JP6812967B2 - キレート化鉄を含む神経幹細胞用培地 - Google Patents
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Description
本発明は、キレート化鉄を含む、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞用培地、及び当該培地を用いた神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞培養方法等に関する。
非特許文献1には、神経幹細胞のインビトロでの培養方法として、ニューロスフィア(neurosphere)培養が記載されている。該文献では、上皮細胞成長因子(EGF)および塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を含む無血清培地中で神経幹細胞を浮遊培養することにより、神経幹細胞の未分化状態を維持し複分化能を保持したまま増殖させることが可能であることが示されている。
上記の接着単層培養においては、神経幹細胞は対称分裂を行い、自己複製することが報告されており、ニューロスフィア培養と比較して均一な細胞集団を提供可能であるという利点を有する。
[1] キレート化鉄を含む神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞用培地。
[2] 神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進用である、上記[1]に記載の培地。
[3] 神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の未分化維持用である、上記[1]又は[2]に記載の培地。
[4] 神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞が多能性幹細胞由来である、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の培地。
[5] キレート化鉄を含む神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞誘導用培地。
[6] 多能性幹細胞から神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を誘導するための培地である、上記[5]に記載の培地。
[7] キレート化鉄の含有量が3〜7ppbである、上記[1]〜[6]のいずれかに記載の培地。
[8] キレート化鉄が、鉄結合性タンパク質と結合した鉄である、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の培地。
[9] キレート化鉄が、鉄キレート剤と結合した鉄である、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の培地。
[10] キレート化鉄が、トランスフェリン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、フェリチン、デフェロキサミン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、フィチン酸、ニトリロ三酢酸(NTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、L−グルタミン酸二酢酸(GLDA)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(GEDTA)、トリエチレンテトラミン六酢酸(TTHA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、ジヒドロキシエチルグリシン(DHEG)からなる群より選択される少なくとも一種と結合した鉄である、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の培地。
[11] キレート化鉄の少なくとも一種が、トランスフェリンと結合した鉄である、上記[10]に記載の培地。
[12] トランスフェリンの培地中の含有量が0.5μg/ml以上6.5μg/ml以下である、上記[11]に記載の培地。
[13] トランスフェリンの培地中の含有量が0.1μg/ml以上1.8μg/ml以下である、上記[11]に記載の培地。
[14] キレート化鉄の少なくとも一種が、デフェロキサミン、クエン酸又はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)と結合した鉄である、上記[10]に記載の培地。
[15] 無血清培地である、上記[1]〜[14]のいずれかに記載の培地。
[16] 塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む、上記[1]〜[15]のいずれかに記載の培地。
[17] 培地中のbFGF量が10ng/ml以上200ng/ml以下である、上記[16]に記載の培地。
[18] 培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の培養方法。
[19] 培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を増殖させる方法。
[20] 培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の未分化維持方法。
[21] 神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞が多能性幹細胞由来である、上記[18]〜[20]のいずれかに記載の方法。
[22] 培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を誘導する方法。
[23] 多能性幹細胞から神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞へ誘導する方法である、上記[22]に記載の方法。
