CN108913647B - 一种干细胞培养基及其制备方法 - Google Patents
一种干细胞培养基及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种干细胞培养基及其制备方法，属于细胞培养技术领域，所述培养基包括基础培养基和添加剂，向所述基础培养基中添加的各添加剂及其浓度为：原花青素8‑10mg/mL、胆甾烯基豆蔻酸酯5‑10mg/mL、人参皂苷0.1‑0.5mg/mL、转铁蛋白0.1‑0.2mg/mL、人表皮细胞生长因子微球1.5×10‑3‑2×10‑3mg/mL、成纤维细胞生长因子微球1.5×10‑3‑2×10‑3mg/mL、棕榈酸0.7×10‑3‑1.2×10‑3mg/mL、胰岛素2×10‑3‑6×10‑3mg/mL、贻贝粘蛋白2×10‑5‑4×10‑5mg/mL，本发明的培养基不含动物血清，通过微球缓释作用使细胞平稳扩增。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种干细胞培养基及其制备方法。
背景技术
干细胞是一种具有自我复制能力，并且在一定条件下可以分化成多种功能细胞的多潜能细胞，因此干细胞在疾病治疗领域具有至关重要的作用，但是干细胞在正常成体组织中含量较低，需要在体外进行扩增和培养，因此如何在体外快速扩增与培养干细胞是干细胞治疗疾病的重要环节。
目前用于培养干细胞的培养基中一般都要加入胎牛血清，用于支持细胞生长、执行细胞的功能，但是由于血清组分不确定，并且含有大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的批次化、标准化带来困难，其次含动物血清的培养基无法规避动物血清中的异源体，并且容易诱导细胞分化，从而给细胞培养表达产品分离纯化和结果的重复性带来困难。
发明内容
针对上述背景，本发明旨在提供一种不含有动物血清的干细胞培养基，为了解决现有技术中存在的问题，本发明还提供干细胞培养基的制备方法。
本发明采用的技术方案是：一种干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，向所述基础培养基中添加的各添加剂及其浓度为：原花青素8-10mg/mL、胆甾烯基豆蔻酸酯5-10mg/mL、人参皂苷0.1-0.5mg/mL、转铁蛋白0.1-0.2mg/mL、人表皮细胞生长因子微球1.5×10-3-2×10-3mg/mL、成纤维细胞生长因子微球1.5×10-3-2×10-3mg/mL、棕榈酸0.7×10-3-1.2×10-3mg/mL、胰岛素2×10-3-6×10-3mg/mL、贻贝粘蛋白2×10-5-4×10-5mg/mL，所述人表皮细胞生长因子微球中人表皮细胞生长因子的负载量为6.72-7.15mg/g，所述成纤维细胞生长因子微球中成纤维细胞生长因子的负载量为6.45-7.02mg/g，所述基础培养基为DMEM/F12液体培养基。
优选地，所述人表皮细胞生长因子微球EGF-壳聚糖缓释微球，所述成纤维细胞生长因子微球为FGF-壳聚糖缓释微球，通过壳聚糖微球负载包覆细胞生长因子，一方面可以提高细胞生长因子对酸、热的稳定性，另一发面通过缓释微球可以使细胞生长因子在培养基中持续、平稳地释放，使细胞平稳扩增；其次，壳聚糖分子中带有游离氨基，在弱酸中溶解后呈阳离子性质，因此有助于细胞粘附生长。
