PT1651754E - Cultura de células de mieloma em meio de baixo teor de ferro e isento de transferrina. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Cultura de células de mieloma em meio de baixo teor de ferro e isento de transferrina"

Introdução A presente invenção refere-se a um método para crescer certas células de mamífero num meio de cultura contendo ferro mas na ausência de transferrina ou de um quelante lipófilo ou quelante contendo azoto sintético.

Antecedentes

Os meios de cultura de células devem proporcionar os nutrientes necessários para manter e crescer células num meio ambiente, artificial e in vitro, controlado. As características particulares dos meios de cultura de células dependem em grande medida do tipo de células a ser cultivadas e, em menor grau, do método de cultura.

As células de mamífero têm uma necessidade absoluta de ferro, o qual, in vitro, é fornecido no meio de cultura de células. Bertheussen (Cytotechnology 11:219-231, 1993) comentou que o ferro não pode ser eficazmente fornecido às células de mamífero simplesmente adicionando sais de ferro ao meio de cultura de células, essencialmente devido ao ferro disponível para as células ser reduzido por oxidação rápida e precipitação do ferro. 0 ferro na forma livre, além disso, tem um potencial oxidativo elevado, que pode resultar na oxidação de componentes de um meio de cultura de células. Provou-se assim, ser benéfico complexar o ferro de modo a reduzir ou eliminar este potencial oxidativo.

In vivo, o ferro é apresentado às células de mamífero pela proteína de ligação ao ferro, transferrina. A transferrina actua ligando o ferro e interagindo com um receptor de transferrina na superfície da célula. 0 complexo transferrina-ferro é então incorporado na célula por endocitose. Uma vez na célula, o complexo transferrina-ferro é 2

ΕΡ 1 651 754 /PT degradado e o ferro libertado é então complexado com uma proteína transportadora de ferro (ferritina). A transferrina é reciclada. Thorstensen e Romslo, Biochem. j., 271:1-10 (1990) oferecem uma revisão excelente sobre este mecanismo de transferência de ferro in vivo. A capacidade da transferrina mediar o transporte de ferro para as células foi explorado em cultura de células pela adição simples de transferrina e um sal de ferro ao meio de cultura de células.

No entanto, a transferrina tipicamente utilizada no meio de cultura de células é de origem animal e em anos recentes tem havido uma pressão reguladora crescente para remover proteínas de origem animal de processos de cultura de células. Claramente, a utilização de proteínas de origem animal acarreta o risco de introduzir contaminantes e patogénios fortuitos, tais como a doença de Creutzfeld-Jakob (CJD) ou encefalopatia espongiforme (doença das vacas loucas). Deste modo, foram pesquisados transportadores de ferro alternativos à transferrina e aplicados com vários graus de sucesso. Verificou-se que o tipo e concentração de qualquer transportador de ferro alternativo é muitas vezes dependente do tipo de célula de mamífero a ser cultivada.

Kovar e Franek (Biotechnology Letters 9:259-264 (1987)) demonstraram que vários compostos de ferro solúveis, tais como citrato férrico, podem ser utilizados em vez da ferritina na cultura de linhas celulares de hibridoma. Kovar e Franek testaram a capacidade do citrato férrico suportar o crescimento de duas linhas celulares de hibridoma numa gama de concentrações de 5 μΜ (1,25 mg/1) a 5 mM (1225 mg/1). Embora tenha sido proposto na arte anterior que concentrações mais baixas de compostos férricos são adequadas para utilização em meios de cultura para várias linhas celulares diferentes (em particular as de origem leucémica ou epitelial humana) Kovar e Franek referem que no caso de se utilizar citrato férrico para suportar o crescimento de células de hibridoma de fora equivalente à ferritina, este era necessário numa concentração de 500μΜ (122,5 mg/1). Kovar e Franek verificaram que o meio contendo citrato férrico 500 μΜ era adequado para a cultura de outras linhas celulares de hibridoma e era também adequado para a cultura de vários tipos de células de mieloma. 3

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Eto, et al., (Agric. Biol. Chem. 55(3):863-865 (1991)), descrevem observações semelhantes às de Kovar e Franek. Estes investigadores testaram o efeito estimulador de crescimento do citrato férrico numa gama de concentrações de 10 mg/1 a 600 mg/1 numa linha celular de hibridoma. Referem que se utilizaram 300 mg/1 para outros estudos. Observou-se um crescimento equivalente ao que se obtém com transferrina quando se adicionou etanolamina (um precursor lipídico) numa concentração de 10 μΜ ao meio contendo citrato férrico 300 mg/1.

Num estudo semelhante, Toyoda & Inouye, (Agric. Biol. Chem. 55(6):1631-1633 (1991)), testaram o crescimento de três linhas celulares de hibridoma em meios contendo citrato férrico numa gama de concentrações de 0 a 500 μΜ. Referem que para duas das três linhas celulares de hibridoma testadas se verificou que o citrato férrico 50 μΜ (12,5 mg/1) era óptimo. Este resultado é contrário ao observado por Eto et al., e Kovar e Franek, embora se tenha verificado que uma concentração de 500 μΜ era óptima para a terceira linha celular.

No entanto, é importante notar que o trabalho de Kovar & Franek, Toyoda & Inouye, e Eto et al. foi todo realizado em cultura estática. A WO 94/02592 refere que embora o citrato férrico de amónio (FAC) 10 mg/1 fosse capaz de suportar o crescimento de hibridoma em cultura estática, este não era o caso em cultura em suspensão agitada. É evidente, portanto, que a capacidade das células de hibridoma fazerem um uso óptimo do ferro quando crescidas em cultura em suspensão agitada é diferente de quando em cultura estática.

Em WO 93/00423 descreve-se um meio de cultura aditivo compreendendo um quelato de ferro de um sal de ferro solúvel e um citrato de metal alcalino ou metal alcalino-terroso que é uma fonte de ferro adequada para meios de cultura isentos de soro, ou isentos de proteína. Os exemplos deste pedido referem-se essencialmente ao crescimento de células de mamífero, tais como células BHK e CHO. Embora o Exemplo 5 sirva para demonstrar o crescimento de células de mieloma, deve notar-se que as células SP2/0 utilizadas são, de facto, células de hibridoma ratinho/ratinho não segregantes. As 4

ΕΡ 1 651 754 /PT condições de cultura são especificadas como sendo de uma cultura em suspensão estática.

Kovar e Franek reivindicam que o seu meio contendo citrato férrico 500 μΜ era adequado para cultura em suspensão agitada, mas não apresentam evidências para suportar esta reivindicação. Qi et al., (Cytotechnology 21:95-109 (1996)), no entanto, referem que um meio contendo citrato férrico 500 μΜ (122,5 mg/1), como descrito por Kovar e Franek, era adequado para a cultura de três linhas celulares de hibridoma em culturas em suspensão agitada. No entanto, Qi et al. verificaram que de modo a utilizar um meio contendo estas concentrações elevadas de citrato férrico (500 μΜ), era necessário fazer o desmame das células deste meio; no caso de uma linha celular, este período de desmame era bastante prolongado. Qi et al. comentam que nestas condições as células tinham dificuldade em se adaptar e que a formulação do meio podia ser melhorada por substituição do citrato férrico no meio com um composto apresentador de ferro mais eficaz, tal como ácido auritricarboxilico.

Em acordo com a arte anterior citada por Kovar e Franek (1987), vários investigadores têm referido que alguns tipos de células de mamífero são sustentáveis em cultura utilizando concentrações mais baixas de compostos de ferro.

Ramos et al., na WO 92/05246, referem que na cultura de linhas celulares epiteliais e em particular em linhas celulares de ovário de Hamster chinês (CHO), a transferrina pode ser substituída por citrato férrico a 10-100 mg/1 (fornecendo aproximadamente 0,6-16 mg/1 de ferro). No entanto, este pedido de patente afirma claramente que se verificou que o meio não era adequado para a cultura de linhas celulares de mieloma. Keen et al., US 5,633,162, referem que o citrato férrico, sulfato ferroso e citrato férrico de amónio (FAC) podem ser utilizados em concentrações entre 0,25 e 5 mg/1 (equivalente a 0,04 a 0,8 mg/1 de fero) para substituir a transferrina na cultura de células CHO.

Em WO 98/08934 define-se um meio de substituição em que todas as proteínas animais, í.e. transferrina e insulina foram substituídas. A transferrina foi substituída por sulfato 5

ΕΡ 1 651 754 /PT ferroso quelatado com um composto quelante contendo azoto em concentrações, com base no ferro, entre 0,28 e 11 mg/1, tendo-se verificado que 1,1 mg/1 é óptimo. Os compostos quelantes contendo azoto descritos como adequados incluem: ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA); ácido etilenoglicol-bis(β-aminoetiléter)-Ν,Ν,Ν',N'-tetra-acético (EGTA); mesilato de desferroxamina; ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA) e ácido trans-1,2-diaminociclo-hexano-N, N,N', N'-tetra-acético (CDTA) . De entre estes, o EDTA é o mais preferido. O citrato férrico também foi utilizado na forma de FeCl3-citrato de sódio, mas este era necessário em concentrações mais elevadas do que o quelato de sulfato ferroso.7H20-EDTA.

