ES2285481T3 - Cultivo de celulas de mieloma en un medio exento de transferrina y bajo en hierro. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para el cultivo in vitro de una línea celular de mieloma, que comprende: (a) inocular un medio de cultivo con una línea celular de mieloma, dicho medio siendo capaz de soportar el crecimiento de dicha línea celular de mieloma y comprendiendo hierro a concentraciones en el medio de aproximadamente 0, 03 mg/L a aproximadamente 3, 2 mg/L, donde dicho medio no contiene transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante sintético lipófilo que contiene nitrógeno; y (b) hacer crecer el medio de cultivo inoculado en condiciones apropiadas y usando cultivo en suspensión agitado.

Description

Cultivo de células de mieloma en un medio exento de transferrina y bajo en hierro.

Introducción

La presente invención se refiere a un procedimiento para cultivar ciertas células de mamífero en un medio de cultivo que contiene hierro, pero en ausencia de transferrina o un quelante lipófilo o sintético que contiene nitrógeno.

Antecedentes

Los medios de cultivo de células deben proporcionar los nutrientes necesarios para mantener y cultivar las células en un entorno controlado, artificial e in vitro. Las características particulares de los medios de cultivo celular dependen en gran medida del tipo de célula que se está cultivando y, en una menor medida, del procedimiento de cultivo.

Las células de mamífero tienen una necesidad absoluta de hierro que, in vitro, se suministra en el medio de cultivo celular. Bertheussen (Cytotechnology 11: 219-231, 1993) ha comentado que no puede suministrarse hierro de forma eficaz a las células de mamífero añadiendo sales sencillas de hierro al medio de cultivo de células, principalmente debido a que la disponibilidad del hierro para las células se reduce por la rápida oxidación y precipitación del
hierro.

El hierro en forma libre, además, tiene un elevado potencial oxidativo, que puede provocar la oxidación de componentes de un medio de cultivo de células. Por lo tanto, se ha demostrado que es beneficioso formar complejos con el hierro para reducir o eliminar este potencial oxidativo.

In vivo, el hierro es presentado a las células de mamífero por la proteína de unión a hierro transferrina. La transferrina funciona uniéndose al hierro e interaccionando con un receptor de transferrina en la superficie celular. El complejo transferrina-hierro después se introduce en la célula mediante endocitosis. Una vez en la célula, el complejo transferrina-hierro se rompe y el hierro liberado forma a continuación complejos con una proteína transportadora de hierro (ferritina). La transferrina se recicla. Thorstensen y Romslo, Biochem. J., 271: 1-10 (1990) ofrecen una revisión excelente de este mecanismo de transferencia de hierro in vivo. En el cultivo de células se ha aprovechado la capacidad de la transferrina de mediar el transporte de hierro a las células por la simple adición de transferrina y una sal de hierro al medio de cultivo celular.

Sin embargo, la transferrina típicamente usada en medios de cultivo de células es de origen animal y en los últimos años ha ido creciendo la presión reguladora para retirar proteínas de origen animal de los procesos de cultivo celular. Claramente, el uso de proteínas de origen animal lleva asociado el riesgo de introducir contaminantes y patógenos adventicios tales como la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD) o la Encefalopatía Espongiforme (Enfermedad de las Vacas Locas). Por lo tanto, se han buscado transportadores de hierro alternativos a la transferrina y se han aplicado con grados variables de éxito. El tipo y concentración de cualquier transportador alternativo de hierro a menudo se ha considerado dependiente del tipo de célula de mamífero que se está cultivando.

Kovar y Franek (Biotechnology Letters 9: 259-264 (1987)) demostraron que en el cultivo de líneas celulares de hibridoma, podrían usarse diversos compuestos de hierro solubles, tales como citrato férrico, en lugar de la transferrina. Kovar y Franek ensayaron la capacidad del citrato férrico de mantener el crecimiento de dos líneas celulares de hibridoma en un intervalo de concentraciones de 5 \muM (1,25 mg/L) a 5 mM (1225 mg/L). Aunque en la técnica anterior se habían propuesto como adecuadas concentraciones inferiores de compuestos férricos para uso en medios de cultivo para varias líneas celulares diferentes (en particular las de origen leucémico o epitelial humano), Kovar y Franek notifican que si el citrato férrico mantenía el crecimiento de las células de hibridoma con equivalencia a la transferrina, éste se requería a una concentración de 500 \muM (122,5 mg/L). Kovar y Franek descubrieron que un medio que contenía citrato férrico 500 \muM era adecuado para el cultivo de otras líneas celulares de hibridoma y también era adecuado para el cultivo de varios tipos celulares de mieloma.

Eto, et al., (Agric. Biol. Chem. 55(3): 863-865 (1991)), presentan descubrimientos similares a los de Kovak y Franek. Estos especialistas ensayaron el efecto estimulador del crecimiento del citrato férrico en un intervalo de concentraciones de 10 mg/L a 600 mg/L en una línea celular de hibridoma. Indican que se usaron 300 mg/L para estudios adicionales. Se observó un crecimiento equivalente al conseguido con la transferrina cuando se añadió etanolamina (un precursor de los lípidos) a una concentración de 10 \muM al medio que contenía 300 mg/L de citrato férrico.

En un estudio similar, Toyoda & Inouye, (Agric. Biol. Chem. 55(6): 1631-1633 (1991)), ensayaron el crecimiento de tres líneas celulares de hibridoma en medios que contenían citrato férrico en un intervalo de concentraciones de 0 a 500 \muM. Notifican que para dos de las tres líneas celulares de hibridoma ensayadas, se descubrió que era óptima una concentración de citrato férrico 50 \muM (12,5 mg/L). Este resultado es contrario a los descubrimientos de Eto et al., y Kovar y Franek, aunque una concentración de 500 \muM se consideró óptima para la tercera línea celular.

Sin embargo, es importante observar que los trabajos de Kovar y Franek, Toyoda e Inouye, y Eto et al. se realizaron en un cultivo estático. El documento WO 94/02592 notifica que aunque una concentración de 10 mg/L de citrato de amonio férrico (FAC) podía mantener el crecimiento de hibridoma en cultivo estático, esto no ocurría en un cultivo en suspensión agitado. Es evidente, por lo tanto, que la capacidad de las células de hibridoma de hacer un uso óptimo del hierro cuando crecen en el caso de un cultivo en suspensión agitado es diferente de la que existe en cultivo estático.

El documento WO 93/00423 describe un aditivo de medio de cultivo que comprende un quelato de hierro de una sal de hierro soluble y un citrato de metal alcalino o metal alcalinotérreo que es una fuente de hierro adecuada para medios de cultivo sin suero y sin proteínas. Los ejemplos de esta solicitud están relacionados predominantemente con el crecimiento de células de mamífero tales como células BHK y CHO. Aunque el ejemplo 5 pretende demostrar el crecimiento de células de mieloma, se observa que las células SP2/0 usadas son efectivamente células de ratón no secretoras/de hibridoma de ratón. A lo largo del texto se especifica que las condiciones de cultivo son condiciones de cultivo en suspensión estático.

Kovar y Franek reivindican que su medio que contenía citrato férrico 500 \muM era adecuado para el cultivo en suspensión agitado, pero no muestran pruebas que apoyen esta afirmación. Qi et al., (Cytotechnology 21: 95-109 (1996)), sin embargo, notificaron que un medio que contenía citrato férrico 500 \muM (122,5 mg/L), como el descrito por Kovar y Franek, era adecuado para el cultivo de tres líneas celulares de hibridoma en cultivos en suspensión agitados. Sin embargo, Qi et al., descubrieron que para usar un medio que contuviera estas elevadas concentraciones de citrato férrico (500 \muM), era necesario que las células se alejaran de este medio; en el caso de una línea celular, este período de alejamiento era muy prolongado. Qi et al. comentan que en estas condiciones, las células estaban experimentando dificultades para adaptarse y que la formulación de medio podría mejorarse por sustitución de citrato férrico del medio por un compuesto de presentación de hierro más eficaz tal como el ácido aurin tricarboxílico.

De acuerdo con la técnica anterior citada por Kovar y Franek (1987), varios especialistas han notificado que se ha descubierto que se pueden mantener en cultivo ciertos tipos de células de mamífero usando concentraciones inferiores de compuestos de hierro.

Ramos et al., WO 92/05246, notifican que en el cultivo de líneas de células epiteliales y, en particular, líneas de células de Ovario de Hámster Chino (CHO), la transferrina puede reemplazarse por citrato férrico a 10-100 mg/L (proporcionando aproximadamente 0,6-16 mg/L de hierro). Sin embargo, esta solicitud de patente indica claramente que se descubrió que el medio no era adecuado para el cultivo de líneas celulares de mieloma. Keen et al, documento US 5.633.162, notifican que el citrato férrico, el sulfato ferroso y el citrato de amonio férrico (FAC) pueden usarse a concentraciones comprendidas entre 0,25 y 5 mg/L (equivalente a 0,04 a 0,8 mg/L de hierro) para reemplazar a la transferrina en el cultivo de células CHO.