本发明中加入的人表皮细胞生长因子微球和成纤维细胞生长因子微球主要用于促进干细胞的生长分裂，原花青素可以清楚自由基对细胞的伤害，胆甾烯基豆蔻酸酯、人参皂苷可以促进干细胞的增殖，转铁蛋白能够调节体内铁元素的代谢，且能与其他微量元素结合来调节干细胞的生长增殖，胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸的效率，从而加速蛋白质、脂肪酸等的合成，贻贝粘蛋白有助于细胞贴壁生长。
本发明还提供了上述干细胞培养基的制备方法，主要包括以下步骤：
S1、人表皮细胞生长因子微球的制备：将壳聚糖溶解在体积分数为2％的乙酸溶液中，乙酸溶液中壳聚糖的浓度为8-12mg/mL，然后在超声分散条件下，将人表皮细胞生长因子加入到壳聚糖乙酸溶液中，磁力搅拌2-3h后加入浓度为100-120mg/mL的硫胺素焦磷酸溶液，继续搅拌2-3h后离心分离、将沉淀反复漂洗后进行冷冻干燥即得到人表皮细胞生长因子微球，4℃下存放备用；
S2、成纤维细胞生长因子微球的制备：将壳聚糖溶解在体积分数为2％的乙酸溶液中，乙酸溶液中壳聚糖的浓度为8-12mg/mL，然后在超声分散条件下，将成纤维细胞生长因子加入到壳聚糖乙酸溶液中，磁力搅拌2-3h后加入浓度为100-120mg/mL的硫胺素焦磷酸溶液，继续搅拌2-3h后离心分离、将沉淀反复漂洗后进行冷冻干燥即得到成纤维细胞生长因子微球，4℃下存放备用；
S3、向基础培养基中加入原花青素、胆甾烯基豆蔻酸酯、人参皂苷、转铁蛋白、贻贝粘蛋白、S1步骤制备的人表皮细胞生长因子微球以及S2步骤制备的成纤维细胞生长因子微球，搅拌均匀后加入棕榈酸溶液和胰岛素溶液，继续啊搅拌至均匀后，静置得混合物；
S4、向S3步骤的混合物中加入质量分数为9-12％的碳酸钠溶液，调节培养基pH至6.5-7，最后灭菌即得干细胞培养基。
本发明提供一种干细胞培养基，与现有技术相比，具有以下有益效果：1、本发明的干细胞培养基组分确定，便于批次化和标准化，不添加动物血清，可以规避动物血清中的异源体；2、本发明中加入了人表皮细胞生长因子微球和成纤维细胞生长因子微球，通过壳聚糖微球负载包裹细胞生长因子，一方面可以提高细胞生长因子对酸、热的稳定性，另一发面通过缓释微球可以使细胞生长因子在培养基中持续、平稳地释放，使细胞平稳扩增。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
一种干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，所述基础培养基为DMEM/F12液体培养基，向所述DMEM/F12液体培养基中添加的各种添加剂种类及浓度如下所示：原花青素8mg/mL、胆甾烯基豆蔻酸酯5mg/mL、人参皂苷0.1mg/mL、转铁蛋白0.1mg/mL、人表皮细胞生长因子微球1.5×10-3mg/mL、成纤维细胞生长因子微球1.5×10-3mg/mL、棕榈酸0.7×10- 3mg/mL、胰岛素2×10-3mg/mL、贻贝粘蛋白2×10-5mg/mL，所述人表皮细胞生长因子微球中人表皮细胞生长因子的负载量为6.72mg/g，所述成纤维细胞生长因子微球中成纤维细胞生长因子的负载量为6.45mg/g，所述人表皮细胞生长因子微球EGF-壳聚糖缓释微球，所述成纤维细胞生长因子微球为FGF-壳聚糖缓释微球。
每升上述干细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
S1、人表皮细胞生长因子微球的制备：取10mg壳聚糖溶解在1mL体积分数为2％的乙酸溶液中，乙酸溶液中壳聚糖的浓度为10mg/mL，然后在超声分散条件下，将0.1mg的人表皮细胞生长因子加入到上述壳聚糖乙酸溶液中，磁力搅拌2h后加入1mL浓度为100mg/mL的硫胺素焦磷酸，继续搅拌2h后2000转离心分离5min，将沉淀用石油醚反复洗涤后，进行冷冻干燥24h即得到人表皮细胞生长因子微球，4℃下存放备用；
