CN114732008B - 一种红细胞保存液及其制备方法、红细胞悬液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种红细胞保存液及其制备方法、红细胞悬液。所述红细胞保存液包括溶剂、葡萄糖、腺嘌呤、肌苷、柠檬酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、羟乙基淀粉、甘露醇、氯化钠、氯化铵、氯化钙、氯霉素、维生素E及还原型谷胱甘肽。采用本发明的红细胞保存液，各组分相互牵制、协同作用，不仅延长红细胞的保存期限，且增强红细胞的性能稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种红细胞保存液及其制备方法、红细胞悬液。
背景技术
红细胞膜表面有很多种抗原，如ABH抗原、Rh抗原等。这些抗原能够特异性地与抗体结合，所以红细胞被广泛地应用于血型血清学试验。由于红细胞存在易破碎、不易运输等缺点，因此对红细胞保存液的保存受到了极大的限制。目前的红细胞保存液对红细胞保存期限较短，且红细胞稳定性差。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种红细胞保存液及其制备方法、红细胞悬液，以解决现有的红细胞保存液对红细胞保存期限较短，且红细胞稳定性差的问题。
第一方面，本发明提供一种红细胞保存液，包括：溶剂、葡萄糖、腺嘌呤、肌苷、柠檬酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、羟乙基淀粉、甘露醇、氯化钠、氯化铵、氯化钙、氯霉素、维生素E及还原型谷胱甘肽。
第二方面，本发明提供一种红细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：
将甘露醇、腺嘌呤、肌苷、羟乙基淀粉、柠檬酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化铵、氯化钙、氯霉素溶解于溶剂中，以得到混合溶液；
调节所述混合溶液的PH值，并灭菌处理；
向所述混合溶液中加入葡萄糖溶液、维生素E和还原型谷胱甘肽，以制得所述红细胞保存液。
第三方面，本发明提供一种红细胞悬液，包括红细胞和如上所述的红细胞保存液。
本发明实施例提供的红细胞保存液及其制备方法、红细胞悬液，基于红细胞保存液的组成包括溶剂、葡萄糖、腺嘌呤、肌苷、柠檬酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、羟乙基淀粉、甘露醇、氯化钠、氯化铵、氯化钙、氯霉素、维生素E及还原型谷胱甘肽，各组分相互牵制、协同作用，不仅延长红细胞的保存期限，且增强红细胞的性能稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的红细胞保存液的制备方法的流程示意图。
图2是第一组红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度随细胞保养时间变化的示意图。
图3是第二组红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度随细胞保养时间变化的示意图。
图4是第三组红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度随细胞保养时间变化的示意图。
图5是第四组红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度随细胞保养时间变化的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
可以理解的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语仅是为了描述特定实施例，并非要限制本发明。术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。此外，本发明可以以多种不同的形式来实现，并不限于本实施例所描述的实施例。
说明书后续描述为实施本发明的较佳实施例，然而上述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明实施例提供的红细胞保存液的组分包括溶剂、葡萄糖、腺嘌呤、肌苷、柠檬酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、羟乙基淀粉、甘露醇、氯化钠、氯化铵、氯化钙、氯霉素、维生素E及还原型谷胱甘肽。其中，溶剂例如是但不局限于去离子水。
本发明的上述红细胞保存液，各组分相互牵制、协同作用，在基于通过葡萄糖等营养体系维持细胞基本代谢活性的同时，通过PH调节剂、渗透压维持剂及抑菌剂等保护细胞的能量产生机构，使其维持正常结构和功能；以及通过维生素E及还原型谷胱甘肽等细胞抗氧化剂来减慢细胞代谢速度，减少能量消耗并供应能量物质，并且辅助修复成分，降低保存过程中的细胞损伤。
