CN112608884B - 培养基补充组合物、干细胞培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种培养基补充组合物、干细胞培养基及其制备方法。发明人在对干细胞的研究中发现，还原型谷胱甘肽和维生素，具体为维生素E或/和维生素E类似物，具有维持干细胞增殖能力和干性的作用，将包含还原型谷胱甘肽和维生素E或/和维生素E类似物的培养基补充组合物添加至基础培养基时，用所得培养积极培养干细胞能够有效维持干细胞增殖能力和未分化状态，同时，还降低干细胞氧化应激反应。

Description

培养基补充组合物、干细胞培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种培养基补充组合物、干细胞培养基及其制备方法。
背景技术
胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)是一种具有高度分化能力的细胞团，可以分化为不同类型的功能细胞。体外维持胚胎干细胞良好的干性能力是诱导分化、构建疾病模型、药物筛选工具的关键因素。然而，体外培养胚胎干细胞时，细胞会受到培养环境、培养基成分、实验操作人员水平等的影响。尤其是，在长时间连续传代培养胚胎干细胞时，如果不能维持在一个很好的培养环境下，细胞会受到不同的刺激导致细胞状态变差、干性能力下降以及分化能力不可控。
氧化应激(Oxidative Stress，OS)的存在常常需要内源性抗氧化应激机制的适应性反应，而这反过来又显著地调节氧化应激水平，导致氧化应激反应增加。一方面会增加eNOS(一氧化氮合酶)的水平，导致α-酮谷氨酸脱氢酶活性降低、线粒体功能障碍、活性氧水平(ROS)上升。ROS介导的生物大分子损伤可能使蛋白质变性、脂质过氧化、DNA修饰和线粒体功能障碍，最终导致细胞分化、衰老。
为了降低细胞氧化应激反应，传统上主要是通过在培养基或者保存液中添加还原剂、抗氧化剂等予以实现，例如：一种用于保持组织样本高细胞活性的保存液，所述保存液包括如下成分：离子缓冲液成分、糖类化合物成分、避免低温条件下组织细胞内外溶液产生冰晶的成分、为组织细胞的合成代谢提供补充的成分、抗氧化和抗细胞凋亡成分；所述低温条件为0℃～6℃；所述抗氧化和抗细胞凋亡成分选自还原型谷胱甘肽、维生素C、维生素D、水溶性维生素E、别嘌呤醇、N-乙酰半胱氨酸中的一种或几种。再例如：一种培养基添加剂，包含维生素C、糖还原合成激酶3抑制剂、维生素B12、胰岛素、受体酪氨酸激酶和抗氧化剂，所述抗氧化剂为硫氨、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽、维生素E、乙酰化纤维素E、亚油酸、亚麻酸和亚硒酸钠中的至少一种。又例如：细胞培养基补充剂，其包含至少一种抗氧化剂或至少两种、至少三种或所有选自以下组的抗氧化剂：a)抗坏血酸、抗坏血酸盐、或其酯，b)一种维生素E的水溶性类似物，c)N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽，或其盐或酯，和d)丙酮酸、丙酮酸盐或其酯。还例如：一种无血清细胞培养基，其特征在于，包含以下组分：基础培养基、NaHCO3、L型植物血球凝集素、复合氨基酸、柠檬酸铁、重组人胰岛素和抗氧化剂；所述抗氧化剂包含维生素E和还原型谷胱甘肽。
传统技术中，维生素E和还原型谷胱甘肽添加在培养基中主要是发挥抗氧化作用，将其应用至干细胞培养中，能否还发挥其他效果，是不得而知的。
发明内容
基于此，本发明提供一种培养基补充组合物、干细胞培养基及其制备方法。所述培养基补充组合物中添加有还原型谷胱甘肽和维生素E(或/和维生素E类似物)的组合，该组合具有维持干细胞增殖能力和干性的功效。
具体方案如下：
还原型谷胱甘肽和维生素作为培养基补充剂在维持干细胞增殖能力和干性中的用途；所述维生素为维生素E或/和维生素E类似物。
在其中一个实施例中，所述培养基补充剂包含1mg/L～10mg/L的还原型谷胱甘肽和0.1mg/L～5mg/L的维生素。
在其中一个实施例中，其特征在于，所述培养基补充剂包含1.5mg/L～3mg/L的还原型谷胱甘肽和0.1mg/L～1.5mg/L的维生素。
一种培养基补充组合物，所述培养基补充组合物包含NaHCO3、亚硒酸钠、乙二胺四乙酸铁、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子、硫酸锌、L-谷氨酰胺、NEAA、D-泛酸钙、L-抗坏血酸、还原型谷胱甘肽和维生素；所述维生素为维生素E或/和维生素E类似物。
