CN109628380A - 一种人体外受精液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人体外受精液，其配方包括无机盐氯化钠90～113mM/L、氯化钾4.20～5.18mM/L、二水氯化钙1.80～2.28mM/L、磷酸二氢钾0.26～0.48mM/L和七水硫酸镁0.18～0.87mM/L，pH缓冲剂碳酸氢钠20～30mM/L，抑菌成份硫酸庆大霉素0.01～0.05g/L，能量物质丙酮酸钠0.21～0.45mM/L、L‑乳酸钠18.50～24.3mM/L、葡萄糖2.56～3.00mM/L，其它成分非必需氨基酸0.45～1.05％(v/v)，丙胺酰谷氨酰胺0～1.0mM/L、乙二胺四乙酸二钠0～0.01mM/L、牛磺酸0.05～0.10mM/L、人血清蛋白5～10g/L，以及人重组胰岛素42～58IU/L。

Description

一种人体外受精液及其制备方法
技术领域
本发明属于人类辅助生殖领域，具体涉及一种人体外受精液以及制备所述体外受精液的方法。
背景技术
人类第一例体外受精(IVF)婴儿诞生于1978年，从此辅助生殖蓬勃发展，相继诞生卵子单精子注射(ICSI)，植入前遗传学诊断(PGD)，卵子或胚胎冻存等技术，极大地促进了辅助生殖业。
体外受精液是人类辅助生殖领域中最常规的试剂之一，它为体外受精提供了能量及受精环境，是辅助生殖领域临床或实验研究中不可或缺的试剂。目前国内临床所用的受精液均为进口试剂，价格高昂，给患者带来巨大的经济负担。另外，进口采购周期长，长途运输条件的不确定性有可能导致产品的性能下降。
现市场受精液基本上都为人输卵管液(HTF)，只针对精子数正常的男性按常规受精操作规程使用，对于精子数目少的患者达不到理想的受精效果。本发明在HTF的基础上进一步研究并改良了人体外受精液的配方，通过增加人重组胰岛素及EDTA等成分，并优化配比，提高了体外受精性能，尤其是在患者精子数量较少的情况下仍可实现较高的受精率。
发明内容
针对以上问题，本发明的一个目的是提供一种人体外受精液，其配方包括无机盐氯化钠90～113mM/L、氯化钾4.20～5.18mM/L、二水氯化钙1.80～2.28mM/L、磷酸二氢钾0.26～0.48mM/L和七水硫酸镁0.18～0.87mM/L，pH缓冲剂碳酸氢钠20～30mM/L，抑菌成份硫酸庆大霉素0.01～0.05g/L，能量物质丙酮酸钠0.21～0.45mM/L、L-乳酸钠18.50～24.3mM/L、葡萄糖2.56～3.00mM/L，其它成分非必需氨基酸0.45～1.05％(v/v)，丙胺酰谷氨酰胺0～1.0mM/L、乙二胺四乙酸二钠0～0.01mM/L、牛磺酸0.05～0.10mM/L、人血清蛋白5～10g/L，以及人重组胰岛素42～58IU/L。
进一步，所述配方包括无机盐氯化钠92.5～101.5mM/L、氯化钾4.52～4.90mM/L、二水氯化钙1.89～2.10mM/L、磷酸二氢钾0.32～0.39mM/L和七水硫酸镁0.18～0.22mM/L，pH缓冲剂碳酸氢钠22～28mM/L，抑菌成份硫酸庆大霉素0.01～0.04g/L，能量物质丙酮酸钠0.30～0.40mM/L、L-乳酸钠20.25～22.90mM/L、葡萄糖2.69～2.93mM/L，其它成分非必需氨基酸0.45～1％(v/v)，丙胺酰谷氨酰胺0.5～1.0mM/L、乙二胺四乙酸二钠0.005～0.01mM/L、牛磺酸0.07～0.10mM/L、人血清蛋白5～10g/L，以及人重组胰岛素48～50IU/L。
进一步，所述配方还包括pH指示剂酚红0.005～0.01g/L。