[24] キレート化鉄の含有量が3〜7ppbである、上記[18]〜[23]のいずれかに記載の方法。
[25] キレート化鉄が、鉄結合性タンパク質と結合した鉄である、上記[18]〜[24]のいずれかに記載の方法。
[26] キレート化鉄が、鉄キレート剤と結合した鉄である、上記[18]〜[24]のいずれかに記載の方法。
[27] キレート化鉄が、トランスフェリン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、フェリチン、デフェロキサミン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、フィチン酸、ニトリロ三酢酸(NTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、L−グルタミン酸二酢酸(GLDA)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(GEDTA)、トリエチレンテトラミン六酢酸(TTHA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、ジヒドロキシエチルグリシン(DHEG)からなる群より選択される少なくとも一種と結合した鉄である、上記[18]〜[24]のいずれかに記載の方法。
[28] キレート化鉄の少なくとも一種が、トランスフェリンと結合した鉄である、上記[27]に記載の方法。
[29] トランスフェリンの培地中の含有量が0.5μg/ml以上6.5μg/ml以下である、上記[28]に記載の方法。
[30] トランスフェリンの培地中の含有量が0.1μg/ml以上1.8μg/ml以下である、上記[28]に記載の方法。
[31] キレート化鉄の少なくとも一種が、デフェロキサミン、クエン酸又はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)と結合した鉄である、上記[27]に記載の方法。
[32] 上記[1]〜[17]のいずれかに記載の培地並びに神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を含んでなる培養組成物。
本明細書中、キレート化鉄とは、鉄キレート剤と結合した鉄、又は鉄結合性タンパク質と結合した鉄を指す。
キレート(chelate)とは、複数の配位座を持つ配位子(多座配位子)による金属イオンへの結合(配位)をいう。キレート化とは、配位子の有する2個以上の配位原子が、共に1つのイオン又は原子に配位して環状化合物を形成することを指す。配位とは、電子対供与体から電子対受容体への電子の供与のことをいい、配位によってできた結合を配位結合という。配位子(ligand)とは金属に配位する化合物を指す。配位子は孤立電子対を持つ基を有しており、この基が金属と配位結合する。配位子のうち、複数の配位基を持つ配位子を多座配位子という。配位原子とは、配位子を構成する元素の中で金属と直接結合する原子を指す。
キレート錯体とは、多座配位子と金属とが結合し形成された環状の化合物を指す。キレート錯体は配位子が複数の配位基を持っており、配位している物質から分離しにくい。
また、鉄と錯体を形成し得る物質であって、タンパク質以外の物質を鉄キレート剤と呼び、鉄と錯体を形成し得るタンパク質を鉄結合性タンパク質と呼ぶ。
本明細書中、鉄キレート剤と結合した鉄、又は鉄結合性タンパク質と結合した鉄は、それぞれ、鉄キレート剤と鉄キレート錯体を形成している鉄、又は鉄結合性タンパク質と鉄キレート錯体を形成している鉄を意味する。
鉄キレート剤又は鉄結合性タンパク質と鉄供給源とからあらかじめ錯体を形成させ、該錯体培地に添加する場合、本発明の培地に含まれるキレート化鉄の量は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、3〜7ppb、好ましくは4〜6ppbである。培地中のキレート化鉄の量は、例えば質量分析等の自体公知の方法によって測定できる。培地中のキレート化鉄の量は、例えば、実施例に記載の方法に準じて、誘導結合プラズマ質量分析装置を用いて高分子体の鉄量を測定することにより測定することができる。
デフェロキサミンの入手法の例としては、ストレプトマイセス属に属するデフェロキサミンB生産菌株、例えば、ストレプトマイセス ピロサス(Streptomyces pilosus;JCM4403、ATCC19797など)を培養することにより得ることができる他、Prolegらの方法(Helv Chim Acta、45,31,1962)により合成することも可能である。
鉄キレート剤としてクエン酸を用いる場合、培地に含まれるクエン酸の濃度は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約30μg/ml以下、好ましくは約3μg/ml以下であり、より好ましくは3μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約0.03μg/ml以上、好ましくは約0.3μg/ml以上、より好ましくは0.3μg/ml以上である。培地中のクエン酸の濃度範囲は約0.03〜30μg/ml、好ましくは約0.3〜3μg/ml、より好ましくは0.3〜3μg/mlである。
EDTAの塩としては、EDTA 2Na、EDTA 3Na、EDTA 4Na等のナトリウム塩、EDTA 2K、EDTA3Kなどのカリウム塩、マグネシウム塩、クロム酸塩、ナトリウムカルシウム塩などが挙げられる。本発明に使用するEDTAの塩は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくはナトリウム塩又はカリウム塩である。
鉄キレート剤としてEDTAを用いる場合、培地に含まれるEDTAの濃度は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約50μg/ml以下、好ましくは約5μg/ml以下、より好ましくは5μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約0.05μg/ml以上、好ましくは約0.5μg/ml以上、より好ましくは0.5μg/ml以上である。培地中のEDTAの濃度範囲は約0.05〜50μg/ml、好ましくは約0.5〜5μg/ml、より好ましくは0.5〜5μg/mlである。
