MX2009002748A - Mejoras de cultivos celulares. - Google Patents

Mejoras de cultivos celulares.

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Joseph C Matuck
John C Fann
Christof Schulz
Nicole A Roy
David F Bruton
James Mcintire
Yu-Hsiang David Chang
Thomas Seewoester
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Abstract

La presente invención describe método mejorados para producir una proteína recombinante, por ejemplo un anticuerpo, en un cultivo de células de mamífero. Además, la invención proporciona medios de cultivo mejorados, incluyendo medios de producción mejorados, soluciones de alimentación y soluciones combinadas, que se pueden utilizar para mejorar la productividad de proteínas en cultivos de células de mamífero.

Description

MEJORAS DE CULTIVOS CELULARES Solicitudes Relacionadas La presente Solicitud reclama el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 60/845158, presentada el 13 de septiembre del 2006, y la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 60/876374, presentada el 21 de diciembre del 2006. El contenido de cada uno de los documentos de prioridad anteriores se incorpora en la presente como referencia. Antecedentes de la Invención La tecnología de ADN recombinante ha proporcionado un medio para producir proteínas en cantidades que se permitan para utilizarse en un espectro de aplicaciones, incluyendo propósitos terapéuticos, de diagnóstico, agrícolas y de investigación. Una meta de la producción de proteínas recombinantes, es la optimización de medios y condiciones de cultivos celulares, con el fin de obtener una cantidad de proteínas más grande y los medios más eficientes de productividad. Cualquier mejora, incluyendo mejoría creciente, puede tener enormes beneficios económicos. En la industria farmacéutica, la optimización de la producción de proteínas para productos biológicos utilizados en terapias para el tratamiento de enfermedades es ventajosa, como cualquier mejoría que pueda tener impacto significativo cuando el producto biológico sea manufactura a gran escala. Así, existe una necesidad de maximizar la producción de proteínas de cultivos celulares que expresan proteínas biológicas para utilizarse en medicina. Típicamente, los medios de cultivo de células de mamíferos se basan en medios de formulaciones disponibles en el comercio, que incluyen por ejemplo, DMEM o F12 de Ham. A menudo, los medios de formulaciones no son suficientemente enriquecidos para soportar el incremento tanto en el crecimiento celular como la expresión de proteínas biológicas. Existe una necesidad para mejorar los medios de cultivo celulares, suplementos y métodos de cultivo celular para mejorar la producción de proteínas. Breve Descripción de la Invención La invención proporciona métodos y composiciones para mejorar la expresión de proteínas en cultivos celulares, particularmente cultivos celulares de mamíferos. La invención se refiere a medios de cultivo celular mejorados, que incluyen medios para el crecimiento de células para la expresión de proteínas y medios de producción de cultivo celular optimizados para la expresión de proteínas. La invención también incluye métodos y medios de formulaciones optimizados para una alta expresión de proteínas en cultivos celulares de mamíferos. En particular, los medios de cultivo celular se optimizan para la expresión de anticuerpos en cultivos celulares de mamíferos, por ejemplo células CHO. También se proporcionan métodos de alimentación por lotes mejorados y composiciones, para promover la producción de proteínas, agregando soluciones suplementarias, por ejemplo soluciones que contienen hidrolizado y soluciones de medios básales. La invención proporciona medios de crecimiento básales libres de sal mejorados, para utilizarse en cultivos celulares de mamíferos. La invención incluye un medio de cultivo celular libre de suero que comprende la Parte, Parte B y Parte C, en donde la Parte A consiste esencialmente de un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, una solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; la Parte B consiste esencialmente de una fuente de fierro inorgánico; y la Parte C comprende un factor de crecimiento recombinante; una solución reguladora; un regulador de osmolaridad; una fuente de energía; y al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal. En una modalidad, la Parte A además comprende iones de metal no ferroso, vitaminas, o una combinación de ambos. En una modalidad, la fuente de fierro inorgánico de la Parte B es citrato férrico, por ejemplo aproximadamente de 100 a 150 mg/L o una solución de concentración final de 0.1 a 1 mM de citrato férrico. En otra modalidad, la fuente de fierro inorgánico de la Parte B es citrato férrico por ejemplo, aproximadamente 122.5 mg/L ó 0.5 mM de concentración final de citrato férrico. En una modalidad, el factor de crecimiento recombinante de la Parte C se selecciona del grupo que consiste de insulina o un análogo recombinante, IGF-1, y una combinación de insulina e IGF-1, por ejemplo, aproximadamente 4 mg/L a 13 mg/L de insulina, o un análogo recombinante de la misma. En una modalidad, la solución reguladora que es excluida del medio basal modificado, es solución reguladora HEPES. En una modalidad, la solución reguladora de la Parte C comprende una solución reguladora de fosfatos, HEPES, y bicarbonato de sodio, por ejemplo, aproximadamente de 0.1 a 3 g/L de bicarbonato de sodio, aproximadamente de 0.1 a 3 g/L de HEPES. En una modalidad, la solución reguladora de la Parte C comprende 1-6 g/L de bicarbonato de sodio y/o aproximadamente 1.8 g/L de HEPES. En una modalidad, la solución reguladora de fosfatos comprende aproximadamente de 0.01 a 0.5 g/L de fosfatos sódicos monobásicos y dibásicos. En una modalidad adicional, la Parte C además comprende asparagina, glutamina, o glutamina y asparagina. En una modalidad, el regulador de osmolaridad de la Parte C es NaCI, por ejemplo, aproximadamente de 1.0 a 6.5 g/L de NaCI. En una modalidad, la fuente de energía de la Parte C es un monosacárido, por ejemplo glucosa (tal como D-glucosa), maltosa, mañosa, galactosa y fructosa. En una modalidad, el medio de cultivo celular de la invención comprende no más de aproximadamente 7.0 g/L de glucosa. En otra modalidad, el medio de cultivo celular de la invención comprende al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal de la Parte C, los cuales son un hidrolizado basado en plantas y un hidrolizado que no es de origen animal ni basado en plantas. Un ejemplo de un hidrolizado basado en plantas que puede ser utilizado en la invención, es un hidrolizado basado en soya. Un ejemplo de un hidrolizado que no es de origen animal ni se basa en plantas, es un hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, el medio de cultivo celular de la invención además comprende metotrexato. En una modalidad, el medio de cultivo celular además comprende aproximadamente 100 nM a 5000 nM de metotrexato. En todavía otra modalidad, el medio de cultivo celular además comprende un protector celular o agente tensoactivo. Un ejemplo de un agente tensoactivo que puede utilizarse en el medio de cultivo celular de la invención, es metilcelulosa o poliol Pluronic, por ejemplo, Pluronic F-68. En una modalidad, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0.1-5 g/L de Pluronic F-68. En una modalidad, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1.0 g/L de Pluronic F-68. En aún otra modalidad de la invención, el medio de cultivo celular además comprende L-glutamina. En una modalidad, el medio de cultivo celular tiene un pH en el rango de 7.1 a 7.3. En otra modalidad, el medio de cultivo celular de la invención tiene una osmolaridad en el rango de aproximadamente 320 a 450 mOsm/kg. La invención incluye un medio de cultivo celular libre de suero que comprende, un medio basal; aproximadamente 8-12 mL/kg u 116-126 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 2-6 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 2-5 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1-0.5 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1-3 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 0.01-0.05 g/kg de NaH2P04«H20; aproximadamente 0.4 a 0.5 g/kg de Na2HP0 »7H20; y aproximadamente 1.0-3.0 g/kg de hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, el medio de cultivo celular comprende un medio basal; aproximadamente 10.0 mL/kg ó 122 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 4.0 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 3.5 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.29 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 0.03 g/kg de NaH2P04«H20; aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP0 *7H20; y aproximadamente 2.0 g/kg de hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, el medio de cultivo celular consiste esencialmente de un medio basal; aproximadamente 10.0 mL/kg ó 122 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 4.0 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 3.5 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.29 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 0.03 g/kg de NaH2P04«H20; aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de NaH2P04»7H20; y aproximadamente 2.0 g/kg de hidrolizado basado en levadura. La invención además proporciona un medio de cultivo celular libre de suero, que consiste esencialmente de un medio basal; aproximadamente de 8-12 mL/kg ó de 116-126 mg/L de citrato férrico; aproximadamente de 2-6 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente de 2-5 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente de 0.1-0.5 g/kg de L-glutamina; aproximadamente de 1-3 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente de 0.01-0.05 g/kg de NaH2P04*H20; aproximadamente de 0.4 a 0.5 g/kg de Na2HP04»7H20; y aproximadamente de 1.0-3.0 g/kg de hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, el cultivo celular consiste esencialmente de un medio basal; aproximadamente de 8-12 mL/kg ó de 116-126 mg/L de citrato férrico; aproximadamente de 2-6 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente de 2-5 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente de 0.1-0.5 g/kg de L-glutamina; aproximadamente de 1-3 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 0.01-0.05 g/kg de NaH2P04*H20; aproximadamente de 0.4 a 0.5 g/kg de Na2HP04«7H20; y aproximadamente 1.0-3.0 g/kg de hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, el medio de cultivo celular además comprende aproximadamente 2.50 mL/kg de metotrexato. La invención también incluye un método para producir una proteína, que comprende cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica la proteína en el medio de cultivo de la invención; y transferir el cultivo al medio de producción de cultivo celular, para que se produzca la proteína. En una modalidad, la proteína es un anticuerpo, incluyendo por ejemplo, D2E7 (adalimumab).
La invención además proporciona un medio de producción de cultivo celular libre de suero, que comprende: un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente de 8 a 12 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; aproximadamente de 4 a 8 mL/kg ó 10 a 14 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente de 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente de 0.5 a 0.7 g/kg de L-glutamina; aproximadamente de 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente de 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente de 2 a 3 g/kg de NaCI; aproximadamente de 0.5 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente de 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04»H20; aproximadamente de 0.4 a 0.5 g/kg de Na2HP04«7H20; aproximadamente de 8 a 12 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente de 60 a 70 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el medio de producción de cultivo celular consiste esencialmente de un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente de 8 a 12 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; aproximadamente de 4 a 8 mL/kg ó de 10 a 14 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente de 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente de 0.5 a 0.7 g/kg de L-glutamina; aproximadamente de 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente de 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente de 2 a 3 g/kg de NaCI; aproximadamente de 0.5 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente de 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04»H20; aproximadamente de 0.4 a 0.5 g/kg de Na2HP04»7H20; aproximadamente de 8 a 12 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente de 60 a 70 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En otra modalidad, el medio de producción de cultivo celular comprende un medio basal, aproximadamente 10.0 mL/kg ó 122.45 rng/L de citrato férrico; aproximadamente 6.0 mL/kg ó 12 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente de 0.58 a 0.59 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; aproximadamente 2.4 a 2.5 g/kg de NaCI; aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P0 *H20; aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04'7H20; aproximadamente 10.7 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 6.9 a 7.0 g/kg de hidrolizado basado en plantas. La invención también proporciona un medio de cultivo celular libre de suero que comprende un medio basal modificado, que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato sódico monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 8 a 12 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 3 a 5 mL/kg ó 6 a 8 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente 2 a 3 g/kg de NaCI; aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04«H20; aproximadamente 0.4 a 0.5 g/kg de NaH2P04«7H20; aproximadamente 0.4 a 0.5 g/kg de L-asparagina monohidratada; aproximadamente 2 a 6 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 2 a 4 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el medio de cultivo celular consiste esencialmente de un medio basal modificado, que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 8 a 12 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 3 a 5 mL/kg ó 6 a 8 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente 2 a 3 g/kg de NaCI; aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04»H20; aproximadamente 0.4 a 0.5 g/kg de Na2HP04»7H20; aproximadamente 0.4 a 0.5 g/kg de L-asparagina monohidratada; aproximadamente 2 a 6 9/k9 de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 2 a 4 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el medio de cultivo celular comprende un medio basal modificado; aproximadamente 10.0 mL/kg ó 122.45 mg/kg de citrato férrico; aproximadamente 3.8 a 3.9 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.8 a 0.9 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; aproximadamente 2.6 a 2.7 g/kg de NaCI; aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04»H20; aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04»7H20; aproximadamente 0.45 g/kg de L-asparagina monohidratada; aproximadamente 4.0 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 2.6 g/kg de hidrolizado basado en plantas. La invención también incluye un medio de cultivo celular libre de suero que comprende un medio basal modificado, que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato sódico monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 8 a 10 mL/kg ó 120 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 3 a 5 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.8 a 0.9 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 0.3 a 0.5 g/kg de L-asparagina monohidratada; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente 2 a 3 g/kg de NaCI; aproximadamente 0.5 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2PCVH20; aproximadamente 0.1 a 1.0 g/kg de Na2HP04*7H20; aproximadamente 2 a 6 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 2 a 4 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el medio de cultivo celular consiste esencialmente de un medio basal modificado, que excluye los siguientes componentes. bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 8 a 10 mL/kg ó 120 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 3 a 5 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.8 a 0.9 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 0.3 a 0.5 g/kg de L-asparagina monohidratada; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente 2 a 3 g/kg de NaCI; aproximadamente 0.5 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04«H20; aproximadamente 0.1 a 1.0 g/kg de Na2HP04«7H20; aproximadamente 2 a 6 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 2 a 4 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En otra modalidad, el medio de cultivo celular comprende un medio basal modificado; aproximadamente 10 mL/kg ó 122 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 3.8 a 3.9 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.87 a 0.88 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 0.45 g/kg de L-asparagina monohidratada; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio, aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; aproximadamente 2.67 a 2.68 g/kg de NaCI; aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04*H20; aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04»7H20; aproximadamente 4.0 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 2.6 g/kg de hidrolizado basado en plantas. La invención incluye un medio de cultivo celular libre de suero que comprende un medio de crecimiento celular basal; aproximadamente 8 a 12 mL/kg ó 120 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 2 a 6 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 150 a 250 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1 a 0.5 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; y aproximadamente 5 a 15 g/kg de hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, el medio de cultivo celular consiste esencialmente de un medio de crecimiento celular basal; aproximadamente 8 a 12 mL/kg ó 120 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 2 a 6 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 150 a 250 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1 a 0.5 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; y aproximadamente 5 a 15 g/kg de hidrolizado basado en levadura. En una modalidad adicional, el medio de cultivo celular comprende un medio de crecimiento celular basal; aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 4 mg/kg de insulina recombinante humana, aproximadamente 200 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.29 a 0.30 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; y aproximadamente 11 g/kg de hidrolizado basado en levadura. En una modalidad adicional, la proteína es un anticuerpo, incluyendo por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-12 completamente humano, por ejemplo, ABT-874. La invención también incluye un medio de cultivo celular libre de suero, que comprende un medio de crecimiento celular basal; aproximadamente 8 a 12 mL/kg ó 120 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 2 a 6 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 1 a 3 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; y aproximadamente 1 a 4 g/kg de hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, el medio de cultivo celular consiste esencialmente de un medio de crecimiento celular basal; aproximadamente 8 a 12 mL/kg ó 120 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 2 a 6 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 1 a 3 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; y aproximadamente 1 a 4 g/kg de hidrolizado basado en levadura. En otra modalidad, el medio de cultivo celular comprende un medio de crecimiento celular basal; aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico, aproximadamente 4 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 1.5 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.29 a 0.30 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; y aproximadamente 2 g/kg de hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, el pH del medio de cultivo celular es aproximadamente 7.10 a 7.30 y la osmolaridad se encuentra en el rango de aproximadamente 300 a 340 mOsm/kg. En aún otra modalidad, el medio de cultivo celular comprende al menos 8 g/kg de hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, la proteína que es producida en una célula de mamífero, por ejemplo, célula CHO, utilizando el medio de cultivo celular, es un anticuerpo, incluyendo por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-12 ó un anticuerpo del receptor anti-EPO-R, por ejemplo, ABT-874. La invención además proporciona un medio de cultivo celular que comprende un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 8 a 12 mL/kg ó 120 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 2.5 a 4.5 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.5 a 1 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-asparagina monohidratada; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente 1 a 4 g/kg de NaCI; aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04'H20; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de Na2HPO H20; aproximadamente 2 a 6 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 2 a 6 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el medio de cultivo celular de la invención consiste esencialmente de un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 8 a 12 mL/kg ó 120 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 2.5 a 4.5 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.5 a 1 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-asparagina monohidratada; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente 1 a 4 g/kg de NaCI; aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P0 »H20; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de Na2HP04»7H20; aproximadamente 2 a 6 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 2 a 6 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En otra modalidad, el medio de cultivo celular comprende un medio basal modificado; aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 3.8 a 3.9 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.87 a 0.88 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 0.45 g/kg de L-asparagina monohidratada; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; aproximadamente 2.67 g/kg de NaCI; aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04»H20; aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP0 »7H20; aproximadamente 4.0 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 2.6 g/kg de hidrolizado basado en plantas. La invención también incluye un medio de producción de cultivo celular que comprende un medio basal modificado, el cual es modificado para remover los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora HEPES, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 8 a 12 mL/kg ó 120 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 4 a 8 mL/kg ó 10 a 14 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina, aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente 1 a 3 g/kg de NaCI; aproximadamente 0.5 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04*H20; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de Na2HP04»7H20; aproximadamente 8 a 12 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 6 a 8 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el medio de producción de cultivo celular de la invención consiste esencialmente de un medio basal modificado, el cual es modificado para remover los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora HEPES, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 8 a 12 mL/kg ó 120 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 4 a 8 mL/kg ó 10 a 14 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente 1 a 3 g/kg de NaCI; aproximadamente 0.5 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P0 »H20; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de Na2HP0 «7H20; aproximadamente 8 a 12 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 6 a 8 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En otra modalidad, el medio de producción de cultivo celular comprende un medio basal modificado; aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 6.0 mL/kg ó 12 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.58 a 0.59 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio, aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; aproximadamente 2.45 g/kg de NaCI; aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04»H20; aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04«7H20; aproximadamente 10.7 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 6.9 a 7.0 g/kg de hidrolizado basado en plantas. Otro aspecto de la invención es un medio de producción de cultivo celular que comprende un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 8 a 12 mL/kg u 110 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 4 a 8 mL/kg u 11 a 15 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio, aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente 1 a 3 g/kg de NaCI; aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04»H20; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de Na2HP04«7H20; aproximadamente 12 a 16 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 8 a 10 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el medio de producción de cultivo celular consiste esencialmente de un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 8 a 12 mL/kg u 110 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 4 a 8 mL/kg u 11 a 15 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio, aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente 1 a 3 g/kg de NaCI; aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04»H20; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de Na2HP0 »7H20; aproximadamente 12 a 16 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 8 a 10 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En otra modalidad, el medio de producción de cultivo celular de la invención comprende un medio basal modificado; aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 6.5 mL/kg ó 13 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.58 a 0.59 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; aproximadamente 2.45 g/kg de NaCI; aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04«H20; aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04*7H20; aproximadamente 14.2 a 14.3 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 9.2 a 9.3 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el medio de cultivo celular tiene un pH de aproximadamente 6 a 8. En otra modalidad, el medio de cultivo celular tiene un pH de aproximadamente 7.10 a 7.20. En una modalidad, el medio de cultivo celular tiene una osmolaridad de aproximadamente 350 a 450 mOsm/kg. En otra modalidad, el medio de cultivo celular tiene una osmolaridad de aproximadamente 373 a 403 mOsm/kg. Los medios de cultivo celular de la invención pueden además comprender metotrexato. En una modalidad, el medio de cultivo celular además comprende metotrexato, por ejemplo, aproximadamente de 1-10 mL/kg. En otra modalidad, el medio de cultivo celular además comprende metotrexato, por ejemplo, aproximadamente 2.50 mL/kg. En una modalidad, la proteína que es expresada en el cultivo celular es un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo anti-TNFa o un anticuerpo anti-EPO-R. En otra modalidad, el anticuerpo anti-TNFa, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo anti- TNFa completamente humano, incluyendo por ejemplo, el anticuerpo anti-TNFa completamente humano, D2E7 (adalimumab). En todavía otra modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo anti-IL-12 ó un anticuerpo anti-IL-18, incluyendo un anticuerpo anti-IL-12 ó un anticuerpo anti-IL-18 completamente humano. La invención también incluye un método para producir una proteína, por ejemplo, un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo, que comprende cultivar una célula de mamífero que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína, por ejemplo, un anticuerpo, en un medio de cultivo celular proporcionado en la presente. En una modalidad, el medio de cultivo celular es un medio de producción de cultivo celular. Ejemplos de anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno del mismo, que pueden ser producidos utilizando los métodos y composiciones de la invención, incluyen un anticuerpo anti-IL-18, un anticuerpo anti-TNFa, un anticuerpo anti-IL-12, y un anticuerpo contra el receptor de EPO (EPO-R). En una modalidad, la invención además comprende aislar la proteína de los medios de cultivo celular, por ejemplo, los medios de producción de cultivo celular, descritos en la presente. En una modalidad, los medios de cultivo celular y métodos de la invención, son para cultivar células de mamífero, incluyendo células de Ovario de Hámster Chino (CHO). La invención también incluye una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO) en cualquiera de los medios de cultivo celular descritos en la presente. La invención también proporciona un método de alimentación por lotes mejorado y medios de cultivo celular relacionados, para producir proteínas en un cultivo de células de mamífero, por ejemplo, células CHO. Un aspecto de la invención es un método de alimentación por lotes, para producir una proteína que comprende cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica la proteína en un cultivo celular, que comprende un medio de producción de cultivo celular; y alimentar las células de mamífero agregando una solución de enriquecimiento de hidrolizado y una solución de enriquecimiento basal al cultivo celular durante un periodo de tiempo, en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal, para que se produzca la proteína. En una modalidad, la solución de enriquecimiento basal comprende un medio basal concentrado. En otra modalidad, la solución de enriquecimiento basal comprende un medio basal, asparagina y glucosa. En aún otra modalidad, el medio basal es PF CHO. En una modalidad, la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende un primer hidrolizado que no se deriva de una planta o un animal, y un segundo hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el hidrolizado que no se deriva de una planta o un animal y un hidrolizado basado en plantas, es un hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, el hidrolizado basado en plantas es un hidrolizado basado en soya. En una modalidad, la proteína que es producida, es un anticuerpo o una porción de unión al antígeno del mismo. Ejemplos de anticuerpos o porciones de unión al antígeno del mismo, que pueden ser utilizados en los métodos de alimentación por lotes de la invención, incluyen un anticuerpo anti-TNFa, un anticuerpo anti-IL-12, un anticuerpo anti-IL-18, y un anticuerpo contra el receptor de EPO (EPO-R). La invención incluye un método de alimentación por lotes para producir un anticuerpo anti-TNFa, incluyendo por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFa completamente humano, tal como adalimumab, que comprende cultivar células de Ovario de Hámster Chino (CHO), que comprenden un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TNFa en un cultivo celular que comprende un medio de producción de cultivo celular; y alimentar las células CHO agregando una solución de enriquecimiento de hidrolizado y una solución de enriquecimiento basal al cultivo celular durante un periodo de tiempo, en donde la solución de enriquecimiento basal comprende un medio basal, asparagina y glucosa, y en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal, para que se produzca el anticuerpo anti-TNFa. La invención también caracteriza un método de alimentación por lotes para producir un anticuerpo anti-TNFa que comprende cultivar células CHO que comprenden un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TNFa en un cultivo celular, que comprende un medio de producción de cultivo celular que comprende al menos 1-5 g/L, por ejemplo 2.0 g/L de glucosa, en donde la concentración de glucosa es controlada agregando glucosa al medio de producción de cultivo celular según se requiera, para mantener una concentración de al menos 1-5 g/L, por ejemplo 2.0 g/L de glucosa; y alimentar las células CHO agregando una solución de enriquecimiento de hidrolizado y una solución de enriquecimiento basal al cultivo celular durante un periodo de tiempo, en donde la solución de enriquecimiento basal comprende un medio basal, asparagina y glucosa, y en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal, para que se produzca el anticuerpo anti-TNFa. En una modalidad, La invención incluye además recuperar el anticuerpo anti-TNFa. En todavía otra modalidad, el cultivo celular es cultivado a una temperatura en el rango de aproximadamente 32 a 38°C, por ejemplo 35°C. En una modalidad, el medio de producción de cultivo celular es mantenido con una cantidad de entre 20 y 65% de oxígeno disuelto, por ejemplo a aproximadamente 30% de oxígeno disuelto. En una modalidad, la osmolaridad del medio de producción de cultivo celular es mantenida durante todo el cultivo, a no más de 500 mOsm. En una modalidad, la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende un primer hidrolizado que no se deriva de una planta o un animal, y un segundo hidrolizado basado en plantas. En todavía otra modalidad, el hidrolizado que no se deriva de una planta o un animal y un hidrolizado basado en plantas, es un hidrolizado basado en levadura. En aún otra modalidad, el hidrolizado basado en plantas es un hidrolizado basado en soya. En una modalidad, la solución de enriquecimiento de hidrolizado consiste esencialmente de aproximadamente 50-280 g/kg, por ejemplo 250 a 280 g/kg, de un hidrolizado basado en soya y aproximadamente 75-300 g/kg, por ejemplo 150 a 180 g/kg, de un hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende aproximadamente 50-280 g/kg, por ejemplo 250 a 280 g/kg, de un hidrolizado basado en soya y aproximadamente 75-300 g/kg, por ejemplo 150 a 180 g/kg, de un hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, el medio basal es PF CHO. En una modalidad, la solución de enriquecimiento basal tiene un pH de aproximadamente 9.0 a 10.5. En aún otra modalidad, el periodo de tiempo del método de alimentación por lotes es de entre aproximadamente 9 a 15 días; ó aproximadamente 12 días. En todavía otra modalidad, la solución de enriquecimiento basal es agregada al medio de producción de cultivo celular en al menos uno de los siguientes días del periodo de tiempo: día 4, día 6, día 9, y día 11. En una modalidad, la solución de enriquecimiento de hidrolizado es agregada al medio de producción de cultivo celular en el día 4, día 7, ó día 4 y día 7 del periodo de tiempo. En aún otra modalidad, los métodos de alimentación por lotes además comprenden ajustar el pH del medio de producción de cultivo celular, de conformidad con una disminución lineal del pH, en donde la disminución lineal del pH comprende iniciar desde un pH de aproximadamente 6.5-8, por ejemplo, 7.1 a 7.2 y terminando con un pH final de aproximadamente 6.5-7.0, por ejemplo, 6.9. En una modalidad, la disminución lineal del pH es ajustada con respecto a un periodo de al menos aproximadamente 24 horas. En otra modalidad, la disminución lineal del pH es ajustada con respecto a un periodo de al menos aproximadamente 48 horas. En aún otra modalidad, la disminución lineal del pH es ajustada con respecto a un periodo de aproximadamente 72 horas. La invención también incluye utilizar los medios de cultivo celular descritos en la presente, en el método de alimentación por lotes, por ejemplo, el medio de producción de cultivo celular que comprende un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes, bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 8 a 10 mL/kg u 110 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 4 a 8 mL/kg ó 10 a 14 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1 a 3 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1 a 3 g/kg de HEPES; aproximadamente 2 a 3 g/kg de NaCI; aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04'H20; aproximadamente 0.1 a 0.1 g/kg de Na2HP04-7H20; aproximadamente 8 a 12 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 6 a 8 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el medio de producción de cultivo celular comprende un medio basal modificado; aproximadamente 10.0 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 6.0 mL/kg ó 12 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.58 a 0.59 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; aproximadamente 2.45 g/kg de NaCI; aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04*H20; aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04-7H20; aproximadamente 10.7 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 6.9 a 7.0 g/kg de hidrolizado basado en plantas. La invención también proporciona un método de alimentación por lotes para producir un anticuerpo anti-IL-12, tal como por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-12 completamente humano (por ejemplo, ABT-874), que comprende cultivar células CHO que comprenden un ácido nucleico que codifica el anticuerpo en un cultivo celular que comprende un medio de producción de cultivo celular, alimentar las células CHO agregando una solución de enriquecimiento de hidrolizado y una solución de enriquecimiento basal al cultivo celular durante un periodo de tiempo, en donde la solución de enriquecimiento basal comprende un medio basal, asparagina y glucosa, y en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal, para que se produzca el anticuerpo anti-IL-12. En una modalidad, la solución de enriquecimiento de hidrolizado además comprende glucosa. En una modalidad, La invención también incluye recuperar el anticuerpo anti-IL-12. En una modalidad, el cultivo celular es cultivado a una temperatura en el rango de aproximadamente 32 a 38°C, por ejemplo, aproximadamente 33°C. En una modalidad de la invención, el medio de producción de cultivo celular es mantenido con una cantidad de entre 20-65% de oxígeno disuelto, por ejemplo, a aproximadamente 40% de oxígeno disuelto. En todavía otra modalidad, el medio de producción de cultivo celular tiene un pH de aproximadamente 6.7 a 7.2. En una modalidad adicional de la invención, la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende un hidrolizado que no se deriva de una planta o un animal y un hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el hidrolizado que no se deriva de una planta o un animal es un hidrolizado basado en levadura. En otra modalidad, el hidrolizado basado en plantas es un hidrolizado basado en soya. En aún otra modalidad, la solución de enriquecimiento de hidrolizado consiste esencialmente de aproximadamente 50-225 g/kg, por ejemplo, 150 a 180 g/kg de un hidrolizado basado en soya; aproximadamente 75-300, por ejemplo 250 a 280 g/kg de un hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 1-5 g/L, por ejemplo 2 a 3 g/L de glucosa. En aún otra modalidad, la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende aproximadamente 50-225 g/kg, por ejemplo 150 a 180 g/kg de un hidrolizado basado en soya, aproximadamente 75-300, por ejemplo 250 a 280 g/kg de un hidrolizado basado en levadura, y aproximadamente 1-5 g/L, por ejemplo 2 a 3 g/L de glucosa. En una modalidad, la solución de enriquecimiento basal comprende un medio basal, asparagina y glucosa. En todavía otra modalidad, la solución de enriquecimiento basal tiene un pH de aproximadamente 9-10, por ejemplo aproximadamente de 9.7, y una osmolaridad de aproximadamente 1400 a 1500 mOsm. En una modalidad adicional, el medio basal en la solución de enriquecimiento basal es PF CHO. En una modalidad, el periodo de tiempo del método de alimentación por lotes es de entre 14-15 días. En una modalidad, la solución de enriquecimiento basal es agregada al medio de producción de cultivo celular cada tercer día, iniciando en el día 5 del periodo de tiempo. En una modalidad de la invención, la solución de enriquecimiento de hidrolizado es agregada al medio de producción de cultivo celular a diario, iniciando en el día 6 del periodo de tiempo. En aún otra modalidad, la solución de enriquecimiento basal y la solución de enriquecimiento de hidrolizado son agregadas al medio de producción de cultivo celular a diario, iniciando en el día 5 del periodo de tiempo. La invención también incluye utilizar los medios de cultivo celular descritos en la presente, en el método de alimentación por lotes, por ejemplo, el medio de producción de cultivo celular que comprende un medio basal modificado, excluyendo los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 8 a 12 mL/kg u 110 a 130 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 5 a 8 mL/kg u 11 a 15 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio, aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; aproximadamente 2 a 3 g/kg de NaCI; aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04-H20; aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de Na2HP04-7H20; aproximadamente 6 a 12 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 6 a 8 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el medio de producción de cultivo celular comprende aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 6.5 mL/kg ó 13 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.58 a 0.59 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; aproximadamente 2.45 g/kg de NaCI; aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04-H20; aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP0 -7H20; aproximadamente 10.7 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 6.9 a 7.0 g/kg de hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, la invención caracteriza métodos para cultivar células a gran escala. En una modalidad, el cultivo celular a gran escala es mayor de aproximadamente 10 L. En otra modalidad, el cultivo celular a gran escala es aproximadamente de 13 L. La invención también proporciona soluciones de alimentación combinadas que son ventajosas, debido a que estas soluciones proporcionan una combinación de nutrientes en una sola solución. La invención incluye una solución de alimentación combinada que comprende glucosa; un medio basal; un aminoácido diferente de glutamina; y al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal. La invención también incluye una solución de alimentación combinada que consiste esencialmente de glucosa; un medio basal; un aminoácido diferente de glutamina; y al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal. En una modalidad, la solución de alimentación tiene un pH de aproximadamente 6.0 a 8.0. En una modalidad, la solución de alimentación combinada comprende aproximadamente 100 a 250 g/kg de glucosa. En una modalidad, la solución de alimentación combinada comprende el aminoácido asparagina, por ejemplo aproximadamente 1.0 a 15.0 g de asparagina; o aproximadamente 3.0 a 5.0 g/kg de asparagina. En una modalidad, los al menos dos diferentes hidrolizados Que no son de origen animal en la solución de alimentación combinada, son un hidrolizado basado en plantas y un hidrolizado que no sea de origen animal o se base en plantas. En una modalidad, el hidrolizado que no es de origen animal o se basa en plantas, es un hidrolizado basado en levadura. En una modalidad, el hidrolizado basado en plantas es un hidrolizado basado en soya.
En una modalidad, la solución de alimentación combinada comprende un medio basal que es ya sea PF-CHO ó un medio DMEM/F12. En una modalidad, el medio celular basal es un medio basal modificado, y excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, glutamina y glucosa. En aún otra modalidad, la solución de alimentación combinada además tiene una turbiedad de menos de aproximadamente 15 UTN. La invención caracterizada un método para mantener un nivel constante de glucosa de un medio de producción de cultivo celular que comprende agregar las soluciones de alimentación combinadas descritas en la presente. Otro aspecto de la invención es un método para fabricar una solución de alimentación combinada que comprende un medio basal, glucosa, y al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal, que comprende combinar la glucosa y el medio celular basal en una solución; ajustar el pH de la solución de a) a aproximadamente 9.5 a 10.5; agregar los al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal a la solución de b); y ajustar el pH de la solución de c), para que la solución de alimentación combinada tenga un pH de aproximadamente 6.5 a 7.5. En una modalidad, la etapa c) comprende agregar un primer hidrolizado que no es de origen animal o se base en plantas, y un segundo hidrolizado basado en plantas. En una modalidad, el hidrolizado que no es de origen animal o se base en plantas es un hidrolizado basado en levadura. En aún otra modalidad, el hidrolizado basado en plantas es un hidrolizado basado en soya. La invención además proporciona métodos para incrementar la producción de proteínas, por ejemplo, anticuerpo o porciones de unión al antígeno de los mismos, a partir de cultivos de células de mamíferos. La invención proporciona un método para producir al menos aproximadamente 1.5 g/L de un anticuerpo a partir de un cultivo de células de mamífero, que comprende cultivar células de mamífero, que comprende cultivar células de mamífero en un medio de producción de cultivo celular; y agregar una solución de alimentación combinada que tenga un pH de aproximadamente 6.7 a 7.2 al medio de producción de cultivo celular, en donde la solución de alimentación combinada comprende glucosa; un medio celular basal; un aminoácido diferente de glutamina; y al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal, para que se produzcan al menos aproximadamente 1.5 g/L del anticuerpo. En una modalidad, se producen al menos 2 g/L del anticuerpo. En otra modalidad, se producen al menos 4 g/L del anticuerpo. En aún otra modalidad, se producen al menos 5 g/L del anticuerpo. En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para producir aproximadamente 6 g/L de un anticuerpo. En una modalidad, la solución de alimentación combinada comprende aproximadamente 100 a 250 g/kg de glucosa.
La invención también proporciona un método para incrementar el titulo de un anticuerpo producido a partir de un cultivo de células de mamífero, que comprende cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica el anticuerpo en un medio de producción de cultivo celular; y agregar una solución de alimentación combinada que tenga un pH de aproximadamente 6.7 a 7.2 al medio de producción de cultivo celular, en donde la solución de alimentación combinada comprende glucosa; un medio celular basal; un aminoácido diferente de glutamina; y al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal, para que el título del anticuerpo producido sea al menos 50% más que el de un cultivo de células de mamífero de control que es cultivado de conformidad con la etapa a) y excluyendo la etapa b). En una modalidad, el título del anticuerpo producido es al menos 100% más que el de control. En otra modalidad, el título del anticuerpo producido es al menos 150% más que el de control. En una modalidad, la solución de alimentación combinada es agregada cuando la densidad celular alcanza al menos 2.0 x 106 células/mL En una modalidad, la solución de alimentación combinada es agregada cuando la densidad celular alcanza al menos 3.5 x 106 células/mL. La invención además proporciona un método para producir una proteína, por ejemplo un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo, en un cultivo de células de mamífero que comprende cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica la proteína, en un medio de producción de cultivo celular; y agregar una solución de alimentación combinada al medio de producción de cultivo celular, utilizando un sistema de control de retroalimentación para monitorear la concentración de un indicador metabólico en el medio de producción de cultivo celular, en donde la solución de alimentación combinada es agregada al medio de producción de cultivo celular en un punto en el tiempo, determinado por el sistema de control de retroalimentación, para que se produzca el anticuerpo. En una modalidad, el indicador metabólico es glucosa o glutamina. En otra modalidad, la solución de alimentación es una solución de alimentación combinada que comprende glucosa; un medio celular basal; un aminoácido diferente de glutamina; y al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo anti-TNFa, un anticuerpo anti-IL-12, un anticuerpo anti-IL-18, y un anticuerpo contra el receptor de EPO (EPO-R). En una modalidad, un título de al menos 1.5 g/L del anticuerpo es producido utilizando los métodos de la invención. En otra modalidad, se produce un título de al menos 2 g/L. E n una modalidad de la invención, la solución de alimentación combinada comprende aproximadamente 3.0 a 12.5 g/kg de asparagina. En una modalidad de la invención, la solución de alimentación combinada comprende aproximadamente 100 a 200 g/kg de glucosa.
