a medium containing a signal inhibitor and a glycogen synthase kinase 3 ⁇ (GSK3 ⁇ ) inhibitor [Non-patent Document 2].
  • Cheng et al. Also reported that neural progenitor cells can be obtained by culturing fibroblasts under hypoxic conditions in a medium containing valproic acid, a TGF- ⁇ signal inhibitor, and a GSK3 ⁇ inhibitor [ Non-Patent Document 3].
  • An object of the present invention is to provide a method for inducing cells of the nervous system directly and efficiently from somatic cells in a short time without performing artificial gene transfer.
  • the present inventors have inhibited the Smad signal and the p53 signal when culturing somatic cells, so that the nervous system is highly efficient. As a result, the present invention was completed.
  • the present invention [1] A method for producing neural cells, comprising a step of culturing somatic cells under the inhibition of Smad signal and p53 signal, [2] The method of [1], wherein the Smad signal is inhibited by a transforming growth factor- ⁇ signal inhibitor or a bone morphogenetic protein signal inhibitor. [3] The method of [1], wherein the p53 signal is inhibited by a p53 inhibitor, [4] Furthermore, somatic cell culture is carried out under culture conditions selected from the conditions under which glycogen synthase kinase 3 ⁇ signal is inhibited, mitogen-activated protein kinase signal is inhibited, and intracellular cAMP concentration is increased.
  • [1] method, [5] Transforming growth factor- ⁇ signal inhibitor, bone morphogenetic protein signal inhibitor and p53 inhibitor, glycogen synthase kinase 3 ⁇ signal inhibitor, mitogen-activated protein kinase signal inhibitor, adenylate cyclase activation The method of [4], wherein somatic cell culture is performed in a medium containing a substance selected from the group consisting of agents; [6] The method according to [1], wherein culture of somatic cells is further performed under the conditions of inhibiting glycogen synthase kinase 3 ⁇ signal and mitogen-activated protein kinase signal and increasing intracellular cAMP concentration, [7] Transforming growth factor- ⁇ signal inhibitor, bone morphogenetic protein signal inhibitor, p53 inhibitor, glycogen synthase kinase 3 ⁇ signal inhibitor, mitogen-activated protein kinase signal inhibitor and adenylate cyclase activator The method of [6], wherein the culture of somatic cells is carried out in
  • composition for treating nervous system diseases comprising the nervous system cell obtained by any of the methods [1] to [11] and the cell of [13] [12] as an active ingredient, About.
  • the method of the present invention it is possible to directly induce neural cells with high efficiency and in a short period regardless of the age and background of the source of somatic cells used for the material. In addition, it is possible to obtain more safe neural cells without risk of inserting foreign genes into the cells.
  • the present invention relates to a method for producing nervous system cell, comprising a step of culturing somatic cells under the inhibition of Smad signal and p53 signal.
  • Living cells are largely divided into somatic cells and germ cells. Any somatic cell can be used as a starting material for the method for producing nervous system cells of the present invention.
  • the somatic cell is not particularly limited, and may be either a primary cell collected from a living body or a cell line established.
  • somatic cells in various stages of differentiation for example, somatic cells that have undergone terminal differentiation, somatic cells that are on the way to final differentiation, and somatic cells that have been initialized and have acquired pluripotency can be used.
  • the somatic cell that can be used in the present invention is not particularly limited, but any somatic cell that does not belong to a nervous system cell, for example, a hematopoietic cell (various lymphocytes, macrophages, dendritic cells, bone marrow, etc. Cells), organ-derived cells (hepatocytes, spleen cells, pancreatic cells, kidney cells, lung cells, etc.), muscle tissue cells (skeletal muscle cells, smooth muscle cells, myoblasts, cardiomyocytes, etc.), fibers Examples include blast cells, osteoblasts, chondrocytes, endothelial cells, stromal cells, and adipocytes.
  • the method of the present invention can also be applied to precursor cells of these cells, cancer cells, and various stem cells (hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, etc.).
  • somatic cell source is exemplified by, but not limited to, human or non-human animals.
  • somatic cells collected from a donor whose histocompatibility type is the same as or similar to that of the recipient are used as the material. More preferably, somatic cells collected from the recipient themselves are used for induction of nervous system cells.
  • the nervous system cell obtained by the method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include neurons (neurons), glial cells (astrocytes, oligodendrocytes, microglia), and Schwann cells.
  • neurons neurogen
  • glial cells astrocytes, oligodendrocytes, microglia
  • Schwann cells a group consisting of astrocytes, oligodendrocytes, microglia.
  • various progenitor cells destined to differentiate into them are also included in the nervous system cells in the present invention.
  • Smad is a group of molecules responsible for intracellular signal transduction of the TGF- ⁇ superfamily. When phosphorylated by a receptor to which a TGF- ⁇ family cytokine is bound, it translocates into the nucleus and functions as a transcriptional activator. Signals transmitted by Smad are involved in the control of cell proliferation, differentiation and apoptosis.
  • the means for achieving the culture conditions of “inhibition of Smad signal” in the method of the present invention is not particularly limited, and known means capable of inhibiting Smad signal can be used.
  • a substance that acts directly on Smad and inhibits its function for example, an anti-Smad antibody or other drug
  • a drug that suppresses the production of Smad itself, or the like can be used.
  • the Smad signal can also be inhibited by inhibiting signal transduction involving Smad upstream. That is, the present invention can be carried out by inhibiting the functions of TGF- ⁇ family cytokines and / or their receptors.
  • an anti-cytokine antibody an anti-cytokine receptor antibody (antagonist antibody), a cytokine receptor inhibitor and the like can be used.
  • a substance acting as an inhibitor inhibits signal transduction involving TGF- ⁇ and / or bone morphogenetic protein (BMP), thereby inhibiting the Smad signal. Is preferably inhibited.
