JPH06500918A - 哺乳動物細胞の培養用培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物細胞の培養用培地 発明の分野 本発明は細胞培養培地の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は哺乳動物細胞 培養培地の分野に関する。

発明の背景 塩類、糖類、アミノ酸類、およびビタミン類の基礎栄養混合物以外に、試験管内 細胞は、増殖のためには、はっきりとされていない生物学的流動体またはエキス の補足も必要とすることが判明している。利用可能性および貯蔵容易性のために 、最も通常に使用される補足物は血清である。

しかしながら、細胞培養培地での血清の使用にはい（つかの不利がある。血清は 比較的高価である。血清ははっきりとした成分ではないので、異なるロットの血 清は、存在する化合物の濃度が変動する可能性があり、かくして予期しない培養 増殖の結果となる。また、血清はウィルスまたはマイクプラズマで汚染され得る 。血清中の蛋白は培養培地からの細胞産物の精製を複雑化する。

含血清培地の不利を解消しようとする努力において、研究者は、血清の代わりに 、はっきりとした、ないしはよく特徴付けられた成分で置き換えることにより、 無血清培地を提供しようと試みてきた。不幸にも、血清の複雑性と、異なるタイ プの細胞の異なる増殖要件は、かかる培地の提供を困難なものとしてきた。哺乳 動物細胞培養のための無血清培地に関する総括ついては、リッジノ（Ｒｉｚｚｉ ｎｏ）ら、（１９７９）　［はっきりとした培地ならびに培養哺乳動物細胞の栄 養的およびホルモン的要件の決定（Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｍｅｄｉａ　ａｎｄ　ｔｈ ｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌａｎｄ　Ｂｏ ｒｍｏｎａｌ　Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ ｌｓ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）Ｊ、ニュートリ塔■ ン・レビューズ（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）、旦ユニ　３６９−３ ７８　；バルネスおよびサト（Ｂａｒｎｅｓ　ａｎｄ　５ａｔｏ）（１９８０） 　ｒ無血清細胞培地、統一化アプローチ（Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ　Ｃｅ１ｌ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ：ａ　Ｕｎｉｆｙｉｍｇ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）Ｊ、セル（Ｃｅｌｌ ）、λ２：６４９−６５５：パル不スおよびサト（Ｂａｒｎｅｓ　ａｎｄ　５ａ ｔｏ）（１，９８０）　ｒ無血清培地における培養細胞の増殖法（Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｆｏｒ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｊ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｓｅ ｒｕｍ−Ｆｒｅｅ１ｉｅｄｉ＋Ｊｍ）Ｊ　、アナリティカル・バイオケミストリ ー（＾ｎａＬｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　１旦λ　２２５−２７０：および ボデカー（Ｂｏｄｅｋｅｒ）ら、（１９８５）ｒ接着性細胞系１ｍ−’）イテノ 無血清培養培地の開発スクリーニング法（Ａ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏ ｄ　Ｔｏ　ＤｅｖｅｌｏｐＳｅｒｕａ＋−Ｆｒｅｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉ ａ　Ｆｏｒ　Ａｄｈｅｒｅｎｔ　ＣｅＬｉ　Ｌｉｎｅｓ）Ｊ　、ディベロップ− パイオル・スタンダード（Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａｒｄ、 　）旦０：９３−１００を参照されたし。

チェセベフおよびパディウ（Ｃｈｅｓｓｅｂｅｕｆ　ａｎｄ　Ｐａｄｉｅｕ）ｌ ：１９８８年１１月２２日に発行された米国特許第４７８６５９９号は、６種の 脂肪酸およびアルブミンまたはデキストランの混合物を含有する無血清動物組織 培養培地を開示している。

該培地は、特に、細胞系、特にミエローマおよびハイブリドーマ細胞系を得るた めに、可能にはホルモンおよび／または成長因子の存在下で、ラット肝臓上皮細 胞の初代培養に適用される。