En todavía otra modalidad, la invención además comprende monitorear una concentración de glucosa en el medio de cultivo celular, para que se mantenga el nivel de glucosa entre aproximadamente 0.25 and 20.0 g/L. En una modalidad, la concentración de glucosa es monitoreada utilizando un aparato de muestreo automatizado. En una modalidad, el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo, que es producido utilizando los métodos y composiciones descritos en la presente, se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo anti-TNFa, un anticuerpo anti-IL-18, un anticuerpo contra el receptor EPO-R, y un anticuerpo anti-IL-12. En una modalidad, el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo completamente humano. En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa es D2E7 (adalimumab). En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-18 es ABT-325. En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-12 es ABT-874. La invención también proporciona un método para determinar un perfil de alimentación para producir una proteína en un cultivo de células de mamífero, que comprende cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica el anticuerpo en un medio de producción de cultivo celular; y agregar una solución de alimentación combinada al medio de producción de cultivo celular, utilizando un sistema de control de retroalimentación para monitorear un indicador metabólico en el medio de producción de cultivo celular, en donde la solución de alimentación combinada es agregada al medio de producción de cultivo celular para cumplir un punto establecido del indicador metabólico objetivo; y determinar la cantidad de la solución de alimentación combinada agregada al medio de producción de cultivo celular por día, para que se determine el perfil de alimentación. En una modalidad, el indicador metabólico es glucosa o glutamina. La invención también incluye un método de alimentación por lotes para producir una proteína en un cultivo de células de mamífero, que comprende agregar una solución de alimentación combinada al cultivo de células de mamífero, de conformidad con el perfil de alimentación determinado, utilizando los métodos de la invención . Otro aspecto de la invención son medios de cultivo celular mejorados que incluyen butirato de sodio y/o N-acetilcisteína. La invención caracterizada un método para producir un anticuerpo en un cultivo de células de mamífero para que el título del anticuerpo sea de al menos 300 mg/L, dicho método comprende cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica el anticuerpo en un medio de producción de cultivo celular; agregar butirato de sodio, N-acetilcisteína, o una combinación de los mismos, al medio de cultivo celular, en donde el butirato de sodio es agregado a una concentración final de aproximadamente 0.1 mM a 10 mM, y la N-acetilcisteína es agregada a una concentración final de aproximadamente 1 mM a 80 mM, para que se produzca el anticuerpo a un título de al menos 300 mg/L. En una modalidad, el título del anticuerpo es de al menos aproximadamente 100 mg/L. En una modalidad, el título del anticuerpo es de al menos aproximadamente 200 mg/L. En una modalidad, el título del anticuerpo es de al menos aproximadamente 250 mg/L. En una modalidad, el título del anticuerpo es de al menos aproximadamente 300 mg/L. En una modalidad, el título del anticuerpo es de al menos aproximadamente 400 mg/L. La invención también proporciona un método para producir un anticuerpo en un cultivo de células de mamífero para que el título del anticuerpo sea al menos 10% mayor que el de un cultivo de células de mamífero de control, dicho método comprendiendo a) cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica el anticuerpo en un medio de producción de cultivo celular; y b) agregar butirato de sodio, N-acetilcisteína, o una combinación de los mismos, al medio de cultivo celular, en donde el butirato de sodio es agregado a una concentración final de aproximadamente 0.1 mM a 10 mM y la N-acetilcisteína es agregada a una concentración final de aproximadamente 1 mM a 80 mM, para que el título del anticuerpo sea al menos 10% mayor que la del control, en donde el cultivo de células de mamífero de control comprende la etapa a) y excluye la etapa b). En una modalidad, el título del anticuerpo del cultivo de células de mamífero es mejorado al menos 29% con respecto al cultivo de células de mamífero de control. En una modalidad, el título del anticuerpo del cultivo de células de mamífero es mejorado al menos 40% con respecto al cultivo de células de mamífero de control. En una modalidad, el título del anticuerpo del cultivo de células de mamífero es mejorado al menos 70% con respecto al cultivo de células de mamífero de control. En una modalidad, el título del anticuerpo del cultivo de células de mamífero es al menos 90% mayor que el del cultivo de células de mamífero de control. En una modalidad, se agrega butirato de sodio, N-acetilcisteína , o una combinación de los mismos al cultivo de células de mamífero durante la fase de crecimiento del cultivo de células de mamífero. En una modalidad, se agrega butirato de sodio, N-acetilcisteína, o una combinación de los mismos al cultivo de células de mamífero entre los días 4 y 7 de tiempo del cultivo. En una modalidad, se agrega butirato de sodio, N-acetilcisteína, o una combinación de los mismos al cultivo de células de mamífero en el día 0 de tiempo del cultivo. En otra modalidad, la concentración final del butirato de sodio es de aproximadamente 0.1 m a 10 mM. En una modalidad, la concentración final del butirato de sodio es de aproximadamente 0.1 mM a 8.0 mM. En una modalidad, la concentración final del butirato de sodio es de aproximadamente 0.1 mM a 3.0 mM de butirato de sodio. En una modalidad, la concentración final de la N-acetilcisteína es de aproximadamente 20 mM a 60 mM. En una modalidad, la concentración final de la N-acetilcisteína es de aproximadamente 10 mM. En una modalidad, la concentración final de la N-acetilcisteína es de aproximadamente 8 mM.
La invención además proporciona un método para extender la longevidad de un cultivo de células de mamífero al menos 35% en comparación con un cultivo de células de mamífero de control, dicho método comprende a) cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica el anticuerpo en un medio de producción de cultivo celular; y b) agregar aproximadamente 1 mM a 80 mM de N-acetilciste¡na al medio celular; para que la longevidad del cultivo de células de mamífero sea extendida al menos 35% en comparación con un cultivo de células de mamífero de control, en donde el cultivo de células de mamífero de control comprende la etapa a) y excluye la etapa b). En una modalidad, la longevidad del cultivo de células de mamífero es extendida al menos aproximadamente 45% en comparación con el cultivo de células de mamífero de control. En una modalidad, la longevidad del cultivo de células de mamífero es extendida al menos aproximadamente 55% en comparación con el cultivo de células de mamífero de control. En una modalidad, el método de la invención caracteriza agregar una concentración final de aproximadamente 8 mM de N-acetilcisteína al medio de producción de cultivo celular. En una modalidad, el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo anti-TNFa, un anticuerpo anti-IL-18 (por ejemplo ABT-325), y un anticuerpo anti-IL-12. La invención proporciona un medio de cultivo celular libre de suero que comprende la Parte A, Parte B y Parte C, en donde la Parte A consiste esencialmente de un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, una solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; la Parte B consiste esencialmente de una fuente de fierro inorgánico; y la Parte C comprende un factor de crecimiento recombinante; una solución reguladora; un regulador de osmolaridad; una fuente de energía; y al menos dos diferentes idrolizados que no son de origen animal. En una modalidad, la Parte C consiste esencialmente de un factor de crecimiento recombinante; una solución reguladora; un regulador de osmolaridad; una fuente de energía; y al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal. La invención también proporciona un medio de producción de cultivo celular libre de suero que comprende un medio basal modificado que tiene un contenido reducido de vitaminas y que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 6.5 mL/kg ó 13 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.58 a 0.59 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio, aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; aproximadamente 2.45 g/kg de NaCI; aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04«H20, aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04»7H20; aproximadamente 10.7 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 6.9 a 7.0 g/kg de hidrolizado basado en plantas. La invención también proporciona un medio de cultivo celular libre de suero que comprende: un medio basal modificado que tiene un contenido reducido de vitaminas y que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 150 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 5.0 g/kg de L-asparagina monohidratada; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 65 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 41 g/kg de hidrolizado basado en plantas. La invención además proporciona un medio de cultivo celular libre de suero que comprende: un medio basal modificado que tiene un contenido reducido de vitaminas y que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; aproximadamente 6.5 mL/kg ó 13 mg/kg de insulina recombinante humana; aproximadamente 200 g/kg de glucosa anhidra; aproximadamente 0.58 a 0.59 g/kg de L-glutamina; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio, aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; aproximadamente 2.45 g/kg de NaCI; aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04«H20; aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04*7H20; aproximadamente 10.7 g/kg de hidrolizado basado en levadura; y aproximadamente 6.9 a 7.0 g/kg de hidrolizado basado en plantas. La invención también proporciona las siguientes modalidades de medios mejorados. La invención incluye un medio mejorado para cultivar células CHO que expresan productos biológicos recombinantes que comprende las Partes A, B y C, en donde: la Parte A comprende agua, aminoácidos, vitaminas y otros cofactores; la Parte B comprende una fuente de fierro inorgánico; y la Parte C comprende factores de crecimiento recombinantes, soluciones reguladoras, un regulador de osmolaridad, una fuente de energía, iones de metal no ferroso, hidrolizados y agentes adicionales. En una modalidad, la Parte C comprende bicarbonato de sodio, HEPES, fosfatos sódicos monobásicos y dibásicos, cloruro de sodio, Pluronic F-68 y glucosa. En otra modalidad, se agregan 1.5 g/L de bicarbonato de sodio. En una modalidad adicional, se agregan 1.8 g/L de HEPES. En aún otra modalidad, se agregan 0.1-0.5 g/L de fosfatos sódicos monobásicos y dibásicos. En todavía otra modalidad, se agregan 1 g/L a 6.5 g/L de cloruro de sodio. En una modalidad adicional, se agrega 1.0 g/L de Pluronic F-68. En una modalidad, se agregan 1 g/L a 7 g/L de glucosa. En una modalidad, las vitaminas se seleccionan del grupo que consiste de PABA (ácido p-aminobenzoico), biotina, D-Pantotenato de Calcio (vitamina B5), ácido fólico, l-lnositol, niacinamida, piridoxina (vitamina B6), riboflavina (vitamina B2), tiamina (vitamina B1), y cianocobalamina (vitamina B12). En otra modalidad, los otros cofactores se seleccionan del grupo que consiste de factores lipidíeos, una alcoholamina, aminoácidos y péptidos. En aún otra modalidad, los factores lipidíeos se seleccionan del grupo que consiste de cloruro de colina y fosfatidilcolina. En todavía otra modalidad, una alcoholamina es etanolamina. En una modalidad, los aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de asparagina, glutamina y putrescína. En una modalidad, el péptido es glutatión. En una modalidad, se agregan 0.4 mg/L a 1.65 mg/L de glutatión. En aún otra modalidad, la fuente de fierro inorgánico en la Parte B es citrato férrico. En una modalidad, se agregan 10 mL/L ó 122 mg/L de citrato férrico. En todavía otra modalidad, el citrato férrico es mantenido a una concentración de 122 mg/L. En una modalidad, el factor de crecimiento recombinante es insulina o un análogo recombinante, IGF-1, ó una combinación de insulina e IGF-1. En una modalidad, se agregan 4 mg/L a 13 mg/L de insulina o un análogo recombinante. En otra modalidad, se agregan 25 ng/L a 150 ng/L de IGF-1. En todavía otra modalidad, se agregan 50 ng/L a 100 ng/L de IGF-1. En aún otra modalidad, se suplementan 25 ng/L a 150 ng/L de IGF-1 a la insulina. En una modalidad, se suplementan 50 ng/L a 100 ng/L de IGF-1 a la insulina. En aún otra modalidad, el regulador de osmolaridad se selecciona del grupo que consiste de NaCI, KCI, KN03. En una modalidad, se agregan de 0 g/L a 10 g/L de regulador de osmolaridad. En otra modalidad, se agregan 0 g/L a 6.5 g/L de regulador de osmolaridad. En aún otra modalidad, la fuente de energía es un monosacárido, por ejemplo, glucosa (por ejemplo D-glucosa), maltosa, mañosa, galactosa y fructosa. En una modalidad, se agregan 1.0 a 7.0 g/L de glucosa. En otra modalidad, se agregan 1.5 a 5.0 g/L de glucosa. En todavía otra modalidad, los iones de metal no ferroso se agregan en forma de cloruro y sales de sulfato. En una modalidad, los iones de metal no ferroso se seleccionan del grupo que consiste de potasio, magnesio, cúprico, selenio, zinc, níquel, manganeso, estaño, cadmio, molibdato, vanadato y silicato. En una modalidad, la solución reguladora se selecciona del grupo que consiste de carbonatos, cloruros, sulfatos y fosfatos. En una modalidad, la solución reguladora se selecciona del grupo que consiste de NaHC03, CaCI2, gS04, NaH2P04, Na2HP04> C3H303Na y ácido N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[2-etansulfónico] conocido como HEPES. En una modalidad de la invención, uno de los agentes adicionales agregado al medio es metotrexato. En una modalidad, el metotrexato es utilizado para hacer crecer células CHO que expresan anticuerpos anti-IL-18, anti-l L 12 , anti-TNF-alfa (por ejemplo, anticuerpos anti-TNFa completamente humanos), o anticuerpos contra EPO-R. En una modalidad, se agregan de 100 nM a 5000 nM. En una modalidad, se agregan 500 nM de metotrexato al medio. En una modalidad, se agregan 100 nM de metotrexato. En una modalidad, se agregan 5000 nM de metotrexato. En aún otra modalidad de la invención, uno de los agentes adicionales es un protector de célula, por ejemplo, metilcelulosa o poliol Pluronic (por ejemplo, Pluronic F-68). En una modalidad, se agregan 0.5 g/L a 1.0 g/L de metilcelulosa. En una modalidad, se agregan 0.5 g/L a 1.0 g/L de Pluronic F-68. En una modalidad, se agregan 0.7 g/L a 1.2 g/L de Pluronic F-68. En todavía otra modalidad, el pH de la Parte A es incrementado a un pH máximo de 10. En una modalidad, el pH de la Parte A posteriormente es reducido a un mínimo de 7.0 conforme se agregan los hidrolizados. La invención también proporciona un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-TNF-alfa completamente humano, que comprende: 10.0 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 2 mL/kg ó 4.0 mg/kg de insulina recombinante humana; 3.5 g/kg de glucosa anhidra; 0.292 g/kg de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 0.031 g/kg de NaH2P04-H20; 0.436 g/kg de Na2HP04-7H20; 2.0 g/kg de hidrolizado; y 2.50 mL/kg de metotrexato. La invención también proporciona un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-TNF-alfa completamente humano, que comprende: 10.0 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 6.0 mL/kg ó 12 mg/kg de insulina recombinante humana; 7.0 g/kg de glucosa anhidra; 0.584 g/kg de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 1.8 g/kg de HEPES; 2.45 g/kg de NaCI; 1.0 g/kg de Pluronic F-68; 0.031 g/kg de NaH2P04-H20; 0.436 g/kg de Na2HP04-7H20; 10.7 g/kg de hidrolizado; 6.92 g/kg de peptona Phytone; y 2.50 mL/kg de metotrexato. También incluido en la invención, se encuentra un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-TNF-alfa completamente humano, que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/L de citrato férrico; 3.88 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina recombinante humana; 7.0 g/kg de glucosa anhidra; 0.876 g/kg de L-glutamina; 0.45 g/kg de L-asparagina monohidratada; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 1.8 g/kg de HEPES; 2.67 g/kg de NaCI; 1.0 g/kg Pluronic F-68; 0.031 g/kg de NaH2P04-H20; 0.436 g/kg de Na2HP04-7H20; 10.7 g/kg de hidrolizado; 6.92 g/kg de peptona Phytone; y 2.50 mL/kg de metotrexato. La invención además proporciona un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-TNF-alfa completamente humano, que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/L de citrato férrico; 3.88 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina recombinante humana; 7.0 g/kg de glucosa anhidra; 0.876 g/kg de L-glutamina; 0.45 g/kg de L-asparagina monohidratada; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 1 g/kg de HEPES; 2.67 g/kg de NaCI; 1.0 g/kg de Pluronic F- 68; 0.031 g/kg de NaH2P04-H20; 0.436 g/kg de Na2HP04-7H20; 4.0 g/kg de hidrolizado; 2.6 g/kg de peptona Phytone; yd 2.50 mL/kg de metotrexato. Otro aspecto de la invención es un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/L de citrato férrico; 3.88 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina recombinante humana; 7.0 g/kg de glucosa anhidra; 0.876 g/kg de L-glutamina; 0.45 g/kg de L-asparagina monohidratada; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 1.8 g/kg de HEPES; 2.675 g/kg de NaCI; 1.0 g/kg de Pluronic F-68; 0.031 g/kg de NaH2P04-H20; 0.436 g/kg de Na2HP04-7H20; 4.0 g/kg hidrolizado fuente de levaduras; 2.579 g/kg de peptona Phytone; y 2.50 mL/kg de metotrexato. La invención proporciona un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/L de citrato férrico; 6.5 mL/kg ó 13 mg/kg de insulina recombinante humana; 7.0 g/kg de glucosa anhidra; 0.584 g/kg de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 1.8 g/kg de HEPES; 2.45 g/kg de NaCI; 1.0 g/kg de Pluronic F-68; 0.031 g/kg de NaH2P04-H20; 0.436 g/kg de Na2HP04-7H20; 10.7 g/kg de hidrolizado de levadura; y 6.92 g/kg de peptona Phytone. La invención proporciona un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende. 150.0 g/kg de glucosa anhidra; 5.0 g/kg de L-asparagina monohidratada; 65.0 g/kg de hidrolizado de levadura; y 41.0 g/kg de peptona Phytone.
La invención también proporciona un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 6.5 mL/kg ó 13 mg/kg de insulina recombinante humana; 200.0 g/kg de glucosa anhidra; 0.584 g/kg de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 1.8 g/kg de HEPES; 2.45 g/kg de NaCI; 1.0 mL/kg de Pluronic F-68; 0.031 g/kg de NaH2P04-H20; 0.436 g/kg de Na2HP04-7H20; 10.7 g/kg de hidrolizado de levadura; y 6.92 g/kg de peptona Phytone. La invención incluye un medio mejorado para células CHO Que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 2 mL/kg ó 4 mg/kg de insulina recombinante humana; 3.5 + 1.5 g/kg de glucosa anhidra; 0.292 g/kg de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 2 g/kg de hidrolizado de levadura; y 0.25 mL/kg de metotrexato. La invención incluye un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 2 mL/kg ó 4 mg/kg de insulina recombinante humana; 3.5 + 1.5 g/kg de glucosa anhidra; 0.292 g/kg de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 11 g/kg de hidrolizado de levadura; y 0.250 mL/kg de metotrexato. La invención incluye un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 2 mL/kg ó 4 mg/kg de insulina recombinante humana; 200 g/L de glucosa anhidra; 0.292 g/kg de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 8 g/kg de hidrolizado de levadura; y 0.250 mL/kg de metotrexato. La invención incluye un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 3.88 mL/kg ó 7.76 mg/L de insulina recombinante humana; 7.0 g/L de dextrosa anhidra; 0.876 g/L de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 1.8 g/L de HEPES; 2.67 g/L de NaCI; 1.0 g/L de Pluronic; 0.031 g/L de NaH2P04«H20; 0.436 g/L Na2HP04»7H20; 4.0 g/L de yeastolate; 2.579 g/L peptona Phytone; 0.05 mL/kg de metotrexato; 3.5 mL/L de NaOH 2N; y 2.91 g/L de HCI 2N; lo cual da como resultado un pH final de 7.10 a 7.20 y una osmolaridad final de 373 a 403 mOsmo/kg. La invención incluye un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 13 mg/L de insulina recombinante humana; 7.0 g/L dextrosa anhidra; 0.584 g/L L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 1.8 g/L de HEPES; 2.45 g/L de NaCI; 1.0 g/L de Pluronic; 0.031 g/L de NaH2P04»H20; 0.436 g/L de Na2HP04-7H20; 10.7 g/L de yeastolate; 6.92 g/L de peptona Phytone; 0.05 mL/kg de metotrexato; 5.67 mL/L de NaOH 2N; y 2.5 g/L de HCI 2N; lo cual da como resultado un pH final de 7.10 a 7.20 y una osmolaridad final de 373 a 403 mOsmo/kg. La invención incluye un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 4 mg/kg de insulina recombinante humana; 1.5 g/kg dextrosa anhidra; 0.292 g/kg de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 2.0 g/L de yeastolate; y 0.25 mL/kg de metotrexato; lo cual da como resultado un pH final de 7.10 a 7.30 y una osmolaridad final de 300 a 340 mOsmo/kg. La invención incluye un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 13 mg/kg de insulina recombinante humana; 7.0 g/kg de dextrosa anhidra; 0.584 g/kg de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 1.8 g/kg de HEPES; 2.45 g/kg de NaCI; 1.0 g/kg de Pluronic F-68; 0.031 g/kg de NaH2P04»H20; 0.436 g/kg de Na2HP04*7H20; 10.7 g/L de yeastolate; y 6.92 g/kg de peptona Phytone; 5.67 mL/kg de NaOH; y 2.5 mL/kg de HCI; lo cual da como resultado un pH final de 7.10 a 7.20 y una osmolaridad final de 373 a 403 mOsmo/kg. La invención incluye un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 7.76 mg/kg de insulina recombinante humana; 7.0 g/L de dextrosa anhidra; 0.876 g/kg de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 1.8 g/kg de HEPES; 2.67 g/kg de NaCI; 1.0 g/kg de Pluronic F-68; 0.031 g/kg de NaH2P04«H20; 0.436 g/kg de Na2HP04»7H20; 4.0 g/L de yeastolate; y 2.579 g/L de peptona Phytone; 0.05 mL/L de metotrexato; 3.5 mL/kg de NaOH; y 2.91 mL/kg de HCI; lo cual da como resultado un pH final de 7.10 a 7.20 y una osmolaridad final de 373 a 403 mOsmo/kg. La invención incluye un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 13 mg/kg de insulina recombinante humana; 7.0 g/L de dextrosa anhidra; 0.584 g/kg de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 1.8 g/kg de HEPES; 2.45 g/kg de NaCI; 1.0 g/kg de Pluronic F-68; 0.031 g/kg de NaH2P04»H20; 0.436 g/kg de Na2HP04«7H20; 10.7 g/L de yeastolate; y 6.92 g/L de peptona Phytone; 0.05 mL/L de metotrexato; 5.67 mL/kg de NaOH; y 2.5 mL/kg de HCI; lo cual da como resultado un pH final de 7.10 a 7.20 y una osmolaridad final de 373 a 403 mOsmo/kg. La invención incluye un medio mejorado para células CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-18 que comprende: 10 mL/kg ó 122 mg/kg de citrato férrico; 13 mg/kg de insulina recombinante humana; 7.0 g/L de dextrosa anhidra; 0.584 g/kg de L-glutamina; 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; 1.8 g/kg de HEPES; 1.0 g/kg de Pluronic F-68; 0.031 g/kg de NaH2P04»H20; 0.436 g/kg de Na2HP04*7H20; 14.27 g/L de yeastolate; 9.23 g/L de peptona Phytone; 0.05 mL/L de metotrexato; 8.95 mL/kg de NaOH; y 4.1 mL/kg de HCI; lo cual da como resultado un pH final de 7.10 a 7.20 y una osmolaridad final de 373 a 403 mOsmo/kg. La invención también caracteriza un método para incrementar la productividad de una línea de células CHO que producen un anticuerpo IgG 1 , mediante el aumento del título final, que comprende: agregar butirato de sodio y agregar N-acetilcisteína. En una modalidad, el anticuerpo lgG1 es un anticuerpo anti-IL-18. En una modalidad, el incremento en la productividad se mide por un incremento en el título final. En una modalidad, el incremento en el título final es alcanzado mediante la adición de butirato de sodio a una concentración de 0.1 mM a 10 mM. En una modalidad, la concentración del butirato de sodio es de 0.1 mM a 8.0 mM. En una modalidad, la concentración del butirato de sodio es de 0.1 mM a 3.0 mM. En una modalidad, la concentración del butirato de sodio es de 0.125 mM a 2.0 mM. En una modalidad, la concentración del butirato de sodio es de 0.125 mM. En una modalidad, el incremento en el título final es de 10-80%. En una modalidad, el incremento en el título final es de 20-60%. En una modalidad, el incremento en el título final es de 35-55%. En una modalidad, el incremento en el título final es de 40%. En una modalidad, la longevidad del cultivo celular mejorado se logra mediante la adición de N-acetilcisteína a una concentración de 0.1 mM a 10 mM. En una modalidad, el incremento en la longevidad del cultivo celular es de 5-50%. La invención también proporciona un medio de cultivo celular que incrementa la productividad de una línea de células CHO que producen un anticuerpo lgG1 mediante el aumento del título final, que comprende: medio SR-371 y butirato de sodio. En una modalidad, el anticuerpo IgG 1 es un anticuerpo anti-IL-18. En una modalidad, el incremento de productividad se mide al incrementar el título final de anti-IL-18 en un 10-80%. En una modalidad, el incremento de productividad se mide al incrementar el título final de anti-IL-18 en un 20-60%. En una modalidad, el incremento de productividad se mide por el incremento del título final de anti-IL-18 en un 35-55%. En una modalidad, el incremento de productividad se mide por el incremento del título final de anti-IL-18 en un 40%. En una modalidad, la concentración del butirato de sodio agregado es 0.125 mM a 8.0 mM. En una modalidad, la concentración del butirato de sodio agregado es 0.2 mM a 3.0 mM. En una modalidad, la concentración del butirato de sodio agregado es 0.3 mM a 2.0 mM. En una modalidad, la concentración del butirato de sodio agregado es 0.125 mM. En una modalidad, la concentración del N-acetilcisteína agregada es 1 mM a 10 mM. En una modalidad, la concentración del N-acetilcisteína agregada es 5 mM a 10 mM. En una modalidad, el título final promedio es aumentado en un 5-50%. En una modalidad, el título final promedio es aumentado en un 15-35%. En una modalidad, el título final promedio es aumentado en un 25-35%. Descripción de la Figura La Figura 1 es una gráfica que muestra el título de crecimiento de ABT-874 como una función de la densidad celular viable en la siembra. Los resultados de la titulación en el día 15 están fuertemente correlacionados con la densidad de células viables en la siembra. Un ajuste polinomial a los datos anteriores, sugiere que la densidad de alimentación óptima ocurre en alrededor de 3.5 x 106 células/mL. Los parámetros del proceso fueron pH = 6.9, T = 35°C, DO = 40%, relación de inoculo 1:5 ó 1:4 en medio 4X; la alimentación inició a la densidad especificada, 1% de volumen inicial durante 10 días. Descripción Detallada de la Invención I. Definiciones En tanto que la terminología utilizada en la presente Solicitud es la acostumbrada dentro de la técnica, las definiciones de ciertos términos son proporcionadas en la presente para asegurar claridad y concreción al significado de las reivindicaciones. El término "anticuerpo", tal como se utiliza en la presente, se pretende que se refiera a moléculas de inmunoglobulina comprendidas de cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como HCVR ó VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como LCVR ó VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida por el dominio CL. Las regiones VH y VL pueden estar además subdivididas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que son más conservadas, regiones de marco (FR). Cada región VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, arreglados del extremo amino-terminal al extremo carboxi-terminal, en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ejemplos de anticuerpo que pueden ser producidos utilizando los métodos y composiciones de la invención, incluyen anticuerpos del factor de necrosis tumoral alfa (TNF)-a (también referidos como anticuerpos anti-TNFa), anticuerpos contra interleucina ( I L ) - 12 (también referidos como anticuerpos anti-IL-12), anticuerpos contra interleucina (IL)-18 (también referidos como anticuerpos anti-l L 18), y anticuerpos anti-EPO/R (también referidos en la presente como anticuerpos contra EPO/R). Los anticuerpos contra TNFa que pueden ser producidos utilizando la invención, se describen con mayor detalle en las Patentes Norteamericanas Nos. U.S. 6,090,382; 6,258,562; y 6,509,015, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia, en su totalidad. La invención puede también ser utilizada para producir fragmentos de anticuerpo. El término "porción de unión al antígeno" o "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), tal como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo hTNFa). Se ha mostrado que algunos fragmentos de un anticuerpo de longitud completa puede llevar a cabo la función de unión al antígeno de un anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo, incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (¡i) un fragmento F(ab')2, un fragmento divalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro a la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546), que consiste del dominio VH ó VL; (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR); y (vii) un anticuerpo de dominio variable dual (DVD). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH son codificados por genes por separado, éstos pueden ser unidos, utilizando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que les permita ser fabricados como una cadena de proteína simple, en la cual el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes FV (scFV) de una sola cadena, véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sd. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de una sola cadena también están abarcados dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de una sola cadena, tales como diacuerpos también están abarcadas. Los diacuerpos son anticuerpos divalentes, biespecificos, en donde los dominios VH y VL son expresados en una cadena polipetidica simple, pero utilizando un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, por lo que de esta manera se fuerza a los dominios a aparearse con los dominios de complementariedad de otra cadena, y creando dos sitios de unión al antígeno (véase por ejemplo Holliger et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sd. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Ejemplos de porciones de anticuerpo que pueden ser producidas mediante los métodos de la invención, se describen con más detalle en las Patentes Norteamericanas Nos. U.S. 6,090,382, 6,258,562, 6,509,015, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia, en su totalidad. La producción de fragmentos o porciones de anticuerpo utilizando los métodos y composiciones de la invención, también se incluyen dentro del alcance de la misma. El término "anticuerpo humano recombinante", tal como se utiliza en la presente, se pretende que incluya todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados y aislados por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados, utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinantes combinatoria (descrita más adelante), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo un ratón), que sea transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que involucre el empalmamiento de las secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes son sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, en tanto se deriven de y se relacionen con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de manera natural dentro del repertorio de la línea de anticuerpos humanos, in vivo. Un "anticuerpo aislado", tal como se utiliza en la presente, se pretende que se refiera a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a hTNFa, está sustancialmente libre de anticuerpos Que específicamente se unen a antígenos diferentes de hTNFa). Un anticuerpo aislado que específicamente se une a hTNFa puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de TNFa de otras especies. Más aún, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o químicos. El término "medio basal", se refiere a cualquier medio que sea capaz de soportar el crecimiento de células. El medio basal suministra sales inorgánicas estándar, tales como zinc, fierro, magnesio, calcio y potasio, así como elementos traza, vitaminas, una fuente de energía, un sistema regulador, y aminoácidos esenciales. Ejemplos de medios básales incluyen, pero no se limitan a, Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), DME/F12, Medio Esencial Mínimo (MEM), Medio Basal de Eagle (MBE), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio Esencial Mínimo a (???-a), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (MEM-G), PF CHO (SAFC Biosciences) y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove. El término "medio basal modificado", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un medio basal a partir del cual al menos un ingrediente, componente o nutriente estándar (es decir, al menos un ingrediente, componente o nutriente encontrado en un medio basal formulado de manera acostumbrada en la técnica) ha sido excluido, disminuido o incrementado. El término "modificado", tal como se utiliza en el contexto del término "medio basal modificado", también puede referirse a cambios de las proporciones entre los componentes individuales dentro del medio basal. En una modalidad preferida de la invención, un medio basal modificado excluye al menos uno de los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, una solución reguladora, fosfato de sodio (monobásico y/o dibásico), un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y glucosa, por ejemplo, monosacárido glucosa. Tal como se utiliza en la presente, los términos "medio de cultivo celular", "medio de cultivo", y "formulación de medio", se refieren a una solución nutritiva para el mantenimiento, crecimiento, propagación o expansión de células en un medio artificial in vitro fuera de un organismo o tejido pluricelular. El medio de cultivo celular puede ser optimizado para un uso de cultivo celular específico, incluyendo, por ejemplo medio de crecimiento de cultivo celular el cual se formula para promover el crecimiento celular, o medio de producción de cultivo celular, el cual se formula para promover la producción de proteínas recombinantes. Los términos "nutriente", "ingrediente" y "componente", se utilizan de manera indistinta en la presente, para referirse a los componentes que constituyen un medio de cultivo celular. Los términos "medio de producción de cultivo celular" o "medio de producción", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un medio de cultivo celular diseñado para utilizarse durante la fase de producción de un cultivo celular. En una modalidad preferida, el medio de producción es diseñado para la expresión de proteínas recombinantes durante la fase de producción. Se proporcionan en la presente ejemplos de medios de producción, incluyendo las Tablas 2-7 de la Sección de Ejemplos. Los términos "cultivo celular de alimentación por lotes" y "cultivo de alimentación por lotes", tal como se utiliza en la presente, se refieren a un cultivo celular en donde las células, de preferencia células de mamífero y el medio de cultivo, son suministrados al recipiente de cultivo inicialmente, y adicionalmente se alimentan nutrientes de manera continua o en incrementos discretos al cultivo durante la fase de cultivo, con o sin cosecha periódica de células y/o producto antes del término del cultivo. Un "método de alimentación por lotes" se refiere a un método por el cual un cultivo celular de alimentación por lotes es provisto de nutrientes adicionales. Por ejemplo, un método de alimentación por lotes puede comprender agregar medios suplementarios de conformidad con un esquema de alimentación determinado dentro de un periodo de tiempo dado.
Tal como se utiliza en la presente, el término "alimentar", se refiere a cualquier adición de cualquier sustancia hecha para un cultivo después de la inoculación. La alimentación puede ser una o más adiciones. Tal como se utiliza en la presente, los términos "solución de alimentación" y "medio de alimentación", se refiere a un medio que contenga uno o más nutrientes que se agregan al cultivo, iniciando en algún momento después de la inoculación. En una modalidad, la solución de alimentación es una alimentación combinada que comprende un medio basal y al menos un hidrolizado, por ejemplo un hidrolizado basado en soya, un hidrolizado basado en levadura o una combinación de los dos tipos de hidrolizados. En otra modalidad de la invención, una solución de alimentación puede incluir sólo un medio basal, tal como un medio basal concentrado, o puede incluir sólo hidrolizados, o hidrolizados concentrados. Tal como se utiliza en la presente, el término "sistema de control de retroalimentación", se refiere a un proceso para monitorear un parámetro dado, por medio del cual se agrega un agente adicional o se realiza una modificación del medio ambiente del cultivo celular, con el fin de cumplir un punto establecido de un parámetro deseado. En una modalidad, el parámetro dado es la concentración de glucosa de un cultivo de células de mamífero, por medio del cual la concentración de glucosa es utilizada para determinar cuando una solución de alimentación, por ejemplo, una solución de alimentación combinada, debe ser agregada al cultivo celular. Se puede utilizar un sistema de control de retroalimentación para mantener los componentes nutricionales necesarios para optimizar la producción de proteínas en un cultivo de células de mamífero. Tal como se utiliza en la presente, el término "perfil de alimentación", se refiere a un esquema para suplementar un cultivo de células de mamífero con una solución de alimentación, por ejemplo una solución de alimentación combinada. Un perfil de alimentación es de preferencia generado utilizando un sistema de control de retroalimentación. Las células pueden ser "manipuladas por ingeniería genética", para expresar un polipéptido o proteína específico, cuando las secuencias de ácido nucleico recombinantes que permiten la expresión del polipéptido, hayan sido introducidas a las células utilizando métodos de "ingeniería genética", tal como infección viral con un virus recombinante, transfección, transformación o electroporación. Véase Kaufman et al. (1990), Meth. Enzymol. 185: 487-511; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, y actualizaciones trimestrales). Los métodos y vectores para las células y/o líneas de células manipuladas por ingeniería genética para expresar una proteína de interés, son bien conocidos por los técnicos en la materia. Las técnicas de ingeniería genética incluyen, pero no se limitan a vectores de expresión, recombinación homologa dirigida y activación génica (véase por ejemplo la Patente Norteamericana No. 5,272,071 de Chappel) y transactivación por factores de transcripción manipulados por ingeniería (véase por ejemplo Segal et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96(6):2758-63). Opcionalmente, los polipéptidos son expresados bajo el control de un elemento de control heterologo tal como por ejemplo un promotor que no dirige de manera natural la producción de ese polipéptido. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor viral fuerte (por ejemplo CMV, SV40), que dirige la expresión de un polipéptido de mamífero. La célula huésped puede o no producir el polipéptido de manera normal. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula CHO que ha sido manipulada por ingeniería genética para producir un polipéptido humano, lo que quiere decir que el ácido nucleico que codifica el polipéptido humano ha sido introducido a la célula CHO. Alternativamente, la célula huésped puede ser una célula humana que ha sido manipulada por ingeniería genética, para producir concentraciones incrementadas de un polipéptido humano normalmente presente sólo a muy bajas concentraciones (por ejemplo reemplazando el promotor endógeno con un promotor viral fuerte). El término "fase de crecimiento", tal como se utiliza en la presente, se refiere al periodo durante el cual las células cultivadas se dividen rápidamente e incrementan en número. Durante la fase de crecimiento, las células pueden ser cultivadas generalmente en un medio y bajo condiciones diseñadas para maximizar la proliferación celular. El término "hidrolizado", incluye cualquier enzima de digestión, particularmente un tipo especializado de extracto preparado tratando la sustancia a ser extraída (por ejemplo, componentes de plantas o células de levadura), con al menos una enzima capaz de romper los componentes de la sustancia en formas más simples (por ejemplo, en una preparación que comprende monosacáridos o disacáridos y/o monotripéptidos o tripéptidos). Un "hidrolizado" puede además ser digerido enzimáticamente, por ejemplo mediante papaína, y/o formado por autolisis, termólisis y/o plasmólisis. En una modalidad preferida de la invención, el hidrolizado no es preparado a partir de una fuente animal; es decir, Que no es de origen animal. Ejemplos de hidrolizados que no son de origen de animal, incluyen hidrolizados basados en plantas, por ejemplo, el hidrolizado no es preparado de una fuente animal, es decir, que no es de origen animal. Ejemplos de hidrolizados que no son de origen animal preferidos incluyen hidrolizados basados en plantas, por ejemplo, un hidrolizado basado en soya, e hidrolizados que no se derivan de plantas ni de animales, por ejemplo un hidrolizado basado en levadura. Los términos "solución de enriquecimiento de hidrolizado" y "medio de enriquecimiento de hidrolizado", se refiere a un medio que contiene un hidrolizado o una combinación de hidrolizados, es decir, hidrolizados extraídos de diferentes fuentes, como un ingrediente principal que es agregado al cultivo celular. La solución de enriquecimiento de hidrolizado puede, por ejemplo, ser agregada al cultivo celular para intensificar la producción proteínica. De manera similar, los términos "solución de enriquecimiento basal" y "medio de enriquecimiento basal", se refiere a un medio que contiene un medio basal (o combinación de medios básales) como ingrediente principal. En una modalidad, una solución de enriquecimiento de hidrolizado o una solución de enriquecimiento basal o una combinación de las dos soluciones de enriquecimiento, es agregada a un cultivo celular para incrementar la productividad de un cultivo celular en la producción de una proteína. La producción de una proteína es "incrementada" mediante la adición de un agente adicional o la alteración de un parámetro del proceso de producción proteínico, si la cantidad de polipéptido producido en un cultivo que contiene el agente adicional o parámetro alterado del proceso de producción proteínico, es mayor que la cantidad de polipéptido producido en otro cultivo idéntico que no contenga el agente adicional o parámetro alterado del proceso de producción proteinica. Ejemplos de alteraciones al proceso de producción proteinica incluyen, pero no se limitan a, adición de medios suplementarios, incrementos en la cantidad de medios de suplementarios, variaciones en la temperatura del cultivo, y la concentración de oxígeno a la cual las células son cultivadas. Un agente adicional puede ser proporcionado al cultivo celular, utilizando una solución suplementaria, tal como una solución de alimentación . El término "ingrediente" se refiere a cualquier compuesto, si es de origen químico o biológico, que pueda ser utilizado en los medios de cultivo celular para mantener o promover el crecimiento de proliferación de células. Los términos "componente", "nutriente" e "ingrediente" se usan indistintamente y todos tienen la intención de referirse a tales componentes. Los ingredientes típicos que son utilizados en los medios de cultivo celular incluyen aminoácidos, sales, metales, azúcares, lípidos, ácidos nucleicos, hormonas, vitaminas, ácidos grasos, proteínas y similares. Otros ingredientes que promueven o mantienen el cultivo de células ex vivo, se pueden seleccionar por los técnicos en la materia, dentro del alcance de la invención, y de conformidad con la necesidad particular. Tal como se utiliza en la presente, el término "inoculación", se refiere a la adición de células a un medio para iniciar el cultivo. El término "fase de producción" se refiere a un periodo durante el cual las células están produciendo cantidades máximas de un polipéptido o proteína recombinante. Una fase de producción está caracterizada por menos división celular que durante la fase de crecimiento, y también puede incluir el uso de un medio y condiciones de cultivo diseñadas para maximizar la producción polipeptídica. Un "polipéptido recombinante" o "proteína recombinante" es un polipéptido o proteína resultante del proceso de ingeniería genética. En una modalidad preferida, las proteínas recombinantes son obtenidas del cultivo de células que expresan dichas proteínas en un cultivo celular. El término "fase de transición", significa un periodo de cultivo celular entre una "fase de crecimiento" y una "fase de producción". Durante la fase de transición, el medio y las condiciones ambientales pueden ser modificados de las diseñadas para maximizar la proliferación con respecto a aquéllas diseñadas para maximizar la producción polipeptídica. La presente invención proporciona nuevas composiciones y procesos para la producción de proteínas, de preferencia una proteína recombinante, por ejemplo anticuerpos de mamíferos, por ejemplo cultivos de células de Ovario de Hámster Chino (CHO). Los medios de cultivo celular y procesos descritos en la presente, han sido utilizados para la producción de proteínas recombínantes, particularmente la producción de un anticuerpo monoclonal recombinante (completamente humano, humanizado o quimérico). Los medios y procesos han sido modificados respecto a numerosas líneas de producción de anticuerpos para incorporar varias mejorías y avances, que conduzcan al crecimiento y productividad incrementados de células de mamífero, por ejemplo células CHO. Se proporcionan en detalle más adelante, aspectos de las composiciones y métodos mejorados de la invención. II. Proteínas de Interés Generalmente, los métodos y composiciones de la invención son útiles para la producción de proteínas recombínantes. Las proteínas recombínantes son producidas por el proceso de ingeniería genética. Las proteínas particularmente preferidas para la producción de conformidad con los métodos y composiciones de la invención, son productos terapéuticos basados en proteínas, también conocidos como productos biológicos. De preferencia, las proteínas son secretadas como productos extracelulares. Las proteínas que pueden ser producidas utilizando los métodos y composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos. Se conocen numerosas técnicas en el campo mediante las cuales el ADN que codifica moléculas de anticuerpo se puede manipular para producir ADNs capaces de codificar proteínas recombinantes, tales como anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos con afinidad mejorada u otros polipéptidos basados en anticuerpos (véase por ejemplo Larrick et al., 1989, Biotechnology 7:934-938; Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-327; Roberts et al., 1987, Nature 328:731-734; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536; Chaudhary et al., 1989, Nature 339:394-397, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia). En la invención también se pueden utilizar células recombinantes que producen anticuerpos completamente humanos (tales como los que son preparados utilizando animales transgénicos, y opcionalmente además modificados in vitro), así como anticuerpos humanizados. El término "anticuerpo humanizado", también abarca anticuerpos de cadena simple. Véase, por ejemplo, Cabilly et al., Patente Norteamericana No. 4,816,567; Cabilly et al., Patente Europea No. 0,125,023 B1; Boss et al., Patente Norteamericana No. 4,816,397; Boss et al., Patente Europea No. 0,120,694 B1; Neuberger, M. S. et al., Publicación Internacional de Patente WO 86/0.1533; Neuberger, M. S. et al., Patente Europea No. 0,194,276 B1; Winter, Patente Norteamericana No. 5,225,539; Winter, Patente Europea No. 0,239,400 B1; Queen et al., Patente Europea No. 0 451 216 B1; y Padlan, E. A. et al., Patente EP 0519596 A1, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. Por ejemplo, la invención puede ser utilizada en la producción de anticuerpos humanos y/o humanizados que reconocen inmunoespecíficamente blancos celulares específicos, por ejemplo cualquiera de las proteínas anteriormente mencionadas, el receptor EGF humano, el antígeno her-2/neu, el antígeno CEA, el Antígeno Membranal Específico de la Próstata (AMEP), CD5, CD11a, CD18, NGF, CD20, CD45, CD52, Ep-cam, otras moléculas cancerígenas de superficie celular, TNF-alfa, TGF-b1, factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV), otras citocinas, alfa 4 beta 7 integrína, IgEs, proteínas virales (por ejemplo citomegalovirus). Ejemplos de anticuerpos que pueden ser producidos utilizando las composiciones y métodos de la invención, incluyen, pero no se limitan a, anticuerpo anti-TNFa, anticuerpo anti-IL-12, anticuerpo anti-IL-18, y anticuerpo contra el receptor de EPO (EPO-R). En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa es un anticuerpo anti-TNFa completamente humano, por ejemplo adalimumab/D2E7 (véase la Patente Norteamericana No. 6,090,382, incorporada en la presente como referencia; Humira®; Abbott Laboratories). En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-12 es un anticuerpo anti-IL-12 completamente humano, por ejemplo ABT-874 (Abbott Laboratories; véase la Patente Norteamericana No. 6,914,128, incorporada en la presente como referencia). En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-18 es un anticuerpo IL-18 completamente humano (por ejemplo, ABT-325), por ejemplo veánse también los anticuerpos descritos en la Patente Norteamericana No. US20050147610 A1. En una modalidad, el anticuerpo contra EPO/R (también referido como ABT-007), es un anticuerpo completamente humano, similar al descrito en la Publicación de Patente Norteamericana No. US 20060018902 A1, que se incorpora en la presente como referencia.