Este pedido refere que o meio isento de transferrina é adequado para crescer células de mamífero, em particular células epiteliais ou fibroblastos. Foram proporcionados exemplos de crescimento de CHO e da linha celular de rim embrionário humano 293.

Neumiposannova et al., (In vitro Cell Dev. Biol., 31:625-632 (1995)) também testaram uma gama de tipos de células para crescimento a longo prazo em meio contendo ferro na forma de citrato férrico, na concentração baixa de 1,25 mg/1 (aproximadamente 0,2 mg/1 de ferro). Das 19 linhas celulares testadas, apenas 5 foram capazes de crescer a longo prazo neste meio com baixo teor de ferro. As 5 linhas celulares eram

Jurkat, Jlll e THP-1 (linhas celulares de leucemia humana), HeLa (uma linha celular epitelial humana) e XC (um sarcoma de rato) . Embora as linhas celulares de hibridoma e células de mieloma estivessem incluídas entre as linhas testadas, nenhuma mostrou ser capaz de crescer no meio de baixo teor de ferro.

Como discutido acima, as concentrações mais baixas de compostos férricos são adequados para utilização em meios de cultura para alguns tipos de células (em particular os de origem epitelial e leucémica humana). No entanto, é geralmente aceite na arte que, de modo a cultivar células de hibridoma em cultura em suspensão agitada utilizando um meio isento de transferrina, é necessária uma concentração elevada, por exemplo, na gama de 122,5 mg/1, de um composto de ferro. 6

ΕΡ 1 651 754 /PT A arte anterior também ensina, no entanto, que concentrações elevadas de ferro não são vantajosas. Bertheussen, em Cytotechnology 11:219-231(1993), afirma que não deverão utilizar-se concentrações elevadas de ferro, tais como o citrato férrico 500 μΜ sugerido por Kovar e Franek, uma vez que estas concentrações elevadas provocam a precipitação rápida de hidróxido de ferro no meio. O hidróxido de ferro formado de fresco absorve outros metais e várias moléculas orgânicas eficazmente, pelo que a composição e estabilidade dos meios contendo um teor de ferro elevado serão fortemente afectadas.

Tendo em conta as dificuldades encontradas no fornecimento de ferro a determinadas células de mamífero em cultura, em particular a células de hibridoma, foi desenvolvido o conceito de quelação do ferro, e.g. com compostos lipófilos.

Os quelantes de ferro são tipicamente compostos heterocíclicos que ligam o ião metálico por ligações coordenadas a pelo menos dois iões não metálicos no quelante e podem ser classificados utilizando vários critérios, tais como a sua origem (moléculas produzidas sintética ou biologicamente), a sua interacção com solventes, tais como água (hidrófobos versus hidrófilos) ou a sua interacção estequiométrica (bidentado ou hexadentado).

Os quelantes lipófilos são compostos que têm duas propriedades distintas: (1) os compostos são hidrófobos e muitas vezes aromáticos exibindo assim solubilidade em solventes orgânicos (e.g. álcool) mas têm uma solubilidade limitada em água; (2) os compostos têm também, tipicamente, uma região de carga negativa que permite a "ligação" de ferro através de interacções electrostáticas com iões de ferro carregados positivamente. Em cultura de células pensa-se que estes compostos serão atraídos para as membranas ricas em lípidos das células e irão, portanto, transportar ferro "ligado" para e possivelmente através da membrana celular, facilitando assim o fornecimento de ferro às células (US 5045468) . Os quelantes lipófilos são tipicamente adicionados em excesso em relação a um sal de ferro acompanhante. 7

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Uma das primeiras descrições da utilização de um quelante lipófilo foi feita por Brock e Stevensen (Immunology Letters 15:23-25, (1987)) que utilizaram piridoxalisonicotinoil- hidrazona (PIH) em conjunção com nitrilotriacetato férrico. Verificaram que o PIH:nitriloactato férrico numa razão de 2:1 e uma concentração de 40 μΜ (com base no PIH) podia substituir a transferritina para a cultura de linhas celulares de linfócitos de ratinho.

Darfler, (US 5045468/in Vitro Cell. Dev. Biol. 26:769-778, 1990) descrevem um meio isento de proteínas adequado para a cultura de linhas celulares de hibridoma. O autor verificou que a transferrina podia ser substituída utilizando o composto de organoferro, nitroprussiato de sódio (SNP), juntamente com EDTA, nas concentrações de 5,7 e 5,5 mg/1 respectivamente. O autor designou este meio por "meio ABC".

Bertheussen, (US 5045467/Cytotechnology 11:219-231 (1993)), descreveram que a transferritina em meios de cultura de células podia ser substituída pela utilização de ácido auritricarboxílico, um quelante de ferro lipófilo e iões férricos 3μΜ (adicionados na forma de FeCl3). Bertheussen desenvolveu este meio utilizando vários tipos de células e verificou que este era especialmente adequado para a cultura de linhas celulares de hibridoma de crescimento rápido. A wo 94/02592 propôs a utilização de tropolona para substituir a função da transferritina na apresentação de ferro às células em cultura em suspensão agitada. O autor comenta que a tropolona deverá ser adicionada em excesso relativamente ao ferro acompanhante. O ferro pode estar presente na forma de iões férricos ou ferrosos, utilizando uma variedade de compostos de ferro, sendo FAC o mais preferido. Utilizou-se uma linha celular de hibridoma para demonstrar que as concentrações óptimas de tropolona e FAC são 5 μΜ e 0,2 mg/1, respectivamente. Este meio também era adequado para o crescimento de células de mieloma NSO. Meramente como controlos experimentais, testaram-se meios sem transferrina e tropolona, mas contendo FAC, com células de hibridoma e mieloma. Verificou-se que o FAC isolado, entre 0,1 e 10 mg/1, era incapaz de suportar o crescimento de células de hibridoma em cultura em suspensão agitada. O FAC isolado numa 8

ΕΡ 1 651 754 /PT concentração de 0,2 mg/1 não conseguia suportar o crescimento das linhas celulares de mieloma NSO. Não foram investigadas outras concentrações de FAC isolado com as linhas celulares de mieloma: presumivelmente, os autores assumiram que o NSO e as linhas celulares de hibridoma se comportam de modo semelhante e não esperavam que outras concentrações de FAC suportassem o crescimento celular.

Keen (Cytotechnology 17:193-202, 1995) descreve o desenvolvimento de um meio isento de proteínas para a cultura de células de mieloma de rato e hibridoma de rato. Este meio, designado por W38, baseava-se numa mistura 1:1:1 de DMEM, RPMI e do meio ABC desenvolvido por Darfler. O meio continha assim SNP como fonte lipófila de ferro e EDTA como quelante contendo azoto. O SNP e EDTA estavam, no entanto, a 1/3 da concentração encontrada no meio ABC e Keen verificou que era benéfico aumentar a concentração de ferro incluindo citrato férrico no meio. O meio W38 também era adequado para a cultura da linha celular de mieloma auxotrófica de colesterol, NSO, desde que fosse assegurada uma provisão adequada para as necessidades de colesterol (Keen e Steward, Cytotechnology 17:203-211, 1995).

Um pedido de patente recente de Epstein et al., WO 01/16294, comenta que em muitos casos os transportadores de ferro simples, tais como o citrato, não proporcionam uma disponibilidade de ferro suficiente para, ou incorporação pelas células cultivadas. A patente também descreve que uma gama de compostos quelantes de ferro lipófilos pode ser utilizada para uma variedade de tipos de células, com diferentes graus de sucesso. No entanto, resultados pelo menos tão bons quanto os da transferrina apenas foram obtidos com sorbitol quelatado com FeCl3 e N-óxido de 2-hidroxipiridina. A utilização de compostos lipófilos para quelar e auxiliar na apresentação de ferro em cultura isenta de transferrina de tipos de células de hibridoma e mieloma tornou-se assim um estado da arte. Há, no entanto, várias desvantagens em incluir quelantes lipófilos no meio de cultura de células. Os quelantes lipófilos são muitas vezes tóxicos, por exemplo, o SNP está classificado como altamente tóxico e tem uma LD50 no rato <1 mg/kg. Em linhas celulares utilizadas para a produção industrial de produtos bioterapêuticos, isto 9

ΕΡ 1 651 754 /PT tem consequências quer para os operadores de fabrico, quer para o produto final. De facto, poderá ser necessário desenvolver e validar testes para provar que o produto bioterapêutico purificado final está isento de qualquer quelante lipófilo contaminante. Adicionalmente, a optimização da concentração de ferro de qualquer processo particular será também complicada devido ao sistema de dois componentes de quelante e composto de ferro.