其中，所述溶剂可以为但不局限于去离子水或超纯水。所述红细胞保存液的组成和含量如下：所述红细胞保存液的组成和含量如下：所述葡萄糖89.55-90.45mmol/L、所述腺嘌呤3.48-3.52mmol/L、所述肌苷1.29-1.31mmol/L、所述柠檬酸钾15.92-16.08mmol/L、所述磷酸氢二钾24.88-25.13mmol/L、所述磷酸二氢钾13.93-14.07mmol/L、所述羟乙基淀粉0.20-0.21mmol/L、所述甘露醇44.78-45.23mmol/L、所述氯化钠76.62-77.39mmol/L、所述氯化铵39.80-40.20mmol/L、所述氯化钙0.35-0.36mmol/L、所述氯霉素6.97-7.04mmol/L、所述维生素E 0.010-0.011g/L、所述还原型谷胱甘肽1.99-2.01mmol/L。本发明的上述红细胞保存液通过优化各组分及配比，以使得红细胞保存液重复性好，细胞保存长期安全稳定，成本较低、适用于实验用以及大规模的工业生产。
优选地，所述红细胞保存液的组成和含量如下：所述红细胞保存液的组成和含量如下：所述葡萄糖90mmol/L、所述腺嘌呤3.5mmol/L、所述肌苷1.3mmol/L、所述柠檬酸钾16mmol/L、所述磷酸氢二钾25mmol/L、所述磷酸二氢钾14mmol/L、所述羟乙基淀粉0.2mmol/L、所述甘露醇45mmol/L、所述氯化钠77mmol/L、所述氯化铵40mmol/L、所述氯化钙0.36mmol/L、所述氯霉素7mmol/L、所述维生素E 0.01g/L、所述还原型谷胱甘肽2.00mmol/L。
可以理解地，红细胞的长期保存需要不断地为新陈代谢提供能量，而红细胞中没有细胞核、线粒体等细胞器，因此这种能量主要来自于糖酵解。红细胞通过糖酵解获得生长所需能量，糖酵解产生的ATP是细胞生命活动所需能量的直接来源，可增强细胞代谢活性。本发明以葡萄糖、腺嘌呤、肌苷等作为红细胞的营养体系。在本实施例中，糖酵解以葡萄糖为底物。腺嘌呤是三磷酸腺苷来源，可以提高ATP的活性水平。腺嘌呤用于维持和恢复ATP、DPG水平，还能稳定红细胞的形态。肌苷是腺嘌呤的前体，能直接透过细胞膜进入红细胞，参与能量代谢。
本发明以磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钾等作为红细胞保持液的PH缓冲剂，以使得红细胞在缓冲保存期间产生的代谢产物所造成的pH波动。此外，糖酵解产生的ATP、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钾提供的钾离子及氯化纳提供的钠离子能够维持红细胞膜上钠钾泵(Na+-K+-ATPase)的正常运转，以稳定红细胞的形态。
羟乙基淀粉作为红细胞保持液的稀释剂和稳定剂，能够增加红细胞的细胞膜负电荷，减少红细胞聚集，使得红细胞充分悬浮及分散。甘露醇作为抗溶血剂，以防止高血比积的浓缩红细胞悬液溶血的增加。甘露醇还能够提供胶体渗透压，以减少红细胞的渗透性膨胀，清除细胞保存液中的自由离子团，从而达到保持红细胞活力并延长细胞保存期的目的，增强红细胞保存液的稳定性。氯化钠、氯化铵、氯化钙作为盐类缓冲体系主要负责维持晶体渗透压，且为红细胞提供营养离子，营养离子配合其它试剂一同使用，可以较好的维持细胞活性。具体地，氧化钠是细胞的等渗溶液，因此添加氧化钠后，不仅可以维持红细胞的渗透压，保护细胞膜结构的完整性，还可以保持红细胞内外的离子平衡。氯化铵能穿透红细胞，使得其余的非渗透溶质就红细胞保存液成为红细胞的低渗透环境。氧化钙还能够与羟乙基淀粉能够有效交联，有利于维持红细胞在羟乙基淀粉凝胶中的稳定性。羟乙基淀粉、甘露醇、氯化钠、氯化铵及氯化钙能维持适合细胞生存的晶体和胶体物质，保持合适的细胞外渗透压，稳定细胞的膜结构。从上述选择可以看出，并不存在大量的多种营养，在保存中控制细胞代谢速度处于较低的水平，从而降低了红细胞保存液的制作成本。
氯霉素主要负责抑菌作用。氯霉素相比其他类型的抗生素，其属于抑菌性广谱抗生素。本发明中一方面是基于其广谱性采用，以避免窄谱性的抗生素的抑菌类型过少而达不到良好的抑菌效果；另一方面，其主要是抑菌性的类型，而不是杀菌性的类型；这样可以最大化地避免对红细胞自身的代谢产生杀伤。氯霉素的量优选为7mmol/L。
抗氧化体系主要负责消化红细胞在保存期间产生的自由基及抑制自由基活动的物质，能够预防自由基的形成，或是在自由基形成之后防止它们与其他的细胞分子结合，从而阻止自由基造成细胞的衰老和氧化损伤。在本实施例中，抗氧化体系采用维生素E及还原型谷胱甘肽。维生素E是属于还原性维生素。还原型谷胱甘肽是寡肽，添加的过程中分别按照各自适合的量进行添加，相互之间并不存在统一的标准用量(酶类是以活力单位U计量、化学成分以mol、质量等方式计量)。由于还原型谷胱甘肽自身也是多肽，添加量多有可能会作为C、N源进行能源代谢，可能也会诱导细胞产生分化，还原型谷胱甘肽的量优选为2mmol/L。维生素E与还原型谷胱甘肽共同协作使用时，维生素E的量优选为0.01g/L。
