DE602004005868T2

DE602004005868T2 - Myeloma zellkultur in einem transferrin-freien medium mit niedrigem eisengehalt

Info

Publication number: DE602004005868T2
Application number: DE200460005868
Authority: DE
Inventors: Matthew David Sandwich OSBORNE; Jonathan H. Cambridge DEMPSEY
Original assignee: Cambridge Antibody Technology Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2004-07-28
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2024-07-29
Also published as: CA2534286C; DE602004005868D1; ATE359359T1; WO2005014800A1; KR20060054433A; DK1651754T3; JP2007501606A; KR101050176B1; ES2285481T3; AU2004263723B2; JP4619362B2; CN1867665B; CA2534286A1; CN1867665A; AU2004263723A1; EP1651754B1; PT1651754E; EP1651754A1

Description

Einführung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung gewisser Säugetierzellen in einem Kulturmedium, das Eisen enthält, jedoch in Abwesenheit von Transferrin oder eines lipophilen oder synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildners.
Hintergrund
Zellkulturmedien müssen die für das Aufrechterhalten und das Kultivieren von Zellen in einer kontrollierten, künstlichen und In-vitro-Umgebung notwendigen Nährstoffe bereitstellen. Diese bestimmten Eigenschaften der Zellkulturmedien hängen zu einem großen Teil von der Art der kultivierten Zelle und, in geringerem Ausmaß, vom Kulturverfahren ab.
Bei Säugetierzellen gibt es eine absolute Notwendigkeit in Bezug auf Eisen, das in vitro im Zellkulturmedium bereitgestellt wird. Bertheussen (Cytotechnology 11, 219–231 (1993)) merkte an, dass Eisen den Säugetierzellen durch Hinzufügen einfacher Eisensalze zum Zellkulturmedium nicht wirksam zugeführt werden kann, hauptsächlich aufgrund der Verfügbarkeit von Eisen für die Zellen, die durch schnelle Oxidation und die Präzipitation von Eisen reduziert wird.
Weiters besitzt Eisen in freier Form ein hohes Oxidationspotential, das zur Oxidation der Komponenten eines Zellkulturmediums führen kann. Es wurde daher nachgewiesen, dass es von Vorteil ist, das Eisen zu komplexieren, um dieses Oxidationspotential zu reduzieren oder zu eliminieren.
In vivo wird Eisen den Säugetierzellen durch das eisenbindende Protein Transferrin präsentiert. Transferrin funktioniert durch die Bindung von Eisen und die Wechselwirkung mit einem Transferrin-Rezeptor auf der Zelloberfläche. Der Transferrin-Eisen-Komplex wird anschließend durch Endocytose in die Zelle gebracht. Einmal in der Zelle, wird der Transferrin-Eisen-Komplex gespalten, und das freigesetzte Eisen wird anschließend an ein eisentransportierendes Protein (Ferritin) komplexiert. Das Transferrin wird rückgeführt. Thorstensen und Romslo, Biochem. J. 271, 1–10 (1990), bieten eine exzellente Diskussion über diesen In-vivo-Eisentransfermechanismus. Die Fähigkeit von Transferrin, den Transport von Eisen zu Zellen zu vermitteln, wurde in der Zellkultur durch die einfache Addition von Transferrin und einem Eisensalz zum Zellkulturmedium ausgenutzt.
Das in Zellkulturmedien typischerweise verwendete Transferrin ist jedoch tierischen Ursprungs, und während der letzten Jahre gab es zunehmenden, durch Regeln auferlegten Druck bezüglich der Entfernung von Proteinen tierischen Ursprungs aus Zellkulturverfahren. Es ist klar, dass die Verwendung von Proteinen tierischen Ursprungs in sich das Risiko einer Einführung von Kontaminanten und zufällig auftretenden Pathogenen trägt, wie z.B. Creutzfeld-Jakob-Erkrankung (CJD) oder spongiformer Encephalopathie (Rinderwahnsinn). Daher wurden alternative Eisentransporter zu Transferrin gesucht und mit verschieden großem Erfolg angewandt. Es wurde bereits oftmals herausgefunden, dass die Art und die Konzentration eines jeden alternativen Eisentransporters von der Art der kultivierten Säugetierzelle abhängt.
Kovar und Franek (Biotechnology Letters 9, 259–264 (1987)) zeigten, dass verschiedene lösliche Eisenverbindungen, wie z.B. Eisen(III)-citrat, anstelle von Transferrin in der Kultur der Hybridom-Zelllinien verwendet werden konnten. Kovar und Franek testeten die Fähigkeit von Eisen(III)-citrat, das Wachstum von zwei Hybridom-Zelllinien über einen Konzentrationsbereich von 5 μM (1,25 mg/l) bis 5 mM (1225 mg/l) zu unterstützen. Obwohl niedrigere Konzentrationen an Eisen(III)-Verbindungen bereits zuvor nach dem Stand der Technik als für die Verwendung in Kulturmedien für mehrere verschiedene Zelllinien vorgeschlagen wurden (insbesondere jene von menschlichem leukämischem oder Epithel-Ursprung), berichten Kovar und Franek, dass Eisen(III)-citrat, wenn es tatsächlich das Hybridom-Zellwachstum mit Äquivalenz zu Transferrin unterstützen sollte, in einer Konzentration von 500 μM (122,5 mg/l) erforderlich war. Kovar und Franek fanden heraus, dass das Medium, das 500 μM Eisen(III)-citrat enthielt, für die Kultur von anderen Hybridom-Zelllinien geeignet war sowie auch für die Kultivierung von mehreren Myelom-Zelllinien geeignet war.
Eto et al. (Agric. Biol. Chem. 55 (3), 863–865 (1991)) berichten über ähnliche Resultate wie Kovar und Franek. Diese Fachmänner testeten die wachstumsstimulierende Wirkung von Eisen(III)-citrat über einen Konzentrationsbereich von 10 mg/l bis 600 mg/l auf eine Hybridom-Zelllinie. Sie berichten, dass 300 mg/l für weitere Studien verwendet wurden. Das Wachstumsäquivalent zu jenem, das mit Transferrin erreicht wurde, wurde beobachtet, als Ethanolamin (ein Lipidvorläufer) in einer Konzentration von 10 μM zu dem Medium, enthaltend 300 mg/l Eisen(III)-citrat, hinzugefügt wurde.
In einer ähnlichen Studie testeten Toyoda & Inouye (Agric. Biol. Chem. 55 (6), 1631–1633 (1991)) das Wachstum von drei Hybridom-Zelllinien in Medien, die Eisen(III)-citrat enthielten, über eine Konzentrationsbandbreite von 0 bis 500 μM. Sie berichteten, dass für zwei der drei getesteten Hybridom-Zelllinien 50 μM (12,5 mg/l) Eisen(III)-citrat als optimal herausgefunden wurde. Dieses Resultat wiederspricht den Ergebnissen von Eto et al. und von Kovar und Franek, obwohl eine Konzentration von 500 μM als Optimalwert für die dritte Zelllinie herausgefunden wurde.
Es ist jedoch wichtig, anzumerken, dass die Arbeit von Kovar & Franek, Toyoda & Inouye und Eto et al. in einer statischen Kultur durchgeführt wurde. WO 94/02592 berichtet darüber, dass, obwohl 10 mg/l Eisen(III)-ammoniumcitrat (FAC) in der Lage waren, das Hybridom-Wachstum in einer statischen Kultur zu unterstützen, dies in einer gerührten Suspensionskultur nicht der Fall war. Es scheint daher, dass sich die Fähigkeit von Hybridom-Zellen, das Eisen optimal zu verwenden, bei Zucht in einer gerührten Suspensionskultur von jener in einer statischen Kultur unterscheidet.
WO 93/00423 beschreibt ein Kulturmedium-Additiv, das einen Eisen-Chelat aus einem löslichen Eisensalz und einem Alkalimetall- oder Erdalkalimetallcitrat umfasst, das eine geeignete Eisenquelle für die serumfreien oder proteinfreien Kulturmedien ist. Die Beispiele dieser Anwendung betreffen hauptsächlich das Züchten von Säugetierzellen wie z.B. BHK- und CHO-Zellen. Obwohl Beispiel 5 das Wachstum von Myelom-Zellen darstellt, wird angemerkt, dass die verwendeten SP2/0-Zellen tat sächlich nicht sekretierende Maus/Maus-Hybridom-Zellen sind. Die Kulturbedingungen sind während der ganzen Zeit als statische Suspensionskultur spezifiziert.
Kovar und Franek behaupten, dass ihr Medium, enthaltend 500 μM Eisen(III)-citrat, für die gerührte Suspensionskultur geeignet war, zeigen jedoch keine Beweise, um diesen Anspruch zu unterstützen. Qi et al. (Cytotechnology 21, 95–109 (1996)) berichten jedoch, dass ein Medium, enthaltend 500 μM (122,5 mg/l) Eisen(III)-citrat, wie von Kovar und Franek beschrieben, für die Zellkultur von drei Hybridom-Zelllinien in gerührten Suspensionskulturen geeignet war. Qi et al. fanden jedoch heraus, dass, um ein Medium zu verwenden, dass diese hohen Konzentrationen an Eisen(III)-citrat (500 μM) enthielt, es notwendig war, die Zellen auf dieses Medium zu entwöhnen; im Fall einer Zelllinie war diese Entwöhnungsperiode sehr in die Länge gezogen. Qi et al. merkten an, dass es unter diesen Bedingungen für die Zellen schwierig war, sich anzupassen, und dass die Formulierung des Mediums durch Substitution des Eisen(III)-citrats im Medium mit einer wirksameren eisenhältigen Verbindung, wie z.B. Aurintricarbonsäure, verbessert werden konnte.
In Einklang mit dem Stand der Technik, der zuvor von Kovar und Franek (1987) zitiert wurde, berichteten mehrere Fachmänner, dass bei gewissen Typen an Säugetierzellen in Kulturen mit geringeren Konzentrationen an Eisenverbindungen eine Nachhaltigkeit entdeckt wurde.
Ramos et al., WO 92/05246, berichten, dass beim Züchten der Epithelzelllinien und insbesondere von Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zelllinien Transferrin durch Eisen(III)-citrat mit 10–100 mg/l ersetzt werden kann (wodurch etwa 0,6–16 mg/l Eisen bereitgestellt werden). Diese Patentanmeldung gibt jedoch klar und deutlich an, dass das Medium als für die Kultur von Myelom-Zelllinien nicht geeignet betrachtet wurde. Keen et al., US-Patent Nr. 5.633.162, berichten, dass Eisen(III)-citrat, Eisen(II)-sulfat und Eisen(III)-ammoniumcitrat (FAC) in Konzentrationen zwischen 0,25 und 5 mg/l verwendet werden können (äquivalent zu 0,04 bis 0,8 mg/l Eisen), um Transferrin in der Kultur von CHO-Zellen zu ersetzen.