Otro ejemplo del tipo de proteína que puede ser producida utilizando los métodos y composiciones de la invención, incluyen proteínas de fusión. Una proteína de fusión es una proteína o dominio o una proteína (por ejemplo un dominio extracelular soluble) fusionado a una proteína o péptido heterólogo. Ejemplos de tales proteínas de fusión incluyen proteínas expresadas en forma de fusión con una porción de una molécula de inmunoglobulina, proteínas expresadas como proteínas de fusión con una porción de cremallera y proteínas polifuncionales novedosas, tales como una proteína de fusión de una citocina y un factor de crecimiento (es decir, GM-CSF e IL-3, MGF e IL-3). Las Publicaciones Internacionales de Patente WO 93/08207 y WO 96/40918 describen la preparación de varias formas oligoméricas solubles de una molécula referida como CD40L, que incluye una proteína de fusión de inmunoglobulina y una proteína de fusión de cremallera, respectivamente; las técnicas discutidas ahí son aplicables a otras proteínas. Otra proteína de fusión es un TNFR:Fc recombinante, también conocido como etanercept. El etanercept o Enbrel , Amgen/Wyeth) es un dímero de dos moléculas de la porción extracelular del receptor del TNF-a p75, cada molécula consiste de un polipéptido derivado del TNFR de 235 aminoácidos que está fusionado a una porción Fe de la IgG 1 humana de 232 aminoácidos. De hecho, cualquier molécula puede ser expresada como una proteína de fusión incluyendo, pero no limitándose a, el dominio extracelular de una molécula del receptor celular, una enzima, una hormona, una citocina, una porción de una molécula de inmunoglobulina, un dominio de cremallera y un epítopo.
III. Medios de Cultivo Celular de la Invención La presente invención proporciona medios de cultivo celular para utilizarse en cultivos de células de mamíferos para la producción o expresión de proteínas recombinantes, por ejemplo anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos. Los diversos medios de cultivo celular descritos en la presente, pueden ser utilizados por separado o de manera conjunta para mejorar el cultivo celular, incluyendo la producción proteínica incrementada y el extendimiento de la longevidad celular. En una modalidad preferida, los medios de cultivo celular de la invención son libres de suero, lo que quiere decir que el medio no contiene suero (por ejemplo, suero fetal bovino (SFB), suero de caballo, suero de cabra, o cualquier otro suero derivado de un animal conocido por un técnico en la materia).
En un primer aspecto, la invención proporciona un medio de cultivo de células de mamífero que incluye, por completo o en parte, un medio basal modificado. Los medios celulares básales modificados pueden ser derivados de medios celulares básales estándar conocidos en la técnica. Los medios básales adecuados incluyen pero no se limitan a Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), DME/F12, Medio Esencial Mínimo (MEM), Medio Basal de Eagle (MBE), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio Esencial Mínimo a (???-a), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (MEM-G), PF CHO (véase por ejemplo medio libre de proteínas CHO) (Sigma) o Medio Libre de Suero PF CHO EXCELL™ 325 para células CHO libres de proteína (SAFC Biosciences), y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove. Otros ejemplos de medios básales que pueden ser utilizados en la invención incluyen Medio Basal BME (Gibco-lnvitrogen; véase también Eagle, H (1965) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 89, 36); Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, en polvo) (Gibco-lnvitrogen (# 31600); véase también Dulbecco and Freeman (1959) Virology 8, 396; Smith et al. (1960) Virology 12, 185. Tissue Culture Standards Commitee, In Vitro 6:2, 93); CMRL 1066 Médium (Gibco-lnvitrogen (#11530); véase también Parker R.C. et al (1957) Special Publications, N.Y. Academy of Sciences, 5, 303).
El medio basal puede ser modificado con el fin de remover ciertos componentes no nutricionales encontrados en el medio basal estándar, tales como varias soluciones reguladoras orgánicas e inorgánicas, agentes tensoactivos y cloruro de sodio. La remoción de tales componentes del medio celular basal permite una concentración mayor de los componentes nutricionales restantes, y mejora todo el crecimiento celular y la expresión proteínica, tal como se describe en la presente. Además, los componentes omitidos pueden ser agregados de regreso al medio de cultivo celular que contiene el medio celular basal modificado, de conformidad con los requerimientos de las condiciones de cultivo celular. Como se describe más adelante, se ha encontrado que separar ciertos ingredientes del medio celular basal, es decir, agregar medio celular basal modificado como un ingrediente en un medio de cultivo celular, y subsecuentemente agregar el ingrediente de regreso al medio de cultivo celular como un ingrediente separado, proporciona propiedades ventajosas al crecimiento del cultivo celular y a la producción proteínica.
El medio basal modificado de la invención excluye cualquiera, sino todos, los siguientes ingredientes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa. Estos ingredientes son comúnmente encontrados en medios celulares básales disponibles en el comercio.
La exclusión de componentes, por ejemplo, bicarbonato de sodio, una solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y/o monosacárido glucosa, puede ser realizada por servicios comerciales, por ejemplo, SAFC Pharma™. Un técnico en la materia apreciará que los medios básales modificados pueden ser obtenidos, en una modalidad, utilizando un servicio comercial de medios de cultivo celular, es decir, un servicio de medios de cultivo preparados a la medida. Ejemplos de servicios de medios de cultivo preparados a la medida son proporcionados por compañías tales como SAFC (a saber JRH Bioscience), Invitrogen®, Atlanta Biologicals®, y Lonza.
Alternativamente, un técnico en la materia puede preparar el medio celular basal modificado de la invención de conformidad con métodos estándar, para preparar medios celulares básales, en donde los ingredientes específicos descritos en la presente son omitidos (véase por ejemplo, Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique; BD Bionutrients Technical Manual, (2006), Tercera Edición; Jenkins, ed. (1999), Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Humana Press; Doyle y Griffiths, eds., (1997) Essential Techniques: Mammalian Cell Culture, John Wiley and Sons; Butler, ed. (1991) Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach Oxford University Press; Darling y Morgan (1994) Animal Cells: Culture and Media, John Wiley and Sons; Freshney, ed. (1992), Animal Cell Culture: A Practical Approach (2nd ed), Oxford University Press; Pollard and Walker (1997), Basic Cell Culture Protocols (2nd Ed), Humana Press, (Parte de Métodos en la series de Biología Molecular, Volumen 75), cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia).
En una modalidad, el medio de cultivo celular de la invención contiene un medio celular basal modificado, una fuente de fierro (de preferencia inorgánico, por ejemplo, citrato férrico), un factor de crecimiento recombinante; una solución reguladora; un agente tensoactivo; un regulador de osmolaridad; una fuente de energía; y al menos dos diferentes hídrolizados que no son de origen animal. Además, el medio celular basal modificado puede opcionalmente contener aminoácidos, vitaminas, o una combinación de ambos aminoácidos y vitaminas.
Tal como se utiliza en la presente, el término "fierro" significa una fuente de fierro que no es de origen animal utilizada para suplementar el medio. La fuente de fierro en el medio de cultivo celular de preferencia es inorgánica. La fuente de fierro de preferencia es inorgánica, e incluye, por ejemplo, sales férricas y sales ferrosas, tales como citrato férrico o sulfato ferroso. Las sales queladas tales como citrato férrico y citrato de amonio férrico se prefieren. Sin embargo, se pueden utilizar otras fuentes de fierro que no sean aisladas de una fuente animal, por ejemplo quelantes químicos de fierro o portadores de fierro de proteína recombinante que proporcionan cantidades equivalentes de fierro. Los componentes quelantes de fierro que pueden ser utilizados incluyen, pero no se limitan a quelatos de fierro del ácido etilendiamintetraacético (AEDT), ácido etilenglicol-bis(beta-aminoetiléte -N.N^N'.N'-tetraacético (EGTA), mesilato de desferoxamina, dimercaptopropanol, ácido dietilentriaminpentaacético (ADPA) y ácido transé ,2-diaminociclohexan-N,N,N',N'-tetraacético (CDTA), así como un quelato de citrato férrico y un quelato de sulfato ferroso. Una fuente particularmente preferida de fierro es citrato férrico, que de preferencia está presente en el volumen final del medio de cultivo celular en una concentración de 0.1-1 mM. En una modalidad, la concentración del citrato férrico es de aproximadamente 0.5 mM. En otra modalidad, la concentración del citrato férrico es de 100-150 mg/L, por ejemplo, 122 mg/L. Números intermedios de las concentraciones mM mencionados anteriormente, por ejemplo, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, y 1.0 mM, and mg/L, por ejemplo, 100, 110, 120, 130, 140, and 150, también se pretende que formen parte de la presente invención.
Ejemplos no limitantes de factores de crecimiento que pueden ser incluidos en el medio de cultivo celular, son insulina o un análogo recombinante de la misma, IGF-1, y una combinación de insulina e IGF-1. Un factor de crecimiento recombinante particularmente preferido es la insulina, o un análogo recombinante de la misma, que de preferencia está presente en el volumen final del medio de cultivo celular en una concentración de entre aproximadamente 4 mg/L a 13 mg/L. Números intermedios de las concentraciones mencionadas anteriormente de insulina, también se pretende que formen parte de la invención, por ejemplo, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, y 13. El medio de cultivo celular también puede incluir una solución reguladora. En una modalidad preferida, una solución reguladora es excluida del medio celular basal modificado, pero agregada como un componente por separado al medio de cultivo celular (al cual también se agrega el medio celular basal modificado). Las soluciones reguladoras para utilizarse en el medio de cultivo celular son conocidas en la técnica. Ejemplos no limitantes de soluciones reguladoras que pueden incluirse en el medio de cultivo celular son solución regladora de fosfatos, HEPES, y bicarbonato de sodio. En una modalidad, el bicarbonato de sodio es agregado como una solución reguladora al medio de cultivo celular a una concentración final de aproximadamente 0.1-3 g/L. En una modalidad, el bicarbonato de sodio es agregado como una solución reguladora al medio de cultivo celular a una concentración final de aproximadamente 1.6 g/L. En una modalidad, HEPES es agregado como una solución reguladora al medio de cultivo celular a una concentración final de aproximadamente 0.1-3 g/L. En otra modalidad, HEPES es agregado como una solución reguladora al medio de cultivo celular a una concentración final de 1.8 g/L. En una modalidad, una solución regladora de fosfatos, por ejemplo, fosfato de sodio monobásico y dibásico, es agregado al medio de cultivo celular a una concentración final de entre 0.01 y 0.5 g/L. Números intermedios de las concentraciones anteriormente citadas, también se pretende que formen parte de la invención, por ejemplo, concentración de bicarbonato de sodio o HEPES de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, y 3.0 ó la concentración de solución reguladora de fosfatos de 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.18, 0.2, 0.22, 0.24, 0.26, 0.28, 0.3, 0.32, 0.34, 0.36, 0.38, 0.4, 0.42, 0.44, 0.46, 0.48, y 0-5 g/L.
La solución reguladora se incluye para ayudar a mantener al medio de cultivo celular a un pH deseado. En una modalidad, el pH del medio de cultivo celular varía de 6.0 a 8.0; 6.5 a 7.5; ó 7.1 a 7.2. Números intermedios de estos valores de pH, por ejemplo 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, y 8.0, así como otros números mencionados en la presente, también se pretende que formen parte de la presente invención. Los rangos de valores, utilizando una combinación de cualquiera de los valores mencionados anteriormente como límites superiores y/o inferiores, se pretende que se incluyan en el alcance de la invención. El medio de cultivo celular también puede incluir un regulador de osmolaridad, tal como NaCI. En una modalidad, se agrega NaCI al medio de cultivo celular a una concentración final de entre aproximadamente 1.0 a 6.5 g/L. En una modalidad, la osmolaridad del medio de cultivo celular varía de 260 a 450 mOsm/kg. En una modalidad, la osmolaridad del medio de cultivo celular varía de 320 a 450 mOsm/kg. Números intermedios a las concentraciones de NaCI mencionadas y valores de mOsm/kg, por ejemplo concentración de NaCI de 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, y 6.5 ó un rango de mOsm/kg de 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, así como números intermedios de los mismos, también se pretende que formen parte de la presente invención. Los rangos de valores, utilizando una combinación de cualquiera de los valores mencionados anteriormente como límites superiores y/o inferiores, se pretende que se incluyan en el alcance de la invención. Una fuente de energía, también se puede agregar al medio de cultivo celular de la invención. De preferencia, la fuente de energía es un monosacárido. Ejemplos de monosacáridos que pueden ser utilizados en el medio de cultivo celular incluyen glucosa (por ejemplo, D-glucosa), maltosa, mañosa, galactosa y fructosa. En una modalidad, la glucosa es agregada al medio de cultivo celular a una concentración final que varía en el rango de 3.5 - 7.0 g/L. En una modalidad, la glucosa es agregada al medio de cultivo celular a una concentración final no mayor de 7.0 g/L. En una modalidad, la glucosa es agregada al medio de cultivo celular a una concentración final de aproximadamente 7.0 g/L. Números intermedios a las concentraciones de glucosa mencionadas, por ejemplo 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, y 7, así como números intermedios de los mismos, también se pretende que formen parte de la presente invención. Los rangos de valores, utilizando una combinación de cualquiera de los valores anteriormente citados como límites superiores y/o inferiores, también se pretende que se incluyan en el alcance de la invención. Un ingrediente importante en el medio de cultivo celular de la invención, es la adición de un hidrolizado. El medio de cultivo celular de la invención puede incluir un hidrolizado derivado de una fuente única, por ejemplo levadura o soya, o puede incluir una combinación de hidrolizados, por ejemplo hidrolizados basados en levadura y soya. De preferencia, los hidrolizados utilizados en los medios de cultivo celular de la invención no son de origen animal. Ejemplos de hidrolizados que no son de origen animal incluyen hidrolizados basados en plantas e hidrolizados que no basados en plantas, por ejemplo, hidrolizados basados en levadura, triptona, hidrolizado de caseína, extracto de levadura o peptona de soya digerida con papaína. Los hidrolizados utilizados en los medios de la invención, se encuentran disponibles en el comercio, incluyendo por ejemplo, HyPep 1510. RTM, Hy-Soy.RTM. , Hy- Yeast 412. RTM y Hi-Yeast 444. RTM., de fuentes tales como Quest International, Norwich, N. Y., OrganoTechnie, S. A. France, Deutsche Hefewerke GmbH, Alemania, ó DMV Intl. Delhi, N.Y. Las fuentes de extractos de levadura e hidrolizados de soya, también se describen en las Publicaciones Internacionales de Patente WO 98/15614, WO 00/03000, WO 01/23527 y en la Patente Norteamericana No. 5,741,705. Ejemplos de un hidrolizado basado en levadura el cual también puede ser utilizado en la invención, incluye TC Yeastolate (BD Diagnostic) y Yeastolate UF (SAFC Biosciences), mientras que ejemplos de hidrolizados basados en plantas incluyen Soy Hydrolysate UF (SAFC Biosciences) and HyQ® Soy Hydrolysate (HyClone Media). En una modalidad, el medio de cultivo celular de la invención además incluye glutamina, e.g, L-glutamina. Fuentes adecuadas de L-glutamina se encuentran disponibles en el comercio de varias fuentes, tal como Gibco (Cat. No.25030-081).
Opcionalmente, el medio de cultivo celular de la invención, incluyendo los descritos más adelante en la Sección de Ejemplos, pueden incluir metotrexato. Ejemplos de cantidades de metotrexato utilizadas en los medios de cultivo celular para cultivar células CHO, incluyen aproximadamente 100 nM a 5000 nM de metotrexato. Números intermedios de la molaridad de metotrexato mencionados, por ejemplo, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800, 4000, 4200, 4400, 4600, 4800, and 5000 nM, así como números intermedios de los mismos, también se pretende que formen parte de la presente invención. Los rangos de valores, utilizando una combinación de cualquiera de los valores anteriormente citados como límites superiores y/o inferiores, también se pretende que se incluyan en el alcance de la invención. En biorreactores a gran escala, las células CHO son particularmente susceptibles a las fuerzas de corte que surgen del burbujeo de los gases en el recipiente y el mezclado con la paleta. Por lo tanto, los medios de cultivo celular de la invención también pueden incluir opcionalmente un protector de célula. El término "protector de célula" tal como se utiliza en la presente, significa una sustancia que protege células eucarióticas contra daño. Tal daño puede ser causado, por ejemplo, por fuerzas de tensión o los efectos del burbujeo del gas en un biorreactor. Para minimizar la presencia de daño celular, es ventajoso que el medio tenga un protector celular, tal como metilcelulosa, polietilenglicol, alcoholes de polivinilo o polioles Pluronic. De éstos, se prefiere el poliol F68 Pluronic.RTM. (poliol, BASF Wyandotte Corp.), ya que a diferencia de los alcoholes polivinílicos ésta es una sustancia no tóxica y a diferencia de los polietilenglicoles, no interfiere con la purificación corriente abajo. El medio de cultivo celular de la invención también puede incluir iones de metal no ferroso. Ejemplos de iones de metal no ferroso incluyen, pero no se limitan a, cloruro y sales de sulfato, potasio, magnesio, cúprico, selenio, zinc, níquel, manganeso, estaño, cadmio, molibdato, vanadato, y silicato. El medio de cultivo celular de la invención también puede incluir vitaminas y cofactores enzimáticos. Ejemplos de tales vitaminas y cofactores enzimáticos, incluyen pero no se limitan a, PABA (ácido p-aminobenzoico), Vitamina K (Biotina), Vitamina B5 (D-Pantotenato de Calcio), ácido fólico, l-lnositol, Niacinamida (Amida del ácido nicotinico), Vitamina B6 (Clorhidrato de piridoxina) y (Clorhidrato de pirodoxal), Vitamina B2 (Riboflavina), Vitamina B1 (Tiamina), y Vitamina B12 (Cianocobalamina). Alternativamente, la vitamina C (ácido L-ascórbico), puede ser agregada a los medios. También se puede agregar cloruro de colina, que es generalmente considerada una vitamina, pero también puede considerarse como un factor lipídico. Adicionalmente, el medio de cultivo celular de la invención también puede incluir factores similares a lípidos. Ejemplos de factores lipidíeos incluyen cloruro de colina y fosfatidilcolina. También se puede incluir un auxiliar en la producción lipídica, por ejemplo, una alcoholamina similar a etanolamina. En los métodos y composiciones de la invención, las células de preferencia son cultivadas en medios libres de suero. El término "libre de suero", según se aplica a los medios, incluye cualquier medio de cultivo de células de mamífero que no contenga suero, tal como suero fetal bovino. También incluidas dentro del alcance de la invención, se encuentran las células de mamífero, por ejemplo las células CHO, en cualquiera de los medios de cultivo celular mejorados descritos en la presente. En un aspecto de la invención, se proporcionan formulaciones para los medios de cultivo celular optimizados para la producción de un cierto anticuerpo. Ejemplos de formulaciones optimizadas incluyen medios de cultivo celular para el crecimiento o producción proteínica de células CHO que expresan un anticuerpo anti-TNFa, un anticuerpo anti-IL-12, un anticuerpo anti-IL-18, y un anticuerpo contra el receptor de EPO (EPO-R). Incluidos en la invención, se encuentran los medios de cultivo celular para células de mamífero, por ejemplo células CHO que expresan anticuerpos anti-TNFa, incluyendo anticuerpos anti-TNFa completamente humanos. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-TNFa completamente humano es adalimumab (también referido como D2E7 y Humira®: Abbott Laboratories). Las características del adalimumab, incluyendo el ácido nucleico y las secuencias de aminoácido, se describen en la Patente Norteamericana No. 6,090,382, que se incorpora en la presente como referencia. El adalimumab puede ser producido al cultivar células de mamífero, por ejemplo, células CHO que comprenden un ácido nucleico que codifica la proteína, por ejemplo, adalimumab, en un medio de crecimiento de cultivo celular, transfiriendo el cultivo celular al medio de producción de cultivo celular y aislando la proteína del medio de producción de cultivo celular. En una modalidad, la invención proporciona un medio de crecimiento de cultivo celular optimizado para células CHO, que comprenden un ácido nucleico que codifica adalimumab. La formulación del medio de crecimiento de cultivo celular libre de suero optimizado para células CHO que expresan adalimumab, incluye un medio basal; citrato férrico (por ejemplo, aproximadamente de 8-12 mL/kg, aproximadamente 10.0 mL/kg ó 122 mg/L); insulina recombinante humana (por ejemplo, aproximadamente 2-6 mg/kg ó 4.0 mg/kg); glucosa anhidra (por ejemplo de 2-5 g/kg, aproximadamente 3.5 g/kg); L-glutamina (por ejemplo, aproximadamente 0.29 g/kg); bicarbonato de sodio (por ejemplo, aproximadamente 1.6 g/kg); 3?2?04·?20 (por ejemplo, aproximadamente 0.03 g/kg); Na2HP04»7H20 (por ejemplo, aproximadamente de 0.43 a 0.44 g/kg); e hidrolizado basado en levadura (por ejemplo, aproximadamente 2.0 g/kg). Otro ejemplo de un medio de crecimiento de cultivo celular libre de suero optimizado para células CHO que expresan adalimumab, incluye los siguientes ingredientes: un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; citrato férrico (por ejemplo, aproximadamente 10.0 mL/kg ó 122.45 mg/kg); insulina recombinante humana (por ejemplo, aproximadamente 3.8 a 3.9 mL/kg ó 7.8 mg/kg); glucosa anhidra (por ejemplo, aproximadamente 7.0 g/kg); L-glutamina (por ejemplo, aproximadamente 0.8 a 0.9 g/kg); bicarbonato de sodio (por ejemplo, aproximadamente 1.6 g/kg); HEPES (por ejemplo aproximadamente 1-8 g/kg); NaCI (por ejemplo, aproximadamente 2.6 a 2.7 g/kg); Pluronic F-68 (por ejemplo, aproximadamente 1.0 g/kg); ?3?2?04·?20 (por ejemplo, aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg); Na2HP04»7H20 (por ejemplo, aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg); L-asparagina monohidratada (por ejemplo, aproximadamente 0.45 g^g); hidrolizado basado en levadura (por ejemplo, aproximadamente 4.0 g/kg); e hidrolizado basado en plantas (por ejemplo, aproximadamente 2.6 g/kg). El medio de crecimiento de cultivo celular para expresar adalimumab puede además incluir metotrexato, por ejemplo aproximadamente de 1-5 mL/kg ó aproximadamente 2.50 mL/kg. En una modalidad, la invención proporciona un medio de producción de cultivo celular optimizado para células CHO que expresan un anticuerpo incluyendo por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFa humano (por ejemplo, adalimumab) o un anticuerpo del receptor de eritropoyetina (EPO-R). Ejemplos de anticuerpos contra EPO/R se describen en la Patente Norteamericana No. 20040071694, que se incorpora en la presente como referencia. La formulación del medio de producción de cultivo celular libre de suero optimizado para células CHO que expresan anticuerpo, tal como adalimumab o un anticuerpo contra EPO/R, incluye un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato sódico monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; citrato férrico (por ejemplo, aproximadamente 10.0 mL/kg ó 122.45 mg/L); insulina recombinante humana (por ejemplo, aproximadamente 6.0 mL/kg ó 12 mg/kg); glucosa anhidra (por ejemplo, aproximadamente 7.0 g/kg); L-glutamina (por ejemplo, aproximadamente de 0.58 a 0.59 g/kg); bicarbonato de sodio (por ejemplo, aproximadamente 1.6 g/kg); HEPES (por ejemplo, aproximadamente 1.8 g/kg); NaCI (por ejemplo, aproximadamente de 2.4 a 2.5 g/kg); Pluronic F-68 (por ejemplo, aproximadamente 1.0 g/kg); NaH2P04*H20 (por ejemplo, aproximadamente de 0.03 a 0.04 g/kg); Na2HP04»7H20 (por ejemplo, aproximadamente de 0.43 a 0.44 g/kg); un hidrolizado basado en levadura (por ejemplo, aproximadamente 10.7 g/kg); e hidrolizado basado en plantas (por ejemplo, aproximadamente de 6.9 a 7.0 g/kg). En una modalidad, el medio de producción de cultivo celular tiene un pH en el rango de aproximadamente 7.1 a 7.2 y una osmolaridad en el rango de 373 a 403 mOsm/kg. Números intermedios de los valores anteriores, por ejemplo, la insulina mencionada, pH, o valores de osmolaridad, también se pretende que formen parte de la presente invención. Otro aspecto de la invención se refiere a medios de cultivo celular que son optimizados por la producción de anticuerpos anti-interleucina-12 (IL-12), por ejemplo, anticuerpos IL-12 completamente humanos, producidos por células CHO. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-12 completamente humano es ABT-874. Las características del ABT-874, incluyendo el ácido nucleico y secuencias de aminoácido, se describen en la Patente Norteamericana No. 6,914,128, incorporada en la presente como referencia. En una modalidad, un medio de crecimiento de cultivo celular libre de suero optimizado para el crecimiento de células CHO que expresan ABT-874, incluye lo siguiente: un medio basal modificado, que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; citrato férrico (por ejemplo, aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L); insulina recombinante humana (por ejemplo, aproximadamente de 3.8 a 3.9 mL/kg ó 7.8 mg/kg); glucosa anhidra (por ejemplo, aproximadamente 7.0 g/kg); L-glutamina (por ejemplo, aproximadamente de 0.87 a 0.88 g/kg); L-asparagina monohidratada (por ejemplo, aproximadamente 0.45 g/kg); bicarbonato de sodio (por ejemplo, aproximadamente 1.6 g/kg); HEPES (por ejemplo, aproximadamente 1.8 g/kg); NaCI (por ejemplo, aproximadamente de 2.67 a 2.68 g/kg); Pluronic F-68 (por ejemplo, aproximadamente 1.0 g/kg); NaH2P04»H20 (por ejemplo, aproximadamente de 0.03 a 0.04 g/kg); Na2HPCv7H20 (por ejemplo, aproximadamente de 0.43 a 0.44 g/kg); hidrolizado basado en levadura (por ejemplo, aproximadamente 4.0 g/kg); e hidrolizado basado en plantas (por ejemplo, aproximadamente 2.6 g/kg). En una modalidad, un medio de producción de cultivo celular libre de suero para la expresión de ABT-874, incluye lo siguiente: un medio basal modificado que tiene un contenido reducido de vitaminas y que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; citrato férrico (e.g., aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L); insulina recombinante humana (e.g., aproximadamente 6.5 mL/kg ó 13 mg/kg); glucosa anhidra (e.g., aproximadamente 7.0 g/kg); L-glutamina (por ejemplo, aproximadamente de 0.58 a 0.59 g/kg); bicarbonato de sodio (e.g., aproximadamente 1.6 g/kg); HEPES (e.g., aproximadamente 1.8 g/kg); NaCI (e.g., aproximadamente 2.45 g/kg); Pluronic F-68 (por ejemplo, aproximadamente 1.0 g/kg); NaH2P0 *H20 (por ejemplo, aproximadamente de 0.03 a 0.04 g/kg); Na2HP04*7H20 (por ejemplo, aproximadamente de 0.43 a 0.44 g/kg); hidrolizado basado en levadura (por ejemplo, aproximadamente 10.7 g/kg); y un hidrolizado basado en plantas (por ejemplo, aproximadamente de 6.9 a 7.0 g/kg). En una modalidad, la invención proporciona medio de crecimiento de cultivo celular libre de suero para células CHO que expresan anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos anti-l L12 y anticuerpos contra EPO/R, que comprende lo siguiente: un medio basal; citrato férrico (por ejemplo, aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L); insulina recombinante humana (por ejemplo, aproximadamente 4 mg/kg); glucosa anhidra (por ejemplo, aproximadamente 1.5 g/kg); L-glutamina (por ejemplo, aproximadamente de 0.29 a 0.30 g/kg); bicarbonato de sodio ((por ejemplo, aproximadamente 1.6 g/kg); e hidrolizado basado en levadura (por ejemplo, al menos aproximadamente 2 g/kg). En una modalidad, el medio de crecimiento de cultivo celular para células CHO que expresan anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos anti-l L12 y anticuerpo contra EPO/R, tiene un pH de aproximadamente 7.10 a 7.30 y una osmolaridad de aproximadamente 300 a 340 mOsmo/kg. El medio de cultivo celular también puede contener un hidrolizado basado en levadura (e.g, al menos aproximadamente 8 g/kg). Otro aspecto de la invención se refiere a medios de cultivo celular optimizados para la producción de anticuerpos anti-interleucina-18 (IL-18), por ejemplo, anticuerpos IL-18 completamente humanos, producidos por células CHO. Ejemplos de anticuerpos IL-18 completamente humanos que pueden ser producidos utilizando los métodos y composiciones de la invención, se describen en la Publicación PCT WO 01/058956, incorporada en la presente como referencia. En una modalidad, un medio de crecimiento de cultivo celular optimizado para la producción del anticuerpo IL-18 en células CHO, incluye los siguientes ingredientes: un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; citrato férrico (por ejemplo, aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L); insulina recombinante humana (por ejemplo, aproximadamente 3.8 a 3.9 mL/kg ó 7.8 mg/kg); glucosa anhidra (por ejemplo, aproximadamente 7.0 g/kg); L-glutamina (por ejemplo, aproximadamente 0.87 a 0.88 g/kg); L-asparagina monohidratada (por ejemplo, aproximadamente 0.45 g/kg); bicarbonato de sodio (por ejemplo, aproximadamente 1.6 g/kg); HEPES (por ejemplo, aproximadamente 1.8 g/kg); NaCI (por ejemplo, aproximadamente 2.67 g/kg); Pluronic F-68 (por ejemplo, aproximadamente 1.0 g/kg); NaH2P04»H20 (por ejemplo, aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg); Na2HP04»7H20 (por ejemplo, aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg); hidrolizado basado en levadura (por ejemplo, aproximadamente 4.0 g/kg); y un hidrolizado basado en plantas (por ejemplo, aproximadamente 2.6 g/kg). El medio de cultivo celular para el crecimiento de células que expresan anticuerpos IL-18 completamente humanos puede tener un pH de 7.10 a 7.20 y una osmolaridad de 373 a 403 mOsm/kg. Números intermedios de los valores anteriores, por ejemplo, la insulina, pH, o valores de osmolaridad citados, también se pretende que formen parte de la presente invención. Un ejemplo de un medio de producción de cultivo celular optimizado para la producción del anticuerpo IL-18 en células CHO, incluye los siguientes ingredientes: un medio basal modificado, el cual es modificado para remover los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora HEPES, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; citrato férrico (por ejemplo, aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L); insulina recombinante humana (por ejemplo, aproximadamente 6.0 mL/kg ó 12 mg/kg); glucosa anhidra (por ejemplo, aproximadamente 7.0 g/kg); L-glutamina (por ejemplo, aproximadamente 0.58 a 0.59 g/kg); bicarbonato de sodio (por ejemplo, aproximadamente 1.6 g/kg); HEPES (por ejemplo, aproximadamente 1.8 g/kg); NaCI (por ejemplo, aproximadamente 2.45 g/kg); Pluronic F-68 (por ejemplo, aproximadamente 1.0 g/kg); NaH2PCvH20 (por ejemplo, aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg); Na2HP04»7H20 (por ejemplo, aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg); hidrolizado basado en levadura (por ejemplo, aproximadamente 10.7 g/kg); y un hidrolizado basado en plantas (por ejemplo, aproximadamente 6.9 a 7.0 g/kg). Otro ejemplo de un medio de producción de cultivo celular para producir anticuerpos anti-IL-18 completamente humanos, incluye un medio basal modificado, el cual excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y monosacárido glucosa; citrato férrico (por ejemplo, aproximadamente 10 mL/kg ó 122.45 mg/L); insulina recombinante humana (por ejemplo, a aproximadamente 6.5 mL/kg ó 13 mg/kg); glucosa anhidra (por ejemplo, aproximadamente 7.0 g/kg); L-glutamina (por ejemplo, aproximadamente 0.58 a 0.59 g/kg); bicarbonato de sodio (por ejemplo, aproximadamente 1.6 g/kg); HEPES (por ejemplo, aproximadamente 1.8 g/kg); NaCI (por ejemplo, aproximadamente 2.45 g/kg); Pluronic F-68 (por ejemplo, aproximadamente 1.0 g/kg); NaH2P0 «H20 (por ejemplo, aproximadamente 003 a 0.04 g/kg); Na2HP04'7H20 (por ejemplo, aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg); hidrolizado basado en levadura (por ejemplo, aproximadamente 14.2 a 14.3 g/kg); y un hidrolizado basado en plantas (por ejemplo, aproximadamente 9.2 a 9.3 g/kg). El medio de cultivo celular para células CHO que producen anticuerpos IL-18 completamente humanos, puede tener un pH de 7.10 a 7.20 y una osmolaridad de 373 a 403 mOsm/kg. Números intermedios de los valores anteriores, por ejemplo, insulina, pH o valores de osmolaridad citados, también se pretende que formen parte de la presente invención. Otros ejemplos de medios dentro del alcance de la invención, se describen más adelante con relación a los métodos de alimentación por lotes y medios suplementarios que mejoran la producción de anticuerpos, además de los medios de ejemplo en la sección de Ejemplos. Los medios de la presente invención pueden ser utilizados para realizar cultivos de células apropiados poniendo los medios o sus componentes en contacto con toda o parte de la población de células. Los medios pueden ser puestos en contacto con las células, mezclando, agregando, combinando, sembrando o agitando una o más células con uno o más compuestos, soluciones, medios, etcétera. Los medios también pueden ser puestos en contacto con todas las células a la vez, de manera gradual o paso a paso, por ejemplo "alimentando", para reemplazar o suplementar el medio en el cual las células se cultivan, como se describe con mayor detalle más adelante. IV. Métodos y composiciones para la producción proteínica mejorada Los métodos de las composiciones de la invención se refieren a cultivos de células de mamífero. En una modalidad, la célula de mamífero utilizada, es la célula CHO. Se han descrito métodos establecidos para introducir ADN a células de mamífero. Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. Se pueden utilizar protocolos adicionales utilizando reactivos disponibles en el comercio, tales como los reactivos de lípidos catiónicos Lipofectamine™ , lipofectamine™-2000, o Lipofectamine™-plus (los cuales pueden ser adquiridos en Invitrogen), para transfectar células. Feigner et al. (1987), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7417. Además, se puede utilizar electroporación o bombardeo con microproyectiles recubiertos con ácidos nucleicos para transfectar las células de mamíferos, utilizando procedimientos tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y Fitzpatrick-McEIMgott (1992), Biotechnology (NY) 10(9): 1036-40. La selección de transformantes estable puede llevarse a cabo utilizando los métodos conocidos en la técnica, tales como por ejemplo resistencia a fármacos citotóxicos. Kaufman et al. ((1990), Meth. in Enzymology 185:487-51 ), describe varios esquemas de selección, tal como resistencia a la dihidrofolato reductasa (DHFR). Una cepa huésped adecuada para la selección de DHFR puede ser la cepa DX-B11 de células CHO, la cual es deficiente en DHFR. Urlaub and Chasin (1980), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220. Se puede introducir un plásmido que expresa el ADNc de DHFR a la cepa DX-B11, y sólo las células que contienen el plásmido pueden crecer en los medios selectivos apropiados. Otros ejemplos de marcadores seleccionables que pueden ser incorporados en un vector de expresión, incluyen ADNcs que confieren resistencia a antibióticos, tales como G418 e higromicina B. Las células que hospedan al vector, pueden ser seleccionadas basándose en la resistencia a estos compuestos. Las secuencias de control adicionales mostradas para mejorar la expresión de genes heterólogos de vectores de expresión de mamíferos, incluyen tales elementos como el elementos de secuencia que aumentan la expresión (ESAE) derivados de células CHO (Morris et al., in Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997); Patentes Norteamericanas Nos.6,312,951 B1, 6,027,915, y 6,309,841 B1) y la secuencia líder tripartita (LTP) y ARNs del gen VA del adenovirus 2 (Gingeras et al. (1982), J. Biol. Chem. 257:13475-13491). Las secuencias del sitio de entrada al ribosoma interno (SERI) de origen viral, permiten a los mRNAs dicistrónicos ser traducidos eficientemente (Oh and Sarnow (1993), Current Opinión in Genetics and Development 3:295-300; Ramesh et al. (1996), Nucleic Acids Research 24:2697- 2700). La expresión de un ADNc heterologo como parte de un ARNm dicistrónico seguido por el gen para un marcador seleccionable (por ejemplo DHFR), ha sido mostrado para mejorar la transfectabilidad del huésped y la expresión del ADNc heterologo (Kaufman et al. (1990), Methods in Enzymol. 185:487-511). Los vectores de expresión de ejemplo que emplean ARNms dicistrónicos son pTR-DC/GFP descritos por Mosser et al., Biotechniques 22:150-161 (1997), y p2A5l descrito por Morris et al., in Animal Cell Technology, pp.529-534 (1997). Un vector de expresión altamente útil, el pCAVNOT, ha sido descrito por Mosley et al. ((1989), Cell 59:335-348). Otros vectores de expresión para utilizarse en células huésped de mamífero pueden ser construidos según lo descrito por Okayama y Berg ((1983), Mol. Cell. Biol. 3:280). Un sistema útil para la expresión a un nivel altamente estable de ADNcs de mamífero en células epiteliales de mamífero murino C127, puede ser construido sustancialmente como se describe por Cosman et al. ((1986), Mol. Immunol. 23:935). Un vector de expresión altamente útil, el PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al. ((1984), Nature 312:768), ha sido depositado en la ATCC 39890. Los vectores de expresión de mamífero útiles adicionales, se describen en la Patente Europea EP No. -A-0 367 566 y en la Publicación Internacional de Patente WO 01/27299 A1. Los vectores se pueden derivar de retrovirus. En lugar de la secuencia de señal nativa, se puede agregar una secuencia de señal heteróloga, tal como una de las siguientes secuencias: la secuencia de señal para la IL-7 descrita en la Patente Norteamericana No. 4,965,195; la secuencia de señal para el receptor de IL-2 descrito en Cosman et al. (Nature 312:768 (1984)); el péptido de señal de IL-4 descrito en la Patente Europea EP No. 0 367 566; el péptido de señal del receptor de IL-1 descrito en la Patente Norteamericana No. 4,968,607; y el péptido de señal del receptor de IL-1 tipo II descrito en la Patente Europea EP No. 0460 846. Los polipéptidos pueden ser producidos de manera recombinante en células eucarióticas, y de preferencia son secretados por células huésped adaptadas para crecer en cultivo celular. Las células huésped para utilizarse en la invención, de preferencia son células de mamífero. Las células también pueden ser manipuladas por ingeniería genética para expresar un gen de interés, que puede ser la producción de células de mamífero adaptadas para crecer en cultivo celular y/o pueden ser líneas celulares homogéneas. Ejemplos de tales células comúnmente utilizadas en la industria son VERO, BHK, HeLa, CV1 (incluyendo Cos), MDCK, 293, 3T3, líneas de células de mieloma (por ejemplo, NSO, NS1), PC12, células WI38, y células de Ovario de Hámster Chino (CHO), las cuales son ampliamente utilizadas para la producción de varios polipéptidos recombinantes complejos, por ejemplo, citocinas, factores de coagulación y anticuerpos (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J. Biol. Chem. 