请参阅图1，图1是本发明实施例提供的红细胞保存液的制备方法的流程示意图。如图1所示，本发明还提供一种红细胞保存液的制备方法，包括以下步骤。
步骤S101，将甘露醇、腺嘌呤、肌苷、羟乙基淀粉、柠檬酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化铵、氯化钙、氯霉素溶解于溶剂中，以得到混合溶液。
其中，所述溶剂可以为但不局限于去离子水或超纯水。所述混合溶液中的各组分的量如下：腺嘌呤3.48-3.52mmol/L、肌苷1.29-1.31mmol/L、柠檬酸钾15.92-16.08mmol/L、磷酸氢二钾24.88-25.13mmol/L、磷酸二氢钾13.93-14.07mmol/L、羟乙基淀粉0.20-0.21mmol/L、甘露醇44.78-45.23mmol/L、氯化钠76.62-77.39mmol/L、氯化铵39.80-40.20mmol/L、氯化钙0.35-0.36mmol/L、氯霉素6.97-7.04mmol/L。本发明的上述红细胞保存液通过优化各组分及配比，以使得红细胞保存液重复性好，细胞保存长期安全稳定，成本较低、适用于实验用以及大规模的工业生产。
步骤S103，调节所述混合溶液的PH值，并灭菌处理。
在本实施例中，采用氢氧化钠调节所述混合溶液的PH值。所述混合溶液的PH值大致为6.9-7.9，优选地为7.4，从而确保混合溶液中的各个组分的稳定性，以保证制得的红细胞保存液能够有效延长红细胞的保存期限，并保持红细胞活力。灭菌处理的时间为25-35分钟，优选为30分钟。灭菌处理的温度为110-120℃，优选为115℃。可理解地，由于混合溶液中含有腺嘌呤、肌苷等营养物质，因此容易被细菌等微生物破坏或消耗，从而通过对混合溶液进行灭菌处理能保证各个组分之间的平衡性和稳定性。
步骤S105，向所述混合溶液中加入葡萄糖溶液、维生素E和还原型谷胱甘肽，以制得所述红细胞保存液。
在一些实施例中，所述向所述混合溶液中加入葡萄糖溶液、维生素E和还原型谷胱甘肽，包括：
配置第一浓度的葡萄糖溶液，灭菌处理；
将灭菌处理后的葡萄糖溶液中加入至灭菌处理后的混合溶液中，以得到保存基础液；
向所述保存基础液中添加维生素E和还原型谷胱甘肽，以制得所述红细胞保存液。
其中，所述保存基础液中的葡萄糖溶液的浓度为第二浓度，所述第二浓度小于所述第一浓度。第一浓度大致为1.79-1.81mol/L，优选为1.8mol/L。第二浓度大致为89.55-90.45mmol/L，优选为90mmol/L。灭菌处理的时间为25-35分钟，优选为30分钟。灭菌处理的温度为110-120℃，优选为115℃。可理解地，由于葡萄糖溶液中的葡萄糖是细胞糖酵解的主要营养物质，从而通过对葡萄糖溶液进行灭菌处理能保证葡萄糖溶液的稳定性，及避免葡萄糖溶液携带的细菌等微生物污染所述混合溶液而出现各组分失调的问题。可以理解地，为了兼顾所述红细胞保存液中的各个组分之间相互作用和相互协调，所述维生素E 0.010-0.011g/L、所述还原型谷胱甘肽1.99-2.01mmol/L，从而保证所述红细胞保存液中的各组分的性能均衡、协调互补性及稳定性。优选地，所述维生素E 0.01g/L、所述还原型谷胱甘肽2.00mmol/L。
本发明通过单独配置高浓度的葡萄糖溶液，再将灭菌后的高浓度的葡萄糖溶液中加入至所述混合溶液，从而能够避免葡萄糖的羟基与混合溶液中的其它组分在灭菌处理过程中发生反应而出现保存基础液中的各组分的成分发生变化的问题，从而确保保存基础液中的各个组分的稳定性和平衡性，以保证整个保存体系各种成分的协同作用，进而保证制得的红细胞保存液能够有效延长红细胞的保存期限，并保持红细胞活力。此外，将高浓度的葡萄糖溶液添加至灭菌处理后的混合溶液中，即通过混合溶液来稀释高浓度的葡萄糖溶液，可以确保葡萄糖的稳定性。
所述向所述保存基础液中添加无菌处理后的维生素E和还原型谷胱甘肽，以制得所述红细胞保存液，包括：
向所述保存基础液中添加维生素E和还原型谷胱甘肽，以制得红细胞保存原液；
向所述红细胞保存原液中添加预设体积的补充溶液，以制得所述红细胞保存液。
其中，所述补充溶液的成分与所述溶剂的成分相同，均为去离子水或超纯水。在本实施例中，所述补充溶液与所述溶剂均为去离子水。本发明通过补充溶液与红细胞保存原液混合来制得所述红细胞保存，从而各个组分的浓度能够保持同比例变化，进而保证所述红细胞保存液各个成分的量的准确性，保证各组分的协调作用和平衡作用。
可选地，在一些实施例中，所述制备方法还包括：确定配置所述红细胞保存液的目标体积；根据所述目标体积按照预设体积比配置所述混合溶液、所述葡萄糖溶液、包含所述维生素E和所述还原型谷胱甘肽的抗氧化溶液及所述补充溶液。例如，红细胞保存液的目标体积为1L，混合溶液的体积为800ml，葡萄糖溶液的体积为50ml，抗氧化溶液的体积为10ml，去离子水的体积为140ml。需要说明的是，所述混合溶液、所述葡萄糖溶液、所述抗氧化溶液及所述补充溶液的数值仅用于描述说明，本发明不作具体限定。