Em resumo, a arte anterior mostra que: 1. na ausência de transferrina, as células de hibridoma e mieloma irão crescer em concentrações de ferro elevadas (citrato férrico a 122,5 mg/1) (Kovar & Franek). 2. concentrações elevadas de ferro (e.g. citrato férrico a 122,5 mg/1) provocam precipitação o que danifica o meio de cultura (Bertheussen). 3. Na ausência de transferrina ou de um quelante lipófilo, as células de hibridoma não irão crescer em cultura agitada e as células de mieloma não irão crescer de todo em concentrações de ferro baixas (0,1-10 mg/1 e 0,2 mg/1 respectivamente) (WO 94/02592) . 4. É necessário um quelante lipófilo no meio, para permitir que as células de hibridoma e mieloma cresçam em cultura agitada em baixas concentrações de ferro (WO 94/02592). 5. Podem-se utilizar baixas concentrações de ferro para crescer algumas células de mamífero, mas apenas com a utilização de um quelante contendo azoto, tal como EDTA (WO 98/08934).

Na arte de cultura de células tem-se em conta que alguns tipos de células partilham atributos nutricionais semelhantes. É de notar que ambos os tipos de células de mieloma e hibridoma partilham atributos significativos que nem sempre são exibidos por outros tipos de células, por exemplo auxotrofia de glutamina (Bebbington et al. Biotechnology 10:169-175, 1992). O facto de os hibridomas e mielomas 10

ΕΡ 1 651 754 /PT reagirem de um modo semelhante em muitos aspectos não é, em certa medida, surpreendente, uma vez que as linhas celulares de hibridoma são produzidas por fusão de uma célula de mieloma com um anticorpo que produz linfócitos B (Kohler e Milstein, Nature 256:495-497,1975). A arte anterior, como referido acima, mostrou que a capacidade das células de hibridoma e mieloma utilizarem o ferro presente no meio com um transportador de ferro simples, tal como um citrato e na ausência de transferrina ou de um quelante lipófilo ou contendo azoto é diferente da capacidade correspondente de, por exemplo, células CHO. Os ensinamentos globais da arte anterior são que as células de hibridoma e mieloma são iguais na sua capacidade de utilizar o ferro num meio isento de transferrina.

Torna-se evidente a partir da literatura, como discutido acima, que se tem dedicado tempo e esforço ao desenvolvimento de meios isentos de transferrina para o crescimento de tipos de células de hibridoma, em particular em cultura estática. Sendo assumido na arte que as células de mieloma irão demonstrar as mesmas necessidades que as células de hibridoma a este respeito, não foi feito um esforço equivalente com células de mieloma.

Ao longo dos anos, torna-se evidente que a arte de cultura de células de hibridoma e mieloma se tem afastado da utilização de ferro na forma de um composto de ferro solúvel, como substituição para transferrina, e, pelo contrário, determinou-se que para ter os benefícios de concentrações baixas de ferro se deve incluir no meio de cultura um quelante lipófilo ou contendo azoto. Obviamente, a utilização destes quelantes em meios utilizados para crescer células para obter o produto para o qual foram manipuladas para produzir também requer que o produto seja posteriormente tratado para assegurar que não há contaminação com esse quelante. A inclusão de um quelante deste tipo no meio de cultura não só prolonga o tempo utilizado para demonstrar que o produto é puro, mas também aumenta o custo de produção ao necessitar do desenvolvimento de testes específicos para demonstrar que um quelante de ferro "tóxico" não está a contaminar o produto puro. 11

ΕΡ 1 651 754 /PT É evidente, portanto, que ainda existe a necessidade de proporcionar ferro numa forma simples para algumas células em cultura, em concentrações que irão proporcionar ferro suficiente para permitir a continuação do crescimento celular, mas que não irão resultar no dano de precipitação acima discutido. Outra vantagem seria ter um meio isento de transferrina e quelantes lipófilos ou contendo azoto. 0 objectivo seria obter uma cultura de células equivalente num meio isento de transferrina e quelante lipófilo ou contendo azoto, tal como seria obtido num meio contendo transferrina.

Sumário da invenção

De modo a satisfazer a necessidade de proporcionar um meio isento de transferrina que suporta o crescimento de algumas células, a presente invenção proporciona inter alia um método para a cultura de células de mieloma sob cultura em suspensão agitada num meio contendo ferro, mas que não possui transferrina, nem um quelante lipófilo ou contendo azoto sintético. A presente invenção mostra, surpreendentemente e ao contrário das indicações da arte anterior, que os requisitos de ferro de uma célula de mieloma são diferentes dos de uma célula de hibridoma, obtendo-se o resultado inesperado de que as células de mieloma apresentam um crescimento contínuo em concentrações de ferro no meio até 100 vezes inferiores às necessárias para as células de hibridoma. Outra vantagem do método da presente invenção é demonstrada pelo título melhorado de produto de células de mieloma obtido quando as células são cultivadas em meio com concentrações de ferro baixas.

Descrição das Figuras

Figura 1: A Figura la ilustra a capacidade de uma linha celular de mieloma crescer em várias concentrações de citrato férrico de amónio sob condições de cultura em suspensão agitada e a Figura lb mostra a quantidade de anticorpo produzido por uma linha celular de mieloma crescida em várias concentrações de citrato férrico de amónio. A Figura lc mostra os dados de crescimento de um duplicado desta experiência. 12

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Figura 2: A Figura 2a ilustra o crescimento de uma linha celular de mieloma em várias concentrações de citrato férrico sob condições de cultura em suspensão agitada e a Figura 2b mostra a contagem de células e titulos de anticorpo da linha celular assim crescida.

Figura 3: A Figura 3a ilustra o crescimento de uma linha celular de hibridoma em várias concentrações de citrato férrico de amónio sob condições de cultura em suspensão agitada e a Figure 3b mostra a contagem de células e a

Figura 3c mostra uma comparação derivada matematicamente do crescimento da linha celular assim crescida.

Figura 4: A Figura 4a ilustra o crescimento de uma linha celular de mieloma num meio rico isento de transferrina, isento de soro, em várias concentrações de citrato férrico de amónio sob condições de cultura em suspensão agitada.

Figura 5: ilustra a capacidade do citrato férrico de amónio proporcionar todo o ferro necessário para o crescimento de uma linha celular de mieloma sob condições de crescimento de fermentação em suspensão agitada.

Figura 6: ilustra a capacidade do citrato férrico de amónio proporcionar todo o ferro necessário para o crescimento de uma linha celular de mieloma num meio isento de proteínas e num meio isento de soro, sob condições de fermentação em suspensão agitada.

Figura 7: ilustra que a capacidade de uma linha celular de mieloma crescer com citrato férrico de amónio como única fonte de ferro não é devida à transfecção com o sistema de selecção de GS.

Figura 8A: ilustra o crescimento de uma linha celular de mieloma alternativa num meio isento de proteínas, suplementado com citrato férrico de amónio, numa fermentação à escala laboratorial.

Figura 8B: ilustra o crescimento de uma linha celular de mieloma num meio isento de proteínas suplementado com citrato 13 ΕΡ 1 651 754 /PT férrico de amónio numa fermentação de alimentação por lotes à escala piloto de 100L.

Figura 9: ilustra o crescimento de outra linha celular de mieloma num meio isento de proteínas suplementado com citrato férrico de amónio numa fermentação à escala laboratorial.

Figura 10: ilustra o crescimento de outra linha celular de mieloma num meio isento de proteínas suplementado com citrato férrico de amónio numa fermentação de alimentação por lotes à escala piloto de 100L.

Nas Figuras 8A, 8B, 9 e 10, tal como nas outras Figuras, o eixo dos x define o tempo em dias e o eixo dos y define o número de células viáveis (x 105 células/ml).

Descrição detalhada da invenção

De acordo com o acima exposto, a presente invenção proporciona no seu primeiro aspecto, um método para a cultura in vitro de uma linha celular de mieloma, que compreende: (a) inocular um meio de cultura com uma linha celular de mieloma em que o referido meio é capaz de suportar o crescimento da referida linha celular de mieloma e compreende ferro em concentrações no meio de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 3,2 mg/L, em que o referido meio não contém transferrina, um quelante lipófilo, um quelante contendo azoto sintético, ou um quelante contendo azoto sintético lipófilo; e (b) crescer o meio de cultura inoculado sob condições adequadas e utilizando uma cultura em suspensão agitada.

Numa concretização deste aspecto, a presente invenção proporciona um método para a cultura in vitro de uma linha celular de mieloma que compreende: (a) inocular um meio de cultura com uma linha celular de mieloma, em que o referido meio é capaz de suportar o crescimento da referida linha celular de mieloma e compreende citrato férrico de amónio numa concentração no meio de cerca de 0,2 mg/L a cerca de 20 mg/L, em que o referido meio não contém transferrina, um quelante 14

ΕΡ 1 651 754 /PT lipófilo um quelante contendo azoto sintético ou um quelante contendo azoto sintético, lipófilo; e (b) crescer o meio de cultura inoculado sob condições adequadas e utilizando uma cultura em suspensão agitada.

Num segundo aspecto, a presente invenção proporciona um processo para obter um produto de células de mamífero compreendendo cultivar uma célula de mieloma capaz de produzir o referido produto num meio de cultura capaz de suportar o crescimento da referida linha celular de mieloma, em que o referido meio de cultura compreende ferro em concentrações no meio de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 3,2 mg/L, em que o referido meio não contém transferrina, um quelante lipófilo, um quelante contendo azoto sintético ou um quelante contendo azoto sintético, lipófilo e recuperar o referido produto de células de mamífero.