WO 98/08934 define un medio de reemplazo en el que se han reemplazado todas las proteínas animales, es decir, la transferrina y la insulina. La transferrina se reemplazó por sulfato ferroso quelado con un compuesto quelante que contenía nitrógeno a concentraciones, con respecto al hierro, comprendidas entre 0,28 y 11 mg/L, descubriéndose que era óptima una concentración de 1,1 mg/L. Los compuestos quelantes que contenían nitrógeno indicados como adecuados incluyen: ácido etilendiaminatetraacético (EDTA); ácido etilenglicol-bis(\beta-aminoetil éter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA); mesilato de desferoxamina; ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) y ácido trans-1,2-diaminociclohexano-N,N,N',N'-tetraacético (CDTA). De éstos, el EDTA es el más preferido. También se usó citrato férrico en forma de FeCl_{3}-citrato sódico, pero éste se requería a concentraciones mayores que el quelato sulfato ferroso.7H_{2}O-
EDTA.

Esta solicitud indica que el medio sin transferrina es adecuado para cultivar células de mamífero, particularmente células epiteliales o fibroblastos. Se ha proporcionado un ejemplo del crecimiento de CHO y la línea celular de riñón embrionario humano 293.

También se ha ensayado una serie de tipos celulares por Neumannova et al., (In vitro Cell Dev. Biol., 31: 625-632 (1995)) con respecto al crecimiento a largo plazo en medios que contienen hierro en forma de citrato férrico a baja concentración de 1,25 mg/L (aproximadamente 0,2 mg/L de hierro). De las 19 líneas celulares ensayadas, solamente 5 tuvieron un crecimiento a largo plazo en este medio de bajo contenido de hierro. Las 5 líneas celulares eran Jurkat, J111 y THP-1 (líneas celulares de leucemia humana), HeLa (una línea de células epiteliales humana) y XC (un sarcoma de rata). Aunque se incluyeron líneas celulares de hibridoma y mieloma entre las ensayadas, no se observó que ninguna fuera capaz de crecer en el medio de bajo contenido de hierro.

Como se ha analizado anteriormente, concentraciones inferiores de compuestos férricos son adecuadas para uso en medios de cultivo para ciertos tipos celulares (particularmente los de origen epitelial y de leucemia humana). Sin embargo, en la técnica generalmente está acordado que para cultivar células de hibridoma en cultivo en suspensión agitado usando un medio sin transferrina, se requiere una elevada concentración, por ejemplo, en la región de 125,5 mg/L de un compuesto de hierro.

La técnica anterior también enseña, sin embargo, que no son ventajosas concentraciones elevadas de hierro. Bertheussen, en Cytotechnology 11: 219-231 (1993), indica que no deben usarse elevadas concentraciones de hierro, tales como el citrato férrico 500 \muM sugerido por Kovar y Franek, ya que estas elevadas concentraciones ocasionan una rápida precipitación de hidróxido de hierro en el medio. El hidróxido de hierro recién formado absorbe otros metales y diversas moléculas orgánicas de forma eficaz, por lo tanto, se verán afectadas seriamente la composición y estabilidad de los medios que tienen un elevado contenido de hierro.

En vista de las dificultades encontradas en el suministro de hierro a ciertas células de mamífero en cultivo, en particular a células de hibridoma, se desarrolló el concepto de quelación del hierro, por ejemplo, con compuestos lipófilos.

Los quelantes de hierro son compuestos típicamente heterocíclicos que se unen al metal hierro por enlaces coordinados con al menos dos iones no metálicos del quelante, y pueden clasificarse usando varios criterios tales como su origen (moléculas sintéticas o producidas biológicamente), su interacción con disolventes tales como agua (hidrófobo frente a hidrófilo) o su interacción estequiométrica (bidentado o hexadentado).

Los quelantes lipófilos son compuestos que tienen dos propiedades distintas: (1) los compuestos son hidrófobos y a menudo aromáticos, mostrando de este modo solubilidad en disolventes orgánicos (por ejemplo, alcohol) pero una solubilidad limitada en agua; y (2) los compuestos también tienen, típicamente, una región de carga negativa que permite la "unión" de hierro a través de interacciones electrostáticas con iones de hierro cargados positivamente. En cultivo celular, se cree que dichos compuestos se unirán a las membranas ricas en lípidos de las células y, por lo tanto, transportarán el hierro "unido" a y posiblemente a través de la membrana celular, facilitando de este modo el suministro de hierro a las células (US 5.045.468). Los quelantes lipófilos se añaden típicamente en exceso de una sal de hierro adjunta.

Uno de los informes más prematuros del uso de un quelante lipófilo fue el de Brock y Stevensen (immunology Letters 15: 23-25, (1987)) que usaron piridoxal isonicotinoil hidrazona (PIH) junto con nitrilotriacetato férrico. Descubrieron que PIH: nitrilotriacetato férrico en una proporción de 2:1 y a una concentración de 40 \muM (con respecto a PIH) podía reemplazar a la transferrina para el cultivo de líneas celulares de linfocitos de ratón.

Darfler, (documento US 5.045.468/in Vitro Cell. Dev. Biol. 26: 769-778. 1990) presenta un medio sin proteínas adecuado para el cultivo de líneas celulares de hibridoma. El autor descubrió que la transferrina podría reemplazarse usando el compuesto orgánico de hierro, nitroprusiato sódico (SNP), junto con EDTA a concentraciones de 5,7 y 5,5 mg/L respectivamente. El autor llamó a este medio "medio ABC".

Bertheussen, (documento US 5045467/Cytotechnology 11: 219-231 (1993)), notificó que la transferrina en medios de cultivo celular podría reemplazarse usando ácido aurin tricarboxílico, un quelante de hierro lipófilo, e iones férricos 3 \muM (añadidos en forma de FeCl_{3}). Bertheussen desarrolló este medio usando varios tipos celulares y lo encontró especialmente adecuado para el cultivo de líneas celulares de hibridoma de crecimiento rápido.

WO 94/02592 propuso que se usara tropolona para reemplazar la función de la transferrina en la presentación del hierro a las células en cultivo en suspensión agitado. El autor comenta que la tropolona debe añadirse en exceso del hierro adjunto. El hierro puede presentarse como iones férricos o ferrosos usando una diversidad de compuestos de hierro, siendo FAC el más preferido. Se usó una línea celular de hibridoma para establecer las concentraciones óptimas de la tropolona y FAC como 5 \muM y 0,2 mg/L respectivamente. Este medio también fue adecuado para el crecimiento de células de mieloma NSO. Simplemente como controles experimentales, se ensayaron medios que carecían de transferrina y tropolona pero que contenían FAC con células de hibridoma y mieloma. Se descubrió que FAC solo, a una concentración comprendida entre 0,1 y 10 mg/L, era incapaz de soportar el crecimiento de células de hibridoma en cultivos en suspensión agitados. FAC solo a una concentración de 0,2 mg/L no podía soportar el crecimiento de las líneas celulares de mieloma NSO. No se investigaron otras concentraciones de FAC solo con las líneas celulares de mieloma; presumiblemente, los autores supusieron que las líneas celulares NSO y de hibridoma se comportaban de forma similar y no esperaban que otras concentraciones de FAC soportaran el crecimiento celular.

Keen (Cytotechnology 17: 193-202, 1995) informa sobre el desarrollo de un medio sin proteínas para el cultivo de células de mieloma de rata e hibridoma de rata. Este medio, denominado W38, se basaba en una mezcla 1:1:1 de DMEM, RPMI y el medio ABC desarrollado por Darfler. Por lo tanto, el medio contenía SNP como fuente lipófila de hierro y EDTA como quelante que contiene nitrógeno. Sin embargo, SNP y EDTA estaban a 1/3 de la concentración encontrada en el medio ABC, y Keen consideró beneficioso aumentar la concentración de hierro incluyendo citrato férrico en el medio. El medio W38 también era adecuado para el cultivo de la línea celular de mieloma auxotrófica para colesterol, NSO, proporcionando una provisión adecuada del colesterol requerido (Keen y Steward, Cytotechnology 17: 203-211, 1995).

Una solicitud de patente reciente de Epstein et al., WO 01/16294, comenta que en muchos casos, simples portadores de hierro tales como el citrato no proporcionan suficiente disponibilidad del hierro para, o captación por, las células cultivadas. La patente también notifica que podría usarse un intervalo de compuestos quelantes de hierro lipófilos para una diversidad de tipos celulares con grados diferentes de éxito. Sin embargo, solamente se obtuvieron resultados al menos tan buenos como los obtenidos con la transferrina con sorbitol quelado con FeCl_{3} y el N-óxido de 2 hidroxipiridina.

Por lo tanto, se ha incorporado al estado de la técnica el uso de compuestos lipófilos para quelar y ayudar a la presentación del hierro en cultivos sin transferrina de tipos celulares de hibridoma y mieloma. Hay, sin embargo, varias desventajas en la inclusión de quelantes lipófilos en el medio de cultivo de células. Los quelantes lipófilos a menudo son tóxicos, por ejemplo SNP se clasifica como elevadamente tóxico y tiene un valor de DL50 en rata <1 mg/kg. En líneas celulares usadas para la producción industrial de productos bioterapéuticos, esto tiene consecuencias tanto para los operarios de fabricación como para el producto final. De hecho, puede ser necesario desarrollar y validar ensayos para demostrar que el producto bioterapéutico purificado final está limpio de cualquier quelante lipófilo contaminante. Además, la optimización de la concentración de hierro de cualquier proceso particular se complicará adicionalmente debido al sistema de dos componentes del quelante y compuesto de hierro.