チャイニーズ・ハムスター・オバリー細胞（ＣＨＯ）の無血清培養用培地が報告 されている。ガサ−（Ｇａｓｓｅｒ）ら（１９８５）は、イン・ビトロ・セリュ ーラー・アンド・ディベロブメンタル・バイオロジー（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ １ｌｕｌａｒ　＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）λ１：５８８ −５９２において、ＣＨＯ細胞の培養用の無血清培地を開示している。該無血清 培地は、トランスフェリン、インスリン、およびセレンを補足したハム（Ｈａｍ ）のＦ１２および修正イーグル最小必須培地の１＝１混合物よりなる。メンディ アス（Ｍｅｎｄｉａｚ）ら（１９８６）は、イン・ビトロ・セリューラー・アン ド・ディベロプメンタル・バイオロジー（Ｉｎ　Ｖｉｔｒ。

Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）λ２　 ：　６６−７４において、インスリン、および硫酸第２鉄またはトランスフェリ ン、セレン、微量元素、塩化カルシウム、グルタミン、リノール酸、非必須アミ ノ酸、およびインスリンを補足した基礎培地よりなるＣＨＯ細胞の培養用無血清 培地を開示している。

ピエトルズコフスキイ（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉ）ら（１９８８）［）オリア ・ヒストケミ力・工・シトビオロッカ（Ｆｏｌｉａ　Ｈｉｓｔｏｃｈａ＋＋ｉｃ ａ　ｅｔ　Ｃｙｔｏｌ）ｉｏｌｏｇｉｃａ）　２６　＋１２３−１３２］は、デ キストランを含有するニワトリ胚細胞の培養用無血清培地を報告している。ビエ トルズコフスキイおよびコロホダ（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉ　ａｎｄＫｏｒｏ ｈｏｄａ）　（１９８８）　［）ｔ　Ｊア・ヒストナミカーエーントビオグロジ 力（Ｆｏｌｉａ　ＨｉｓｔｏｃｈｅＩＩＩｉｃａ　ｅｔ　ＣｙｔｏｂｉｏｉＯｇ ｉｃａ）　２６　：１４３−１５４　］は、ニワトリ胚線維芽細胞の培養用のデ キストランを含何する無血清培地を報告している。これらの２つの文献において 、デキストランを培地に添加して細胞の付着および伸展を促進している。

オーモリ（Ｏｈｍｏｒｉ）　（１９８８）　［ジャーナル・オブ・イミュノロジ カル、メソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉａ＋ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ）　１１２　：　２２７−２３３　］は、培養したマウスリンパ球に よる第一次抗体反応を支持できる無血清培地を報告している。この培地はβ−ン クロデキストリン、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、低密度リポ蛋 白、プトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）およびアラニンを補足した基礎培地に 基づく。

本発明の目的は哺乳動物細胞培養用の無血清培地を提供することにある。また、 本発明の目的は、生成収率を増大させる組換え産物を生産するように形質転換し た哺乳動物の培養用の無血清培地を提供することにある。さらに、本発明のもう １つの目的は、ＣＨ○細胞の培養用の無血清培地を提供することにある。

発明の概要 本発明は哺乳動物細胞の培養用培地を提供する。本発明は添付の請求の範囲で特 に指摘し、以下の記載においてその好ましい具体例を記載する。

発明の詳細な記載 本発明の培地は、哺乳動物の培養で有用である。本発明の培地はチャイニーズ・ ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞、およびＨＡＫ細胞、ベイビーハムスター 腎臓細胞系の培養で有用であることが判明した。本発明の培地はミエローマ細胞 系の培養には適当でないことが判明した。

細胞は本発明の無血清培地にてバッチ培養および連続培養で増殖させ得る。本発 明の培地で増殖させたＣＨＯ細胞は高細胞密度に達し、含血清培地で増殖させた ＣＨＯ細胞と比較して組換え産物の分泌の増大を示す。