S2、成纤维细胞生长因子微球的制备：取10mg壳聚糖溶解在1mL体积分数为2％的乙酸溶液中，乙酸溶液中壳聚糖的浓度为10mg/mL，然后在超声分散条件下，将0.1mg的成纤维细胞生长因子加入到上述壳聚糖乙酸溶液中，磁力搅拌2h后加入1mL浓度为100mg/mL的硫胺素焦磷酸，继续搅拌2h后2000转离心分离5min，将沉淀用石油醚反复洗涤后，进行冷冻干燥24h即得到成纤维细胞生长因子微球，4℃下存放备用；
S3、称取原花青素8g、胆甾烯基豆蔻酸酯5g、人参皂苷0.1g、转铁蛋白0.1g、S1步骤的人表皮细胞生长因子微球1.5×10-3g、S2步骤的成纤维细胞生长因子微球1.5×10-3g、棕榈酸0.7×10-3g、胰岛素2×10-3g、贻贝粘蛋白2×10-5g；
S4、将S3步骤称取的棕榈酸用1mL的乙酸溶解得到棕榈酸溶液，将S3步骤称取的胰岛素同样用1mL的乙酸溶解得到胰岛素溶液；
S5、向DMEM/F12液体培养基加入S3步骤称取的原花青素、胆甾烯基豆蔻酸酯、人参皂苷、转铁蛋白、人表皮细胞生长因子微球、成纤维细胞生长因子微球、贻贝粘蛋白、搅拌均匀后加入S4步骤得到的棕榈酸溶液和胰岛素溶液，继续搅拌至均匀后，静置得混合物；
S6、向S5步骤的混合物中加入质量分数为10％的碳酸钠溶液，调节培养基pH至6.5，最后灭菌即得干细胞培养基。
实施例2
一种干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，所述基础培养基为DMEM/F12液体培养基，向所述DMEM/F12液体培养基中添加的各种添加剂种类及浓度如下所示：原花青素10mg/mL、胆甾烯基豆蔻酸酯10mg/mL、人参皂苷0.5mg/mL、转铁蛋白0.2mg/mL、人表皮细胞生长因子微球2×10-3mg/mL、成纤维细胞生长因子微球2×10-3mg/mL、棕榈酸1.2×10-3mg/mL、胰岛素6×10-3mg/mL、贻贝粘蛋白4×10-5mg/mL，所述人表皮细胞生长因子微球中人表皮细胞生长因子的负载量为7.15mg/g，所述成纤维细胞生长因子微球中成纤维细胞生长因子的负载量为7.02mg/g，所述人表皮细胞生长因子微球EGF-壳聚糖缓释微球，所述成纤维细胞生长因子微球为FGF-壳聚糖缓释微球。
实施例2的干细胞培养基的制备方法与实施例1的制备方法相同。
实施例3
一种干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，所述基础培养基为DMEM/F12液体培养基，向所述DMEM/F12液体培养基中添加的各种添加剂种类及浓度如下所示：原花青素9mg/mL、胆甾烯基豆蔻酸酯6mg/mL、人参皂苷0.3mg/mL、转铁蛋白0.2mg/mL、人表皮细胞生长因子微球2×10-3mg/mL、成纤维细胞生长因子微球2×10-3mg/mL、棕榈酸0.8×10-3mg/mL、胰岛素4×10-3mg/mL、贻贝粘蛋白3×10-5mg/mL，所述人表皮细胞生长因子微球中人表皮细胞生长因子的负载量为6.83mg/g，所述成纤维细胞生长因子微球中成纤维细胞生长因子的负载量为6.56mg/g，所述人表皮细胞生长因子微球EGF-壳聚糖缓释微球，所述成纤维细胞生长因子微球为FGF-壳聚糖缓释微球。
实施例3的干细胞培养基的制备方法与实施例1的制备方法相同。
对比例1