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En resumen, la técnica anterior demuestra que:

1.

en ausencia de transferrina, las células de hibridoma y mieloma crecerán en elevadas concentraciones de hierro (122,5 mg/L de citrato férrico) (Kovar y Franek).

2.

concentraciones elevadas de hierro (por ejemplo, 122,5 mg/L de citrato férrico) causan precipitación con daños en el medio de cultivo (Bertheussen).

3.

en ausencia de transferrina o un quelante lipófilo, las células de hibridoma no crecerán en cultivo agitado y las células de mieloma no crecerán en absoluto en concentraciones bajas de hierro (0,1-10 mg/L y 0,2 mg/L, respectivamente) (documento WO 94/02592).

4.

es necesario un quelante lipófilo en el medio para permitir que las células de hibridoma y mieloma crezcan en cultivo agitado en concentraciones bajas de hierro (documento WO 94/02592).

5.

pueden usarse concentraciones bajas de hierro para el crecimiento de ciertas células de mamífero, pero solamente con el uso de un quelante que contenga nitrógeno tal como EDTA (documento WO 98/08934).

En la técnica del cultivo celular se aprecia que ciertos tipos celulares comparten atributos nutricionales similares. Es notable que los tipos celulares tanto de mieloma como de hibridoma comparten atributos significativos que no siempre se muestran por otros tipos celulares, por ejemplo son auxotróficos para glutamina (Bebbington et al. Biotechnology 10: 169-175, 1992). El hecho de que los hibridomas y mielomas reaccionen de un modo similar en muchos aspectos no es, en cierto grado, sorprendente, ya que las líneas celulares de hibridoma son producidas por fusión de una célula de mieloma con un anticuerpo que produce linfocitos B (Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497, 1975).

La técnica anterior, como se ha indicado anteriormente, ha demostrado que la capacidad de las células de hibridoma y mieloma de usar el hierro presente en el medio con un simple portador de hierro, tal como un citrato, y en ausencia de transferrina o un quelante lipófilo o que contenga nitrógeno es diferente de la capacidad correspondiente de, por ejemplo, las células CHO. La enseñanza global de la técnica anterior es que las células de hibridoma y mieloma son iguales en su capacidad de usar hierro en un medio de cultivo sin transferrina.

Es evidente a partir de la bibliografía, como se ha analizado anteriormente, que se ha dedicado tiempo y esfuerzo al desarrollo de medios sin transferrina para el crecimiento de tipos celulares de hibridoma, particularmente en cultivo estático. Basándose en la suposición implícita de la técnica de que las células de mieloma demostrarán los mismos requisitos que las células de hibridoma en este aspecto, no se ha hecho ningún esfuerzo equivalente con células de mieloma.

Con los años, es evidente que la técnica de cultivo celular de hibridoma y mieloma se ha alejado del uso de hierro en forma de un compuesto de hierro soluble como sustituto de la transferrina, y en su lugar ha determinado que para conseguir los beneficios de las bajas concentraciones de hierro, debe incluirse un quelante lipófilo que contenga nitrógeno en el medio de cultivo. Por supuesto, el uso de dichos quelantes en medios usados en el crecimiento de las células para producir el producto para el que han sido diseñados, también necesita que el producto se trate adicionalmente para asegurar que no hay contaminación con ese quelante. La inclusión de dicho quelante en el medio de cultivo, de esta manera, no sólo prolonga el tiempo que lleva demostrar que el producto es puro, sino que también aumenta el gasto de producción porque necesita el desarrollo de ensayos específicos para demostrar que un quelante de hierro "tóxico" no contamina el producto puro.

Es evidente, por lo tanto, que aún existe la necesidad de proporcionar hierro en una forma sencilla a ciertas células en cultivo a concentraciones que proporcionen suficiente hierro para permitir que continúe el crecimiento celular pero que no provoquen el daño de precipitación analizado anteriormente. Una ventaja adicional sería tener un medio sin transferrina y quelantes lipófilos o que contengan nitrógeno. El objetivo sería conseguir un cultivo celular en un medio sin transferrina y sin quelante lipófilo o que contenga nitrógeno equivalente al que se obtendría en un medio que contiene transferrina.

Descripción resumida de la invención

Para satisfacer la necesidad de proporcionar un medio sin transferrina que soporte el crecimiento de ciertas células, la presente invención proporciona, entre otros, un medio para cultivar células de mieloma en cultivo en suspensión agitado en un medio que contiene hierro pero que carece de transferrina o un quelante lipófilo o sintético que contiene nitrógeno. La presente invención demuestra que, sorprendentemente y en contra de las indicaciones de la técnica anterior, los requisitos de hierro de una célula de mieloma son diferentes a los de una célula de hibridoma, con el resultado inesperado de que las células de mieloma muestran crecimiento continuo en concentraciones de hierro en el medio hasta 100 veces menores que la necesaria para las células de hibridoma. Una ventaja adicional del procedimiento de la presente invención se demuestra por el título mejorado del producto de células de mieloma obtenido cuando las células se cultivan en medio con bajas concentraciones de hierro.

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Descripción de las figuras

Figura 1: la figura 1a ilustra la capacidad de una línea celular de mieloma de crecer en concentraciones variables de citrato de amonio férrico en condiciones de cultivo en suspensión agitado y la figura 1b demuestra la cantidad de anticuerpo producido por una línea celular de mieloma cultivada en concentraciones variables de citrato de amonio férrico. La figura 1c muestra los datos de crecimiento de una réplica de este experimento.

Figura 2: la figura 2a ilustra el crecimiento de una línea celular de mieloma en concentraciones variables de citrato férrico en condiciones de cultivo en suspensión agitado y la figura 2b muestra el recuento de células y el título de anticuerpo de la línea celular cultivada de este modo.

Figura 3: la figura 3a ilustra el crecimiento de una línea celular de hibridoma en concentraciones variables de citrato de amonio férrico en condiciones de cultivo en suspensión agitado, la figura 3b muestra el recuento de células y la figura 3c muestra una comparación obtenida matemáticamente del crecimiento de la línea celular cultivada de este modo.

Figura 4: la figura 4a ilustra el crecimiento de una línea celular de mieloma en un medio rico sin suero, sin transferrina en concentraciones variables de citrato de amonio férrico en condiciones de cultivo en suspensión agitado.

Figura 5: ilustra la capacidad del citrato de amonio férrico de proporcionar todo el hierro necesario para el crecimiento de una línea celular de mieloma en condiciones de crecimiento en fermentación en suspensión agitada.

Figura 6: ilustra la capacidad del citrato de amonio férrico de proporcionar todo el hierro necesario para el crecimiento de una línea celular de mieloma en un medio sin proteína y en un medio sin suero en condiciones de fermentación en suspensión agitada.

Figura 7: ilustra que la capacidad de una línea celular de mieloma de crecer con citrato de amonio férrico como única fuente de hierro no se debe a la transfección con el sistema de selección GS.

Figura 8A: ilustra el crecimiento de una línea celular de mieloma alternativa en un medio sin proteínas suplementado con citrato de amonio férrico en una fermentación a escala experimental.

Figura 8B: ilustra el crecimiento de una línea celular de mieloma en un medio sin proteínas suplementado con citrato de amonio férrico en una fermentación semicontinua a escala piloto de 100 L.

Figura 9: ilustra el crecimiento de una línea celular de mieloma adicional en un medio sin proteínas suplementado con citrato de amonio férrico en una fermentación a escala experimental.

Figura 10: ilustra el crecimiento de una línea celular de mieloma adicional en un medio sin proteínas suplementado con citrato de amonio férrico en una fermentación semicontinua a escala piloto de 100 L.

En las Figuras 8A, 8B, 9 y 10, como en las otras figuras, el eje x define el tiempo en días y el eje y define la cantidad de células viables (x10^{5} células/ml).

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona, en su primer aspecto, un procedimiento para el cultivo in vitro de una línea celular de mieloma que comprende:

(a) inocular un medio de cultivo con una línea celular de mieloma, siendo capaz dicho medio de soportar el crecimiento de dicha línea celular de mieloma y comprendiendo hierro a concentraciones en el medio de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 3,2 mg/L, donde dicho medio no contiene transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante sintético lipófilo que contiene nitrógeno; y

(b) cultivar el medio de cultivo inoculado en condiciones apropiadas y usando cultivo en suspensión agitado.

En una realización de este aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para el cultivo in vitro de una línea celular de mieloma que comprende:

(a) inocular un medio de cultivo con una línea celular de mieloma, siendo capaz dicho medio de soportar el crecimiento de dicha línea celular de mieloma y comprendiendo citrato de amonio férrico a una concentración en el medio de aproximadamente 0,2 mg/L a aproximadamente 20 mg/L, donde dicho medio no contiene transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante lipófilo sintético que contiene nitrógeno; y

(b) cultivar el medio de cultivo inoculado en condiciones apropiadas y usando cultivo en suspensión agitado.