本发明的另一个目的是提供所述的人体外受精液在人类配子体外受精过程中的应用。
本发明的再一个目的是提供一种制备人体外受精液的方法，包括以下步骤：
a、按配方称量所有固体成分并分开放置；
b、按先固体后液体，将除硫酸庆大霉素、酚红、碳酸氢钠和人血清白蛋白外的所有成分加入并溶解于超纯水中；
c、向步骤b获得的溶液加入硫酸庆大霉素及酚红，最后加入碳酸氢钠并溶解得基础液；
d、将基础液放入5％二氧化碳，95％空气和饱和温度的培养箱内平衡7-12
小时；
e、测量并调节上述基础液pH值在7.3±0.1，渗透压在260～290mOsm/kg；
f、将基础液经0.22μm过滤器过滤，按比例加入人血清白蛋白并分装、封口，2-8℃保存。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步对本发明进行说明，不能理解为是对本发明的限制，实施例中使用的材料、试剂，仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径得到。
【实施例1】体外受精液配方及制备方法：
A、体外受精液配方：
B、配制方法：
a、按配方称取所有固体成分并分开放置；
b、按先固体后液体，碳酸氢钠最后加的原则，将除硫酸庆大霉素、酚红、碳酸氢钠和人血清白蛋白外的所有成分加入并溶解于超纯水中；
c、向步骤b中的溶液加入硫酸庆大霉素及酚红，最后加入碳酸氢钠并溶解得基础液；
d、上述基础液放入5％二氧化碳，95％空气和饱和温度的培养箱平衡7-12小时；
e、测量并调节上述基础液pH值在7.3±0.1，渗透压在260～290mOsm/kg，并作好记录；
f、隔离器内用将基础液经0.22μm过滤器过滤，按比例加入人血清白蛋白并在隔离工作台内分装、封口，2-8℃保存。
【实施例2】体外受精液的质控检测
1、pH值检测
取适量待测样品用pH计测量三次，取所得三个数据的平均值为结果，在7.3±0.1视为合格。
渗透压检测
渗透压仪校正后，取500μl待测样品到测试管中开始测试，当数值稳定后读出数据，按以上方法测出3个数据，取平均值为结果，在260～290mOsm/kg视为合格。
细菌内毒素检测
根据中华人民共和国药典2015版要求，用鲎试剂凝胶法进行检测，结果≤0.1EU/ml视为合格。
细胞毒性
按GB/T 16886.5的规定进行检测，细胞毒性分数不应超过1分。
致敏检测
按GB/T 16886.10的规定进行检测，应无致敏反应。
无菌试验
根据中华人民共和国药典2015版要要求，运用薄膜过滤法，待测样品经滤膜过滤后直接接种培养基培养14天，每天观察结果，应无菌。
皮内刺激
按GB/T 16886.10的规定进行检测，应无皮内刺激反应。
热原
根据中华人民共和国药典2015版要求，应无热原反应。
小鼠胚胎体外培养试验
(1)小鼠超数排卵
选取4～6周龄B6D2品系小鼠10IU/只注射PMSG，48h后10IU/只注射hCG，注射完hCG后即与同品系具有交配能力的雄鼠交配。
(2)准备胚胎体外培养皿
取无菌35mm皿，用待测样品做数滴50μl液滴作为测试组培养滴，用含70IU/ml内毒素的M16培养液做数滴50μl液滴作为阳性对照组，用普通M16培养液做数滴50μl液滴作为阴性对照组，表面覆盖培养用矿物油，放5％CO2，5％O2，90％N2，饱和湿度的培养箱中过夜平衡。
(3)受精卵收集
合笼后第二天早上检栓，见栓母鼠选取后处死，取其输卵管放于预热至37℃M2操作液中，将输卵管壶腹部膨大处刺破，收集絮状受精卵团至37℃透明质酸酶滴中消化颗粒细胞，待颗粒细胞完全脱落后将受精卵转移到37℃M2中清洗数次，挑取受精胚胎待用。
(4)胚胎培养
