CN108359638B - 功能大脑皮层细胞的诱导分化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种功能大脑皮层细胞诱导分化用培养基，包括神经细胞培养基和营养添加剂，所述营养添加剂选自SU5402、BIBF1120、IBMX和葡萄糖中的一种或多种。本发明提供了一种功能大脑皮层细胞的诱导分化方法。本发明在由神经干细胞或神经前体细胞向多种神经细胞诱导分化的特定时间添加特定的因子，例如FGF、VEGF信号通路的抑制剂，cAMP的激活剂等，加速神经细胞的分化和成熟，可以在从人神经前体细胞开始诱导分化7～14天左右得到具有主要功能且稳定健康的神经细胞，其中包含兴奋性及抑制性神经元，从而使得体外培养的人神经细胞可以真正应用于药物筛选等领域，降低制造成本，缩短生产周期。

Description

功能大脑皮层细胞的诱导分化方法
技术领域
本发明属于功能大脑皮层细胞的诱导分化技术领域，尤其涉及一种人神经干细胞快速诱导分化为功能大脑皮层细胞的方法。
背景技术
自从2008年(Dimos et al.2008)开始，从人诱导多能干细胞(hiPSC)或胚胎干细胞(hESC)体外诱导分化得到人的神经细胞，并用于神经系统疾病研究，药物筛选，药物的神经毒性测试，移植试验等就一直是科研和药物研发的热点，相关的文章一直在持续增长。其中，诱导分化的方法虽然层出不穷，但是能得到接近大脑的组成和比例，以及成熟功能的神经细胞群体依然是一大难题。
人神经前体细胞被诱导分化为成熟有功能的大脑皮层细胞一般需要30～60天，且很难具有真正成熟的神经结构和功能，如神经递质受体在突触的分布，自发、较强且频繁的兴奋性和抑制性电生理信号等。而且，在高通量药物筛选的多孔板中，神经细胞无法稳定健康的长时间培养，且不适宜再次换液，所以需要较长培养时间和不够成熟这两点极大地限制了这些细胞在疾病研究，药物筛选及毒性测试方面的大规模应用，同时也影响到所获得数据的代表性和可靠性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种功能大脑皮层细胞的诱导分化方法，本发明提供的方法用时较短即可获得具有主要功能且稳定健康的神经细胞。
本发明提供了一种功能大脑皮层细胞的诱导分化方法，包括以下步骤：
将神经干细胞或神经前体细胞消化后接种至细胞培养板上，第1天开始使用神经分化培养基A进行培养；第7天开始使用神经分化培养基B继续培养；
所述神经分化培养基A包括维甲酸(retinoic acid)、BDNF、GDNF、抗坏血酸(ascorbic acid)、营养添加剂、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂；
所述神经分化培养基B包括BDNF、GDNF、抗坏血酸(ascorbic acid)、营养添加剂、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂；
所述营养添加剂选自SU5402、BIBF1120、IBMX和葡萄糖(glucose)中的一种或多种。
本发明在由神经干细胞或神经前体细胞向多种神经细胞诱导分化的特定时间添加特定的因子，例如FGF、VEGF信号通路的抑制剂，cAMP的激活剂等，加速神经细胞的分化和成熟，可以在从人神经前体细胞开始诱导分化7～14天左右得到具有主要功能且稳定健康的神经细胞，其中包含兴奋性及抑制性神经元，从而使得体外培养的人神经细胞可以真正应用于药物筛选等领域，降低制造成本，缩短生产周期。
本发明首先将神经干细胞或神经前体细胞消化后接种至细胞培养板上，具体而言，将神经干细胞或神经前体细胞用accutase消化后按5×105/cm2接种至用poly-D-lysine和laminin包被的细胞培养板上，然后第1天开始使用神经分化培养基A进行培养；第7天开始使用神经分化培养基B继续培养。
在本发明中，所述神经分化培养基A包括维甲酸(retinoic acid)、BDNF(脑源性神经营养因子)、GDNF(胶质细胞源性神经营养因子)、抗坏血酸(ascorbic acid)、营养添加剂、Neurobasal培养基和B27添加剂；所述神经分化培养基B包括BDNF、GDNF、抗坏血酸(ascorbic acid)、营养添加剂、Neurobasal培养基和B27添加剂。
本发明在神经细胞培养基中添加营养添加剂，能够加速神经细胞的分化和成熟。在本发明中，所述营养添加剂选自SU5402、BIBF1120、IBMX和葡萄糖(glucose)中的一种或多种。