具体地，举例来说，本发明较优实施例的红细胞保存液的制作方法具体包括如下步骤：（1）取去离子水加入容器（例如烧杯）中，向容器中依次加入45mmol/L甘露醇、25mmol/L磷酸氢二钾、14mmol/L磷酸二氢钾、3.5mmol/L腺嘌呤、1.3mmol/L肌苷、16mmol/L柠檬酸钾、40mmol/L氯化铵、77mmol/L氯化钠、7mmol/L氯霉素、0.36mmol/L氯化钙及0.2mmol/L羟乙基淀粉，以制得混合溶液；（2）采用氢氧化钠调节所述混合溶液的pH值为7.4，并在115℃下灭菌30min；（3）单独配制浓度为1.8mol/L的葡萄糖溶液，并在115℃下灭菌30min；（4）将1.8mol/L葡萄糖溶液中加入灭菌处理后的混合溶液中，以制得葡萄糖浓度为的90mmol/L的保存基础液；（5）向保存基础液中加入无菌过滤的0.01g/L维生素E和2.00mmol/L还原型谷胱甘肽，以制得红细胞保存原液；（6）向红细胞保存原液中加入预设体积的灭菌去离子水，以制得具有目标体积的所述红细胞保存液。本发明的红细胞保存液的制作方法，制作简单，制得的红细胞保存液具有保护效果良好，成本低，保存时间长等优点，且适用于实验用以及大规模的工业生产。
需要说明的是，以上实施案例是对本发明所述的详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。本发明中所述的各种试剂和溶液，均为实验室中所常用的，对于本领域的普通技术人员来说，应当理解，同时在不跳脱本发明的构思前提下，对部分试剂溶液进行等同替换，而这些等同替换，也应属于本发明的保护范围之内。
本发明还提供一种红细胞悬液，包括红细胞和如上所述的红细胞保存液。需要说明的是，术语“红细胞悬液”是指红细胞添加至红细胞保存液中而得到的混合物。术语“悬液”是指红细胞被红细胞保存液所包围，并且红细胞在红细胞保存液中均匀或不均匀分布的状态。术语“红细胞”是血液中数量最多的一种血细胞，其通过细胞内大量血红蛋白负责体内氧气的输送。红细胞在脊椎动物中广泛存在，也存在与少量无脊椎动物中。优选地，本文中红细胞指哺乳动物红细胞，包括大鼠、小鼠、猫、牛、马、猴红细胞，更优选人红细胞。术语“红细胞保存液”是指用于保存红细胞的混合溶液。当将采集的红细胞置于红细胞保存液中，可以较长时间地保持红细胞的形态、活性或膜成分等。
将不同组分的红细胞保存液与红细胞配置红细胞悬液，并对不同红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度进行检测。为了方便阐述，将不同实验组中的测试组1、测试组2、…、测试组9对应的红细胞悬液标记为“1#”、“2#”、…、“9#”。
可以理解地，红细胞主要由红细胞膜和大量的血红蛋白组成，当红细胞膜破裂时，膜表面抗原被破坏，血红蛋白逸出，发生溶血现象。所以游离血红蛋白浓度可以作为红细胞体外保存效果的质量指标之一。
表一 第一组红细胞悬液中的1#-8#对应的红细胞保存液成分
| 组分类别 | 1# | 2# | 3# | 4# | 5# | 6# | 7# | 8# |
| 葡萄糖 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 腺嘌呤 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 肌苷 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 柠檬酸钾 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 磷酸氢二钾 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 磷酸二氢钾 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 磷酸氢二钠 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 磷酸二氢钠 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 羟乙基淀粉 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 甘露醇 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 氯化钠 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 氯化铵 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 氯化钙 | 0 | 1 | 0 | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 |