在其中一个实施例中，所述培养基补充组合物包含1mg/L～10mg/L的还原型谷胱甘肽和0.1mg/L～5mg/L的维生素。
在其中一个实施例中，所述培养基补充组合物包含1.5mg/L～3mg/L的还原型谷胱甘肽和0.1mg/L～1.5mg/L的维生素。
在其中一个实施例中，所述培养基补充组合物包含：100mg/L～1000mg/L的NaHCO3、1μg/L～50μg/L的亚硒酸钠、100μM～400μM的乙二胺四乙酸铁、5μg/L～150μg/L的重组人碱性成纤维细胞生长因子、1μg/L～20μg/L的重组人转化生长因子β、1μg/～50μg/L的硫酸锌、100μM～1000μM的L～谷氨酰胺、10μM～500μM的NEAA、1mg/L～10mg/L的D-泛酸钙和1mg/L～100mg/L的L-抗坏血酸。
在其中一个实施例中，所述培养基补充组合物包含：400mg/L～600mg/L的NaHCO3、20μg/L～40μg/L的亚硒酸钠、250μM～350μM的乙二胺四乙酸铁、25μg/L～55μg/L的重组人碱性成纤维细胞生长因子、1.5μg/L～4μg/L的重组人转化生长因子β、6μg/L～16μg/L的硫酸锌、400μM～600μM的L-谷氨酰胺、75μM～130μM的NEAA、1mg/L～4mg/L的D-泛酸钙和60mg/L～80mg/L的L-抗坏血酸。
一种干细胞培养基，所述干细胞培养基包含如上所述的培养基补充组合物以及基础培养基。
在其中一个实施例中，所述基础培养基选用DMEM/F12基础培养基。
在其中一个实施例中，所述干细胞培养基的渗透压控制在310mOsm/kg～350mOsm/kg。
如上所述的干细胞培养基的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
取所述培养基补充组合物所含的各成分，添加至所述基础培养基，混合。
在其中一个实施例中，所述制备方法还包括将所述干细胞培养基的渗透压调节至310mOsm/kg～350mOsm/kg的步骤。
一种干细胞的培养方法，所述的培养方法包括如下步骤：将干细胞接种于如上所述的干细胞培养基，培养。
在其中一个实施例中，所述干细胞为胚胎干细胞或者多能干细胞。
在其中一个实施例中，所述培养的过程中，于接种所述干细胞第2天开始每天更换新鲜的所述干细胞培养基进行培养，每隔4天～6天进行传代培养。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
发明人在对干细胞的研究中发现，还原型谷胱甘肽和维生素(具体为维生素E或/和维生素E类似物)具有维持干细胞增殖能力和干性的作用，将包含还原型谷胱甘肽和维生素(具体为维生素E或/和维生素E类似物)的培养基补充组合物添加至基础培养基时，用所得培养积极培养干细胞能够有效维持干细胞增殖能力和未分化状态，同时，还降低干细胞氧化应激反应。
附图说明
图1为第13代hES(H9)细胞形态图；
图2为第13代hES(H9)细胞Oct4基因表达图；
图3为第13代hES(H9)细胞Sox2基因表达图；
图4为第13代hES(H9)细胞Nanog基因表达图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例涉及还原型谷胱甘肽和维生素作为培养基补充剂在维持干细胞增殖能力和干性中的用途；所述维生素为维生素E或/和维生素E类似物。
发明人在对干细胞的研究中发现，还原型谷胱甘肽和维生素(具体为维生素E或/和维生素E类似物)具有维持干细胞增殖能力和干性的作用，将包含还原型谷胱甘肽和维生素(具体为维生素E或/和维生素E类似物)的培养基补充组合物添加至基础培养基时，用所得培养积极培养干细胞能够有效维持干细胞增殖能力和未分化状态，同时，还不影响其降低干细胞氧化应激反应的功效。
可选地，本发明实施例所述的维生素E类似物为trolox、MDL-73404等水溶性维生素E类似物。
优选地，所述培养基补充剂包含1mg/L～10mg/L的还原型谷胱甘肽和0.1mg/L～5mg/L的维生素。
优选地，所述培养基补充剂包含1.5mg/L～3mg/L的还原型谷胱甘肽和0.1mg/L～1.5mg/L的维生素。
本发明实施例提供一种培养基补充组合物，所述培养基补充组合物包含NaHCO3、亚硒酸钠、乙二胺四乙酸铁、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子、硫酸锌、L-谷氨酰胺、NEAA、D-泛酸钙、L-抗坏血酸、还原型谷胱甘肽和维生素；所述维生素为水溶性维生素E或/和水溶性维生素E类似物。