SU5402和BIBF1120用于抑制FGF和VEGF受体信号通路，抑制细胞聚集，促进未成熟神经元迁移，使得神经细胞具有足够的距离空隙，有利于神经突起的生长，进一步成熟为功能性的真神经元。因为细胞的聚集会导致神经元的高密度，导致细胞失去延伸神经突起的机会，不利于细胞的成熟，现有分化和神经元培养方法普遍都有因神经细胞聚集而影响细胞健康，成熟和均一性，甚至在成熟前大量死亡的问题，添加SU5402和BIBF1120可以通过减少细胞聚集而有效的防止这些情况的出现，使得神经细胞可以较早成熟，同时保持健康及均一的密度，降低死亡率，从而可以满足科研及产业界大批量和功能上的需求，可用于高通量筛选等。而且，使用添加SU5402和BIBF1120培养基所培养的神经细胞可维持长达3年以上，而通过其它方法分化人神经干细胞得到的神经细胞一般在体外只能培养至1～2个月就会大量死亡。
IBMX是胞内cAMP降解酶-磷酸二酯酶(PDE)的非特异性抑制剂,可通过抑制cAMP的降解而提高胞内cAMP的水平，IBMX的作用需要glucose的参与才能发挥效果。神经元的分化成熟需要大量的cAMP提供能量，通常都使用大量的cAMP,较高成本；而IBMX通过抑制cAMP降解酶-磷酸二酯酶的活性，可以间接提高细胞内cAMP的浓度。使用IBMX和glucose替代大量的cAMP，一方面使得神经细胞可以更早成熟，另一方面可以降低细胞培养的成本，从而可以满足科研及产业界大批量和功能上的需求，适合用于高通量筛选。
在一个实施例中，所述营养添加剂包括SU5402、BIBF1120、IBMX和葡萄糖。
在一个实施例中，所述营养添加剂包括SU5402。
在一个实施例中，所述营养添加剂包括100nM～100μM的SU5402、1～500ng/mlBIBF1120、1～100μM IBMX和1～10mM的葡萄糖中的一种或多种。
在一个实施例中，所述营养添加剂包括100nM～100μM的SU5402、1～500ng/mlBIBF1120、1～100μM IBMX和1～10mM的葡萄糖。
在一个实施例中，所述营养添加剂包括80～120nM SU5402、150～250ng/mlBIBF1120、5～15μM IBMX和3～8mM的葡萄糖(glucose)。
在一个实施例中，所述营养添加剂包括100nM SU5402、200ng/ml BIBF1120、10μMIBMX和5mM的葡萄糖(glucose)。
在本发明中，神经细胞培养基选自大脑神经细胞培养基、多巴胺神经细胞培养基、运动神经细胞培养基等基本培养基，也可添加不同的因子组合。在一个实施例中，所述神经细胞培养基包括维甲酸(retinoic acid)、BDNF、GDNF、抗坏血酸(ascorbic acid)、Neurobasal培养基和不含vitamine A的B27添加剂；在一个实施例中，所述神经细胞培养基包括BDNF、GDNF、抗坏血酸(ascorbic acid)、Neurobasal培养基和不含vitamine A的B27添加剂。
在诱导分化神经干细胞或神经前体细胞时，第1天开始使用神经分化培养基A进行培养；第7天开始使用神经分化培养基B继续培养。
具体而言，所述神经分化培养基A包括神经细胞培养基A和营养添加剂。所述神经细胞培养基A包括维甲酸(retinoic acid)、BDNF、GDNF、抗坏血酸(ascorbic acid)、Neurobasal培养基和B27添加剂(不含vitamine A)。在一个实施例中，所述神经分化培养基A包括2μM维甲酸(retinoic acid)、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM抗坏血酸(ascorbic acid)、100nM SU5402、200ng/ml BIBF1120、10μM IBMX、5mM的葡萄糖和补足的Neurobasal培养基和不含vitamine A的B27添加剂，其中，Neurobasal培养基和B27添加剂的用量比例是50:1。
具体而言，所述神经分化培养基B包括神经细胞培养基B和营养添加剂。所述神经细胞培养基B包括BDNF、GDNF、抗坏血酸(ascorbic acid)、Neurobasal培养基和不含vitamine A的B27添加剂。在一个实施例中，所述神经分化培养基B包括20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM抗坏血酸(ascorbic acid)、100nM SU5402、200ng/ml BIBF1120、10μMIBMX、5mM的葡萄糖和补足的Neurobasal培养基和不含vitamine A的B27添加剂，其中，Neurobasal培养基和不含vitamine A的B27添加剂的用量比例是50:1。