| 氯霉素 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
注：“1”表示1#-8#的红细胞保存液中所添加的成分，“0”表示1#-8#的红细胞保存液中没有添加的成分。
请参阅图2，图2是第一组红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度随细胞保养时间变化的示意图。图2示出了第一组红细胞悬液中的1#-8#的游离血红蛋白浓度在3个月之内的测定结果。具体地，如图2所示，随着保存时间的延长，1#-8#的红细胞悬液的游离血红蛋白浓度都逐渐上升。1#和8#、2#和7#、3#和6#及4#和5#中的红细胞保存液成分大致相同，区别在于1#、2#、3#和4#的红细胞保存液采用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，而5#、6#、7#和8#的红细胞保存液采用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾。从图2的测试结果来看，采用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配置的红细胞保存液所对应的红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度明显大于采用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置的红细胞保存液所对应的红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度，且，这表明红细胞保存液中采用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾更有利于延长红细胞的保存期限。5#、6#、7#和8#中的红细胞保存液的成分区别在于是否包含羟乙基淀粉和氯化钙，从图2的测试结果来看，没有采用羟乙基淀粉和/或氯化钙配置的红细胞保存液所对应的红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度明显大于采用羟乙基淀粉和/或氯化钙配置的红细胞保存液所对应的红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度，这表明红细胞保存液中同时采用羟乙基淀粉和氯化钙更有利于延长红细胞的保存期限。
表二 第二组红细胞悬液中的1#-8#的红细胞保存液成分
| 组分类别 | 1# | 2# | 3# | 4# | 5# | 6# | 7# | 8# |
| 葡萄糖 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 腺嘌呤 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 肌苷 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 柠檬酸钾 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 磷酸氢二钾 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 磷酸二氢钾 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 羟乙基淀粉 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 甘露醇 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 氯化钠 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 氯化铵 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 氯化钙 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 氯霉素 | 0 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 维生素E | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| 还原型谷胱甘肽 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 叠氮钠 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 磷脂酶B | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 超氧歧化酶 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 精氨酸 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