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood et al. (1990), J. Immunol. 145:3011-3016). Las líneas celulares mutantes deficientes de dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub et al. (1980), Proc Nati Acad Sci USA 77: 4216-4220, la cual se incorpora como referencia), DXB11 y DG-44, son deseablemente líneas de células CHO huésped, debido a la eficiente DHFR seleccionable y al sistema de expresión génica amplificable que permite un alto nivel de expresión de polipéptido recombinante en estas células (Kaufman R. J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566, que se incorpora como referencia). Además, estas células son fáciles de manipular como cultivos adherentes o cultivos en suspensión, y exhiben una estabilidad genética relativamente buena. Las células CHO y los polipéptidos recombinantes expresados en ellas, han sido extensamente caracterizados y han sido aprobados para utilizarse en la manufactura comercial clínica, por agencias regulatorias. Los métodos de la invención también pueden ser practicados utilizando líneas de células de hibridoma que producen un anticuerpo. Los métodos para preparar líneas de hibridoma, son bien conocidos en la técnica. Véase See e.g. Berzofsky et al. in Paul, ed., Fundamental Immunology, Second Edition, pp. 315-356, at 347-350, Raven Press Ltd., New York (1989). Las líneas celulares derivadas de las líneas mencionadas anteriormente, también son adecuadas para practicar la invención. Después de la transformación de una célula huésped de mamífero adecuada, por ejemplo la célula CHO, con secuencias polinucleotídicas que codifican una proteína recombinante, las células que demuestran una expresión estable de la proteína recombinante, son identificadas y aisladas. La expresión estable de una proteína recombinante es lograda mediante la transfección de vectores de ADN apropiados en células de Ovario de Hámster Chino deficientes de dihidrofolato reductasa (DHFR) (CHO AM-1/D, Patente Norteamericana No. 6,210,924), seguido por el aislamiento y prueba de clonas individuales que demuestran una expresión más elevada de proteína recombinante, de conformidad con métodos conocidos en la técnica. Basándose en el crecimiento y producción en agitadores a pequeña escala y biorreactores a mayor escala, se escoge una línea de células específica como la línea de células para manufacturar la proteína recombinante. Las células que producen los más altos niveles de proteína recombinante, pueden ser clonadas por métodos bien conocidos en la técnica, mediante múltiples rondas de dilución limitante en placas de 96 y/ó 24 pozos, bajo condiciones libres de suero, utilizando los medios de cultivo celular de la presente invención. Las clonas son seleccionadas basándose en la producción y características de crecimiento en varios recipientes de suspensión. Los inmunoensayos enzimáticos (IEE) se pueden realizar para seleccionar la clona que produzca el nivel más alto de proteína recombinante. Las características de crecimiento, incluyendo dobles tiempos y densidades, pueden ser medidos haciendo crecer las clonas en varios agitadores o matraces para agitación y biorreactores en el rango de 100 ml_ hasta 3 L. Se selecciona una clona óptima, por ejemplo una clona con el tiempo de duplicación más rápido que alcanza la densidad más alta en el cultivo, y es seleccionada como la línea celular para utilizarse en la producción de proteínas recombinantes. En una modalidad, la producción de proteína recombinante, es para propósitos comerciales, y se lleva a cabo utilizando un biorreactor a gran escala. Típicamente, el cultivo celular se lleva a cabo bajo condiciones de temperatura controlada y atmosféricas estériles, en placas de cultivo tisular (por ejemplo placas de 10 cm, placas de 96 pozos, etc.) u otro cultivo adherente (por ejemplo sobre cuentas microportadoras) o en cultivos en suspensión, tal como en botellas. Los cultivos pueden hacerse crecer en matraces para agitación, biorreactores a pequeña escala y/o biorreactores a gran escala. Un biorreactor es un aparato utilizado para cultivar células, en donde las condiciones ambientales tales como temperaturas, atmósfera, agitación y/o pH, pueden ser monitoreadas, ajustadas y controladas. Los métodos, incluyendo los métodos de alimentación por lotes y composiciones de la invención, pueden ser utilizados en cultivo de células de mamífero a gran escala, por ejemplo de 10 L, 11 L, 12 L, 13 L, 14 L, etcétera. En una modalidad, los métodos de cultivo celular a gran escala y composiciones de la invención, son adecuados para el cultivo de células CHO y la producción de anticuerpos. De conformidad con la presente invención, una célula huésped de mamífero es cultivada bajo condiciones que promuevan la producción del polipéptido de interés, el cual puede ser un anticuerpo o un polipéptido recombinante. Los técnicos en la materia pueden escoger utilizar uno o más de los medios de cultivo celular descritos en la presente, que hayan sido desarrollados para maximizar el crecimiento celular, la viabilidad celular y/o la producción polipeptídica recombinante, en una célula huésped cultivada particular. Alternativamente, los métodos y composiciones de conformidad con la presente invención, pueden utilizarse en combinación con medios de cultivo celular disponibles en el comercio. Las condiciones de cultivo adecuadas para las células de mamífero, son conocidas en la técnica (véase por ejemplo Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, Nueva York (1992)), y pueden ser combinadas con los métodos mejorados de la invención. Las células de mamífero pueden ser cultivadas en suspensión o unidas a un sustrato sólido. Además, las células de mamífero pueden ser cultivadas, por ejemplo, en biorreactores de lecho fluidizado, biorreactor de fibra hueca, botellas giratorias, matraces para agitación o en biorreactores de tanque con agitación, con o sin microportadores, y operados de un modo por lotes, alimentación por lotes, modo continuo, semicontinuo o por perfusión. Los métodos de conformidad con la presente invención, pueden ser utilizados para mejorar la producción de polipéptidos recombinante, tanto en fase simple como en procesos de cultivo de fase múltiple. En un proceso de fase simple, las células son inoculadas en un ambiente de cultivo, y los métodos descritos son durante la fase de producción simple. En un proceso de etapas múltiples, las células son cultivadas en dos o más fases distintas. Por ejemplo, las células pueden ser cultivadas primero en una fase de crecimiento, bajo condiciones ambientales que maximicen la proliferación y viabilidad celular, posteriormente se transfieren a una fase de producción, bajo condiciones que maximicen la producción polipeptídica. El crecimiento y las fase de producción pueden ser precedidas por, o separadas por, una o más fases de transición. En los procesos de fase múltiple, los métodos de conformidad con la presente invención son empleados al menos durante la fase de producción. Para los propósitos de entendimiento, aún sin limitación, deberá apreciarse por los técnicos en la materia, que los cultivos celulares y procesos de cultivo para la producción de proteínas puede incluir tres tipos generales; a saber, cultivo continuo, cultivo por lotes y cultivo de alimentación por lotes. En un cultivo continuo, por ejemplo, se proporciona un suplemento fresco al medio de cultivo (es decir, un medio de alimentación) a las células, durante el periodo de cultivo, mientras que un medio de cultivo menos fresco es removido diariamente y el producto es cosechado, por ejemplo, diariamente o continuamente. En el cultivo continuo, el medio de alimentación puede ser agregado diariamente o de manera continua, es decir, por goteo o por infusión. Para el cultivo continuo, las células pueden permanecer en el cultivo tanto tiempo como se desee, siempre y cuando las células permanezcan vivas y se mantengan las condiciones de cultivo y ambientales. En el cultivo por lotes, las células inicialmente se cultivan en el medio, y este medio es ya sea removido, reemplazado, no suplementado, es decir, las células no son "alimentadas" con un medio nuevo, durante o antes del término del proceso de cultivo. El producto deseado es cosechado al final del proceso de cultivo. Para los cultivos de alimentación por lotes, el tiempo de proceso del cultivo se incrementa suplementando el medio de cultivo una o más veces diariamente (o de manera continua) con soluciones nutrientes durante el proceso, es decir, las células son "alimentadas" con un medio de alimentación durante el periodo del cultivo. Los cultivos de alimentación por lotes pueden incluir varios regímenes y tiempos de alimentación como se describe más adelante, por ejemplo, a diario, cada tercer día, cada dos días, etc., más de una vez por día o menos de una vez por día, etcétera. Además, los cultivos de alimentación por lotes pueden ser alimentados continuamente con el medio de alimentación. El producto deseado posteriormente es cosechado al final del cultivo/proceso de producción. La presente invención de preferencia abarca cultivos celulares de alimentación por lotes, en donde la alimentación utiliza soluciones de alimentación optimizadas que incrementan la producción proteínica y pueden extender la fase de producción proteínica. Cultivo de alimentación por lotes mejorado: Soluciones de enriquecimiento de hidrolizado y basal Un aspecto de la invención caracteriza métodos y composiciones para incrementar la producción de proteínas, utilizando un método de alimentación por lotes mejorado en combinación con soluciones suplementarias básales y de hidrolizado. El método de alimentación por lotes mejorado, en parte, se basa en la adición de dos soluciones enriquecidas, es decir, una solución de enriquecimiento de hidrolizado y una solución de enriquecimiento basal, las cuales se agregan al medio de cultivo celular durante un periodo de tiempo durante la producción proteínica. La solución de enriquecimiento de hidrolizado utilizada en el método de alimentación por lotes de la invención, comprende un primer hidrolizado que no se deriva de una planta o de un animal, y un segundo hidrolizado basado en plantas. Un ejemplo de un hidrolizado que no se deriva de una planta o un animal y un hidrolizado basado en plantas, es un hidrolizado basado en levadura. Un ejemplo de hidrolizado basado en planta el cual puede ser utilizado en la solución enriquecida de hidrolizado, es un hidrolizado basado en soya. La solución de enriquecimiento basal incluye un medio basal, por ejemplo, PF CHO, asparagina y glucosa, y la solución de enriquecimiento de hidrolizado incluye al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal. Las soluciones de enriquecimiento de hidrolizado y basal son agregadas al cultivo celular a intervalos durante un periodo de tiempo, por ejemplo a intervalos diarios durante un periodo de tiempo de 11 a 15 días, y pueden ser agregadas el mismo día o en diferentes días. La invención caracteriza un método de alimentación por lotes para producir un anticuerpo anti-TNFa, por ejemplo, adalimumab/D2E7, que comprende cultivar células de Ovario de Hámster Chino (CHO) que comprenden un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TNFa, en un cultivo celular a una temperatura de cultivo en el rango de 32 a 38°C. En una modalidad, la temperatura del cultivo es de 35°C. Las células CHO son alimentadas con una solución de enriquecimiento de hidrolizado y una solución de enriquecimiento basal con el fin de encargarse de, por ejemplo resolver o corregir, las deficiencias nutricionales para maximizar la productividad. Las soluciones de enriquecimiento de hidrolizado y basal son agregadas al cultivo celular. En una modalidad, el medio de producción de cultivo celular comprende entre 20 and 65% de oxígeno disuelto, por ejemplo, aproximadamente 30% de oxígeno disuelto. En una modalidad, el medio de producción de cultivo celular contiene una concentración de glucosa necesaria para la producción proteínica, por ejemplo, al menos aproximadamente de 1-5 g/L de glucosa. En una modalidad, el medio de producción de cultivo celular contiene aproximadamente de 1.5-2.5 g/L de glucosa. En una modalidad adicional, el medio de producción de cultivo celular contiene aproximadamente 2.0 g/L de glucosa. La concentración de glucosa puede ser controlada durante la producción proteínica del proceso del cultivo, agregando glucosa al medio de producción de cultivo celular según se requiera, para mantener una concentración dada, por ejemplo al menos 2.0 g/L de glucosa. En una modalidad, la solución de enriquecimiento de hidrolizado utilizada en el método de alimentación por lotes para un anticuerpo anti-TNFa, comprende de aproximadamente 50-280 g/L de un hidrolizado basado en soya (incluyendo rangos y números en el mismo, por ejemplo, 100-225, 50-225, 255- 275, y 265 g/L), y aproximadamente 75-300 g/L de un hidrolizado basado en levadura (incluyendo rangos y números en el mismo, por ejemplo, 100-250, 150-200, 145-175, y 165 g/L). Una solución de enriquecimiento basal optimizada para utilizarse en un método de alimentación por lotes para la producción de un anticuerpo anti-TNFa, por ejemplo, adalimumab/D2E7, en células CHO, tiene un pH de aproximadamente 9.0 a 10.5 (incluyendo rangos y números en el mismo, por ejemplo, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 96, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5). El periodo de tiempo durante el cual la solución de enriquecimiento de hidrolizado y la solución de enriquecimiento basal son agregadas, es de entre 9 a 15 días, por ejemplo, 12 días. En una modalidad, la solución de enriquecimiento basal es agregada al medio de cultivo celular en al menos uno de los siguientes días del periodo de tiempo: día 4, día 6, día 9, y día 11, y la solución de enriquecimiento de hidroiizado es agregada al medio de cultivo celular en el día 4, día 7 ó día 4 y día 7 del periodo de tiempo. Números intermedios de los valores anteriores también se pretende que formen parte de la presente invención. En otra modalidad alternativa, el método de alimentación por lotes para la producción de un anticuerpo anti-TNFa, por ejemplo, adalimumab/D2E7, puede incluir ajustar el pH del medio de cultivo celular, de conformidad con una disminución lineal del pH, que comprende iniciar de un pH de aproximadamente 6.5-8, por ejemplo, de 7.1 a 7.2, y terminando en un pH final de aproximadamente 6.9. En una modalidad, la disminución lineal del pH es ajustada con respecto a un periodo de al menos aproximadamente 24 horas, 48 horas ó 72 horas. La invención también caracteriza un método de alimentación por lotes para producir un anticuerpo anti-IL-12, por ejemplo, ABT-874, que comprende cultivar células de Ovario de Hámster Chino (CHO) que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo a nti- 1 L 12 en un cultivo celular a una temperatura de cultivo que varía de 32 a 38°C, por ejemplo 33°C. La solución de enriquecimiento de hidroiizado utilizada para la producción del anticuerpo IL-12, también puede contener glucosa. En una modalidad, las células CHO son cultivadas a un pH de aproximadamente 6.9. Las células CHO se alimentan de una solución de enriquecimiento de hidroiizado y una solución de enriquecimiento basal, con el fin de mantener las deficiencias nutricionales para maximizar la productividad. Las soluciones de enriquecimiento de hidrolizado y basal, son agregadas al cultivo celular. En una modalidad, el medio de producción de cultivo celular comprende entre 20 y 65% de oxígeno disuelto, por ejemplo, aproximadamente 40% de oxígeno disuelto. En una modalidad, la solución de enriquecimiento de hidrolizado utilizada en el método de alimentación por lotes para un anticuerpo anti-IL-12 comprende aproximadamente 50-280 g/L de un hidrolizado basado en soya (incluyendo rangos y números en el mismo, por ejemplo, 100-225, 50-225, 255-275 y 265 g/L), aproximadamente 75-300 g/L de un hidrolizado basado en levadura (incluyendo rangos y números en el mismo, por ejemplo, 100-250, 150- 200, 145-175 y 165 g/L), y aproximadamente 2-3 g/L de glucosa, por ejemplo 2.4 g/L de glucosa. La solución de enriquecimiento basal para utilizarse en un método de alimentación por lotes para la expresión de un anticuerpo anti-IL-12, por ejemplo, ABT-874, en células CHO, tiene un pH de aproximadamente 9.7 y una osmolaridad de aproximadamente 1480 mOsm. El periodo de tiempo durante el cual la solución de enriquecimiento de hidrolizado y la solución de enriquecimiento basal son agregadas, es de entre 14 a 15 días, por ejemplo, 12 días. En una modalidad, la solución de enriquecimiento basal es agregada al medio de producción de cultivo celular cada tercer día, iniciando en el día 5 del periodo de tiempo, and la solución de enriquecimiento de hidrolizado es agregada al medio de producción de cultivo celular a diario, iniciando en el día 6 del periodo de tiempo. Alternativamente, la solución de enriquecimiento basal y la solución de enriquecimiento de hidrolizado pueden ser agregadas al medio de producción de cultivo celular a diario, iniciando en el día 5 del periodo de tiempo. Números intermedios de los rangos de valores anteriores, también se pretende que formen parte de la presente invención. Solución de alimentación de concentración alta, estable Un aspecto de la invención caracteriza métodos y composiciones que se refieren a una solución de alimentación de concentración alta estable mejorada, para mejorar la productividad proteínica. La solución de alimentación mejorada, puede ser utilizada para suplementar un el medio de producción de cultivo celular, en la producción de un anticuerpo. La solución de alimentación incluye glucosa (por ejemplo, de 100 a 250 g/kg); un medio basal; un aminoácido diferente de glutamina, por ejemplo, asparagina (por ejemplo, de 1.0 a 15.0 g/kg; de 3-12.5 g/kg, ó 3-5 g/kg); y al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal. Además, la solución de alimentación tiene un pH de aproximadamente 6.0 a 7.5. Los dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal pueden incluir un hidrolizado basado en plantas, por ejemplo hidrolizado basado en soya, y un hidrolizado que no es de origen animal o se base en plantas, por ejemplo, un hidrolizado basado en levadura. Cualquier medio basal conocido en la técnica, puede ser utilizado en la solución de alimentación mejorada incluyendo, pero no limitándose a, PF CHO ó DMEM/medio F12. También se puede utilizar un medio basal. En una modalidad, el medio celular basal excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, solución reguladora, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, glutamina y glucosa. La solución de alimentación mejorada es estable, teniendo una turbiedad de menos de aproximadamente 15 UTN. La invención también incluye mantener un nivel constante de glucosa del medio de producción de cultivo celular, agregando la solución de alimentación. Números intermedios de los rangos de valores anteriores, también se pretende que formen parte de la presente invención, por ejemplo, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.6, 3.8, 4, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8 y 5 g/kg de asparagina. También incluido en la invención, se encuentra un método para fabricar una solución de alimentación que comprende glucosa y al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal. El método para fabricar la solución de alimentación incluye combinar glucosa y un medio celular basal a una solución combinada, y ajustar el pH de la solución combinada a aproximadamente 9.5 a 10.5. Posteriormente, se agregan al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal a la solución, y el pH es ajustado otra vez para que la solución de alimentación resultante tenga un pH de aproximadamente 6.5 a 7.5. Números intermedios de los rangos de valores anteriores, también se pretende que formen parte de la presente invención, por ejemplo, pH de 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5.
La solución de alimentación de la invención puede ser utilizada para alcanzar niveles altos de la producción proteínica recombinante, por ejemplo, producción de anticuerpos, de cultivo de células de mamíferos. En una modalidad, la invención caracteriza un método para producir al menos 1.5 g/L de un anticuerpo a partir de un cultivo de células de mamífero, que comprende cultivar las células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, en un medio de producción de cultivo celular. Posteriormente se agrega al medio de producción de cultivo celular, una solución de alimentación que tenga un pH de aproximadamente 6.7 a 7.0. La solución de alimentación incluye glucosa (por ejemplo, aproximadamente de 100 a 250 g/kg); un medio celular basal; un aminoácido diferente de glutamina; y al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal. En una modalidad, tal proceso, da como resultado la producción de al menos 2 g/L de un anticuerpo, al menos 4 g/L de un anticuerpo; al menos aproximadamente 5 g/L del anticuerpo; y al menos 6 g/L del anticuerpo. Números intermedios de los rangos de valores anteriores, también se pretende que formen parte de la presente invención, por ejemplo, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 g/L del anticuerpo. Al utilizar una solución de alimentación que tenga un pH de aproximadamente 6.7 a 7.2 e incluyendo los siguientes componentes: glucosa; un medio celular basal; aproximadamente un aminoácido diferente de glutamina, y al menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal, se puede incrementar el título del anticuerpo producido a partir de un cultivo de células de mamífero. En una modalidad, agregando la solución de alimentación a un medio de producción de cultivo celular para células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, se obtiene un incremento de al menos 50% más que el de un cultivo de células de mamífero de control, el cual es cultivado sin la adición de la solución de alimentación. En una modalidad, la adición de la solución de alimentación da como resultado un incremento del título de al menos 100% más que el de control. En una modalidad, la adición de la solución de alimentación, da como resultado un incremento del título de al menos 150% más que el de control. La solución de alimentación suplementaria puede ser agregada al cultivo celular a cierta densidad celular, por ejemplo cuando la densidad celular alcanza al menos 2.0 x 106 células/mL o la densidad celular alcanza al menos 3.5 x 106 células/mL. Números intermedios al rango de valores anterior, también se pretende que formen parte de la presente invención. Rangos de valores, utilizando una combinación de cualquiera de los valores mencionados anteriormente como límites superiores y/o inferiores, se pretende que se incluyan en el alcance de la invención. Ya que los métodos de alimentación por lotes de la invención sirven para encargarse de, por ejemplo resolver o corregir, ciertos requerimientos nutricionales de un cultivo celular para la producción de una proteína, por ejemplo un anticuerpo, puede ser ventajoso monitorear ciertos ingredientes. Los ingredientes que pueden ser monitoreados incluyen cualquier indicador metabólico, es decir, un indicador del metabolismo celular. En una modalidad, el método de alimentación por lotes de la invención, comprende monitorear la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular, incluyendo, monitorear la concentración de glucosa para que sea mantenida a entre 0.25-20 g/L. En una modalidad, la concentración de glucosa es mantenida a 0.5 a 5.5 g/L ó 4 .0- 5.5 g/L. Al monitorear los niveles de glucosa, el metabolismo celular puede ser monitoreado indirectamente. Como se describen en el Ejemplo 3, la glucosa puede ser utilizada como indicador metabólico. En una modalidad, un cultivo celular puede ser suplementado con un componente o componentes nutricionales, por ejemplo, un hidrolizado, basándose en la concentración de glucosa. Los métodos para monitorear las concentraciones de glucosa son conocidos en la técnica y pueden incluir monitorear utilizando un aparato de muestreo automatizado. Otro ejemplo de un indicador metabólico que puede ser utilizado, es la glutamina. Números intermedios a los rangos anteriores, así como otros números mencionados en la presente, también se pretende que formen parte de la presente invención. Rangos de valores, utilizando una combinación de cualquiera de los valores mencionados anteriormente como límites superiores y/o inferiores, se pretende que se incluyan en el alcance de la invención. Se puede utilizar un sistema de control de retroalimentación para monitorear la concentración de un indicador metabólico en el medio de producción de cultivo celular. En una modalidad, con el fin de cumplir un punto establecido de un parámetro deseado, por ejemplo una concentración de glucosa predeterminada, se agrega una solución de alimentación combinada al medio de producción de cultivo celular, según sea determinado por el sistema de control de retroalimentación. El sistema de control de retroalimentación también puede ser utilizado para determinar un perfil de alimentación para un cultivo de células de mamífero dado, y la producción de una proteína de interés. En una modalidad, un método para determinar un perfil de alimentación para producir una proteína en un cultivo de células de mamífero, comprende cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica la proteína, y agregar una solución de alimentación, por ejemplo, una solución de alimentación combinada al medio de cultivo celular, utilizando un sistema de control de retroalimentación para monitorear un indicador metabólico. La solución de alimentación es agregada al medio de producción de cultivo celular para cumplir un punto establecido de un indicador metabólico objetivo, por ejemplo, una concentración de glucosa. Después de concluir el cultivo celular, se determina la cantidad de la solución de alimentación agregada al medio de producción de cultivo celular por día, y se proporciona un perfil de alimentación de cuándo debe ser agregada una solución de alimentación al cultivo celular. Una vez que se establece un perfil de alimentación, ya no es necesario monitorear el indicador metabólico para un cultivo de células de mamífero dado que produce una proteína de interés. Un perfil de alimentación presenta muchas ventajas, incluyendo un riesgo disminuido de contaminación, ya que el muestreo frecuente no se requiere más. Métodos y composiciones de la N-acetilcistelna y butirato de sodio Como se describió anteriormente, el proceso de cultivo celular de la presente invención, ventajosamente logra un título de anticuerpo incrementado. Otro aspecto de la invención para lograr la productividad proteínica en un cultivo de células de mamífero, es mediante la adición de butirato de sodio, N-acetilcisteína, o una combinación de los mismos, al medio de cultivo celular. En una modalidad, la invención caracterizada un método para producir un anticuerpo, agregando butirato de sodio (por ejemplo, de 0.1 mM a 10 mM), N-acetilcisteína (por ejemplo, de 1 mM a 80 mM), o un combinación de los mismos, al medio de cultivo celular. En una modalidad, el título del anticuerpo es de al menos aproximadamente 100 mg/L; al menos aproximadamente 150 mg/L; al menos aproximadamente 200 mg/L; al menos aproximadamente 250 mg/L; al menos aproximadamente 300 mg/L; al menos aproximadamente 350 mg/L; o al menos aproximadamente 400 mg/L. La invención también caracteriza un método para producir un anticuerpo en un cultivo de células de mamífero, para que el título del anticuerpo sea mejorado al menos 10% con respecto a un cultivo de células de mamífero de control, agregando butirato de sodio (por ejemplo, concentración final de 0.1 mM a 10 mM), N-acetilcisteína (por ejemplo, concentración final de 1 mM a 80 mM), o una combinación de los mismos, al medio de cultivo celular (de conformidad con ello, el control carece de butirato de sodio, N-acetilcisteína, o la combinación de los mismos). En una modalidad, el título del anticuerpo del cultivo de células de mamífero es mejorado al menos 29% con respecto al cultivo de células de mamífero de control; al menos 40% con respecto al cultivo de células de mamífero de control; al menos 70% con respecto al cultivo de células de mamífero de control; o al menos 90% más que la del cultivo de células de mamífero de control. Se puede agregar butirato de sodio, N-acetilcisteína, o la combinación de los mismos, al cultivo de células de mamífero durante la fase de crecimiento del cultivo de células de mamífero. En una modalidad, el butirato de sodio, N-acetilcisteína, o la combinación de los mismos, es agregada al cultivo de células de mamífero entre los días 4 y 7 de tiempo del cultivo. En una modalidad, se agrega N-acetilcisteína, ya sea sola o en combinación con butirato de sodio, en una cantidad en el rango de una concentración final de 5 mM a 80 mM, por ejemplo, 20-60 mM, o aproximadamente 10 mM. La invención también caracteriza un método para extender la longevidad de un cultivo de células de mamífero al menos aproximadamente 45% en comparación con un cultivo de células de mamífero de control, agregando aproximadamente 0.1 mM a 10 mM de N-acetilcisteína al medio celular (el cultivo de control carece de esta adición). En una modalidad, la longevidad del cultivo de células de mamífero es extendida al menos aproximadamente 35% en comparación con el cultivo de células de mamífero de control; o al menos aproximadamente 55% en comparación con el cultivo de células de mamífero de control. Debe notarse que los medios de cultivo celular y los métodos de cultivo mejorados descritos en la presente, pueden ser utilizados por separado o en combinación unos con otros. Después de cultivar, utilizando los métodos y composiciones de la invención, la proteína expresada resultante posteriormente puede ser recuperada o colectada. Además, la proteína puede ser purificada o parcialmente purificada a partir de dicho cultivo o componente (por ejemplo, del medio de cultivo o de extractos celulares o del fluido intracelular), utilizando procesos conocidos. Los procedimientos de fraccionación pueden incluir, pero no se limitan a una o más etapas de filtración, centrifugación, precipitación, separación de fases, purificación por afinidad, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH, utilizando tales resinas como feniléter, butiléter o propiléter), CLAR o alguna combinación de los anteriores. Por ejemplo, la purificación del polipéptido puede incluir una columna de afinidad que contenga agentes que se unirán al polipéptido; una o más etapas en columna sobre tales resinas de afinidad como la concavalina A-agarosa, HEPARIN-TOYOPEARL (medio cromatográfico) o Cibacrom azul 3GA SEPHAROSE (cuentas de agarosa); una o más etapas que involucran la elución; y/o cromatografía de ¡nmunoafinidad. El polipéptido puede ser expresado en una forma que facilite la purificación. Por ejemplo, puede ser expresado como un polipéptido de fusión, tal como los polipéptido de unión a maltosa (PU ), glutatión-S-transferasa (GST) o tiorredoxina (TRX). Los paquetes para la expresión y purificación de tales polipéptidos de fusión se encuentran comercialmente disponibles en New England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia (Piscataway, NJ.) y en InVitrogen, respectivamente. El polipéptido puede ser marcado con un epítopo y purificarse subsecuentemente utilizando un anticuerpo específico dirigido a tal epítopo. Uno de tales epítopos, FLAG (marca epitópica), se encuentra disponible en el comercio en Kodak (New Haven, Conn.). También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende un polipéptido de unión a polipéptido, tal como un anticuerpo monoclonal a la proteína recombinante, para purificar por afinidad los polipéptidos expresados. Otros tipos de etapas de purificación por afinidad pueden ser una columna de proteína A ó G, cuyos agentes de afinidad se unen a proteínas que contienen dominios Fe. Los polipéptidos pueden ser removidos de una columna de afinidad utilizando técnicas convencionales, por ejemplo en solución de elución con alto contenido de sal y posteriormente dialízarse en una solución reguladora con menor contenido de sal, para su uso o cambiando el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada, o pueden ser removidos de manera competitiva utilizando el sustrato de origen natural de la porción de afinidad. En una modalidad, los anticuerpos producidos utilizando los métodos y composiciones de la invención, son purificados de conformidad con los métodos descritos en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 11/732918, incorporada en la presente como referencia. El grado deseado de pureza final depende del uso pretendido del polipéptido. Los métodos y composiciones de la invención son adecuados para usos terapéuticos de la proteína de interés. Por lo tanto, se desea un grado de pureza relativamente alto, cuando el polipéptido va a ser administrado in vivo. En tal caso, 'os polipéptidos son purificados de tal manera que las bandas no polipeptídicas que corresponden a otros polipéptidos, sean detectables al analizarlos por electroforesis en gel de poliacrilamida son DSS (EGPA-DSS). Un técnico en la materia reconocerá, en el campo pertinente, que las múltiples bandas correspondientes al polipéptido, pueden ser visualizadas por EGPA-DSS, debido a la glucosilación diferencial, procesamiento diferencial posterior a la traducción y similares. Más preferiblemente, el polipéptido de la invención es purificado a una homogeneidad sustancial, según sea indicado por una banda polipéptido única al analizar por EGPA-DSS. La banda polipeptídica puede ser visualizada por tinción de planta, tinción con azul de Coomassie o (si el polipéptido es radiomarcado), por autoradiografía. Opcionalmente, la invención también abarca la formulación de proteínas. El término "formulación", quiere decir que las proteínas pueden ser sometidas a intercambio en soluciones reguladoras, esterilizadas, empacadas a granel y/o empacadas para un usuario final. Tales composiciones pueden comprender una cantidad efectiva de la proteína, en combinación con otros componentes tales como un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. El término "fisiológicamente aceptable", significa un material no tóxico que no interfiera con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente o ingredientes activos. Deberá notarse que, con respecto a los números citados en la presente, los números que son intermedios a los rangos anteriores, así como otros números citados en la presente, también se pretende que formen parte de la presente invención. Rangos de valores, utilizando una combinación de cualquiera de los valores mencionados anteriormente como límites superiores y/o inferiores, se pretende que se incluyan en el alcance de la invención. Ejemplos Los siguientes Ejemplos muestran métodos y composiciones mejorados para cultivar células de mamífero, incluyendo métodos y composiciones mejorados para la expresión de productos biológicos en células de mamífero. Un medio definido bioquímicamente mejorado para cultivar células de Ovario de Hámster Chino (CHO), utilizado para expresar varios productos biológicos recombinantes, se describe más adelante. Además, también se ejemplifican procesos de medios para el cultivo de células en biorreactores a gran escala bajo varias configuraciones y escalas, que contienen los mismos componentes pero con diferente balance de componentes y enriquecidas, para permitir un mayor crecimiento celular y un incremento en la expresión del producto. EJEMPLO 1: MEDIOS MEJORADOS PARA CULTIVAR CÉLULAS DE MAMÍFERO Típicamente, los medios de cultivo de células de mamífero, por ejemplo, de Ovario de Hámster Chino (CHO), se basan en formulaciones de medios disponibles en el comercio, tales como DMEM, F12 de Ham o combinaciones de estos tipos de medios. Para la preparación de proteínas en células de mamífero, un medio de cultivo celular debe estar suficientemente enriquecido para soportar el incremento tanto en el crecimiento celular como en la expresión del producto biológico. Los siguientes ejemplos describen un medio bioquímicamente definido mejorado para cultivar células de mamífero, por ejemplo células de Ovario de Hámster Chino (CHO), para expresar varios productos biológicos recombinantes, incluyendo anticuerpos. Células de Ovario de Hámster Chino (CHO) deficientes de dihidrofolato reductasa [dhfr(-)], se adaptaron para crecer en suspensión en ausencia de suero o cualquier otro material derivado de una fuente animal. Las células se hicieron crecer en ausencia de hipoxantina y timidina, en un medio de cultivo definido para las células obtenido de una fuente comercial, JRH PF-CHO (Catálogo #67147). Aunque la línea celular no era deficiente de glutamina sintetasa, se agregó glutamina adicional al medio de cultivo. Se generaron líneas de células CHO que expresaban productos biológicos, tales como anticuerpos contra un objetivo dado, mediante el uso de técnicas de biología molecular conocidas en este campo. Brevemente, un vector de expresión capaz de expresar el anticuerpo de interés y capaz de expresar el gen de la enzima dhfr, se introdujeron en células CHO utilizando métodos conocidos en la técnica. Las células transfectadas de interés se obtuvieron seleccionando las células en presencia de hipoxantina y timidina. Las transformantes seleccionadas fueron cultivadas adicionalmente en concentraciones crecientes de metotrexato, para amplificar los genes transfectados e incrementar el rendimiento de las proteínas expresadas. El medio de cultivo celular mejorado utilizado para cultivar las células CHO, se describe a continuación. Ejemplo 1.1: Medio de Cultivo Celular para Células de Ovario de Hámster Chino (CHO) Generalmente, las formulaciones de los medios para cultivar células CHO estuvieron conformadas por tres partes, denominadas Partes A, B y C. La Parte A era un medio basal y comprendía agua, aminoácidos, vitaminas, sales metálicas inorgánicas, elementos traza, etanolamina, putrescina, un agente tensoactivo, piruvato de sodio, glutatión y 2-mercaptoetanol. La Parte B comprendía una fuente de fierro inorgánica; y la Parte C comprendía factores de crecimiento recombinantes, soluciones amortiguadoras, un regulador de osmolaridad, una fuente de energía, varios iones metálicos no ferrosos, un agente tensoactivo, e hidrolizados. Los componentes del medio en su mayoría eran inorgánicos o provenían de una fuente recombinante y estaban altamente purificados. Los medios no contenían proteínas, lípidos ni carbohidratos de fuentes animales. Se obtuvieron complejos provenientes de fuentes de levaduras y plantas altamente procesadas. La Parte A del medio incluía medio CHO (PF CHO) libre de proteínas (JRH - SAFC Biosciences; JRH Cat #67147 -también referido como la Parte A Original). Así pues, la Parte A incluía un medio basal, incluyendo agua, aminoácidos y vitaminas. El medio basal (PF CHO) se seleccionó para efectuar modificaciones y la reformulación para soportar incrementos adicionales en el crecimiento celular y en la productividad de la proteína expresada. El medio PF CHO fue modificado para remover ciertos componentes, incluyendo el bicarbonato de sodio, solución reguladora HEPES, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y glucosa como monosacárido (el medio PF CHO modificado es referido en la presente como Parte A modificada (también denominada JRH Catálogo #67411)). Estas modificaciones también se hicieron para facilitar las condiciones de mejoría en el proceso de cultivo celular en biorreactores de gran escala. El componente de la Parte B (JRH), consistía de una solución de citrato férrico concentrada, que se añadía por separado. La concentración del componente de la Parte B se mantuvo constante en todos los proyectos de cultivos de células CHO.