  • TGF- ⁇ signal inhibitors examples include SB431542 (CAS No. 301836-41-9), RepSox [E-61652] (CAS No. 446859-33-2), A-83-01 (CAS No. 909910-43-6), LY364947 (CAS No. 396129-53-6), SD208 (CAS No. 627536-09-8).
  • BMP signal inhibitor examples include LDN-193189 (CAS No. 1062368-24-4), Dorsorphine (CAS No. 866405-64-3), Noggin (Noggin: J Neuroscience, 1995, Vol. 15, p6077-84).
  • TGF- ⁇ signal inhibitor and BMP signal inhibitor effective for induction of nervous system cells may be determined as appropriate.
  • SB431542 can be used in the method of the present invention in the range of 0.2 ⁇ M to 20 ⁇ M
  • LDN-193189 can be used in the range of 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • P53 protein is a product of p53 gene known as a tumor suppressor gene, and is involved in cell cycle regulation and apoptosis control. Its function is exhibited through specific binding with DNA and gene expression control.
  • the means for achieving the culture conditions “inhibition of p53 signal” in the present invention is not particularly limited, and a known means capable of inhibiting the p53 signal may be used.
  • the activity of p53 protein is known to be affected by cell and DNA damage, and p53 signal can be inhibited by applying appropriate physical and chemical treatment to the cell. Examples of the physical treatment include vibration, irradiation with visible light or radiation, temperature stimulation, and the like.
  • Anti-p53 protein antibodies and known p53 signal inhibitors are also suitable for the present invention. Examples of p53 inhibitors that can be used in the present invention include pifithrin- ⁇ (CAS No. 63208-82-2), pifthrin- ⁇ (CAS No.
  • neural cells can be induced by culturing somatic cells under the inhibition of Smad signal and p53 signal. Furthermore, under the inhibition of the GSK3 ⁇ signal, under any inhibition of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal, the conditions for increasing the intracellular cAMP concentration, or any combination thereof were combined. By culturing under culture conditions, the induction efficiency of neural cells from somatic cells can be improved.
  • GSK3 ⁇ signal under any inhibition of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal, the conditions for increasing the intracellular cAMP concentration, or any combination thereof were combined.
  • GSK3 ⁇ was found as a protein kinase that phosphorylates and inactivates glycogen synthase. This enzyme has an activity to phosphorylate various proteins and is involved in not only glycogen metabolism but also cell division, cell proliferation and other physiological phenomena.
  • GSK3 ⁇ signal inhibition means such as an anti-GSK3 ⁇ antibody or a GSK3 ⁇ inhibitor may be used. it can.
  • GSK3 ⁇ loses its activity when its specific site is phosphorylated, means for promoting the phosphorylation can also be used for inhibition of GSK3 ⁇ signal.
  • GSK3 ⁇ signal inhibitors that can be used in the present invention include CHIR99021 (CAS No. 252917-06-9), BIO ((2′Z, 3′E) -6-Bromoindrubin-3′-oxime; CAS No.
  • the concentration of the GSK3 ⁇ signal inhibitor effective for the method of the present invention may be appropriately determined and is not particularly limited.
  • CHIR99021 can be used in the method of the present invention in the range of 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • MAPK is a protein kinase involved in signal transduction via phosphorylation.
  • MAPK moves into the nucleus and mainly plays a role in transmitting cytoplasmic signals into the nucleus by phosphorylating / activating transcriptional activators.
  • a MAPK signal inhibition means such as an anti-MAPK antibody or a MAPK inhibitor may be used. it can.
  • means for inhibiting an enzyme involved in MAPK activation such as MAPK kinase (MAPKK) and MAPK kinase kinase (MAPKKK) can also be used for inhibiting MAPK signals.
  • MAPK signal inhibitors that can be used in the present invention include PD0325901 (CAS No. 391210-10-9), PD184352 (CAS No. 212631-79-3), PD98059 (CAS No.
  • PD334581 ( CAS No. 548756-68-9) is exemplified.
  • concentration of the MAPK signal inhibitor effective for the method of the present invention may be appropriately determined and is not particularly limited.
  • PD0325901 can be used in the method of the present invention in the range of 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • Cyclic adenosine monophosphate is a substance involved in various intracellular signal transduction as a second messenger. cAMP is produced in cells by adenosine triphosphate (ATP) being cyclized by adenylate cyclase.
  • ATP adenosine triphosphate
  • condition for increasing intracellular cAMP concentration there are no particular limitations on the culture conditions of “conditions for increasing intracellular cAMP concentration” in the method of the present invention.
  • an enzyme involved in cAMP production substances that can promote the expression of adenylate cyclase, substances that inhibit phosphodiesterase, an enzyme that degrades cAMP, etc. It can be used as a means of increasing cAMP concentration.
  • the structural analog of cAMP, dibutyryl cAMP (dibutyryl cAMP), which has the same action as cAMP in cells, can also be used in the present invention.
  • adenylate cyclase activator that can be used in the present invention, forskolin (CAS) No. 66575-29-9) and forskolin derivatives (for example, JP-A-2002-348243).
  • concentration of the adenylate cyclase activator effective for the method of the present invention may be determined as appropriate, and is not particularly limited.
  • forskolin is used in the method of the present invention in the range of 0.5 ⁇ M to 50 ⁇ M. it can.
  • somatic cells are cultured under conditions where Smad signal and p53 signal are inhibited.
  • any of a means for inhibiting the GSK3 ⁇ signal, a means for inhibiting the MAPK signal, a means for increasing the intracellular cAMP concentration, or a combination thereof may coexist.
  • the GSK3 ⁇ signal Neural cells are induced by culturing somatic cells in a medium containing one or more substances selected from an inhibitor, a MAPK signal inhibitor, and an adenylate cyclase activator.