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En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un proceso para obtener un producto celular de mamífero que comprende cultivar una célula de mieloma capaz de producir dicho producto en un medio de cultivo capaz de soportar el crecimiento de dicha línea celular de mieloma, comprendiendo dicho medio de cultivo hierro a concentraciones en el medio de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 3,2 mg/L, donde dicho medio no contiene transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante lipófilo sintético que contiene nitrógeno; y recuperar dicho producto celular de mamífero.

En todavía un aspecto más, la presente invención proporciona el uso de un medio de cultivo para soportar el crecimiento in vitro de una línea celular de mieloma, donde el medio de cultivo comprende hierro a concentraciones en el medio de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 3,2 mg/L, donde dicho medio no contiene transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante sintético lipófilo que contiene nitrógeno.

En una realización de estos aspectos de la invención, el medio contiene citrato de amonio férrico a una concentración en el medio de aproximadamente 0,2 mg/L a aproximadamente 20 mg/L.

En la presente invención, el medio de cultivo es capaz de soportar el crecimiento de una línea celular de mieloma. Por "soportar el crecimiento", se entiende el crecimiento continuo de las células en múltiples subcultivos con una cantidad celular al menos duplicada y preferiblemente triplicada en cada pase, es decir, de un subcultivo al siguiente. La cantidad de subcultivos no es esencial para la presente invención y depende, por ejemplo, de la duración del experimento que se está realizando, o del producto que se está produciendo. En la presente invención generalmente se prefiere que las células muestren crecimiento continuo en al menos 2 subcultivos, y preferiblemente en al menos 3 subcultivos.

Una célula de mieloma, conocida de otro modo como célula linfoide, es un linfocito canceroso que típicamente es inmortal en condiciones de crecimiento normales. Los tipos celulares de mieloma son útiles ya que son excelentes parejas de fusión para la producción de hibridomas que produzcan anticuerpos monoclonales. En los últimos años, la importancia de los tipos celulares de mieloma como células hospedadoras en tecnología génica recombinante ha llegado a ser altamente significativa. Esto ocurre particularmente con el uso del marcador de selección de glutamina sintetasa, que se usa con un hospedador de mieloma NSO para producir líneas celulares recombinantes estables de producción elevada (Barnes et al. Cytotechnology 32: 109-123, 2000).

En la presente invención, se prevé que pueda usarse cualquier línea celular de mieloma en el medio de cultivo. Generalmente se prefiere que la línea celular de mieloma sea de origen murino y, cuando es así, se prefiere particularmente que el mieloma sea la línea celular NSO o una línea celular de la serie P3, más preferiblemente una línea celular NSO (tal como ECACC 85110503). Otros mielomas de ratón incluyen la serie MOPC, MPC-11, J558L, K6H6/B5 y 45.6.TG1.7. El procedimiento de la invención también puede usarse para cultivar tipos celulares de mieloma de rata y humano. Las líneas celulares de mieloma de rata apropiadas para uso en el procedimiento de la invención incluyen Y0 e Y, y las líneas celulares de mieloma humano apropiadas incluyen HTK, RPMI 8226 y U266B1.

Cuando la línea celular de mieloma es una célula NSO, generalmente se prefiere que la línea celular se transfecte usando el sistema de expresión de glutamina sintetasa.

El medio de cultivo de células de la presente invención no contiene transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante sintético lipófilo que contiene nitrógeno. Los quelantes lipófilos pueden definirse para los fines de esta invención como quelantes que tienen dos propiedades distintas: (1) son hidrófobos, siendo poco solubles o insolubles en agua o un medio de cultivo de células, y a menudo son aromáticos y (2) tienen una región de carga negativa que permite la "unión" de hierro a través de interacciones electrostáticas con iones de hierro cargados positivamente. Son ejemplos de quelantes lipófilos la tropolona y el nitroprusiato sódico. Para los fines de la presente invención, los quelantes sintéticos que contienen nitrógeno pueden definirse como compuestos que se unen a hierro que contienen en su estructura al menos un átomo de nitrógeno. Dichos compuestos pueden ser hidrófobos o hidrófilos. Por "sintético", en este aspecto, se entiende que los quelantes que contienen nitrógeno no son de origen natural, es decir, no pueden encontrarse normalmente en la naturaleza. Los quelantes que contienen nitrógeno de origen natural que se fabrican sintéticamente no se incluyen en esta definición y no se excluyen de los procedimientos y usos de la presente invención. Dichos quelantes sintéticos que contienen nitrógeno incluyen, aunque sin limitación, compuestos tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA); ácido etilenglicol-bis-(\beta-aminoetil éter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA); mesilato de desferoxamina; ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) y ácido trans-1,2-diaminociclohexano-N,N,N',N'-tetraacético (CDTA). También se excluyen de los procedimientos y usos de la presente invención compuestos que pueden ser quelantes que contienen nitrógeno tanto lipófilos como sintéticos.

La composición exacta del medio no es importante para la presente invención, siempre que el medio no contenga transferrina, quelante lipófilo, quelante sintético que contiene nitrógeno o quelante sintético que contiene nitrógeno lipófilo, pero contenga hierro a las concentraciones presentadas anteriormente, y siempre que el medio sea capaz de soportar el crecimiento de la línea celular de mieloma, como se ha definido previamente.

Típicamente, el medio de cultivo de células incluirá fuentes de aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas y azúcares. Los compuestos capaces de proporcionar estos requisitos esenciales para el crecimiento están disponibles habitualmente y su incorporación en el medio para el crecimiento celular pertenece a la capacidad de los expertos en la materia basándose en la información disponible en la técnica.

Generalmente se prefiere que el medio de cultivo de células esté basado en un medio basal conocido o derivado del mismo que soporte el crecimiento continuo de células de mamífero. Dicho medio basal está disponible habitualmente. Los ejemplos de medios basales apropiados que pueden suplementarse para proporcionar el medio de la presente invención incluyen Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), medio F12 de Ham, medio de Dulbecco modificado por Iscove y Roswell Park Memorial Institute (RPMI).

El medio de la presente invención puede carecer de suero, de proteínas, de componentes de origen animal o puede estar definido químicamente.

En una alternativa, el medio de cultivo de células puede producirse a partir de los primeros principios por combinación de los componentes específicos necesarios para el crecimiento continuo.

Cuando se prepara un medio de cultivo de células para un tipo celular o línea celular específica, un medio basal típicamente se modificará o suplementará dependiendo de los requisitos del tipo/línea celular particular. La elección de los suplementos pertenece a la capacidad del experto en la materia y no constituye un aspecto esencial de la presente invención. Típicamente dichos suplementos pueden incluir lípidos (por ejemplo, colesterol y ácidos grasos), precursores de lípidos (por ejemplo, etanolamina), promotores o reguladores del crecimiento (por ejemplo, insulina), oligoelementos (por ejemplo, selenio), polímeros (por ejemplo, pluronic F68) y glutamina en el caso de tipos celulares dependientes de glutamina.

Un ejemplo de un medio al que puede añadirse una fuente de hierro para proporcionar hierro al medio a las concentraciones indicadas anteriormente para hacerlo adecuado en el uso de la presente invención es un medio de cultivo de células basado en CDSS descrito por Qi et al. en Cytotechnology 21: 95-109 (1996). Este medio, conocido como CDSS modificado, se basa en DMEM/F12 (1:1) (Gibco BRL. 1 x líquido nº cat. 21331) con las siguientes adiciones: suplemento de GS (JRH nº cat. 58672) a 40 ml/L; oligoelementos I de Clevelands (Cellgro 99-175) a 0,5 ml/L; oligoelementos II de Clevelands (Cellgro 99-176) a 1 ml/L; Sulfato de Zinc 2 \muM; Selenita sódica 50 nM; Etanolamina 20 \muM; Pluronic F68 a 1 g/L; Bicarbonato sódico 1,3 g/L y ácido clorhídrico 2 M a 3,6 ml/L. El medio también contiene glutamina 6 mM para líneas celulares que no pueden tener un crecimiento independiente de glutamina y 2 ml/L de concentrado lipídico de colesterol (Gibco nº cat. 00-0061) para líneas celulares NSO.

El medio de cultivo de células de la presente invención comprende hierro a una concentración en el medio de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 3,2 mg/L. En una realización preferida, la fuente de hierro en el medio de cultivo es un compuesto de hierro soluble. La cantidad de compuesto de hierro soluble usada debería ser suficiente para proporcionar hierro a esa concentración en el medio y, siempre que la cantidad de hierro en el medio esté en este intervalo, debería ser justo la suficiente para soportar el crecimiento de las células. La concentración exacta de compuesto de hierro soluble en el medio puede variar dependiendo del compuesto de hierro soluble específico que se está usando y la línea celular en uso y/o de otros componentes del medio presentes. La concentración apropiada puede determinarse de un modo sencillo, por ejemplo por realización de experimentos a pequeña escala de acuerdo con la práctica convencional, tal como una curva de dosis-respuesta al compuesto de hierro soluble en un medio particular con una línea celular particular.