鉄キレート剤としてフィチン酸を用いる場合、培地に含まれるフィチン酸の濃度は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約120μg/ml以下、好ましくは約12μg/ml以下、より好ましくは12μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約0.12μg/ml以上、好ましくは約1.2μg/ml以上、より好ましくは1.2μg/ml以上である。培地中のフィチン酸の濃度範囲は、約0.12〜120μg/ml、好ましくは約1.2〜12μg/ml、好ましくは1.2〜12μg/mlである。
ニトリロ三酢酸の塩としては、例えば、NTA・H・2Na(CAS No.15467−20−6)、NTA・3Na・H2O(CAS No.5064−31−3)、NTA・H・2(NH4)が挙げられるが、これらに限定されない。キレスト株式会社から販売されている、キレスト3NTB(NTA・H・2Na)、キレストNTA(NTA・3Na・H2O)、キレスト2NTA(NTA・3Na・H2O)、キレスト2NX−40(NTA・H・2(NH4))などを使用することもできる。
鉄キレート剤としてNTAを用いる場合、培地に含まれるNTAの濃度は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約30μg/ml以下、好ましくは約3μg/ml以下、より好ましくは3μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約0.03μg/ml以上、好ましくは約0.3μg/ml以上、より好ましくは0.3μg/ml以上である。培地中のNTAの濃度範囲は約0.03〜30μg/ml、好ましくは約0.3〜3μg/ml、より好ましくは0.3〜3μg/mlである。
DTPAの誘導体の例としては、非エステル結合性DTPA誘導体(特開平9−031037)、テトラ−アルキル基−DTPA(特開2006−342105)などが挙げられる。
DTPAの塩の例としてはナトリウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に使用するDTPAの塩は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくはナトリウム塩である。
鉄キレート剤としてDTPAを用いる場合、培地に含まれるDTPAの濃度は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約40μg/ml以下、好ましくは約4μg/ml以下、より好ましくは4μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約0.04μg/ml以上、好ましくは約0.4μg/ml以上、より好ましくは0.4μg/ml以上である。培地中のDTPAの濃度範囲は約0.04〜40μg/ml、好ましくは約0.4〜4μg/ml、より好ましくは0.4〜4μg/mlである。
GLDAの塩としては、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩、アンモニウム塩、アミン塩などが挙げられる。神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくは、GLDAの塩はナトリウム塩である。
鉄キレート剤としてGLDAを用いる場合、培地に含まれるGLDAの濃度は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約50μg/ml以下、好ましくは約5μg/ml以下、より好ましくは5μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約0.05μg/ml以上、好ましくは約0.5μg/ml以上、より好ましくは0.5μg/ml以上である。培地中のGLDAの濃度範囲は約0.05〜50μg/ml、好ましくは約0.5〜5μg/ml、より好ましくは0.5〜5μg/mlである。
HEDTAの塩としては、ナトリウム塩などが挙げられる。神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくは、HEDTAの塩は三ナトリウム塩(CAS No.139−89−9)である。
鉄キレート剤としてHEDTAを用いる場合、培地に含まれるHEDTAの濃度は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約50μg/ml以下、好ましくは約5μg/ml以下、より好ましくは5μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約0.05μg/ml以上、好ましくは約0.5μg/ml以上、より好ましくは0.5μg/ml以上である。培地中のHEDTAの濃度範囲は約0.05〜50μg/ml、好ましくは約0.5〜5μg/ml、より好ましくは0.5〜5μg/mlである。
GEDTAの塩としては、カリウム塩、ナトリウム塩などが挙げられる。GEDTAの誘導体の例としては、8−アミノ−2−[(2−アミノ−5−メチルフェノキシ)メチル]−6−メトキシキノリン−N,N,N’,N’−四酢酸(Org Biomol Chem.2008 Jul 7;6(13):2361−8.)が挙げられる。神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくは、GEDTAの塩はナトリウム塩である。