  • the inhibitor and activator are added to the medium at a concentration effective for induction of nervous system cells.
  • the concentration effective for the induction of nervous system cells may be determined as appropriate and is not particularly limited, but is, for example, about 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • a histone deacetylase inhibitor is not used in the step of culturing somatic cells.
  • a histone deacetylase inhibitor that is said to promote reprogramming by a nuclear reprogramming factor, it can be said that the risk of inducing pluripotent cells that may cause unintended differentiation is lower.
  • the culture of somatic cells in the present invention may be carried out by selecting a medium, temperature, and other conditions according to the type of somatic cells to be used, and exhibiting the means for inhibiting the various signals described above.
  • the medium can be selected from a known medium or a commercially available medium. For example, it can be used by adding appropriate components (serum, protein, amino acids, sugars, fatty acids, antibiotics, etc.) to common media such as MEM, DMEM, DMEM / F12 and modified media. .
  • culture conditions general cell culture conditions may be selected. The conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 are exemplified. During culture, it is preferable to change the medium at an appropriate interval.
  • fibroblasts as a material, cells of the nervous system appear in 2 to 3 weeks under these conditions. It is possible to convert somatic cells whose number of cells has been increased in advance into neural cells by selecting somatic cells to be easily cultured. Therefore, it is easy to produce scaled-up neural cells.
  • cell culture equipment such as plates, dishes, cell culture flasks and cell culture bags
  • a cell culture bag a gas permeable bag is suitable.
  • a large culture tank may be used.
  • the culture can be carried out in either an open system or a closed system, but when the obtained neural cells are to be administered to humans, it is preferable to carry out the culture in a closed system.
  • Nervous cells obtained by the method of the present invention By the above-described method for producing neural cells of the present invention, a cell population containing nervous system cells can be obtained.
  • the induction of nervous system cells according to the present invention can be confirmed by, for example, morphological changes of the cells. Since cells of the nervous system take a characteristic form depending on the cell type, the presence of the nervous system cell can be known by comparing the form of the cells before and after the culture. In addition, neural cells can be identified by detecting molecules characteristic of neural cells, such as enzymes, receptors, low molecular compounds, and the like. Molecules characteristic of nervous system cells include ⁇ 3-tubulin, synapsin I, vesicular glutamate transporter (vGULT), microtubule-associated protein (MAP) 2, and ⁇ -aminobutyric acid.
  • vGULT vesicular glutamate transporter
  • MAP microtubule-associated protein
  • GABA tyrosine hydroxylase
  • an immunological method detection by an antibody
  • the protein molecule may be detected by quantifying its mRNA amount.
  • Antibodies that recognize molecules characteristic of nervous system cells are also useful for isolating and purifying neural cells obtained by the present invention.
  • the nervous system cells obtained by the method of the present invention and the composition containing the cells are useful for the treatment of nervous system diseases.
  • nervous system diseases in which the nervous system cells and the composition are effective for treatment include spinal cord injury, cerebrovascular disorder (cerebral infarction, etc.), Parkinson's disease, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, etc. It is not limited to.
  • the nervous system cells can also be used to produce a pharmaceutical composition for the treatment of nervous system diseases.
  • the nervous system cell of the present invention When used as a pharmaceutical composition, a preparation in a form suitable for administration to an individual, for example, by mixing the cell with a pharmaceutically acceptable carrier by a conventional method, do it.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include physiological saline, distilled water for injection made isotonic by adding glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • the neural cells obtained in the present invention can also be used for research, for example, research on neuronal differentiation, drug screening for nervous system diseases, evaluation of efficacy and safety of drug candidate compounds, and the like. According to the present invention, a large number of nervous system cells can be obtained with a single operation, so that it is possible to obtain reproducible research results without being affected by cell lot differences as before. It becomes.
  • Example 1 Direct induction of nervous system cells from human fibroblasts (1) 1) Human fibroblasts Human fibroblasts as materials were purchased from DS Pharma Biomedical Co., Ltd. Table 1 shows the background information of the four cells used.
  • Two compounds that inhibit the Smad signal namely, LDN-193189 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: final concentration of 1 ⁇ M) as a BMP signal inhibitor and SB-431542 (manufactured by Tocris: final concentration of 2 ⁇ M) as a TGF- ⁇ family inhibitor.
  • LDN-193189 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: final concentration of 1 ⁇ M
  • SB-431542 manufactured by Tocris: final concentration of 2 ⁇ M
  • TGF- ⁇ family inhibitor a TGF- ⁇ family inhibitor.
  • CHIR99021 which is a GSK3 ⁇ inhibitor (Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: final concentration 1 ⁇ M)
  • PD0325901 which is a MEK / ERK inhibitor (final concentration 1 ⁇ M)
  • pifthrin- ⁇ which is an inhibitor of p53 signal.
  • This neuronal cell culture medium contains DMEM / F12 containing 1% (v / v) N2 supplement (manufactured by Lifetech) and Neurobasal Medium (life) containing 2% (v / v) B27 supplement (manufactured by Lifetech). (Made by Tech Co.) is mixed 1: 1. The above-mentioned dish of human fibroblasts cultured for 2 days was replaced with this nerve cell medium, and the medium was changed every 3 days under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 to continue the culture.
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • Tyrosine Hydroylase could not be confirmed. Therefore, it can be presumed that the nerve cells produced in the present invention have both the functions of glutamatergic neurons and inhibitory neurons.
  • Example 2 Direct induction of nervous system cells from human fibroblasts (2) Using the nerve cell medium containing the six substances used in Example 1 and the nerve cell medium lacking one of each of these six substances, direct induction of neural cells from fibroblasts was performed. It was. Moreover, the culture
  • Example 3 Using each medium described above, cells 2 (P5) described in Example 1 were cultured as described in Example 1. After 2 weeks of culture, the cells were fixed with 2% PFA and immunostained with mouse anti- ⁇ III-tubulin. The results are shown in Table 3. In the table, the description “6c- [compound name]” indicates that a medium obtained by removing the compound from a nerve cell medium containing six substances is used.