WO 98/08934 definiert ein Ersatzmedium, in dem alle tierischen Proteine, d.h. Transferrin und Insulin, ersetzt wurden. Transferrin wurde durch Eisen(II)-sulfat ersetzt, das an eine stickstoffhältige chelatbildende Verbindung chelatisiert wurde, in Konzentrationen, bezogen auf Eisen, von zwischen 0,28 und 11 mg/l, wobei 1,1 mg/l als Optimalwert angesehen werden. Die stickstoffhältigen chelatbildenden Verbindungen, die als geeignet angegeben wurden, umfassen: Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); Ethylenglykolbis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA); Desferoxaminmesylat; Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und trans-1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure (CDTA). Von diesen ist EDTA am meisten bevorzugt. Eisen(III)-citrat wurde auch in der Form von FeCl₃-Natriumcitrat verwendet, dieses war jedoch in höheren Konzentrationen als das Eisen(II)-sulfat.7H₂O-EDTA-Chelat erforderlich.
Diese Anmeldung gibt an, dass das transferrinfreie Medium geeignet ist, um Säugetierzellen, insbesondere Epithel- oder Fibroblasten-Zellen, zu züchten. Es wurde eine Veranschaulichung des Wachstums der CHO- und der menschlichen Embryonieren-Zelllinie 293 bereitgestellt.
Ein Bereich von Zelltypen wurde auch von Neumannova et al. (In vitro Cell Dev. Biol. 31, 625–632 (1995)) für das Langzeitwachstum in Medien getestet, die Eisen in Form von Eisen(III)-citrat in der geringen Konzentration von 1,25 mg/l (etwa 0,2 mg/l Eisen) enthielten. Von den 19 getesteten Zelllinien waren nur 5 zu Langzeitwachstum in diesem Medium mit geringer Eisenkonzentration in der Lage. Die 5 Zelllinien waren Jurkat, J111 und THP-1 (menschliche Leukämie-Zelllinien), HeLa (eine menschliche Epithel-Zelllinie) und XC (ein Ratten-Sarkom). Obwohl sich Hybridom- und Myelom-Zelllinien unter den getesteten befanden, war keine davon in der Lage, in dem Medium mit der geringen Eisenkonzentration zu wachsen.
Wie oben stehend beschrieben, sind geringere Konzentrationen an Eisen(III)-Verbindungen für die Verwendung in Kulturmedien für gewisse Zelltypen geeignet (insbesondere jene mit Herkunft aus Epithelen und menschlichem leukämischem Ursprung). Es ist jedoch nach dem Stand der Technik allgemein anerkannt, dass, um Hybridom-Zellen in gerührter Suspensionskultur unter Verwendung eines transferrinfreien Mediums zu züchten, eine hohe Konzentration, z.B. im Bereich von 122,5 mg/l, einer Eisenverbindung erforderlich ist.
Die vorhergehende Stand der Technik lehrt jedoch auch, dass hohe Konzentrationen an Eisen nicht von Vorteil sind. Bertheussen in Cytotechnology 11, 219–231 (1993), gibt an, dass hohe Konzentrationen an Eisen, wie z.B. das 500 μM Eisen(III)-citrat, das von Kovar und Franek vorgeschlagen wurde, nicht verwendet werden sollten, da diese hohen Konzentrationen eine schnelle Präzipitation von Eisenhydroxid im Medium bewirken. Frisch gebildetes Eisenhydroxid absorbiert wirksam andere Metalle und verschiedene organische Moleküle, daher wird die Zusammensetzung und die Stabilität von Medien, die einen hohen Eisengehalt haben, stark beeinflusst.
Angesichts der Schwierigkeiten, die bei der Anlieferung von Eisen an gewisse Säugetierzellen in Kultur angetroffen werden, besonders an Hybridom-Zellen, wurde das Konzept der Chelatbildung des Eisens, z.B. an lipophile Verbindungen, entwickelt.
Eisen-Chelatbildner sind typischerweise heterozyklische Verbindungen, die das Metallion durch koordinierte Bindungen an zumindest zwei nichtmetallische Ionen im Chealtbildner binden, und diese können unter Verwendung einer Reihe an Verfahren, wie z.B. durch ihren Ursprung (synthetisch oder biologisch produzierte Moleküle), ihre Wechselwirkung mit Lösungsmittel, wie z.B. Wasser (hydrophob vs. hydrophil), oder ihre stöchiometrische Wechselwirkung (zweizähnig von sechszähnig), klassifiziert werden.
Lipophile Chelatbildner sind Verbindungen, die zwei unterschiedliche Eigenschaften aufweisen: (1) die Verbindungen sind hydrophob und oftmals aromatisch, daher zeigen sie eine Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln (z.B. Alkohol), jedoch geringe Löslichkeit in Wasser; (2) die Verbindungen besitzen typischerweise auch eine Region mit negativer Ladung, die eine „Bindung" von Eisen durch elektrostatische Wechselwirkungen mit positiv geladenen Eisenionen ermöglicht. In Zellkultur wird davon ausgegangen, dass solche Verbindungen von den lipidreichen Membranen der Zel len angezogen werden und daher „gebundenes" Eisen bis zu der und möglicherweise durch die Zellmembran transportieren, wodurch die Eisenversorgung der Zellen erleichtert wird (US-Patent Nr. 5.045.468). Die lipophilen Chelatbildner werden typischerweise im Überschuss eines begleitenden Eisensalzes hinzugefügt.
Einer der frühesten Berichte über die Verwendung eines lipophilen Chelatbildners stammte von Brock und Stevensen (Immunology Letters 15, 23–25 (1987)), die Pyridoxalisonicotinoylhydrazon (PIH) zusammen mit Eisen(III)-nitrilotriacetat verwendeten. Sie fanden heraus, dass PIH:Eisen(III)-nitrilotriacetat in einem Verhältnis von 2:1 und einer Konzentration von 40 μM (bezogen auf PIH) Transferrin für die Kultur von Maus-Lymphozyten-Zelllinien ersetzen konnte.
Darfler (US-Patent Nr. 5.045.468/In Vitro Cell. Dev. Biol. 26, 769–778 (1990)) berichtete über ein proteinfreies Medium, das für die Kultur von Hybridom-Zelllinien geeignet war. Der Autor fand heraus, dass Transferrin unter Verwendung der organisch gebundenen Eisenverbindung, Natriumnitroprussid (SNP), zusammen mit EDTA in Konzentrationen von 5,7 bzw. 5,5 mg/l ersetzt werden konnte. Der Autor nannte dieses Medium „ABC-Medium".
Bertheussen (US-Patent Nr. 5045467/Cytotechnology 11, 219–231 (1993)) berichtete darüber, dass das Transferrin in Zellkulturmedium unter Verwendung von Aurintricarbonsäure, eines lipophilen Eisen-Chelatbildners, und 3 μM Eisen(III)-Ionen (hinzugefügt in Form von FeCl₃) ersetzt werden konnte. Bertheussen entwickelte dieses Medium unter Verwendung mehrerer Zelltypen und fand es besonders für die Kultur von schnellwachsenden Hybridom-Zelllinien geeignet.
WO 94/02592 schlug vor, dass Tropolon verwendet werden sollte, um die Funktion von Transferrin in der Anlieferung von Eisen für Zellen in gerührter Suspensionskultur zu ersetzen. Der Author kommentiert, dass Tropolon im Überschuss des begleitenden Eisens hinzugefügt werden sollte. Das Eisen kann als Eisen(III)- oder Eisen(II)-Ionen unter Verwendung einer Reihe an Eisenverbindungen aufscheinen, wobei FAC am meisten bevorzugt wird. Eine Hybridom-Zelllinie wurde verwendet, um die optimalen Konzentrationen von Tropolon und FAC bei 5 μM bzw. 0,2 mg/l aufzuklären. Dieses Medium war auch für das Züchten von NSO-Myelom-Zellen geeignet. Nur als experimentelle Kontrollen wurden Medien, denen Transferrin und Tropolon fehlte, die jedoch FAC enthielten, mit Hybridom- und Myelom-Zellen getestet. Es wurde herausgefunden, dass FAC alleine, zwischen 0,1 und 10 mg/l, nicht in der Lage war, das Wachstum von Hybridom-Zellen in gerührter Suspensionskultur zu unterstützen. FAC alleine in einer Konzentration von 0,2 mg/l konnte das Wachstum von NSO-Myelom-Zelllinien nicht unterstützen. Keine anderen Konzentrationen von FAC alleine wurden mit den Myelom-Zelllinien untersucht: die Autoren nahmen vermutlich an, dass sich NSO- und Hybridom-Zelllinien ähnlich verhalten, und erwarteten von keinen anderen Konzentrationen von FAC, dass sie das Zellwachstum unterstützen.
Keen (Cytotechnology 17, 193–202 (1995)) berichtete über die Entwicklung eines proteinfreien Mediums für das Züchten von Ratten-Myelom- und Ratten-Hybridom-Zellen. Dieses Medium, genannt W38, basierte auf einem 1:1:1-Gemisch von DMEM-, RPMI- und dem ABC-Medium, das von Darfler entwickelt wurde. Dieses Medium enthielt daher SNP als lipophile Eisenquelle und EDTA als stickstoffhältigen Chelatbildner. SNP und EDTA wiesen jedoch 1/3 der Konzentration auf, die im ABC-Medium zu finden war, und Keen sah es als positiv an, die Eisenkonzentration durch das Inkludieren von Eisen(III)-citrat im Medium zu erhöhen. Das W38-Medium war auch für das Züchten der cholesterin-auxotrophen Myelom-Zelllinie NSO geeignet, vorausgesetzt eine geeignete Vorsorge wurde bezüglich der Cholesterinerfordernisse getroffen (Keen und Steward, Cytotechnology 17, 203–211 (1995)).
Eine vor kurzem eingereichte Patentanmeldung von Epstein et al., WO 01/16294, kommentiert, dass in vielen Fällen einfache Eisenträger, wie z.B. Citrat, keine ausreichende Eisenverfügbarkeit für oder Aufnahme durch gezüchtete Zellen bereitstellen. Das Patent berichtet auch darüber, dass eine Reihe von lipophilen eisenchelatbildenden Verbindungen für eine Reihe an Zelltypen mit unterschiedlichem Ausmaß an Erfolg verwendet werden konnten. Resultate, die jedoch zumindest so gut wie Trans ferrin waren, wurden nur mit Sorbit erhalten, der an FeCl₃ und 2-Hydroxypyridin-N-oxid chelatisiert war.
Die Verwendung von lipophilen Verbindungen zur Chelatbildung und zur Unterstützung der Anlieferung von Eisen in transferrinfreier Kultur von Hybridom- und Myelom-Zelltypen gehört daher nun zum Stand der Technik. Es gibt jedoch mehrere Nachteile bezüglich des Einschlusses von lipophilen Chelatbildnern im Zellkulturmedium. Die lipophilen Chelatbildner sind oftmals toxisch, SNP z.B. ist als hochgradig toxisch eingestuft und besitzt eine LD50 bei Ratten von < 1 mg/kg. Bei Zelllinien, die für die industrielle Produktion von biotherapeutischen Produkten verwendet werden, hat dies Konsequenzen sowohl für die Herstellung von Operatoren als auch für das Endprodukt. Es kann tatsächlich notwendig sein, Tests zu entwickeln und zu validieren, um zu beweisen, dass das gereinigte biotherapeutische Endprodukt frei von jeglichem kontaminierenden lipophilen Chelatbildner ist. Zusätzlich dazu wird die Optimierung der Eisenkonzentration eines beliebigen Verfahrens aufgrund des Zweikomponenten-Systems des Chelatbildners und der Eisenverbindung weiter kompliziert.
Zusammenfassend zeigt der Stand der Technik, dass:

1. in Abwesenheit von Transferrrin Hybridom- und Myelom-Zellen bei hohen Eisenkonzentrationen (122,5 mg/l Eisen(III)-citrat) wachsen (Kovar & Franek).
2. hohe Eisenkonzentrationen (z.B. 122,5 mg/l Eisen(III)-citrat) eine Präzipitation hervorrufen, die dem Zellkulturmedium schadet (Bertheussen).
3. in Abwesenheit von Transferrrin oder einem lipophilen Chelatbildner Hybridom-Zellen nicht in einer gerührten Kultur wachsen und dass Myelom-Zellen bei niedrigen Eisenkonzentrationen (0,1–10 mg/l bzw. 0,2 mg/l) überhaupt nicht wachsen (WO 94/02592).
4. ein lipophiler Chelatbildner im Medium erforderlich ist, um es Hybridom- und Myelom-Zellen zu ermöglichen, in gerührter Kultur bei niedrigen Eisenkonzentrationen zu wachsen (WO 94/02592).
5. niedrige Eisenkonzentrationen für das Wachstum gewisser Säugetierzellen verwendet werden können, jedoch nur mit der Verwendung eines stockstoffhältigen Chelatbildners, wie z.B. EDTA (WO 98/08934).

Nach dem Stand der Technik der Zellkultur weiß man es zu schätzen, dass gewisse Zelltypen ähnliche Nähreigenschaften aufweisen. Es ist anzumerken, dass sowohl Myelom- als auch Hybridom-Zelltypen signifikante Eigenschaften teilen, die nicht immer von anderen Zelltypen aufgewiesen werden, z.B. Glutaminauxotrophie (Bebbington et al., Biotechnology 10, 169–175 (1992)). Die Tatsache, dass Hybridome und Myelome in vielerlei Hinsicht auf ähnliche Art und Weise reagieren, ist, in gewissem Ausmaß, nicht überraschend, da Hybridom-Zelllinien durch Fusion einer Myelom-Zelle mit einem Antikörper produziert werden, der B-Lymphozyten produziert (Kohler und Milstein, Nature 256, 495–497 (1975)).
Wie oben stehend umrissen, hat der Stand der Technik gezeigt, dass die Fähigkeit von Hybridom- und Myelom-Zellen, das im Zellmedium mit einem einzelnen Eisenträger, wie z.B. einem Citrat, vorhandene Eisen sowie in Abwesenheit von Transferrin oder eines lipophilen oder stickstoffhältigen Chelatbildners zu verwenden, sich von der korrespondierenden Fähigkeit von z.B. CHO-Zellen unterscheidet. Die allgemeine Lehrmeinung nach dem Stand der Technik ist, dass sich Hybridom- und Myelom-Zelllinien in ihrer Fähigkeit, Eisen in einem transferrinfreien Kulturmedium zu verwenden, gleichen.
Es ist, wie oben stehend beschrieben, aus der Literatur offensichtlich, dass der Entwicklung von transferrinfreien Medien für das Züchten von Hybridom-Zelltypen, besonders in statischer Kultur, Zeit und Anstrengung gewidmet wurde. Nach der durch den Stand der Technik implizierten Annahme, dass Myelom-Zellen dieselben Erfordernisse aufzeigen wie Hybridom-Zellen es diesbezüglich tun, wurden keine äquivalenten Anstrengungen bei Myelom-Zellen gemacht.
Während der Jahre ist es offensichtlich, dass sich der Stand der Technik der Hybridom- und der Myelom-Zellkultur von der Verwendung von Eisen in Form einer lösli chen Eisenverbindung als Ersatz für Transferrin wegbewegt hat und dass stattdessen bestimmt wurde, dass, um die Vorteile niedriger Eisenkonzentrationen zu genießen, ein lipophiler oder ein stickstoffhältiger Chelatbildner in ein Kulturmedium inkludiert werden muss. Natürlich erfordert die Verwendung solcher Chelatbildner in Medien, die verwendet werden, um Zellen für das Produkt zu züchten, für dessen Erzeugung sie gentechnisch verändert wurden, auch die weitere Behandlung des Produkts, um sicherzustellen, dass es keine Kontaminierung mit dem Chelatbildner gibt. Die Inklusion eines solchen Chelatbildners im Kulturmedium verlängert daher nicht nur die Zeitspanne, die verwendet wird, um zu demonstrieren, dass das Produkt rein ist, sondern sie erhöht auch die Produktionskosten dadurch, dass sie die Entwicklung spezifischer Tests erforderlich macht, um zu beweisen, dass ein „toxischer" Eisen-Chelatbildner das reine Produkt nicht kontaminiert.
Es ist daher offensichtlich, dass noch ein Bedarf für die Bereitstellung von Eisen in einer einfachen Form für gewisse Zellen in Kultur in Konzentrationen besteht, die ausreichend viel Eisen bereitstellen, um das fortschreitende Zellwachstum zu ermöglichen, jedoch nicht, wie oben beschrieben, zu dem Präzipitationsschaden führen. Ein weiterer Vorteil wäre es, wenn ein Medien vorhanden wäre, das frei von Transferrin und lipophilen oder stickstoffhältigen Chelatbildnern ist. Das Ziel wäre es, eine äquivalente Zellkultur in einem Medium ohne Transferrin und lipophilen oder stickstoffhältigen Chelatbildner zu erzielen, wie man sie in einem Medium, das Transferrin enthält, erhalten würde.
Zusammenfassung der Erfindung
Um der Notwendigkeit gerecht zu werden, ein transferrinfreies Medium bereitzustellen, welches das Wachstum gewisser Zellen unterstützt, stellt die vorliegende Erfindung unter anderem ein Verfahren zum Züchten von Myelom-Zellen bei gerührter Suspensionskultur in einem Medium bereit, das Eisen enthält, dem jedoch Transferrin oder ein lipophiler oder synthetischer stickstoffhältiger Chelatbildner fehlt. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass, überraschenderweise und im Gegensatz zu den Anweisungen des Stands der Technik, die Eisenerfordernisse einer Myelom-Zelle sich von jenen einer Hybridom-Zelle unterscheiden, und zwar mit dem unerwarteten Resultat, dass Myelom-Zellen ein kontinuierliches Wachstum in Eisenkonzentrationen im Medium zeigen, die bis zu 100-mal geringer sind als jene, die für Hybridom-Zellen erforderlich ist. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird durch den verbesserten Titer des Myelom-Zellprodukts gezeigt, der erhalten wird, wenn die Zellen in Medium mit niedrigen Eisenkonzentrationen gezüchtet werden.
Beschreibung der Figuren
1: 1a zeigt die Fähigkeit einer Myelom-Zelllinie, in variierenden Konzentrationen an Eisen(III)-ammoniumcitrat bei gerührten Suspensionskulturbedingungen zu wachsen, und 1b zeigt die Menge an Antikörpern, die von einer Myelom-Zelllinie produziert wird, die in variierenden Konzentrationen an Eisen(III)-amminiumcitrat gezüchtet wurde. 1c zeigt Wachstumsdaten aus einer Gegenprobe dieses Experiments.
2: 2a zeigt das Wachstum einer Myelom-Zelllinie bei variierenden Konzentrationen von Eisen(III)-citrat bei gerührten Suspensionskulturbedingungen, und 2b zeigt die Zellzählung und den Antikörper-Titer der so gezüchteten Zelllinie.
3: 3a veranschaulicht das Wachstum einer Hybridom-Zelllinie bei variierenden Konzentrationen von Eisen(III)-ammoniumcitrat bei gerührten Suspensionskulturbedingungen, und 3b zeigt die Zellzählung, und 3c zeigt einen mathematisch erhaltenen Vergleich des Wachstums der so gezüchteten Zelllinie.
4: 4a veranschaulicht das Wachstum einer Myelom-Zelllinie in einem reichen serumfreien, transferrinfreien Medium bei verschiedenen Konzentrationen von Eisen(III)-ammoniumcitrat bei gerührten Suspensionskulturbedingungen.
5 veranschaulicht die Fähigkeit von Eisen(III)-ammoniumcitrat, alles für das Wachstum einer Myelom-Zelllinie bei gerührten Suspensionsfermentations-Wachstumsbedingungen erforderliche Eisen bereitzustellen.
6 veranschaulicht die Fähigkeit von Eisen(III)-ammoniumcitrat, alles für das Wachstum einer Myelom-Zelllinie in einem proteinfreien Medium und in einem serumfreien Medium bei gerührten Suspensionsfermentationsbedingungen erforderliche Eisen bereitzustellen.
7 veranschaulicht, dass die Fähigkeit einer Myelom-Zelllinie, mit Eisen(III)-ammoniumcitrat als einziger Eisenquelle zu wachsen, nicht auf Transfektion mit dem GS-Selektionssystem zurückzuführen ist.
8A veranschaulicht das Wachstum einer alternativen Myelom-Zelllinie in einem proteinfreien Medium, das mit Eisen(III)-ammoniumcitrat ergänzt wurde, im Rahmen einer Fermentation im Labormaßstab.
8B veranschaulicht das Wachstum einer Myelom-Zelllinie in einem proteinfreien Medium, das mit Eisen(III)-ammoniumcitrat ergänzt wurde, in einer 100-l-Pilotmaßstab-Fed-Batch-Fermentation.
9 veranschaulicht das Wachstum einer weiteren Myelom-Zelllinie in einem proteinfreien Medium, das mit Eisen(III)-ammoniumcitrat ergänzt wurde, in einer Fermentation im Labormaßstab.
10 veranschaulicht das Wachstum einer weiteren Myelom-Zelllinie in einem proteinfreien Medium, das mit Eisen(III)-ammoniumcitrat ergänzt wurde, in einer 100-l-Pilotmaßstab-Fed-Batch-Fermentation.
In den 8A, 8B, 9 und 10 sowie bei den anderen Figuren definiert die x-Achse die Zeit in Tagen und die y-Achse die Anzahl lebensfähiger Zellen (× 10⁵ Zellen/ml).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In Einklang mit den oben stehenden Informationen stellt die vorliegende Erfindung in ihrem ersten Aspekt ein Verfahren für die In-vitro-Kultur einer Myelom-Zelllinie bereit, das Folgendes umfasst:

(a) das Beimpfen eines Kulturmediums mit einer Myelom-Zelllinie, wobei das Medium in der Lage ist, die Vermehrung der Myelom-Zellinie zu unterstützen, und Eisen in Konzentrationen im Medium von etwa 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l umfasst, worin das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner oder keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner enthält; und
(b) das Züchten des beimpften Kulturmediums unter geeigneten Bedingungen und unter Verwendung einer gerührten Suspensionskultur.