En la presente invención, la concentración del hierro en el medio, preferiblemente proporcionado por un compuesto de hierro soluble, es de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 3,2 mg/L, preferiblemente de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 2,4 mg/L, más preferiblemente de aproximadamente 0,064 mg/L a aproximadamente 1,6 mg/L y aún más preferiblemente de aproximadamente 0,16 mg/L a aproximadamente 0,32 mg/L.

En una realización preferida de la presente invención, la fuente de hierro en el medio es un compuesto de hierro soluble. Los compuestos de hierro solubles apropiados son solubles en agua o en el medio de cultivo de células, pero muestran solubilidad limitada en disolventes orgánicos. Dichos compuestos están disponibles habitualmente para los expertos en la materia, para los que la determinación de la solubilidad es sencilla.

La presente invención también prevé el uso de cualquier fuente de hierro alternativa, siempre que la fuente de hierro sea capaz de proporcionar suficiente hierro a las células para permitir el crecimiento continuo en ausencia de transferrina o un quelante lipófilo o sintético que contenga nitrógeno.

Los compuestos de hierro solubles apropiados para proporcionar hierro y, por lo tanto, para usar en la presente invención incluyen sales férricas y ferrosas o quelatos simples de las mismas. Debe tenerse en cuenta que "quelatos simples", como se usa en este documento, no incluyen los quelantes lipófilos o sintéticos que contienen nitrógeno analizados anteriormente en este documento. La expresión "quelatos simples" se usa en este documento de un modo comparable al uso de la expresión "portadores de hierro simples" en diversas partes de la técnica anterior.

Los ejemplos de sales férricas o ferrosas o quelatos simples de las mismas, que pueden ser la fuente de hierro en el medio de cultivo para los procedimientos y usos de la invención, incluyen sulfato ferroso, citrato ferroso, citrato férrico y compuestos de amonio férricos. Para el uso en la presente invención se prefieren compuestos de amonio férricos. Los compuestos de amonio férricos específicos apropiados para el uso en la presente invención incluyen citrato de amonio férrico, oxalato de amonio férrico, fumarato de amonio férrico, malato de amonio férrico y succinato de amonio férrico. Para el uso en la presente invención, es más preferido el citrato de amonio férrico.

Aunque el medio de la presente invención puede contener más de una fuente de hierro, por ejemplo una mezcla de compuestos que contienen hierro apropiados, generalmente se prefiere que, cuando ese agente de hierro es un compuesto de hierro soluble, solamente haya uno de dichos compuestos en el medio.

En una realización preferida de la presente invención, el compuesto de hierro soluble es citrato de amonio férrico. Típicamente, en esta realización y para proporcionar hierro al medio en el intervalo de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 3,2 mg/L, el citrato de amonio férrico se usará a concentraciones de aproximadamente 0,2 mg/L a aproximadamente 20 mg/L, preferiblemente de aproximadamente 0,2 mg/L a aproximadamente 15 mg/L, más preferiblemente de aproximadamente 0,4 mg/L a aproximadamente 10 mg/L y mucho más preferiblemente de aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2 mg/L.

En una realización preferida de la presente invención, el medio de cultivo contiene un compuesto de amonio férrico. Los resultados de la presente invención han demostrado que dichos compuestos de amonio férricos, en particular citrato de amonio férrico, es usado de forma más eficaz por las células que, por ejemplo, el citrato férrico. En particular, si se usa citrato férrico, debe estar presente en una concentración 10 veces mayor que la de un compuesto de amonio férrico en un medio de cultivo equivalente. Esto se demuestra por las Figuras 1 y 2 de la presente invención, en las que es evidente que para el crecimiento celular continuo en al menos 3 pases, el citrato férrico debe estar presente a concentraciones de al menos 10 mg/L, mientras que el citrato de amonio férrico proporciona el mismo nivel de crecimiento a concentraciones de 0,2 mg/L. También es digno de mención que el título de anticuerpo es mejor a concentraciones de hierro inferiores.

El medio de cultivo de células de la presente invención puede prepararse mediante mezcla apropiada de los componentes individuales usando la práctica habitual. Los medios también pueden prepararse en formas diferentes tales como forma líquida o como un medio en polvo seco para la reconstitución antes de su uso. Los medios de cultivo de la presente invención son estables cuando se almacenan en condiciones apropiadas.

Por consiguiente, la presente invención también proporciona un procedimiento para la preparación de un medio de cultivo de células capaz de soportar el crecimiento in vitro de una línea celular de mieloma, comprendiendo dicho medio hierro a concentraciones en el medio de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 3,2 mg/L, donde dicho medio no contiene transferrina, quelante lipófilo, quelante sintético que contiene nitrógeno o quelante lipófilo sintético que contiene nitrógeno; que comprende la mezcla de los componentes individuales de la misma.

El medio de cultivo de células de la presente invención es apropiado para el uso en una diversidad de condiciones de cultivo. De esta manera, el medio puede sostener el crecimiento de una línea celular de mieloma en monocapa y suspensión, particularmente cultivo en suspensión agitado. El cultivo en suspensión agitado puede definirse como el cultivo celular en el que se ayuda a la suspensión homogénea de las células en el medio de cultivo mediante una fuerza de agitación. Los medios para aplicar la fuerza de agitación son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, un impulsor agitado mecánicamente y/o rociado de gas para cultivos en birreactor, y mantenimiento de matraces de cultivo celular en una plataforma de agitación recíproca. El medio de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para el cultivo de células en un cultivo en suspensión agitado, es decir, en suspensión usando un recipiente de cultivo agitado adecuado, por ejemplo un depósito agitado o un fermentador de ascenso por aire, usando técnicas de cultivo conocidas.

Por consiguiente, la presente invención también proporciona un medio de cultivo capaz de soportar el crecimiento en cultivo en suspensión agitado de una línea celular de mieloma, comprendiendo el medio hierro a concentraciones en el medio de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 3,2 mg/L, donde el medio no contiene transferrina, quelante lipófilo, quelante sintético que contiene nitrógeno o quelante lipófilo sintético que contiene nitrógeno.

La técnica anterior ha enseñado que los tipos celulares de mieloma e hibridoma tienen los mismos requisitos cuando se añade hierro en un medio de cultivo. Los resultados de los presentes solicitantes indican que esto no es así. La figura 3 ilustra el crecimiento de una línea celular de hibridoma en un medio de cultivo que contiene citrato de amonio férrico. Como puede observarse en esta figura, el crecimiento de las células de hibridoma corresponde con las expectativas de la técnica, es decir, hay buen crecimiento de las células a concentraciones elevadas de citrato de amonio férrico (50 mg/L y 100 mg/L), pero no a concentraciones inferiores de este compuesto de hierro soluble (menos de 10 mg/L). Cuando esto se compara con la figura 1, que ilustra el crecimiento de células de mieloma en medios con concentraciones equivalentes de un compuesto de hierro soluble, se hace evidente que las células de hibridoma requieren aproximadamente 100 veces más hierro en el medio que las células de mieloma para un crecimiento comparable.

Una ventaja adicional de los procedimientos de la presente invención es el mejor título de un producto de células de mieloma cuando la célula de mieloma se cultiva en un medio de bajo contenido en hierro, es decir, cuando la línea celular se cultiva de acuerdo con el procedimiento de la invención. Los siguientes ejemplos demuestran que el título del producto de células de mieloma es inesperadamente más elevado cuando la concentración de hierro en el medio es baja, por ejemplo, entre 0,03 mg/L y 3,2 mg/L, preferiblemente entre 0,6 mg/L y 0,32 mg/L.

Los productos celulares que pueden obtenerse de acuerdo con la invención incluyen cualquier producto que sea producido por células de mamífero cultivadas. Los productos típicos incluyen, por ejemplo, polipéptidos y proteínas, por ejemplo inmunoglobulinas tales como anticuerpos monoclonales y recombinantes y fragmentos de los mismos, hormonas tales como eritropoyetina y hormona del crecimiento, por ejemplo, hormona del crecimiento humana, linfoquinas tales como interferón, interleuquinas tales como interleuquina 2, 4, 5 y 6, y enzimas útiles industrial y terapéuticamente tales como el activador de plasminógeno tisular. Se usan ampliamente y están disponibles habitualmente en la técnica procedimientos para la manipulación de células de mieloma mediante técnicas recombinantes genéticas de manera que sean capaces de producir dichos productos celulares.

Para obtener productos celulares, las células de mieloma capaces de producir dichos productos se cultivan en el medio de la invención. Las condiciones para el crecimiento dependerán de, por ejemplo, la línea celular que se está usando y el producto a producir, pero se podrá determinar fácilmente usando el conocimiento disponible en la técnica.

Para este fin, la presente invención también proporciona el uso de un medio de cultivo que comprende hierro a concentraciones en el medio de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 3,2 mg/L, donde dicho medio no contiene transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante sintético lipófilo que contiene nitrógeno, para la preparación de un producto celular de mamífero.