鉄キレート剤としてGEDTAを用いる場合、培地に含まれるGEDTAの濃度は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約50μg/ml以下、好ましくは約5μg/ml以下、より好ましくは5μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約0.05μg/ml以上、好ましくは約0.5μg/ml以上、より好ましくは0.5μg/ml以上である。培地中のGEDTAの濃度範囲は約0.05〜50μg/ml、好ましくは約0.5〜5μg/ml、より好ましくは0.5〜5μg/mlである。
TTHAの塩としては、ナトリウム塩などが挙げられる。神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくは、TTHAの塩はナトリウム塩である。
鉄キレート剤としてTTHAを用いる場合、培地に含まれるTTHAの濃度は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約110μg/ml以下、好ましくは約11μg/ml以下、より好ましくは11μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約0.11μg/ml以上、好ましくは約1.1μg/ml以上、より好ましくは1.1μg/ml以上である。培地中のTTHAの濃度範囲は約0.11〜110μg/ml、好ましくは約1.1〜11μg/ml、より好ましくは1.1〜11μg/mlである。
HIDAの塩としては、ナトリウム塩などが挙げられる。神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくは、HIDAの塩は二ナトリウム塩である。
鉄キレート剤としてHIDAを用いる場合、培地に含まれるHIDAの濃度は神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約30μg/ml以下、好ましくは約3μg/ml以下、より好ましくは3μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約0.03μg/ml以上、好ましくは約0.3μg/ml以上、より好ましくは0.3μg/ml以上である。培地中のHIDAの濃度範囲は約0.03〜30μg/ml、好ましくは約0.3〜3μg/ml、より好ましくは0.3〜3μg/mlである。
DHEGの塩としては、ナトリウム塩などが挙げられる。神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくは、DHEGの塩はナトリウム塩である。
鉄キレート剤としてDHEGを用いる場合、培地に含まれるDHEGの濃度は神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約30μg/ml以下、好ましくは約3μg/ml以下、より好ましくは3μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約0.03μg/ml以上、好ましくは約0.3μg/ml以上、より好ましくは0.3μg/ml以上である。培地中のDHEGの濃度範囲は約0.03〜30μg/ml、好ましくは約0.3〜3μg/ml、より好ましくは0.3〜3μg/mlである。
本明細書中、ホロトランスフェリンは、アポトランスフェリン1分子と鉄イオン1つが結合した分子、及びアポトランスフェリン1分子と鉄イオン2つが結合した分子を含む。
上記条件を達成することにより、所望の培地中のキレート化鉄量がもたらされるがこれらに限定されない。
鉄結合性タンパク質として、ラクトフェリンを用いる場合、培地に含まれるラクトフェリンの濃度は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約10μg/ml以下、好ましくは約5μg/ml以下であり、より好ましくは5μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約1μg/ml以上、好ましくは約2.5μg/ml以上、より好ましくは2.5μg/ml以上である。培地中のラクトフェリンの濃度範囲は約1〜10μg/ml、好ましくは約2.5〜5μg/ml、好ましくは2.5〜5μg/mlである。
ヘモグロビンαサブユニットをコードする核酸配列としてはNM_000558、NM_000517が、ヒトヘモグロビンαサブユニットのアミノ酸配列としてはNP_000549、NP_000508が挙げられるが、これらに限定されない。
ヘモグロビンβサブユニットをコードする核酸配列としてはNM_000518が、ヒトヘモグロビンβサブユニットのアミノ酸配列としてはNP_000509が挙げられるが、これらに限定されない。
ヘモグロビンδサブユニットをコードする核酸配列としてはNM_000519が、ヒトヘモグロビンδサブユニットのアミノ酸配列としてはNP_000510が挙げられるが、これらに限定されない。
ヘモグロビンγサブユニットをコードする核酸配列としてはNM_000184が、ヒトヘモグロビンγサブユニットのアミノ酸配列としてはNP_000175が挙げられるが、これらに限定されない。
鉄結合性タンパク質として、ヘモグロビンを用いる場合、培地に含まれるヘモグロビンの濃度は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約8μg/ml以下、好ましくは約4.8μg/ml以下、より好ましくは4.8μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約0.8μg/ml以上、好ましくは約3.2μg/ml以上、より好ましくは3.2μg/ml以上である。培地中のヘモグロビンの濃度範囲は約0.8〜8μg/ml、好ましくは約3.2〜4.8μg/ml、好ましくは3.2〜4.8μg/mlである。
鉄結合性タンパク質として、フェリチンを用いる場合、培地に含まれるフェリチンの濃度は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約50μg/ml以下、好ましくは約30μg/ml以下、より好ましくは30μg/ml以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約5μg/ml以上、好ましくは約20μg/ml以上、より好ましくは20μg/ml以上である。培地中のフェリチンの濃度範囲は約5〜50μg/ml、好ましくは約20〜30μg/ml、より好ましくは20〜30μg/mlである。