Los componentes de la Parte C incluyeron un factor de crecimiento, por ejemplo insulina, el aminoácido glutamina, TC yeastolate e hidrolizado de fitona de soya, siendo necesario el metotrexato para retener la presión selectiva, y se utilizó la base NaOH y el ácido HCI para ajustar el pH después de que los medios fueron hidratados durante su preparación. Las formulaciones de los medios de cultivo celular mejorados se realizaron de la siguiente manera. Primero, se hicieron crecer originalmente células CHO en medio PF-CHO (SAFC-JRH Catálogo #67147), obtenido en JRH. Se modificó adicionalmente el medio PF-CHO (Catálogo #67147), para utilizarse con las líneas de células CHO que se describirán más adelante. Este medio modificado fue diseñado por JRH, con un nuevo # de Catálogo 67411. La meta de las modificaciones fue permitir incrementar las concentraciones de la Parte A del medio de cultivo celular, de tal modo que no fuera afectada la osmolaridad ni el pH. La Parte A original (Catálogo #67147) también declaró el fabricante (JRH) que no contenía bicarbonato de sodio, glutamina y estaba libre de proteínas (sin insulina ni otras proteínas o factores de crecimiento peptídicos). Estos componentes omitidos, entonces, fueron agregados a las formulaciones de la Parte A 67147 y 67411 independientemente, específicamente para líneas de células CHO cuando probaran ser eficaces. Estos fueron algunos de los componentes que se describen en detalle más adelante como la Parte C.
Tabla 1: Composición de la formulación de medio de cultivo celular original (Parte A 67147), con formulación de medio de cultivo modificada (Parte A 67411 modificada) Componente Medio de Medio de cultivo cultivo celular celular conteniendo conteniendo 67411 (RM-230) 67147 (RM-003) modificado (Parte A (Parte A modificada) original) a 1X, 2X, 3X, y 4X g/L Parte A Parte A Original, Polvo: 16.45g/L NA Fuente JRH. Concentración 1X solamente Parte A Modificada: NA 2.63,526,789 and10.52 g/L Fuente JRH Especial. Componentes seleccionados sin bicarbonato de sodio, HEPES, y los fosfatos monobásico y dibásico de sodio, el regulador de osmolaridad cloruro de sodio, el tensoactivo Pluronic F-68, y el monosacáridos glucosa Parte B Parte B: Citrato Férrico 10 mL/L (0.5 mM) 10 mL/L (0.5 mM) JRH, solución concentrada Parte C Factor de crecimiento, monosacárido, fuente de energía-aminoácido: múltiples niveles Insulina humana 2-4 mg/L 4-13 mg/L Componente Medio de Medio de cultivo cultivo celular celular conteniendo conteniendo 67411 (RM-230) 67147 (RM-003) modificado (Parte A (Parte A modificada) original) a 1X, 2X, 3X, y 4X g/L recombinante Glucosa 1.5-3.5 g/L Hasta 7.0 g/L max. L-glutamina 0.292 g/L 0.584 g/L Amortiguadores: mantener a una sola concentración Bicarbonato de sodio 1.6 g/L 1.6g/L HEPES NA 1.8g/L NaH2P04 H20 NA 0.031 g/L Na2HP047H20 NA 0.436 g/L Regulador de Osmolaridad: Niveles Múltiples por Línea de Producto NaCI NA 0-6.5 g/L Hidrolizados: Niveles Múltiples por Línea de Producto Bacto TC Yeastolate NA 2.0-10.7 g/L Peptona BD Phytone NA 0-6.92 g/L (soya) Primatone NA 2-8 g/L Otros/Agentes Adicionales Presión selectiva (sistema dhfr): Niveles Múltiples por Línea de Producto Metotrexato Al nivel de Al nivel de amplificación amplificación requerido requerido Tensoactivo-protector de corte: Un solo nivel Pluronic F-68 1 0 g/L 1.0 g/L Componente Medio de Medio de cultivo cultivo celular celular conteniendo conteniendo 67411 (RM-230) 67147 (RM-003) modificado (Parte A (Parte A modificada) original) a 1X, 2X, 3X, y 4X g/L Ácido-Base para el ajuste del pH NaOH Según sea Según sea necesario necesario HCI Según sea Según sea necesario necesario Soluciones Objetivo pH final 7.2-7.4 7.1-7.3 Osmolaridad final 280-320 280-320 Parte A del Medio de Cultivo Celular para Cultivar Células CHO Como se describió anteriormente, la Parte A del medio de cultivo celular mejorado contenía una versión modificada del medio basal, es decir, medio PF-CHO. El medio PF-CHO (Catálogo No. 67147) obtenido en JRH, se modificó al remover los amortiguadores bicarbonato de sodio, HEPES y fosfato monobásico y dibásico de sodio, el regulador de osmolaridad cloruro de sodio, el tensoactivo Pluronic F-68, y el monosacárido glucosa, de la Parte A. Estos componentes se agregaron de nuevo a la Parte A a varias concentraciones, dependiendo de las necesidades del proyecto de cultivo celular específico. Esto permitió que la concentración de amortiguador se mantuviera constante, y la concentración de tensoactivo se mantuviera por debajo de los niveles tóxicos para las células, mientras que permitía que la osmolaridad y los niveles de sustrato de carbono, se manipularan para incrementar el crecimiento de las células y aumentar la producción de anticuerpos. Una vez que estos componentes fueron separados de la formulación Parte A original de JRH, se facilitó el incremento en la concentración de los componentes restantes en la Parte A de JRH, tal como se observa en el medio de cultivo celular modificado (PF CHO modificado -referido como #67411 en la Tabla 1), permitiendo de esta manera un aumento en el crecimiento celular y la expresión del anticuerpo, determinada por titulación del anticuerpo. Los componentes individuales de la formulación en polvo Parte A modificada (67411), incluyendo aminoácidos, vitaminas, elementos traza y otras fracciones componentes diversas, se incrementaron hasta cuatro veces con respecto a la concentración en la formulación original, sin tener que cambiar el volumen del medio. Una comparación de la formulación de la Parte A original utilizando 67147 y la formulación utilizando 67411, se describió anteriormente en la Tabla 1. Por definición, el medio basal original PF CHO de JRH (catálogo #67147), también era un medio basal PF CHO sin glutamina y sin bicarbonato de sodio. La concentración original de glucosa en la Parte 1, era de 1.5 mg/L. Parte B del Medio de Cultivo Celular para Cultivar Células CHO El componente Parte B del medio de cultivo celular comprendía una solución concentrada de citrato férrico, la cual era la misma que el componente Parte B del medio PF-CHO (Catálogo No. 67147) obtenida en JRH, y se agregó por separado. Las fuentes de fierro inorgánico, tales como sales férricas y ferrosas, particularmente citrato férrico y sulfato ferroso, se agregaron al medio basal, por ejemplo Parte A o Parte A modificada. Aunque se agregó una pequeña cantidad de sulfato ferroso (0.2-0.8 mg/L) y nitrato férrico no hidratado (0.025-0.11 mg/L), se prefirieron las sales queladas, tales como citrato férrico. El citrato férrico se agregó en mayor concentración como suplemento líquido, y fue incluido en el medio de cultivo celular como PF-CHO Parte B. Aunque la concentración de los otros componentes del medio podría cambiar y tener un mayor rango de concentración, el citrato férrico se mantuvo a una sola concentración de 122 mg/L. Esto se debió a la formación de superóxidos y radicales libres que causan daño celular, y a la formación de compuestos no deseados en el medio basal. Parte C del Medio de Cultivo Celular para Cultivar Células CHO La Parte C del medio de cultivo celular comprendía principalmente factores de crecimiento recombinantes, soluciones reguladoras, un regulador de osmolaridad, una fuente de energía e hidrolizados. Compuestos adicionales agregados al medio de cultivo celular que no están incluidos en los grupos usuales de aminoácidos, vitaminas y cofactores, sales inorgánicas y amortiguadores, elementos traza o minerales, en el transcurso del desarrollo, se describieron en la Tabla 1 anterior como "Parte C". Con respecto a la Parte C mencionada en la Tabla 1, debe observarse que los ingredientes identificados en la Parte C se pueden agregar por separado o en combinación. Factores de crecimiento recombinantes La hormona peptídica insulina, o alternativamente un análogo recombinante, se agregó al medio de cultivo celular en un rango de concentración de 4-13 mg/L. También se puede agregar IGF-1 sustituyendo o suplementando a la insulina, al medio de cultivo celular, a una concentración de 50-100 ng/L. Regulador de osmolaridad La osmolaridad de los diversos medios de cultivo celular estuvo en el rango de 260 a 460 mOsm. La regulación de la osmolaridad se efectuó a través de sales, especialmente NaCI, KCI y KN03, aunque todos los aminoácidos y los hidrolizados contribuyen considerablemente a cambiar la osmolaridad. Fuente de energía El monosacárido más abundante en el medio de cultivo fue la glucosa (D-glucosa) y fue suplementada según fuera necesario. La concentración inicial del medio de cultivo celular varió dentro del rango de 3.5 a 7.0 g/L. Otros azúcares también pueden ser suplementados como metabolitos o como protectores, estos pueden incluir maltosa, mañosa, galactosa o fructosa. Hidrolizados Los hidrolizados se consideran como una fuente adicional de aminoácidos libres, junto con los dipéptidos y tripéptidos. Mantenimiento del pH (amortiguador) Se utilizaron varios amortiguadores para mantener el pH del medio de cultivo celular dentro de un rango de 6.5 a 7.5. Los amortiguadores inorgánicos (o sistemas amortiguadores) utilizados en los medios, incluyeron carbonatos (NaHC03), cloruros (CaCI2), sulfatos (MgS04) y fosfatos (NaH2P04 y Na2HP04). Los amortiguadores orgánicos también incluyen el Piruvato de Sodio (C3H303Na) y ácido N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[2-etansulfónico], también conocido como HEPES. Glutamina También se incluyó glutamina en la Parte C, ya que ésta fue omitida en la Parte A original y en la Parte A modificada. La glutamina se incluyó en la Parte C, por ejemplo a razón de 0.2 a 0.4 (0.29) g/L en el medio de cultivo celular que contenía la Parte A original, y a razón de 0.3 a 0.7, por ejemplo 0.58 en el medio de cultivo celular que contenía la Parte A modificada (véase la Tabla 1 anterior). Otros Componentes del Medio de Cultivo Celular para Cultivar Células CHO A continuación se proporcionan componentes adicionales que se pueden agregar al medio de cultivo celular. Debe observarse que los componentes adicionales que se pueden agregar, no se limitan a los ejemplos que se proporcionan a continuación. Péptidos adicionales Sal HCI de putrescina, la cual ayuda a mantener la estructura del retículo endoplásmico y el crecimiento específico para líneas de células CHO, la cual fue agregada a razón de 0.4 a 1.65 mg/L al medio basal. Glutatión (un tripéptido) se agregó en cantidades que variaron dentro del rango de 0.5 a 2.0 mg/L. También se añadió 2- mercaptoetanol a 3.6 mg/L, actuando como agente reductor para mantener los grupos sulfhidrilo y unirse y transportar varios metales, como el cobre. Reduce el deshidroascorbato y la cistina, y regenera ascorbato y cisteína. Metotrexato Las concentraciones de metotrexato difirieron entre las líneas de producto, dependiendo de los niveles de amplificación finales por ser alcanzados. Utilizando una solución concentrada con una concentración 2 mM, los volúmenes de adición y las concentraciones finales son: 0.250 mL/kg produce 500 nM final para anti-IL-12 y anti-EPO-R; 0.5 mL/kg producen una concentración final 100 nM para anti-IL-18; y finalmente, 2.5 mL/kg producen una concentración final 5000 nM para el antí-TNF alfa. Protector Celular/Tensoactivo Los medios descritos en este ejemplo se emplearon para cultivar células CHO en suspensión, en todas las escalas de reactores, botellas y matraces, tanto bajo agitación como bajo burbujeo, lo cual creó grandes fuerzas de corte. Para minimizar el daño celular, se agregó un protector celular como polioles de pluronic, específicamente Pluronic F-68 a una concentración de aproximadamente 1 g/L de medio. Otros mitigantes de corte incluyeron metilcelulosa a una concentración menor o igual que 1 g/L, y ciertos hidrolizados o extractos de plantas, a concentraciones variables, hasta cantidades de gramos por litro. Aminoácidos El medio de cultivo celular tuvo una cantidad variable de aminoácidos, tal como se describe en la presente. Dos aminoácidos, la asparagina y glutamina, se agregaron en mayores concentraciones iniciales que los demás aminoácidos, ya que éstos rápidamente se vuelven nutrientes limitantes durante el transcurso del cultivo de células CHO. La asparagina en particular constituye aproximadamente de 0.4 a 0.5 g/kg del medio basal. Mientras que la asparagina fue un componente de la Parte A (incluyendo la original y PF CHO modificada), la concentración de asparagina se incrementó agregándola al medio de cultivo celular. El medio de cultivo celular fue capaz de soportar el crecimiento de células CHO desde densidades iniciales muy bajas hasta más de 1.0*107 células/mL, por un número de días, dependiendo de la concentración de los componentes con propósito y efecto celular del medio deseado. El proceso CHO adicionalmente incluyó una fase de crecimiento y una fase de producción, tal como se describirá en otras secciones, y requirió diferentes rangos de componentes. Sin embargo, las proporciones e identidades de la formulación del medio de cultivo celular permanecieron igual. Preparación final del medio de células CHO La preparación del medio de cultivo celular mejorado, requirió la adición de varios componentes en un orden particular, con ajustes de pH utilizando una base o un ácido en momentos particulares. La base se agregó en forma de NaOH a medida que la concentración basal de la Parte A se incrementaba, para ayudar a disolver los aminoácidos en la formulación hasta un pH máximo de 10. El pH se bajó al mínimo de 7.0, a medida que se agregaban los hidrolizados, utilizando un ácido en forma de HCI. Otros ajustes hasta un pH particular se llevaron a cabo utilizando NaOH o HCI, según fuera necesario. Los siguientes ejemplos describen medios de cultivo celular basándose en lo anterior, para la expresión de varios anticuerpos específicos. Ejemplo 1.2: Medio de Cultivo Celular para Cultivar Células CHO que Expresan el Anticuerpo Anti-TNF Alfa Líneas de células CHO que expresaban un anticuerpo humano completo contra TNFa (por ejemplo, adalimumab; D2E7), se cultivaron en los medios de cultivo celular descritos en la Tabla 2. Tabla 2: Medios de cultivo celular para cultivar células CHO que expresan el anticuerpo humano completo anti-TNF alfa Componentes de los Medios Materias Primas AFD2-E7- AFD2E7- AF and AY- AY-D2E7- AY-D2E7 Especificación # 1XP 1XP D2E7 2XP SR- SR-250 SR-286 SR-332 SR-333 Lista de Componentes: JRH Parte A 243Crecim. Crecim.+MT Producción Crecim.1 Crecim.2 y Parte B + X proadJXP Componentes ABC agregados pH final 7.2 ± 0.1 7.2 ±0.1 7.2 ±0.1 7.2 ±0.1 7.2 ±0.1 Osmolaridad final: 280-320 280-320 370-390 320-360 320-360 Parte A: no modificado -original RM-003 16.45 16.45 NA NA NA disponible en el comercio Parte A Especial (Modificado): libre RM-230 NA NA 7.89 g/kg 5.26 g/kg 5.26 g/kg de sal Parte B: citrato férrico: fuente de RM-004 10 mL/kg 10 mL/kg 10 mL/kg 10 mL/kg 10 mL/kg fierro quelado Parte C: Insulina HUR: Regulador proteico SR-055 2.0 mL/kg 2.0 mL/kg (4 6.0 mL/kg 3.88 mL/kg (8 3.88 mL/kg recombinante de glucosa (4mg/kg) mg/kg) (12mg/kg) mg/kg) (8 mg/kg) Glucosa anhidra: fuente de carbono RM-011 3.5 g/kg 3.5 g/kg 7.0 g/kg 7.0 g/kg 7.0 g/kg Ejemplo 1.3: Composición de los Medios para Cultivar Células CHO que Expresan el Anticuerpo Contra IL-12 La línea celular CHO que expresa un anticuerpo humano completo contra IL-12, se cultivó en un medio de cultivo descrito en la Tabla 3.
Tabla 3: Medios para C ultivar Cél ulas C HO que Expresan el Antic uerpo H umano Com pleto Anti-IL1 2 (ABT-874) Especifica ABT-874 ABT-874 ABT-874 ABT-874 ABT-874 ABT-874 ABT-874 -ción de Nombre del medio SR-383 SR-352 SR-468 SR-351 Materia Prima # Crecimiento Producción Alimentación Alim. Glu SR-274 SR-273 SR-272 pH final: 6.5-6.9 6.5-6.9 6.5-6.9 Osmolaridad final: 2.65-2.82 2.65-2.82 2.65-2.82 Parte A: No RM-003 NA NA NA NA 16.45 g/kg 16.45 g/kg 16.45 modificado - original - g/kg disponible en el comercio Parte A (modificado): RM-230 5.26 g/kg NA NA NA NA NA NA libre de sal Parte A (modificado): RM-322 NA 7.89 g/kg 21.0 g/kg 7.89 g/kg NA NA NA libre de sal y reducido en vitaminas Parte B: citrato RM-004 10 mL/kg 10 mL/kg NA 10 mL/kg 10 mL/kg 10 mL/kg 10 mL/kg férrico: fuente de fierro quelado Parte C: Transferían bovina: SR-057 NA NA NA NA NA NA NA Fuente de Fe animal, vehículo Insulina Humana SR-055 3.88 mL/kg 6.5 mL/kg NA 6.5 mL/kg 2 mL/kg (4 2 mL/kg (4 2 mL/kg mg/L) (4 mg/L) recomb: Regulador (13 mg/kg) mg/L) proteico recombinante de glucosa Glucosa anhidra: RM-011 7.0 g/kg 7.0 g/kg 150 g/kg 200 g/kg 3.5 + 1.5 3.5 + 1.5 200 g/L fuente de carbono g/kg g/kg L-glutamina: RM-071 0.876 g/kg 0.584 NA 0.584 g/kg 0.292 g/kg 0.292 g/kg 0.292 g/kg aminoácido y fuente g/kg de energía Bicarbonato de sodio: RM-077 1.60 g/kg 1.60 g/kg NA 1.6 g/kg 1.6 g/kg 1.6 g/kg 1.6 g/kg amortiguador: regulador de CO2-PH HEPES: amortiguador RM-090 1.80 g/kg 1.80 g/kg NA 1.8 g/kg NA NA NA orgánico NaCI (sal): regulador RM-174 2.675 g/kg 2.45 g/kg NA 2.45 g/kg NA NA NA de osmolaridad NaH2P04-H20: R -200 0.031 g/kg 0.031 NA 0.031 g/kg NA NA NA amortiguador de g/kg fosfatos ABT-874 ABT-874 ABT-874 ABT-874 ABT-874 ABT-874 ABT-874 Na2HPOH20: RM-233 0.436 g/kg 0.436 NA 0.436 g/kg NA NA NA amortiguador de fosfatos Bacto TC Yeastolate: R -216 4.0 g/kg 10.7 g/kg 65.0 g/kg 10.7 g/kg 2 g/kg 11 g/kg 8 g/kg hidrolizado fuente de levadura Peptona Phytone: RM-238 2.579 g/kg 6.92 g/kg 41.0 g/kg 6.92 g/kg NA NA NA hidrolizado fuente de soya de planta Oreos Componentes Pluronic F-68 R -188 1.00 g/kg 1.00 g/kg NA 1.0 mL/kg NA NA NA (Poloxámero 188 NF): tensoactívo, vehículo L-asparagina R -284 0.450 g/kg NA 5.0 g/kg NA NA NA NA monohidratada: aminoácido Primatote: hidrolizado R -149 NA NA NA NA NA NA NA fuente animal-Res Metotrexato: Selectivo SR-133 0.250 mL/kg NA NA NA 0.250 mL/kg 0.250 mL/kg 0.250 en el sistema DHFR mL/kg de amplificación CHO NaOH 2N: Base SR-288 3.50 mL/kg 5.67 Según sea 5.67 mL/kg Según sea Según sea Según mL/kg necesario necesario necesario sea necesario HCI 2N: Acido SR-287 2.91 mL/kg 2.5 mL/kg Según sea 2.5 mL/kg Según sea Según sea Según necesario necesario necesario sea necesario Con respecto al med io basal modificado libre de sal y con u n conten ido red ucido de vitami nas anteriormente referido , la cantidad de vitaminas se redujo u na tercera parte en relación con el med io basal no mod ificado , anteriormente descrito como RM-003 , o el med io basal modificado l ibre de sal , descrito anteriormente como RM-230. As í pues, u n med io basal con contenido reducido de vitaminas, como se describió anteriormente, tiene una tercera parte de la cantidad de las vitaminas que los medios RM-003 y RM-230. Cuando se utilizó en las cantidades dadas en la tabla anterior, la concentración final de vitaminas en los medios se redujo a una tercera parte, en contraste con lo que se utilizó en los medios RM-003 ó RM-230. Sin embargo, debe observarse que, si es necesario, también se puede utilizar la producción y alimentación de medio utilizando RM-230. Ejemplo 1.4: Composición de Medios para Cultivar Células CHO que Expresan Anticuerpos Contra IL-18 y EPO/R La Tabla 4 proporciona un resumen de los medios de crecimiento y producción utilizados para expresar anticuerpos anti-IL18 y anti-EPO/R. Se pueden encontrar detalles adicionales referentes a los medios para expresar estos anticuerpos, en la Tabla 5 (anti-IL-18) y en la Tabla 6 (anti-EPO/R). Tabla 4: Medio para cultivar células CHO que expresan anticuerpos humanos completos anti-IL18 y anti-EPO/R Componentes del Medio Especificación Anti-IL-18 Anti-IL-18 Anti-IL-18 anti-EPO-R anti-EPO-R de Materia 2XP 3XP 4XP 1XP 3XP Lista de componentes: Prima # SR-371 SR-372 SR-382 SR-274 SR-286 JRH Parte A y Parte B crecimiento producción producción crecimiento producción Componentes ABC pH final: 7.0 ±0.1 6.9 ± 0.05 7.0 ± 1.0 7.2 ±0.1 7.2 ±0.1 agregados Osmolaridad 280-300 373-403 360400 280-320 370-390 final' Parte A: No modificado - RM-003 NA NA NA 16.45 NA origina - disponible en el comercio Parte A especial RM-230 5.26 g/kg 7.89 g/kg 10.52 g/kg NA 7.89 g/kg (modificado): libre de sal Parte B: citrato férrico: RM-004 10 mL/kg 10 mL/kg 10 mL/kg 10 mL/kg 10 mL/kg fuente de fierro quelado Parte C: Insulina humana recomb: SR-055 3.88 mL/kg (8 6.0 mL/kg (12 6.5 mL/kg (12 2.0 mL/kg (4 6.0 mL/kg (12 La línea de células CHO que expresaba IL-18 se cultivó en un medio de cultivo 2xP (SR-37 ), y posteriormente se produjo el 15 anticuerpo en un medio de producción 3xP (SR-372), para un título final de aproximadamente 1 g/L. El proceso de alto título utilizó 4xP (SR-382) como medio de producción, para alcanzar un título final de aproximadamente 2 g/L. El medio de producción empleado para la producción de anti-EPO/R, fue idéntico al SR-286, pero se utilizó un 2o medio 1xP (SR-274) para el crecimiento celular. Todos los medios se describen en las Tablas 4 y 5. Ejemplo 1.5: Procesos de Cultivo Celular para Producir Anticuerpos en Células de Mamífero El medio anteriormente descrito, también se desarrolló en ye dos plataformas de producción utilizadas en dos proyectos para cultivar células de mamífero, por ejemplo células CHO. La primera plataforma se desarrolló utilizando la composición de medio similar a la descrita en el medio de producción modificado descrito en las Tablas 2-4 anteriores, con la única diferencia de una diferente temperatura utilizada para el crecimiento celular. Esta plataforma se empleó para la producción del anticuerpo anti-IL18, así como para la producción del anticuerpo contra el receptor de eritropoyetina (antí-EPO/R). La segunda plataforma de medios fortaleció adicionalmente los componentes nutricionales, y se utilizó para la producción de altos títulos del anticuerpo anti-IL-18, para lograr una productividad de anticuerpos volumétrica mayor. Todos los anticuerpos, incluyendo el anti-IL- 2, anti-IL-18 y anti-EPO/R, fueron anticuerpos IgG 1 humanos completos expresados por líneas de células CHO transfectadas dhfr(-), tal como se describió previamente. Estas líneas celulares se cultivaron en suspensión y sin la ayuda de una fuente de suero bovino ni otros materiales animales. Para producir anticuerpos anti-IL 18, la línea celular CHO que expresaba anti-IL-18 se cultivó en un medio de crecimiento, denominado en la presente como SR-371. El medio SR-371 se utilizó para soportar una alta productividad celular, con un crecimiento celular moderado. Una vez que la densidad celular alcanzó los criterios de transferencia, las células fueron transferidas al medio de producción (SR-372), para iniciar la etapa de producción.
Tabla 5: Composiciones de medios de cultivo en el Proceso A Anti-IL-18 Se utilizó el medio de crecimiento SR-371 en los reactores de entrenamiento y siembra. El medio de producción SR-372, se utilizó en el biorreactor de producción de 3000 litros.
La temperatura se mantuvo a 35°C durante el cultivo. Se agregaron 4 g/L de glucosa adicionales, cuando el nivel de glucosa del cultivo celular se encontrara por debajo de 2 g/L. También se empleó un proceso similar para la producción del anticuerpo anti-EPO/R. Sin embargo, este medio (SR-274) se utilizó para el crecimiento celular en la siembra. El medio SR-286, que es el mismo utilizado para la producción Humira, se empleó en la etapa de producción del anticuerpo anti-EPO/R (Tabla 6). El medio de crecimiento SR-274, se utilizó en los reactores de entrenamiento y siembra. El medio de producción SR-286 se utilizó en el biorreactor de producción de 3000 litros. Tabla 6: Composiciones de medios de cultivo en el proceso anti- EPO/R Componente Medio de Medio de Crecimiento Producción SR-274 SR-286 PFCHO Parte A, RM-003 16.45 g/kg N7A PFCHO Parte A, RM-230 (libre de sal) N/A 789 g/kg PFCHO Parte B (solución conc. de 10 mL/kg 10 mL/kg citrato férrico) Insulina humana recombinante 4 mg/kg 13 mg/kg Dextrosa anhidra 1.5 g/kg 7.0 g/kg L-glutamina 0.292 g/kg 0.584 g/kg Bicarbonato de sodio 1 6 g/kg 1.6 g/kg HEPES N/A 1.8 g/kg NaCI N/A 245 g/kg Pluronic F-68 (Poloxámero 188 NF) N/A 1.0 g/kg NaH2P04 H20 N/A 0.031 g/kg Na2HP04-7H20 N/A 0.436 g/kg Bacto TC Yeastolate 2.0 g/kg 10.7 g/kg Peptona Phytone N/A 6.92 g/kg Metotrexato 2 mM 0.25 mL/kg N/A NaOH 2N Según se 5.67 mL/kg necesite HCI 2N Según se 2.5 mL/kg necesite pH final 7.20 ± 0.10 7.15 ± 0.05 Osmolaridad final (mOsm/kg) 320 ± 20 388 ± 15 Los medios de producción SR-286 y SR-372, consistieron de componentes de medio similares a los listados en las Tablas 5 y 6, pero con diferente nivel de TX (0 nM para el SR-286 y 100 nM para el SR-372). Se desarrolló un proceso mejorado para la producción de anti-IL-18, para obtener una mayor productividad. Este nuevo proceso, denominado Proceso B, introdujo un nuevo medio para extender la longevidad del cultivo celular e incrementar la productividad volumétrica de anticuerpos. El medio de producción (SR-382) fue diferente de los medios de producción anteriores en la cantidad de nutrientes utilizados en la etapa de producción. La composición completa del medio SR-382, se describe en la Tabla 7. En el nuevo proceso para la producción de anti-IL-18, aunque las células todavía fueron cultivadas en medio SR-371 durante la etapa de siembra, se utilizó el medio SR-372 en el biorreactor de siembra de una etapa antes de la etapa de producción. Después, las células se cultivaron en medio SR-382 en la etapa de producción, con un cambio de temperatura de 35 a 33°C, para prolongar la longevidad del cultivo celular y por lo tanto extender los efectos del medio SR- 382 sobre las células. Se utilizó el medio de crecimiento SR-371 en matraces para agitación, Wave bag, y el biorreactor de siembra de 100 litros. Se utilizó el medio SR-372 poco lleno en la etapa inicial del cultivo de 575 litros en el biorreactor de producción de 3000 litros. Se utilizó el medio de producción SR-382 en el biorreactor de producción de 3000 litros solamente. Tabla 7: Composición de los medios de cultivo en el Proceso B anti-IL-18 Componente Medio de Medio de Medio de Crecimiento Producción Producción SR-274 SR-286 SR-382 PFCHO Parte A, 5.26 g/L 7.89 g/L 10.52 g/L formulación especial libre de sal PFCHO Parte B 10 mL/L 10 mL/L 10 mL/L (solución conc. de citrato férrico) Insulina humana 7.76 mg/L 13 mg/L 13 mL/L recombinante Dextrosa anhidra 7.0 g/L 7.0 g/L 7.0 g/L L-glutamina 0.876 g/L 0.584 g/L 0.584 g/L Bicarbonato de sodio 1.6 g/L 1.6 g/L 1.6 g/L HEPES 1.8 g/L 1 8 g/L 1.8 g/L NaCI 2.67 g/L 2.45 g/L 0 g/L Pluronic F-68 1.0 g/L 1 0 g/L 1.0 g/L (Poloxámero 188 NF) NaH2P04 H20 0.031 g/L 0.031 g/L 0.031 g/L Na2HPCv7H20 0.436 g/L 0.436 g/L 0.436 g/L Bacto TC Yeastolate 4.0 g/L 10.7 g/L 14.27 g/L Componente Medio de Medio de Medio de Crecimiento Producción Producción SR-274 SR-286 SR-382 Peptona Phytone 2.579 g/L 6.92 g/L 9.23 g/L Metotrexato 2 mM 0.05 mL/L 0.05 mL/L 0.05 mL/L NaOH 2N 3.5 mL/L 5.67 mL/L 8.95 mL/L HCI 2N 2.91 g/L 2.5 mL/L 4.1 mL/Kg pH final 7.1 - 7.2 7.1 - 7.2 7.1 - 7.2 Osmolaridad final 373 - 403 373 - 403 373 - 403 (mOsm/kg) Los nutrientes fueron enriquecidos en el siguiente medio para proporcionar fuentes de energía adicionales y componentes de construcción para el crecimiento de las células CHO y la producción de anticuerpos. En el proceso B, aunque las células todavía fueron cultivadas en medio SR-371 durante la etapa de entrenamiento, se utilizó el medio SR-372 en la siembra del biorreactor de una etapa antes de la etapa de producción. Después las células se cultivaron en medio SR-382 en la etapa de producción, con un cambio de temperatura de 35 a 32°C, para prolongar la longevidad del cultivo celular y por lo tanto extender los efectos del medio SR-382 sobre las células. Proceso A: Desempeño de las Células Anti-IL-18 y Células Anti-EPO/R en el Medio SR-372 y en el Medio SR-286 Se cultivaron células que expresaban el anticuerpo anti-IL-18 en medio SR-371, con MTX 100 nM, para acumular masa celular para la etapa de producción. El medio SR-371 se utilizó para soportar una productividad celular más alta con un crecimiento celular moderado. La Tabla 8 muestra un perfil de crecimiento de producción representativo de células CHO productoras de anti-IL-18, en el biorreactor de producción de 3000 L. Utilizando este proceso (Proceso A) con el medio SR-372, se obtuvo un título final de hasta 1 g/L. Tabla 8: Producción del Anticuerpo Anti-IL-18 en Medio 372 (Proceso A) Resultados Medibles Proceso a Escala Proceso a 3000 L Piloto (n=5) (n=6) Temp = 35°C Temp = 35°C Densidad Celular 8.68 9.2 Máxima [106 células viables/mL] Duración hasta 50% 11 11 de viabilidad [Días] Productividad 20.5 17.6 Específica de las Células [pg/célula-día] Productividad 98.8 81.8 Volumétrica Hasta la Cosecha @ 50% de viabilidad [mg/L-día] Título @ 50% de 1004 900 viabilidad [mg/L] El medio 286, que comparte la misma formulación que el medio 372, excepto por la concentración de MTX, se utilizó para la producción de anti-EPO/R. Aunque normalmente se obtiene una densidad celular más baja en la etapa de producción, se alcanzó una mayor productividad, para hacer posible que las células produjeran hasta 1.8 g/L de anticuerpo a escala de 3000 L, utilizando el medio SR-286 como medio de producción. Se observó un crecimiento celular razonable, tal como se resume en la Tabla 9. Los resultados a escala piloto, así como los resultados a escala de 3000 L, demostraron que este medio incrementó la productividad específica celular y se observó un título final de hasta 1.9 g/L. Estos resultados demuestran que los medios con formulación similar (SR-372 y SR-286 en las Tablas 1 y 2), soportan un buen crecimiento celular y una alta producción de anticuerpos, en cultivos de células CHO a gran escala.
