CN109337862A - 一种精子洗涤液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及精子处理领域，具体而言，涉及一种精子洗涤液及其制备方法和应用。一种精子洗涤液，包括以下组分：氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、丙酮酸钠、乳酸钠、葡萄糖、HEPES、甘氨酸、谷氨酰胺、L‑丙氨酸、L‑天门冬氨酸、L‑天门冬酰胺、L‑谷氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸、维生素E、维生素C、维生素B12、牛磺酸、庆大霉素、人血清白蛋白。本发明提供的精子洗涤液，含有的组分齐全，各物质协同配合，有效提供营养能量，抑制氧化反应，保持精子的活性，提高精子的成活率。

Description

一种精子洗涤液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及精子处理领域，具体而言，涉及一种精子洗涤液及其制备方法和应用。

背景技术

随着社会环境以及人类晚婚晚育的发展，不孕不育率逐年增高，促使试管婴儿或者体外受精等辅助生育技术的发展。这些技术中需要采集到优良的精子，精子质量的好坏决定了辅助生育的成败。目前采集精子主要有两个方面的来源，一是直接采集人体精子，二是从精子库中提取。这两种来源在操作前都需要对精子进行洗涤，以去掉状态差或者已经死亡的精子。同时需要使质量优良的精子获得足够的能量，并去掉精液或者冻存液中有害成分。

目前市面上使用的洗涤液良莠不齐，效果不佳，价格昂贵。有些洗涤液中营养成分不足或不全，在洗涤过程中容易造成精子死亡或者获能不足。因此，需要进一步研发效果更好，价格适中的精子洗涤液。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的主要目的在于解决现有技术中精子洗涤后活力不高，有害物质洗涤不充分等问题，提供一种精子洗涤培养液及其制备方法和应用。

目前的精子洗涤液产品洗涤精子后保持活力率接近或低于75％的标准合格率。对于一些弱精或者少精患者，提高该保持活力率非常重要。目前的产品中精子营养物质不足，保护物质不够。精子保持活力的重要因素是营养能量提供以及抗氧化保护，营养能量物质主要是葡萄糖以及各种氨基酸。现有产品的氨基酸种类以及比例搭配不是十分合适，缺乏抗氧化保护剂。这些因素导致了当前精子洗涤液洗涤后保持活力率偏低。

在洗涤过程中，精液和洗涤液中的活性氧以及氧化物质容易使精子发生氧化应激反应，使得精子的线粒体和DNA受到损伤。维生素E和维生素B12能够抑制氧化反应，提高精子的成活率。

研究表明，精液中游离的氨基酸随着男性年龄增加比例也逐渐变化，精子的活力也逐渐下降。同时存在不孕不育问题男性中，精液的游离氨基酸比例也不一样，部分氨基酸如苯丙氨酸、精氨酸缺失，提示精液中游离氨基酸的种类和比例对于精子活力有非常重要的影响。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种精子洗涤液，以所述洗涤液的体积计，包括以下组分：氯化钠100±5mM，氯化钾4.6±0.2mM，硫酸镁0.2±0.01mM，氯化钙2.0±0.1mM，碳酸氢钠4±0.2mM，磷酸二氢钾0.36±0.02mM，丙酮酸钠0.32±0.02mM，乳酸钠20±1mM，葡萄糖2.8±0.1mM，HEPES 20±0.5mM，甘氨酸0.1±0.01mM，谷氨酰胺1.0±0.05mM，L-丙氨酸0.1±0.05mM，L-天门冬氨酸0.1±0.05mM，L-天门冬酰胺0.1±0.05mM，L-谷氨酸0.1±0.05mM，L-脯氨酸0.1±0.05mM，L-丝氨酸0.1±0.05mM，维生素E 100±10μg/ml，维生素C 100±10μg/ml，维生素B12 100±10μg/ml，牛磺酸0.1±0.01mM，庆大霉素5±0.2μg/ml，人血清白蛋白5±0.2mg/ml。

本发明提供的精子洗涤液，含有的组分全面，各物质协同配合，有效提供营养能量，抑制氧化反应，保持精子的活性，提高精子的成活率。

进一步地，所述精子洗涤液的pH值为7.1-7.5，渗透压为275-295mOsm/kg。

进一步地，内毒素含量小于1.0EU/ml。

本发明还提供了上述的精子洗涤液的制备方法，包括以下步骤：

(a)氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、丙酮酸钠、乳酸钠、葡萄糖和HEPES加水制成溶液；

(b)加入甘氨酸、谷氨酰胺、L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-天门冬酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、维生素E、维生素C、维生素B12、牛磺酸和庆大霉素，混合均匀；

(c)加入人血清白蛋白，定容即可。

本发明提供的精子洗涤液的制备方法中，先将无机盐和糖类等混合，然后加入氨基酸和维生素类物质等，得到的混合液中加入血清白蛋白，防止血清白蛋白活性的破坏，得到的溶液各组分处于一定均衡的平衡体系中。