In einer Ausführungsform dieses Aspekts stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die In-vitro-Kultur einer Myelom-Zelllinie bereit, das Folgendes umfasst:

(a) das Beimpfen eines Kulturmediums mit einer Myelom-Zelllinie, wobei das Medium in der Lage ist, die Vermehrung der Myelom-Zellinie zu unterstützen, und Eisen(III)-ammoniumcitrat in einer Konzentration im Medium von etwa 0,2 mg/l bis etwa 20 mg/l umfasst, worin das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner oder keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner enthält; und
(b) das Züchten des beimpften Kulturmediums unter geeigneten Bedingungen und unter Verwendung einer gerührten Suspensionskultur.

In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für den Erhalt eines Säugetierzellprodukts bereit, umfassend das Züchten einer Myelom-Zelle, die in der Lage ist, das Produkt zu produzieren, in einem Kulturmedium, das in der Lage ist, die Vermehrung der Myelom-Zelllinie zu unterstützen, wobei das Medium Eisen in Konzentrationen im Medium von etwa 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l umfasst, wobei das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stick stoffhältigen Chelatbildner oder keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner enthält; sowie das Gewinnen des Säugetierzellprodukts.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Kulturmediums für die Unterstützung des In-vitro-Wachstums einer Myelom-Zelllinie bereit, worin das Kulturmedium Eisen in Konzentrationen im Medium von etwa 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l umfasst, wobei das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner oder keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner enthält.
In einer Ausführungsform dieser Aspekte der Erfindung enthält das Medium Eisen(III)-ammoniumcitrat in einer Konzentration im Medium von etwa 0,2 mg/l bis etwa 20 mg/l.
In der vorliegenden Erfindung ist das Kulturmedium in der Lage, das Wachstum einer Myelom-Zelllinie zu unterstützen. Mit dem „Unterstützen des Wachstums" ist das kontinuierliche Wachstum der Zellen über mehrere Subkulturen mit zumindest einer Verdoppelung und vorzugsweise einer Verdreifachung der Zellanzahl bei jeder Passage, d.h. von einer Subkultur zu der nächsten, gemeint. Die Anzahl der Subkulturen ist für die vorliegende Erfindung nicht essentiell und hängt z.B. von der Länge der Durchführung des Experiments oder dem produzierten Produkt ab. In der vorliegenden Erfindung wird es im Allgemeinen bevorzugt, wenn die Zellen über zumindest 2 Subkulturen und vorzugsweise über zumindest 3 Subkulturen ein kontinuierliches Wachstum zeigen.
Eine Myelom-Zelle, andernfalls als lymphoide Zelle bekannt, ist ein kanzeröser Lymphozyt, der sich typischerweise unter normalen Wachstumsbedingungen unbegrenzt vermehrt. Myelom-Zelltypen sind nützlich, da sie ausgezeichnete Fusionspartner für die Produktion von Hybridomen, die monoklonale Antikörper produzieren, sind. Während der letzten Jahre wurde die Bedeutung von Myelom-Zelltypen als Wirtszellen in der Gen-Rekombinationstechnologie in hohem Ausmaß signifikant. Dies ist insbesondere mit der Verwendung des selektierbaren Glutamin-Synthetase-Markers der Fall, der mit einem NSO-Myelom-Wirt verwendet wird, um stabile, in hohem Ausmaß produzierende rekombinante Zelllinien zu produzieren (Barnes et al., Cytotechnology 32, 109–123 (2000)).
In der vorliegenden Erfindung wird vorweggenommen, dass eine beliebige Myelom-Zelllinie im Kulturmedium verwendet werden kann. Es wird im Allgemeinen bevorzugt, dass die Myelom-Zellinie von einer Maus stammt, und, wenn dies der Fall ist, wird es besonders bevorzugt, dass das Myelom eine NSO-Zelllinie oder eine Zellinie der Serie P3 ist, insbesondere wird eine NSO-Zelllinie bevorzugt (wie z.B. ECACC 85110503). Andere Maus-Myelome umfassen MOPC-Serien, MPC-11, J558L, K6H6/B5 und 45.6.TG1.7. Das Verfahren der Erfindung kann auch verwendet werden, um Ratten- und menschliche Myelom-Zelltypen zu züchten. Ratten-Myelom-Zelllinien, die für die Verwendung im Verfahren der Erfindung geeignet sind, umfassen Y0 und Y, und geeignete menschliche Myelom-Zelllinien umfassen HTK, RPMI 8226 und U266B1.
Ist die Myelom-Zelllinie eine NSO-Zelle, so wird im Allgemeinen bevorzugt, dass die Zelllinie unter Verwendung des Glutaminsynthetase-Expressionssystems transfiziert wird.
Das Zellkulturmedium der vorliegenden Erfindung enthält weder Transferrin, einen lipophilen Chelatbildner, einen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner noch einen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner. Für den Zweck dieser Erfindung können lipophile Chelatbildner als Chelatbildner definiert werden, die zwei unterschiedliche Eigenschaften aufweisen: (1) sie sind hydrophob und in Wasser oder einem Zellkulturmedium schlecht löslich oder nicht löslich und oftmals aromatisch, und (2) sie besitzen eine Region mit negativer Ladung, die eine „Bindung" von Eisen durch elektrostatische Wechselwirkungen mit positiv geladenen Eisenionen ermöglicht. Beispiele für lipophile Chelatbildner sind Tropolon und Natriumnitroprussid. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung können synthetische stickstoffhältige Chelatbildner als eisenbindende Verbindungen definiert werden, die in ihrer Struktur zumindest ein Stickstoffatom enthalten. Solche Verbindungen können hydrophob o der hydrophil sein. Mit „synthetisch" ist in diesem Hinblick gemeint, dass die stickstoffhältigen Chelatbildner nicht natürlich vorkommen, d.h. sie sind in der Natur normalerweise nicht anzutreffen. Natürlich vorkommende stickstoffhältige Chelatbildner, die synthetisch hergestellt werden, sind in dieser Definition nicht inkludiert und sind nicht von den Verfahren und Verwendungen der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen. Diese synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Verbindungen, wie z.B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); Ethylenglykolbis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA); Desferoxaminmesylat; Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und trans-1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure (CDTA). Auch aus den Verfahren und Verwendungen der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen sind Verbindungen, die sowohl lipophile als auch synthetische stickstoffhältige Chelatbildner sein können.
Die genaue Zusammensetzung des Mediums ist für die vorliegende Erfindung nicht von Bedeutung, solange das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner oder keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner enthält, jedoch Konzentrationen an Eisen enthält, wie sie oben stehend angegeben wurden, und solange das Medium in der Lage ist, das Wachstum einer Myelom-Zelllinie, wie zuvor angegeben, zu unterstützen.
Typischerweise umfasst das Zellkulturmedium Quellen an Aminosäuren, Vitaminen, organischen und anorganischen Salzen und Zucker. Verbindungen, die in der Lage sind, diese essentiellen Wachstumserfordernisse bereitzustellen, sind im Handel erhältlich, und ihre Inkorporation in Medien zum Zellwachstum ist dem Fachmann basierend auf Informationen, die nach dem Stand der Technik erhältlich sind, möglich.
Es wird im Allgemeinen bevorzugt, dass das Zellkulturmedium auf einem bekannten Grundmedium oder Derivat davon basiert, welches das kontinuierliche Wachstum von Säugetierzellen unterstützt. Solche Grundmedien sind im Handel erhältlich. Beispiele für geeignete Grundmedien, die ergänzt werden können, um das Medium der vorliegenden Erfindung zu ergeben, umfassen Dulbeccos Modifiziertes Eagles- Medium (DMEM), Hams-F12-Medium, Iscoves Modifiziertes Dulbecco-Medium und Roswell-Park-Memorial-Institute (RPMI).
Das Medium der vorliegenden Erfindung kann serumfrei, proteinfrei, frei von Komponenten tierischen Ursprungs oder chemisch definiert sein.
In einer Alternative dazu kann das Zellkulturmedium aus Grundprinzipien durch Kombination der spezifischen Komponenten hergestellt werden, die für kontinuierliches Wachstum erforderlich sind.
Beim Herstellen eines Zellkulturmediums für eine(n) spezifische(n) Zelltyp oder Zelllinie wird ein Grundmedium typischerweise modifiziert oder ergänzt, und zwar in Abhängigkeit von den Erfordernissen des/der bestimmten Zelltyps/Zelllinie. Die Auswahl der Ergänzungen liegt innerhalb des fachmännischen Wissens und stellt keinen essentiellen Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Typischerweise können solche Ergänzungen Lipide (z.B. Cholesterin oder Fettsäuren), Lipidvorläufer (z.B. Ethanolamin), Wachstumspromotoren oder -regulatoren (z.B. Insulin), Spurenelemente (z.B. Selen), Polymere (z.B. Pluronic F-68) und Glutamin, im Fall von glutaminabhängigen Zelltypen, umfassen.
Ein Beispiel eines Mediums, zu dem eine Eisenquelle hinzugefügt werden kann, um dem Medium Eisen in den oben erwähnten Konzentrationen bereitzustellen, um es für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet zu machen, ist ein Zellkulturmedium basierend auf CDSS, beschrieben von Qi et al. in Cytotechnology 21, 95–109 (1996). Dieses Medium, bekannt als modifiziertes CDSS, basiert auf DMEM/F12 (1:1) (Gibco BRL. 1 × Flüssigkeitskatalognummer 21331) mit folgenden Additionen: 40 ml/l GS-Ergänzung (JRH-Katalognummer 58672); 0,5 ml/l Clevelands-Spurenelemente I (Cellgro 99–175); 1 ml/l Clevelands-Spurenelemente II (Cellgro 99–176); 2 μM Zinksulfat; 50 nM Natriumselenit; 20 μM Ethanolamin; 1 g/l Pluronic F68; 1,3 g/l Natriumbicarbonat und 3,6 ml/l 2 M Salzsäure. Das Medium umfasst auch 6 mM Glutamin für Zelllinien, die nicht zu glutaminunabhängigem Wachs tum in der Lage sind, sowie 2 ml/l Cholesterin-Lipidkonzentrat (Gibco Katalognummer 00-0061) für NSO-Zelllinien.
Das Zellkulturmedium der vorliegenden Erfindung umfasst Eisen in einer Konzentration im Medium von etwa 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Eisenquelle im Kulturmedium eine lösliche Eisenverbindung. Die Menge an löslicher Eisenverbindung, die verwendet wird, sollte so sein, dass sie ausreicht, um dem Medium Eisen in dieser Konzentration zuzuführen, und sollte, solange die Menge des Eisens im Medium innerhalb dieses Bereichs liegt, genau ausreichen, um das Wachstum der Zellen zu unterstützen. Die genaue Konzentration an löslicher Eisenverbindung im Medium kann in Abhängigkeit von der spezifischen löslichen Eisenverbindung, die verwendet wird, und von der verwendeten Zelllinie und/oder anderen vorhandenen Mediumkomponenten variieren. Die geeignete Konzentration kann auf einfache Art und Weise bestimmt werden, z.B. durch Durchführung von Experimenten in kleinem Rahmen gemäß den herkömmlichen Praktiken, z.B. eine Dosiswirkung auf die lösliche Eisenverbindung in einem bestimmten Medium mit einer bestimmten Zelllinie.