Ainda noutro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de um meio de cultura para suportar o crescimento in vitro de uma linha celular de mieloma, em que o meio de cultura compreende ferro em concentrações no meio de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 3,2 mg/L, em que o referido meio não contém transferrina, um quelante lipófilo, um quelante contendo azoto sintético ou um quelante contendo azoto sintético, lipófilo.

Numa concretização destes aspectos da invenção, o meio contém citrato férrico de amónio numa concentração no meio de cerca de 0,2 mg/L a cerca de 20 mg/L.

Na presente invenção, o meio de cultura é capaz de suportar o crescimento de uma linha celular de mieloma. Por "suportar o crescimento" entende-se o crescimento contínuo das células em múltiplas subculturas, com pelo menos uma duplicação e, de preferência, triplicação do número de células em cada passagem, i.e., de uma subcultura para a próxima. O número de subculturas não é essencial para a presente invenção e depende, por exemplo, da duração da experiência a ser realizada, ou do produto produzido. Na presente invenção, é geralmente preferido que as células apresentem um crescimento contínuo ao longo de pelo menos 2 subculturas e, de preferência, ao longo de pelo menos 3 subculturas. 15

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Uma célula de mieloma, também conhecida como célula linfóide, é um linfócito canceroso que é tipicamente imortal sob condições de crescimento normais. Os tipos de células de mieloma são úteis uma vez que são parceiros de fusão excelentes para a produção de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais. Em anos recentes, a importância dos tipos de células de mieloma como células hospedeiras na tecnologia de genes recombinantes tornou-se bastante significativa. Isto é particularmente o caso com a utilização do marcador seleccionável de glutamina-sintetase, que é utilizado com um hospedeiro do mieloma NSO para produzir linhas celulares recombinantes estáveis, de produção elevada (Barnes et al. Cytotechnology 32: 109-123, 2000).

Na presente invenção prevê-se que se possa utilizar qualquer linha celular de mieloma no meio de cultura. É geralmente preferido que a linha celular de mieloma seja proveniente de ratinho e, nesse caso, é particularmente preferido que o mieloma seja uma linha celular NSO ou uma linha celular da série de P3, muito preferencialmente uma linha celular NSO (tal como ECACC 85110503) . Outros mielomas de ratinho incluem a série MOPC, MPC-11, J558L, K6H6/B5, e 45.6.TG1.7. O método da invenção também pode ser utilizado para a cultura de tipos de células de mieloma de rato e humano. As linhas celulares de mieloma de rato adequadas para utilização no método da invenção incluem Y0 e Y, e as linhas celulares de mieloma humano adequadas incluem HTK, RPMI 8226 e U266B1.

Quando a linha celular de mieloma é uma célula NSO, é geralmente preferido que a linha celular seja transfectada utilizando o sistema de expressão de glutamina-sintetase. O meio de cultura de células da presente invenção não contém nem transferrina, nem um quelante lipófilo, nem um quelante contendo azoto sintético, nem um quelante contendo azoto sintético, lipófilo. Os quelantes lipófilos podem ser definidos para os fins da presente invenção como quelantes que têm duas propriedades distintas: (1) são hidrófobos, sendo fracamente solúveis ou insolúveis em água, ou num meio de cultura de células e são muitas vezes aromáticos e (2) têm uma região de carga negativa que permite a "ligação" de ferro 16

ΕΡ 1 651 754 /PT através de interacções electrostáticas com iões de ferro carregados positivamente. Exemplos de quelatos lipófilos são a tropolona e nitroprussiato de sódio. Para os fins da presente invenção, os quelantes contendo azoto sintéticos podem ser definidos como compostos de ligação ao ferro contendo na sua estrutura pelo menos um átomo de azoto. Estes compostos podem ser hidrófobos ou hidrófilos. Por "sintético", a este respeito, pretende significar-se que os quelantes contendo azoto não ocorrem naturalmente, i.e. não podem ser normalmente encontrados na natureza. Os quelantes contendo azoto que ocorrem naturalmente que são produzidos sinteticamente não estão incluídos nesta definição e não são excluídos dos métodos e utilizações da presente invenção. Estes quelantes contendo azoto sintéticos incluem, mas não se limitam a, compostos tais como ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA); ácido etilenoglicol-bis(β-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetra- acético (EGTA); mesilato de desferoxamina; ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) e ácido trans-1,2-diaminociclo-hexano-N,N,N',N'-tetra-acético (CDTA). Também se excluem dos métodos e utilizações da presente invenção os compostos que podem ser quer quelantes lipófilos, quer quelantes contendo azoto sintéticos. A composição exacta do meio não é importante para a presente invenção, desde que o meio não contenha transferrina, quelante lipófilo, quelante contendo azoto sintético, ou quelante contendo azoto sintético, lipófilo, mas contenha ferro nas concentrações referidas acima e desde que o meio seja capaz de suportar o crescimento de uma linha celular de mieloma, como anteriormente definido.

Tipicamente, o meio de cultura de células incluirá fontes de aminoácidos, vitaminas, sais orgânicos e inorgânicos e açúcares. Os compostos capazes de proporcionar estes requisitos essenciais para o crescimento estão normalmente disponíveis e a sua incorporação nos meios para o crescimento celular está no âmbito dos conhecimentos de um perito na arte, com base na informação disponível na arte. É geralmente preferido que o meio de cultura de células se baseie num meio basal conhecido ou seu derivado, que irá suportar o crescimento contínuo das células de mamífero. Estes 17

ΕΡ 1 651 754 /PT meios basais estão comummente disponíveis. Exemplos de meios basais adequados que podem ser suplementados para proporcionar o meio da presente invenção incluem meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), meio F12 de Hams, meio de Dulbecco modificado da Iscove e Roswell Park Memorial Institute (RPMI). 0 meio da presente invenção pode ser isento de soro, isento de proteínas, isento de componentes de origem animal ou quimicamente definido.

Numa alternativa, o meio de cultura de células pode ser produzido a partir de primeiros princípios por combinação dos componentes específicos necessários para o crescimento contínuo.

Quando se prepara um meio de cultura de células para um tipo de célula ou linha celular específico, um meio basal será tipicamente modificado ou suplementado, dependendo dos requisitos do tipo/linha celular particular. A escolha dos suplementos está no âmbito dos conhecimentos do perito na arte e não constitui um aspecto essencial da presente invenção. Tipicamente, estes suplementos podem incluir lípidos (e.g. colesterol e ácidos gordos), precursores lipídicos (e.g. etanolamina) promotores de crescimento ou reguladores (e.g. insulina), elementos vestigiários (e.g. selénio), polímeros (e.g. Pluronic F-68) e glutamina no caso de tipos de células dependentes de glutamina.

Um exemplo de um meio ao qual se pode adicionar uma fonte de ferro de modo a proporcionar ferro ao meio nas concentrações referidas acima, para o tornar adequado para utilização na presente invenção é um meio de cultura de células baseado em CDSS, descrito por Qi et al. em Cytotechnology 21:95-109 (1996). Este meio, conhecido como CDSS modificado, baseia-se em DMEM/F12 (1:1) (Gibco BRL. lx líquido N.° cat. 21331) com as seguintes adições: suplemento GS (JRH N.° cat. 58672) 40 ml/L; elementos vestigiários de Clevelands I (Cellgro 99-175) 0,5 mVL; elementos vestigiários de Clevelands II (Cellgro 99-176) 1 ml/L; sulfato de zinco 2 μΜ; selenito de sódio 50 nM; Etanolamina 20 μΜ; Pluronic F68 lg/L; bicarbonato de sódio 1,3 g/L e ácido clorídrico 2 M 3,6 ml/L. O meio também contém glutamina 6 mM para linhas 18

ΕΡ 1 651 754 /PT celulares que não são capazes de crescer de forma independente da glutamina e concentrado lipídico de colesterol 2 ml/L (Gibco N.° cat. 00-0061) para linhas celulares NSO. O meio de cultura de células da presente invenção compreende ferro numa concentração no meio de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 3,2 mg/L. Numa concretização preferida, a fonte de ferro no meio de cultura é um composto de ferro solúvel. A quantidade de composto de ferro solúvel utilizado deverá ser suficiente para proporcionar ferro a essa concentração ao meio e, desde que a quantidade de ferro no meio esteja nessa gama, deverá ser suficiente para suportar o crescimento das células. A concentração exacta do composto de ferro solúvel no meio pode variar, dependendo do composto de ferro solúvel especifico utilizado e da linha celular utilizada e/ou de outros componentes do meio presentes. A concentração adequada pode ser determinada de um modo linear, por exemplo realizando experiências em pequena escala de acordo com a prática convencional, tal como uma resposta à dose de composto de ferro solúvel num meio particular com uma linha celular particular.

Na presente invenção, a concentração de ferro no meio, de preferência fornecido por um composto de ferro solúvel, é de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 3,2 mg/L, de preferência de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 2,4 mg/L, mais preferencialmente de cerca de 0,064 mg/L a cerca de 1,6 mg/L e muito preferencialmente de cerca de 0,16 mg/L a cerca de 0,32 mg/L.