本発明の培地は、哺乳動物細胞培養に設計した基礎培地に成分を添加することに よって調製する。該培地は細胞培養培地を調製するのに標準的な手法で調製され る。

適当な基礎培地は、ハムの培地、ウェイマウス（Ｗａｙｍｏｕｔｈ）Ｍ　Ｂ　７ ５２　／　１培地、イーグルの培地、ウィリアムス（１’ｉｌｌｉａｍｓ）のＥ 培地、１９９培地のごとき標準的な哺乳動物細胞培養培地ならびにＭＥＭおよび ＭＥＭαタイプの誘導培地およびこれらの培地のいずれの組合も包含する。また 、哺乳動物細胞の培養に用いる他の標準的な培地もまた本発明で適当である。好 ましい基礎培地は実施例１０基礎培地である。好ましい基礎培地は細胞増殖を支 持し、細胞培養間の培地における細胞集塊のサイズをおおいに減少させる。

イーストレイト（１’ｅａｓｔｏｌａｔｅ）のごとき酵母加水分解物は、１リツ トル当たり約１１ないし約１００グラム、好ましくは１リツトル当たり約５グラ ムの量で基礎培地に添加する。

アルブミンまたはデキストランは１リツトル当たり約０１ないし約５０グラムの 量で基礎培地に添加する。好ましくは、つ／血清アルブミンまたは約５００００ ０の分子量を有するデキストランいずれかを基礎培地に添加する。ウシ血清アル ブミンは好ましくは１すｌトル当たり約０１ないし約０．５グラムの量で添加す る。好ましくは、デキストランＴ５００のごとき約５０００００の分子量を存す るデキストランは１リツトル当たり約０．１ないし約１０グラムの量で基礎培地 に添加する。

インスリンは１ミリリツトル当たり約２．０ないし約２０ミリグラム、好ましく は、１リツトル当たり約１０ミリグラムの量で基礎培地に添加する。

トランスフェリンまたはトランスフニリン代替物は１ミリリツトル当たり約０な いし１０００マイクログラムの量で基礎培地に添加する。トランスフニリンは、 フエリンクフルクトース（１リツトル当たり約１０ないし約１０．０ミリグラム ）、クエン酸第二鉄（１リツトル当たり約１．０ないし約１００．０ミリグラム ）、または硫酸第一鉄（１リツトル当たり約５．０マイクロモルないし約２００ ０マイクロモル）と培地中にて置き換えることができる。

脂肪酸オレイン酸、リノール酸およびリルン酸の混合物は、培地１リツトル当た り、オレイン酸０６：リノール酸：リルン酸０．１４ミリグラムの比で基礎培地 に添加する。本発明の好ましい具体例において、脂肪酸のこの比率を保ちつつ、 オレイン酸は好ましくは１リツトル当たり約０．０１２ないし約０．１２ミリグ ラムの量で基礎培地に添加し、リノール酸は好ましくは１リツトル当たり約０． ２ないし約５．０ミリグラムの量で基礎培地に添加し：リルン酸は１リツトル当 たり約１０２８ないし約０．７ミリグラムの量で培地に添加する。コレステロー ルは１リツトル当たり約Ｏないし約１００ミリグラムの量で基礎培地に添加する 。

実施例２で詳細に記載する本発明の好ましい具体例において、塩化カルシウム（ ＣａＣ］□）（無水物）を１リツトル当たり約Ｏないし約２００ミリグラム、好 ましくは、１リツトル当たり約６６．６７ミリグラムの量で基礎培地に添加する 。硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水物）は１リツトル当たり約０ないし約 １００．０ミリグラム、好ましくは、１リツトル当たり約２４ミリグラムの量で 基礎培地に添加する。

培地のｐＨは好ましくは約６４８ないし約７４とする。該培地の容量オスモル濃 度は好ましくは約２８０ないし３６０ミリオスモルとする。

該基礎培地は４℃にて１年間粉末として保存できる。液状の完成した培地（補足 物を添加した基礎培地）は４℃で６力月間保存できる。

本発明の好ましい具体例を以下の実施例に記載する。

実施例１　基礎培地の調製 基礎培地の成分を混合し、ボールミルで粉砕して均質な粉末を処方する。次いで 、粉末化した培地を１０ＯＬのパケットに分配させ、４℃で貯蔵する。