上述胚胎随机平均分三组，每组不少于50枚，一组放于测试组中培养，一组放于阳性对照级培养，一组放于阴性对照组培养，培养皿放于5％CO2，5％O2，90％N2，饱和湿度的培养箱中培养24h。将三组胚胎分别转移到经平衡后的M16培养液滴中继续培养72h。
(5)测试结果
培养72h后记录各组囊胚数。
可接受标准：a、阳性对照组囊胚数统计学上显著低于阴性对照组囊胚数
b、阴性对照组囊胚数≥80％
(6)检测结果
表1各配方的检测结果
检测项目 配方1 配方2 配方3 配方4 配方5 配方6 配方7 配方8
pH值 7.3 7.3 7.3 7.3 7.4 7.4 7.3 7.4
渗透压mOsm/kg 278 275 269 268 267 276 269 271
内毒素 合格 合格 合格 合格 合格 合格 合格 合格
细胞毒素 合格 合格 合格 合格 合格 合格 合格 合格
致敏检测 无致敏反应 无致敏反应 无致敏反应 无致敏反应 无致敏反应 无致敏反应 无致敏反应 无致敏反应
无菌测试 无菌 无菌 无菌 无菌 无菌 无菌 无菌 无菌
皮内刺激 无皮内刺激 无皮内刺激 无皮内刺激 无皮内刺激 无皮内刺激 无皮内刺激 无皮内刺激 无皮内刺激
热原检测 无热原 无热原 无热原 无热原 无热原 无热原 无热原 无热原
鼠胚体外培养测试 90.23％ 93.50％ 94.21％ 96.10％ 92.86％ 90.8％ 93.00％ 92.00％
【实施例3】小鼠胚胎学实验
小鼠体外受精实验步骤
1、实验材料
(1)小鼠：雌性C57，4-5周龄，雄性C57,10周龄。12光照，温度20-25℃，自由采食和饮水；
(2)耗材与设备：1ml注射器，眼科剪，眼科镊；
(3)试剂：PMSG，hCG，HTF培养液，KSOM-AA胚胎培养液，实验组受精液。
2、培养皿准备(IVF前1天下午准备并在培养箱里平衡过夜)
(1)鲜精采集皿：500μl HTF(35mm国产)，500μl实验组受精液(35mm国产)；
(2)卵子采集皿：1ml M2(35mm国产)提前1小时预热至37℃；
(3)体外受精皿和清洗用培养皿：60mm(HTF)皿----上部做受精液滴，下部做清洗液滴60mm(实验组受精液)皿----上部做受精液滴，下部做清洗液滴；
(4)发育培养皿：35mm皿，培养密度：10枚胚胎/50ul。
3、操作步骤
A.体内成熟的MⅡ期卵母细胞收集准备
(1)第一天21：00，雌鼠腹腔(IP)注射10IU PMSG；
(2)48h后腹腔(IP)注射10IU hCG；
(3)hCG注射后13小时左右，雌鼠颈椎脱臼致死，75％酒精消毒腹部，从腹部剪下两侧卵巢及输卵管迅速置于预热的M2；
(4)在体视镜下用1ml注射器(1号针头)将输卵管刺破，释放出COCs；
(5)用口吸管将COCs置于100ul 0.1％Hya消化去除卵丘细胞(体视镜下观察)；
(6)MII期卵母细胞经M2液滴洗涤3次，移入HTF/实验组受精液中，置于CO2培养箱培养1小时备用。
B.精子准备
(1)采集小鼠精液进行IVF MII期卵母细胞准备好之后，颈椎脱臼致死雄鼠；
(2)75％酒精消毒腹部，剪开腥部取出附睾尾及输精管迅速置于预热的获能液HTF/实验组受精液中，剪2-3下，使精子团释放上浮并获能1小时；
(3)用移液器取10～20ul(依精液浓度而定)精液于受精液中共同孵育6小时；
(4)倒置显微镜下挑选排出第二极体或有双原核的受精卵经KSOM培养液洗涤几次，移入KSOM培养液(平衡4h以上)继续培养。此时计为0h，统计受精率；
(5)观察，记录体外受精和发育情况。
对照组HTF成分为：
表2受精效果对比结果
表3不同精子浓度对受精效果对比结果