  • Example 3 Direct induction of nervous system cells from human fibroblasts (3)
  • the cells 2 (P5) described in Example 1 were cultured in the same conditions as in Example 1 in a nerve cell medium containing the six substances described in Example 1.
  • One week, 2 weeks, 3 weeks, and 4 weeks after the start of culture in the medium a part of the cells was collected and fixed with 2% PFA, and immunostaining was performed using mouse anti- ⁇ III-tubulin, respectively.
  • Tuj1-positive cells were quantified. The results are shown in Table 4.
  • the present invention provides a method capable of directly inducing nervous system cells with high efficiency and in a short period of time.
  • the method of the present invention is not affected by the nature and background of somatic cells used for the material and can be easily scaled up, so that it is possible to supply a stable nervous system cell.
  • Nervous cells obtained by the method of the present invention are useful in various research and medical fields.

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Abstract

　本発明により、高い効率で、かつ短期間で神経系細胞を直接誘導可能な方法が提供される。本発明の方法は、材料に使用する体細胞の性質や背景の影響を受けないこと、スケールアップも容易であることから、安定した神経系細胞の供給を可能とする。本発明の方法により得られる神経系細胞は各種の研究、医療の分野において有用である。

Description

神経系細胞の製造方法
　本発明は体細胞を材料として神経系の細胞を製造する方法に関する。本発明はまた、前記方法により得られる神経系細胞、当該細胞を有効成分として含有する神経系疾患治療用の組成物に関する。
　近年の細胞関連研究の発展、とくに多能性細胞に関する多くの研究成果は、個体への移植に利用可能な品質、量の治療用細胞の入手に道を開いた。すでにいくつかの疾患についてはその治療に有効な形質を有する細胞を患者に移植する試みが開始されている。
　神経系疾患もその例外ではなく、脊髄損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症等の疾患について、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来する神経系の細胞もしくは神経前駆細胞を使用した治療の可能性について検討が行われている。
　神経系疾患の再生医療においても、治療用細胞を入手、作製する手段は課題とされている。非自己ドナー由来の細胞、胚性幹細胞から分化させた細胞は拒絶反応のおそれがあるため、自己の細胞より多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）を作製し、これを適切な神経系細胞に分化させたものが治療用細胞として期待されている。この方法では、ｉＰＳ細胞の作製（リプログラミング）、神経系細胞への分化の双方のステップで高い転換効率を得ることが必要である。また、神経系細胞を得るために数カ月に及ぶ期間を要するため、治療等への使用において適用可能な疾患が限られるという問題も有していた。
　一方、線維芽細胞のような体細胞を直接神経系の細胞に転換する方法も報告されており、体細胞への遺伝子の導入により実施する方法［非特許文献１］、化学物質と共に体細胞を培養する方法、両者を組み合わせた方法が知られている。細胞に人為的に遺伝子を導入した場合、導入法やその他の条件が細胞内での遺伝子発現に影響を与える場合がある。したがって、遺伝子導入を行わずに体細胞から神経系細胞への転換を行う方法はより有効な選択肢である可能性がある。
　Ｔｈｏｍａらは、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるバルプロ酸で処理した線維芽細胞を、複数のキナーゼの活性を阻害する化合物（化合物Ｂ）、トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）－βシグナル阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤を含有する培地中で培養することにより、シュワン細胞を取得できると報告している［非特許文献２］。また、Ｃｈｅｎｇらは、バルプロ酸、ＴＧＦ－βシグナル阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地中、低酸素条件で繊維芽細胞を培養することにより、神経前駆細胞が得られることを報告している［非特許文献３］。
実験医学、２０１２年、第３０巻、１８９－１９６頁 ステム　セル　リポーツ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ）、２０１４年、第３巻、５３９－５４７頁 セル　リサーチ（Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１４年、第２４巻、第６６５－６７９頁
　本発明の目的は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、体細胞から短期間に直接かつ効率よく神経系の細胞を誘導する方法を提供することにある。
　本発明者らは、治療その他の用途に使用できる神経系細胞を得る方法について鋭意研究を重ねた結果、体細胞を培養する際にＳｍａｄシグナル並びにｐ５３シグナルを阻害することにより、高効率で神経系の細胞を誘導できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、
［１］神経系細胞を製造する方法であって、Ｓｍａｄシグナル及びｐ５３シグナルの阻害下に体細胞を培養する工程を包含する方法、
［２］Ｓｍａｄシグナルがトランスフォーミング増殖因子－βシグナル阻害剤又は骨形成タンパク質シグナル阻害剤により阻害される［１］の方法。
［３］ｐ５３シグナルがｐ５３阻害剤により阻害される［１］の方法、
［４］さらにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナルの阻害下、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナルの阻害下、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下から選択される培養条件下に体細胞の培養が実施される［１］の方法、
［５］トランスフォーミング増殖因子－βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤及びｐ５３阻害剤と、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル阻害剤、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル阻害剤、アデニル酸サイクラーゼ活性化剤からなる群より選択される物質とを含有する培地中で体細胞の培養が実施される［４］の方法、