Numa concretização preferida da presente invenção, a fonte de ferro no meio é um composto de ferro solúvel. Os compostos de ferro solúveis adequados são solúveis em água ou no meio de cultura de células, mas exibem uma solubilidade limitada em solventes orgânicos. Estes compostos estão normalmente disponíveis para o perito na arte, para o qual é linear a determinação de solubilidade. A presente invenção também prevê a utilização de qualquer fonte de ferro alternativa, desde que a fonte de ferro seja capaz de proporcionar ferro suficiente às células para permitir o crescimento continuo na ausência de transferrina ou um quelante lipófilo ou quelante contendo azoto, sintético. 19

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Os compostos de ferro solúveis adequados para fornecimento de ferro e assim para utilização na presente invenção, incluem sais férricos e ferrosos ou seus quelatos simples. Deve notar-se que "quelatos simples", tal como aqui utilizado, não inclui os quelantes lipófilos ou quelantes contendo azoto sintéticos discutidos acima. 0 termo "quelatos simples" é aqui utilizado de um modo comparável à utilização do termo "transportadores de ferro simples" em vários artigos da arte anterior.

Exemplos de sais férricos ou ferrosos ou seus quelatos simples que podem ser a fonte de ferro no meio de cultura para os métodos e utilizações da invenção, incluem sulfato ferroso, citrato ferroso, citrato férrico e compostos férricos de amónio. Preferem-se para utilização na presente invenção compostos férricos de amónio. Compostos férricos de amónio específicos, adequados para utilização na presente invenção incluem citrato férrico de amónio, oxalato férrico de amónio, fumarato férrico de amónio, malato férrico de amónio e succinato férrico de amónio. É particularmente preferido para utilização na presente invenção o citrato férrico de amónio.

Embora o meio da presente invenção possa conter mais do que uma fonte de ferro, por exemplo uma mistura de compostos contendo ferro adequados, é geralmente preferido que quando a fonte de ferro é um composto de ferro solúvel haja apenas um destes compostos no meio.

Numa concretização preferida da presente invenção, o composto de ferro solúvel é citrato férrico de amónio. Tipicamente, nesta concretização e de modo a fornecer ferro para o meio na gama de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 3,2 mg/L, o citrato férrico de amónio será utilizado em concentrações de cerca de 0,2 mg/L a cerca de 20 mg/L, de preferência de cerca de 0,2 mg/L a cerca de 15 mg/L, mais preferencialmente de cerca de 0,4 mg/L a cerca de 10 mg/L e muito preferencialmente de cerca de 1 mg/L a cerca de 2 mg/L.

Numa concretização preferida da presente invenção, o meio de cultura contém um composto férrico de amónio. Os resultados da presente invenção demonstraram que estes compostos férricos de amónio, em particular o citrato férrico de amónio, são 20

ΕΡ 1 651 754 /PT utilizados mais eficazmente pelas células do que, por exemplo, o citrato férrico. Em particular, quando se utiliza o citrato férrico, este deverá estar presente a 10 vezes a concentração de um composto férrico de amónio num meio de cultura equivalente. Isto é demonstrado pelas Figuras 1 e 2 da presente invenção, a partir das quais é evidente que para o crescimento celular continuo durante pelo menos 3 passagens, o citrato férrico deverá estar presente em concentrações de pelo menos 10 mg/L, enquanto que o citrato férrico de amónio proporciona o mesmo nivel de crescimento em concentrações de 0,2 mg/L. Também é de notar que o titulo de anticorpo é melhor em concentrações de ferro mais baixas. O meio de cultura de células da presente invenção pode ser preparado por mistura adequada dos componentes individuais, utilizando prática convencional. Os meios também podem ser preparados em diferentes formas, tais como uma forma liquida ou como um meio em pó seco para reconstituição antes de utilização. Os meios de cultura da presente invenção são estáveis quando armazenados sob condições adequadas.

Deste modo, a presente invenção também proporciona um método para a preparação de um meio de cultura de células capaz de suportar o crescimento in vitro de uma linha celular de mieloma, em que o referido meio compreende ferro em concentrações no meio desde cerca de 0,03 mg/L a cerca de 3,2 mg/L, em que o referido meio não contém transferrina, quelante lipófilo, quelante contendo azoto sintético, ou quelante contendo azoto sintético, lipófilo; que compreende a mistura dos seus componentes individuais. O meio de cultura de células da presente invenção é adequado para utilização numa variedade de condições de cultura. Assim, o meio pode sustentar o crescimento de uma linha celular de mieloma em monocamada e suspensão, em particular em cultura em suspensão agitada. A cultura em suspensão agitada pode ser definida como uma cultura de células em que uma suspensão homogénea de células no meio de cultura é sustentada por meio de uma força de agitação. Os meios para aplicar uma força de agitação são bem conhecidos na arte e incluem, por exemplo, um impulsor mecanicamente agitado e/ou injecção de gás para culturas em biorreactor e a 21

ΕΡ 1 651 754 /PT manutenção de frascos de culturas de células numa plataforma com agitação recíproca. 0 meio de acordo com a invenção é particularmente adequado para a cultura de células em cultura em suspensão agitada, í.e. em suspensão utilizando um recipiente de cultura agitada adequado, por exemplo um tanque agitado ou fermentador airlift, utilizando técnicas de cultura conhecidas.

Deste modo, a presente invenção também proporciona um meio de cultura capaz de suportar o crescimento em cultura em suspensão agitada de uma linha celular de mieloma, em que o meio compreende ferro numa concentração no meio de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 3,2 mg/L, em que o meio não contém transferrina, quelante lipófilo, quelante contendo azoto sintético, ou quelante contendo azoto sintético, lipófilo. A arte anterior ensinou que os tipos de células de mieloma e hibridoma têm os mesmos requisitos no que se refere a ferro num meio de cultura. Os nossos resultados indicam que não é isto que acontece. A Figura 3 ilustra o crescimento de uma linha celular de hibridoma num meio de cultura contendo citrato férrico de amónio. Como se pode ver nesta figura, o crescimento das células de hibridoma corresponde ao esperado na arte, í.e. há um bom crescimento das células em concentrações elevadas de citrato férrico de amónio (50 mg/L e 100 mg/L), mas não em concentrações mais baixas deste composto de ferro solúvel (inferiores a 10 mg/L). Quando isto é comparado com a Figura 1, que ilustra o crescimento de células de mieloma em meios com concentrações equivalentes de um composto de ferro solúvel, torna-se evidente que as células de hibridoma requerem aproximadamente 100 vezes mais de ferro no meio do que as células de mieloma, para um crescimento comparável.

Outra vantagem dos métodos da presente invenção é o título melhorado de um produto de células de mieloma quando a célula de mieloma é cultivada num meio contendo um baixo teor de ferro, i.e. quando a linha celular é cultivada de acordo com o método da invenção. Os exemplos a seguir demonstram que o título do produto de células de mieloma é inesperadamente mais elevado quando a concentração de ferro no meio é baixa, 22

ΕΡ 1 651 754 /PT por exemplo entre 0,03 mg/L e 3,2 mg/L, de preferência entre 0,16 mg/L e 0,32 mg/L.

Os produtos celulares que podem ser obtidos de acordo com a invenção incluem quaisquer produtos que são produzidos por células de mamífero cultivadas. Os produtos típicos incluem, por exemplo, polipéptidos e proteínas, por exemplo imunoglobulinas tais como anticorpos monoclonais e recombinantes e seus fragmentos, hormonas, tais como eritropoietina e hormona de crescimento, e.g. hormona de crescimento humana, linfóquinas, tais como interferão, interleucinas, tais como interleucina 2, 4, 5 e 6 e enzimas industrial e terapeuticamente úteis, tais como activador de plasminogénio tecidular. Os métodos para a manipulação de células de mieloma por técnicas genéticas recombinantes de modo a elas serem capazes de produzir os referidos produtos celulares são amplamente utilizados e estão normalmente disponíveis na arte.

De modo a obter produtos celulares, as células de mieloma capazes de produzir estes produtos são crescidas no meio da invenção. As condições para o crescimento dependerão, por exemplo, da linha celular a ser utilizada e do produto a ser produzido, mas serão facilmente determinadas utilizando conhecimentos disponíveis na arte.

Para este fim, a presente invenção também proporciona a utilização de um meio de cultura compreendendo ferro em concentrações no meio de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 3,2 mg/L, em que o referido meio não contém transferrina, um quelante lipófilo, um quelante contendo azoto sintético, ou um quelante contendo azoto sintético, lipófilo; para a preparação de um produto de células de mamífero.

Os métodos para o isolamento do produto celular a ser produzido a partir das células de mieloma e/ou meio de cultura são bem conhecidos e de prática comum na arte.