Claims (10)

1.一种人体外受精液，其配方包括无机盐氯化钠90～113mM/L、氯化钾4.20～5.18mM/L、二水氯化钙1.80～2.28mM/L、磷酸二氢钾0.26～0.48mM/L和七水硫酸镁0.18～0.87mM/L，pH缓冲剂碳酸氢钠20～30mM/L，抑菌成份硫酸庆大霉素0.01～0.05g/L，能量物质丙酮酸钠0.21～0.45mM/L、L-乳酸钠18.50～24.3mM/L、葡萄糖2.56～3.00mM/L，其它成分非必需氨基酸0.45～1.05％(v/v)，丙胺酰谷氨酰胺0～1.0mM/L、乙二胺四乙酸二钠0～0.01mM/L、牛磺酸0.05～0.10mM/L、人血清蛋白5～10g/L，以及人重组胰岛素42～58IU/L。
2.如权利要求1所述的人体外受精液，其特征在于，所述非必需氨基酸包括L-丙氨酸，L-天冬氨酸，L-天门氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸的一种或几种。
3.如权利要求1所述的人体外受精液，其特征在于，所述配方为无机盐氯化钠92.5～101.5mM/L、氯化钾4.52～4.90mM/L、二水氯化钙1.89～2.10mM/L、磷酸二氢钾0.32～0.39mM/L和七水硫酸镁0.18～0.22mM/L，pH缓冲剂碳酸氢钠22～28mM/L，抑菌成份硫酸庆大霉素0.01～0.04g/L，能量物质丙酮酸钠0.30～0.40mM/L、L-乳酸钠20.25～22.90mM/L、葡萄糖2.69～2.93mM/L，其它成分非必需氨基酸0.45～1％(v/v)，丙胺酰谷氨酰胺0.5～1.0mM/L、乙二胺四乙酸二钠0.005～0.01mM/L、牛磺酸0.07～0.10mM/L、人血清蛋白5～10g/L，以及人重组胰岛素48～50IU/L。
4.如权利要求1-3中任一项所述的人体外受精液，其特征在于，所述配方还包括pH指示剂酚红0.005～0.01g/L。
5.如权利要求1所述的人体外受精液，其特征在于，所述配方为氯化钠101.5mM/L、氯化钾4.69mM/L、二水氯化钙2.04mM/L、磷酸二氢钾0.37mM/L，七水硫酸镁0.20mM/L，碳酸氢钠25mM/L，硫酸庆大霉素0.01g/L，丙酮酸钠0.33mM/L、L-乳酸钠21.40mM/L、葡萄糖2.78mM/L，非必需氨基酸0.50％(v/v)，丙胺酰谷氨酰胺1.0mM/L、乙二胺四乙酸二钠0.01mM/L、牛磺酸0.10mM/L、人血清蛋白5g/L，以及人重组胰岛素50IU/L。
6.如权利要求5所述的人体外受精液，其特征在于，所述配方还包括酚红0.01g/L。
7.如权利要求1所述的人体外受精液在人类配子体外受精过程中的应用。
8.一种制备人体外受精液的方法，包括以下步骤：
a、按权利要求1所述配方称量所有固体成分并分开放置；
b、按先固体后液体，将除硫酸庆大霉素、酚红、碳酸氢钠和人血清白蛋白外的所有成分加入并溶解于超纯水中；
c、向步骤b获得的溶液加入硫酸庆大霉素及酚红，最后加碳酸氢钠并溶解得基础液；
d、将基础液放入5％二氧化碳，95％空气和饱和温度的培养箱内平衡7-12小时；
e、测量并调节上述基础液pH值在7.3±0.1，渗透压在260～290mOsm/kg；
f、将基础液经0.22μm过滤器过滤，按比例加入人血清白蛋白并分装、封口，2-8℃保存。
9.一种由权利要求8所述方法配制而成的人体外受精液。
10.如权利要求8所述方法配制而成的人体外受精液在人类配子体外受精过程中的应用。
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