Tabla 9: Producción del anticuerpo anti-EPO/R en medio 286 Resultados Medibles Proceso a Escala Proceso a 3000 L Piloto (n = 5) (n=6) Temp = 35°C Temp = 35°C Densidad Celular 8.68 9.2 Máxima [106 células viables/mL] Duración hasta 50% 11 11 de viabilidad [Días] Productividad 20.5 17.6 Específica de las Células Resultados Medí bles Proceso a Escala Proceso a 3000 L Piloto (n = 5) (n=6) Temp = 35°C Temp = 35°C [pg/célula-día] Productividad 98.8 81.8 Volumétrica Hasta la Cosecha @ 50% de viabilidad [mg/L-día] Título @ 50% de 1004 900 viabilidad [mg/L] Proceso B: Desempeño de las Células Anti-IL 18 en el Proceso B con el Medio SR-382 El medio SR-382 fue el más enriquecido que se utilizó en el proceso por lotes extendido para la producción del anticuerpo anti-IL-18. El Proceso B incluye el uso del medio SR-371 en la etapa de entrenamiento y SR-372 en el biorreactor de siembra antes de la etapa de producción, o de la etapa de poco llenado. El crecimiento celular fue moderado en comparación con el crecimiento celular en el medio SR-372, en la etapa de producción. Sin embrago, con el cambio de temperatura, se obtuvo un título final de hasta 2.5 g/L, utilizando el medio SR-382. El medio SR-382 fue desarrollado basándose en el estudio que demostró que la actividad específica de las células que expresan a nti- 1 L 18 se incrementaba proporcionalmente con el aumento de nutrientes en el medio de producción. El medio SR-382 fue el medio óptimo que proporcionó el balance entre crecimiento celular e incremento en el título final. Aunque la densidad celular máxima sólo alcanzó 5.9*106 células/mL, la productividad específica celular se incrementó en un factor de dos. La combinación con el cambio de temperatura para prolongar la duración del cultivo celular, causó que se alcanzara un título de hasta 2.2 g/L, tal como se muestra en la Tabla 10. Tabla 10: Producción del anticuerpo anti-IL18 en medio SR-382 (Proceso B) Resultados Medibles Proceso a Escala Proceso a 3000 L Piloto (n = 1) (n=1) Temp = 35-33°C Temp = 35-33°C Densidad Celular 7.85 5.90 Máxima [106 células viables/mL] Duración hasta 50% 12 13 de viabilidad [Días] Productividad 32.0 42.1 Específica de las Células [pg/célula-día] Productividad 181.1 191.8 Volumétrica Hasta la Cosecha @ 50% de viabilidad [mg/L-día] Título @ 50% de 2173 2110 viabilidad Resultados Medibles Proceso a Escala Proceso a 3000 L Piloto (n = 1) (n = 1) Temp = 35-33°C Temp = 35-33°C [mg/L] EJEMPLO 2: Proceso por Lotes de Alimentación Mejorado y Soluciones de Alimentación para la Expresión de Anticuerpos El análisis del medio gastado de los biorreactores funcionando en la modalidad por lotes, demostró el agotamiento de ciertos aminoácidos. Este resultado también sugirió el agotamiento de otros componentes del medio, incluso si no fueron medidos, lo cual podría causar deficiencias adicionales en la nutrición. Con el fin de compensar estas deficiencias potenciales, se agregaron soluciones de nutrientes. En el campo de la ingeniería, este enfoque generalmente se denomina como alimentación-lote. Desde un punto de vista operativo, es conveniente utilizar soluciones de alimentación concentradas. Los siguientes ejemplos describen la adición de soluciones altamente concentradas del medio basal químicamente definido (PFCHO, Catálogo #67411-50L) e hidrolizados complejos, por ejemplo yeastolate y phytone. Se determinó que este par de hidrolizados exhibía un efecto sinérgico en el incremento de productividad, relacionado con su razón de concentración. Ejemplo 2.1: Proceso de Alimentación por Lotes de Adalimumab El proceso de adalimumab (Humira/D2E7) inicial consistió de un proceso de 3 días en el cual el medio fue removido y rellenado ocho veces consecutivas. Un proceso de alimentación por lotes mejorado se desarrolló al reemplazar en el medio el hidrolizado Primatone por el hidrolizado Yeastolate y utilizando nuevos parámetros en el reactor. El proceso de alimentación por lotes mejorado duró aproximadamente 12 días. La productividad del proceso por lotes inicial se mejoró adicionalmente mediante la reformulación del medio basal, PFCHO, y agregando un nuevo hidrolizado, por ejemplo Phytone. Esta formulación de medio que contiene hidrolizado se utilizó en el proceso referido anteriormente como SR-286 (véase la Tabla 2). Los parámetros de operación del reactor también se investigaron, lo cual dio como resultado la identificación de una temperatura óptima para correr todo el proceso de producción de adalimumab. El análisis de muestras tomadas diariamente de los experimentos en el reactor, resaltó algunas deficiencias nutricionales potenciales. Para el caso del proceso por lotes de adalimumab, la deficiencia nutricional potencial se corrigió alimentando una solución de PFCHO concentrada 25x y una solución 33x de los hidrolizados yeastolate y phytone. Los hidrolizados son componentes complejos °.ue exhiben un efecto sinérgico relacionado con su razón de concentración. Esta razón se mantuvo en una versión altamente concentrada 33x. Plan Experimental La meta del experimento fue comparar el nuevo proceso de alimentación por lotes del proceso de dos lotes de control (cambio de temperatura de 37->33°C vs. temperatura constante a 35°C). Las modificaciones de alimentación por lotes fueron: 1. Enriquecimiento del medio basal 25x (solución PFCHO), alimentado basándose en las deficiencias de aminoácidos. 2. Solución de enriquecimiento de hidrolizado 33x alimentada a intervalos de tal modo que la osmolaridad del medio nunca excediera los 440 mOsm (condición que da como resultado una reducción en el crecimiento y viabilidad celular). 3. La temperatura del reactor establecida en 35°C todo el proceso. Los controles para este experimento fueron: a) Un reactor idéntico operando con los medios actuales (SR-286) y bajo los parámetros del proceso del lote control (las condiciones de control incluían reactores funcionando con el medio SR-286, con un cambio de temperatura y un incremento lineal del pH), designado como control #1; y b) un reactor idéntico operando con el medio actual (SR-286) y bajo todos los parámetros de los procesos por lotes actuales, excepto por la temperatura de operación de 35°C durante todo el proceso, designado como control #2. Materiales Reactores Braun ED con un volumen de trabajo de 13 L Inoculo de Planta Piloto AFI915A utilizando el Banco de Células de Trabajo WCB970513-6 Solución de medio basal 3XP11Y7P (SR-286) Solución de Enriquecimiento de Medio Basal (25x) (solución PF CHO) Solución de Enriquecimiento de Hidrolizado (33x) Alimentación de Glucosa (200 g/L) (solución de glucosa) Solución de hidróxido de sodio 0.5N, para el control del pH Preparación de la Solución 1. Medio de Producción (véase el Registro de Solución SR-286 descrito anteriormente en la Tabla 2) 2. 2 kg de Solución de Enriquecimiento PFCHO (25x) (solución de enriquecimiento basal): Preparada en el siguiente orden, bajo agitación constante y dejando mezclar durante 10 minutos antes de cada adición: Filtrar a través de un filtro de membrana PES de 0.2 µ?? Almacenar a 4°C En cada adición de 1% del volumen inicial de la solución anterior se incrementará lo siguiente: a) la concentración de PFCHO en 0.25x en comparación con la concentración 3x original b) la asparagina en 75 mg/L c) la concentración de glucosa en 0.5 g/L d) la osmolaridad en 10 mOsm e) el pH en -0.10 unidades de pH 3. 1 kg de Solución de Enriquecimiento de Hidrolizado (33x): Preparada en el siguiente orden, bajo agitación constante y dejando mezclar durante 10 minutos después de cada adición: Componente Masa [g] Notas H20 MilliQ 500 Yeastolate TC 265 Peptona Phytone 165 H20 MilliQ Según se requiera Llevar el peso hasta 1000 g Filtrar a través de un filtro de membrana PES de 0.2 pm Almacenar a 4°C Nota: En cada adición de 1% del volumen inicial de la solución anterior se incrementará lo siguiente: a) la concentración de Yeastolate TC en 2.65 g/L (0.33x), en comparación con la concentración original del lote. b) la concentración de peptona Phytone en 1.65 g/L (0.33x), en comparación con la concentración original del lote.
Métodos Operación del reactor: Para inocular el reactor, se descongeló un frasco y se expandió siguiendo la descripción del proceso de siembra Humira. Después del crecimiento en el reactor, este fue drenado hasta 3.62 L, para simular la etapa de poco llenado. Después, el reactor se aumentó hasta el nivel de 13 L con medio de producción (SR-286). Los reactores se operaron con los siguientes parámetros: a) Agitación, 70 rpm b) Temperatura, 35°C c) Disminución lineal de pH iniciando en pH 7.16 hasta pH 6.90, en un periodo de 72 horas d) Oxígeno disuelto, 30% e) Los reactores fueron alimentados con 195 g de una solución de glucosa a 200 g/L, cuando el nivel de glucosa disminuía a menos de 2.0 g/L Programa de Alimentación A continuación se representa el programa de alimentación para agregar nutrientes adicionales, por ejemplo medio basal suplementario e hidrolizados al lote de adalimumab. Tabla 11: Programa de alimentación para el proceso de alimentación por lotes de adalimumab Cantidades Alimentadas [g] Día PFCHO 25x Hidrolizados 33x 0-3 4 130 130 5 6 260 Cantidades Alimentadas [g] Día PFCHO 25x Hidrolizados 33x 7 130, glucosa 8 9 260, glucosa 10 260 11 130 12-13 Resultados: Los resultados (así como las mejoras proyectadas) compararon los procesos de control #1 y #2 con el proceso de alimentación por lotes mejorado, se describen en las Tablas 12 y 13. Tal como se muestra en la Tabla 12, la productividad de adalimumab se incrementó con la adición de medio basal enriquecido mejorado y la solución de enriquecimiento de hidrolizado, utilizando el proceso de alimentación por lotes mejorado, bajo temperatura constante. Tabla 12: Comparación de procesos de alimentación por lotes de adalimumab Resultados Control #1 Control #2 Experimento Medibles (Proceso (Proceso de 3000L) 3000L) Alimentación Temp. = 37°C Temp. = 35°C por lotes 133°C Temp. = 35°C Densidad 3.63 4.45 4.41 Celular Máxima [106 células viables/mL] Resultados Control #1 Control #2 Experimento Medibles (Proceso (Proceso de 3000L) 3000L) Alimentación Temp. = 37°C Temp. = 35°C por lotes 133°C Temp. = 35°C c Duración hasta 13 10 12 O 50% de viabilidad [Días] Productividad 42.5 46.7 61.4 Específica de las Células [pg/célula-día] 0 Productividad 98 114 163 Volumétrica Hasta la Cosecha @ 50% de viabilidad 5 [mg/L-día] Título @ 50% 1322 1178 1979 de viabilidad [mg/L] Tabla 13: Comparación de los resultados proyectados utilizando procesos de alimentación por lotes de adalimumab Resultado Control #1 Control #2 Experimento de Proyectado (Proceso (Proceso Alimentación 3000L) 3000L) por lotes Temp. = 37°C Temp. = 35°C Temp. = 35°C |33 5 °C Cosechas 22 28 24 Anuales [Permitiendo 3 días de recuperación] Rendimiento de 75.6 85.7 123.4 Producto Anual [Basándose en cosechas de 2600 L) Incremento del 100% 114% 163% Rendimiento Anual (control = 100%) Ejemplo 2.2: Proceso de Alimentación por Lotes de ABT-874 Al igual que en el caso del proceso de alimentación por lotes mejorado para adalimumab anteriormente mencionado, el análisis de las muestras tomadas diariamente del reactor ABT-874 funcionando en la modalidad por lotes, resaltó el agotamiento de aminoácidos. Una vez más, esta deficiencia fue corregida utilizando una solución 25x de PFCHO y una solución concentrada de hidrolizado 33x. El proceso por lotes de AVT-874, originalmente fue desarrollado para D2E7 (adalimumab), reemplazando el hidrolizado en los medios e introduciendo nuevos parámetros en el reactor. Además, al igual que en el caso de D2E7 (adalimumab), los medios básales fueron reformulados y se agregó un nuevo hidrolizado. Esta formulación de medios se utilizó en el proceso actual de D2E7 como SR-286 (véase la Tabla 2 anterior). Plan Experimental La meta del experimento fue comparar un proceso por lotes de control con las siguientes condiciones de alimentación por lotes, ambos iniciando en el momento en que se agotaron los aminoácidos anteriormente identificado: a) Se alimentaron alternativamente solución de enriquecimiento de medio basal PFCHO 25x y solución de enriquecimiento de hidrolizado 33x b) Se alimentaron diariamente la solución de enriquecimiento de medio basal PFCHO 25x y la solución de enriquecimiento de hidrolizado 33x El control para este experimento incluyó un reactor idéntico que operaba con los medios actuales (SR-286) y bajo los parámetros del proceso por lotes de control (medio SR-286, con un cambio de temperatura y una disminución lineal del pH). Materiales Reactores Braun ED con un volumen de trabajo de 13 L Banco de Células de Trabajo W990107-J695 Solución de medio basal 3XP11Y7P (SR-286-111899-1 ) Medio de Crecimiento PFCHO-0-500-HG2Y Solución de Enriquecimiento del Medio Basal (25x) Solución de Enriquecimiento de Hidrolizado (33x) Solución de Hidróxido de Sodio 0.5N Preparación de la Solución 1. Medio de producción (véase el Registro de la Solución SR-286) 2. Solución PFCHO 25x (solución de enriquecimiento basal: descrita en el ejemplo previo; con la excepción de que se utilizaron 462 g de solución de glucosa en vez de glucosa en polvo, siendo entonces el peso final de 2170 g). Nota: En cada adición de 1% del volumen inicial de la solución anterior, se incrementará lo siguiente: a) Concentración de PFCHO en 0.25x en comparación con la concentración 3x original b) Asparagina en 75 mg/L c) Concentración de glucosa en 2.1 g/L · pH en -0.10 unidades de pH 3. Solución de Hidrolizado 33x (descrita en el ejemplo previo con la adición de 2.40 g/L de glucosa) Nota: en la adición de 1% del volumen inicial de la solución anterior, se incrementará lo siguiente: a) La concentración de Yeastolate TC en 2.65 g/L (0.33x), en comparación con la concentración original del lote. b) La concentración de peptona Phytone en 1.65 g/L (0.33x), en comparación con la concentración original del lote. Método: Para inocular el reactor, se descongeló un frasco y se expandió siguiendo la descripción del proceso de siembra ABT-874. Después de crecer en el reactor, éste fue drenado hasta 4.06 litros (designación de la corrida B9013-ED2 y B9014-ED3, tal como se describe en la Tabla 13), para simular el proceso de poco llenado. El reactor después se llenó hasta 13 L con medio de producción regular (SR-286). Los reactores se operaron de conformidad con los siguientes parámetros: a) Agitación, 70 rpm D) Temperatura, 33°C c) pH 6.90 d) Oxígeno disuelto, 40% Tabla 13: Programa de Alimentación para ABT-874 Cantidades Alimentadas [g] Programa de Alimentación Programa de Alimentación Alternativa Diario Designación del Proceso Designación del Proceso B9013-ED2 B9014-ED3 PFCHO 25x Hidrolizados PFCHO 25x Hidrolizados 33x 33x 0-4 5 130 65 65 6 130 65 65 7 130 65 65 8 130 65 65 9 130 65 65 10 130 65 65 11 130 65 65 12 130 65 65 13 130 65 65 14-15 Resultados Los resultados que comparan los procesos de alimentación por lotes mejorados, se describen a continuación en las Tablas 14 y 15. Tabla 14: Resultados del proceso de alimentación por lotes Parámetro Control Experimento de Experimento de (Proceso Alimentación Alimentación 1000L) por Lotes por lotes Diario Temp. = 33°C Alternativo Temp. = 33°C Temp. = 33°C Densidad 3.79 5.39 4.15 Celular Máxima [106 células viables/mL] Duración hasta 14 a 76% 15 15 50% de viabilidad [Días] Productividad 71 83 82 Específica de las Células [pg/célula-d ía] Productividad 188 281 212 Volumétrica Hasta la Cosecha @ 50% de viabilidad [mg/L-día] Titulo @ 50% 2505 @ 76% 3995 3033 viable (mg/L] Tabla 15: Resultados del proceso de alimentación por lotes Resultado Control Experimento de Experimento de Proyectado (Proceso Alimentación Alimentación 1000L) por Lotes por lotes Diario Temp. = 33°C Alternativo Temp. = 33°C Temp. = 33°C Cosechas 21 20 20 Anuales [Permitiendo 3 días de recuperación] Rendimiento de 137 208 158 Producto Anual [Basándose en cosechas de 2600 L) [kg/año] Incremento del 100% 152% 115% Rendimiento Anual (control = 100%) EJEMPLO 3: Soluciones de Alimentación Combinadas Estables para Incrementar la Productividad Volumétrica del Cultivo Alimentado por Lotes Los siguientes ejemplos describen un nuevo enfoque para formular soluciones de alimentación altamente concentradas estables, que incluye dos hidrolizados, cuando menos un aminoácido diferente de glutamina, un azúcar y un medio base químicamente definido. Las soluciones de alimentación resultantes son comparables en el incremento de la producción volumétrica de líneas de células de mamífero productoras de proteínas recombinantes. Finalmente, se propuso un método acelerado para el desarrollo de procesos de alimentación por lotes, basado en el control de la retroalimentación de la concentración de glucosa. Materiales y Métodos Las alimentaciones combinadas contenían los hidrolizados Bacto TC yeastolate, (RM-216) (BD Difco 255771) y peptona phytone, (BD Difco 2922450) más glucosa, L-asparagina monohidratada (Sigma-Aldrich), una versión reducida de DMEM/F12 (el NaCI, las sales de fosfato, los indicadores de pH y otros componentes no esenciales, fueron removidos; Invitrogen 12500) o Ex-Cell PFCHO (A)-S1 (deficiente modificado) sin glutamina, sin NaHCO (JRH Biosciences 67411 -500L35470). Para la preparación de soluciones, se filtró agua utilizando un filtro Millipore Milli-Q PF, con un cartucho de filtración PMQ004D2. Los materiales se disolvieron en la masa especificada de agua, empleando un agitador magnético de laboratorio. Después de que se agregó cada componente, la disolución completa se verificó visualmente antes de que se incorporara el siguiente componente. Cuando fuera aplicable, se cuantificó la turbiedad con el uso de un turbidímetro portátil HACH 2100P (Hach Co. Loveland, CO). El umbral del ojo humano para detectar turbiedad es de aproximadamente 15 UTN (Unidades de Turbiedad Nefelométrica). Los experimentos en biorreactor se llevaron a cabo en biorreactores Applikon de 3 L, a un volumen de operación de 1.5 L, con control de pH, temperatura, agitación y oxígeno, mediante la aplicación de aire en cascada y un flujo de oxígeno. La cuenta de células se realizó con un aparato Cedex (Innovatis AG, Bielefeld, Alemania). La glucosa y lactato se determinaron utilizando un aparato YSI 2700 (YSI Inc., Yellow Springs, OH) y en algunos casos también se determinaron metabolitos adicionales con un aparato Nova Bioprofile 400 (Nova Biomedical Corp., Waltham, MA). La presión parcial de oxígeno (p02) al equilibrio, el bióxido de carbono (pC02) y el pH, se verificaron con un Analizador de Gases en Sangre ABL 5 (Radiometer A/S, Copenhagen, Bronshoj, Dinamarca). Ejemplo 3.1. Preparación de Alimentaciones Combinadas Estables Utilizando PFCHO como Medio Basal Una sola alimentación de alta concentración facilita la manufactura de cultivos celulares por alimentación por lote, debido que reduce el volumen y el número de adiciones requeridas. Sin embargo, esto es complicado a causa del hecho de que el polvo PFCHO debe ser disuelto a valores de pH por arriba de 9.00. Además, los hidrolizados son solubles bajo condiciones de pH neutro. Así pues, el tratar de simplemente mezclar, ambos componentes a valores de pH neutro o alto, producirá suspensiones de polvos (no disueltos). Como se reporta en la literatura científica, "las alimentaciones completamente optimizadas a menudo existen en forma de dos o más soluciones por separado que soportan más de un índice de introducción y pH de alimentación (por ejemplo, por razones de solubilidad)" [1]. Experimento de estabilidad de la alimentación combinada Se determinó que la adición de lo hidrolizados permitía que las concentraciones de PFCHO se mantuvieran estables por periodos más prolongados, tal como se describe en la siguiente tabla. Las cantidades de componentes de 20 g/kg de PFCHO, 7.5 g/kg de asparagina, 21 g/kg de glucosa, 22 g/kg de yeastolate, y 14 g/kg de phytone, se agregaron en orden a aproximadamente 700 g de agua y al final se agregó agua hasta alcanzar el peso final de 1 kg. Las soluciones se mezclaron y después se llevaron al pH objetivo con HCI 2.0N. En la siguiente tabla, la turbiedad se determinó por observación visual a simple vista. Tabla 16. Efecto del pH final sobre diferentes formulaciones de alimentación combinada Formulación pH final de la solución 6.75 7.00 7.25 7.50 7.75 1 PFCHO, N/A N/A N/A Precipitaron por asparagina completo antes de 4 y glucosa horas disueltas a pH 10.0 Las mismas N/A N/A PH N/A N/A que en el final (1) a pH de 7.3 7.75, después agregar Phytone y yeastolate 3 Mismas que Ligera turbiedad en un periodo de 30-60 min.; y en (2), aún así, la solución permanece estable después pH a 6.75, 7.00, 7.25 7.50, 7.75 Como se observa en la Tabla 16, las menos turbias fueron 2) y 3), pH 6.75 y 7.25. Nótese que ambas formulaciones 2) y 3) no se tornaron turbias incluso después de casi 24 horas. Basándose en estos resultados, fue claro que los hidrolizados estabilizan al PFCHO en solución, ya que se logró una baja turbiedad. Dado que los hidrolizados estabilizan la mezcla resultante, se pudieron agregar phytone y yeastolate a la solución de PFCHO, a pH 10.0; después toda la mezcla se llevó al pH objetivo. Este orden de adición elimina la etapa inestable de mantener la solución de PFCHO a valores de pH menores de 8.0, particularmente vulnerable cuando se mezclan volúmenes mayores.
Para probar la hipótesis anterior, se probó este nuevo orden de adición con una formulación que contenía 20 y 7.5 g/kg de PFCHO y asparagina, respectivamente. La solución resultante, X-1, se dividió y se llevó a pH 7.0, 6.75, 6.5 y 6.25. Estas soluciones probaron ser estables, como puede observarse en la siguiente gráfica: Tabla 17. Perfiles de turbiedad (UTN) de la formulación X-1, a diferentes valores de pH Después de tres horas, la solución menos turbia fue a pH 6.50. La disminución aparente de turbiedad, en particular para pH 7.0, se debió a la sedimentación de algunas partículas minúsculas. Glucosa como estabilizante Se probó una formulación (véase la Tabla 18) con 200 g/kg de glucosa agregada como estabilizante. Tabla 18. Solución de alimentación D2E7 diluida H20MÍII¡Q 750.0 Hubo agua en exceso Glucosa 200.0 Como estabilizador potencial PFCHO 20.0 NaOH 10N ->pH 10.00 Asparagina 2.29 Yeastolate 15.7 Phytone 10.0 HCI 5N - pH 6.75-7.50 Esta solución probó ser estable por varias horas, para un rango de valores de pH, como se puede observar en la siguiente tabla: Tabla 19. Lecturas de turbiedad (UTN) de la alimentación combinada como función del tiempo y el pH Las soluciones de alimentación combinadas modificadas que comprendían glucosa, se utilizaron para expresar dos diferentes anticuerpos, es decir, adalimumab (D2E7) y el anticuerpo anti-IL-18 ABT-325. Combinación de soluciones alimentadas para la producción de D2E7 estable Si el volumen de la formulación agregada al biorreactor se basa en el componente menos concentrado (por ejemplo PFCHO), se necesitarían cantidades muy grandes de alimentación por ser agregadas para igualar lo que se ha evaluado individualmente. Por lo tanto, las concentraciones más altas fueron el siguiente paso en el desarrollo de una formulación de alimentación efectiva. Esta solución se denomina como la solución de alimentación combinada D2E7 y se describe en la siguiente tabla. Tabla 20. Solución de alimentación combinada D2E7 ->pH 10.00 ->pH 6.75 Se probaron formulaciones con 200, 150 y 100 g/kg de glucosa. Como se puede observar en la siguiente tabla, estas soluciones también tuvieron una turbiedad estable por varias horas. La Tabla 21 muestra que la adición de glucosa, redujo la turbiedad de la solución.
Tabla 21. Perfiles de tiempo de la turbiedad para la solución de alimentación combinada D2E7, como función de la concentración de glucosa Como se muestra en la Tabla 21, al incrementar el nivel de glucosa disminuyó la turbiedad de la solución. Estas diferentes formulaciones, basadas en sus niveles de turbiedad, se consideraron como aceptables para experimentos de filtración. Solución de alimentación combinada para la producción estable de ABT-325 Para obtener una alimentación combinada de ABT-325 estable, se prepararon 50 L de la formulación actual de conformidad con el método utilizado para la alimentación combinada D2E7, tal como se muestra en la Tabla 22.
Tabla 22. Solución de alimentación combinada ABT-325 g/kg - pH 10.00 - pH 6.75 Después de la preparación, la solución mantuvo un nivel de turbiedad de aproximadamente 20-30 UTN, tal como se puede observar en la siguiente tabla: Tabla 23. Turbiedad de la alimentación combinada ABT-325 Se prepararon 50 L de una solución de alimentación combinada de formulación ABT-325, de conformidad con el método de D2E7, para probar la escalabilidad y la aplicabilidad del método de preparación. Como se mostró anteriormente, la solución permaneció estable por cuatro horas. Debe observarse que el medio PF CHO referido en el ejemplo anterior, corresponde al PF CHO modificado (Parte A modificada), referido en el medio de cultivo celular del Ejemplo 1. EJEMPLO 3.2: Preparación de Alimentaciones Combinadas Estables Utilizando DMEM-F12 como Medio Basal Como se describió en el ejemplo anterior, fue posible preparar una solución de alimentación combinada estable con PFCHO y dos hidrolizados, así como glucosa. El siguiente ejemplo demuestra que esta metodología se puede aplicar a cualquier formulación de alimentación basal y produce una solución de alimentación combinada estable. El DMEM-F12, que es un medio de formulación disponible al público, se modificó para hacerlo compatible con la preparación de alimentación combinada, denominada en la presente como DMEM-F12m. Los siguientes componentes fueron removidos: NaCI, NaHC03, NaH2P04 H20, Na2HP04, D-Glucosa, HEPES, Na Hipoxantina, rojo de fenol, L-glutamina y timidina. Se prepararon soluciones de alimentación combinada que igualaran las formulaciones de alimentación D2E7 y ABT-325, de conformidad con la metodología descrita en los Ejemplos 3.0 y 3.1. Los componentes finales y la secuencia de la formulación, se muestran en la siguiente tabla: Tabla 24. Alimentaciones combinadas DMEM-F12 g/kg ?·?? 10.00 ?·?? 6.75 Una vez preparadas, ambas soluciones de alimentación I y II mantuvieron una turbiedad de 12 UTN o menor, por más de 4 horas. EJEMPLO 3.3: Crecimiento Celular y Mejora de Productividad Causadas por la Adición de Soluciones de Alimentación Combinadas Para evaluar el crecimiento y las características de promoción del título de las soluciones de alimentación combinadas anteriores, se utilizaron células ABT-874 (que expresan un anticuerpo lgG1 anti IL-12 completamente humano). Esta línea de células CHO normalmente se cultiva en el medio de cultivo celular SR-383 (2X con mtx 500 nM). Para estos experimentos, las células se hicieron pasar por DMEM/F 12 durante al menos 5 generaciones, hasta que se observara la adaptación mediante una velocidad de crecimiento constante. Los cultivos se agitaron en una placa de agitación Thermolyne, a 70 rpm en una incubadora a 35°C y 5% de C02. Inmediatamente antes de la inoculación, se tomó la cantidad requerida de suspensión celular del cultivo de mantenimiento. Las células se centrifugaron, el sobrenadante se desechó y las pellas se resuspendieron en medio recién preparado y previamente calentado, para obtener una densidad de siembra de 4x105/ml_. El cultivo celular se expandió en matraces para agitación hasta que se generara un volumen suficiente para la inoculación del biorreactor, hasta alcanzar una relación de división de 1:5 en biorreactores Applikon de 1.5 L. Las condiciones del reactor fueron pH 6.9, 35°C, 150 rpm y nivel de oxígeno disuelto al 40% de saturación. Todos lo experimentos del biorreactor se llevaron a cabo por duplicado. A las células se les dieron tres bolos de 1% del volumen inicial del reactor de alimentación combinada cada tercer día, durante el transcurso de una corrida. El uso de ambas soluciones de alimentación de combinación incrementa en gran medida el crecimiento del cultivo celular. Para el caso de CF I, se alcanzó el doble del pico de densidad celular, aunque el cultivo duró sólo 10 días, en comparación con 13 para el control. En el caso de CF II, el pico de densidad celular casi se triplicó en comparación con el control y el cultivo duró un tiempo similar. En términos del título final, se obtuvo un efecto más drástico. Los títulos para el medio DMEM/F12 fueron de aproximadamente 41 mg/L, vs. 188 para CF I y 434 para CF II. El efecto de diferentes soluciones de alimentación sobre la densidad celular máxima, la duración del cultivo, el título y la productividad específica, se resumen en la siguiente tabla: Tabla 25. Desempeño de las soluciones de alimentación combinadas DMEM-F12m EJEMPLO 3.4: Proceso de Cultivo Celular de Alto Título Mediante la Adición de Solución de Alimentación Combinada La obtención de títulos más altos hace que se necesiten menos corridas de manufactura para satisfacer un rendimiento total dado. El siguiente ejemplo describe un proceso a gran escala de alimentación por lotes para ABT-874, el cual rindió un título promedio de aproximadamente 4 g/L durante un proceso de alimentación por lotes. Adicionalmente, una mejoría adicional de los medios y de la solución de alimentación combinada, permitieron alcanzar títulos mayores de 6 g/L. Materiales y Métodos Como sistema modelo, se utilizó la línea de producción de anticuerpos ABT-874. Preparación de la solución de alimentación La solución de alimentación se preparó de conformidad con los procedimientos previamente descritos. Se utilizaron dos concentraciones de asparagina, es decir, 5.0 ó 7.5 g/kg. El método de preparación se muestra en la siguiente tabla: Tabla 26. Preparación de alimentación combinada ABT-874 Los componentes fueron pesados y agregados con el fin de alcanzar una masa final de 1 kg. Los materiales se disolvieron en la masa especificada de agua, utilizando un agitador magnético de laboratorio bajo agitación intensa. Hasta el paso 5, después de agregar cada componente, se verificó visualmente la disolución completa antes de incorporar el siguiente componente. Sin embargo, esto no fue posible en los pasos 6 y 7. Para estos dos pasos, la incorporación del polvo en la solución se consideró suficiente para proceder a la adición final de HCI. Selección del medio de proceso Con el fin de obtener datos de rendimiento de línea basal, se llevó a cabo un experimento con alimentación por lotes 3X (FB) 3000 L como control, el proceso prototipo 4X FB y condiciones no alimentadas (lote extendido: EB) 3X y 4X. En particular, se había sugerido que concentraciones de medio más altas creaban una fase lag inicial en el perfil de crecimiento del cultivo; sin embargo, no se observó ninguna fase lag significativa para los procesos de lote extendido (EB) 3X ó 4X. Como se esperaba, la suplementación alimentada produjo títulos más altos para ambos procesos 3X y 4X. No obstante, se observó una significativa supresión del crecimiento para el proceso 4X si era alimentado (es decir, alimentación por lotes). El análisis de aminoácidos de los experimentos a pequeña escala demostró que, incluso después de haber sido alimentados, todavía existía un agotamiento completo de los aminoácidos asparagina y glutamina. Por esta razón, el tiempo de alimentación total y la cantidad de asparagina en la alimentación combinada se incrementaron. En conclusión, se determinó que el proceso 4X FB tenía el potencial de alcanzar títulos finales más altos que los procesos EB o que el control 3X FB. Por lo tanto, éste fue elegido como punto de partida para continuar el desarrollo. Las diferencias entre los procesos de alimentación por lotes 3X (control) y 4X, se describen en la Tabla 27 y se describen más detalladamente a continuación. Densidad de células viables al inicio de la alimentación Se observó que al iniciar la alimentación a densidades celulares muy bajas, había una tendencia a suprimir el crecimiento celular y eventualmente el título final. Así pues, se esperaba que una alimentación excesivamente retrasada causara pérdida de productividad volumétrica debido a la inanición celular. Con el fin de investigar la hipótesis anterior, se llevaron a cabo varios experimentos para determinar el significado de la alimentación a diferentes densidades de células viables. Los resultados combinados de estos experimentos, se presentan en la gráfica que se describe en la Figura 1. Como puede observarse en la Figura 1, el título en el día 15 muestra una fuerte dependencia de la densidad de células viables en el día que inicia la alimentación. Un ajuste polinomial de tercer grado de los datos, muestra que el título máximo en el día 15 se puede esperar a una velocidad de alimentación de 3.5x106 células/mL. Reproducibilidad Las condiciones del proceso para el proceso 67 g/L se describen en la Tabla 27 y se definieron como inóculo a una partición de 1:4 de la corrida con poco llenado en SR-383, pH 7.0, DO = 30%, 37°C hasta una densidad celular de 5.0x106 células viables/mL. Las condiciones de funcionamiento del reactor fueron pH 7.9, T = 35°C, DO = 40%. La alimentación se inició cuando las células alcanzaron una densidad viable de 3.5x106 células/mL, durando 10 días, a través de adiciones en bolo de la solución de alimentación combinada que consistía del 1% del peso inicial del reactor, cada día.
Las condiciones del proceso para el proceso de 4 g/L, se describen a continuación en la Tabla 27. Tabla 27. Resultados más destacados del proceso de cultivo celular de 4 y 6 g/L de ABT-874 Ejemplo 3.5: alimentación por lotes utilizando la solución de alimentación combinada mediante el control de retroalimentación de glucosa El control de retroalimentación permite llegar a un punto establecido para un parámetro dado con un entendimiento muy limitado del comportamiento intrínseco del sistema. De esta manera, un punto dado se puede mantener independientemente de cualquier alteración que el sistema pudiera haber sufrido. Debido a la complejidad del metabolismo del cultivo de células de mamíferos, es una labor intensiva obtener modelos completos que pudieran permitir la predicción de la trayectoria de un cultivo dado. No obstante, es deseable desarrollar un método de muestreo, por ejemplo utilizando un muestreador automático, para ser capaz de suministrar glucosa con el fin de mantener un nivel de glucosa objetivo. Esto permite desacoplar el efecto de una concentración de glucosa dada (u de otros metabolitos) y también proporciona un mecanismo para estudiar el efecto que las diferentes relaciones de glucosa en la solución de alimentación combinada, tiene sobre diferentes cultivos. El desacoplamiento de los efectos se refiere al efecto de mantener una concentración dada de glucosa, versus el efecto de utilizar una cantidad diferente de glucosa en una solución de alimentación combinada. Materiales y Métodos Como sistema modelo, se utilizaron las líneas de producto de dos diferentes anticuerpos antí-IL-12, que fueron el ABT-784 y el 1D4.7. Se eligió un muestreo automatizado; es decir, el Analizador Bioprocess YSI 2700, como medio para monitorear la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular. El aparato de muestreo automatizado en línea se estableció uniendo un monitor YSI 2730 y el Accesorio de Control a un Analizador Bioprocess YSI 2700 (véase YSI Life Sciences; Yellow Spring, OH). Este aparato de muestreo consistía de una bomba que sostenía dos tubos. El primer tubo tenía dos ramificaciones, una que colectaba la muestra del biorreactor, y otra que bombeaba antiséptico para mantener la esterilidad. Una vez que se tomaba la muestra, se bombeaba hacia una cámara externa, a partir de la cual se tomaba la muestra para el análisis real. El segundo tubo a través de la bomba se utilizaba para colectar la descarga en un contenedor de desechos. Varios parámetros del accesorio de muestreo en línea, estaban controlados, tales como el intervalo de muestreo y el TPU (Error de Tiempo por Unidad, que corresponde al tiempo en que corre la bomba libre basándose en el desplazamiento medido desde un punto establecido). La bomba se conectó al YSI utilizando un conector de 15 agujas. La aguja que correspondía a la sonda de glucosa (Blanco-7, Negro-11) en el YSI, se conectó a la aguja de encendido/apagado TTL (8) en la bomba, y uno de las agujas de tierra del YSI (1-5) se conectó al chasis, del conector de 15 agujas para la bomba. La conexión se probó encendiendo la bomba y apagándola desde el menú de preparación del YSI. La tubería de la bomba utilizada fue CFLEX 082 de Masterflex. Tabla 28: Preparación del experimento inicial de retroalimentación Células ABT-874 Medios 3xPFCHO (SR-286) Glucosa alimentada 400 g/L TPU de YSI 16 Volumen del reactor probado 1.5 L Tiempo de Purga del YSI 60 seg. Velocidad de la bomba 50 (mitad, -16 rpm) Intervalo del Muestreo del YSI 4 h/2 h (se explica más adelante) Señal de Salida del YSI X2 (para YSI1-A25) Antiséptico NaOH 0.1N El reactor YSI1-A25 se controló a 4.9 g/L de glucosa. El control de glucosa a 4.9 g/L se inició aproximadamente el día 2, empleando un intervalo de muestreo de 4 horas hasta el día 8. En el día 8, el intervalo de muestreo se redujo a 2 horas, y el punto establecido en el aparato automatizado YSI se volvió a ajustar para borrar la memoria PID. Las fluctuaciones causadas por rebasar el punto establecido, se redujeron significativamente después del día 8. De aquí que, se estableció que un intervalo de muestreo de 2 horas era óptimo para estas condiciones. El rebase promedio del día 2 al 8 fue de 0.43 g/L, y el faltante promedio fue de 0.31 g/L, con un error de fluctuación de aproximadamente 8% del punto establecido. Por otro lado, el rebase promedio del día 8 al 13 fue de 0.08 g/L, y el faltante promedio fue de 0.09 g/L, con un error de fluctuación de aproximadamente 2%. Control de la concentración de glucosa utilizando la alimentación combinada El programa de alimentación de las soluciones de alimentación combinadas a un cultivo en un biorreactor, se definió mediante una aproximación empírica. Se probaron diferentes cantidades de alimentación, al igual que diferentes tiempos de alimentación, hasta que se encontrara un esquema de alimentación por lotes viable. De manera ideal, el programa de alimentación de una solución de alimentación combinada debe cumplir los requerimientos específicos para un cultivo dado. En vista de las consideraciones anteriores, fue ventajoso proporcionar la alimentación combinada basándose en las necesidades del cultivo celular, por ejemplo, utilizando glucosa como indicador de requerimientos nutricionales. De esta manera, se puede utilizar un sistema de control de retroalimentación para 1) probar diferentes soluciones de alimentación con concentraciones variables de glucosa, y 2) utilizar el perfil de alimentación generado para alimentar manualmente en el cultivo a gran escala. La siguiente tabla resume dos diferentes modos de operación del reactor, empleando una línea celular que produce el anticuerpo monoclonal 1D4.7. El experimento de referencia (referido como línea basal en la Tabla 29), ilustra el rendimiento de título típico de un proceso por lotes extendido en el medio SR-372, corriendo a pH 6.9, T = 35°C, DO = 40-5, en biorreactores Applikon de 1.5L. Los experimentos en YSI se llevaron a cabo bajo las mismas condiciones, más el control de retroalimentación, para suministrar las soluciones de alimentación combinada conteniendo 100, 150 ó 200 g/L de glucosa. Tala 29. Rendimiento de la alimentación combinada utilizando control de retroalimentación Como se puede observar en la Tabla 29, el sistema de retroalimentación utilizando una variedad de soluciones de alimentación combinada, mejoró en gran medida el título final del anticuerpo. Los perfiles de alimentación de los experimentos como el anterior, se obtuvieron pesando la cantidad de solución de alimentación combinada suministrada por día. Un perfil de alimentación típico se presenta en la siguiente tabla: Tabla 30: Perfil de alimentación típico generado a través del control de retroalimentación (perfil para el anticuerpo 1D4.7) El esquema anterior también se puede realizar para alimentar manualmente un reactor incluso sin un sistema de control de retroalimentación. De esta manera, el programa de alimentación se puede escalar. Resumen de los Resultados Los procesos de alimentación por lotes utilizando una mezcla de hidroiizados y un medio basal químicamente definido, se demostró que incrementan el título final de anticuerpos monoclonales secretados en cultivos de células de mamífero. Además, se demostró un método capaz de generar las siguientes alimentaciones combinadas estables: Tabla 31: Alimentaciones combinadas estables La alimentación combinada descrita en la Tabla 31 , se preparó iniciando con H2OM¡HÍQ (hasta 750 g). Como se indicó anteriormente, los ingredientes se agregaron al agua hasta un peso final (peso global de la alimentación combinada) de 1000 g. Adicionalmente, las soluciones de alimentación combinada se demostró que incrementaban la longevidad del cultivo celular, el pico de densidad de células viables, y la productividad específica. Se demostraron procesos de alimentación por lotes de cultivos celulares, utilizando soluciones de alimentación combinada capaces de alcanzar títulos de hasta 6 g/L del anticuerpo monoclonal secretado. Las soluciones de alimentación combinadas anteriores también se demostró que incrementan la densidad celular de los cultivos. Finalmente, también se demostró que un método que emplea un sistema de control de retroalimentación y diferentes soluciones de alimentación combinadas, es capaz de incrementar los títulos. Este enfoque se pudo utilizar para acelerar el desarrollo del proceso de cultivo celular, al generar rápidamente programas de alimentación. Referencias 1. Whitford, W.G., Feb-Batch Mammalian Cell Culture in Bioproduction. BíoProcess International, 2006. 30-40. 2. YSI Incorporated. (1998) YSI 2700 Select Biochemistry Analyzer User's Manual. 3. YSI Incorporated. (1998) YSI 2730 Monitor and Control Accessory User's Manual. 4. Watson Marlow Pumps. 101 F, 101U User's Manual. Ejemplo 4: Aplicación de Butirato de sodio y N-acetilcisteína para Incrementar la Productividad de una Línea de Células CHO Productora de anti-IL-18 La presente invención abarca un nuevo enfoque para incrementar la productividad de un anticuerpo, por ejemplo una línea de células CHO productora de un. anti-IL-18. Más específicamente, el siguiente ejemplo se refiere a un incremento del título final del anticuerpo, por ejemplo anti-IL-18, mediante la adición de sustancias químicas al medio de cultivo celular. A continuación se describen las mejorías en la viabilidad celular y en el título del anticuerpo, empleando un anticuerpo de ejemplo; es decir, el anticuerpo IL-18. Línea Celular y Medios de Cultivo El anticuerpo anti-IL-18 utilizado en el siguiente ejemplo, es un anticuerpo lgG1 completamente humano (Ab) contra IL-18. La línea de células CHO que expresa anti-IL-18, se cultivó en un medio de crecimiento, anteriormente descrito en la Tabla 4 del Ejemplo 1, SR-371. Los medios de producción para la línea celular también son como los anteriormente descritos en el Ejemplo 1, SR-372 (utilizado para el cultivo en matraces para agitación) y SR-372 (utilizado para el cultivo en biorreactores). Condiciones de Cultivo para Experimentos Llevados a Cabo en Matraces para Agitación Todos los experimentos en matraces para agitación se realizaron por duplicado. Los cultivos en matraz se agitaron en una placa de agitación Thermolyne a 80 rpm, en una incubadora a 35°C con 5% de C02. Inmediatamente antes de la inoculación, se tomó la cantidad requerida de suspensión celular del cultivo de mantenimiento. Las célula se centrifugaron, el sobrenadante se desechó y las pellas se resuspendieron en medio de cultivo recién preparado y previamente calentado, para obtener una densidad de siembra de 4 x 105 células/mL.