优选地，所述培养基补充组合物包含1mg/L～10mg/L的还原型谷胱甘肽和0.1mg/L～5mg/L的维生素。
优选地，所述培养基补充组合物包含1.5mg/L～3mg/L的还原型谷胱甘肽和0.1mg/L～1.5mg/L的维生素。
优选地，所述培养基补充组合物包含：100mg/L～1000mg/L的NaHCO3、1μg/L～50μg/L的亚硒酸钠、100μM～400μM的乙二胺四乙酸铁、5μg/L～150μg/L的重组人碱性成纤维细胞生长因子、1μg/L～20μg/L的重组人转化生长因子β、1μg/～50μg/L的硫酸锌、100μM～1000μM的L-谷氨酰胺、10μM～500μM的NEAA、1mg/L～10mg/L的D-泛酸钙和1mg/L～100mg/L的L-抗坏血酸。
优选地，所述培养基补充组合物包含：400mg/L～600mg/L的NaHCO3、20μg/L～40μg/L的亚硒酸钠、250μM～350μM的乙二胺四乙酸铁、25μg/L～55μg/L的重组人碱性成纤维细胞生长因子、1.5μg/L～4μg/L的重组人转化生长因子β、6μg/L～16μg/L的硫酸锌、400μM～600μM的L-谷氨酰胺、75μM～130μM的NEAA、1mg/L～4mg/L的D-泛酸钙和60mg/L～80mg/L的L-抗坏血酸。
一种干细胞培养基，所述干细胞培养基包含如上所述的培养基补充组合物以及基础培养基。
干细胞的培养一直是本技术领域持续探究的问题，传统的干细胞的培养基例如：一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括肝素钠、哌啶酸、γ-氨基丁酸和锂离子盐；所述肝素钠在所述培养基中的浓度为10ng/mL～200ng/mL，所述哌啶酸在所述培养基中的浓度为0.05μg/mL～5μg/mL；所述γ-氨基丁酸在所述干细胞培养基中的浓度为10μg/mL～200μg/mL；所述锂离子盐在所述干细胞培养基中的浓度为10μg/mL～150μg/mL；所述添加剂还包括pH调节剂、硒补充剂、铁补充剂、抗氧化剂、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β、谷胱甘肽、丙戊酸、D-泛酸钙和硫酸锌；所述pH调节剂(碳酸氢钠)、硒补充剂(亚硒酸钠)、铁补充剂(乙二胺四乙酸铁)、抗氧化剂(L-抗坏血酸)、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β、谷胱甘肽、丙戊酸、D-泛酸钙和硫酸锌在所述干细胞培养基中的浓度分别为100mg/L～1000mg/L、1μg/L～50μg/L、100μM～400μM、30μg/L～100mg/L、5μg/L～100μg/L、1μg/L～20μg/L、1mg/L～50mg/L、20mg/L～200mg/L、1mg/L～20mg/L和1μg/L～50μg/L。该干细胞培养基对干细胞扩增倍数有待提升，并且添加补充成分相对较多，同时，用该干细胞培养基传到10代以上的干细胞是否还能够具备较好的增殖能力以及很好的维持干性，也是不确定的。
而本发明实施例将包含NaHCO3、亚硒酸钠、乙二胺四乙酸铁、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子、硫酸锌、L-谷氨酰胺、NEAA、D-泛酸钙、L-抗坏血酸、还原型谷胱甘肽和维生素E的培养基补充组合物添加至基础培养基后，用所得培养培养干细胞时，干细胞的增殖能力强，能有效维持干细胞干性，例如，传代培养13代的干细胞扩增倍数可以达到90％以上且多能性标志物表达不会显著下降。并且，本发明实施例添加的补充成分种类相对较少，更有利于降低成本、推进培养基商品化。
优选地，所述基础培养基选用DMEM/F12基础培养基。
优选地，所述干细胞培养基的渗透压控制在310mOsm/kg～350mOsm/kg。
如上所述的干细胞培养基的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
取所述培养基补充组合物所含的各成分，添加至所述基础培养基，混合。
优选地，所述制备方法还包括将所述干细胞培养基的渗透压调节至310mOsm/kg～350mOsm/kg的步骤。
可以理解的是，本发明实施例在制备干细胞培养基的过程中需要进行除菌，除菌的方式包括但不限于采用滤膜过滤除菌。
一种干细胞的培养方法，所述的培养方法包括如下步骤：将干细胞接种于如上所述的干细胞培养基，培养。