注：“1”表示1#-8#的红细胞保存液中所添加的成分，“0”表示1#-8#的红细胞保存液中没有添加的成分。
请参阅图3，图3是第二组红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度随细胞保养时间变化的示意图。图3示出了第二组红细胞悬液中的1#-8#的游离血红蛋白浓度在3个月之内的测定结果。具体地，如图3所示，随着保存时间的延长，1#-8#的红细胞悬液的游离血红蛋白浓度都逐渐上升。1#对应的游离血红蛋白浓度明显大于3#对应的游离血红蛋白浓度，且随着保存时间的延长，1#和3#之间的差异越来越大，这表明红细胞保存液中采用氯霉素替代叠氮钠将更有利于延长红细胞的保存期限。3#对应的游离血红蛋白浓度小于4#对应的游离血红蛋白浓度，这表明在红细胞保存液中添加抑菌剂能够延长红细胞的保存期限。7#和8#对应的游离血红蛋白浓度明显小于5#和6#对应的游离血红蛋白浓度，且随着保存时间的延长，7#和8#与5#和6#之间的差异越来越大，这表明红细胞保存液中采用维生素E或还原性谷胱甘肽替代超氧歧化酶和精氨酸更有利于延长红细胞的保存期限。
表三 第三组红细胞悬液中的1#-9#的红细胞保存液成分
| 组分类别 | 1# | 2# | 3# | 4# | 5# | 6# | 7# | 8# | 9# |
| 葡萄糖 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 腺嘌呤 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 肌苷 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 柠檬酸钾 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 磷酸氢二钾 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 磷酸二氢钾 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 羟乙基淀粉 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 甘露醇 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 氯化钠 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 氯化铵 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 氯化钙 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 氯霉素 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 维生素E | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| 还原型谷胱甘肽 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| 超氧歧化酶 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 茶多酚 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
注：“1”表示1#-9#的红细胞保存液中所添加的成分，“0”表示1#-9#的红细胞保存液中没有添加的成分。
请参阅图4，图4是第三组红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度随细胞保养时间变化的示意图。图4示出了第三组红细胞悬液中的1#-9#的游离血红蛋白浓度在6个月之内的测定结果。具体地，如图4所示，随着保存时间的延长，1#-9#的红细胞悬液的游离血红蛋白浓度都逐渐上升。1#和3#对应的游离血红蛋白浓度明显大于4#和5#对应的游离血红蛋白浓度，且随着保存时间的延长，1#和3#与4#和5#之间的差异越来越大，这表明红细胞保存液中添加抗氧化剂的条件下更有利于延长红细胞的保存期限，且红细胞保存液中采用维生素E或还原性谷胱甘肽替代超氧歧化酶将更有利于延长红细胞的保存期限。8#对应的游离血红蛋白浓度小于1#-7#和9#对应的游离血红蛋白浓度，这表明茶多酚添加至本发明的红细胞保存液中会出现缩短红细胞的保存期限的现象。8#对应的游离血红蛋白浓度小于1#-7#和9#对应的游离血红蛋白浓度，这表明本发明的红细胞保存液有利于延长红细胞的保存期限。
表四 第四组红细胞悬液中的1#-5#的红细胞保存液成分及含量
