JP7223448B2 - 機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための方法 - Google Patents
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Description
神経幹細胞または神経前駆細胞が、分離後に細胞培養プレート上に蒔かれ、第1日目から神経細胞分化培地A(neural differentiation medium A)中で培養され、そしてその後、第7日目から神経細胞分化培地B(neural differentiation medium B)中で培養される;
神経細胞分化培地Aは、レチノイン酸、BDNF、GDNF、アスコルビン酸、栄養サプリメント、neurobasal medium、およびビタミンAを含まないB27サプリメントのうちの一またはそれ以上を含む;
神経細胞分化培地Bは、BDNF、GDNF、アスコルビン酸、栄養サプリメント、neurobasal medium、およびビタミンAを含まないB27サプリメントのうちの一またはそれ以上を含む;
栄養サプリメントは、SU5402、BIBF1120、IBMX、およびグルコースのうちの一またはそれ以上を含む。
工程1:ヒト人工多能性幹細胞株DYR0100の分化により得られるヒト神経前駆細胞(hNPC)が、アキュターゼによって分離され、そしてその後、5×105/cm2の密度で、ポリ-D-リシン/ラミニンコートプレート上に蒔かれた。
実施例1との違いは、神経細胞分化培地Aおよび神経細胞分化培地Bが神経細胞培養用基礎培地(Neurobasal mediumおよびB27)と置き換わったことであった。
実施例1との違いは、神経細胞分化培地Aおよび神経細胞分化培地Bが、神経細胞の神経生理学的成熟を促進させる培養培地(BrainPhys)と置き換わったことであり、培養培地(BrainPhys)は、著名な幹細胞試薬会社である、カナダ国のStemCell technologies社(CompA)によって製造されている。
実施例1との違いは、神経細胞分化培地Aおよび神経細胞分化培地Bが、神経細胞の成熟を促進する培地サプリメントによって置き換わったことであり、ここで、培地サプリメントは、幹細胞神経分化の技術分野において広く知られているアメリカ国の教授によって運営されている会社、BrainXell社(CompB)によって製造されている。
工程1:ヒト人工多能性幹細胞株DYR0100の分化により得られるヒト神経前駆細胞(hNPC)が、アキュターゼによって分離され、そしてその後、5×105/cm2の密度で、ポリ-D-リシン/ラミニンコートプレート上に蒔かれた。
工程1:ヒト人工多能性幹細胞株DYR0100の分化により得られるヒト神経前駆細胞(hNPC)が、アキュターゼによって分離され、そしてその後、5×105/cm2の密度で、ポリ-D-リシン/ラミニンコートプレート上に蒔かれた。
工程1:ヒト人工多能性幹細胞株DYR0100の分化により得られるヒト神経前駆細胞(hNPC)が、アキュターゼによって分離され、そしてその後、5×105/cm2の密度で、ポリ-D-リシン/ラミニンコートプレート上に蒔かれた。
Claims (12)
- 機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための培地であって、ニューロン培地および栄養サプリメントを含み、前記栄養サプリメントが、FGF/VEGFシグナル伝達経路の阻害剤およびcAMPの活性化剤を含み、
前記FGF/VEGFシグナル伝達経路の阻害剤が、SU5402およびBIBF1120であり、ならびに、
前記cAMPの活性化剤が、IBMXおよびグルコースである培地。 - 前記栄養サプリメントが、前記FGF/VEGFシグナル伝達経路の阻害剤として80nM~100μMのSU5402および1~500ng/mLのBIBF1120を含み、ならびに、前記cAMPの活性化剤として1~100μMのIBMXおよび1~10mMのグルコースを含む請求項1記載の培地。
- 機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための方法であって、
神経幹細胞または神経前駆細胞が、分離後に細胞培養プレート上に蒔かれ、第1日目から神経細胞分化培地A中で培養され、そしてその後、第7日目から神経細胞分化培地B中で培養される
ことを含み;
前記神経細胞分化培地Aが、レチノイン酸、BDNF、GDNF、アスコルビン酸、栄養サプリメント、neurobasal medium、およびビタミンAを含まないB27サプリメントのうちの一またはそれ以上を含み;
前記神経細胞分化培地Bが、BDNF、GDNF、アスコルビン酸、栄養サプリメント、neurobasal medium、およびビタミンAを含まないB27サプリメントのうちの一またはそれ以上を含み;
前記栄養サプリメントが、FGF/VEGFシグナル伝達経路の阻害剤およびcAMPの活性化剤を含み、
前記FGF/VEGFシグナル伝達経路の阻害剤が、SU5402およびBIBF1120であり、
前記cAMPの活性化剤が、IBMXおよびグルコースの組み合わせである方法。 - 前記栄養サプリメントが、前記FGF/VEGFシグナル伝達経路の阻害剤として80nM~100μMのSU5402および1~500ng/mLのBIBF1120を含み、ならびに、前記cAMPの活性化剤として1~100μMのIBMXおよび1~10mMのグルコースを含む請求項3記載の方法。
- 前記栄養サプリメントが、前記FGF/VEGFシグナル伝達経路の阻害剤として80nM~10μMのSU5402および150~250ng/mLのBIBF1120を含み、ならびに、前記cAMPの活性化剤として5~15μMのIBMXおよび3~8mMのグルコースを含む請求項4記載の方法。
- 前記栄養サプリメントが、100nMのSU5402、200ng/mLのBIBF1120、10μMのIBMX、および5mMのグルコースを含む請求項5記載の方法。
- 前記栄養サプリメントが、10μMのSU5402を含む請求項4記載の方法。
- 前記栄養サプリメントが、5μMのSU5402および50μMのIBMXを含む請求項4記載の方法。
- 前記栄養サプリメントが、5ng/mLのBIBF1120および50μMのIBMXを含む請求項4記載の方法。
- 前記神経細胞分化培地Aが、2μMのレチノイン酸、20ng/mLのBDNF、20ng/mLのGDNF、および0.2mMのアスコルビン酸、100nMのSU5402、200ng/mLのBIBF1120、10μMのIBMX、5mMのグルコース、neurobasal medium、およびビタミンAを含まないB27サプリメントを含み、前記neurobasal mediumの前記ビタミンAを含まないB27サプリメントに対する比が50:1であり;
前記神経細胞分化培地Bが、20ng/mLのBDNF、20ng/mLのGDNF、および0.2mMのアスコルビン酸、100nMのSU5402、200ng/mLのBIBF1120、10μMのIBMX、5mMのグルコース、neurobasal medium、およびビタミンAを含まないB27サプリメントを含み、前記neurobasal mediumの前記ビタミンAを含まないB27サプリメントに対する比が、50:1である請求項3記載の方法。 - 培養が、第1日目から前記神経細胞分化培地A中で、前記培地の半量が3~5日毎に交換されながら行われ;
培養が、第7日目から、前記神経細胞分化培地Bを用いて、前記培地の半量が3~5日毎に交換されながら継続される請求項10記載の方法。 - 前記神経幹細胞または前記神経前駆細胞がアキュターゼによって分離され、および、5×105細胞/cm2の密度で、ポリ-D-リシン/ラミニンコートプレート上に蒔かれる請求項11記載の方法。
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