In der vorliegenden Erfindung liegt die Eisenkonzentration im Medium, vorzugsweise bereitgestellt durch eine lösliche Eisenverbindung, bei von etwa 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l, vorzugsweise von etwa 0,03 mg/l bis etwa 2,4 mg/l, noch bevorzugter bei von etwa 0,064 mg/l bis etwa 1,6 mg/l und insbesondere bevorzugt bei von etwa 0,16 mg/l bis etwa 0,32 mg/l.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Eisenquelle im Medium eine lösliche Eisenverbindung. Geeignete lösliche Eisenverbindungen sind in Wasser oder dem Zellkulturmedium löslich, zeigen jedoch eine eingeschränkte Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln. Diese Verbindungen sind für den Fachmann, für den eine Bestimmung der Löslichkeit sehr leicht durchzuführen ist, leicht im Handel erhältlich.
Die vorliegende Erfindung zieht auch die Verwendung einer beliebigen alternativen Eisenquelle in Betracht, solange die Eisenquelle in der Lage ist, den Zellen ausreichend Eisen zuzuführen, um ein kontinuierliches Wachstum in Abwesenheit von Transferrin oder einem lipophilen oder synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner zu ermöglichen.
Geeignete lösliche Eisenverbindungen zur Versorgung mit Eisen und daher für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Eisen(III)- und Eisen(II)-Salze oder einfache Chelate davon. Es ist anzumerken, dass „einfache Chelate", wie hierin verwendet, keine lipophilen oder synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner, die hierin oben stehend beschrieben werden, umfassen. Der Begriff „einfache Chelate" wird hierin auf eine Art und Weise verwendet, die mit der Verwendung des Begriffs „einfache Eisenträger" in verschiedenen Werken des Stands der Technik vergleichbar ist.
Beispiele für Eisen(III)- oder Eisen(II)-Salze oder einfache Chelate davon, welche die Eisenquelle im Kulturmedium für die Verfahren und die Verwendungen der Erfindung sein können, umfassen Eisen(II)-sulfat, Eisen(II)-citrat, Eisen(III)-citrat und Eisen(III)-ammoniumverbindungen. Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden Eisen(III)-ammoniumverbindungen bevorzugt. Spezifische Eisen(III)-ammoniumverbindungen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Eisen(III)-ammoniumcitrat, Eisen(III)-ammoniumoxalat, Eisen(III)-ammoniumfumarat, Eisen(III)-ammoniummalat und Eisen(III)-ammoniumsuccinat. Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung wird Eisen(III)-ammoniumcitrat am meisten bevorzugt.
Obwohl das Medium der vorliegenden Erfindung mehr als eine Eisenquelle enthalten kann, z.B. ein Gemisch geeigneter eisenhältiger Verbindungen, wird es im Allgemeinen bevorzugt, dass, wenn diese Eisenquelle eine lösliche Eisenverbindung ist, es nur eine solche Verbindung im Medium gibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die lösliche Eisenverbindung Eisen(III)-ammoniumcitrat. Typischerweise wird in dieser Ausführungsform und um Eisen für das Medium im Bereich von etwa 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l bereitzustellen das Eisen(III)-ammoniumcitrat in Konzentrationen verwendet, die von etwa 0,2 mg/l bis etwa 20 mg/l reichen, vorzugsweise von etwa 0,2 mg/l bis etwa 15 mg/l, noch bevorzugter von etwa 0,4 mg/l bis etwa 10 mg/l und insbesondere bevorzugt von etwa 1 mg/l bis etwa 2 mg/l.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Kulturmedium eine Eisen(III)-ammoniumverbindung. In den Resultaten der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass solche Eisen(III)-ammoniumverbindungen, insbesondere Eisen(III)-ammoniumcitrat, von den Zellen wirksamer verwendet werden als z.B. Eisen(III)-citrat. Insbesondere wenn Eisen(III)-citrat verwendet wird, muss dieses in einer Konzentration vorhanden sein, die 10-mal der Konzentration einer Eisen(III)-ammoniumverbindung in einem äquivalenten Kulturmedium entspricht. Dies wird durch die 1 und 2 der vorliegenden Erfindung veranschaulicht, aus denen ersichtlich ist, dass für kontinuierliches Zellwachstum über zumindest 3 Passagen Eisen(III)-citrat in Konzentrationen von zumindest 10 mg/l vorhanden sein muss, wohingegen Eisen(III)-ammoniumcitrat für dasselbe Ausmaß an Wachstum bei Konzentrationen von 0,2 mg/l sorgt. Es ist ebenso anzumerken, dass der beste Antikörper-Titer bei niedrigeren Eisenkonzentrationen vorliegt.
Das Zellkulturmedium der vorliegenden Erfindung kann durch ein geeignetes Gemisch der einzelnen Komponenten unter Verwendung der Standardverfahren hergestellt werden. Die Medien können auch in verschiedenen Formen, wie z.B. in flüssiger Form oder als trockenes Medium in Pulverform zur Wiederherstellung vor der Verwendung, erzeugt werden. Kulturmedien der vorliegenden Erfindung sind stabil, wenn sie unter geeigneten Bedingungen gelagert werden.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren für die Herstellung eines Zellkulturmediums bereit, das in der Lage ist, das In-vitro-Wachstum einer Myelom-Zelllinie zu unterstützen, wobei das Medium Eisen in Konzentrationen im Medium von etwa 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l umfasst, worin das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner oder keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner enthält; umfassend die Beimischung der einzelnen Komponenten davon.
Das Zellkulturmedium der vorliegenden Erfindung ist für die Verwendung in einer Reihe an Kulturbedingungen geeignet. Daher kann das Medium das Wachstum einer Myelom-Zelllinie in Monoschicht- und Suspensionskultur, insbesondere in gerührter Suspensionskultur, unterstützen. Eine gerührte Suspensionskultur kann als Zellkultur definiert werden, in der eine homogene Suspension an Zellen im Kulturmedium durch eine rührende Kraft unterstützt wird. Mittel zum Anwenden einer rührenden Kraft sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und umfassen z.B. ein mechanisch betriebenes Rührwerk und/oder das Besprengen von Gas für Bioreaktor-Kulturen sowie das Halten von Zellkulturflaschen auf einer Reziprokschüttelplattform. Das Medium gemäß der Erfindung ist besonders für die Kultur von Zellen in gerührter Suspensionskultur geeignet, d.h. in Suspension unter Verwendung eines geeigneten gerührten Kulturgefäßes, z.B. eines Rührkessel- oder Airlift-Fermentors, und zwar unter Verwendung bekannter Kulturverfahren.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch ein Kulturmedium bereit, das in der Lage ist, das Wachstum in einer gerührten Suspensions-Kultur einer Myelom-Zelllinie zu unterstützen, wobei das Medium Eisen in Konzentrationen im Medium von etwa 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l umfasst, worin das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner oder keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner enthält.
Der Stand der Technik ging davon aus, dass Myelom- und Hybridom-Zelltypen dieselben Anforderungen in Bezug auf Eisen in einem Kulturmedium aufweisen. Die Resultate der Erfinder weisen darauf hin, dass dies nicht der Fall ist. 3 veranschaulicht das Wachstum einer Hybridom-Zelllinie in einem Kulturmedium, das Eisen(III)-ammoniumcitrat enthält. Wie aus dieser Fig. zu erkennen ist, entspricht das Wachstum der Hybridom-Zellen den Erwartungen nach dem Stand der Technik, d.h. es gibt ein gutes Wachstum der Zellen bei hohen Konzentrationen an Eisen(III)-ammoniumcitrat (50 mg/l und 100 mg/l), jedoch nicht bei niedrigeren Konzentrationen dieser löslichen Eisenverbindung (weniger als 10 mg/l). Wird dies mit 1 verglichen, die das Wachstum von Myelom-Zellen in Medien mit äquivalenten Konzentrationen einer löslichen Eisenverbindung veranschaulicht, so ist es offensichtlich, dass Hybridom-Zellen etwa 100-mal mehr Eisen im Medium benötigen als es Myelom-Zellen für ein vergleichbares Wachstum benötigen.
Ein weiterer Vorteil der Verfahren der vorliegenden Erfindung ist der verbesserte Titer eines Myelom-Zellprodukts, wenn die Myelom-Zelle in einem Medium mit niedrigem Eisengehalt gezüchtet wird, d.h. wenn die Zelllinie gemäß dem Verfahren der Erfindung gezüchtet wird. Die folgenden Beispiele zeigen, dass der Titer des Myelom-Zellprodukts unerwartet höher ist, wenn die Konzentration an Eisen im Medium gering ist, z.B. zwischen 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l, vorzugsweise zwischen 0,16 mg/l bis etwa 0,32 mg/l.
Zellprodukte, die gemäß der Erfindung erhalten werden können, umfassen beliebige Produkte, die durch gezüchtete Säugetierzellen produziert werden. Typische Produkte umfassen z.B. Polypeptide und Proteine, z.B. Immunglobuline, wie z.B. monoklonale und rekombinante Antikörper und Fragmente davon, Hormone, wie z.B. Erythropoietin und Wachstumshormone, z.B. das menschliche Wachstumshormon, Lymphokine, wie z.B. Interferon, Interleukine, wie z.B. Interleukin 2, 4, 5 und 6, sowie gewerblich und therapeutisch nützliche Enzyme, wie z.B. den Gewebe-Plasminogenaktivator. Verfahren zur Manipulation von Myelom-Zellen durch genetische Rekombinationsverfahren, so dass diese in der Lage sind, die Zellprodukte zu produzieren, sind weitverbreitet und nach dem Stand der Technik allgemeinl erhältlich.
Um Zellprodukte zu erhalten, werden Myelom-Zellen, die in der Lage sind, solche Produkte zu produzieren, im Medium der Erfindung gezüchtet. Die Wachstumsbedingungen hängen z.B. von der verwendeten Zelllinie und dem herzustellenden Produkt ab, sind jedoch unter Verwendung des nach dem Stand der Technik erhältlichen Wissens leicht zu bestimmen.
Daher stellt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Kulturmediums, das Eisen in Konzentrationen im Medium von etwa 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l umfasst, worin das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner oder keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner enthält, für die Herstellung eines Säugetierzellprodukts bereit.
Verfahren zur Isolation des Zellprodukts, das aus den Myelom-Zellen und/oder dem Kulturmedium produziert wird, sind wohlbekannt und werden nach dem Stand der Technik häufig angewandt.
Alle hierin erwähnten Verweise sind explizit durch Verweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen. Es ist anzumerken, dass, während die Erfindung zusammen mit den oben erwähnten Ausführungsformen beschrieben wurde, die vorangehende Beschreibung und die folgenden Beispiele den Umfang der Erfindung veranschaulichen und nicht einschränken sollen. Weitere Aspekte, Vorteile und Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung sind für den Fachmann, den die Erfindung betrifft, erkenntlich.