Los procedimientos para el aislamiento del producto celular que se produce a partir de las células de mieloma y/o medio de cultivo son bien conocidos y están en la práctica habitual en la técnica.

Todas las referencias mencionadas en este documento se incorporan expresamente como referencia en su totalidad. Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito junto con las realizaciones anteriores, se pretende que la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustren y no limiten el alcance de la invención. Serán evidentes otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance de la invención para aquellos expertos en la materia a la que pertenece la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 El citrato de amonio férrico (FAC) a 0,2 mg/L es capaz de soportar el crecimiento continuo de líneas celulares GS-NSO Procedimientos

Se centrifugó y resuspendió una línea celular de mieloma de ratón GS-NSO recombinante (línea celular A) que expresa un anticuerpo IgG humano usando el sistema de expresión de glutamina sintetasa (GS) (descripción de la Patente Europea Nº 2560550) previamente subcultivada en un medio sin suero patentado (medio GSF) que contenía una fuente quelada de hierro en un medio sin quelante. Las células resuspendidas en este medio se usaron después para inocular matraces experimentales a una densidad de inoculación de 2 x 10^{5} células/ml.

El experimento se realizó usando matraces Erlenmeyer de 250 ml (volumen de trabajo entre 20 y 50 ml) con tapones ventilados, incubados en un agitador recíproco a 36,5ºC y 125 rpm con una atmósfera de CO_{2} al 5%/aire al 95% y humedad del 75%.

Los matraces individuales que contenían medio CDSS modificado se suplementaron usando soluciones stock de FAC para dar matraces que contenían FAC a las concentraciones finales de 0,2, 0,4, 1, 2, 10, 50 y 100 mg/L. Las soluciones stock de FAC se prepararon en agua a concentraciones de 0,5 (para matraces que contenían de 0,2 a 2 mg/L de FAC) y 25 mg/L (para matraces que contenían de 10 a 100 mg/L de FAC). Las soluciones stock se esterilizaron por filtración antes de la adición a los matraces.

Como control positivo se incluyó un matraz que contenía medio CDSS modificado suplementado con 1 mg/L de transferrina humana y 0,1 mg/L de FAC. Como control negativo se incluyó un matraz que contenía medio CDSS modificado sin transferrina o suplementos de FAC. Todos los matraces se suplementaron con concentrado lipídico de colesterol a 2 ml/L (Gibco) como fuente de colesterol. El concentrado lipídico de colesterol es una emulsión de colesterol y ácidos grasos complejados con ciclodextrina.

Los matraces se subcultivaron tres veces para minimizar cualquier efecto de retirar el hierro quelado almacenado del inóculo. Los matraces se subcultivaron por dilución con medio fresco de nuevo a 2 x 10^{5} células/ml a intervalos de 3 días. En los terceros matraces de subcultivo, se dejó proceder el ciclo de crecimiento completo hasta que se alcanzó una baja viabilidad (esto a menudo se conoce como sobrecrecimiento). Se realizaron recuentos celulares usando un contador de células Innovatis Cedex. El título de anticuerpo se determinó usando un ELISA tipo sándwich frente al patrón de IgG homóloga.

Resultados

La figura 1a muestra la concentración celular durante el subcultivo y el sobrecrecimiento final para el intervalo de concentraciones de FAC ensayadas. Esta figura demuestra claramente que el cultivo de control negativo no podía proliferar más allá del primer subcultivo. El cultivo que contenía 0,2 mg/L de FAC pudo proliferar después de la primera división, pero después fue incapaz de crecer adicionalmente. El hecho de que estos cultivos fueran capaces de crecer después de la inoculación inicial es probablemente un resultado del almacenamiento de hierro en la célula que requiere la eliminación por división celular.

La figura 1 también demuestra claramente que una concentración igual y superior a 0,4 mg/L podía soportar el crecimiento celular continuo en varios subcultivos y durante el cultivo de sobrecrecimiento. La figura 1c demuestra que en una réplica de este experimento, una concentración de FAC de 0,2 mg/L fue capaz de soportar el crecimiento celular continuo.

La figura 1b muestra el recuento celular y los datos de producción de anticuerpos para los cultivos de sobrecrecimiento de la primera de las réplicas. Esta figura demuestra que se conseguía un crecimiento equivalente al control que contiene transferrina, en términos de cantidad de células viables máxima y el área por debajo de la curva de crecimiento, con concentraciones de FAC de 1 mg/L y mayores. Esto indica que después de que se alcance un nivel umbral (1 mg/L), el crecimiento es en gran medida equivalente sobre un amplio intervalo de concentraciones de FAC. Sin embargo, a una concentración de FAC de 10 mg/L, se observó una pequeña cantidad de precipitado del color del óxido. A 50 y 100 mg/L, este precipitado se observó en cantidades mucho mayores. Este precipitado es supuestamente hidróxido de hierro como avisó Bertheussen (Cytotechnology 11: 219-231, 1993).

La figura 1b también muestra el título de anticuerpos determinado por ELISA tipo sándwich. Esto demuestra que en comparación con el control que contenía transferrina, los cultivos que contenían FAC produjeron al menos tanto, y en la mayoría de los casos significativamente más anticuerpo. El título de anticuerpos obtenido en los cultivos que contenían FAC también mostró una relación inversamente proporcional con la concentración de FAC, por ejemplo, el cultivo que contenía 0,4 mg/L de FAC produjo más de un 30% más anticuerpo que el cultivo que contenía 100 mg/L de FAC.

Ejemplo 2 Se requiere citrato férrico (FC) a una concentración un orden de magnitud mayor que FAC con el fin de soportar el crecimiento continuo de líneas celulares GS-NSO Procedimientos

La metodología del ejemplo 2 fue idéntica a la del ejemplo 1, siendo la única excepción la fuente de hierro quelado. En este ejemplo, se usó citrato férrico (FC) en lugar de FAC.

FC es sólo ligeramente soluble en agua fría. Para preparar soluciones stock de FC, por lo tanto, fue necesario disolver FC en agua mantenida a 80ºC, con agitación, durante hasta 2 horas. Las soluciones stock se prepararon a concentraciones de 0,5 (para matraces que contenían de 0,2 a 2 mg/L de FAC) y 10 mg/L (para matraces que contenían de 10 a 100 mg/L de FAC).

Resultados

La figura 2a muestra la concentración celular durante el subcultivo y el sobrecrecimiento final para el intervalo de concentraciones de FC ensayadas. Esto demuestra que el cultivo del control negativo y el cultivo que contenía 0,2 mg/L de FC no podían proliferar más allá del primer subcultivo. Los cultivos que contenían 0,4, 1 y 2 mg/L de FC fueron incapaces de proliferar más allá del segundo subcultivo. De esta manera, para las concentraciones ensayadas, se requiere FC a una concentración de 10 mg/L o mayor para soportar el crecimiento celular continuo durante varios subcultivos y durante el cultivo de sobrecrecimiento.

La figura 2b muestra el recuento celular y los datos de producción de anticuerpos para los cultivos de sobrecrecimiento. Esta figura demuestra que se conseguía un crecimiento equivalente al control que contenía transferrina, en términos de cantidad de células viables máxima y el área por debajo de la curva de crecimiento, con concentraciones de FC de 10 mg/L y mayores. Como con FAC, se observó un precipitado del color del óxido en cultivos que contenían 10 mg/L de FC o una concentración mayor.

La figura 2b también muestra el título de anticuerpo determinado por ELISA tipo sándwich. Esto demuestra que cuando se compara con el control que contiene transferrina, los cultivos que contenían FC produjeron al menos tanto, y en el caso de 10 mg/L de FC significativamente más anticuerpo. Como se observó con FAC, la concentración más baja de FC dio el título mayor.

Este resultado demuestra que para soportar un crecimiento celular equivalente al observado con transferrina, se requiere FC a una concentración 10 veces mayor que FAC.

Ejemplo 3 Las líneas celulares de hibridoma requieren FAC a una concentración en exceso de dos órdenes de magnitud mayor que las líneas celulares GS-NSO para obtener crecimiento celular continuo en cultivo en suspensión agitado Procedimientos

La metodología del ejemplo 3 fue idéntica a la del ejemplo 1, con las siguientes excepciones:

Se usó una línea celular de hibridoma de ratón (9E10), que producía anticuerpo anti-Myc, previamente subcultivada en CDSS modificado suplementado con 1 mg/L de transferrina humana y glutamina 6 mM para inocular matraces experimentales a una densidad de inoculación de 1x10^{5} células/ml.

El experimento se realizó usando matraces Erlenmeyer de 250 ml con tapones precintados incubados en un agitador recíproco a 36,5ºC y 125 rpm. Los matraces se gasificaron inicialmente y a intervalos de 2 días con 5% de CO_{2}/95% de Aire.

Los matraces no se suplementaron con concentrado lipídico de colesterol, ya que esta línea celular de hibridoma no requiere colesterol.

Los matraces se subcultivaron por dilución con medio fresco de nuevo a 1x10^{5} células/ml a intervalos de 3 días. En el tercer subcultivo, se permitió el sobrecrecimiento en los matraces. Los recuentos celulares se realizaron usando un procedimiento de exclusión de azul tripán.