［６］さらにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル及び分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナルの阻害下、かつ細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下に体細胞の培養が実施される［１］の方法、
［７］トランスフォーミング増殖因子－βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、ｐ５３阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル阻害剤、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤を含有する培地中で体細胞の培養が実施される［６］の方法、
［８］体細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に接触させる工程を含まないことを特徴とする［１］の方法、
［９］体細胞が分化した細胞である［１］の方法、
［１０］体細胞が線維芽細胞である［９］の方法、
［１１］体細胞がヒト細胞である［１０］の方法、
［１２］［１］～［１１］いずれかの方法で得られる神経系細胞、及び
［１３］［１２］の細胞を有効成分として含有する、神経系疾患治療用の組成物、
に関する。
　本発明の方法によれば、材料に使用する体細胞の給源の年齢や背景によらず、高い効率で、かつ短期間で神経系細胞を直接誘導できる。また、細胞への外来遺伝子の挿入のリスクもなく、より安全性の高い神経系細胞の取得が可能となる。
（１）本発明の神経系細胞の製造方法
　本発明は、Ｓｍａｄシグナル及びｐ５３シグナルの阻害下に体細胞を培養する工程を包含する、神経系細胞の製造方法に関する。
　生物の細胞は体細胞と生殖細胞に大きく二分される。本発明の神経系細胞の製造方法には、その出発材料として任意の体細胞が使用できる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、株化された細胞のいずれでもよい。本発明には分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞、最終分化への途上にある体細胞、初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明に使用できる体細胞としては、特に本発明を限定するものではないが、神経系細胞に属しない任意の体細胞、例えば造血系の細胞（各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等）、臓器由来の細胞（肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等）、筋組織系の細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等）、繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞が挙げられる。またこれら細胞の前駆細胞、癌細胞、各種の幹細胞（造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞等）にも本発明の方法を適用できる。
　上記の体細胞の給源としては、ヒトもしくは非ヒト動物が例示されるがこれらに限定されるものではない。ヒトへの投与を目的として本発明の方法により神経系細胞を製造する場合、好ましくはレシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された体細胞が材料とされる。より好ましくはレシピエント自身より採取された体細胞が神経系細胞の誘導に供される。
　本発明の方法で得られる神経系細胞にも特に限定はなく、神経細胞（ニューロン）、グリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア）、シュワン細胞が例示される。以上の最終分化した細胞の他、それらに分化することが運命づけられた種々の前駆細胞も本発明における神経系細胞に包含される。
　ＳｍａｄはＴＧＦ－βスーパーファミリーの細胞内シグナル伝達を担っている一群の分子である。ＴＧＦ－βファミリーのサイトカインが結合したレセプターによりリン酸化を受けると、核内に移行して転写活性化因子として機能する。Ｓｍａｄにより伝達されるシグナルは細胞の増殖、分化、アポトーシスの制御に関わっている。
　本発明の方法における「Ｓｍａｄシグナルの阻害下」の培養条件を達成するための手段には特に限定はなく、Ｓｍａｄシグナルを阻害することができる公知の手段を利用することができる。本発明にはＳｍａｄに直接作用してその機能を阻害する物質（例えば抗Ｓｍａｄ抗体やその他の薬剤）や、Ｓｍａｄ自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、Ｓｍａｄが関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＳｍａｄシグナルを阻害することができる。すなわち、ＴＧＦ－βファミリーのサイトカイン及び／又はそのレセプターの機能を阻害することにより、本発明を実施することができる。当該方法には、抗サイトカイン抗体、抗サイトカインレセプター抗体（アンタゴニスト抗体）、サイトカインレセプター阻害剤等が使用できる。本発明では、特に本発明を限定するものではないが、阻害剤として作用する物質でＴＧＦ－β及び／又は骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）が関わるシグナル伝達を阻害することにより、Ｓｍａｄシグナルを阻害することが好適である。
　本発明に使用できるＴＧＦ－βシグナル阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ　Ｎｏ．　３０１８３６－４１－９）、ＲｅｐＳｏｘ［Ｅ－６１６４５２］（ＣＡＳ　Ｎｏ．　４４６８５９－３３－２）、Ａ－８３－０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．　９０９９１０－４３－６）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ　Ｎｏ．　３９６１２９－５３－６）、ＳＤ２０８（ＣＡＳ　Ｎｏ．　６２７５３６－０９－８）が例示される。また、本発明に使用できるＢＭＰシグナル阻害剤としては、ＬＤＮ－１９３１８９（ＣＡＳ　Ｎｏ．　１０６２３６８－２４－４）、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．　８６６４０５－６４－３）、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ：Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，　１９９５，　Ｖｏｌ．　１５，　ｐ６０７７－８４）が例示される。神経系細胞の誘導に有効なＴＧＦ－βシグナル阻害剤、ＢＭＰシグナル阻害剤の濃度は適宜決定すればよい。特に本発明を限定するものではないが、例えば、ＳＢ４３１５４２は０．２μＭ～２０μＭ、ＬＤＮ－１９３１８９は０．１μＭ～１０μＭの範囲で、それぞれ本発明の方法に使用することができる。
　ｐ５３タンパク質はがん抑制遺伝子として知られているｐ５３遺伝子の産物であり、細胞周期調節やアポトーシス制御に関わっている。その機能はＤＮＡとの特異的結合並びに遺伝子発現制御を通じて発揮されている。