Beispiele
Beispiel 1: Eisen(III)-ammoniumcitrat (FAC) mit 0,2 mg/l ist in der Lage, das kontinuierliche Wachstum von GS-NSO-Zelllinien zu unterstützen
Verfahren
Eine rekombinante GS-NSO-Maus-Myelom-Zelllinie (Zelllinie A), die einen menschlichen IgG-Antikörper unter Verwendung des Glutaminsynthetase- (GS-) Expressionssystems (Europäische Patentschrift Nr. 2560550) exprimiert, der zuvor in einem geschützten serumfreien Medium (GSF-Medium) subkultiviert wurde, das eine chelatisierte Eisenquelle enthielt, wurde zentrifugiert und in chelatbildnerfreiem Medium resuspendiert. Zellen, die in diesem Medium resuspendiert wurden, wurden anschlie ßend verwendet, um Experimentflaschen mit einer Beimpfungsdichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml zu beimpfen.
Dieses Experiment wurde unter Verwendung von 250-ml-Erlenmeyer-Kolben (Arbeitsvolumen zwischen 20 und 50 ml) mit belüfteten Kapseln durchgeführt, die in einem Reziprokschüttler bei 36,5 °C und 125 U/min mit einer Atmosphäre von 5 % CO₂/95% Luft und 75 % Feuchtigkeit inkubiert wurden.
Einzelne Flaschen, enthaltend modifiziertes CDSS-Medium, wurden unter Verwendung von Stammlösungen an FAC ergänzt, um Flaschen zu ergeben, die FAC in Endkonzentrationen von 0,2, 0,4, 1, 2, 10, 50 und 100 mg/l enthielten. Die Stammlösungen an FAC wurden in Wasser in Konzentrationen von 0,5 (für Flaschen, enthaltend 0,2 bis 2 mg/l FAC) und 25 mg/l (für Flaschen, enthaltend 10 bis 100 mg/l FAC) hergestellt. Die Stammlösungen wurden vor der Hinzufügung zu den Flaschen filtersterilisiert.
Eine Flasche, enthaltend modifiziertes CDSS-Medium, ergänzt mit 1 mg/l menschlichem Transferrin und 0,1 mg/l FAC, wurde als positive Kontrolle inkludiert. Eine Flasche, enthaltend modifiziertes CDSS-Medium ohne Transferrin- oder FAC-Ergänzungen, wurde als negative Kontrolle inkludiert. Alle Flaschen wurden mit 2 ml/l Cholesterin-Lipid-Konzentrat (Gibco) als eine Quelle von Cholesterin ergänzt. Cholesterin-Lipid-Konzentrat ist eine Emulsion von Cholesterin und Fettsäuren, die mit Cyclodextrin komplexiert sind.
Die Flaschen wurden drei Mal subkultiviert, um jegliche Wirkungen einer Verschleppungskontamination von chelatisiertem/gelagertem Eisen aus dem Impfmaterial zu minimieren. Die Flaschen wurden durch Verdünnung mit frischem Medium zurück auf 2 × 10⁵ Zellen/ml in Zeitabständen von 3 Tagen subkultiviert. Bei der dritten Subkultur wurde es den Flaschen ermöglicht, dem kompletten Wachstumszyklus zu folgen, bis eine geringe Lebensfähigkeit erreicht wurde (dies wird oftmals als ein übermäßiges Wachstum bezeichnet). Zellzählungen wurden unter Verwendung eines Innovatis- Cedex-Zellzählers durchgeführt. Der Antikörper-Titer wurde unter Verwendung eines Sandwich-ELISA-Tests gegen einen homologen IgG-Standard bestimmt.
Resultate
1a zeigt die Zellkonzentration während des Subkultivierens und des schlussendlichen Überwuchses für den Bereich an getesteten FAC-Konzentrationen. Diese Fig. zeigt klar und deutlich, dass die negative Kontrollkultur nicht in der Lage war, sich über die erste Subkultur hinweg zu vermehren. Jene Kultur, die 0,2 mg/l FAC enthielt, war in der Lage, sich nach der ersten Teilung zu vermehren, war jedoch anschließend nicht fähig, weiter zu wachsen. Die Tatsache, dass diese Kulturen in der Lage waren, nach der anfänglichen Beimpfung zu wachsen, ist wahrscheinlich ein Resultat der Zellspeicherung an Eisen, die durch die Zellteilung eine Verarmung erfordert.
1a zeigt auch klar und deutlich, dass eine gleiche Konzentration wie und eine Konzentration im Überschuss von 0,4 mg/l in der Lage war, ein kontinuierliches Zellwachstum über mehrere Subkulturen hinweg und während der Überwuchskultur zu unterstützen. 1c zeigt, dass in einem Duplikat dieses Experiments eine FAC-Konzentration von 0,2 mg/l in der Lage war, kontinuierliches Zellwachstum zu unterstützen.
1b zeigt die Zellzählungs- und die Antikörper-Produktions-Daten für die Überwuchskulturen aus dem ersten der Duplikate. Diese Fig. zeigt, dass ein Wachstum, das jenem der transferrinhältigen Kontrollen entsprach, im Hinblick auf die maximale Anzahl an lebensfähigen Zellen und das Gebiet unter der Wachstumskurve mit FAC-Konzentrationen von 1 mg/l und mehr erreicht wurde. Dies deutet darauf hin, dass, nachdem ein Schwellenwert (1 mg/l) erreicht wird, das Wachstum im Großen und Ganzen über einen großen Bereich von FAC-Konzentrationen äquivalent ist. Bei einer FAC-Konzentration von 10 mg/l wurde jedoch eine kleine Menge an rostfärbigem Präzipitat beobachtet. Bei 50 und 100 mg/l wurde dieses Präzipitat in viel größeren Mengen beobachtet. Dieses Präzipitat ist wahrscheinlich Eisenhydroxid, wogegen auch Bertheussen (Cytotechnology 1, 219–231 (1993)) gewarnt hat.
1b zeigt auch den Antikörper-Titer, wie er durch einen Sandwich-ELISA-Test bestimmt wurde. Dies zeigt, dass, bei Vergleich mit der transferrinhältigen Kontrolle, die Kulturen, die FAC enthielten, zumindest genauso viel und in der Mehrzahl der Fälle signifikant mehr Antikörper produzierten. Der Antikörper-Titer, der in den FAC-hältigen Kulturen erhalten wurde, zeigte auch ein umgekehrt proportionales Verhältnis mit der FAC-Konzentration, z.B. produzierte die Kultur, die 0,4 mg/l FAC enthielt, über 30 % mehr Antikörper als die Kultur, die 100 mg/l FAC enthielt.
Beispiel 2: Eisen(III)-citrat (FC) ist in einer Konzentration erforderlich, die um eine Größenordnung größer als die von FAC ist um das kontinuierliche Wachstum von GS-NSO-Zelllinien zu unterstützen.
Verfahren
Die Methodik aus Beispiel 2 war identisch mit jener aus Beispiel 1, die einzige Ausnahme war die Quelle des chelatisierten Eisens. In diesem Beispiel wurde Eisen(III)-citrat (FC) anstelle von FAC verwendet.
FC ist in kaltem Wasser nur langsam löslich. Um Stammlösungen an FC herzustellen, war es daher erforderlich, FC in Wasser, das auf 80 °C gehalten wurde, unter Rühren über eine Zeitspanne von bis zu 2 Stunden aufzulösen. Es wurden Stammlösungen in Konzentrationen von 0,5 (für Flaschen, enthaltend 0,2 bis 2 mg/l FAC) und 10 mg/l (für Flaschen, enthaltend 10 bis 100 mg/l FAC) hergestellt.
Resultate
2a zeigt die Zellkonzentration während des Subkultivierens und des schlussendlichen Überwuchses für den Bereich an getesteten FC-Konzentrationen. Dies zeigt klar, dass die negative Kontrollkultur und die Kultur, die 0,2 mg/l FC enthielt, nicht in der Lage waren, sich über die erste Subkultur hinaus zu vermehren. Jene Kulturen, die 0,4, 1 und 2 mg/l FC enthielten, waren nicht in der Lage, sich über die zweite Subkultur hinaus zu vermehren. Daher ist für die getesteten Konzentrationen FC in einer Konzentration von 10 mg/l oder mehr erforderlich, um das kontinuierliche Zellwachstum über mehrere Subkulturen und während der Überwuchskultur zu unterstützen.
2b zeigt die Zellzählungs- und die Antikörper-Produktions-Daten für die Überwuchskulturen. Diese Fig. zeigt, dass ein Wachstum, das jenem der transferrinhältigen Kontrollen entsprach, im Hinblick auf die maximale Anzahl an lebensfähigen Zellen und das Gebiet unter der Wachstumskurve mit FC-Konzentrationen von 10 mg/l und mehr erreicht wurde. Wie bei FAC wurde ein rostfärbiges Präzipitat in Kulturen beobachtet, die 10 mg/l FC oder mehr enthielten.
2b zeigt auch den Antikörper-Titer, wie er durch einen Sandwich-ELISA-Test bestimmt wurde. Dies zeigt, dass, bei Vergleich mit der transferrinhältigen Kontrolle, die Kulturen, die FC enthielten, zumindest genauso viel und im Fall von 10 mg/l FC signifikant mehr Antikörper produzierten. Wie bei FAC beobachtet, ergab die niedrigste FC-Konzentration den höchsten Titer.
Dieses Resultat zeigt, dass, um das Zellwachstum in einem äquivalenten Ausmaß zu jenem zu unterstützen, das mit Transferrin beobachtet wurde, FC in einer Konzentration erforderlich ist, die 10 × höher ist als FAC.
Beispiel 3: Hybridom-Zelllinien erfordern FAC in einer Konzentration von über zwei Größenordnungen mehr als für GS-NSO-Zelllinien, um ein kontinuierliches Zellwachstum in einer gerührten Suspensionskultur zu erreichen
Verfahren
Die Methodik von Beispiel 3 war identisch zu jener aus Beispiel 1, mit den folgenden Ausnahmen:
Eine Maus-Hybridom-Zelllinie (9E10), produzierend Anti-Myc-Antikörper, die zuvor in modifiziertem CDSS, ergänzt mit 1 mg/l menschlichem Transferrin und 6 mM Glutamin, subkultiviert wurde, wurde verwendet, um Versuchsflaschen mit einer Beimpfungsdichte von 1 × 10⁵ Zellen/ml zu beimpfen.
Das Experiment wurde unter Verwendung von 250-ml-Erlenmeyer-Kolben mit verschlossenen Kapseln durchgeführt, die in einem Reziprokschüttler bei 36,5 °C und 125 U/min inkubiert wurden. Die Flaschen wurden anfänglich und in Zeitabständen von 2 Tagen mit 5 % CO₂/95% Luft begast.
Die Flaschen wurden nicht mit einem Cholesterin-Lipid-Konzentrat ergänzt, da diese Hybridom-Zelllinie kein Cholesterin erfordert.
Die Flaschen wurden mittels Verdünnung mit frischem Medium zurück auf 1 × 10⁵ Zellen/ml in Zeitabständen von 3 Tagen subkultiviert. Bei der dritten Subkultur wurde es den Flaschen ermöglicht, einen Überwuchs zu bilden. Es wurden Zellzählungen unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussverfahrens durchgeführt.
Resultate
3a zeigt die Zellkonzentration während des Subkultivierens und des schlussendlichen Überwuchses für den Bereich an getesteten FAC-Konzentrationen. Dies zeigt, dass die negative Kontrollkultur und die Kulturen, die 0,2 und 0,4 mg/l FAC enthielten, nicht in der Lage waren, sich über die erste Subkultur hinaus zu vermehren. Jene Kulturen, die 1, 2 und 10 mg/l FAC enthielten, waren nicht in der Lage, sich über die zweite Subkultur hinaus zu vermehren. Für die getesteten Konzentrationen ist FAC in einer Konzentration von 50 mg/l oder mehr erforderlich, um das Wachstum zu unterstützen.
3b zeigt die Zellzählung von Überwuchskulturen. Diese Fig. zeigt, dass, um ein Wachstum, das jenem der transferrinhältigen Kontrolle entsprach, im Hinblick auf die maximale Anzahl an lebensfähigen Zellen zu erhalten, 100 mg/l FAC erforderlich wa ren. Falls das Wachstum jedoch im Hinblick auf das Integral des gesamten Bereichs unter der Wachstumskurve in Betracht gezogen wird (berechnet durch Summierung der Bereiche, die durch ein rechteckiges Trapez angenähert sind), oder hinsichtlich kumulativer Zellstunden (CCH), so wird ein Wachstum, das zu jenem der transferrinhältigen Kontrolle äquivalent ist, bei 50 mg/l FAC beobachtet. Dies wird klar und deutlich im Balkendiagramm dargestellt, das den maximalen CCH-Wert zeigt (3c). Wie zuvor beobachtet, wurde ein rostfärbiges Präzipitat in Kulturen, die 50 und 100 mg/l FAC enthielten, beobachtet.