在本发明中，第1天开始使用神经分化培养基A在37℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养，每3～5天半量换液；第7天开始使用神经分化培养基B继续在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，每3～5天半量换液，从第7天开始可以通过电生理及免疫荧光染色等方法检测神经细胞的成熟度，当达到目的功能指标后即可使用。
本发明在由神经干细胞或神经前体细胞向多种神经细胞诱导分化的特定时间添加特定的因子，例如FGF、VEGF信号通路的抑制剂，cAMP的激活剂等，加速神经细胞的分化和成熟，可以在从人神经前体细胞开始诱导分化7～14天左右得到具有主要功能且稳定健康的神经细胞，其中包含兴奋性及抑制性神经元，从而使得体外培养的人神经细胞可以真正应用于药物筛选等领域，降低制造成本，缩短生产周期。另外，本发明提供的方法采用的培养基的成分都是无血清无动物源的因子，因此也适合用于临床移植试验。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的功能大脑皮层细胞的诱导分化方法的流程示意图；
图2是实施例1诱导分化第1、7、14及84天的人神经细胞的明场照片；
图3是实施例1诱导分化第14天时单细胞膜片钳记录人神经细胞的动作电位示例，miniIPSC(抑制性神经发放)和miniEPSC(兴奋性神经发放)的示例；
图4是实施例1诱导分化第14天所记录的细胞的兴奋及抑制性神经发放的幅度及频率的统计数据；
图5是分化诱导第14天时单细胞膜片钳记录人神经细胞的sEPSC(自发性兴奋神经发放)的示例记录；
图6是实施例1分化诱导第14天时人神经细胞的自发性神经发放的示例记录；
图7是分化第14天时的MAP2荧光免疫染色结果；
图8是分化第14天时的MAP2荧光免疫染色结果柱状图；
图9是分化第14天时的Synapsin荧光免疫染色结果；
图10是分化第14天时的Synapsin荧光免疫染色结果柱状图；
图11是分化第21天时的vGlut荧光免疫染色结果；
图12是分化第21天时的vGlut荧光免疫染色结果柱状图；
图13是实施例2及比较例1分化第21天时的人神经细胞的明场照片；
图14是实施例2及比较例1分化第21天时的人神经细胞的分散程度统计结果柱状图；
图15是实施例2及比较例1分化第21天时的Synapsin荧光免疫染色结果柱状图；
图16是实施例2及比较例1分化第21天时的FOXG1荧光免疫染色结果柱状图；
图17是实施例2及比较例1分化第7天时的人神经细胞的自发性神经发放记录统计图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
步骤1、将人诱导多能干细胞系DYR0100分化所得到的神经前体细胞(hNPC)用accutase消化后，按5×105/cm2接种至poly-D-lysine和laminin包被好的细胞培养板上；
步骤2、从第1天开始使用神经分化培养基A在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养7天，每3天半量换液；所述神经分化培养基A含有终浓度为2μM retinoic acid、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM ascorbic acid、100nM SU5402、200ng/ml BIBF1120、10μM IBMX和5mM glucose的Neurobasal培养基及不含vitamine A的B27添加剂，其中，Neurobasal培养基和B27添加剂的用量比例是50:1；