Todas as referências aqui mencionadas são expressamente incorporadas para referência na sua totalidade. Deve entender-se que apesar da invenção ter sido descrita em conjunção com as concretizações acima referidas, a descrição anterior e os 23 ΕΡ 1 651 754 /PT exemplos seguintes pretendem ilustrar e não limitar o âmbito da invenção. Outros aspectos, vantagens e modificações no âmbito da invenção serão evidentes para os peritos na arte a quem se dirige a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: o citrato férrico de amónio (FAC) a 0,2 mg/L é capaz de suportar o crescimento contínuo de linhas celulares GS-NSO Métodos

Uma linha celular de mieloma de ratinho GS-NSO recombinante (linha celular A) que expressa um anticorpo IgG humano utilizando o sistema de expressão de glutamina-sintetase (GS) (fascículo de patente europeia No. 2560550) previamente subcultivada num meio isento de soro próprio (meio GSF) contendo uma fonte de ferro quelatado foi centrifugada e ressuspensa em meio isento de quelante. As células ressuspensas neste meio foram então utilizadas para inocular frascos experimentais a uma densidade de inoculação de 2 x 105 células/ml. A experiência foi realizada utilizando frascos Erlenmeyer de 250 ml (volume de trabalho entre 20 e 50 ml) com tampas ventiladas incubados num agitador recíproco a 36,5°C e 125 rpm, com uma atmosfera de C02 a 5%/ar a 95% e 75% de humidade.

Os frascos individuais contendo meio CDSS modificado foram suplementados utilizando soluções mãe de FAC para se obterem frascos contendo FAC em concentrações finais de 0,2, 0,4, 1, 2, 10, 50 e 100 mg/L. As soluções mãe de FAC foram preparadas em água em concentrações de 0,5 (para frascos contendo 0,2 a 2 mg/L de FAC) e 25 mg/L (para frascos contendo 10 a 100 mg/L de FAC). As soluções mãe foram esterilizadas por filtração antes da adição ao frascos.

Um frasco contendo meio CDSS modificado suplementado com transferrina humana 1 mg/L e FAC 0,1 mg/L foi incluído como controlo positivo. Um frasco contendo meio CDSS modificado sem 24

ΕΡ 1 651 754 /PT qualquer suplemento de ferritina ou FAC foi incluído como controlo negativo. Todos os frascos foram suplementados com 2 ml/L de concentrado lipídico de colesterol (Gibco) como fonte de colesterol. 0 concentrado lipídico de colesterol é uma emulsão de colesterol e ácidos gordos complexados com ciclodextrina.

Os frascos foram subcultivados três vezes de modo a minimizar quaisquer efeitos de arrastamento do ferro quelatado/armazenado do inoculo. Os frascos foram subcultivados por diluição com meio fresco de volta para 2 x 105 células/ml a intervalos de 3 dias. Na terceira subcultura, deixaram-se os frascos seguir o ciclo de crescimento completo até se atingir uma viabilidade baixa (isto é muitas vezes designado por sobrecrescimento). As contagens de células foram realizadas utilizando um contador de células Innovatis Cedex. 0 título de anticorpo foi determinado utilizando um ELISA sanduíche contra um padrão de IgG homólogo.

Resultados A Figura la mostra a concentração de células durante a subcultura e crescimento final para a gama de concentrações de FAC testadas. Esta figura mostra claramente que a cultura de controlo negativo não era capaz de proliferar para além da primeira subcultura. A cultura contendo FAC a 0,2 mg/L FAC era capaz de proliferar após a primeira divisão, mas era em seguida incapaz de crescer mais. O facto de estas culturas serem capazes de crescer após a inoculação inicial é provavelmente resultado do armazenamento de ferro pelas células, que requer depleção por divisão celular. A Figura la também mostra claramente que concentrações iguais a e em excesso de 0,4 mg/L eram capazes de suportar o crescimento celular contínuo em várias subculturas e durante a cultura de sobrecrescimento. A Figura lc mostra que num duplicado desta experiência, uma concentração de FAC de 0,2 mg/L era capaz de suportar um crescimento celular contínuo. 25

ΕΡ 1 651 754 /PT A Figura lb mostra os dados de contagem de células e produção de anticorpos para as culturas de sobrecrescimento, a partir dos primeiros duplicados. Esta figura mostra que o crescimento equivalente ao controlo contendo transferrina, em termos de número máximo de células viáveis e a área sob a curva de crescimento, foi alcançado com concentrações de FAC de 1 mg/L e superiores. Isto indica que após se atingir um nível limiar (1 mg/L), o crescimento é bastante equivalente ao longo de uma vasta gama de concentrações de FAC. No entanto, numa concentração de FAC de 10 mg/L, observou-se uma pequena quantidade de precipitado cor de ferrugem. A 50 e 100 mg/L este precipitado foi observado em quantidades muito maiores. Este precipitado é presumivelmente hidróxido de ferro, como alertado por Bertheussen (Cytotechnology 11: 219-231, 1993). A Figura lb também mostra o título de anticorpo, tal como determinado por ELISA sanduíche. Isto mostra que quando comparadas com o controlo contendo transferrina, as culturas que contêm FAC produziram pelo menos a mesma quantidade e, na maioria dos casos, significativamente mais anticorpo. O título de anticorpo obtido nas culturas contendo FAC também mostrou uma relação inversamente proporcional com a concentração de FAC, por exemplo uma cultura contendo FAC 0,4 mg/L produziu mais de 30% mais de anticorpo do que a cultura contendo FAC 100 mg/L.

Exemplo 2: O citrato férrico (FC) é necessário numa concentração uma ordem de grandeza acima do FAC de modo a suportar o crescimento contínuo de linhas celulares GS-NSO Métodos A metodologia do exemplo 2 era idêntica à do exemplo 1, sendo a única excepção a fonte de ferro quelatado. Neste exemplo, o citrato férrico (FC) foi utilizado em vez de FAC. O FC é apenas lentamente solúvel em água fria. Para preparar soluções mãe de FC foi portanto necessário dissolver o FC em água, mantendo a 80°C, com agitação, durante até 2 horas. As soluções mãe foram preparadas em concentrações de 0,5 (para frascos contendo 0,2 a 2 mg/L FAC) e 10 mg/L (para frascos contendo 10 a 100 mg/L de FAC). 26

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Resultados A Figura 2a mostra a concentração de células durante a subcultura e sobrecrescimento final para a gama de concentrações de FC testadas. Isto mostra que a cultura de controlo negativo e a cultura contendo FC a 0,2 mg/L não eram capazes de proliferar para além da primeira subcultura. As culturas contendo FC a 0,4, 1 e 2 mg/L não eram capazes de proliferar para além da segunda subcultura. Assim, para as concentrações testadas, o FC é necessário numa concentração de 10 mg/L ou superior, para suportar o crescimento celular continuo ao longo de várias subculturas e durante a cultura de sobrecrescimento. A Figura 2b mostra os dados de contagem celular e produção de anticorpos para as culturas de sobrecrescimento. Esta figura mostra que o crescimento equivalente ao controlo contendo transferrina, em termos de número máximo de células viáveis e área sob a curva de crescimento, foi alcançado com concentrações de FC de 10 mg/L e superiores. Tal como com o FAC, observou-se um precipitado cor de ferrugem em culturas contendo FC a 10 mg/L e superior. A Figura 2b também mostra o titulo de anticorpo, tal como determinado por ELISA sanduíche. Isto mostra que quando comparado com o controlo contendo transferrina, as culturas contendo FC produziram pelo menos tanto quanto e no caso de FC a 10 mg/L, significativamente mais anticorpo. Tal como observado com o FAC, a concentração mais baixa de FC originou o título mais elevado.

Este resultado mostra que de modo a suportar o crescimento celular equivalente ao observado com transferrina, o FC é necessário numa concentração 10 x superior à de FAC. 27

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Exemplo 3: As linhas celulares de hibridoma requerem FAC numa concentração num excesso de duas ordens de grandeza acima da das linhas GS-NSO, para se obter um crescimento celular contínuo em cultura em suspensão agitada. Métodos A metodologia do exemplo 3 era idêntica à do exemplo 1, com as seguintes excepções:

Utilizou-se uma linha celular de hibridoma de ratinho (9E10) que produz um anticorpo anti-Myc, previamente subcultivada em CDSS modificado suplementado com 1 mg/L de transferrina humana e glutamina 6 mM para inocular frascos experimentais a uma densidade de inoculação de 1 x 105 células/ml. A experiência foi realizada utilizando frascos Erlenmeyer de 250 ml com tampas fechadas, incubadas num agitador recíproco a 36,5°C e 125 rpm. Os frascos foram gaseados inicialmente e a intervalos de 2 dias com CO2 a 5%/ar a 95%.

Os frascos não foram suplementados com concentrado lipídico de colesterol uma vez que esta linha celular de hibridoma não necessita de colesterol.

Os frascos foram subcultivados por diluição com meio fresco de novo para 1 x 105 células/ml a intervalos de 3 dias. Na terceira subcultura, deixou-se ocorrer o sobrecrescimento nos frascos. As contagens celulares foram realizadas utilizando o método de exclusão de azul de tripano.