| 组分含量 | 1# | 2# | 3# | 4# | 5# |
| 葡萄糖 | 90mmol/L | 90mmol/L | 90mmol/L | 90mmol/L | 90mmol/L |
| 腺嘌呤 | 3.5mmol/L | 3.5mmol/L | 3.5mmol/L | 3.5mmol/L | 3.5mmol/L |
| 肌苷 | 1.3mmol/L | 1.3mmol/L | 1.3mmol/L | 1.3mmol/L | 1.3mmol/L |
| 柠檬酸钾 | 16mmol/L | 16mmol/L | 16mmol/L | 16mmol/L | 16mmol/L |
| 磷酸氢二钾 | 25mmol/L | 25mmol/L | 25mmol/L | 25mmol/L | 25mmol/L |
| 磷酸二氢钾 | 14mmol/L | 14mmol/L | 14mmol/L | 14mmol/L | 14mmol/L |
| 羟乙基淀粉 | 0.2mmol/L | 0.2mmol/L | 0.2mmol/L | 0.2mmol/L | 0.2mmol/L |
| 甘露醇 | 45mmol/L | 45mmol/L | 45mmol/L | 45mmol/L | 45mmol/L |
| 氯化钠 | 77mmol/L | 77mmol/L | 77mmol/L | 77mmol/L | 77mmol/L |
| 氯化铵 | 40mmol/L | 40mmol/L | 40mmol/L | 40mmol/L | 40mmol/L |
| 氯化钙 | 0.36mmol/L | 0.36mmol/L | 0.36mmol/L | 0.36mmol/L | 0.36mmol/L |
| 氯霉素 | 7mmol/L | 7mmol/L | 7mmol/L | 7mmol/L | 7mmol/L |
| 维生素E | 0.012g/L | 0.01g/L | 0.01g/L | 0.008g/L | 0.01g/L |
| 还原型谷胱甘肽 | 2.00mmol/L | 1.6mmol/L | 2.4mmol/L | 2.00mmol/L | 2.00mmol/L |
请参阅图5，图5是第三组红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度随细胞保养时间变化的示意图。图5示出了第三组红细胞悬液中的1#-5#的游离血红蛋白浓度在3个月之内的测定结果。具体地，如图5所示，随着保存时间的延长，1#-5#的红细胞悬液的游离血红蛋白浓度都逐渐上升。
5#对应的游离血红蛋白浓度明显小于1#-4#对应的游离血红蛋白浓度，且随着保存时间的延长，5#与1#-4#之间的差异越来越大，这表明红细胞保存液中添加维生素E和还原型谷胱甘肽的量的大小会影响红细胞的保存期限，且红细胞保存液中采用低于或高于0.01g/L维生素E及低于或高于2.00mmol/L还原性谷胱甘肽，均会缩短红细胞的保存期限，因此本发明的红细胞保存液中采用0.01g/L维生素E及2.00mmol/L还原性谷胱甘肽更有利于延长红细胞的保存期限。可以理解地，虽然维生素E和还原性谷胱甘肽能够作为红细胞保存液中的抗氧化体系，以减弱或抑制红细胞内的氧化作用，但是少量的维生素E和还原性谷胱甘肽不足以抑制红细胞内的氧化作用，而过量的维生素E和还原性谷胱甘肽会使得红细胞内的氧化与抗氧化作用失衡的一种状态失衡。综上，本发明的红细胞保存液中的各组分类别及其组分含量更有利于延长红细胞的保存期限。
本发明优选各组分，整个保存体系各种成分协同作用，葡萄糖、腺嘌呤及肌苷作为营养体系主要负责为保存期间红细胞代谢提供能量，甘露醇可以作为抗溶血剂及提供胶体渗透压，羟乙基淀粉作为红细胞保持液的稀释剂和稳定剂，磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钾作为PH缓冲体系主要负责缓冲保存期间代谢产物造成的pH波动，氯化钠、氯化铵、氯化钙作为盐类缓冲体系主要负责维持晶体渗透压，氯霉素主要负责抑菌作用，维生素E及还原型谷胱甘肽作为抗氧化体系主要负责消化红细胞在保存期间产生的自由基。各组分相互牵制、协同作用，不仅延长红细胞的保存期限，且增强红细胞的性能稳定性，以满足临床检验需求。此外，实验结果表明使用本发明的红细胞保存液，通过优化红细胞保存液中的各个组分，不仅能够有效延长红细胞的保存期限，且保持红细胞活力，有效降低成本，以满足临床型红细胞转变为试剂检测型红细胞的检验需求，应用前景广。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上上述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (8)