步骤3、从第7天开始使用神经分化培养基B在37℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养，每3天半量换液；神经分化培养基B含有终浓度20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mMascorbic acid、100nM SU5402、200ng/ml BIBF1120、10μM IBMX和5mM glucose的Neurobasal培养基及不含vitamine A 的B27添加剂，其中，Neurobasal培养基和B27添加剂的用量比例是50:1；从第7天开始可以通过电生理及免疫荧光染色等方法检测神经细胞的成熟度，当达到目的功能指标后即可使用。
参见图1，图1为本发明提供的功能大脑皮层细胞的诱导分化方法的流程示意图，将hNSC或hNPC消化后进行诱导分化，在诱导分化第1天开始使用神经分化培养基A，第7天开始使用神经分化培养基B，第14天起即可检测到基本的神经细胞功能及成熟标志物，继续成熟即可获得人大脑神经细胞。其中，神经分化培养基A含有终浓度为2μM retinoic acid、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM ascorbic acid、100nM SU5402、200ng/ml BIBF1120、10μM IBMX和5mM glucose的Neurobasal及B27(不含vitamine A)培养基；神经分化培养基B含有终浓度为20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM ascorbic acid、100nM SU5402、200ng/ml BIBF1120、10μM IBMX和5mM glucose的Neurobasal及B27(不含vitamine A)培养基。
参见图2、图3和图4，图2是实施例1诱导分化第1、7、14及84天的人神经细胞的明场照片；图3是实施例1诱导分化第14天时单细胞膜片钳记录人神经细胞的动作电位示例，miniIPSC(抑制性神经发放)和miniEPSC(兴奋性神经发放)的示例；图4是实施例1诱导分化第14天所记录的细胞的兴奋及抑制性神经发放的幅度及频率的统计数据。由图2、图3和图4可知，采用本发明提供的方法14天即可获得具有兴奋性及抑制性神经元的神经细胞，具有电生理功能，且可以长期培养。
比较例1
与实施例1的差别在于，采用普通神经细胞培养基(含有20ng/ml BDNF、20ng/mlGDNF、0.2mM ascorbic acid及B27的Neurobasal培养基)代替神经分化培养基A和神经分化培养基B；
比较例2
与实施例1的差别在于，采用加拿大著名干细胞试剂公司StemCell technologies(CompA)的促进神经细胞电生理成熟度的培养基(BrainPhys)代替神经分化培养基A和神经分化培养基B。
比较例3
与实施例1的差别在于，采用美国著名的干细胞神经分化的教授所经营公司BrainXell(CompB)的促进神经细胞成熟度的培养基添加物(1:1000稀释)代替神经分化培养基A和神经分化培养基B的营养添加剂。
参见图5和图6，图5是实施例1及比较例1～3分化诱导第14天时单细胞膜片钳记录人神经细胞的sEPSC(自发性兴奋神经发放)的示例记录，从上到下依次是用比较例1、比较例2、比较例3和实施例1；图6是实施例1分化诱导第14天时人神经细胞的自发性神经发放的示例记录(由Axion Bioscience的MEA(Multi Electrode Array，多电极阵列电生理记录仪)记录得到)，可以看到经过软件的分析，找出了多个电极间簇状协同发放动作电位的关联。这代表着在第14天，实施例1提供的方法分化得到的神经细胞已经形成了一定的网状连接(更成熟的功能表现)，而在使用其他方法分化获得的细胞上均没有观测到这一现象(第14天)，并且根据已知的文献，其它分化方法及培养基培养得到人神经细胞甚至在分化2个月时都很难观测到这样的现象。
参见图7和图8，图7是实施例1及比较例1～3分化第14天时的MAP2荧光免疫染色结果，其中，由左到右依次为比较例1、比较例2、比较例3和实施例1，由上到下依次为明场照片、DAPI染色结果和MAP2染色结果，图8是实施例1及比较例1～3分化第14天时的MAP2荧光免疫染色结果柱状图，由左至右分别为比较例1、比较例2、比较例3和实施例1。
参见图9和图10，图9是实施例1及比较例1～3分化第14天时的Synapsin荧光免疫染色结果，其中，由左到右依次为比较例1、比较例3和实施例1，由上到下依次为Merge结果、MAP2染色结果、Synapsin染色结果；图10是实施例1及比较例1～3分化第14天时的Synapsin荧光免疫染色结果柱状图，由左至右分别为比较例1、比较例3和实施例1。