Resultados A Figura 3a mostra a concentração de células durante a subcultura e sobrecrescimento final para a gama de concentrações de FAC testada. Isto mostra que a cultura de controlo negativo e as culturas contendo 0,2 e 0,4 mg/L de FAC não eram capazes de proliferar par além da primeira subcultura. As culturas contendo 1, 2 e 10 mg/L de FAC não eram capazes de proliferar para além da segunda subcultura. 28

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Assim, para as concentrações testadas, o FAC é necessário numa concentração de 50 mg/L ou mais para suportar o crescimento. A Figura 3b mostra a contagem de células de culturas com sobrecrescimento. Esta Figura mostra que para obter um crescimento equivalente ao controlo contendo transferrina, em termos de número máximo de células viáveis, era necessário FAC a 100 mg/L. No entanto, se o crescimento é considerado em termos do integral da área sob a curva de crescimento (calculado pela soma das áreas aproximadas a um trapézio de ângulo recto), ou horas de células cumulativas (CCH), observa-se um crescimento equivalente ao controlo contendo transferrina a FAC 50 mg/L. Isto pode ver-se claramente no gráfico de barras que apresenta um CCH máximo (Figura 3c) . Como observado anteriormente, observou-se um precipitado cor de ferrugem em culturas contendo FAC a 50 e 100 mg/L.

Este resultado mostra que para um crescimento celular continuo em cultura em suspensão agitada, as linhas celulares de hibridoma requerem FAC numa concentração num excesso de 100 x superior ao das células GS-NSO.

Exemplo 4: o FAC é uma fonte eficaz de ferro quando utilizado em meio rico capaz de suportar o crescimento celular e títulos de anticorpo a níveis elevados O exemplo 4 mostra também a utilidade do FAC como fonte de ferro. Neste exemplo, o FAC é utilizado como única fonte de ferro num meio isento de soro próprio (contendo albumina de soro bovino [BSA] como único componente não definido), conhecido como GSF, utilizando uma segunda linha celular GS-NSO recombinante, produtora de anticorpo (linha celular B). Métodos

As células previamente cultivadas num meio isento de soro próprio contendo tropolona 10 μΜ (um quelante de ferro lipófilo [veja-se WO94/02592]) e FAC a 0,4 mg/L como fonte de ferro foram centrifugadas e ressuspensas em tropolona e meio isento de soro GSF, isento de ferro. As células ressuspensas neste meio foram então utilizadas para inocular frascos 29 ΕΡ 1 651 754 /PT experimentais a uma densidade de inoculo de 2 x 105 células/ml. A experiência foi realizada utilizando frascos Erlenmeyer de 250 ml (volume de trabalho 50 ml) com tampas fechadas incubadas num agitador reciproco a 36,5°C e 125 rpm. Os frascos foram gaseados inicialmente e a intervalos de 2 dias com CO2 a 5%/ar a 95%.

Os frascos individuais contendo meio GSF (tropolona e isento de ferro) foram suplementados utilizando uma solução mãe de FAC a 1 mg/ml para se obterem frascos contendo FAC em concentrações finais de 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 e 2 mg/L. A solução mãe foi esterilizada por filtração antes da adição aos frascos. Incluiu-se como controlo positivo um frasco contendo meio suplementado com tropolona 5 μΜ e FAC a 0,4 mg/L (que se verificou anteriormente ser equivalente a transferrina).

Todos os frascos foram também suplementados com 1 ml/L de um suplemento de colesterol e ácido gordo lOOOx concentrado (CLOC).

Os frascos foram subcultivados por diluição com meio fresco de novo para 2 x 105 células/ml a intervalos de 5 dias. Na segunda subcultura, deixou-se ocorrer o sobrecrescimento nos frascos até à saturação. As contagens de células foram realizadas utilizando o método de exclusão de azul de tripano. A análise do titulo de anticorpo foi realizada utilizando HPLC de proteína A analítica contra um padrão homólogo.

Resultados A Figura 4 mostra a concentração de células durante a subcultura e sobrecrescimento final para a gama de concentrações de FAC testadas. Esta Figura mostra que o meio que contém FAC nas concentrações de 0,8 mg/L e superiores podia suportar um crescimento equivalente ao observado na cultura de controlo positivo. A Figura 4 também mostra a produção de anticorpo nas culturas de sobrecrescimento. Isto mostra que o FAC a 0,8 mg/L e superior era capaz de suportar uma produção de anticorpos pelo menos equivalente à do 30

ΕΡ 1 651 754 /PT controlo. As tendências na produção de anticorpo também eram muito semelhantes às observadas nos Exemplos 1 e 2.

Este resultado mostra que o FAC é eficaz quando utilizado em meio rico capaz de suportar o crescimento celular e títulos de anticorpo a níveis elevados.

Exemplo 5: O meio contendo FAC como fonte de ferro é capaz de suportar o crescimento e produção de anticorpos numa versão de variação para escala inferior de um sistema de produção. Métodos

As fermentações da linha celular B foram realizadas utilizando meio GSF isento de soro contendo tropolona 5 μΜ e FAC a 0,4 mg/L (controlo), ou FAC a 1,0 mg/L. As fermentações foram realizadas em fermentadores Applikon de 7L (volume de trabalho de 4,5 L) com um fundo hemisférico e agitados a 150 rpm utilizando um impulsor marinho. As fermentações foram realizadas a 36,5 °C, pH 7,1 e injectadas com ar/oxigénio para manter uma tensão de oxigénio dissolvida de 15%. O inoculo para estas fermentações era proporcionado por subcultura das células em meio homólogo ao utilizado nas fermentações.

Resultados A Figura 5 mostra que se observou um crescimento celular e características de produção semelhantes quando se utilizou meio suplementado ou com tropolona 5 μΜ /FAC a 0,4 mg/L (controlo), ou FAC a 1 mg/L em recipientes de fermentação injectados com gás, agitados.

Este resultado demonstra a utilidade do FAC como uma fonte de ferro numa versão de variação para escala inferior do sistema de produção. 31

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Exemplo 6: O FAC pode suportar o crescimento até densidades celulares elevadas e a produção a títulos elevados em meio isento de proteína Métodos

Fez-se uma comparação de meio GSF isento de soro (contendo proteína [BSA]) e meio GSF isento de proteína, contendo cada um FAC a 1 mg/L, utilizando fermentações de alimentação por lotes, injectadas com gás, agitadas, da linha celular A (veja-se exemplo 1) . As fermentações isentas de proteína foram suplementadas com concentrado lipídico de colesterol 2 ml/L (veja-se exemplo 1), e as fermentações isentas de soro foram suplementadas com 1 ml/L do suplemento CLOC (veja-se exemplo 4) . As condições de fermentação eram como descrito no Exemplo 5. 0 inoculo para estas fermentações foi proporcionado por subcultura das células no mesmo meio que o utilizado nas fermentações.

Resultados A Figura 6 mostra o crescimento e produção de anticorpos nas duas fermentações. Esta figura mostra claramente que o FAC é capaz de suportar um bom crescimento e produção de anticorpo em ambos os meios.

Este resultado demonstra a capacidade do FAC suportar o crescimento a densidades celulares elevadas e a produção com títulos elevados em ambos, meio contendo proteína (í.e. isento de soro) e meio isento de proteína.

Exemplo 7: 0 FAC no meio isento de proteína pode suportar o crescimento para densidades celulares elevadas e a produção a títulos elevados 0 exemplo seguinte ilustra que o FAC pode ser utilizado como a única fonte de ferro no meio isento de proteína do Exemplo 6 e que este meio suplementado com FAC pode suportar o crescimento a densidades celulares elevadas e a títulos elevados, para uma gama de linhas celulares GS-NSO e a uma escala de fabrico. 32

ΕΡ 1 651 754 /PT Métodos

Recuperaram-se três linhas celulares GS-NSO que expressam anticorpos diferentes (linhas celulares C, D e E) do armazenamento em azoto liquido, directamente em meio contendo FAC isento de proteína, do Exemplo 6. As culturas foram subcultivadas múltiplas vezes no meio contendo FAC isento de proteina e estas culturas foram utilizadas para inocular fermentações de alimentação por lotes à escala laboratorial (4,5 L) ou piloto. 0 meio e alimentação utilizados nestas fermentações de alimentação por lotes foram optimizados para se obterem títulos de anticorpo elevados. A linha celular C foi crescida quer na escala de 4,5, quer de 100 L, a linha celular D na escala de 4,5 L e a linha celular E na escala de 100 L.

Resultados A Figura 8A mostra o crescimento e produção de anticorpos da linha celular C em fermentações de 4,5 L. A Figura 8B mostra o crescimento e produção de anticorpos da linha celular C em fermentações de 100 L.

As Figuras 9 e 10 mostram o crescimento e produção de anticorpos da linha celular D em fermentações de 4,5 L e da linha celular E em 100 L, respectivamente.

Estas Figuras mostram claramente que o meio FAC isento de proteína suporta um bom crescimento de e produtividade de anticorpo numa vasta gama de linhas celulares e à escala de fabrico.