1.一种红细胞保存液，其特征在于，包括溶剂、葡萄糖、腺嘌呤、肌苷、柠檬酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、羟乙基淀粉、甘露醇、氯化钠、氯化铵、氯化钙、氯霉素、维生素E及还原型谷胱甘肽，所述红细胞保存液的组成和含量如下：所述葡萄糖89.55-90.45mmol/L、所述腺嘌呤3.48-3.52mmol/L、所述肌苷1.29-1.31mmol/L、所述柠檬酸钾15.92-16.08mmol/L、所述磷酸氢二钾24.88-25.13mmol/L、所述磷酸二氢钾13.93-14.07mmol/L、所述羟乙基淀粉0.20-0.21mmol/L、所述甘露醇44.78-45.23mmol/L、所述氯化钠76.62-77.39mmol/L、所述氯化铵39.80-40.20mmol/L、所述氯化钙0.35-0.36mmol/L、所述氯霉素6.97-7.04mmol/L、所述维生素E 0.010-0.011g/L、所述还原型谷胱甘肽1.99-2.01mmol/L，所述红细胞包括人红细胞。
2.如权利要求1所述的红细胞保存液，其特征在于，所述红细胞保存液的组成和含量如下：所述葡萄糖90mmol/L、所述腺嘌呤3.5mmol/L、所述肌苷1.3mmol/L、所述柠檬酸钾16mmol/L、所述磷酸氢二钾25mmol/L、所述磷酸二氢钾14mmol/L、所述羟乙基淀粉0.2mmol/L、所述甘露醇45mmol/L、所述氯化钠77mmol/L、所述氯化铵40mmol/L、所述氯化钙0.36mmol/L、所述氯霉素7mmol/L、所述维生素E 0.01g/L、所述还原型谷胱甘肽2.00mmol/L。
3.如权利要求1所述的红细胞保存液，其特征在于，所述溶剂为去离子水或超纯水。
4.一种红细胞保存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将甘露醇、腺嘌呤、肌苷、羟乙基淀粉、柠檬酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化铵、氯化钙、氯霉素溶解于溶剂中，以得到混合溶液；
调节所述混合溶液的pH值，并灭菌处理；
向所述混合溶液中加入葡萄糖溶液、维生素E和还原型谷胱甘肽，以制得所述红细胞保存液，其中，所述红细胞保存液的组成和含量如下：所述葡萄糖89.55-90.45mmol/L、所述腺嘌呤3.48-3.52mmol/L、所述肌苷1.29-1.31mmol/L、所述柠檬酸钾15.92-16.08mmol/L、所述磷酸氢二钾24.88-25.13mmol/L、所述磷酸二氢钾13.93-14.07mmol/L、所述羟乙基淀粉0.20-0.21mmol/L、所述甘露醇44.78-45.23mmol/L、所述氯化钠76.62-77.39mmol/L、所述氯化铵39.80-40.20mmol/L、所述氯化钙0.35-0.36mmol/L、所述氯霉素6.97-7.04mmol/L、所述维生素E 0.010-0.011g/L、所述还原型谷胱甘肽1.99-2.01mmol/L，所述红细胞包括人红细胞，向所述混合溶液中加入葡萄糖溶液、维生素E和还原型谷胱甘肽，包括：
配置第一浓度的葡萄糖溶液，灭菌处理；
将灭菌处理后的葡萄糖溶液中加入至灭菌处理后的混合溶液中，以得到保存基础液；其中，所述保存基础液中的葡萄糖溶液的浓度为第二浓度，所述第二浓度小于所述第一浓度；
向所述保存基础液中添加无菌处理后的维生素E和还原型谷胱甘肽，以制得所述红细胞保存液。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，向所述保存基础液中添加无菌处理后的维生素E和还原型谷胱甘肽，以制得所述红细胞保存液，包括：
向所述保存基础液中添加无菌处理后的维生素E和还原型谷胱甘肽，以制得红细胞保存原液；
向所述红细胞保存原液中添加预设体积的补充溶液，以制得所述红细胞保存液；其中，所述溶剂和所述补充溶液为去离子水或超纯水。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：
确定配置所述红细胞保存液的目标体积；
根据所述目标体积按照预设体积比配置所述混合溶液、所述葡萄糖溶液、包含所述维生素E和所述还原型谷胱甘肽的抗氧化溶液及所述补充溶液。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述红细胞保存液的组成和含量如下：所述葡萄糖90mmol/L、所述腺嘌呤3.5mmol/L、所述肌苷1.3mmol/L、所述柠檬酸钾16mmol/L、所述磷酸氢二钾25mmol/L、所述磷酸二氢钾14mmol/L、所述羟乙基淀粉0.2mmol/L、所述甘露醇45mmol/L、所述氯化钠77mmol/L、所述氯化铵40mmol/L、所述氯化钙0.36mmol/L、所述氯霉素7mmol/L、所述维生素E 0.01g/L、所述还原型谷胱甘肽2.00mmol/L。
8.一种红细胞悬液，其特征在于，包括红细胞和如权利要求1-3中任意一项所述的红细胞保存液。
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