Ejemplo 4.1: Efecto del butirato de sodio sobre el crecimiento y productividad de una línea de células CHO productora de anti-IL- 18, cultivada en medio de crecimiento Para determinar el rango de concentración del butirato de sodio, el primer experimento se llevó a cabo en medio SR-371 conteniendo varias concentraciones de butirato de sodio. El experimento se llevó a cabo en matraces para agitación de 100 mL, con un volumen de trabajo de 70 mL. El butirato de sodio se agregó a partir de una solución concentrada 1M, que fue preparada disolviendo 1.101 g de butirato de sodio en 10 mL de agua MilliQ y se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0.2 µ??. La solución se almacenó a -20°C. Se agregó butirato de sodio al principio del cultivo (día 0), en concentraciones de 0 mM, 0.125 mM, 0.5 mM y 1 mM. La densidad y viabilidad celulares se determinaron con un contador celular automático (Cedex, Innovatis, Alemania) en este ejemplo y en todos los ejemplos siguientes. La Tabla 32 muestra la densidad de células viables con respecto al tiempo, y la Tabla 33 describe la viabilidad con respecto al tiempo. El experimento se llevó a cabo durante 12 días. Tabla 32: Densidad de Células Viables con respecto al Tiempo de Cultivo Densidad de Células Viables [105/mL] Día Matraz 1 : Matraz 2: Matraz 3: Matraz 4: Matraz 5: Matraz 6: Matraz 7: Matraz 8: Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato 1 0 mM 0 mM 0.125 0.125 0.5 mM 0.5 mM 1 mM mM mM mM o 3.2 3.85 4.46 3.01 3.66 3.98 3.83 3 36.38 33.18 27.12 29.96 16.97 11.71 7.68 5 84.48 70.37 62.56 66.1 21.79 9.77 3.25 7 65.98 64.19 59.15 68.65 17.72 5.41 1.04 10 7.83 11.17 8.63 11.85 4.53 6.93 0.8 12 1.36 2.28 3.68 3.81 2.08 1.89 0.22 Tabla 33: Viabilidad con respecto al Tiempo de Cultivo Viabilidad [%] Día Matraz 1 : Matraz 2: Matraz 3: Matraz 4: Matraz 5: Matraz 6: Matraz 7: Matr Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato Butir 0 mM 0 mM 0.125 0.125 0.5 mM 0.5 mM 1 mM mM mM mM 0 98.5 97.5 98.9 100 97.4 98.2 98.8 98.8 3 98.3 98.1 97.3 97.9 95 4 92.2 88.3 73.8 5 96.7 96.7 96 96.7 88.8 72.9 54 40.1 7 73.4 75.5 78.1 83.3 69 43.1 24.2 16.4 10 7.9 13.1 13.1 14.3 21 25.9 11.3 14.5 12 1.4 2.8 5.9 4.9 7.6 14.9 3.2 8.9 Claramente puede observarse que el butirato de sodio afectó el crecimiento y la viabilidad de la célula. Mientras que no hubo un efecto obvio sobre el crecimiento y viabilidad celular a una concentración de butirato de 0.125 mM, hubo un claro impacto sobre el crecimiento celular a 0.5 mM de butirato, causando una densidad celular máxima más baja. Con butirato de sodio 0.5 mM, la viabilidad se afectó después de 5 días de tiempo de cultivo. El butirato de sodio inhibió por completo el crecimiento celular a una concentración de 1 mM, y la viabilidad disminuyó continuamente del día 0 en adelante. La Tabla 34 muestra el título de anti-IL-18 con respecto al tiempo de cultivo. La concentración de anti-IL-18 se determinó mediante un ensayo de HPLC Poros A, en este ejemplo y en los ejemplos siguientes Tabla 34: Título de anti-IL-18 con respecto al tiempo de cultivo Titulo (mg/L] Día Matraz 1 : Matraz 2: Matraz 3: Matraz 4: Matraz 5: Matraz 6: Matraz 7: Matraz í Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato 0 mM 0 mM 0.125 0.125 0.5 mM 0.5 mM 1 mM mM mM mM 0 5.4 2.4 1.8 1.6 1.3 1.3 1.1 1.3 3 68.9 58.1 67.7 65.7 52.1 41.9 36.3 26.2 5 173.2 150.4 169.4 174.3 132.6 84.2 68.6 46.4 7 235.5 211.9 253.6 278.5 217.7 110.7 85 60.9 10 265.5 241.8 304.3 365.9 278.2 163.3 91.8 70.3 12 269.7 244.4 318.7 385.8 282.7 175.9 94 75.4 El título final promedio de los cultivos con butirato 0.125 mM, fue de 352 mg/L, el título final promedio del control no tratado fue de 257 mg/L. A esta concentración de butirato, el tratamiento produjo un incremento del 40% en el título final. Ejemplo 4.2: Efecto del butirato de sodio sobre el crecimiento y productividad de una línea de células CHO productoras de anti- IL-18 cultivadas en SR-372 La línea de células CHO que expresaban anti-IL-18, se adaptó a crecer en medio SR-372, con el fin de excluir cualquier efecto posible de la partición del cultivo de SR-37 a SR-372. Todos los experimentos con células adaptadas para crecer en medio SR-372, se llevaron a cabo en matraces para agitación de 250 ml_, con un volumen de trabajo de 180 ml_. Los cultivos se llevaron a cabo aplicando las condiciones anteriormente señaladas en la sección titulada "Condiciones de Cultivo para Experimentos Llevados a Cabo en Matraces para Agitación". Se diseño un experimento para agregar butirato cuando las células estuvieran en la fase de crecimiento exponencial media y tardía. La última adición de butirato, probablemente causará menos estrés a las células, y dará como resultado una mejoría en el crecimiento celular y un ICV más alto en comparación con la adición en el día 0, debido a que la concentración de butirato por célula es más baja (la integral de células viables (ICV), se define como la integral de la densidad de células viables versus el tiempo de cultivo). Se agregó butirato en el día 4 y día 5 en concentraciones de 0.5 mM y 2 mM. El experimento se llevó a cabo durante 12 días. La Tabla 4 muestra la densidad de células viables con respecto al tiempo de cultivo, la Tabla 5 muestra la viabilidad con respecto al tiempo de cultivo. Sólo el butirato de sodio 2 mM agregado en el día 4, dio como resultado una reducción de la viabilidad en comparación con el control, las otras condiciones no afectaron la viabilidad. Tabla 35: Densidad de células viables con respecto al tiempo de cultivo Densidad de Células Viables [105/mL] Día Matraz 1 : Matraz 2: Matraz 3: Matraz 4: Matraz 5: Matraz 6: Matraz 7: Matraz Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato Butirato Butirat 0 mM 0 mM 0.125 0.125 0.5 mM 0.5 mL 1 mM mM mM mM 0 2.35 3.37 3.08 2.61 2.27 2.41 3.2 2.27 3 14.51 15.79 12.79 13.69 14.04 9.42 11.41 11.36 4 28.88 20.91 18.88 26.11 25.48 16.09 18.78 23.15 5 28.58 32.17 36.01 33.03 27.82 21.98 30.76 35.8 6 61.91 54.31 45.2 43.08 37.02 34.28 47.82 55.66 7 56.23 51.59 40.09 36.19 33.34 27.21 42.97 52.03 10 43.06 51.89 29.2 23.33 14.07 13.05 29.58 28.61 12 24.8 33.38 19.38 14.32 9.66 8.22 18.25 16.18 Tabla 36: Viabilidad con respecto al tiempo de cultivo Viabilidad [%] Día Matraz 1 : Matraz 2 Matraz 3: Matraz Matraz 5: Matraz 6: Matraz 7: Matraz í Butirato Butirato Butirato 4: Butirato Butirato Butirato Butirato 0 mM 0 mM 0.125 mM Butirat 0.5 mM 0.5 mM 1 mM mM o 0.125 mM 0 98.4 94.6 92.7 99 95.2 94.9 98.8 97.7 3 96.6 97.2 98.8 99 97.2 98 97.8 97.8 4 97 98.5 99 98.6 98.5 98 98.9 97.8 5 96.6 97.7 97.5 97.3 98.6 97.9 98 97.2 6 96.5 96.4 98.2 98 93.6 92.4 95.3 96 7 95.6 95.7 93.8 92.9 87.8 87.5 94.2 94 10 62.6 69.4 61.9 53.9 40.8 39.2 63.7 56.9 12 38.3 46.2 40.4 33.6 24.5 25.2 36.7 32.7 La Tabla 37 muestra el título de anti-IL-18 con respecto al tiempo de cultivo. El butirato de sodio 2 mM agregado en el día 5, dio como resultado un incremento del 29% en comparación con el control (317 mg/L versus 245 mg/L, respectivamente). El crecimiento celular no se inhibió significativamente bajo estas condiciones (véase la Tabla 35). Tabla 37: Título de anti-IL-18 con respecto al tiempo de cultivo Ejemplo 4.3: Efecto del butirato de sodio sobre el crecimiento y productividad de una línea de células CHO productoras de anti- IL-18 cultivadas en medio SR-382, en una Biorreactor de 3 L El siguiente ejemplo demuestra el incremento del título final de anticuerpos anti-IL-18, mediante la aplicación de butirato de sodio al proceso B anti-IL-18 (véase la Sección 1.5), en biorreactores a gran escala; es decir, 3 L. Este proceso se desarrolló en biorreactores Applikon de 3L. El cultivo para siembra se llevó a cabo en medio SR-371 hasta la etapa de poco llenado (SR-372). La etapa de poco llenado se simuló en una bolsa Biowave de 20 L, con un volumen de trabajo de 10 L. El experimento para investigar el efecto del butirato de sodio sobre el crecimiento y productividad del proceso B anti-IL-18, se llevó a cabo en biorreactores Applikon de 3 L, con un volumen de trabajo de 1.5 L. Cada biorreactor se llenó con 1125 mL de medio SR-382 y se inoculó agregando 375 mL de suspensión celular proveniente de la bolsa Biowave conteniendo células que producían anti-IL-18 en medio SR-372. En el Ejemplo 4.2, el incremento del título se alcanzó al agregar butirato cuando las células estaban en la fase logarítmica media a tardía, lo cual fue el día 5 en matraces para agitación. Históricamente, la fase log media a tardía del proceso de producción anti-IL-18 en un biorreactor de 3 L, es en el día 7 de tiempo de cultivo. En este ejemplo, el día 7 se seleccionó para agregar butirato de sodio al cultivo, para asegurar que el butirato fuera agregado en la fase log media a tardía. Se preparó una solución concentrada de butirato de sodio a una concentración de 200 mM, en el día 7 inmediatamente antes de la adición al cultivo, disolviendo 4.404 g de butirato de sodio en 200 mL de agua MilliQ. Esta solución se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0.22 µ??. El experimento se llevó a cabo con 5 biorreactores. El proceso de cada biorreactor fue terminado cuando la viabilidad respectiva fuera más baja del 50%. Los biorreactores sirvieron como control (proceso B anti-IL-18). El butirato de sodio se agregó en el día 7 de tiempo de cultivo a los otros 3 biorreactores, en concentraciones de 0.3 mM, 1 mM y 3 mM, respectivamente. La Tabla 38 muestra la concentración de células viables con respecto al tiempo de cultivo, y la Tabla 39 muestra la viabilidad con respecto al tiempo de cultivo. Tabla 38: Densidad de células viables durante el tiempo de cultivo Tabla 39: Viabilidad con respecto al tiempo de cultivo 97.3 97.2 96.4 95.8 95.2 97.1 96.4 96.2 96.4 95.3 96.4 96.5 96.2 96.8 95.9 96.3 95.2 95.8 94.3 95.1 96.2 95.2 94.2 95.1 94.8 95.6 95.2 95.4 93.6 94.2 10 94.3 94.5 94.6 87.4 93.4 11 92.2 93.9 93.8 78.9 93 12 88.1 91.7 92.4 51.9 92 13 80.6 86.9 90.2 33.7 89.2 14 66.7 76.2 88.9 84.1 15 57 60.7 85.2 73.4 16 45.9 42.7 69.5 50.7 17 58.1 34.2 18 41 El cultivo de control creció más lento en el reactor 5 que en el replicado (reactor 2), debido a las altas concentraciones iniciales de C02 en el reactor 5. El reactor 2 fue terminado en el día 16 de tiempo de cultivo (históricamente observado en el proceso de producción de anti-IL-18), el reactor 5 fue terminado en el día 17. El butirato de sodio a una concentración de 3 mM (reactor 4), afectó el crecimiento y la viabilidad de las células. Dos días después de la adición del butirato, las células comenzaron a morir. El butirato a una concentración de 1 mM, no afectó el crecimiento ni la viabilidad celular (reactor 1), el reactor funcionó hasta ser terminado en el día 16. El crecimiento celular fue muy similar en el reactor 2, comparado con el control. El butirato a una concentración de 0.3 mM, prolongó el tiempo de cultivo 2 días (reactor 3). La Tabla 40 muestra el título de anti-IL-18 con respecto al tiempo de cultivo. Tabla 40: Título de anti-IL-18 con respecto al tiempo de cultivo El título final (día 16) del cultivo en el reactor 2 (representando un proceso B anti-IL-18), fue de 2325 g/L. El título final en el reactor 5 fue de 1589 g/L. Este título más bajo, posiblemente se debe al peor crecimiento celular causado por la alta concentración inicial de C02 en el medio de cultivo. El butirato a una concentración de 1 mM y 3 mM, agregado en el día 7, dio como resultado un título final más bajo que el control (reactor 2). El butirato a una concentración de 0.3 mM agregado en el día 7, dio como resultado un título de 2561 g/L en el día 17, lo cual es un incremento del 10% en comparación con el control. Este título fue el título más alto alcanzado en el proceso anti-IL-18. Ejemplo 4.4: Efecto de N-acetilcisteína (10 mM, 20 mM, 40 mM, 80 mWl) sobre el crecimiento y productividad de una línea de células CHO productora de anticuerpos anti-IL-18, cultivadas en medio SR-372 La N-acetilcisteína puede proteger a las células de mamífero de la muerte celular. Como antioxidante, puede reducir directamente las especies de oxígeno reactivo. Mediante la desacetilación , puede ser transformada en cisteína e incrementar los niveles de glutatión intracelulares. El glutatión puede recoger especies de oxígeno reactivo y sirve como sustrato en la reducción del peróxido de hidrógeno en agua. Este ejemplo demuestra el efecto de incrementar el título de anti-IL-18 de la N-acetilcisteína. Los experimentos se llevaron a cabo en matraces para agitación de 250 mL, con un volumen de trabajo de 180 mL. El medio de cultivo fue el SR-372. Antes del experimento, las células fueron preadaptadas para crecer en medio SR-372, tal como se describió en el Ejemplo 4.2. Las condiciones del cultivo en agitación se aplicaron de la manera anteriormente descrita, en la Sección "Condiciones de Cultivo para Experimentos Llevados a Cabo en Matraces para Agitación". Se preparó una solución concentrada de N-acetilcisteína 1M, disolviendo 16.32 g de N-acetilcisteína en 100 mL de agua MilliQ, en una placa con calentamiento y agitación. La solución concentrada se esterilizó por filtración, a través de un filtro de 0.22 µ??. Un día antes de iniciar el experimento, la N-acetilcisteína fue agregada al medio SR-372, hasta obtener concentraciones de 0 mM, 10 mM, 20 mM, 40 mM y 80 mM. El experimento inició mediante la centrifugación de las células a partir de un cultivo de mantenimiento de células CHO productoras de anti-IL-18, de la manera anteriormente descrita en la sección "Condiciones de Cultivo para Experimentos Llevados a Cabo en Matraces para Agitación". Cada cultivo en agitación fue terminado cuando la viabilidad respectiva fuera menor del 50%. El crecimiento celular no fue posible en concentraciones de N-acetilcisteína de 20 mM, 40 mM y 80 mM. Las Tablas 41 y 42 muestran la comparación de la densidad de células viables y la viabilidad, respectivamente, con respecto al tiempo de cultivo, con las células crecidas en N-acetilcisteína 0 mM y N-acetilcisteína 10 mM. Tabla 41: Densidad de células viables con respecto al tiempo de cultivo 7 34.26 31.00 12.36 12.00 8 17.49 17.68 24.20 22.42 9 25.34 21.54 20.14 19.48 10 17.49 17.68 24.20 22.42 11 10.75 13.84 25.02 26.00 12 27.44 27.56 13 25.77 27.86 14 22.77 24.17 15 18.40 19.22 16 14.60 16.30 Tabla 42: Viabilidad con respecto al tiempo de cultivo Viabilidad [%] Día Matraz 1 : Matraz 2: Matraz 3: Matraz 4: Sin N- Sin N- N-acetilcisteína N-acetilcisteína acetilcisteína acetilcisteína 10 mM 10 mM 0 97.4 96.9 96.2 95.3 3 98.8 98.6 57.2 52.1 4 99.0 98.8 61.9 62.2 5 98.7 98.5 69.5 72.1 6 95.4 92.8 76.0 73.5 7 87.8 84.0 81.5 80.9 8 73.3 69.6 85.5 82.7 9 64.9 60.8 82.7 86.5 52.5 49.0 82.5 86.9 11 38.6 38.1 81.7 87.2 12 79.2 83.1 13 74.8 78.9 14 67.2 68.7 15 56.7 56.9 16 49.3 47.2 El cultivo de control (sin N-acetilcisteína), fue terminado el día 11 del tiempo de cultivo, mientras que el cultivo con N-acetilcisteína 10 mM, se pudo prolongar hasta el día 16. Inicialmente, la N-acetilcisteína 10 mM afectó el crecimiento celular y la viabilidad, y causó una disminución en la viabilidad hasta el día 3. Después, la viabilidad comenzó a incrementar. La densidad celular máxima de los cultivos crecidos en N-acetilcisteína 10 mM, fue menor en comparación con el control. La Tabla 43 demuestra el incremento del título final de anticuerpos anti-IL-18, por la N-acetilcisteína. Tabla 43: Título de anti-IL-18 con respecto al tiempo de cultivo Título [mg/L] Día Matraz 1 : Matraz 2: Matraz 3: Matraz 4: Sin N- Sin N- N-acetilcisteína N-acetilcisteína acetilcisteína acetilcisteína 10 mM 10 mM 4 102.0 94.9 23.9 21.9 5 130.5 122.4 35.3 32.5 6 168.5 154.3 60.6 55.9 7 190.4 171.8 84.2 78.0 8 216.4 194.3 125.3 119.3 9 233.0 206.9 156.6 153.1 10 243.2 216.4 185.9 187.7 11 258.6 227.8 224.1 230.9 12 264.1 272.6 13 300.2 311.2 14 334.0 314.6 15 393.0 384.4 16 414.6 42 .4 El titulo final promedio de los cultivos de control fue de 243.2 mg/L, el título final promedio de los cultivos que crecieron en N-acetilcisteína 10 mM, fue de 418 mg/L. Este fue un incremento del 72% en comparación con el control. Ejemplo 4.5: Efecto de la N-acetilcisteína (1 mM, 2 mM, 4 mM, 8 mM) sobre el crecimiento y productividad de una línea de células CHO productora de anticuerpos anti-IL-18, cultivadas en medio SR-372 Como se describió en el Ejemplo 4.4, la N-acetilcisteína a una concentración de 10 mM, agregada en el día 0, pudo prolongar el tiempo de cultivo y causó un incremento en el título final. Sin embargo, a esta concentración, la viabilidad celular inicialmente disminuyó. Basándose en los resultados del Ejemplo 4.4, se diseñó un experimento utilizando una décima de las concentraciones de N-acetilcisteína probadas en el Ejemplo 4.4. Las condiciones para este experimento en matraces para agitación, fueron las mismas que en Ejemplo 4.4. Se agregó N-acetilcisteína en concentraciones de 0 mM (control), 1 mM, 2 mM, 4 mM y 8 mM. La Tabla 44 muestra la densidad de células viables con respecto al tiempo de cultivo, y la Tabla 45 muestra la viabilidad con respecto al tiempo de cultivo.
Tabla 44: Densidad de células viables con respecto al tiempo de cultivo Día Matraz 6: Matraz 7: Matraz 8: Matraz 9: Matraz 10: N-acetilcisteína ¡ N-acetilcisteína N-acetilcisteína N-acetilcisteína N-acetílcisteína 2 mM 4 mM 4 mM 8 mM 8 mM 0 2.96 3 13 2.80 2.97 3.54 3 19.03 17.39 16.39 11.24 10.17 4 28.40 24.80 23.71 14.47 13.88 5 34 21 | 28 06 26.92 20.68 18.64 6 37.05 | 30 62 29.54 25.59 23.13 7 32.55 30 66 26 94 28.22 26.12 8 28.99 I 24 75 23.84 30.00 30.77 9 27.75 22 25 21.71 27.45 28.63 10 23 05 20.06 19.67 27.14 27.90 11 20 75 16.79 16.70 26.42 29.60 12 26.39 25.62 13 21.46 22.29 14 30.47 32.41 Tabla 45: Viabilidad con respecto al tiempo de cultivo Oía Matraz 6: Matraz 7: Matraz 8: Matraz 9: Matraz 10: N-acetilcisteína N-acetilcisteína N-acetilcisteina N-acetilcisteína N-acetilcistelna 2 mM 4 mM 4 mM 8 mM 8 mM 0 93.8 94.9 91.7 92.1 93.6 3 97.5 97.1 98.4 96.4 94.3 4 98.2 97.4 97.6 96.4 94.4 5 97.1 97.1 96.9 96.5 94.4 6 93.0 92.4 93.1 95.8 92.0 7 86.1 84.5 85.0 93.4 89.6 8 71.9 68.4 70.6 85.6 84.7 9 65.2 58.5 60.3 79.7 79.5 10 54.9 52.0 55.0 76.3 75.0 11 45.1 42.5 45.7 68.4 69.0 12 61.3 61.2 13 51.1 52.2 14 39.4 42.6 Los cultivos de control (N-acetilcisteína 0 mM) fueron terminados después de 10 días de tiempo de cultivo. La N-acetilcisteína pudo prolongar la longevidad del cultivo. Los cultivos crecidos en N-acetilcisteína 8 mM, fueron terminados después de 14 días de cultivo. Los cultivos crecidos en N-acetilcisteína tuvieron una densidad celular máxima más baja, en comparación con el control. La Tabla 46 muestra el efecto de la N-acetilcisteína sobre el título final de anticuerpos anti-IL-18. Tabla 46: Título de anticuerpos anti-IL-18 con respecto al tiempo de cultivo Titulo [mg/L] Día Matraz 1: Matraz 2: Matraz 3: Matraz 4: Matraz 5: N-acetilcisteina N-acetilcisteina N-acetilcisteina N-acetilcisteina N-acetilcisteina 0 mM 0 mM 1 mM 1 mM 2 mM 7 193.1 168.3 210.1 202.5 198.0 8 230.3 199.9 241.6 232.2 227.5 9 244.7 216 2 256.6 245.4 242.0 10 262.7 227.2 268.9 258.3 253.2 11 268.3 12 13 14 Día Matraz 6: Matraz 7: Matraz 8: Matraz 9: Matraz 10: N-acetilcisteina N-acetilcisteina N-acetilcisteina N-acetilcisteina N-acetilcisteina 2 mM 4 mM 4 mM 8 mM 8 mM 7 274.0 210.9 202.0 181.9 175.1 8 323.9 251.6 240.2 237.6 232.2 9 374.7 271.7 259.3 267.7 263.9 10 428.8 288.9 276.3 295.3 292.2 11 444.1 315.5 304.3 349.1 367.9 12 369.5 401.4 13 429.5 432.0 14 477.6 484.4 El título final promedio de anticuerpos anti-IL-18 de los cultivos de control, fue de 245 mg/L (muy similar a los 243 mg/L del Ejemplo 4.4). El título final de anticuerpos anti-IL-18 de los cultivos crecidos en N-acetilcisteína 8 mM, fue de 481 mg/L. Este es un incremento del 96% en comparación con el control. Equivalentes Los técnicos en la materia reconocerán, o serán capaces de comprobar utilizando no más que experimentos rutinarios, numerosos equivalentes de las modalidades específicas de la invención aquí descritas Tales equivalentes se pretende que queden abarcados por las siguientes reivindicaciones. El contenido de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas, que se citan a lo largo de la presente descripción, quedan incorporadas en la presente como referencia.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un medio de cultivo celular libre de suero que comprende una Parte A, una Parte B y una Parte C, en donde: a) la Parte A consiste esencialmente de un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, un amortiguador, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y el monosacárido glucosa; b) la Parte B consiste esencialmente de una fuente de fierro inorgánico; y c) la parte C comprende un factor de crecimiento recombinante; un amortiguador; un regulador de osmolaridad; una fuente de energía; y cuando menos dos diferentes hidrolizados de origen no animal. 2. El medio de cultivo celular de la reivindicación 1, en donde la Parte A además comprende iones de metales no ferrosos, vitaminas, o una combinación de los mismos. 3. El medio de cultivo celular de la reivindicación 1, en donde la fuente de fierro inorgánico de la Parte B, es citrato férrico. 4. El medio de cultivo celular de la reivindicación 3, que comprende aproximadamente 122.5 mg/L o 0.5 mM de concentración final de la solución de citrato férrico. 5. El medio de cultivo celular de la reivindicación 1, en donde el factor de crecimiento recombinante de la Parte C, se selecciona del grupo que consiste de insulina o un análogo recombinante, IGF-1, y una combinación de insulina e IGF-1. 6. El medio de cultivo celular de la reivindicación 5, que 5 comprende de aproximadamente 4 mg/L a 13 mg/L de insulina, o un análogo recombinante de la misma. 7. El medio de cultivo celular de la reivindicación 1, en donde el amortiguador que es excluido del medio basal modificado, es el amortiguador HEPES. 10 8. El medio de cultivo celular de la reivindicación 1, en donde el amortiguador de la Parte C comprende un amortiguador de fosfatos, HEPES, y bicarbonato de sodio. 9. El medio de cultivo celular de la reivindicación 8, que comprende aproximadamente 1.6 g/L de bicarbonato de sodio. 15 10. El medio de cultivo celular de la reivindicación 8, que comprende aproximadamente 1.8 g/L de HEPES. 11. El medio de cultivo celular de la reivindicación 8, en donde el amortiguador de fosfatos comprende de aproximadamente 0.01 a 0.5 g/L de fosfatos monobásico y dibásico de sodio. 20 12. El medio de cultivo celular de la reivindicación 1, en donde la Parte C además comprende asparagina, glutamina, o glutamina y asparagina. 13. El medio de cultivo celular de la reivindicación 1, en donde el regulador de osmolaridad de la Parte C, es NaCI. oc 14. El medio de cultivo celular de la reivindicación 13, que comprende de aproximadamente 1.0 a 6.5 g/L de NaCI. 15. El medio de cultivo celular de la reivindicación 1, en donde la fuente de energía de la Parte C es un monosacárido. 16. El medio de cultivo celular de la reivindicación 15, en donde el monosacárido se selecciona del grupo que consiste de glucosa, maltosa, mañosa, galactosa y fructosa. 17. El medio de cultivo celular de la reivindicación 16, en donde la glucosa es D-glucosa. 18. El medio de cultivo celular de la reivindicación 17, que comprende no más de aproximadamente 7.0 g/L de glucosa. 19. El medio de cultivo celular de la reivindicación 1, en donde al menos dos diferentes hidrolizados de origen no animal de la Parte C son un hidrolizado basado en plantas y un hidrolizado que no es de origen animal ni está basado en plantas. 20. El medio de cultivo celular de la reivindicación 19, en donde el hidrolizado basado en plantas es un hidrolizado basado en soya. 21. El medio de cultivo celular de la reivindicación 19, en donde el hidrolizado que no es de origen animal ni está basado en plantas, es un hidrolizado basado en levaduras. 22. El medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, que además comprende metotrexato. 23. El medio de cultivo celular de la reivindicación 22, que comprende metotrexato de aproximadamente 100 nM a 5000 nM. 24. El medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, que además comprende un protector celular o agente tensoactivo. 25. El medio de cultivo celular de la reivindicación 24, en donde el agente tensoactivo es metilcelulosa o un poliol plurónico. 5 26. El medio de cultivo celular de la reivindicación 25, en donde el poliol plurónico. 27. El medio de cultivo celular de la reivindicación 26, que comprende aproximadamente 1.0 g/L de Pluronic F-68. 28. El medio de cultivo celular de cualquiera de las •10 reivindicaciones 1 a 21, que además comprende L-glutamina. 29. El medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en donde el pH varía dentro del rango de 7.1 a 7.3. 30. El medio de cultivo celular de cualquiera de las 15 reivindicaciones 1 a 21, en donde la osmolaridad varía dentro del rango de 320 a 450 mOsm/kg. 31. Un método para producir una proteína, que comprende cultivar una célula de mamífero en el medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21. 20 32. El método de la reivindicación 31, en donde la célula de mamífero es una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO). 33. El método de la reivindicación 31 ó 32, en donde la proteína es un anticuerpo. 34. El método de la reivindicación 33, en donde el anticuerpo 25 se selecciona del grupo que consiste de anticuerpo anti-TNFa, anticuerpo anti-IL-12, anticuerpo anti-IL-18, y un anticuerpo contra el receptor de la EPO (EPO-R). 35. Un medio de cultivo celular libre de suero, que comprende: a) un medio basal; b) de aproximadamente 8 a 12 mL/kg o de 116 a 126 mg/L de citrato férrico; c) de aproximadamente 2 a 6 mg/kg de insulina humana recombinante; d) de aproximadamente 2 a 5 g/kg de glucosa anhidra; e) de aproximadamente 0.1 a 0.5 g/kg de L-glutamina; f) de aproximadamente 1 a 3 g/kg de bicarbonato de sodio; g) de aproximadamente 0.01 a 0.05 g/kg de NaH2P04 H20; h) de aproximadamente 0.4 a 0.5 g/kg de Na2HP04-7H20; y i) de aproximadamente 1.0 a 3.0 g/kg de hidrolizado basado en levaduras. 36. El medio de cultivo celular de la reivindicación 35, que comprende: a) un medio basal; b) aproximadamente 10.0 mL/kg o 122 mg/L de citrato férrico; c) aproximadamente 4.0 mg/kg de insulina humana recombinante; d) aproximadamente 3.5 g/kg de glucosa anhidra; e) de aproximadamente 0.29 g/kg de L-glutamina; f) aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; g) aproximadamente 0.03 g/kg de NaH2P04-H20; h) de aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04-7H20; y i) aproximadamente 2.0 g/kg de hidrolizado basado en levaduras. 37. El medio de cultivo celular de la reivindicación 35 ó 36, que además comprende aproximadamente 2.50 mg/kg de metotrexato. 38. Un método para producir una proteína, que comprende: a) cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica para la proteína, en el medio de cultivo de la reivindicación 35 ó 36; y b) transferir el cultivo del inciso (a) a un medio de producción de cultivo celular, de tal modo que se produzca la proteína. 39. El método de la reivindicación 38, que además comprende aislar la proteína del medio de producción de cultivo celular. 40. El método de la reivindicación 38, en donde la proteína es un anticuerpo. 41. El método de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo es D2E7 (adalimumab). 42. Un medio de producción de cultivo celular libre de suero, que comprende: a) un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, un amortiguador, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y el monosacárido glucosa; b) de aproximadamente 8 a 12 mg/kg ó 122.45 mg/L de citrato férrico; c) de aproximadamente 4 a 8 mL/kg o de 10 a 14 mg/kg de insulina humana recombinante; d) de aproximadamente 5 a 9 mg/kg de glucosa anhidra; e) de aproximadamente 0.5 a 0.7 g/kg de L-glutamina; f) de aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; g) de aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; h) de aproximadamente 2 a 3 g/kg de NaCI; i) de aproximadamente 0.5 a 2 g/kg de Pluronic F-68; j) de aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P0 H20; k) de aproximadamente 0.4 a 0.5 g/kg de Na2HP04-7H20; I) de aproximadamente 8 a 12 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y m) de aproximadamente 60 a 70 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 43. El medio de producción de cultivo celular de la reivindicación 42, en donde el medio de cultivo celular comprende: a) aproximadamente 10.0 mL/kg o 122.45 mg/L de citrato férrico; b) aproximadamente 6.0 mL/kg ó 12 mg/kg de insulina humana recombinante; c) aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; d) de aproximadamente 0.58 a aproximadamente 0.59 g/kg de L-glutamina; e) aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; f) aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; g) de aproximadamente 2.4 a 2.5 g/kg de NaCI; h) aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; i) de aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04 H20; j) de aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04-7H20; k) aproximadamente 10.7 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y I) de aproximadamente 6.9 a 7.0 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 44. El medio de producción de cultivo celular de la reivindicación 42 ó 43, que tiene un pH de aproximadamente 7.10 a 7.20. 45. El medio de producción de cultivo celular de la reivindicación 42 ó 43, que tiene una osmolaridad de aproximadamente 373 a 403 mOsm/kg. 46. Un medio de cultivo celular libre de suero, que comprende: a) un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, un amortiguador, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y el monosacárido glucosa; b) de aproximadamente 8 a 12 mL/kg o 122.45 mg/L de citrato férrico; c) de aproximadamente 3 a 5 mL/kg ó de 6 a 8 mg/kg de insulina humana recombinante; d) de aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; e) de aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de L-glutamina; f) de aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; g) de aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; h) de aproximadamente 2 a 3 g/kg de NaCI; i) de aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; j) de aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04 H20; k) de aproximadamente 0.4 a 0.5 g/kg de Na2HP04-7H20; I) de aproximadamente 0.4 a 0.5 g/kg de L-asparagina monohidratada; m) de aproximadamente 2 a 6 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y n) de aproximadamente 2 a 4 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 47. El medio de cultivo celular de la reivindicación 46, en donde el medio de cultivo celular comprende: a) aproximadamente 10.0 mL/kg o 122.45 mg/kg de citrato férrico, b) de aproximadamente 3.8 a 3.9 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina humana recombinante; c) aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; d) de aproximadamente 0.8 a 0.9 g/kg de L-glutamina; e) aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; f) aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; g) de aproximadamente 2.6 a 2.7 g/kg de NaCI; h) aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; i) de aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04 H20; j) de aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04-7H20; k) aproximadamente 0.45 g/kg de L-asparagina monohidratada; I) aproximadamente 4.0 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y m) aproximadamente 2.6 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 48. El medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 42 a 47, que además comprende aproximadamente 2.50 mL/kg de metotrexato. 49- Un método para producir una proteína, que comprende cultivar una célula de mamífero que comprende un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, en el medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 42 a 47. 50. El método de la reivindicación 49, en donde la célula de mamífero es una célula CHO. 51. El método de la reivindicación 49, en donde la proteína es un anticuerpo. 52. El método de la reivindicación 51, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-TNFa o un anticuerpo anti-EPO-R. 53. El método de la reivindicación 52, en donde el anticuerpo anti-TNFa es un anticuerpo anti-TNFa completamente humano. 54. El método de la reivindicación 53, en donde el anticuerpo anti-TNFa completamente humano es el D2E7 (adalimumab). 55. Un medio de cultivo celular libre de suero, que comprende: a) un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, un amortiguador, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y el monosacárido glucosa; b) de aproximadamente 8 a 10 mL/kg o de 120 a 130 mg/L de citrato férrico; c) de aproximadamente 3 a 5 mL/kg ó de 7.8 mg/kg de insulina humana recombinante; d) de aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; e) de aproximadamente 0.8 a 0.9 g/kg de L-glutamina; f) de aproximadamente 0.3 a 0.5 g/kg de L-asparagina monohidratada; g) de aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; h) de aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; i) de aproximadamente 2 a 3 g/kg de NaCI; j) de aproximadamente 0.5 a 2 g/kg de Pluronic F-68; k) de aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04 H20; I) de aproximadamente 0.1 a 1.0 g/kg de Na2HP04-7H20; m) de aproximadamente 2 a 6 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y n) de aproximadamente 2 a 4 g/kg de hidrolizado basado en plantas, medio de cultivo celular de la reivindicación 55, que aproximadamente 10.0 mL/kg o 122 mg/L de citrato férrico; de aproximadamente 3.8 a 3.9 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina humana recombinante; aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; de aproximadamente 0.87 a 0.88 g/kg de L- glutamina; aproximadamente 0.45 g/kg de L-asparagina monohidratada; aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; de aproximadamente 2.67 a 2.68 g/kg de NaCI; aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; de aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04 H20; de aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04-7H20; aproximadamente 4.0 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y aproximadamente 2.6 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 57. El medio de cultivo celular de la reivindicación 55 ó 56, que además comprende metotrexato. 58. Un medio de cultivo celular libre de suero, que comprende: a) medio de crecimiento celular basal; b) de aproximadamente 8 a 12 mL/kg o de 120 a 130 mg/L de citrato férrico; c) de aproximadamente 2 a 6 mg/kg de insulina humana recombinante; d) de aproximadamente 150 a 250 g/kg de glucosa anhidra; e) de aproximadamente 0.1 a 0.5 g/kg de L-glutamina; f) de aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; y g) de aproximadamente 5 a 15 g/kg de hidrolizado basado en levaduras. 59. El medio de cultivo celular de la reivindicación 58, que comprende: a) de aproximadamente 10 mL/kg o de 122.45 mg/L de citrato férrico; b) aproximadamente 4 mg/kg de insulina humana recombinante; c) aproximadamente 200 g/kg de glucosa anhidra; d) de aproximadamente 0.29 a 0.30 g/kg de L- glutamina; e) aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; y f) aproximadamente 11 g/kg de hidrolizado basado en levaduras. 60. El medio de cultivo celular de la reivindicación 58 ó 59, que además comprende metotrexato. 61. Un método para producir una proteína, que comprende cultivar una célula de mamífero que comprende un ácido nucleico que codifica para la proteína, en un medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 55 a 60. 62. El método de la reivindicación 61, en donde la proteína es un anticuerpo. 63. El método de la reivindicación 62, en donde la célula de mamífero es una célula CHO. 64. El método de la reivindicación 63, en donde el ácido nucleico codifica para un anticuerpo anti-IL-12 completamente humano. 65. El método de la reivindicación 64, en donde el anticuerpo anti-IL-12 completamente humano, es el ABT-874. 66. Un medio de cultivo celular libre de suero, que comprende. a) un medio de crecimiento celular basal; b) de aproximadamente 8 a 12 mL/kg o de 120 a 130 mg/L de citrato férrico; c) de aproximadamente 2 a 6 mg/kg de insulina humana recombinante; d) de aproximadamente 1 a 3 g/kg de glucosa anhidra; e) de aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina; f) de aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; y g) de aproximadamente 1 a 4 g/kg de hidrolizado basado en levaduras 67. El medio de cultivo celular de la reivindicación 66, que comprende: a) aproximadamente 10 mL/kg o 122.45 mg/L de citrato férrico; b) aproximadamente 4 mg/kg de insulina humana recombinante; c) aproximadamente 1.5 g/kg de glucosa anhidra; d) de aproximadamente 0.29 a 0.30 g/kg de L- glutamina; e) aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; y 0 aproximadamente 2 g/kg de hidrolizado basado en levaduras. 68. El medio de cultivo celular de la reivindicación 66 ó 67, que además comprende metotrexato. 69. El medio de cultivo celular de la reivindicación 66 ó 67, que tiene un pH de aproximadamente 7.10 a 7.30. 70. El medio de cultivo celular de la reivindicación 66 ó 67, que tiene una osmolaridad de aproximadamente 300 a 340 mOsm/kg. 71. El medio de cultivo celular de la reivindicación 66 ó 67, que comprende cuando menos 8 g/kg de hidrolizado basado en levaduras. 72. Un método para producir una proteína, que comprende cultivar una célula de mamífero que comprende un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, en el medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65. 73 El método de la reivindicación 72, en donde la proteína es un anticuerpo. 