本明細書中、神経幹細胞とは、神経系細胞(神経細胞及びグリア細胞(アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど)、並びにそれらの前駆細胞)への複分化能(multipotency)を維持し、自己複製能を有する未分化な細胞を意味する。具体的には、神経幹細胞とは、神経細胞及びグリア細胞(アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど)を最終的に生み出す能力を有し、かつ、初期化などの特別な操作を加えない限りにおいて、表皮系細胞、血球系細胞、筋肉細胞等の神経系以外の細胞を実質的に生み出さない細胞である。実質的に生み出さないとは、神経幹細胞の生み出す細胞のうち、90%以上が、神経細胞及びグリア細胞(アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど)、並びにそれらの前駆細胞のいずれかである状態を指す。
多能性幹細胞由来の神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞は自体公知の方法により、入手できる。多能性幹細胞由来の神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を作製する方法としては、多能性幹細胞の浮遊培養を行い胚葉体形成を経由して神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を形成させる方法(Bain Gら,Dev Biol.1995 Apr;168(2):342−57など)、ストローマ細胞等をフィーダー細胞として使い多能性幹細胞を培養する方法、bFGFを含む無血清培地中で多能性幹細胞の浮遊培養を行う方法(Watanabe Kら,Nat Neurosci.2005 Mar;8(3):288−96など)、SMADシグナル阻害剤Noggin及びSB431542の存在下で多能性幹細胞(ES細胞等)を接着培養する方法(Chambers SMら,Nat Biotechnol.2009 Mar;27(3):275−80)、単層培養した多能性幹細胞(ES細胞等)を、glycogen synthase kinase 3(GSK3)阻害剤、transforming growth factor β(TGF−β)阻害剤、Notchシグナル阻害剤存在下で培養する方法(Li Wら,Proc Natl Acad Sci USA.2011 May 17;108(20):8299−304)などが挙げられる。
好ましくは、本発明に用いられる神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞は、ES細胞又は人工多能性幹細胞由来であり、より好ましくは人工多能性幹細胞由来である。
また、神経幹細胞は、神経幹細胞で発現することが知られている遺伝子、その転写産物、タンパク質など(神経幹細胞マーカー)により確認することもできる。
神経幹細胞マーカーとしては、細胞骨格タンパク質であるネスチン(Nestin;Science,276,66(1997))、SOX1(SRY(sex determining region Y)−box1)、SOX2(SRY(sex determining region Y)−box2)、Pax6(paired box 6)、Ki67、増殖細胞核抗原(PCNA)、脂肪酸結合タンパク質7(Fabp7、BLBPともいう)などが知られており、当業者は、これらのマーカーを適宜組み合わせて所望の神経幹細胞であることを確認することができる。本発明に適した神経幹細胞としては、例えば、SOX2陽性かつネスチン陽性である細胞が挙げられるが、これに限定されない。
神経前駆細胞で発現する遺伝子としては、Tbr2(T−box brain protein 2)、MASH1(Mammalian achaete−scute homolog 1)、ネスチン等が挙げられる。本発明に適した神経前駆細胞としては、SOX2陰性かつネスチン陽性である細胞が挙げられるが、これに限定されない。
分化した神経細胞のマーカーの例としては、βIIIチューブリン、MAP2(microtubule−associated protein)等が挙げられる。
本発明の一実施形態として、本発明は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の培養用の培地を提供する。本発明の培地は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の未分化性及び多分化能を維持させ、増殖を促進させる効果を有する。別の実施形態として、本発明の培地は、多能性幹細胞からの神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の誘導を効率化する作用を有する。本発明の培地は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の未分化性及び多分化能を維持させ増殖を促進させるため、誘導された少数の神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を効果的に増殖させることができ、その結果、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の誘導を効率化することができる。本発明の一実施形態として、本発明の培地は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の未分化維持用であり、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進用である。別の実施形態として、本発明の培地は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の誘導用であり、多能性幹細胞から神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の誘導用である。