其中，在开始时加水制成溶液步骤中，水的量一般在总水量的70％-90％，以便于各组分的混合均匀。

进一步地，步骤(a)中制成的溶液进行过滤后再进行步骤(b)的步骤。该步骤的过滤主要是去除杂质和微生物。

进一步地，所述过滤采用0.22μm滤膜过滤。

进一步地，步骤(b)得到的溶液的渗透压为260-270mOsm/kg，pH值为7.0-7.4。

进一步地，步骤(c)定容后还包括过滤的步骤，该过滤采用0.22μm滤膜过滤。该步骤的过滤是进一步纯化液体。

本发明还提供了上述的精子洗涤液在处理新鲜精液中的应用。

具体地，步骤如下：

(1)将洗涤液预热到37℃左右。

(2)新鲜精液液化后，将其置入无菌无毒的试管中，按照精液体积:洗涤液体积1:2-4加入洗涤液，轻轻混匀。

(3)800-1000转/分钟离心5-8分钟，轻轻吸掉上层液体，留下沉淀。此步骤为去掉精液中其他成分，沉淀中为精子。

(4)往上述沉淀中加入3-5ml洗涤液，轻轻混匀，800-1000转/分钟离心5-8分钟，轻轻吸掉上层液体。

(5)往沉淀中加入1-2ml洗涤液，制备成悬浮液待用。

若想获得高活力的精子，可以在步骤(3)之后，往沉淀加入3-5ml洗涤液，然后置入37℃水浴30min，之后吸取上面1ml左右液体放入新的离心管中，补充洗涤液至2ml，离心，沉淀中加入1ml洗涤液，制备成悬浮液待用。

本发明还提供了上述的精子洗涤液在培养精子处理中的应用。

具体地，步骤如下：

(1)将洗涤液预热到37℃左右。

(2)往样品里加入样品体积：洗涤液体积为1:2-4的洗涤液，轻轻混匀。

(3)800-1000转/分钟离心5-8分钟，弃掉上层液体，留下沉淀。

(4)沉淀中加入1-2ml洗涤液，制备成悬浮液备用。

本发明还提供了上述的精子洗涤液在处理冻存精液中的应用。

具体地，步骤如下：

(1)将洗涤液预热到37℃左右。

(2)冻存样品在37℃水浴中迅速复温1分钟，复温过程轻轻振荡。

(3)加入体积为冻存体积3-4倍的洗涤液，轻轻混匀。

(4)800-1000转/分钟，离心5-8分钟，弃掉上层液体，留下沉淀。

(5)再次加入3-5ml洗涤液，再次洗涤。

(6)最后精子沉淀中加入1-2ml洗涤液，制备成精子悬浮液待用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的精子洗涤液，含有的组分全面，各物质协同配合，有效提供营养能量，抑制氧化反应，保持精子的活性，提高精子的成活率。

(2)本发明提供的精子洗涤液的制备方法，简便易行，易于产业化生产。

(3)本发明提供的精子洗涤液，可广泛用于精子液的处理中。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

精子洗涤液的配制(以10L为例)

A.按照下表中的组份配制，按照先固体后溶液配制，定容到10L后用0.22μm过滤。

表1组分情况

具体制备步骤如下：

a.将各种无机盐固体(氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、丙酮酸钠、乳酸钠、葡萄糖和HEPES)称量准确，用超纯注射用水溶解。

b.将上述液体经过0.22μm滤膜过滤。

c.加入组分中的氨基酸(甘氨酸、谷氨酰胺、L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-天门冬酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、牛磺酸)、维生素(维生素E、维生素C、维生素B12)和庆大霉素。测量溶液的渗透压以及pH值，此时溶液渗透压为260-270mOsm/Kg,pH值为7.0-7.4。

d.加入重组人血清白蛋白，使得最终白蛋白浓度为5mg/ml。

e.将上述溶液定容，然后再次经过0.22μm滤膜过滤。取一定样品进行测试实验，检测指标：

1)20-37℃条件下pH：7.1-7.5；

2)渗透压：275-295mOsm/Kg；

3)内毒素<1.0EU/ml；

4)鼠胚培养120小时，≥80％的囊胚形成率；

5)细菌检测。

f.将配置好的溶液无菌分装，2-8℃存储保存，尽量避光。

B.在室温30℃下，三次各抽取20ml测量pH值为7.30,7.42,7.28,平均值为7.33，处于7.2-7.4的范围；

C.取精子洗涤液三次测量渗透压为280mOms/kg，275mOms/kg,285mOms/kg，三次平均值为280mOms/kg。

对比例1

与实施例1不同的是，不含有维生素E、维生素C、维生素B12。

对比例2

与实施例1不同的是，不含有维生素C。

对比例3

与实施例1不同的是，非必需氨基酸只保留甘氨酸和丝氨酸，其他非必需氨基酸去除，其余均不变。

实验例1

实施例1制得的精子洗涤液还进行以下检测：

1、精子洗涤液细胞毒性试验

按照GB/T 16886.5进行细胞毒性试验，当前精子洗涤液成品毒性试验积分为0.2，小于1分，洗涤液毒性试验合格。

2、致敏性检测

按照GB/T 16886.10进行致敏性检测，向20只成年小鼠注射该洗涤液，20分钟后无异常无过敏反应。

3、细菌内毒素检测

采用鲎试剂凝胶法进行检测，检测值为0.5EU/ml,小于规定的1EU/ml,产品合格。

实验例2

对实施例1以及对比例1-3制得的精子洗涤液进行精子活力实验

精子洗涤液提前预热至37℃左右；

取1ml新鲜精液，均分为四份，每份中加入不同的精子洗涤液0.5ml，轻轻混合之后1000转/分钟离心5分钟，去掉上清液。

再次加入1ml洗涤液，轻轻混合，置于37℃水浴30分钟，然后吸取上层0.4ml液体(此液体内精子活力为100％)放入新的离心管中，加入预热的2ml洗涤液，37℃无CO₂培养24h。