一种干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，所述基础培养基为DMEM/F12液体培养基，向所述DMEM/F12液体培养基中添加的各种添加剂种类及浓度如下所示：原花青素9mg/mL、胆甾烯基豆蔻酸酯6mg/mL、人参皂苷0.3mg/mL、转铁蛋白0.2mg/mL、人表皮细胞生长因子1.366×10-5mg/mL、成纤维细胞生长因子1.312×10-5mg/mL、棕榈酸0.8×10-3mg/mL、胰岛素4×10-3mg/mL、贻贝粘蛋白3×10-5mg/mL。
1L对比例1的培养基的制备方法包括以下步骤：
S1、称取原花青素9g、胆甾烯基豆蔻酸酯6g、人参皂苷0.3g、转铁蛋白0.2g、人表皮细胞生长因子1.366×10-5g、成纤维细胞生长因子1.312×10-5g、棕榈酸0.8×10-3g、胰岛素4×10-3g、贻贝粘蛋白3×10-5g；
S2、将S1步骤称取的棕榈酸用1mL的乙酸溶解得到棕榈酸溶液，将S3步骤称取的胰岛素同样用1mL的乙酸溶解得到胰岛素溶液；
S3、向DMEM/F12液体培养基加入S1步骤称取的原花青素、胆甾烯基豆蔻酸酯、人参皂苷、转铁蛋白、人表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、贻贝粘蛋白、搅拌均匀后加入S2步骤得到的棕榈酸溶液和胰岛素溶液，继续搅拌至均匀后，静置得混合物；
S4、向S3步骤的混合物中加入质量分数为10％的碳酸钠溶液，调节培养基pH至6.5，最后灭菌即得干细胞培养基。
对比例2
一种干细胞培养基，包括基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12液体培养基，所述DMEM/F12液体培养基中含有10％的胎牛血清。
实验一
将实施例3、对比例1以及对比例2的培养基用于培养造血干细胞，需要说明的是，所用造血干细胞是是从脐带血中按常规方法获得的。将造血干细胞分别接种到实施例3、对比例1以及对比例2的干细胞培养基上，调整培养基中造血干细胞的密度为1.8×105个/mL，然后将接种了干细胞的培养基置于37℃，5％CO2的培养箱中培养2天，每隔6小时测定一次细胞密度并记录，结果如表1所示。
表1流式细胞仪检测结果
表1中实施例3的培养基在24h时，细胞的密度已经达到42％，说明实施例3的培养基可以加速干细胞增殖，并且在48h时，细胞密度已经达到了90％，对比例1中的培养基在48h时，细胞密度只有52％，对比实施例3和对比例1可以看出，通过壳聚糖包裹细胞生长因子，可以提高细胞因子的稳定性，从而促进细胞增殖，并且可以通过缓释作用使细胞能够平稳扩增；将实施例3与对比例2相比说明实施例3的培养基相较于加入了胎牛血清的培养基，可以加快细胞生长增殖，缩短培养时间。
实验二
将实验一中实施例3、对比例2以及对比例2培养的细胞，通过流式细胞术分析G0/G1期、G2/M期细胞百分比，检测结果如表2所示。
表2流式细胞术检测结果
从表2可以看出，实施例3中处于G0/G1期细胞百分比大于对比例1和对比例1组，说明通过实施例3的培养基培养获得的活细胞数更多；另外实施例3中处于G0/G1期的细胞比远大于处于G2/M期的细胞比，说明实施例3的培养基可以使造血干细胞处于增殖状态而不分化，从而维持造血干细胞的干细胞特性。
实验三
将人体骨髓干细胞分别接种到实施例3、对比例1以及对比例2的干细胞培养基上，调整培养基中造血干细胞的密度为1.8×105个/mL，然后将接种了干细胞的培养基置于37℃，5％CO2的培养箱中培养2天，每隔6小时测定一次细胞密度并记录，结果如表3所示。