基礎培地成分：ＭＲｌ　無血清培地 酸　分　ミリグラム／リットル 無機塩／微量元素 ＮａＣ１７０６６，３３３０００ ＫＣＩ　３４１．２００００Ｏ Ｎ　ａ　２　Ｐ　Ｏ４、Ｈ２０９３、３３３０００Ｍｇ５Ｏ４（無水物）　６． ５１００００Ｃｕ　Ｓ　Ｏ４・５Ｈ２００、ＯＯＯ８６６Ｆｅ（ＮＯ３）ｉ・９ Ｈ２００，００００３３Ｎａ２Ｓｅａ３（無水物）　０．１７２９０ＯＬ−アス パラギンＨ，０２８，３３６７０ＯＬ−ンステイン　ＨＣＩ・Ｈ２Ｏ４５，０４ ０００ＯＬ−ンステイン　ＦＢ　１３．３３３３００Ｌ−グルタミン酸　４６． ５６６７０ＯＬ−グルタミン　２９２．００００００グリシン　３５．８３３３ ０Ｏ Ｌ−ヒスチジン　ＨＣＩ・Ｈ２Ｏ２０，９８６７０ＯＬ−ヒスチジン　ＦＢ　５ ．０００００ＯＬ−イソロイシン　３５．４８００００Ｌ−ロイシン　４６．８ ３３３０Ｏ Ｌ−りンン　ＨＣＩ　６５．４８６６０ＯＬ−メチオニン　１１．４９３３００ Ｌ−フェニルアラニン　２０．６５３３０ＯＬ−プロリン　３４．８３３３０Ｏ Ｌ−セリン　１５．１６６７０Ｏ Ｌ−スレオニン　３３．３００００Ｏ Ｌ−）リプトファン　７．３４６７０ＯＬ−チロシン　２Ｎａ２Ｈ２０３６，７ ７６７０ＯＬ−バリン　３５．９０００００ ビタミン類／ＭＩＳＣ成分 デキストロース　４５００．００００００ブトレノン　２ＨＣＩ　０．０５３７ ００ピルビン酸ナトリウム　８１．６６６７００アスコルビン酸　１７．３３３ ３００ ビオチン　０．２０２４００ Ｄ−パントテン酸カル／ウム　０．１６００００パントテン酸ナトリウム　０． ３３７３３０コリンクロリド　５．４８６７００ 葉酸　１．１００００Ｏ Ｎａ２　アルファトコフ、Ｏ−ル　ＰＯ４０，００３３００グルタチオン（還元 型）　０．０１６７００メナシオン　Ｎａ　ビスルフニート　０．００３３００ ピリドキノン　ＭＣＩ　０．０２０７００ピリドキサール　ＭＣＩ　０．６６６ ７００リボフラビン　０．０７９３００ チアミン　ＨＣＩ　０．７８００００ ビタミンＡアセテート　０．０３３０００基礎培地の調製　許容量１００Ｌ 脱イオン化−蒸留水９０リツトルを計量して適当な混合容器に入れる。ボールミ ル粉砕した粉末化培地（前記参＠）の１の１０ＯＬパケット分を添加する。培地 のｐＨをＩＮ　ＨＣＩを用いて７２に調整する。培地の容量を水の添加によって １０ＯＬとする。次いで、０．２ミクロンの酢酸セルロース濾紙を用いるＭｌに 過によって培地を滅菌する。

実施例２　培地ＭＲ１−３の調製 培地ＭＨＩ−３は、５０００ｍｇ／］のＴ　ＣＹｅａｓｔｏｌａｔｅ（ディフコ （Ｄｉｆｃｏ）、デトロイト　ミシガン州）、５００ｍｇ／ｌウン血清アルブミ ン（ＢＳＡ）（アルモール（＾ｒ＋ａｏｕｒ）、カンカキ−、イリノイ州）、１ ０ｍｇ／］ウノ・インスリン（ワイタキ（Ｗａｉｔａｋｉ）、トロント、カナダ 国）、１０ｍｇ／ｌウン、トランスフェリン（ングマ・ケミカル・カンパニー（ Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）、セントルイス、ミズリー州）　、 ０．１２ｍｇ／１オレイン酸（アメレスコ（八ｍｅｒｅｓｃｏ）、クリーブラン ド、オハイオ州）　、０．２０ｍｇ／ｌリノール酸（アメレスコ（Ａｍｅｒｅｓ ｃｏ））、０．０２８ｍｇ／　］リルン酸（アメレスコ（Ａｍｅｒｅｓｃｏ）） 　、２　ｍ　ｇ／ｌコレステロール（アメレスコ（Ａｍｅｒｅｓｃｏ））　、　 ６６．６７　ｍ　ｇ／　］無水塩化カルシウム、および２４ｍｇ／Ｉ無水硫酸マ グネ／ウムを補足した実施例１の基礎培地を含有する。該培地は以下の如くに調 製する。