本発明の培地は、必須アミノ酸(L−リジン、L−ロイシン、L−イソロイシン、L−トレオニン、L−バリン、L−フェニルアラニン、L−ヒスチジン、L−トリプトファン)を含む。本発明の培地は、好ましくは、L−セリン、L−シスチン、グリシン、L−システイン、L−プロリン、L−メチオニン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン酸及びL−アラニン、L−グルタミン、L−アルギニン、L−チロシン、L−アスパラギンを含む。
本発明の培地は、イノシトール、塩化コリン、葉酸、D−パントテン酸カルシウム、チアミン(ビタミンB1)、ピリドキシン(ビタミンB6)、ナイアシンアミド、ビタミンB12、リボフラビン(ビタミンB2)、D−ビオチン、D−グルコース、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチン、チミジン、リポ酸、プトレシン塩酸塩から成る群より選択される培地添加物を1以上、好ましくは2以上、より好ましくは3以上、さらに好ましくは4以上含む。
本発明において培地中のbFGFの量の上限値は、所望の効果を達成し得る限り制限されないが、好ましくは1000ng/ml以下、より好ましくは500ng/ml以下、さらに好ましくは200ng/ml以下である。
本発明において培地中のbFGFの量の下限値は、所望の効果を達成し得る限り制限されないが、好ましくは0.1ng/ml以上、より好ましくは1ng/ml以上、さらに好ましくは10ng/ml以上である。
本発明において培地中のbFGFの量は、所望の効果を達成し得る限り制限されないが、好ましくは0.1ng/ml〜1000ng/ml、より好ましくは1ng/ml〜500ng/ml、さらに好ましくは10ng/ml〜200ng/mlである。
一態様として、本発明の培地は、bFGF(終濃度10ng/ml〜200ng/ml)を含む。また、本発明の培地は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の分化を促進させる効果を有する物質(本明細書中、神経分化促進物質ともいう)を実質的に含まないことが好ましい。
神経分化促進物質の例としては、BDNF(Brain−derived neurotrophic factor)、GDNF(Glial cell line−derived neurotrophic factor)、cAMP(Cyclic adenosine monophosphate)、dbcAMP(dibutyryl cAMP)、DAPT(tert−butyl (2S)−2−[[(2S)−2−[[2−(3,5−difluorophenyl)acetyl]amino]propanoyl]amino]−2−phenylacetate)、compound E(N−[(1S)−2−[[(3S)−2,3−Dihydro−1−methyl−2−oxo−5−phenyl−1H−1,4−benzodiazepin−3−yl]amino]−1−methyl−2−oxoethyl]−3,5−difluorobenzeneacetamide)、SU5402(2−[(1,2−Dihydro−2−oxo−3H−indol−3−ylidene)methyl]−4−methyl−1H−pyrrole−3−propanoic acid)、SU6668(3−[2,4−dimethyl−5−[(E)−(2−oxo−1H−indol−3−ylidene)methyl]−1H−pyrrol−3−yl]propanoic acid; Orantinib; 3−[2, 4−dimethyl−5−[(E)−(2−oxo−1H−indol−3−ylidene)methyl]−1H−pyrrol−3−yl] propanoic acid)が挙げられる。
神経分化促進物質を実質的に含まないとは、神経分化促進物質が含まれていても神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の分化を促進し得ない量であり、用いる神経分化促進物質の種類によって適宜設定される。より好ましくは、本発明の培地に含まれる神経分化促進物質の濃度は、0μMである。
本発明の一実施形態として、本発明は、キレート化鉄を培地に添加することを特徴とする神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の培養方法を提供する。当該方法は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を増殖させ、未分化を維持する方法でもある。別の実施形態として、多能性幹細胞等からの神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の誘導を効率化する方法を提供する。本発明の方法は、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の未分化性及び多分化能を維持させ増殖を促進させるため、誘導された少数の神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を効果的に増殖させることができ、その結果、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の誘導を効率化することができる。
神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を4日以上続けて培養する場合、3日に一回、好ましくは2日に一回培地を交換することが好ましい。
接着培養により神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を培養する場合、培養器は細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス(ECM)等の任意の細胞支持用基質又はそれらの機能をミミックする人工物でコーティングされたものであり得る。細胞支持用基質は、幹細胞又はフィーダー細胞(用いられる場合)の接着を目的とする任意の物質であり得る。