在200倍显微镜下检测精子活力，随机计数三个视野，记录活动的与不活动的精子总数。

经检测，实施例1提供的精子洗涤液中，每个视野中精子总个数分别为158,173,149，保持活力的精子数分别为145,159,137，保持比率为91.8％，91.9％，91.9％，平均值为91.9％，远超过75％的标准。

经检测，对比例1提供的精子洗涤液中，每个视野中精子总个数分别为162,180,151，保持活力的精子数分别为135,149,128，保持比率为83.3％，82.8％，84.8％，平均值为83.6％。

经检测，对比例2提供的精子洗涤液中，每个视野中精子总个数分别为160,175,145，保持活力的精子数分别为125,136,120，保持比率为78.1％，77.7％，82.8％，平均值为79.5％。

经检测，对比例3提供的精子洗涤液中，每个视野中精子总个数分别为165,173,155，保持活力的精子数分别为134,145,125，保持比率为81.2％，83.8％，80.6％，平均值为81.9％。

精子活力＝前向运动精子数量/总精子数量。

从上述检测结果可以看出，本发明实施例提供的精子洗涤液的保持精子的活性效果明显优越于其他对比例。

实验例3

精子培养实验

取4份新鲜精液样本，每份新鲜精液分为两组，组1采用实施例1提供的精子洗涤液处理，组2采用对比例1提供的精子洗涤液处理。具体处理方法如下：

每组新鲜精液样本分别加入2ml洗涤液，轻轻混合之后1000转/分钟离心5分钟，去掉上清液。加入1ml洗涤培养液，此时对精子活力进行计数，随后在37℃无CO₂环境培养24h、48h、72h分别检测精子存活率(存活率＝活动精子数量/总精子数量)。结果如下：

表2检测存活率

从表2可以看出，本发明实施例提供的精子洗涤液能更好的维持精子存活，明显优于未添加维生素的组别。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种精子洗涤液，其特征在于，以所述洗涤液的体积计，包括以下组分：氯化钠100±5mM，氯化钾4.6±0.2mM，硫酸镁0.2±0.01mM，氯化钙2.0±0.1mM，碳酸氢钠4±0.2mM，磷酸二氢钾0.36±0.02mM，丙酮酸钠0.32±0.02mM，乳酸钠20±1mM，葡萄糖2.8±0.1mM，HEPES20±0.5mM，甘氨酸0.1±0.01mM，谷氨酰胺1.0±0.05mM，L-丙氨酸0.1±0.05mM，L-天门冬氨酸0.1±0.05mM，L-天门冬酰胺0.1±0.05mM，L-谷氨酸0.1±0.05mM，L-脯氨酸0.1±0.05mM，L-丝氨酸0.1±0.05mM，维生素E 100±10μg/ml，维生素C 100±10μg/ml，维生素B12 100±10μg/ml，牛磺酸0.1±0.01mM，庆大霉素5±0.2μg/ml，人血清白蛋白5±0.2mg/ml。

2.根据权利要求1所述的精子洗涤液，其特征在于，所述精子洗涤液的pH值为7.1-7.5，渗透压为275-295mOsm/kg；

进一步地，内毒素含量小于1.0EU/ml。

3.权利要求1或2所述的精子洗涤液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、丙酮酸钠、乳酸钠、葡萄糖和HEPES加水制成溶液；

(b)加入甘氨酸、谷氨酰胺、L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-天门冬酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、维生素E、维生素C、维生素B12、牛磺酸和庆大霉素，混合均匀；

(c)加入人血清白蛋白，定容即可。

4.根据权利要求3所述的精子洗涤液的制备方法，其特征在于，步骤(a)中制成的溶液进行过滤后再进行步骤(b)的步骤。

5.根据权利要求4所述的精子洗涤液的制备方法，其特征在于，所述过滤采用0.22μm滤膜过滤。

6.根据权利要求3所述的精子洗涤液的制备方法，其特征在于，步骤(b)得到的溶液的渗透压为260-270mOsm/kg，pH值为7.0-7.4。

7.根据权利要求3所述的精子洗涤液的制备方法，其特征在于，步骤(c)定容后还包括过滤的步骤，该过滤采用0.22μm滤膜过滤。

8.权利要求1-2任一项所述的精子洗涤液在处理新鲜精液中的应用。

9.权利要求1-2任一项所述的精子洗涤液在培养精子处理中的应用。

10.权利要求1-2任一项所述的精子洗涤液在处理冻存精液中的应用。