74. El método de la reivindicación 72, en donde la célula de mamífero es una célula CHO. 75. El método de la reivindicación 72, en donde el ácido nucleico codifica para un anticuerpo anti-IL-12 o un anticuerpo anti- EPO-R. 76. El método de la reivindicación 75, en donde el anticuerpo anti-IL-12 completamente humano, es el ABT-874. Un medio de cultivo celular, que comprende: a) un medio basal modificado que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, un amortiguador, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y el monosacárido glucosa; de aproximadamente 8 a 12 mL/kg o de 120 a 130 mg/L de citrato férrico; de aproximadamente 2.5 a 4.5 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina humana recombinante; de aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; de aproximadamente 0.5 a 1 g/kg de L-glutamina; de aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-asparagina monohidratada; de aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; de aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; de aproximadamente 1 a 4 g/kg de NaCI; de aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; de aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04 H20; de aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de Na2HP04-7H20; de aproximadamente 2 a 6 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y de aproximadamente 2 a 6 g/kg de hidrolizado basado en plantas, medio de cultivo celular de la reivindicación 77, que aproximadamente 10 mL/kg o 122.45 mg/L de citrato férrico; b) de aproximadamente 3.8 a 3.9 mL/kg ó 7.8 mg/kg de insulina humana recombinante; c) aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; d) de aproximadamente 0.87 a 0.88 g/kg de L- glutamina; e) aproximadamente 0.45 g/kg de L-asparagina monohidratada; f) aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; g) aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; h) aproximadamente 2.67 g/kg de NaCI; i) aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; j) de aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04 H20; k) de aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04-7H20; I) aproximadamente 4.0 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y m) aproximadamente 2.6 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 79. El medio de cultivo celular de la reivindicación 77 ó 78, que tiene un pH de aproximadamente 7.10 a 7.20. 80. El medio de cultivo celular de la reivindicación 77 ó 78, que tiene una osmolaridad de aproximadamente 373 a 403 mOsm/kg. 81. Un medio de producción cultivo celular, que comprende: un medio basal modificado, que fue modificado para remover los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, amortiguador HEPES, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y el monosacárido glucosa; de aproximadamente 8 a 12 mL/kg o de 120 a 130 mg/L de citrato férrico; de aproximadamente 4 a 8 mL/kg ó de 10 a 14 mg/kg de insulina humana recombinante; de aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; de aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina; de aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; de aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; de aproximadamente 1 a 3 g/kg de NaCI; de aproximadamente 0.5 a 2 g/kg de Pluronic F-68; de aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04 H20; de aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de Na2HP04-7H20; de aproximadamente 8 a 12 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y de aproximadamente 6 a 8 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 82. El medio de producción cultivo celular de la reivindicación 81 , que comprende: a) aproximadamente 10 mL/kg o 122.45 mg/L de citrato férrico; b) aproximadamente 6.0 mL/kg ó 12 mg/kg de insulina humana recombinante; c) aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; d) de aproximadamente 0.58 a 0.59 g/kg de L- glutamina; e) aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; f) aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; g) aproximadamente 2.45 g/kg de NaCI; h) aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; i) de aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04 H20; j) de aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04-7H20; k) aproximadamente 10.7 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y I) de aproximadamente 6.9 a 7.0 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 83. El medio de producción cultivo celular de la reivindicación 80 u 81, que tiene un pH de aproximadamente 7.10 a 7.20. 84. El medio de producción cultivo celular de la reivindicación 80 u 81, que tiene una osmolaridad de aproximadamente 373 a 403 mOsm/kg. 85. Un medio de producción de cultivo celular, que comprende: a) un medio basal modificado, que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, amortiguador, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y el monosacárido glucosa; b) de aproximadamente 8 a 12 mL/kg o de 110 a 130 mg/L de citrato férrico; c) de aproximadamente 4 a 8 mL/kg ó de 1 a 15 mg/kg de insulina humana recombinante; d) de aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; e) de aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina; f) de aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; g) de aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; h) de aproximadamente 1 a 3 g/kg de NaCI; i) de aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; j) de aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04 H20; k) aproximadamente 0.1 tol g/kg de Na2HP04-7H20; I) de aproximadamente 12 a 16 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y m) de aproximadamente 8 a 10 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 86 El medio de producción cultivo celular de la reivindicación que comprende: a) aproximadamente 10 mL/kg o de 122.45 mg/L de citrato férrico; b) aproximadamente 6.5 mL/kg ó 13 mg/kg de insulina humana recombinante; c) aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; d) de aproximadamente 0.58 a 0.59 g/kg de L- glutamina; e) aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; f) aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; g) aproximadamente 2.45 g/kg de NaCI; h) aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; i) de aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04 H20; j) de aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04-7H20; k) de aproximadamente 14.2 a 14.3 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y I) de aproximadamente 9.2 a 9.3 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 87. El medio de producción de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 81 a 86, que además comprende metotrexato. 88. Un método para producir un anticuerpo, que comprende cultivar una célula de mamífero que comprende un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, en un medio de producción de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 81 a 86. 89. El método de la reivindicación 88, en donde la céluta de mamífero es una célula CHO. 90. método de la reivindicación 88, en donde el ácido nucleico codifica para un anticuerpo anti-IL-18. 91. El medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 35, 36, 42, 43, 46, 47, 55, 56, 77, 78, 81, 82, 85, u 86, en donde el hidrolizado basado en plantas es un hidrolizado basado en soya. 92. Una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO) en el medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 1-30, 35-37, 42-48, 55-60, 66-71 y 81-87. 93. Un método de alimentación por lotes para producir una proteína, que comprende: a) cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica para la proteína, en un cultivo celular que comprende un medio producción de cultivo celular; y b) alimentar las células de mamífero agregando una solución de enriquecimiento de hidrolizado solución de enriquecimiento basal, al cultivo celular durante un período de tiempo; en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende cuando menos dos diferentes hidrolizados de origen no animal, de tal modo que se produzca una proteína. 94. El método de la reivindicación 93, en donde la solución de enriquecimiento basal comprende un medio basal concentrado. 95. El método de la reivindicación 93, en donde la solución de enriquecimiento basal comprende un medio basal, asparagina y glucosa. 96. El método de la reivindicación 94 ó 95, en donde el medio basal es PF CHO. 97. El método de cualquiera de las reivindicaciones 93 a 96, en donde la célula de mamífero es una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO). 98. El método de cualquiera de las reivindicaciones 93 a 96, en donde la proteína es un anticuerpo. 99. El método de la reivindicación 98, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos anti-TNF-a, anticuerpos anti-IL-12, anticuerpos anti-IL-18, y un anticuerpo contra el receptor de la EPO (EPO-R). 100. El método de cualquiera de las reivindicaciones 93 a 96, en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende un primer hidrolizado, que no se deriva de una planta ni de un animal, y un segundo hidrolizado basado en plantas. 101. El método de la reivindicación 100, en donde el hidrolizado que no se deriva de una planta ni de un animal, es un hidrolizado basado en levaduras. 102. El método de la reivindicación 101, en donde el hidrolizado basado en plantas es un hidrolizado basado en soya. 103. Un método de alimentación por lotes para producir un anticuerpo anti-TNF-a, que comprende: a) cultivar células de Ovario de Hámster Chivo (CHO) que comprenden un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo anti-TNF-a, en un medio de cultivo celular que comprende un medio de producción de cultivo celular; y b) alimentar las células CHO agregando una solución de enriquecimiento de hidrolizado y una solución de enriquecimiento basal, al cultivo celular durante un período de tiempo, en donde la solución de enriquecimiento basal comprende un medio basal, asparagina y glucosa, y en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende cuando menos dos diferentes hidrolizados de origen no animal, de tal modo que se produzca el anticuerpo anti-TNF-a. 104. Un método de alimentación por lotes o método de producción de un anticuerpo anti-TNF-a, que comprende: a) cultivar células CHO que comprenden un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo anti-TNF-a, en un cultivo celular que comprende un medio de producción de cultivo celular que comprende cuando menos 2.0 g/L de glucosa, en donde la concentración de glucosa es controlada agregando glucosa al medio de producción de cultivo celular, según sea requerido, para mantener una concentración de cuando menos 2.0 g/L de glucosa; y b) alimentar las células CHO agregando una solución de enriquecimiento de hidrolizado y una solución de enriquecimiento basal, al cultivo celular durante un período de tiempo, en donde la solución de enriquecimiento basal comprende un medio basal, asparagina y glucosa; y en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende cuando menos dos diferentes hidrolizados de origen no animal, de tal modo que se produzca el anticuerpo anti-TNF-a. 105. El método de la reivindicación 103 ó 104, que además comprende recuperar el anticuerpo anti-TNF-a. 106. El método de la reivindicación 103 ó 104, en donde el cultivo celular se cultiva a una temperatura que varía dentro del rango de aproximadamente 32 a 38°C. 107. El método de la reivindicación 106, en donde la temperatura de cultivo es de aproximadamente 35°C. 108. El método de la reivindicación 103 ó 104, en donde el medio de producción de cultivo celular es mantenido con una concentración entre 20 y 65% de oxígeno disuelto. 109. El método de la reivindicación 108, en donde el medio de producción de cultivo celular se mantiene a una concentración de aproximadamente 30% de oxígeno disuelto. 110. El método de la reivindicación 103 ó 104, en donde la osmolaridad del medio de producción de cultivo celular es mantenida a través del cultivo a no más de 500 mOsm. 111. El método de la reivindicación 103 ó 104, en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende un primer hidrolizado que no se deriva de una planta o un animal, y un segundo hidrolizado basado en plantas. 112. El método de la reivindicación 111, en donde el hidrolizado que no se deriva de una planta o un animal, y un hidrolizado basado en plantas, es un hidrolizado basado en levaduras. 113. El método de la reivindicación 112, en donde el hidrolizado basado en plantas, es un hidrolizado basado en soya. 114. El método de la reivindicación 103 ó 104, en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado consiste esencialmente de aproximadamente 50 a 280 g/kg de hidrolizado basado en soya y de aproximadamente 75 a 300 g/kg de un hidrolizado basado en levaduras. 115. El método de la reivindicación 103 ó 104, en donde el medio basal es PF CHO. 116. El método de la reivindicación 103 ó 104, en donde la solución de enriquecimiento basal tiene un pH de aproximadamente 9.0 a 10.5. 117. El método de cualquiera de las reivindicaciones 103 a 116, en donde el período de tiempo es de entre aproximadamente 9 a 15 días. 118. El método de la reivindicación 117, en donde el período de tiempo es de aproximadamente 12 días. 119. El método de cualquiera de las reivindicaciones 103 a 116, en donde la solución de enriquecimiento basal se agrega al medio de producción de cultivo celular, en al menos uno de los siguientes días del período de tiempo: Día 4, Día 6, Día 9 y Día 11. 120. El método de cualquiera de las reivindicaciones 103 a 116, en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado se agrega al medio de producción de cultivo celular en el Día4, Día 7 ó en el Día 4 y Día 7, del período de tiempo. 121. El método de cualquiera de las reivindicaciones 103 a 116, que además comprende ajustar el pH del medio de producción de cultivo celular, de acuerdo a una descendente lineal de pH, en donde la descendente lineal de pH comprende iniciar con un pH de aproximadamente 7.1 a 7.2 y terminar en un pH final de aproximadamente 6.9. 122. El método de la reivindicación 121, en donde la descendente lineal de pH se ajusta sobre un período de cuando menos aproximadamente 24 horas. 123. El método de la reivindicación 121, en donde la descendente lineal de pH se ajusta sobre un período de cuando menos aproximadamente 48 horas. 124. El método de la reivindicación 121, en donde la descendente lineal de pH se ajusta sobre un período de aproximadamente 72 horas. 125. El método de la reivindicación 103 ó 104, en donde el medio de producción de cultivo celular comprende: a) un medio basal modificado, que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, un amortiguador, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y el monosacárido glucosa; b) de aproximadamente 8 a 10 mL/kg o de 110 a 130 mg/L de citrato férrico; c) de aproximadamente 4 a 8 mL/kg ó de 10 a 14 mg/kg de insulina humana recombinante; d) de aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; e) de aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina; f) de aproximadamente 1 a 3 g/kg de bicarbonato de sodio; g) de aproximadamente 1 a 3 g/kg de HEPES; h) de aproximadamente 2 a 3 g/kg de NaCI; i) de aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; j) de aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04 H20; k) de aproximadamente 0.1 a 0.1 g/kg de Na2HP0 -7l-l20; m) de aproximadamente 8 a 12 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y n) de aproximadamente 6 a 8 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 126. El método de la reivindicación 125, en donde el medio de producción de cultivo celular comprende: a) aproximadamente 10.0 mL/kg o 122.45 mg/L de citrato férrico; b) aproximadamente 6.0 mL/kg ó 12 mg/kg de insulina humana recombinante; c) aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; d) de aproximadamente 0.58 a 0.59 g/kg de L- glutamina; e) aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; f) aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; g) aproximadamente 2.45 g/kg de NaCI; h) aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; i) de aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04 H20; j) de aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HPCy7H20; k) aproximadamente 10.7 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y I) de aproximadamente 6.9 a 7.0 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 127. El método de cualquiera de las reivindicaciones 103 a 126, en donde la célula de mamífero es una célula CHO. 128. El método de cualquiera de las reivindicaciones 103 a 126, en donde el cultivo celular es un cultivo celular a gran escala. 129. El método de la reivindicación 128, en donde el cultivo celular a gran escala es mayor que aproximadamente 10 L. 130. El método de la reivindicación 128, en donde el cultivo celular a gran escala es de 13 L. 131. El método de cualquiera de las reivindicaciones 103 a 126, en donde el anticuerpo anti-TNF-a es un anticuerpo anti-TNF-a completamente humano. 132. El método de la reivindicación 131, en donde el anticuerpo anti-TNF-a es adalimumab. 133. Un método de alimentación por lotes para producir un anticuerpo anti-IL-12, que comprende: a) cultivar células CHO que comprenden un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, en un cultivo celular que comprende un medio de producción de cultivo celular, b) alimentar las células CHO agregando una solución de enriquecimiento de hidrolizado y una solución de enriquecimiento basal, al cultivo celular durante un período de tiempo, en donde la solución de enriquecimiento basal comprende un medio basal, asparagina y glucosa; y en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende cuando menos dos diferentes hidrolizados de origen no animal, de tal modo que se produzca el anticuerpo anti-IL-12. 134. El método de la reivindicación 133, en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado además comprende glucosa. 135. El método de la reivindicación 133, que además comprende recuperar el anticuerpo anti-IL-12. 136. El método de la reivindicación 133, en donde el cultivo celular se cultiva a una temperatura que varía dentro del rango de aproximadamente 32 a 38°C. 137. El método de la reivindicación 133, en donde la temperatura de cultivo es de aproximadamente 33°C. 138. El método de la reivindicación 133, en donde el medio de producción de cultivo celular se mantiene a una concentración entre 20 y 65% de oxígeno disuelto. 139. El método de la reivindicación 138, en donde el medio de producción de cultivo celular se mantiene a aproximadamente 40% de oxígeno disuelto. 140. El método de la reivindicación 133, en donde el medio de producción de cultivo celular tiene un pH de aproximadamente 6.7 a 7.2. 141. El método de la reivindicación 133, en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado comprende un hidrolizado que no se deriva de una planta o un animal, y un hidrolizado basado en plantas. 142. El método de la reivindicación 141, en donde el hidrolizado que no se deriva de una planta o un animal, es un hidrolizado basado en levaduras. 143. El método de la reivindicación 142, en donde el hidrolizado basado en plantas es un hidrolizado basado en soya. 144. El método de la reivindicación 133, en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado consiste esencialmente de aproximadamente 50 a 225 g/kg de un hidrolizado basado en soya, de aproximadamente 75 a 300 g/kg de un hidrolizado basado en levaduras, y de aproximadamente 2 a 3 g/L de glucosa. 145. El método de la reivindicación 133, en donde la solución de enriquecimiento basal comprende un medio basal, asparagina y glucosa. 146. El método de la reivindicación 145, en donde la solución de enriquecimiento basal tiene un pH de aproximadamente 9.7 y una osmolaridad de aproximadamente 1400 a 1500 mOsm. 147. El método de la reivindicación 145, en donde el medio basal en la solución de enriquecimiento basal, es PF CHO. 148. El método de cualquiera de las reivindicaciones 133 a 147, en donde el período de tiempo es de entre 14 y 15 días. 149. El método de cualquiera de las reivindicaciones 133 a 147, en donde la solución de enriquecimiento basal se agrega al medio de producción de cultivo celular, cada tercer día, empezando en el Día 5 del período de tiempo. 150. El método de cualquiera de las reivindicaciones 133 a 147, en donde la solución de enriquecimiento de hidrolizado se agrega al medio de producción de cultivo celular, todos los días, empezando en el Día 6 del período de tiempo. 151. El método de cualquiera de las reivindicaciones 133 a 147, en donde la solución de enriquecimiento basal y la solución de enriquecimiento de hidrolizado, se agregan al medio de producción de cultivo celular, todos los días, empezando en el Día 5 del período de tiempo. 152. El método de cualquiera de las reivindicaciones 133 a 147, en donde el medio de producción de cultivo celular comprende: a) un medio basal modificado, que excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, un amortiguador, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, y el monosacárido glucosa; b) de aproximadamente 8 a 12 mL/kg o de 110 a 130 mg/L de citrato férrico; c) de aproximadamente 5 a 8 mL/kg ó de 11 a 15 mg/kg de insulina humana recombinante; d) de aproximadamente 5 a 9 g/kg de glucosa anhidra; e) de aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de L-glutamina; f) de aproximadamente 1 a 2 g/kg de bicarbonato de sodio; g) de aproximadamente 1 a 2 g/kg de HEPES; h) de aproximadamente 2 a 3 g/kg de NaCI; i) de aproximadamente 0.1 a 2 g/kg de Pluronic F-68; j) de aproximadamente 0.01 a 0.1 g/kg de NaH2P04 H20; k) de aproximadamente 0.1 a 1 g/kg de Na2HP04-7H20; m) de aproximadamente 6 a 12 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y n) de aproximadamente 6 a 8 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 153. El método de la reivindicación 152, en donde el medio de producción de cultivo celular comprende: a) aproximadamente 10 mL/kg o 122.45 mg/L de citrato férrico; b) aproximadamente 6.5 mL/kg ó 13 mg/kg de insulina humana recombinante; c) aproximadamente 7.0 g/kg de glucosa anhidra; d) de aproximadamente 0.58 a 0.59 g/kg de L- glutamina; e) aproximadamente 1.6 g/kg de bicarbonato de sodio; f) aproximadamente 1.8 g/kg de HEPES; g) aproximadamente 2.45 g/kg de NaCI; h) aproximadamente 1.0 g/kg de Pluronic F-68; i) de aproximadamente 0.03 a 0.04 g/kg de NaH2P04 H20; j) de aproximadamente 0.43 a 0.44 g/kg de Na2HP04-7H20; k) aproximadamente 10.7 g/kg de hidrolizado basado en levaduras; y I) de aproximadamente 6.9 a 7.0 g/kg de hidrolizado basado en plantas. 154. El método de cualquiera de las reivindicaciones 133 a 153, en donde el cultivo celular es un cultivo celular a gran escala. 155. El método de la reivindicación 154, en donde el cultivo celular a gran escala es mayor que 10 L. 156. El método de la reivindicación 154, en donde el cultivo celular a gran escala es de aproximadamente 13 L. 157. El método de cualquiera de las reivindicaciones 133 a 156, en donde el anticuerpo anti-IL-12 es un anticuerpo anti-IL-12 completamente humano. 158. El método de la reivindicación 157, en donde el anticuerpo anti-IL-12 completamente humano, es el ABT-874. 159. Una solución de alimentación combinada, que comprende: a) glucosa; b) un medio basal; c) un aminoácido diferente de glutamina; y d) cuando menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal; en donde la solución de alimentación tiene un pH de aproximadamente 6.0 a 8.0. 160. La solución de alimentación combinada de la reivindicación 159, que comprende de aproximadamente 100 a 250 g/kg de glucosa. 161. La solución de alimentación combinada de la reivindicación 159, en donde el aminoácido es asparagina. 162. La solución de alimentación combinada de la reivindicación 160, que comprende de aproximadamente 1.0 a 15.0 g de asparagina. 163. La solución de alimentación combinada de la reivindicación 161, que comprende de aproximadamente 3.0 a 5.0 g/kg de asparagina. 164. La solución de alimentación combinada de la reivindicación 159, en donde en los cuando menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal, hay un hidrolizado basado en plantas y un hidrolizado que no es de origen animal ni se basa en plantas. 165. La solución de alimentación combinada de la reivindicación 164, en donde el hidrolizado que no es de origen animal ni se basa en plantas, es un hidrolizado basado en levaduras. 166. La solución de alimentación combinada de la reivindicación 164, en donde el hidrolizado basado en plantas es un hidrolizado basado en soya. 167. La solución de alimentación combinada de la reivindicación 159, en donde el medio basal es PF CHO o medio DMEM/F12. 168. La solución de alimentación combinada de la reivindicación 159, en donde el medio celular basal es un medio basal modificado y excluye los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, un amortiguador, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, un regulador de osmolaridad, un agente tensoactivo, glutamina y glucosa. 169. La solución de alimentación combinada de cualquiera de las reivindicaciones 159 a 168, que además tiene una turbiedad menor de aproximadamente 15 UTN. 170. Un método para mantener una concentración de glucosa constante en un medio de producción de cultivo celular, que comprende agregar la solución de alimentación combinada de cualquiera de las reivindicaciones 159 a 168. 171. Un método para preparar una solución de alimentación combinada que comprende un medio basal, glucosa y cuando menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal, comprendiendo dicho método: a) combinar glucosa y el medio celular basal en una solución; b) ajustar el pH de la solución del inciso (a), a un valor de aproximadamente 9.5 a 10.5; c) agregar los cuando menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal a la solución del inciso (b); y d) ajustar el pH de la solución del inciso (c), de tal modo que la solución de alimentación combinada tenga un pH de aproximadamente 6.5 a 7.5. 172. El método de la reivindicación 171, en donde el paso del inciso (c) comprende agregar un primer hidrolizado, que no es de origen animal ni se basa en plantas, y un segundo hidrolizado basado en plantas. 173. El método de la reivindicación 172, en donde el hidrolizado que no es de origen animal ni se basa en plantas, es un hidrolizado basado en levaduras. 174. El método de la reivindicación 172, en donde el hidrolizado basado en plantas es un hidrolizado basado en soya. 175. Un método para producir cuando menos aproximadamente 1.5 g/l de un anticuerpo, a partir de un cultivo de células de mamífero que comprende: a) cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, en un medio de producción de cultivo celular; y b) agregar una solución de alimentación combinada que tiene un pH de aproximadamente 6.7 a 7.2 al medio de producción de cultivo celular, en donde la solución de alimentación combinada comprende glucosa; un medio celular basal; un aminoácido diferente de glutamina; y cuando menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal de tal modo que se produzca cuando menos aproximadamente 1.5 g/L del anticuerpo. 176. El método de la reivindicación 175, en donde la solución de alimentación combinada comprende de aproximadamente 100 a 250 g/kg glucosa. 177. El método de la reivindicación 175, en donde se producen cuando menos 2 g/L del anticuerpo. 178. El método de la reivindicación 175, en donde se producen cuando menos 4 g/L del anticuerpo. 179. El método de la reivindicación 175, en donde se producen cuando menos 5 g/L del anticuerpo. 180. El método de la reivindicación 175, en donde se producen aproximadamente 6 g/L del anticuerpo. 181. Un método para incrementar el título de un anticuerpo producido a partir de un cultivo de células de mamífero, que comprende: a) cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, en un medio de producción de cultivo celular; y b) agregar una solución de alimentación combinada que tenga un pH de aproximadamente 6.7 a 7.2 al medio de producción de cultivo celular, en donde la solución de alimentación combinada comprende glucosa; un medio celular basal; un aminoácido diferente de glutamina; y cuando menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal, de tal modo que el título del anticuerpo producido sea cuando menos 50% mayor que el de un cultivo de células de mamífero control que se cultiva de conformidad con el paso del inciso (a) y se excluye el paso del inciso (b). 182. El método de la reivindicación 181, en donde el título del anticuerpo producido es cuando menos 100% mayor que el del control. 183. El método de la reivindicación 181, en donde el título del anticuerpo producido es cuando menos 150% mayor que el del control. 184. El método de cualquiera de las reivindicaciones 175 a 183, en donde la solución de alimentación combinada se agrega cuando la densidad celular alcanza un valor de cuando menos 2.0x106 células/mL. 185. El método de cualquiera de las reivindicaciones 175 a 183, en donde la solución de alimentación combinada se agrega cuando la densidad celular alcanza un valor de aproximadamente 3.5x106 células/mL. 186. Un método para producir una proteína en un cultivo de células de mamífero, que comprende: a) cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica para la proteína, en un medio de producción de cultivo celular; y b) agregar una solución de alimentación combinada al medio de producción de cultivo celular, utilizando un sistema de control de retroalimentación para monitorear un nivel indicador metabólico en el medio de producción de cultivo celular, en donde la solución de alimentación combinada se agrega al medio de producción de cultivo celular en un punto de tiempo determinado por el sistema de control de retroalimentación, de tal modo que se produzca el anticuerpo. 187. El método de la reivindicación 186, en donde la célula de mamífero es una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO). 188. El método de la reivindicación 186 ó 187, en donde el indicador metabólico es glucosa o glutamina. 189. El método de la reivindicación 186 ó 187, en donde la solución de alimentación es una solución de alimentación combinada que comprende glucosa; un medio celular basal; un aminoácido diferente de glutamina; y cuando menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal. 190. El método de la reivindicación 186 ó 187, en donde la proteína es un anticuerpo. 191. El método de la reivindicación 190, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo anti-TNF-a, un anticuerpo anti-IL-12, un anticuerpo anti-IL-18, y un anticuerpo contra el receptor de EPO (EPO-R). 192. El método de la reivindicación 190 ó 191, en donde el anticuerpo se produce a un título de cuando menos 1.5 g/L. 193. El método de la reivindicación 190 ó 191, en donde el anticuerpo se produce a un título de cuando menos 2 g/L. 194. El método de cualquiera de las reivindicaciones 175 a 185 y 189, en donde la solución de alimentación combinada comprende de aproximadamente 3.0 a 12.5 g/kg de asparagina. 195. El método de cualquiera de las reivindicaciones 175-185 y 189, en donde los cuando menos dos diferentes hidrolizados que no son de origen animal, comprenden un hidroiizado basado en plantas y un hidroiizado que no es de origen animal ni se basa en plantas. 196. El método de la reivindicación 195, en donde el hidroiizado que no es de origen animal ni se basa en plantas, es un hidroiizado basado en levaduras. 197. El método de la reivindicación 195, en donde el hidroiizado basado en plantas es un hidroiizado basado en soya. 198. El método de cualquiera de las reivindicaciones 175 a 185 y 189, en donde la solución de alimentación combinada comprende de aproximadamente 100 a 200 g/kg de glucosa. 199. El método de cualquiera de las reivindicaciones 175 a 185 y 189, que además comprende monitorear un nivel de glucosa en el medio de cultivo celular, de tal modo que el nivel de glucosa se mantenga entre un valor de aproximadamente 0.25 y 20.0 g/L. 200. El método de la reivindicación 199, en donde el nivel de glucosa se monitorea utilizando un aparato de muestreo automático. 201. El método de cualquiera de las reivindicaciones 175 a 185, en donde el anticuerpo que es producido se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo anti-TNF-a, un anticuerpo anti-IL-18, y un anticuerpo anti-IL-12. 202. El método de la reivindicación 191 ó 201, en donde el anticuerpo anti-TNF-a es el D2E7 (adalimumab). 203. El método de la reivindicación 191 ó 201, en donde el anticuerpo anti-IL-18 es el ABT-325. 204. El método de la reivindicación 191 ó 201, en donde el anticuerpo anti-IL-12 es el ABT-874. 205. Un método para producir un anticuerpo, en un cultivo de células de mamífero, de tal modo que el título del anticuerpo sea cuando menos 100 mg/L, en donde dicho método comprende: a) cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, en un medio de producción de cultivo celular; y b) agregar butirato de sodio, N-acetilcisteína, o una combinación de los mismos, al medio de cultivo celular, en donde el butirato de sodio es agregado a una concentración final de aproximadamente 0.1 mM a 10 mM y la N-acetilcisteína se agrega a una concentración final de aproximadamente 1 mM a 80 mM, de tal modo que el anticuerpo se produzca a un título de cuando menos 100 mg/L. 206 El método de la reivindicación 205, en donde el indicador metabólico es glucosa o glutamina. 207. Un método de alimentación por lotes para producir una proteína en un cultivo de células de mamífero, que comprende agregar una solución de alimentación combinada al cultivo de células de mamífero de conformidad con el perfil de alimentación de la reivindicación 205. 208. Un método para producir un anticuerpo en un cultivo de células de mamífero, de tal modo que el título del anticuerpo sea cuando menos 100 mg/L, en donde dicho método comprende: a) cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, en un medio de producción de cultivo celular; y b) agregar butirato de sodio, N-acetilcisteína, o una combinación de los mismos, al medio de cultivo celular, en donde el butirato de sodio es agregado a una concentración final de aproximadamente 0.1 mM a 10 mM y la N-acetilcisteína se agrega a una concentración final de aproximadamente 1 mM a 80 mM, de tal modo que el anticuerpo se produzca a un título de cuando menos 100 mg/L. 209. El método de la reivindicación 208, en donde el título del anticuerpo es de cuando menos 150 mg/L. 210. El método de la reivindicación 208, en donde el título del anticuerpo es de cuando menos 200 mg/L. 211. El método de la reivindicación 208, en donde el titulo del anticuerpo es de cuando menos 250 mg/L. 212. El método de la reivindicación 208, en donde el título del anticuerpo es de cuando menos 300 mg/L. 213. El método de la reivindicación 208, en donde el título del anticuerpo es de cuando menos 400 mg/L. 214. Un método para producir un anticuerpo en un cultivo de células de mamífero, de tal modo que el título del anticuerpo sea cuando menos 10% mayor que el de un cultivo de células de mamífero de control, en donde dicho método comprende: a) cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, en un medio de producción de cultivo celular; y b) agregar butirato de sodio, N-acetilcisteína, o una combinación de los mismos, al medio de cultivo celular, en donde el butirato de sodio es agregado a una concentración final de aproximadamente 0.1 m a 10 mM y la N-acetilcisteína se agrega a una concentración final de aproximadamente 1 mM a 80 mM, de tal modo que el anticuerpo sea cuando menos 10% mayor que el del control, en donde el cultivo de células de mamífero de control comprende el paso del inciso (a) y excluye el paso del inciso (b). 215. El método de la reivindicación 214, en donde el título del anticuerpo del cultivo de células de mamífero mejora cuando menos un 29% sobre el cultivo de células de mamífero de control. 216. El método de la reivindicación 214, en donde el título del anticuerpo del cultivo de células de mamífero mejora cuando menos un 40% sobre el cultivo de células de mamífero de control. 217. El método de la reivindicación 214, en donde el título del anticuerpo del cultivo de células de mamífero mejora cuando menos un 70% sobre el cultivo de células de mamífero de control. 218. El método de la reivindicación 214, en donde el título del anticuerpo del cultivo de células de mamífero es cuando menos un 90% mayor que el del cultivo de células de mamífero de control. 219. El método de cualquiera de las reivindicaciones 208 a 218, en donde se agrega butirato de sodio, N-acetilcisteína, o una combinación de los mismos, a un cultivo de células de mamífero durante la fase de crecimiento del cultivo de células de mamífero. 220. El método de cualquiera de las reivindicaciones 208 a 218, en donde se agrega butirato de sodio, N-acetilcisteína, o una combinación de los mismos, al cultivo de células de mamífero entre los días 4 y 7 del tiempo de cultivo. 221. El método de cualquiera de las reivindicaciones 208 a 218, en donde se agrega butirato de sodio, N-acetilcisteína, o una combinación de los mismos, al cultivo de células de mamífero el día 0 del tiempo de cultivo. 222. El método de cualquiera de las reivindicaciones 208 a 218, en donde la concentración final de butirato de sodio es de aproximadamente 0.1 a 10 mM. 223. El método de cualquiera de las reivindicaciones 208 a 218, en donde la concentración final de butirato de sodio es de aproximadamente 0.1 a 8.0 mM. 224. El método de cualquiera de las reivindicaciones 208 a 218, en donde la concentración final de butirato de sodio es de aproximadamente 0.1 a 3.0 mM de butirato de sodio. 225. El método de cualquiera de las reivindicaciones 208 a 218, en donde la concentración final de N-acetilcisteína es de aproximadamente 20 a 60 mM. 226. El método de cualquiera de las reivindicaciones 208 a 218, en donde la concentración final de N-acetilcisteína es de aproximadamente 10 mM. 227. El método de cualquiera de las reivindicaciones 208 a 218, en donde la concentración final de N-acetilcisteína es de aproximadamente 8 mM. 228. Un método para extender la longevidad de un cultivo de células de mamífero, en cuando menos 35% en comparación con un cultivo de células de mamífero de control, en donde dicho método comprende: a) cultivar células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, en un medio de producción de cultivo celular; y b) agregar de aproximadamente 1 mM a 80 mM de N- acetilcisteína, al medio de cultivo celular; de tal modo que la longevidad del cultivo de células de mamífero se extienda en cuando menos 35% en comparación con un cultivo de células de mamífero de control, en donde el cultivo de células de mamífero de control comprende el paso del inciso (a) y excluye el paso del inciso (b). 229. El método de la reivindicación 228, en donde la longevidad del cultivo de células de mamífero se extiende cuando menos aproximadamente un 45% en comparación con el cultivo de células de mamífero de control. 230. El método de la reivindicación 228, en donde la longevidad del cultivo de células de mamífero se extiende cuando menos aproximadamente un 55% en comparación con el cultivo de células de mamífero de control. 231. El método de cualquiera de las reivindicaciones 228 a 230, que comprende agregar una concentración final de aproximadamente 8 mM de N-acetilcisteína al medio de producción de cultivo celular. 232. El método de cualquiera de las reivindicaciones 208 a 231, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo anti-TNF-a, un anticuerpo anti-IL-18, y un anticuerpo anti-IL-12. 233. El método de la reivindicación 232, en donde el anticuerpo anti-IL-18 es el ABT-325.
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