(5)キレート化鉄を含む培地並びに神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を含む培養組成物
本発明はさらに上記本発明の培地並びに神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を含んでなる、培養組成物(本明細書中、本発明の培養組成物ともいう)を提供する。該培養組成物は、細胞を培養することにより得られる結果物を含む。本発明の培養組成物に関連する各用語の定義及び態様は、上記に記載したものと同一である。
(1)Long−term self−renewing neuro epithelial−like stem cells(以下LtNES細胞)誘導法
iPS細胞よりEBを形成し、4日間、E6培地(Life TechnologiesまたはSTEMCELL Technologies)からアスコルビン酸及びトランスフェリンを除いた組成に相当する培地にホロトランスフェリン(終濃度0.5〜10μg/ml)、エタノールアミン(終濃度5〜50μM)、bFGF(終濃度5〜100ng/ml)を添加した培地中にて、4日間で培養した。ポリLオルニチン(PO)コートしたdishにEBを播種し、上記培地中で10日程度培養し、Rosette様の構造が形成されることを確認した。Rosette部分をくり抜き、ニューロスフィアとして上記培地中で浮遊培養を7日程度行った。ニューロスフィアをトリプシン/EDTAにて分散し、PO/ラミニンコートしたdish上でRHB−A培地中にて培養し、LtNES細胞を作成した。LtNES細胞は、神経幹細胞及び神経前駆細胞が混在したものである。
なお、上記E6培地(Essential 6培地)については、Life Technologies社ホームページ<URL:http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A1516401>において、E8培地をベースとした製法で作られ、bFGFとTGFβを含まないことが記載されている。なお、E8培地(Essential 8培地)については、Nat Methods 2011 May;8(5):424−429)に記載されている。
また、上記E6培地の成分は、Stem Cells. 2014 Apr;32(4),1032−42の要約中にも記載されている。
ヒト多能性幹細胞より誘導したLtNES細胞は、RHB−A培地、20ng/ml bFGF中にて、37℃、5%CO2環境下で培養を行った。LtNES細胞の継代には、TrypLE Select内で、37℃、1分間インキュベートを行い、培地で希釈し、その後ピペッティングを行い、単一の細胞とした。1.5x105cells/well(6well plate)で上記培地中に分散させた細胞を播種し37℃、5%CO2環境下で培養を行った。細胞数測定は、トリパンブルー(ライフテクノロジーズ社)による死細胞染色を行った上で、血球計算盤で行った。
E6培地(Life TechnologiesまたはSTEMCELL Technologies)からアスコルビン酸及びトランスフェリンを除いた組成に相当する培地に、アルブミン(終濃度0.5〜5mg/ml)、エタノールアミン(終濃度5〜50μM)、bFGF(終濃度5〜100ng/ml)を添加して、被検基礎培地を作成した。
被検基礎培地に、ホロトランスフェリン(Sigma Aldrich)を終濃度0、1.0、2.5、5、7.5μg/mlとなるように添加した被検培地を作成した。
各被検培地を用い、ヒト多能性幹細胞より誘導したLtNES細胞を培養した。細胞の培養は、37℃、5%CO2雰囲気下のインキュベーター内で行った。2日に一度培地交換を行い、4〜5日間培養した。培養後、被検培地の代わりにTrypLE Selectを添加し、37℃、1分間インキュベートして細胞分散処理を行った。TrypLE Selectを培地で希釈後、ピペッティングを行い、単一の細胞とし、細胞数をカウントし、評価した。細胞数測定は、トリパンブルー(ライフテクノロジーズ社)による死細胞染色を行った上で、血球計算盤で行った。
結果を図1に示す。2.5μg/mlホロトランスフェリン添加培地、5μg/mlホロトランスフェリン添加培地において細胞数が最も増加し、1μg/mlホロトランスフェリン添加培地においても細胞は良好な増殖を示した。
尚、本実施例で用いたホロトランスフェリンの鉄含有量を測定したところ、トランスフェリンサンプル(1mg/mlトランスフェリン)中の高分子体の鉄量は380ppbであった。トランスフェリン 1mg/mlに対して結合できる鉄量(飽和)は、計算値では1400ppbである。従って、本実施例で用いたホロトランスフェリンは、トランスフェリンに対する鉄結合率が約27%であることがわかった。
ホロトランスフェリン(Tf)の添加による神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進が、鉄量の増加に依存するのか検討するため、各被検培地に含まれる鉄量の測定を行った。また、鉄以外のMn、Ni、Co、Cu、Zn、Seの量についても測定した。
各被検培地を希釈し、誘導結合プラズマ質量分析装置(以下、ICP−MS、Thermo Fisher Scientific Inc.)に導入して、各元素を検出し、外部検量線法にて定量を実施した。
結果を表1に示す。
次に培地に含有される鉄量を鉄の形態別に測定した。
培地中の形態別鉄量分析を行うため、SEC−ICP−MS(サイズ排除クロマトグラフィー(SEC、Thermo Fisher Scientific Inc.)を接続したICP−MS、アジレントテクノロジー社)を行った。培地をサイズ排除クロマトグラフィーに導入し、溶離液をオンラインで結合したICP−MSにて分析した。ICP−MSにて各元素を検出し、外部検量線法にて定量を実施した。
結果を表2に示す。