　本発明における「ｐ５３シグナルの阻害下」の培養条件を達成するための手段には特に限定はなく、ｐ５３シグナルを阻害することができる公知の手段を利用すればよい。ｐ５３タンパク質の活性は細胞やＤＮＡのダメージの影響を受けることが知られており、適切な物理的、化学的処理を細胞に施すことでｐ５３シグナルを阻害することができる。前記の物理的処理としては振動、可視光もしくは放射線の照射、温度刺激等が挙げられる。また、抗ｐ５３タンパク質抗体や公知のｐ５３シグナル阻害剤も本発明に好適である。本発明に使用できるｐ５３阻害剤としては、ピフィスリン（Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ）－α（ＣＡＳ　Ｎｏ．　６３２０８－８２－２）、ピフィスリン－β（ＣＡＳ　Ｎｏ．　５１１２９６－８８－１）、ピフィスリン－μ（ＣＡＳ　Ｎｏ．　６４９８４－３１－２）、ＮＳＣ６６８１１（ＣＡＳ　Ｎｏ．　６９６４－６２－１）、Ｎｕｔｌｉｎ－３（ＣＡＳ　Ｎｏ．　５４８４７２－６８－０）が例示される。神経系細胞の誘導に有効なｐ５３阻害剤の濃度は適宜決定すればよい。特に本発明を限定するものではないが、例えば、ピフィスリンは０．５μＭ～５０μＭの範囲で本発明の方法に使用することができる。
　本発明によれば、Ｓｍａｄシグナル及びｐ５３シグナルの阻害下で体細胞を培養することにより、神経系細胞を誘導することができる。さらに、ＧＳＫ３βシグナルの阻害下、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ：ＭＡＰＫ）シグナルの阻害下、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件、のいずれかの培養条件、もしくはこれらを組合せた培養条件で培養することにより、体細胞からの神経系細胞の誘導効率を向上させることができる。
　ＧＳＫ３βはグリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして見いだされた。本酵素は種々のタンパク質をリン酸化する活性を有しており、グリコーゲン代謝のみならず、細胞分裂、細胞増殖他の生理現象にも関わっている。
　本発明の方法における「ＧＳＫ３βシグナルの阻害下」の培養条件には特に限定はなく、ＧＳＫ３βの活性を阻害する物質、例えば抗ＧＳＫ３β抗体やＧＳＫ３β阻害剤のようなＧＳＫ３βシグナル阻害手段を利用することができる。また、ＧＳＫ３βは自身の特定の部位がリン酸化されると活性を失うことから、当該リン酸化を促進する手段もＧＳＫ３βシグナルの阻害に利用することができる。本発明に使用できるＧＳＫ３βシグナル阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ　Ｎｏ．　２５２９１７－０６－９）、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ；ＣＡＳ　Ｎｏ．　６６７４６３－６２－９）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．　１４２２７３－２０－９）、Ａ１０７０７２２（ＣＡＳ　Ｎｏ．　１３８４４２４－８０－９）が例示される。本発明の方法に有効なＧＳＫ３βシグナル阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１は０．１μＭ～１０μＭの範囲で本発明の方法に使用することができる。
　ＭＡＰＫはリン酸化を介したシグナル伝達に関わるプロテインキナーゼである。ＭＡＰＫは自身がリン酸化されると核内に移行し、主に転写活性化因子をリン酸化／活性化することにより、細胞質のシグナルを核内に伝える役割を担っている。
　本発明の方法における「ＭＡＰＫシグナルの阻害下」の培養条件には特に限定はなく、ＭＡＰＫの活性を阻害する物質、例えば抗ＭＡＰＫ抗体やＭＡＰＫ阻害剤のようなＭＡＰＫシグナル阻害手段を利用することができる。また、ＭＡＰＫの活性化に関わる酵素、例えばＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）やＭＡＰＫキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）等を阻害する手段もＭＡＰＫシグナルの阻害に利用することができる。本発明に使用できるＭＡＰＫシグナル阻害剤としては、ＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．　３９１２１０－１０－９）、ＰＤ１８４３５２（ＣＡＳ　Ｎｏ．　２１２６３１－７９－３）、ＰＤ９８０５９（ＣＡＳ　Ｎｏ．　１６７８６９－２１－８）、ＰＤ３３４５８１（ＣＡＳ　Ｎｏ．　５４８７５６－６８－９）が例示される。本発明の方法に有効なＭＡＰＫシグナル阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、ＰＤ０３２５９０１は０．１μＭ～１０μＭの範囲で本発明の方法に使用することができる。
　環状アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）はセカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。ｃＡＭＰは、細胞内ではアデニル酸サイクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ）によりアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）が環状化されることで生成する。
　本発明の方法における「細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下」の培養条件には特に限定はない。ｃＡＭＰの生成に関わる酵素であるアデニル酸サイクラーゼに直接作用して活性化できる物質、アデニル酸サイクラーゼの発現を促進しうる物質の他、ｃＡＭＰを分解する酵素であるホスホジエステラーゼを阻害する物質等を細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる手段として使用することができる。細胞内でｃＡＭＰと同じ作用を持つ、ｃＡＭＰの構造類似体であるジブチリルｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ　ｃＡＭＰ）も本発明に使用できる、本発明に使用できるアデニル酸サイクラーゼ活性化剤としては、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ；ＣＡＳ　Ｎｏ．　６６５７５－２９－９）やフォルスコリン誘導体（例えば特開２００２－３４８２４３）が例示される。本発明の方法に有効なアデニル酸サイクラーゼ活性化剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、フォルスコリンは０．５μＭ～５０μＭの範囲で本発明の方法に使用することができる。
　本発明による神経系細胞の製造では、Ｓｍａｄシグナル及びｐ５３シグナルが阻害された条件下で体細胞の培養が実施される。この際、ＧＳＫ３βシグナルを阻害する手段、ＭＡＰＫシグナルを阻害する手段、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる手段のいずれか、もしくはこれらの組合せを共存させてもよい。
　本発明の好適な態様では、Ｓｍａｄシグナルを阻害する手段としてのトランスフォーミング増殖因子－βシグナル阻害剤ならびに骨形成タンパク質シグナル阻害剤、及びｐ５３シグナルを阻害する手段としてのｐ５３阻害剤に加え、ＧＳＫ３βシグナル阻害剤、ＭＡＰＫシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤から選択される１以上の物質を含有させた培地中で体細胞を培養することにより神経系細胞の誘導が実施される。前記の阻害剤、活性化剤は、神経系細胞の誘導に有効な濃度で培地に添加される。神経系細胞の誘導に有効な濃度は、適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μＭ～５０μＭ程度である。