Dieses Resultat zeigt, dass für ein kontinuierliches Zellwachstum in gerührter Suspensionskultur die Hybridom-Zelllinien FAC in einer Konzentration von mehr als 100 × höher als GS-NSO-Zellen erfordern.
Beispiel 4: FAC ist eine wirksame Eisenquelle bei Verwendung in reichem Medium, das in der Lage ist das Zellwachstum zu unterstützen und Antikörper-Titer auf hohe Mengen zu bringen
Beispiel 4 zeigt weiters den Nutzen von FAC als Eisenquelle. In diesem Beispiel wird FAC als einzige Eisenquelle in einem geschützten serumfreien Medium verwendet (enthaltend Rinderserum-Albumin [BSA] als die einzige nicht definierte Komponente), unter dem Namen GSF bekannt, und zwar unter Verwendung einer zweiten antikörperproduzierenden rekombinanten GS-NSO-Zelllinie (Zelllinie B).
Verfahren
Zellen, die zuvor in einem geschützten serumfreien Medium gezüchtet wurden, enthaltend 10 μM Tropolon (einen lipophilen Eisenchelatbildner [siehe WO 94/02592]) und 0,4 mg/l FAC als Eisenquelle, wurden zentrifugiert und in tropolon- und eisenfreiem serumfreiem GSF-Medium resuspendiert. Zellen, die in diesem Medium resuspendiert wurden, wurden anschließend verwendet, um Versuchsflaschen mit einer Beimpfungsdichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml zu beimpfen.
Das Experiment wurde unter Verwendung von 250-ml-Erlenmeyer-Kolben (Arbeitsvolumen 50 ml) mit verschlossenen Kapseln durchgeführt, die in einem Reziprokschüttler bei 36,5 °C und 125 U/min inkubiert wurden. Die Flaschen wurden anfänglich und in Zeitabständen von 2 Tagen mit 5 % CO₂/95% Luft begast.
Einzelne Flaschen, die GSF-Medium (tropolon- und eisenfrei) enthielten, wurden unter Verwendung von 1 mg/ml Stammlösung an FAC ergänzt, um Flaschen zu ergeben, die FAC in einer Endkonzentration von 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 und 2 mg/l enthielten. Die Stammlösung wurde vor der Addition zu den Flaschen filtersterilisiert. Eine Flasche, enthaltend Medium, das mit 5 μM Tropolon und 0,4 mg/l FAC ergänzt wurde (von dem zuvor gezeigt wurde, dass es ein Äquivalent zu Transferrin darstellte), wurde als positive Kontrolle inkludiert.
Alle Flaschen wurden auch mit 1 ml/l einer 1000-×-konzentrierten Cholesterin- und Fettsäure-Ergänzung (CLOC) ergänzt.
Die Flaschen wurden mittels Verdünnung mit frischem Medium zurück auf 2 × 10⁵ Zellen/ml in Zeitabständen von 5 Tagen subkultiviert. Bei der zweiten Subkultur wurde es den Flaschen ermöglicht, einen Überwuchs bis zur Sättigung zu bilden. Es wurden Zellzählungen unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussverfahrens durchgeführt. Es wurde eine Antikörper-Titer-Analyse unter Verwendung analytischer Protein-A-HPLC gegenüber einem homogenen Standard durchgeführt.
Resultate
4 zeigt die Zellkonzentration während des Subkultivierens und des schlussendlichen Überwuchses für den Bereich an getesteten FAC-Konzentrationen. Diese Fig. zeigt, dass das Medium, das FAC in Konzentrationen von 0,8 mg/l und darüber enthielt, das Wachstum in einem Ausmaß unterstützen konnte, das jenem entsprach, das bei der positiven Kontrollkultur beobachtet wurde. 4 zeigt auch die Antikörperproduktion in den Überwuchs-Kulturen. Dies zeigt, dass FAC bei 0,8 mg/l und darüber in der Lage war, die Antikörperproduktion in einem Ausmaß zu unterstützen, das zumindest der Kontrolle entsprach. Die Trends in der Antikörperproduktion waren jenen, die in Beispiel 1 und 2 zu sehen sind, auch sehr ähnlich.
Dieses Resultat zeigt, dass FAC wirksam ist, wenn es in einem reichen Medium verwendet wird, das in der Lage ist, das Zellwachstum zu unterstützen und die Antikörper-Titer auf hohe Mengen zu bringen.
Beispiel 5: Medium enthaltend FAC als Eisenquelle ist in der Lage, das Wachstum und die Antikörperproduktion in einem verkleinerten Produktionssystem zu unterstützen.
Verfahren
Es wurden Fermentationen der Zelllinie B unter Verwendung von serumfreiem GSF-Medium, enthaltend 5 μM Tropolon und 0,4 mg/l FAC (Kontrolle) oder 1,0 mg/l FAC, durchgeführt. Die Fermentationen wurden in 7-l-Applikon-Fermentern (4,5 l Arbeitsvolumen) durchgeführt, die mit einem hemisphärischen Unterteil ausgestattet waren und bei 150 U/min unter Verwendung eines Marine-Rührwerks gerührt wurden. Die Fermentationen wurden bei 36,5 °C, pH 7,1, durchgeführt und mit Luft/Sauerstoff besprengt, um einen Gelöstsauerstoffdruck von 15 % zu erhalten.
Das Impfmaterial für diese Fermentationen wurde durch Subkultur der Zellen in Medien bereitgestellt, die homolog zu jenen sind, die in den Fermentationen verwendet werden.
Resultate
5 zeigt, dass ähnliche Zellwachstums- und Produktionscharakteristiken beobachtet wurden, wenn ein Medium, das mit entweder 5 μM Tropolon/0,4 mg/l FAC (Kon trolle) oder 1 mg/l FAC ergänzt war, in gerührten, besprengten Fermentationsgefäßen verwendet wurde.
Dieses Resultat zeigt den Nutzen von FAC als Eisenquelle in einem verkleinerten Produktionssystem.
Beispiel 6: FAC kann das Wachstum bis zu hohen Zelldichten und die Produktion bis zu hohen Titern in proteinfreiem Medium unterstützen.
Verfahren
Ein Vergleich von serumfreiem GSF-Medium (Protein [BSA] enthaltend) und proteinfreiem GSF-Medium, je enthaltend 1 mg/l FAC, wurde unter Verwendung von gerührten, besprengten Fed-Batch-Fermentationen der Zelllinie A (siehe Beispiel 1) durchgeführt. Proteinfreie Fermentationen wurden mit 2 ml/l Cholesterol-Lipid-Konzentrat (siehe Beispiel 1) ergänzt, und serumfreie Fermentationen wurden mit 1 ml/l der CLOC-Ergänzung (siehe Beispiel 4) ergänzt. Die Fermentationsbedingungen waren so wie in Beispiel 5 beschrieben. Das Impfmaterial für diese Fermentationen wurde durch Subkultur der Zellen in denselben Medien, wie sie in den Fermentationen verwendet wurden, bereitgestellt.
Resultate
6 zeigt das Wachstum und die Antikörper-Produktion in den zwei Fermentationen. Diese Fig. zeigt klar und deutlich, dass FAC in der Lage ist, eine) gutes) Wachstum und Antikörperproduktion in beiden Medien zu unterstützen.
Dieses Resultat zeigt die Fähigkeit von FAC, das Wachstum bis zu hohen Zelldichtewerten und die Produktion bis zu hohen Titern sowohl in proteinhältigem (d.h. serumfreiem) als auch in proteinfreiem Medium zu unterstützen.
Beispiel 7: FAC in proteinfreiem Medium kann das Wachstum bis zu hohen Zelldichtewerten und die Produktion bis zu hohen Titern unterstützen
Das folgende Beispiel veranschaulicht, dass FAC als einzige Eisenquelle im proteinfreien Medium aus Beispiel 6 verwendet werden kann und dass dieses FAC-ergänzte Medium das Wachstum bis zu hohen Zelldichten und bis zu hohen Titern für einen Bereich von GS-NSO-Zelllinien und bei Produktionsgrößenordnung unterstützen kann.
Verfahren
Drei GS-NSO-Zelllinien, die verschiedene Antikörper (Zelllinien C, D und E) exprimieren, wurden aus Flüssigstickstofflagerung direkt in das proteinfreie, FAC-hältige Medium aus Beispiel 6 wiederbelebt. Die Kulturen wurden mehrfach im proteinfreien FAC-hältigen Medium subkultiviert, und diese Kulturen wurden verwendet, um Labormaßstab- (4,5 l) oder Pilotmaßstab-Fed-Batch-Fermentationen zu beimpfen. Medium und Zuführung, die in diesen Fed-Batch-Fermentationen verwendet wurden, wurden optimiert, um hohe Antikörper-Titer bereitzustellen.
Zelllinie C wurde sowohl in einer Größenordnung von 4,5 als auch von 100 l gezüchtet, Zelllinie D wurde in einer Größenordnung von 4,5 und Zelllinie E in einer Größenordnung von 100 l gezüchtet.
Resultate
8A zeigt das Wachstum und die Antikörperproduktion von Zelllinie C in 4,5-l-Fermentationen. 8B zeigt das Wachstum und die Antikörperproduktion von Zelllinie C in 100-l-Fermentationen. Die 9 und 10 zeigen das Wachstum und die Antikörperproduktion von Zelllinie D in 4,5-l-Fermentationen bzw. von Zelllinie E in 100-l-Fermentationen.
Diese Fig. zeigen klar und deutlich, dass proteinfreies FAC-Medium gutes Wachstum von und eine Antikörperproduktivität in einem großen Bereich von Zelllinien sowie bei Produktionsgrößenordnung unterstützt.
Diese Resultate zeigen die Fähigkeit von FAC, das Wachstum und die Antikörperproduktion eines großen Bereichs an Zelllinien in einem chemisch definierten Protein und einem tierkomponentenfreien Medium zu unterstützen. Dies ist für die Verwendung von Antikörpern für die therapeutische Verwendung bei Menschen von Bedeutung, da es das Risiko der Einführung von zufällig erworbenen infektiösen Agenzien aus Verbindungen tierischer Abstammung eliminiert.
Beispiel 8: Die Fähigkeit von NSO unter Verwendung von FAC als einziger Eisenquelle zu wachsen ist nicht auf die Transfektion mit dem GS-Selektionssystem zurückzuführen.
Eine rekombinante NSO-Maus-Myelom-Zelllinie, die menschliche Antikörper exprimiert und unter Verwendung eines G418-Selektionssystems ausgewählt wurde, wurde verwendet, um die Fähigkeit von FAC zu untersuchen, das Wachstum von NSO-Zellen zu unterstützen, die mit einer Alternative zu dem GS-Selektionssystem transfiziert wurden.
Verfahren
Zellen, die in serumfreiem GSF-Medium, enthaltend 1 mg/l Transferrin, 0,1 mg/l FAC und 6 mM Glutamin, gezüchtet wurden, wurden durch Verdünnung zurück auf 2 × 10⁵ in frisches serumfreies GSF-Medium, enthaltend entweder 1 mg/l FAC oder 1 mg/l Transferrin und 0,1 mg/l FAC, subkultiviert. Nach 5 Tagen wurden die Flaschen subkultiviert, und anschließend wurde es ihnen ermöglicht, dem kompletten Wachstumszyklus zu folgen. Das Experiment wurde in Schüttelkolben mit verschlossenen Kapseln durchgeführt, die in einem Reziprokschüttler bei 36,5 °C und 125 U/min inkubiert wurden. Die Flaschen wurden anfänglich und in Zeitabständen von 2 Tagen mit 5 % CO₂/95% Luft begast.
Resultate
Ein äquivalentes Wachstum wurde in beiden Medien beobachtet und deutete darauf hin, dass FAC in der Lage ist, das Wachstum von NSO-Zellen zu unterstützen, die unter Verwendung eines alternativen Selektionssystems transfiziert wurden.
Dieses Resultat zeigt, dass die Fähigkeit von NSO, unter Verwendung von FAC als einziger Eisenquelle zu wachsen, nicht auf die Transfektion mit dem GS-Selektionssystem zurückzuführen ist.
Beispiel 9: Herstellung modifizierter CDSS-Medien
Modifiziertes CDSS wurde wie folgt hergestellt:
Zu 1 l DMEM/F12 (1:1) (Gibco BRL, 1 × Flüssigkeitskatalognummer 21331), unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt, wurden unten stehenden Komponenten in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt, wobei sichergestellt wurde, dass jede vor der Addition der nächsten vollständig aufgelöst war:

• 1 g Pluronic F-68 (Sigma P-1300)
• 50 nM Natriumselenit wasserfrei (Sigma S-5261) (aus einer 25-μM-Stammlösung)
• 2 μM Zinksulfat-Heptahydrat (Sigma Z-0251) (aus einer 2-mM-Stammlösung)
• 0,5 ml Clevelands-Spurenelemente I (Cellgro 99-175)
• 1 ml Clevelands-Spurenelemente II (Cellgro 99-176)
• 20 μM Ethanolamin (Sigma E-0135)
• 40 ml GS-Ergänzung (JRHBiosciences 58672)
• 1,3 g Natriumhydrogencarbonat (BDH 102475W)
• 3,6 ml 2 M Salzsäure (BDH 190675T)

Nur für glutaminabhängige Zelllinien:

• 0,88 g Glutamin (Sigma G-5763)

Für Kontrollmedium, das nur Transferrin enthält:

• 0,1 mg Eisen(III)-ammoniumcitrat (BDH 271634K) (aus einer 1-mg/ml-Stammlösung)
• 1 mg menschliches Transferrin (Serologicals Proteins 82-349)

Es wurde dem Medium ermöglicht, sich zu vermischen, und anschließend wurde es unter Verwendung einer 0,2-μm-Membran filtriert.
Eine lösliche Eisenverbindung, wie z.B. Eisen(III)-ammoniumcitrat, wird zu dem oben genannten Medium aus Stammlösungen hinzugefügt, und zwar entweder während der Herstellung, d.h. gleichzeitig mit den anderen Bestandteilen, oder dann, wenn das Medium bereits hergestellt worden war.

Claims

Verfahren zur In-vitro-Kultivierung einer Myelom-Zelllinie, das Folgendes umfasst: (a) das Beimpfen eines Kulturmediums mit einer Myelom-Zelllinie, wobei das Medium in der Lage ist, die Vermehrung der Myelom-Zelllinie zu unterstützen und Eisen in Konzentrationen im Medium von etwa 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l umfasst, worin das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner und keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner enthält; und (b) das Züchten des beimpften Kulturmediums unter geeigneten Bedingungen und unter Verwendung einer gerührten Suspensionskultur.
Verwendung eines Kulturmediums zur Unterstützung der In-vitro-Vermehrung einer Myelom-Zelllinie unter Bedingungen einer gerührten Suspensionskultur, worin das Kulturmedium Eisen in Konzentrationen im Medium von etwa 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l umfasst, wobei das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner und keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner umfasst.
Prozess zum Erhalt eines Säugetierzellprodukts, umfassend das Züchten einer Myelom-Zelle, die in der Lage ist, das Produkt unter den Bedingungen einer gerührten Suspensionskultur sowie in einem Kulturmedium, das in der Lage ist, die Vermehrung der Myelom-Zelllinie zu unterstützen, zu produzieren, wobei das Medium Eisen in Konzentrationen im Medium von etwa 0,03 mg/l bis etwa 3,2 mg/l umfasst, wobei das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner und keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner enthält; sowie das Gewinnen des Säugetierzellprodukts.
Verfahren nach Anspruch 1, Verwendung nach Anspruch 2 oder Prozess nach Anspruch 3, worin die Eisenkonzentration im Medium etwa 0,03 mg/l bis etwa 2,4 mg/l, z.B. etwa 0,064 mg/l bis etwa 1,6 mg/l, z.B. etwa 0,16 mg/l bis etwa 0,32 mg/l, beträgt.
Verfahren, Verwendung oder Prozess nach Anspruch 4, worin die Eisenquelle eine lösliche Eisenverbindung ist, worin die lösliche Eisenverbindung beispielsweise aus Eisen(II)- oder Eisen(III)-Salzen oder einfachen Chelaten davon ausgewählt wird, z.B. worin die lösliche Eisenverbindung aus Eisen(II)-sulfat, Eisen(II)-citrat, Eisen(III)-citrat und Eisen(III)-ammoniumverbindungen ausgewählt wird, worin die Eisen(III)-ammoniumverbindung gegebenenfalls aus Eisen(III)-ammoniumcitrat, Eisen(III)-ammoniumoxalat, Eisen(III)-ammoniumfumarat, Eisen(III)-ammoniummalat und Eisen(III)-ammoniumsuccinat ausgewählt werden kann.
Verfahren, Verwendung oder Prozess nach Anspruch 5, worin die Eisen(III)-ammoniumverbindung Eisen(III)-ammoniumcitrat ist.
Verfahren zur In-vitro-Kultivierung einer Myelom-Zelllinie, das Folgendes umfasst: (a) das Beimpfen eines Kulturmediums mit einer Myelom-Zelllinie, wobei das Medium in der Lage ist, die Vermehrung der Myelom-Zelllinie zu unterstützen und Eisen(III)-ammoniumcitrat in Konzentrationen im Medium von etwa 0,2 mg/l bis etwa 20 mg/l umfasst, worin das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner und keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner enthält; und (b) das Züchten des beimpften Kulturmediums unter geeigneten Bedingungen und unter Verwendung einer gerührten Suspensionskultur.
Verwendung eines Kulturmediums zur Unterstützung der In-vitro-Vermehrung einer Myelom-Zelllinie unter Bedingungen einer gerührten Suspensionskultur, worin das Kulturmedium Eisen(III)-ammoniumcitrat in einer Konzentration im Medium von etwa 0,2 mg/l bis etwa 20 mg/l umfasst, wobei das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner und keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner umfasst.
Prozess zum Erhalt eines Säugetierzellprodukts, umfassend das Züchten einer Myelom-Zelle, die in der Lage ist, das Produkt unter den Bedingungen einer gerührten Suspensionskultur sowie in einem Kulturmedium, das in der Lage ist, die Vermehrung der Myelom-Zelllinie zu unterstützen, zu produzieren, wobei das Medium Eisen(III)-ammoniumcitrat in einer Konzentration im Medium von etwa 0,2 mg/l bis etwa 20 mg/l umfasst, wobei das Medium kein Transferrin, keinen lipophilen Chelatbildner, keinen synthetischen stickstoffhältigen Chelatbildner und keinen synthetischen stickstoffhältigen lipophilen Chelatbildner enthält; sowie das Gewinnen des Säugetierzellprodukts.
Verfahren nach Anspruch 7, Verwendung nach Anspruch 8 oder Prozess nach Anspruch 9, worin das Eisen(III)-ammoniumcitrat im Medium in einer Konzentration von etwa 0,2 mg/l bis etwa 15 mg/l, z.B. in einer Konzentration von etwa 0,4 mg/l bis etwa 10 mg/l, z.B. in einer Konzentration von etwa 1 mg/l bis etwa 2 mg/l, enthalten ist.
Verfahren, Verwendung oder Prozess nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Medium serumfrei, proteinfrei, frei von Komponenten tierischen Ursprungs ist oder chemisch definiert ist.
Verfahren, Verwendung oder Prozess nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin die Myelom-Zelllinie aus der aus einer NSO-Reihe, einer P3-Reihe, MOPC-Reihen, MPC-11, J558L, K6H6/B5, 45.6.TG1.7, YO, Y3-HTK, RPMI-8226 und U266-B1 bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren, Verwendung oder Prozess nach Anspruch 12, worin die Myelom-Zelllinie eine NSO-Zelllinie ist.
Prozess nach Anspruch 3 oder 9, worin das Zellprodukt aus der aus Polypeptiden, Proteinen, Hormonen, Lymphokinen, Interleukinen sowie industriell und therapeutisch nützlichen Enzymen bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Prozess nach Anspruch 14, worin das Zellprodukt ein Antikörper oder ein Fragment davon ist.