ホロトランスフェリン添加培地にて良好な増殖を示した細胞が神経幹細胞であることを免疫組織化学染色を行い実証した。
実施例1と同様に、終濃度2.5μg/mlとなるようにホロトランスフェリンを添加した培地を作成し、実施例1と同様の条件で培養を行った。培養後、細胞を固定し、神経幹/前駆細胞マーカーであるネスチンに対する抗体及び神経幹細胞マーカーであるSOX2に対する抗体を用いて免疫染色を行った。結果を図3に示す。
培養皿上の細胞は、ほぼ全て細胞が神経幹細胞及び神経前駆細胞マーカーであるネスチン陽性であった。そのうちの大部分の細胞が神経幹細胞マーカーであるSOX2陽性であった。従って、実施例2において良好な増殖を示した細胞は、ネスチン陽性SOX2陽性である神経幹細胞であることが示唆された。
実施例1と同様に、終濃度2.5μg/mlとなるようにホロトランスフェリンを添加した培地を作成し、実施例1と同様の条件で培養を行った。培養後、培地の代わりにTrypLE Selectを添加し、37℃、1分間インキュベートして細胞分散処理を行った。TrypLE Selectを培地で希釈後、ピペッティングを行い、ポリLオルニチン/フィブロネクチンでコートした48ウェルプレートに1.5x105 cells/wellで播種した。Media hormone mix培地に1xB27サプリメントを添加した培地中で20日間培養した。細胞の培養は、37℃、5%CO2雰囲気下のインキュベーター内で行った。培地交換は2日に一度行った。
培養後、細胞を固定し、神経細胞マーカーであるβIIIチューブリンに対する抗体を用いた蛍光抗体法により免疫染色を行った。
分化誘導後の細胞には、βIIIチューブリン陽性である分化した神経細胞が含まれていることが示された。
Claims (20)
- キレート化鉄を含む神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞用培地であって、キレート化鉄の含有量が3〜7ppbであり、キレート化鉄がトランスフェリンと結合した鉄である、培地。
- 神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖促進用である、請求項1に記載の培地。
- 神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の未分化維持用である、請求項1又は2に記載の培地。
- 神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞が多能性幹細胞由来である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の培地。
- キレート化鉄を含む神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞誘導用培地であって、キレート化鉄の含有量が3〜7ppbであり、キレート化鉄がトランスフェリンと結合した鉄である、培地。
- 多能性幹細胞から神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を誘導するための培地である、請求項5に記載の培地。
- トランスフェリンの培地中の含有量が0.5μg/ml以上6.5μg/ml以下である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の培地。
- トランスフェリンの培地中の含有量が0.1μg/ml以上1.8μg/ml以下である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の培地。
- 無血清培地である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の培地。
- 塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の培地。
- 培地中のbFGF量が10ng/mL以上200ng/mL以下である、請求項10に記載の培地。
- 培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の培養方法であって、培地中のキレート化鉄の含有量が3〜7ppbであり、キレート化鉄がトランスフェリンと結合した鉄である、方法。
- 培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を増殖させる方法であって、培地中のキレート化鉄の含有量が3〜7ppbであり、キレート化鉄がトランスフェリンと結合した鉄である、方法。
- 培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の未分化維持方法であって、培地中のキレート化鉄の含有量が3〜7ppbであり、キレート化鉄がトランスフェリンと結合した鉄である、方法。
- 神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞が多能性幹細胞由来である、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を誘導する方法であって、培地中のキレート化鉄の含有量が3〜7ppbであり、キレート化鉄がトランスフェリンと結合した鉄である、方法。
- 多能性幹細胞から神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞へ誘導する方法である、請求項16に記載の方法。
- トランスフェリンの培地中の含有量が0.5μg/ml以上6.5μg/ml以下である、請求項12〜17のいずれか一項に記載の方法。
- トランスフェリンの培地中の含有量が0.1μg/ml以上1.8μg/ml以下である、請求項12〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の培地並びに神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を含んでなる培養組成物。
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