　本発明の神経系細胞の製造方法の好適な態様では、体細胞を培養する工程においてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を使用しない。核初期化因子によるリプログラミングを促進すると言われるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を使用しない本発明の方法では、意図しない分化を起こしかねない多能性細胞が誘導されるリスクはより低いと言える。
　本発明における体細胞の培養は、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、前記の各種シグナルに対する阻害手段等を発揮させて実施すればよい。培地は公知の培地や市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２やこれらを改変した培地に適切な成分（血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、脂肪酸類、抗生物質等）を添加して使用することができる。
　培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ２の条件が例示される。培養中は適切な間隔で培地の交換を実施することが好ましい。繊維芽細胞を材料として本発明の方法を実施する場合、この条件では２～３週間で神経系の細胞が出現する。使用する体細胞として培養の容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させた体細胞を神経系細胞に転換することも可能である。したがってスケールアップした神経系細胞製造も容易である。
　前記の培養には、プレート、ディッシュ、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養用器材（容器）を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができるが、得られた神経系細胞のヒトへの投与等を目的とする場合には、閉鎖系で培養を実施することが好ましい。
（２）本発明の方法により得られる神経系細胞
　上記の、本発明の神経系細胞の製造方法により、神経系細胞を含有する細胞集団を得ることができる。
　本発明による神経系細胞の誘導は、例えば細胞の形態的変化により確認することができる。神経系の細胞は、細胞の種類によって特徴的な形態をとることから、培養前後の細胞の形態を比較することによって神経系細胞の存在を知ることができる。また、神経系細胞に特徴的な分子、例えば酵素、レセプター、低分子化合物等を検出して神経系細胞を確認することもできる。神経系細胞に特徴的な分子としては、β３－チューブリン、シナプシンＩ、ベジクル型グルタミン酸トランスポーター（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ｖＧＵＬＴ）、微小管関連タンパク質（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＡＰ）２、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、チロシン水酸化酵素等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記の分子の検出には免疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。神経系細胞に特徴的な分子を認識する抗体は、本発明により得られた神経系細胞を単離、精製するうえでも有用である。
　本発明の方法により得られる神経系細胞ならびに当該細胞を含有する組成物は、神経系疾患の治療に有用である。前記神経系細胞および前記組成物が治療に有効な神経系疾患としては脊髄損傷、脳血管障害（脳梗塞等）、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記神経系細胞は、神経系疾患の治療のための医薬用組成物を製造するために使用することもできる。
　本発明の神経系細胞を医薬用の組成物とする場合には、常法により、当該細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
　本発明で得られる神経系細胞は、研究、例えば神経細胞分化に関する研究や神経系疾患の医薬スクリーニング、医薬候補化合物の効能・安全性評価等に使用することもできる。本発明によれば、一度の操作で多くの神経系細胞を取得することができることから、これまでのように細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能となる。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
実施例１　ヒト線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導（１）
１）　ヒト線維芽細胞
　材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。使用した４つの細胞の背景情報を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２）　ヒト線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導
　表１に示したヒト繊維芽細胞を、それぞれ３５ｍｍ　ディッシュに８×１０４個ずつ撒き、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ　ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ培養液で、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で２日間インキュベートした。各細胞は下記の継代数で培養に供した。
　　細胞１：　Ｐａｓｓａｇｅ　５（Ｐ５）とＰ２０　
　　細胞２：　Ｐ５とＰ２１
　　細胞３：　Ｐ５とＰ１７
　　細胞４：　Ｐ５とＰ１５
　Ｓｍａｄシグナルを阻害する２つの化合物、即ちＢＭＰシグナル阻害剤であるＬＤＮ－１９３１８９（和光純薬社製：終濃度１μＭ）とＴＧＦ－βファミリー阻害剤であるＳＢ－４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ社製：終濃度２μＭ）、ＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（和光純薬社製：終濃度１μＭ）、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤であるＰＤ０３２５９０１（和光純薬社製：終濃度１μＭ）、ｐ５３シグナルの阻害剤であるピフィスリン－α（和光純薬社製：終濃度５μＭ）並びにｃＡＭＰの生産促進剤であるフォルスコリン（和光純薬社製：終濃度７．５μＭ）を含む神経細胞培地を調製した。この神経細胞培地は１％（ｖ／ｖ）　Ｎ２　サプリメント（ライフテック社製）を含んだＤＭＥＭ／Ｆ１２と、２％（ｖ／ｖ）　Ｂ２７　サプリメント（ライフテック社製）を含んだＮｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテック社製）を１：１で混合したものである。前記の、２日間培養したヒト繊維芽細胞のディッシュの培地をこの神経細胞培地に置換し、３７℃、５％　ＣＯ２の条件で３日毎に培地交換し培養を継続した。
３）　神経系細胞の評価
ａ）神経細胞マーカーの細胞免疫染色
　３週間培養したヒト線維芽細胞は、形態的に神経細胞に類似していた。この細胞を２％　ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で固定した後、免疫染色を行った。細胞免疫染色で使用した抗体は、次の通りである。Ｔｕｊ１について、陽性となった細胞（神経系細胞）の存在比を表２に示す。
　　マウス抗βIII－ｔｕｂｕｌｉｎ［Ｔｕｊ１］（Ｃｏｖａｎｃｅ社製；ＭＭＳ－４３５Ｐ）
　　ウサギ抗βIII－ｔｕｂｕｌｉｎ［Ｔｕｊ１］（Ｃｏｖａｎｃｅ社製；ＰＲＢ－４３５Ｐ）