Resultados

La figura 3a muestra la concentración celular durante el subcultivo y el sobrecrecimiento final para el intervalo de concentraciones de FAC ensayadas. Esto demuestra que el cultivo del control negativo y los cultivos que contenían 0,2 y 0,4 mg/L de FAC no podían proliferar más allá del primer subcultivo. Los cultivos que contenían 1, 2 y 10 mg/L de FAC fueron incapaces de proliferar más allá del segundo subcultivo. Por lo tanto, para las concentraciones ensayadas, se requiere FAC a una concentración de 50 mg/L o mayor para soportar el crecimiento.

La figura 3b muestra el recuento celular de cultivos de sobrecrecimiento. Esta figura demuestra que para obtener un crecimiento equivalente al control que contenía transferrina, en términos de cantidad de células viables máxima, se requería una concentración de 100 mg/L de FAC. Sin embargo, si se considera el crecimiento en términos de la integral del área por debajo de la curva de crecimiento (calculada por suma de las áreas aproximadas a un trapecio de ángulo recto), o células/horas acumulativas (CCH), se observa un crecimiento equivalente al control que contiene transferrina a 50 mg/L de FAC. Esto se muestra claramente en el diagrama de barras que muestra la CCH máxima (figura 3c). Como se ha observado previamente, se vio un precipitado del color del óxido en cultivos que contenían 50 y 100 mg/L de FAC.

Este resultado demuestra que para el crecimiento celular continuo en cultivo en suspensión agitado, las líneas celulares de hibridoma requieren FAC a una concentración más de 100 veces mayor que las células GS-NSO.

Ejemplo 4 FAC es una fuente eficaz de hierro cuando se usa en un medio rico capaz de soportar el crecimiento celular y los títulos de anticuerpos a niveles elevados

El ejemplo 4 muestra adicionalmente la utilidad de FAC como fuente de hierro. En este ejemplo se usa FAC como única fuente de hierro en un medio sin suero patentado (que contiene albúmina de suero bovino [BSA] como único componente no definido), conocido como GSF, usando una segunda línea celular GS-NSO recombinante, que produce anticuerpos (línea celular B).

Procedimientos

Se centrifugaron y resuspendieron células previamente cultivadas en un medio sin suero patentado que contenía tropolona 10 \muM (un quelante de hierro lipófilo (véase WO94/02592) y 0,4 mg/L de FAC como fuente de hierro, en medio GSF sin suero sin tropolona y hierro. Las células resuspendidas en este medio se usaron después para inocular matraces experimentales a una densidad de inoculación de 2x10^{5} células/ml.

El experimento se realizó usando matraces Erlenmeyer de 250 ml (volumen de trabajo de 50 ml) con tapones precintados incubados en un agitador recíproco a 36,5ºC y 125 rpm. Los matraces se gasificaron inicialmente y a intervalos de 2 días con 5% de CO_{2}/95% de Aire.

Los matraces individuales que contenían medio GSF (sin tropolona y hierro) se suplementaron usando una solución stock de 1 mg/ml de FAC para dar matraces que contenían FAC a concentraciones finales de 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 y 2 mg/L. La solución stock se esterilizó por filtración antes de la adición a los matraces. Se incluyó un matraz que contenía medio suplementado con tropolona 5 \muM y 0,4 mg/L de FAC (que, como se ha demostrado previamente, es equivalente a transferrina) como control positivo.

Todos los matraces también se suplementaron con 1 ml/L de un suplemento de colesterol y ácidos grasos (CLOC) concentrado 1000x.

Los matraces se subcultivaron por dilución con medio fresco de nuevo a 2x10^{5} células/ml a intervalos de 5 días. En el segundo subcultivo, se permitió que los matraces sobrecrecieran hasta la saturación. Los recuentos celulares se realizaron usando el procedimiento de exclusión de azul tripán. El análisis del título de anticuerpos se realizó usando hplc analítica con proteína A frente a un patrón homólogo.

Resultados

La figura 4 muestra la concentración celular durante el subcultivo y el sobrecrecimiento final para el intervalo de concentraciones de FAC ensayadas. Esta figura demuestra que el medio que contenía FAC a concentraciones de 0,8 mg/L y mayores podía soportar un crecimiento equivalente al observado en el cultivo de control positivo. La figura 4 también muestra la producción de anticuerpos en los cultivos de sobrecrecimiento. Esto demuestra que FAC a una concentración de 0,8 mg/L y mayor fue capaz de soportar la producción de anticuerpos de una forma al menos equivalente al control. Las tendencias en la producción de anticuerpos también fueron muy similares a las observadas en los ejemplos 1 y 2.

Este resultado demuestra que FAC es eficaz cuando se usa en medio rico capaz de soportar el crecimiento celular y títulos de anticuerpos a elevados niveles.

Ejemplo 5 El medio que contiene FAC como fuente de hierro es capaz de soportar el crecimiento y la producción de anticuerpos en una versión a menor escala de un sistema de producción Procedimientos

Se realizaron fermentaciones de la línea celular B usando medio sin suero GSF que contenía tropolona 5 \muM y 0,4 mg/L de FAC (control), ó 1,0 mg/L de FAC. Las fermentaciones se realizaron en fermentadores Applikon de 7 L (volumen de trabajo de 4,5 L) equipados con un fondo hemisférico y agitados a 150 rpm usando un propulsor marino. Las fermentaciones se realizaron a 36,5ºC, pH 7,1 y se rociaron con aire/oxígeno para mantener una tensión de oxígeno disuelto del 15%.

El inóculo para estas fermentaciones se proporcionó por subcultivo de las células en medios homólogos a los usados en las fermentaciones.

Resultados

La figura 5 demuestra que se observaron características de crecimiento y producción celular similares cuando se usó medio suplementado con tropolona 5 \muM/0,4 mg/L de FAC (control) o 1 mg/L de FAC en recipientes de fermentación agitados, rociados.

Este resultado demuestra la utilidad de FAC como fuente de hierro en una versión a menor escala del sistema de producción.

Ejemplo 6 FAC puede soportar el crecimiento a elevadas densidades celulares y la producción a elevados títulos en medio sin proteínas Procedimientos

Se realizó una comparación de medio GSF sin suero (que contiene proteínas [BSA]) y medio GSF sin proteínas, conteniendo cada uno 1 mg/L de FAC, usando fermentadores semicontinuos, rociados y agitados de la línea celular A (véase el ejemplo 1). Las fermentaciones sin proteína se suplementaron con 2 ml/L de concentrado lipídico de colesterol (véase el ejemplo 1), y las fermentaciones sin suero se suplementaron con 1 ml/L del suplemento CLOC (véase el ejemplo 4). Las condiciones de fermentación fueron las descritas en el ejemplo 5. El inóculo para estas fermentaciones fue proporcionado por subcultivo de las células en medios iguales a los usados en las fermentaciones.

Resultados

La figura 6 muestra el crecimiento y producción de anticuerpos en las dos fermentaciones. Esta figura demuestra claramente que FAC es capaz de soportar un buen crecimiento y producción de anticuerpos en ambos medios.

Este resultado demuestra la capacidad de FAC de soportar el crecimiento a elevadas densidades celulares y la producción a títulos elevados en medio que contiene proteínas (es decir, sin suero) y sin proteínas.

Ejemplo 7 FAC en medio sin proteínas puede soportar el crecimiento a elevadas densidades celulares y producción a elevados títulos

El siguiente ejemplo ilustra que FAC puede usarse como única fuente de hierro en el medio sin proteínas del ejemplo 6 y que este medio suplementado con FAC puede soportar el crecimiento a elevadas densidades celulares y a elevados títulos para una serie de líneas celulares GS-NSO y a escala de fabricación.

Procedimientos

Se revivieron tres líneas celulares GS-NSO que expresaban diferentes anticuerpos (líneas celulares C, D y E) a partir de un almacenamiento en nitrógeno líquido directamente en el medio sin proteínas, que contenía FAC del ejemplo 6. Los cultivos se subcultivaron múltiples veces en el medio sin proteínas que contenía FAC y estos cultivos se usaron para inocular fermentaciones semicontinuas a escala experimental (4,5 L) o piloto. El medio y suministro usados en estas fermentaciones semicontinuas se optimizaron para proporcionar elevados títulos de anticuerpo.

La línea celular C se cultivó a escala de 4,5 y 100 L, la línea celular D a escala de 4,5 L y la línea celular E a escala de 100 L.

Resultados

La Figura 8A muestra el crecimiento y producción de anticuerpos de la línea celular C en fermentaciones de 4,5 L.

La Figura 8B muestra el crecimiento y producción de anticuerpos de la línea celular C en fermentaciones de 100 L.

Las figuras 9 y 10 muestran el crecimiento y la producción de anticuerpos de la línea celular D en fermentaciones de 4,5 L y la línea celular E en fermentaciones de 100 L, respectivamente.

Estas figuras muestran claramente que el medio FAC sin proteínas soporta un buen crecimiento de, y productividad de anticuerpos en, una amplia serie de líneas celulares, y a escala de fabricación.