Estes resultados demonstram a capacidade do FAC suportar o crescimento e produção de anticorpos de uma vasta gama de linhas celulares num meio isento de componentes proteicos e animais, quimicamente definido. Isto tem importância na utilização do anticorpo para utilização terapêutica humana, uma vez que eliminará o risco de introduzir agentes infecciosos fortuitos de compostos derivados de animais. 33

ΕΡ 1 651 754 /PT

Exemplo 8: A capacidade do NSO crescer utilizando FAC como única fonte de ferro não é devida a transfecção com o sistema de selecção de GS.

Utilizou-se uma linha celular de mieloma de ratinho NSO que expressa anticorpos humanos e seleccionou-se utilizando um sistema de selecção de G418 para determinar a capacidade do FAC suportar o crescimento das células NSO transfectadas com uma alternativa ao sistema de selecção de GS. Métodos

As células cultivadas em meio isento de soro GSF contendo transferrina a 1 mg/L, FAC a 0,1 mg/L e glutamina 6 mM foram subcultivadas por diluição de novo para 2 x 105 em meio isento de soro GSF fresco contendo ou FAC a 1 mg/L, ou transferrina a 1 mg/L e FAC a 0,1 mg/L. Após 5 dias, os frascos foram subcultivados e deixou-se em seguida desenvolver o ciclo de crescimento completo. A experiência foi realizada em frascos com agitação com tampas fechadas, incubados num agitador recíproco a 36,5°C e 125 rpm. Os frascos foram gaseados inicialmente e a intervalos de 2 dias com C02 a 5%/ar a 95%.

Resultados

Observou-se um crescimento equivalente em ambos os meios, indicando que o FAC é capaz de suportar o crescimento de células NSO transfectadas, utilizando um sistema de selecção alternativo.

Este resultado demonstra que a capacidade do NSO crescer utilizando FAC como única fonte de ferro não é devida à transfecção com o sistema de selecção de GS.

Exemplo 9: Preparação de meio CDSS modificado O meio CDSS modificado foi preparado como se segue: A 1 L de DMEM/F12 (1:1) (Gibco BRL. lx líquido N.° de cat. 21331), agitado utilizando um agitador magnético, adicionaram-se os componentes a seguir pela ordem indicada, 34

ΕΡ 1 651 754 /PT tendo o cuidado de assegurar que cada um estava totalmente dissolvido antes da adição do seguinte: o lg de Pluronic F-68 (Sigma P-1300) o selenito de sódio anidro 50 nM (Sigma S-5261) (de uma solução mãe 25 μΜ) o sulfato de zinco hepta-hidratado 2 μΜ (Sigma Z-0251) (de uma solução mãe 2 mM)

o 0,5 ml de elementos vestigiários de Clevelands I (Cellgro 99-175) o 1 ml de elementos vestigiários de Clevelands II (Cellgro 99-176) o Etanolamina 20 μΜ (Sigma E-0135) o 40 ml de suplemento GS (JRHBiosciences 58672) o l,3g de hidrogenocarbonato de sódio (BDH 102475W) o 3,6 ml de ácido clorídrico 2 M (BDH 190675T)

Apenas para linhas celulares dependentes de glutamina: o 0,88 g de Glutamina (Sigma G-5763)

Apenas para meio de controlo contendo transferrina: o 0,1 mg de citrato férrico de amónio (BDH 271634K) (de uma solução mãe 1 mg/ml) o 1 mg de transferrina humana (Serologicals Proteins 82-349)

Deixaram-se os meios misturar e em seguida foram filtrados utilizando uma membrana de 0,2 pm.

Adiciona-se um composto de ferro solúvel, tal como citrato férrico de amónio ao meio acima a partir de soluções mãe, quer durante a preparação, i.e. ao mesmo tempo com outros ingredientes, ou após o meio estar preparado.

Lisboa,

Claims (15)

1. ΕΡ 1 651 754 /PT 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a cultura in vitro de uma linha celular de mieloma que compreende: (a) inocular um meio de cultura com uma linha celular de mieloma, em que o referido meio é capaz de suportar o crescimento da referida linha celular de mieloma e compreende ferro em concentrações no meio de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 3,2 mg/L, em que o referido meio não contém transferrina, um quelante lipófilo, um quelante contendo azoto sintético, ou um quelante contendo azoto sintético lipófilo; e (b) crescer o meio de cultura inoculado sob condições adequadas e utilizando cultura em suspensão agitada.
2. 2. utilização de um meio de cultura para suportar o crescimento in vitro de uma linha celular de mieloma sob condições de cultura em suspensão agitada, em que o meio de cultura compreende ferro em concentrações no meio de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 3,2 mg/L, em que o referido meio não compreende transferrina, um quelante lipófilo, um quelante contendo azoto sintético, ou um quelante contendo azoto sintético lipófilo.
3. 3. Processo para obter um produto de células de mamifero compreendendo a cultura de uma célula de mieloma capaz de produzir o referido produto sob cultura em suspensão agitada e num meio de cultura capaz de suportar o crescimento da referida linha celular de mieloma, em que o referido meio compreende ferro em concentrações no meio de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 3,2 mg/L, em que o referido meio não contém transferrina, um quelante lipófilo, um quelante contendo azoto sintético, ou um quelante contendo azoto sintético lipófilo; e a recuperação do referido produto de células de mamifero.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, utilização de acordo com a reivindicação 2 ou processo de acordo com a reivindicação 3, em que a concentração de ferro no meio é de cerca de 0,03 mg/L a cerca de 2,4 mg/L, por exemplo de cerca de 0, 064 mg/L a cerca de 1,6 mg/L, por exemplo de cerca de 0,16 mg/L a cerca de 0,32 mg/L. ΕΡ 1 651 754 /PT 2/3
5. 5. Método, utilização ou processo de acordo com a reivindicação 4, em que a fonte de ferro é um composto de ferro solúvel, em que, por exemplo, o composto de ferro solúvel é seleccionado de entre sais ferrosos ou férricos ou seus quelatos simples, por exemplo em que o composto de ferro solúvel é seleccionado de entre sulfato ferroso, citrato ferroso, citrato férrico e compostos férricos de amónio, opcionalmente em que o composto férrico de amónio pode ser seleccionado de entre citrato férrico de amónio, oxalato férrico de amónio, fumarato férrico de amónio, malato férrico de amónio e succinato férrico de amónio.
6. 6. Método, utilização ou processo de acordo com a reivindicação 5, em que o composto férrico de amónio é citrato férrico de amónio.
7. 7. Método para a cultura in vitro de uma linha celular de mieloma que compreende: (a) inocular um meio de cultura com uma linha celular de mieloma, em que o referido meio é capaz de suportar o crescimento da referida linha celular de mieloma e compreende citrato férrico de amónio numa concentração no meio de cerca de 0,2 mg/L a cerca de 20 mg/L, em que o referido meio não contém transferrina, um quelante lipófilo, um quelante contendo azoto sintético ou um quelante contendo azoto sintético lipófilo; e (b) crescer o meio de cultura inoculado sob condições adequadas e utilizando cultura em suspensão agitada.
8. 8. Utilização de um meio de cultura para suportar o crescimento in vitro de uma linha celular de mieloma sob condições de cultura em suspensão agitada, em que o meio de cultura compreende citrato férrico de amónio numa concentração no meio de cerca de 0,2 mg/L a cerca de 20 mg/L, em que o referido meio não compreende transferrina, um quelante lipófilo, um quelante contendo azoto sintético ou um quelante contendo azoto sintético lipófilo.
9. 9. Processo para obter um produto de células de mamifero compreendendo cultivar uma célula de mieloma capaz de produzir o referido produto sob cultura em suspensão agitada e num meio de cultura capaz de suportar o crescimento da referida linha ΕΡ 1 651 754 /PT 3/3 celular de mieloma, em que o referido meio compreende citrato férrico de amónio numa concentração no meio de cerca de 0,2 mg/L a cerca de 20 mg/L, em que o referido meio não contém transferrina, um quelante lipófilo, um quelante contendo azoto sintético ou um quelante contendo azoto sintético lipófilo; e recuperação do referido produto de células de mamífero.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 7, utilização de acordo com a reivindicação 8, ou processo de acordo com a reivindicação 9, em que o citrato férrico de amónio está presente no meio numa concentração de cerca de 0,2 mg/L a cerca de 15 mg/L, por exemplo numa concentração de cerca de 0,4 mg/L a cerca de 10 mg/L, por exemplo numa concentração de cerca de 1 mg/L a cerca de 2 mg/L.
11. 11. Método, utilização ou processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o meio é isento de soro, isento de proteína, isento de componentes de derivação animal ou é quimicamente definido.
12. 12. Método, utilização ou processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a linha celular de mieloma é seleccionada do grupo constituído por uma série NSO, uma série P3, uma série MOPC, MPC-11, J558L, K6H6/B5, 45.6.TG1.7, Y0, Y3 HTK, RPMI 8226 e U266B1.
13. 13. Método, utilização ou processo de acordo com a reivindicação 12 em que a linha celular de mieloma é uma linha celular NSO.
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 3 ou 9, em que o produto celular é seleccionado do grupo constituído por polipéptidos, proteínas, hormonas, linfóquinas, interleucinas e enzimas industrial e terapeuticamente úteis.
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o produto celular é um anticorpo ou um seu fragmento. Lisboa,