优选地，所述干细胞为胚胎干细胞或者多能干细胞。
优选地，所述培养的过程中，于接种所述干细胞第2天开始每天更换新鲜的所述干细胞培养基进行培养，每隔4天～6天进行传代培养。
实施例1
本实施例提供一种胚胎干细胞无血清培养基，以DMEM/F12为基础培养基，并包含以下组分：
表1
Figure BDA0002823871600000081
Figure BDA0002823871600000091
胚胎干细胞无血清培养基的制备方法包括如下步骤：
将上表培养基中的各添加剂成分按照各自的溶解特性溶解，滤膜过滤除菌后。
在20℃、无菌条件下，将各成分逐一加入到DMEM/F12基础培养基中，吹打混匀，氯化钠调节渗透压为340mOsm/kg，配好的培养基4℃保存。
对比例1
本对比例提供一种胚胎干细胞无血清培养基，以DMEM/F12为基础培养基，并包含以下组分：
表2
成分 浓度
NaHCO<sub>3</sub> 500mg/L
亚硒酸钠 30μg/L
乙二胺四乙酸铁 300μM
重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 40μg/L
重组人转化生长因子β 2μg/L
硫酸锌 10μg/L
L-谷氨酰胺 400μM
NEAA 100μM
D-泛酸钙 1.5mg/L
L-抗坏血酸 70mg/L
还原型谷胱甘肽 2mg/L
维生素E /
胚胎干细胞无血清培养基的制备方法包括如下步骤：
将上表培养基中的各添加剂成分按照各自的溶解特性溶解，滤膜过滤除菌后。
在20℃、无菌条件下，将各成分逐一加入到DMEM/F12基础培养基中，吹打混匀，氯化钠调节渗透压为340mOsm/kg，配好的培养基4℃保存。
对比例2
本对比例提供胚胎干细胞无血清培养基，以DMEM/F12为基础培养基，其配方如下表所示：
表3
成分 浓度
NaHCO<sub>3</sub> 500mg/L
亚硒酸钠 30μg/L
乙二胺四乙酸铁 300μM
重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 40μg/L
重组人转化生长因子β 2μg/L
硫酸锌 10μg/L
L-谷氨酰胺 400μM
NEAA 100μM
D-泛酸钙 1.5mg/L
L-抗坏血酸 70mg/L
还原型谷胱甘肽 /
维生素E 1mg/L
胚胎干细胞无血清培养基的制备方法包括如下步骤：
将上表培养基中的各添加剂成分按照各自的溶解特性溶解，滤膜过滤除菌后。
在20℃、无菌条件下，将各成分逐一加入到DMEM/F12基础培养基中，吹打混匀，氯化钠调节渗透压为340mOsm/kg，配好的培养基4℃保存。
对比例3
本对比例提供一种胚胎干细胞无血清培养基，以DMEM/F12为基础培养基，其配方如下表所示：
表4
成分 浓度
NaHCO<sub>3</sub> 500mg/L
亚硒酸钠 30μg/L
乙二胺四乙酸铁 300μM
重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 40μg/L
重组人转化生长因子β 2μg/L
硫酸锌 10μg/L
L-谷氨酰胺 400μM
NEAA 100μM
D-泛酸钙 1.5mg/L
L-抗坏血酸 70mg/L
还原型谷胱甘肽 /
维生素E /
胚胎干细胞无血清培养基的制备方法包括如下步骤：
将上表培养基中的各添加剂成分按照各自的溶解特性溶解，滤膜过滤除菌后。
在20℃、无菌条件下，将各成分逐一加入到DMEM/F12基础培养基中，吹打混匀，氯化钠调节渗透压为340mOsm/kg，配好的培养基4℃保存。
表5、实施例1、对比例1～对比例3的培养基补充组合物配方
Figure BDA0002823871600000111
Figure BDA0002823871600000121
实施例2至实施例5
实施例2至实施例5均为实施例1的变化例，相对于实施例1的变化主要在于培养基补充组合物配方，参见下表：
表6
Figure BDA0002823871600000122
实施例2至实施例5培养基的制备方法均同实施例1。
对比例4
对比例4是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别在采用维生素C代替实施例1中的维生素E。其余配方组分及制备方法均同实施例1。
对比例5
对比例5是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别在采用N-乙酰半胱氨酸代替实施例1中的还原型谷胱甘肽。其余配方组分及制备方法均同实施例1。