Estos resultados demuestran la capacidad de FAC de soportar el crecimiento y producción de anticuerpos de una amplia serie de líneas celulares en un medio sin proteínas y sin componentes de origen animal definidos químicamente. Esto tiene importancia en el uso de anticuerpos para uso terapéutico humano, ya que eliminará el riesgo de introducir agentes infecciosos adventicios derivados de compuestos de origen animal.

Ejemplo 8 La capacidad de NSO de crecer usando FAC como única fuente de hierro no se debe a la transfección con el sistema de selección GS

Se usó una línea celular de mieloma de ratón NSO recombinante que expresaba anticuerpos humanos y se seleccionó usando un sistema de selección G418 para evaluar la capacidad de FAC de soportar el crecimiento de células NSO transfectadas con una alternativa al sistema de selección GS.

Procedimientos

Se subcultivaron células cultivadas en medio GSF sin suero que contenía 1 mg/L de transferrina, 0,1 mg/L de FAC y glutamina 6 mM por dilución de nuevo a 2x10^{5} en medio GSF fresco sin suero que contenía 1 mg/L de FAC, o 1 mg/L de transferrina y 0,1 mg/L de FAC. Después de 5 días, se subcultivaron los matraces y después se permitió que continuaran el ciclo de crecimiento completo. El experimento se realizó en matraces de agitación con tampones precintados incubados en un agitador recíproco a 36,5ºC y 125 rpm. Los matraces se gasificaron inicialmente y a intervalos de dos días con 5% de CO_{2}/95% de Aire.

Resultados

Se observó un crecimiento equivalente en ambos medios, indicando que FAC es capaz de soportar el crecimiento de células NSO transfectadas usando un sistema de selección alternativo.

Este resultado demuestra que la capacidad de NSO de crecer usando FAC como única fuente de hierro no se debe a la transfección con el sistema de selección GS.

Ejemplo 9 Preparación de medios CDSS modificados

Se preparó CDSS modificado del siguiente modo:

A 1 L de DMEM/F12 (1:1) (Gibco BRL. líquido 1x, nº cat. 21331), agitado usando un agitador magnético, se le añadieron los siguientes componentes en el siguiente orden, teniendo cuidado de asegurarse que cada uno se disolviera completamente antes de la adición del siguiente:

\circ

1 g de Pluronic F-68 (Sigma P-1300)

\circ

selenita sódica anhidra 50 nM (Sigma S-5261) (de una solución stock 25 \muM).

\circ

sulfato de zinc heptahidrato 2 \muM (Sigma Z-0251) (a partir de una solución madre 2 mM)

\circ

0,5 ml de oligoelementos I de Clevelands (Cellgro 99-175)

\circ

1 ml de oligoelementos II de Clevelands (Cellgro 99-176)

\circ

etanolamina 20 \muM (Sigma E-0135)

\circ

40 ml de suplemento GS (JRHBiosciences 58672)

\circ

1,3 g de hidrógeno carbonato sódico (BDH 102475W)

\circ

3,6 ml de ácido clorhídrico 2 M (BDH 190675T)

Para las líneas celulares dependientes de glutamina, solamente:

\circ

0,88 g de glutamina (Sigma G-5763)

Para el medio de control que contenía transferrina, solamente:

\circ

0,1 mg de citrato de amonio férrico (BDH 271634K) (a partir de una solución stock de 1 mg/ml), y

\circ

1 mg de transferrina humana (Serologicals Proteins 82-349).

Se permitió que los medios se mezclaran y después se filtraron usando una membrana de 0,2 \mum.

El compuesto de hierro soluble, tal como el citrato de amonio férrico, se añade al medio anterior a partir de soluciones madre durante la preparación, es decir, simultáneamente con los otros ingredientes, o una vez que se ha preparado el medio.

Claims (15)

1. Procedimiento para el cultivo in vitro de una línea celular de mieloma, que comprende:

(a) inocular un medio de cultivo con una línea celular de mieloma, dicho medio siendo capaz de soportar el crecimiento de dicha línea celular de mieloma y comprendiendo hierro a concentraciones en el medio de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 3,2 mg/L, donde dicho medio no contiene transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante sintético lipófilo que contiene nitrógeno; y

(b) hacer crecer el medio de cultivo inoculado en condiciones apropiadas y usando cultivo en suspensión agitado.

2. Uso de un medio de cultivo para soportar el crecimiento in vitro de una línea celular de mieloma en condiciones de cultivo en suspensión agitado, donde el medio de cultivo comprende hierro a concentraciones en el medio de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 3,2 mg/L, donde dicho medio no comprende transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante sintético lipófilo que contiene nitrógeno.

3. Proceso para obtener un producto celular de mamífero que comprende cultivar una célula de mieloma capaz de producir dicho producto en un cultivo en suspensión agitado y en un medio de cultivo capaz de soportar el crecimiento de dicha línea celular de mieloma, comprendiendo dicho medio hierro a concentraciones en el medio de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 3,2 mg/L, donde dicho medio no contiene transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante sintético lipófilo que contiene nitrógeno; y recuperar dicho productor celular de mamífero.

4. Procedimiento de la reivindicación 1, uso de la reivindicación 2 o proceso de la reivindicación 3, donde la concentración de hierro en el medio es de aproximadamente 0,03 mg/L a aproximadamente 2,4 mg/L, por ejemplo de aproximadamente 0,064 mg/L a aproximadamente 1,6 mg/L, por ejemplo de aproximadamente 0,16 mg/L a aproximadamente 0,32 mg/L.

5. Procedimiento, uso o proceso de la reivindicación 4, donde la fuente de hierro es un compuesto de hierro soluble, donde por ejemplo el compuesto de hierro soluble se selecciona entre sales ferrosas o férricas o quelatos simples de las mismas, por ejemplo donde el compuesto de hierro soluble se selecciona entre sulfato ferroso, citrato ferroso, citrato férrico y compuestos de amonio férricos, opcionalmente donde el compuesto de amonio férrico puede seleccionarse entre citrato de amonio férrico, oxalato de amonio férrico, fumarato de amonio férrico, malato de amonio férrico y succinato de amonio férrico.

6. Procedimiento, uso o proceso de la reivindicación 5, donde el compuesto de amonio férrico es citrato de amonio férrico.

7. Procedimiento para el cultivo in vitro de una línea celular de mieloma, que comprende:

(a) inocular un medio de cultivo con una línea celular de mieloma, dicho medio siendo capaz de soportar el crecimiento de dicha línea celular de mieloma y que comprende citrato de amonio férrico a una concentración en el medio de aproximadamente 0,2 mg/L a aproximadamente 20 mg/L, donde dicho medio no contiene transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante sintético lipófilo que contiene nitrógeno; y

(b) hacer crecer el medio de cultivo inoculado en condiciones apropiadas y usando cultivo en suspensión agitado.

8. Uso de un medio de cultivo para soportar el crecimiento in vitro de una línea celular de mieloma en condiciones de cultivo en suspensión agitado, donde el medio de cultivo comprende citrato de amonio férrico a una concentración en el medio de aproximadamente 0,2 mg/L a aproximadamente 20 mg/L, donde dicho medio no comprende transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante sintético lipófilo que contiene nitrógeno.

9. Proceso para obtener un producto celular de mamífero que comprende cultivar una célula de mieloma capaz de producir dicho producto en cultivo en suspensión agitado en un medio de cultivo capaz de soportar el crecimiento de dicha línea celular de mieloma, comprendiendo dicho medio citrato de amonio férrico a una concentración en el medio de aproximadamente 0,2 mg/L a aproximadamente 20 mg/L, donde dicho medio no contiene transferrina, un quelante lipófilo, un quelante sintético que contiene nitrógeno o un quelante sintético lipófilo que contiene nitrógeno; y recuperar dicho producto celular de mamífero.

10. Procedimiento de la reivindicación 7, uso de la reivindicación 8 o proceso de la reivindicación 9, donde el citrato de amonio férrico está presente en el medio a una concentración de aproximadamente 0,2 mg/L a aproximadamente 15 mg/L, por ejemplo a una concentración de aproximadamente 0,4 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, por ejemplo a una concentración de aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2 mg/L.

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11. Procedimiento, uso o proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el medio carece de suero, de proteínas, de componentes de origen animal o está definido químicamente.

12. Procedimiento, uso o proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la línea celular de mieloma se selecciona entre el grupo compuesto por una serie NSO, una serie P3, una serie MOPC, MPC-11, J558L, K6H6/B5, 45.6.TG1.7, Y0, Y3 HTK, RPMI 8226 y U266B1.

13. Procedimiento, uso o proceso de la reivindicación 12, donde la línea celular de mieloma es una línea celular NSO.

14. Proceso de la reivindicación 3 ó 9, donde el producto celular se selecciona entre el grupo que consiste en polipéptidos, proteínas, hormonas, linfoquinas, interleuquinas y enzimas útiles industrial y terapéuticamente.

15. Proceso de la reivindicación 14 donde el producto celular es un anticuerpo o fragmento del mismo.