１００Ｌの最終容量につき １、脱イオン化−蒸留水９０リツトルを計り、適当な混合容器に入れる。

２、（実施例１からの）ボールミル粉砕培地の１つの１０ＯＬパケット分を添加 する。

３、　Ｍ、ｇｓｏ、（無水物）２．４グラムを添加し、溶解するまで混合する。

４、ＣａＣ］□（無水物）６７グラムを添加し、溶解するまで混合する。

５、　ＴＣＹｅａｓｔｏｌａτｅ５００グラムを添加し、溶解するまで混合する 。

６、ＢＳ、Ａ５０グラムを添加し、溶解するまで混合する。

７、ＮａＨＣ○３２２０グラムを添加し、溶解するまで混合する。

８、インスリン１グラム、トランスフェリン１グラム（またはフェリツクフルク トース１００ｍ１）を添加し、溶解するまで混合する。

９、オレイン酸１２ｍｇ、リノール酸２０ｍｇ、リルン酸２．８ｍｇ、およびコ レステロール２００ｍｇを無水エタノール１００ｍ１に溶解し、この脂肪酸混合 物を該混合容器に添加する。

１０．１Ｎ　ＨＣＩを用いてｐＨを７，２に調整する。

１１、容量を１００リツトルとし、徹底的に混合する。

１２、　０．２ミクロンの酢酸セルロース濾紙を用いて濾過滅菌する。

１３、容量オスモル濃度をチェックし、記録する。

１４．４℃で６力月まで保存する。

実施例３　培地ＭＲＩ−６の調製 培地ＭＨＩ−６は、５０００ｍｇ／　］　ＴＣＴｅａｓｔｏｌａｔｅ　（ディ７ 　：ｌ　（Ｄｉｆｃｏ）、デトロイト、ミシガン州）　、５００ｍｇ／Ｉウシ血 清アルブミン（アルモール（＾ｒ＋１ｏｕｒ）、カンカキ−、イリノイ州）、１ ０ｍｇ／ｌウシ・インスリン（ワイタキ（Ｖａｉｔａｋｉ）、トロント、カナダ 国）　、１０ｍｇ／ｌウシ・トランスフェリン（シグマ・ケミカル・カンパニー （Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）、セントルイス、ミズリー州）、 ０．１２ｍｇ／ｌオレイン酸（アメレスコ（Ａｍｅｒｅｓｃｏ））　、クリーブ ランド、オハイオ州）、０．２０ｍｇ／Ｉリノール酸（アメレスコ（Ａｍｅｒｅ ｓｃｏ））、０．０２８ｍｇ／ｌリルン酸（アメレスコ（Ａｍｅｒｅｓｃｏ）） 　、および２ｍｇ／Ｉコレステロール（アメレスコ（Ａｍｅｒｅｓｃｏ））を補 足した実施例１の基礎培地を含有する。該培地は、工程３および４を省略した以 外は実施例２の培地ＭＨＩ−３と同様に調製する。