应用例1、ESCs形态观察
将第6代hES(H9)细胞按照1×105cell/cm2的密度接种于vitronectin(S-蛋白或血清扩散因子)包被好的6孔板中，分别加入上述各组培养基进行培养，第2天开始每天换液，每隔4天～6天采用ReleSR进行连续传代培养，培养至第13代，倒置显微镜下观察各组第13代时的ESCs形态并采集图像。结果见图1。
如图1所示，实施例组与对照组(TeSR-E8)细胞状态较好，无分化细胞，克隆中细胞排列致密，其余各对比例组均出现不同程度的细胞状态变差情况，且有明显分化的细胞。从图1结果中可以看出，虽然对照组与实施例组中的细胞状态均比较好，克隆中细胞排列致密，但是与对照组相比，实施例组的扩增倍数明显升高。其余各对比例组虽有明显的细胞增殖现象，但增殖速率明显低于实施例组和对照组，说明本发明所述的无血清培养基具有更强的增殖效果。
应用例2、ESCs增殖活性检测
将第13代hES(H9)细胞按照2×104cell/cm2的密度接种于vitronectin包被好的24孔板中，每组3个复孔。分别加入上述各组培养基进行培养，第2天开始每天换液，培养至第7天，收集细胞计算各组扩增倍数及细胞活率。结果表7所示。
表7、第13代hES(H9)细胞扩增倍数和细胞活率
Figure BDA0002823871600000141
应用例4、ESCs多活性氧水平检测
将第13代hES(H9)细胞按照5×103cell/cm2的密度接种于vitronectin包被好的96孔板中，分别加入上述各组培养基进行培养，第2天开始每天换液，培养至第3天，利用活性氧检测试剂盒进行活性氧水平检测，评估各组ROS阳性细胞所占的比例。结果如表8所示
表8、第13代hES(H9)细胞活性氧水平
ROS阳性细胞水平(％) 独立样本T检验(p)
TeSR<sup>TM</sup>-E8 8.53 1.000
实施例1 7.46 0.003
实施例2 7.28 0.050
实施例3 8.46 0.046
实施例4 9.31 0.461
实施例5 10.12 0.025
对比例1 10.76 0.143
对比例2 10.49 0.007
对比例3 9.89 0.078
对比例4 15.46 0.064
对比例5 14.75 0.008
应用例4、ESCs多能性基因检测
将第13代hES(H9)细胞按照1×105cell/cm2的密度接种于vitronectin包被好的6孔板中，分别加入上述各组培养基进行培养，第2天开始每天换液，培养至第5天。0.25％胰酶溶液消化后分别提取各组hES(H9)细胞总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用荧光定量PCR检测ESCs多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的表达水平，qPCR引物序列见表9。
结果如图2所示，与对照组相比，实施例1的ESCs多能性基因mRNA的表达水平明显升高，而对余各组细胞出现分化现象，多能性marker出现不同程度的下降。表明本发明所述的无血清培养基能更好的维持ESCs的多能性和具有更强的自我更新能力。
表9、ESCs多能性基因qPCR引物序列
Figure BDA0002823871600000151
本发明实施例提供的培养基是一种无血清、无饲养层的干细胞培养基，该培养基成分明确、无动物源成分，添加了还原型谷胱甘肽、维生素E等还原剂，解决了胚胎干细胞体外培养时存在氧化应激反应的问题，提高了培养过程中的容错率，能够实现ESCs快速增殖，同时，更加稳定了维持细胞良好的状态，特别是维持细胞的未分化状态。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 生物岛实验室、广东国科细胞科技有限公司