表3流式细胞仪检测结果
从表3可以看出，实施例3的培养基同样可以加速人体骨髓干细胞的增殖。
尽管实施例已经详细描述了本发明，但是本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂，向所述基础培养基中添加的各添加剂及其浓度为：原花青素8-10mg/mL、胆甾烯基豆蔻酸酯5-10mg/mL、人参皂苷0.1-0.5mg/mL、转铁蛋白0.1-0.2mg/mL、人表皮细胞生长因子微球1.5×10-3-2×10-3mg/mL、成纤维细胞生长因子微球1.5×10-3-2×10-3mg/mL、棕榈酸0.7×10-3-1.2×10-3mg/mL、胰岛素2×10-3-6×10-3mg/mL、贻贝粘蛋白2×10-5-4×10-5mg/mL；
所述人表皮细胞生长因子微球中人表皮细胞生长因子的负载量为6.72-7.15mg/g，所述成纤维细胞生长因子微球中成纤维细胞生长因子的负载量为6.45-7.02mg/g；
所述基础培养基为DMEM/F12液体培养基；
所述人表皮细胞生长因子微球为EGF-壳聚糖缓释微球，所述成纤维细胞生长因子微球为FGF-壳聚糖缓释微球；
所述人表皮细胞生长因子微球的制备：将壳聚糖溶解在体积分数为2％的乙酸溶液中，乙酸溶液中壳聚糖的浓度为8-12mg/mL，然后在超声分散条件下，将人表皮细胞生长因子加入到壳聚糖乙酸溶液中，磁力搅拌2-3h后加入浓度为100-120mg/mL的硫胺素焦磷酸溶液，继续搅拌2-3h后离心分离、将沉淀反复漂洗后进行冷冻干燥即得到人表皮细胞生长因子微球，4℃下存放备用；
所述成纤维细胞生长因子微球的制备：将壳聚糖溶解在体积分数为2％的乙酸溶液中，乙酸溶液中壳聚糖的浓度为8-12mg/mL，然后在超声分散条件下，将成纤维细胞生长因子加入到壳聚糖乙酸溶液中，磁力搅拌2-3h后加入浓度为100-120mg/mL的硫胺素焦磷酸溶液，继续搅拌2-3h后离心分离、将沉淀反复漂洗后进行冷冻干燥即得到成纤维细胞生长因子微球，4℃下存放备用。
2.一种如权利要求1所述的干细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
S1、人表皮细胞生长因子微球的制备：将壳聚糖溶解在体积分数为2％的乙酸溶液中，乙酸溶液中壳聚糖的浓度为8-12mg/mL，然后在超声分散条件下，将人表皮细胞生长因子加入到壳聚糖乙酸溶液中，磁力搅拌2-3h后加入浓度为100-120mg/mL的硫胺素焦磷酸溶液，继续搅拌2-3h后离心分离、将沉淀反复漂洗后进行冷冻干燥即得到人表皮细胞生长因子微球，4℃下存放备用；
S2、成纤维细胞生长因子微球的制备：将壳聚糖溶解在体积分数为2％的乙酸溶液中，乙酸溶液中壳聚糖的浓度为8-12mg/mL，然后在超声分散条件下，将成纤维细胞生长因子加入到壳聚糖乙酸溶液中，磁力搅拌2-3h后加入浓度为100-120mg/mL的硫胺素焦磷酸溶液，继续搅拌2-3h后离心分离、将沉淀反复漂洗后进行冷冻干燥即得到成纤维细胞生长因子微球，4℃下存放备用；
S3、向基础培养基中加入原花青素、胆甾烯基豆蔻酸酯、人参皂苷、转铁蛋白、贻贝粘蛋白、S1步骤制备的人表皮细胞生长因子微球以及S2步骤制备的成纤维细胞生长因子微球，搅拌均匀后加入棕榈酸溶液和胰岛素溶液，继续搅拌至均匀后，静置得混合物；
S4、向S3步骤的混合物中加入质量分数为9-12％的碳酸钠溶液，调节培养基pH至6.5-7，最后灭菌即得干细胞培养基。
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