この培地にはＭｇＳＯ４および ＣａＣＬは添加しない。

実施例４　培地ＭＲＩ−７の調製 培地ＭＲＩ−７は、５０００　ｍ　ｇ／　］　Ｔ　ＣＹｅａｓｔｏｌａｔｅ　（ ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、デトロイト、ミンガン州）　、１０００ｍｇ／ｌデキ ストランＴ−５００（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ビス力タウェイ、 ニューシャーシー州）、１０ｍｇ／］つ’ｙ−インスリン（ワイタキ（Ｗａｉｔ ａｋｉ）、トロント、カナダ国）　、１０ｍｇ／］ウノ・トランスフェリン（シ グマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｌＩａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）、 セントルイス、ミズリー州）　、０．１２ｍｇ／１オレイン酸（アメレスＤ　（ Ａｍｅｒｅｓｃｏ））、クリーブランド、オハイオ州）　、０．２０ｍｇ／ｌリ ノール酸（アメレスコ（八ｍｅｒｅｓｃｏ））　、０．０２８ｍｇ／　］リルン 酸（アメレスコ（Ａｍｅｒｅｓｃｏ））　、および２ｍｇ／ｌコレステロール（ アメレスコ（Ａｍｅｒｅｓｃｏ）　）を補足した実施例１の基礎培地を含有する 。工程３および４を省略し、工程６でデキストランＴ−２００がウシ血清アルブ ミンを置き換えた以外は実施例２における培地ＭＲＩ　３と同様にして培地ＭＲ Ｉ−７を調製する。工程６では、デキストランＴ−５００の１００グラムを添加 し、溶解するまで混合する。

寒１列５　細胞培養 可溶性Ｔ４、Ｔ−４リンパ球細胞レセプターの可溶性形！！（細胞系３７−８Ｏ Ｎ）を産生ずるように形質転換したＣＨＯ細胞を４種の異なる培地で培養した。

含血清培地アルファ（−）ＭＥＭ１５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、および実施例 ２．３、および４に記載した培地。培地１５０ｍ１を含む２５０ｍ１ＳＰフラス コに播種した後、１ミリリツトル当たり５ｘｌＯ’細胞を７日間培養した。合計 細胞数をＳｒ１のコールタ−カウンターで測定し、血球計を用いるトリバンブル ー染料排除によって生存活性を測定した。Ｓｒ１の濃度はエライヤ法に基礎を置 くアッセイによって測定した。播種２日後には、無血清培地は含血清培地よりも 多（の細胞数を示した。含血清培地では、はぼ１．３×１０６細胞があったのに 対して、無血清培地ではほぼ１．６Ｘ１０’細胞があった。

３ないし７日においては、有意により多くの細胞が含血清培地よりも無血清培地 に存在した。３日において、含血清培地ではほぼ２．４Ｘ１０’細胞が、無血清 培地ではほぼ３．３Ｘ１０’細胞があった。４日においては、含血清培地におけ る合計細胞数はわずかに約２．２５Ｘ１０’細胞に低下した。対照的に、無血清 培地における細胞数はＭＲＩ−７ではほぼ３．６　Ｘ　１０’細胞に、ＭＲＩ− ３では４．１×１０６細胞に、ＭＨＩ−６では４．３Ｘ１０’細胞に増加した。

７日までに、培地ＭＲＩ−７における合計細胞数はほぼ４．０Ｘ１０’細胞まで 増加し、他の培地における細胞数は４日におけるレベルに匹敵するレベルに止ど まった。

播種後３日までに、無血清培地で増殖させた細胞は、含血清培地で増殖させたは より顕著となった。７日においては、無血清培地で培養した細胞は培地１ミリリ ツトル当たり約７５ないし８７マイクログラムのｓＴ４を生産した一方、含血清 培地で培養した細胞は培地１ミリリツトル当たり約３５ミリグラムのｓＴ４を生 産した。

国際調査報告 輌瞳１１１１１６１！輯＾−”−”　ｐｃＴ／ｌ：ｓｑ＋１０６８１７フロント ページの続き フェニックスビル、ウェストリ・ソジ・ガーデンズ　１７３エイ番