　　ウサギ抗ＭＡＰ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示す通り、６種の物質を含有する培地を使用した場合には、材料とした細胞の給源の違い（年齢、性別、細胞採取部位）にかかわらず、８０％を超える高い効率で神経系細胞マーカーであるＴｕｊ１陽性の細胞が出現した。また、どの細胞でも誘導開始前の継代数が誘導効率に影響を与えなかったことから、本発明の方法では細胞自体の老化の影響を受けないことも明らかとなった。さらに、得られた神経系細胞では成熟した神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２の発現も確認された。
　以上のことから、上記６物質を培養時に使用することによって繊維芽細胞から神経系細胞への直接誘導が可能であることが示された。
ｂ）神経系細胞の機能的評価
　上記ａ）同様の操作により固定した細胞を下記の各抗体を用いた免疫染色に供し、神経細胞の機能を評価した。
　　マウス抗βIII－ｔｕｂｕｌｉｎ［Ｔｕｊ１］（Ｃｏｖａｎｃｅ社製；ＭＭＳ－４３５Ｐ）
　　ウサギ抗ｖＧＬＵＴ１（Ｓｙｎａｐｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）
　　ウサギ抗ＧＡＢＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
　　ウサギ抗Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）
　作製された神経系細胞はグルタミン酸作動性マーカーであるｖＧＬＵＴ－１を発現しており、また、抑制性神経伝達物質マーカーであるγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の存在が確認されたが、ドーパミン作動性マーカーであるＴｙｒｏｓｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅの発現は確認できなかった。よって、本発明で作製した神経細胞はグルタミン酸作動性神経細胞と抑制性神経細胞の両面性を持っていると推測できる。
実施例２　ヒト線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導（２）
　実施例１で使用された６種の物質を含有する神経細胞培地、ならびにこれら６種類の物質のそれぞれ１つを欠いた神経細胞培地を使用して線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導を行った。また、対照として６種の物質すべてを含有しない神経細胞培地での培養も実施した。
　上記の各培地を使用し、実施例１記載の細胞２（Ｐ５）を実施例１に記載のように培養した。培養２週間後に細胞を２％　ＰＦＡで固定し、マウス抗βIII－ｔｕｂｕｌｉｎを用いた免疫染色を行った。この結果を表３に示す。表中、「６ｃ－［化合物名］」との記載は、６種の物質を含有する神経細胞培地から当該化合物を除いた培地が使用されていることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示す通り、６種の物質を含有する培地を使用した場合には高効率で神経系細胞が誘導された。ピフィスリン－αを欠く培地、６種の物質をすべて含有しない培地では神経系細胞は出現しなかったが、他の培地では神経系培地の誘導が確認された。すなわち、このことから、線維芽細胞からの神経細胞直接誘導にはｐ５３シグナルを阻害することが必須であると推測された。
　また、ＬＤＮ－１９３１８９とＳＢ－４３１５４２の２つを欠く培地、すなわちＳｍａｄシグナルを阻害する手段が存在しない状態で培養を行った場合にも神経系細胞の誘導は観察されなかった。
　以上の結果より、培養時にｐ５３シグナルおよびＳｍａｄシグナルの２つの経路を阻害することが、線維芽細胞からの神経系細胞の直接誘導に必須であることが示された。
実施例３　ヒト線維芽細胞からの神経系細胞直接誘導（３）
　実施例１記載の細胞２（Ｐ５）を、実施例１に記載された６種の物質を含有する神経細胞培地中で、実施例１と同じ条件で培養した。前記培地での培養開始から１週間後、２週間後、３週間後、４週間後に細胞の一部を採取して２％　ＰＦＡで固定し、それぞれマウス抗βIII－ｔｕｂｕｌｉｎを用いた免疫染色を行ってＴｕｊ１陽性細胞を定量した。この結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示す通り、６種の物質を含有する培地では、培養開始から２週間後に神経系細胞の割合は５０％を超えていた。また、神経系細胞の誘導はほぼ３週間で最高値にまで達することが示された。
　本発明により、高い効率で、かつ短期間で神経系細胞を直接誘導可能な方法が提供される。本発明の方法は、材料に使用する体細胞の性質や背景の影響を受けないこと、スケールアップも容易であることから、安定した神経系細胞の供給を可能とする。本発明の方法により得られる神経系細胞は各種の研究、医療の分野において有用である。

Claims (13)

  1. 　神経系細胞を製造する方法であって、Ｓｍａｄシグナル及びｐ５３シグナルの阻害下に体細胞を培養する工程を包含する方法。
  2. 　Ｓｍａｄシグナルがトランスフォーミング増殖因子－βシグナル阻害剤又は骨形成タンパク質シグナル阻害剤により阻害される請求項１記載の方法。
  3. 　ｐ５３シグナルがｐ５３阻害剤により阻害される請求項１記載の方法。
  4. 　さらにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナルの阻害下、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナルの阻害下、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下から選択される培養条件下に体細胞の培養が実施される請求項１記載の方法。
  5. 　トランスフォーミング増殖因子－βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤及びｐ５３阻害剤と、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル阻害剤、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル阻害剤、アデニル酸サイクラーゼ活性化剤からなる群より選択される物質とを含有する培地中で体細胞の培養が実施される請求項４記載の方法。
  6. 　さらにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル及び分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナルの阻害下、かつ細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下に体細胞の培養が実施される請求項１記載の方法。
  7. 　トランスフォーミング増殖因子－βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、ｐ５３阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル阻害剤、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤を含有する培地中で体細胞の培養が実施される請求項６記載の方法。
  8. 　体細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に接触させる工程を含まないことを特徴とする請求項１記載の方法。
  9. 　体細胞が分化した細胞である請求項１記載の方法。
  10. 　体細胞が線維芽細胞である請求項９記載の方法。
  11. 　体細胞がヒト細胞である請求項１０記載の方法。
  12. 　請求項１～１１いずれか記載の方法で得られる神経系細胞。
  13. 　請求項１２記載の細胞を有効成分として含有する、神経系疾患治療用の組成物。
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