<120> 培养基补充组合物、干细胞培养基及其制备方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacgagtgga aagcaactca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agatggtggt ctggctgaac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttacctctt cctcccactc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcccaattc ccttgtatct c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagtacctca gcctccagca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgctgagcc cttctgaatc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcaccacacc ttctacaatg ag 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgctgagcc cttctgaatc 20

Claims (11)

1.一种培养基补充组合物，其特征在于，所述培养基补充组合物由NaHCO3、亚硒酸钠、乙二胺四乙酸铁、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子、硫酸锌、L-谷氨酰胺、NEAA、D-泛酸钙、L-抗坏血酸、还原型谷胱甘肽和维生素组成；
所述维生素为维生素E或/和维生素E类似物；
所述培养基补充组合物包含：100mg/L～1000mg/L的NaHCO3、1μg/L～50μg/L的亚硒酸钠、100μM～400μM的乙二胺四乙酸铁、5μg/L-150μg/L的重组人碱性成纤维细胞生长因子、1μg/L～20μg/L的重组人转化生长因子β、1μg/～50μg/L的硫酸锌、100μM～1000μM的L-谷氨酰胺、10μM～500μM的NEAA、1mg/L～10mg/L的 D-泛酸钙和1 mg/L～100mg/L的L-抗坏血酸；
所述培养基补充组合物包含1.5mg/L～10mg/L的还原型谷胱甘肽和0.1mg/L～5 mg/L的维生素。
2.根据权利要求1所述的培养基补充组合物，所述培养基补充组合物包含1.5mg/L～3mg/L的还原型谷胱甘肽和0.1mg/L～1.5mg/L的维生素。
3.根据权利要求1所述的培养基补充组合物，其特征在于，所述培养基补充组合物包含：400mg/L～600mg/L的NaHCO3、20μg/L～40μg/L的亚硒酸钠、250μM～350μM的乙二胺四乙酸铁、25μg/L～55μg/L的重组人碱性成纤维细胞生长因子、1.5μg/L～4μg/L的重组人转化生长因子β、6μg/L～16μg/L的硫酸锌、400μM～600μM的L-谷氨酰胺、75μM～130μM的NEAA、1mg/L～4mg/L的 D-泛酸钙和60mg/L～80mg/L 的L-抗坏血酸。
4.一种干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基包含权利要求1至3任一项所述的培养基补充组合物以及基础培养基。
5.根据权利要求4所述的干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基选用DMEM/F12基础培养基。
6.根据权利要求4或者5所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基的渗透压控制在310 mOsm/kg～350mOsm/kg。
7.权利要求4至6任一项所述的干细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
取所述培养基补充组合物所含的各成分，添加至所述基础培养基，混合。
8.根据权利要求7所述的干细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所述干细胞培养基的渗透压调节至310mOsm/kg～350 mOsm/kg的步骤。
9.一种非诊断治疗目的的干细胞的培养方法，其特征在于，所述的培养方法包括如下步骤：将干细胞接种于权利要求4至6任一项所述的干细胞培养基，培养。
10.根据权利要求9所述的非诊断治疗目的的干细胞的培养方法，其特征在于，所述干细胞为胚胎干细胞或者多能干细胞。
11.根据权利要求9或者10所述的非诊断治疗目的的干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养的过程中，于接种所述干细胞第2天开始每天更换新鲜的所述干细胞培养基进行培养，每隔4天～6天进行传代培养。
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