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）哺乳動物細胞培養に設計した合成基礎培地：（ｂ）１リットル当たり 約０．１ないし約１０グラムの加水分解酵母；（ｃ）１リットル当たり約０．１ ないし約５グラムのデキストランまたはアルブミン； （ｄ）１リットル当たり約２ないし約２０ミリグラムのインスリン；（ｅ）１リ ットル当たり０ないし約１００ミリグラムのトランスフェリン、フェリックフル クトース、クエン酸第一鉄および硫酸第一鉄よりなる群から選択される化合物； および （ｆ）１リットル当たり脂肪酸の約０．６：１：０．１４ミリグラムの比のオレ イン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる脂肪酸成分よりなる無血清の哺乳 動物細胞培養培地。
2. ２．さらに１リットル当たり０ないし約１０ミリグラムのコレステロールよりな る請求の範囲第１項記載の無血清の哺乳動物細胞培養培地。
3. ３．さらに１リットル当たり０ないし約２００ミリグラムの無水塩化カルシウム および１リットル当たり０ないし約１００ミリグラムの無水硫酸マグネシウムよ りなる請求の範囲第１項記載の無血清の哺乳動物培養培地。
4. ４．該加水分解酵母をエリットル当たり約５グラムの量で培地に存在させる請求 の範囲第１項記載の培地。
5. ５．アルブミンを１リットル当たり約０．５グラムの量で該培地に存在させる請 求の範囲第１項記載の培地。
6. ６．該アルブミンがウシ血清アルブミンである請求の範囲第５項記載の培地。
7. ７．該デキストランを１リットル当たり約１グラムの量で該培地に存在させる請 求の範囲第１項記載の培地。
8. ８．該デキストランが約５０００００の分子量を有するデキストランである請求 の範囲第７項記載の培地。
9. ９．該インスリンを１リットル当たり約１０ミリグラムの量で培地に存在させる 請求の範囲第１項記載の培地。
10. １０．トランスフェリンを１リットル当たり約１０ミリグラムの量で存在させる 請求の範囲第１項記載の培地。
11. １１．オレイン酸を１リットル当たり約０．１２ミリグラムの量で存在させ；リ ノール酸を１リットル当たり約０．２０ミリグラムの量で存在させ；リノレン酸 を１リットル当たり約０．０２８ミリグラムの量で存在させる請求の範囲第１項 記載の培地。
12. １２．コレステロールを１リットル当たり約２ミリグラムの量で存在させる請求 の範囲第２項記載の培地。
13. １３．核塩化カリシウムを１リットル当たり約６６ないし６７ミリグラムの量で 存在させ；硫酸マグネシウムを１リットル当たり約２４ミリグラムの量で存在さ せる請求の範囲第３項記載の培地。
14. １４．（ａ）哺乳動物細胞培養に設計した合成基礎培地；（ｂ）１リットル当た り約５グラムの加水分解酵母；（ｃ）ユリットル当たり約１グラムのアルブミン ；（ｄ）１リットル当たり杓１０ミリグラムのインスリン；（ｅ）１ミリリット ル当たり約１０ミリグラムのトランスフェリン；（ｆ）１リットル当たり約０． １２ミリグラムのオレイン酸、１リットル当たり約０．２０ミリグラムのリノー ル酸および１リットル当たり約０．０２８ミリグラムのリノレンからなる脂肪酸 成分；および（ｇ）１リットル当たり約２ミリグラムのコレステロールよりなる 無血清の哺乳動物細胞培養培地。
15. １５．さらに１リットル当たり約６６ないし約６７ミリグラムの無水塩化カルシ ウム；および１リットル当たり約２４ミリグラムの無水硫酸マグネシウムよりな る請求の範囲第１４項記載の培地。
16. １６．（ａ）哺乳動物細胞培養に設計した合成基礎培地；（ｂ）１リットル当た り約５グラムの加水分解酵母；（ｃ）約５０００００の分子量を有する１リット ル当たり約１グラムのデキストラン； （ｄ）１リットル当たり約１０ミリグラムのインスリン；（ｅ）１リットル当た り約１０ミリグラムのトランスフェリン；（ｆ）１リットル当たり約０．１２ミ リグラムのオレイン酸、１リットル当たり約０．２０ミリグラムのリノール酸お よび１リットル当たり約０．０２８ミリグラムのリノレン酸からなる脂肪酸成分 ；および（ｇ）１リットル当たり約２ミリグラムのコレステロールよりなる無血 清の哺乳動物細胞培養培地。