参见图11和图12，图11是实施例1及比较例1～3分化第21天时的vGlut荧光免疫染色结果，其中，由左到右依次为比较例1、比较例2、比较例3和实施例1，由上到下依次为Merge染色图、DAPI染色图、vGlut染色图；图12是实施例1及比较例1～3分化第21天时的vGlut荧光免疫染色结果柱状图，由左至右分别为比较例1、比较例2、比较例3和实施例1。
由图7～图12可知，本发明提供的方法能够快速获得具有兴奋性及抑制性神经元的神经细胞。
实施例2
步骤1、将人诱导多能干细胞系DYR0100分化所得到的神经前体细胞(hNPC)用accutase消化后，按5×105/cm2接种至poly-D-lysine和laminin包被好的细胞培养板上；
步骤2、从第1天开始使用神经分化培养基A在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养7天，每3天半量换液；所述神经分化培养基A含有终浓度为2μM retinoic acid、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM ascorbic acid、10μM SU5402的Neurobasal培养基及不含vitamineA的B27添加剂，其中，Neurobasal培养基和B27添加剂的用量比例是50:1；
步骤3、从第7天开始使用神经分化培养基B在37℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养，每3天半量换液；神经分化培养基B含有终浓度20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mMascorbic acid、10μM SU5402的Neurobasal培养基及B27添加剂(不含vitamine A)，其中，Neurobasal培养基和B27添加剂的用量比例是50:1；从第7天开始可以通过电生理及免疫荧光染色等方法检测神经细胞的成熟度，当达到目的功能指标后即可使用。
参见图13和图14，图13是实施例2及比较例1诱导分化第21天的人神经细胞的明场照片；图14是实施例2及比较例1诱导分化第21天时细胞的分散程度统计数据。
参见图15和图16，图15是实施例2及比较例1诱导分化第21天时的Synapsin荧光免疫染色结果柱状图；图16是实施例2及比较例1诱导分化第21天时的FOXG1荧光免疫染色结果柱状图；
参见图17,图17是实施例2及比较例1诱导分化第7天时人神经细胞的自发性神经发放的记录(由Axion Bioscience的MEA记录得到)统计结果。其中比较例1诱导分化的细胞在第7天没有检测到电生理信号。
由图13～图17可知，本发明提供的方法能够抑制细胞聚集，促进神经元成熟，使得神经细胞具有足够的距离空隙，有利于神经突起的生长，进一步成熟为功能性的真神经元。
实施例3
步骤1、将人诱导多能干细胞系DYR0100分化所得到的神经前体细胞(hNPC)用accutase消化后，按5×105/cm2接种至poly-D-lysine和laminin包被好的细胞培养板上；
步骤2、从第1天开始使用神经分化培养基A在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养7天，每3天半量换液；所述神经分化培养基A含有终浓度为2μM retinoic acid、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM ascorbic acid、5μM SU5402、50μM IBMX和10mM glucose的Neurobasal培养基及不含vitamine A的B27添加剂，其中，Neurobasal培养基和B27添加剂的用量比例是50:1；
步骤3、从第7天开始使用神经分化培养基B在37℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养，每3天半量换液；神经分化培养基B含有终浓度20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mMascorbic acid、5μM SU5402、50μM IBMX和10mM glucose的Neurobasal培养基及B27添加剂(不含vitamine A)，其中，Neurobasal培养基和B27添加剂的用量比例是50:1。结果显示与比较例1、比较例2和比较例3相比，实施例3提供的方法能够有效抑制细胞聚集。
实施例4
步骤1、将人诱导多能干细胞系DYR0100分化所得到的神经前体细胞(hNPC)用accutase消化后，按5×105/cm2接种至poly-D-lysine和laminin包被好的细胞培养板上；
步骤2、从第1天开始使用神经分化培养基A在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养7天，每3天半量换液；所述神经分化培养基A含有终浓度为2μM retinoic acid、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM ascorbic acid、5ng/ml BIBF1120、50μM IBMX和10mM glucose的Neurobasal培养基及不含vitamine A的B27添加剂，其中，Neurobasal培养基和B27添加剂的用量比例是50:1；
步骤3、从第7天开始使用神经分化培养基B在37℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养，每3天半量换液；神经分化培养基B含有终浓度20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mMascorbic acid、5ng/ml BIBF1120、50μM IBMX和10mM glucose的Neurobasal培养基及B27添加剂(不含vitamine A)，其中，Neurobasal培养基和B27添加剂的用量比例是50:1。结果显示与比较例1、比较例2和比较例3相比，实施例3提供的方法能够有效抑制细胞聚集。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种功能大脑皮层细胞诱导分化用培养基，包括神经细胞培养基和营养添加剂；
所述神经细胞培养基包括维甲酸、BDNF、GDNF、抗坏血酸、Neurobasal培养基和不含vitamine A的B27添加剂；
或者，所述神经细胞培养基包括BDNF、GDNF、抗坏血酸、Neurobasal培养基和不含vitamine A的B27添加剂；
所述营养添加剂包括80～120nM SU5402、150～250ng/ml BIBF1120、5～15μM IBMX和3～8mM的葡萄糖。
2.一种功能大脑皮层细胞的诱导分化方法，其特征在于，包括：
将神经干细胞或神经前体细胞消化后接种至细胞培养板上，第1天开始使用神经分化培养基A进行培养；第7天开始使用神经分化培养基B继续培养；
所述神经分化培养基A包括维甲酸、BDNF、GDNF、抗坏血酸、营养添加剂、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂；
所述神经分化培养基B包括BDNF、GDNF、抗坏血酸、营养添加剂、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂；
所述营养添加剂包括80～120nM SU5402、150～250ng/ml BIBF1120、5～15μM IBMX和3～8mM的葡萄糖。
3.根据权利要求2所述的诱导分化方法，其特征在于，所述营养添加剂包括100nMSU5402、200ng/ml BIBF1120、10μM IBMX和5mM的葡萄糖。
4.根据权利要求2～3任意一项所述的诱导分化方法，其特征在于，所述神经分化培养基A包括2μM维甲酸、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM抗坏血酸；
所述神经分化培养基B包括20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM抗坏血酸。
5.根据权利要求4所述的诱导分化方法，其特征在于，第1天开始使用神经分化培养基A进行培养，每3～5天半量换液；第7天开始使用神经分化培养基B继续培养，每3～5天半量换液。
6.根据权利要求5所述的诱导分化方法，其特征在于，将神经干细胞或神经前体细胞用accutase消化后按5×105/cm2接种至用poly-D-lysine和laminin包被的细胞培养板上。
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