CN115812695A - 一种高效获取造血干细胞的骨髓保存液以及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效获取造血干细胞的骨髓保存液，包括：非必需氨基酸和EDTA‑Na2的磷酸缓冲液。本发明采用非必须氨基酸和EDTA‑Na2缓冲液配制的骨髓组织保存液，不仅保持骨髓组织和造血干细胞的活性，同时防止骨髓组织抗凝，达到高效分离造血干细胞的目的。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种高效获取造血干细胞的骨髓保存液以及使用方法。
背景技术
造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞具有重要指导意义，广泛应用于血液系统疾病以及自身免疫疾病。造血干细胞主要存在于骨髓、脐血、胎盘和外周血中。
骨髓移植的本质即造血干细胞移植，是通过静脉输注造血干细胞、祖细胞等，重建患者正常造血与免疫系统，从而治疗一系列疾病的治疗方法，是目前治疗白血病最有效的方法，同时也应用于自身免疫性疾病、血红蛋白等40多种疾病的治疗或辅助性治疗。
所有组织中，骨髓中造血干细胞含量最高，但从骨髓中获取造血干细胞需要通过骨髓穿刺技术，这对供者的伤害较大；同时造血干细胞很难实现体外大量扩增，因此造血干细胞数量的获取是骨髓移植过程中比较关键的环节之一。
通过骨髓穿刺技术抽取骨髓后，需要低温运输至专业实验室提取造血干细胞，因此，将骨髓进行保存时，保持骨髓组织活性尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种高效获取造血干细胞的骨髓保存液，本发明提供的骨髓组织保存液，不仅保持骨髓组织和造血干细胞的活性，同时防止骨髓组织抗凝，达到高效分离造血干细胞的目的。
本发明提供了一种高效获取造血干细胞的骨髓保存液，包括：非必需氨基酸和EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
进一步的，所述高效获取造血干细胞的骨髓保存液，包括：
0.1mM的非必需氨基酸溶液；
10～20mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
本发明提供的高效获取造血干细胞的骨髓保存液中包括0.1mM的非必需氨基酸溶液，其中，所述0.1mM的非必需氨基酸溶液由MEM NEAA非必需氨基酸溶液10mM(100X)稀释100倍得到。所述MEM NEAA非必需氨基酸溶液10mM(100X)为商品化的溶液，为市售产品。
本发明提供的骨髓保存液还包括10～20mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
在本发明的一些具体实施方式中，所述骨髓保存液包括：
0.1mM的非必需氨基酸溶液；
10mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述骨髓保存液包括：
0.1mM的非必需氨基酸溶液；
15mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述骨髓保存液包括：
0.1mM的非必需氨基酸溶液；
20mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
本发明还提供了一种上述高效获取造血干细胞的骨髓保存液的使用方法，包括以下步骤：
将骨髓与骨髓保存液等体积混合后置于2～8℃的条件下保存24小时，进行造血干细胞分离。
与现有技术相比，本发明提供了一种高效获取造血干细胞的骨髓保存液，包括：非必需氨基酸和EDTA-Na2的磷酸缓冲液。本发明采用非必须氨基酸和EDTA-Na2缓冲液配制的骨髓组织保存液，不仅保持骨髓组织和造血干细胞的活性，同时防止骨髓组织抗凝，达到高效分离造血干细胞的目的。
本发明提供的骨髓保存液配方对骨髓组织、细胞和人体无副作用，可以用于后续的科研及临床中。本保存液配方可显著提高造血干细胞的细胞数量和细胞活率，对细胞表型无影响，可满足临床移植治疗用。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的高效获取造血干细胞的骨髓保存液以及使用方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
以下实施例中，所使用的非必须氨基酸为商品化的溶液，MEM NEAA非必需氨基酸溶液10mM(100X)。
实施例
1.骨髓组织保存液配方：
实验组：
骨髓组织保存液为1*非必须氨基酸、10～20mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液(实验组1～3的EDTA-Na2的磷酸缓冲液的浓度分别为10mg/ml、15mg/ml以及20mg/ml)。
对比组：
1×PBS磷酸缓冲液
2.骨髓的采集及保存
选取年龄20～35岁、无传染性疾病的供者1人，签署知情同意书和手术同意书，在手术室内，硬膜外麻醉下用封闭式骨髓抽吸装置，由两侧髂骨抽取骨髓，采髓量是60ml，采髓时用含肝素钠抗凝。
低温运输至专业实验室，将骨髓分成四份，每份15ml，实验组中加入与骨髓等体积的骨髓组织保存液，对比组中加入相同体积的磷酸缓冲液，并放在2～8摄氏度分别保存，保存24h后进行造血干细胞的分离。
3.造血干细胞分离
骨髓组织保存24h后，将骨髓组织转移至150ml储液瓶中，按照4:1的比例加入6％羟乙基淀粉，自然沉降20～30min后，分离上层液体；将上层分离的细胞在4℃、1500r/min离心十分钟，并采用生理盐水清洗2次后进行细胞数量、细胞活率和细胞表面标志物的检测。
4.细胞数量和细胞活率的检测
对各组分离的细胞采用自动细胞计数仪进行细胞数量和细胞活率的计算和比较。
5.细胞表面标志物的检测
取各组分离的造血干细胞，PBS清洗2遍，调整细胞密度为5*105/ml，细胞于CD34-APC流式抗体避光孵育20min。孵育结束后，PBS清洗2遍，洗去未结合的抗体，将细胞样品上机使用流式细胞仪进行检测。
实验结果分析：
1.分离出来的细胞数量和细胞活率比较
表1细胞数量和细胞活率比较表
由细胞数量和细胞活率结果可以看出，和对比组相比，实验组获得的细胞数量和活率有极显著性差异(P＜0.01)，可得出实验组配方可极显著的提高分离出来的细胞数量和细胞活率(P＜0.01)。
2、细胞表面标志物检测比较
表2细胞表面标志物检测比较表
由细胞表面标志物检测可以看出，和对比组相比，实验组获得的细胞表面标志物有显著性差异(P＜0.05)，可得出实验组配方在显著提高分离出来的细胞数量和细胞活率的同时，对细胞特性无影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种高效获取造血干细胞的骨髓保存液，其特征在于，包括：非必需氨基酸和EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
2.根据权利要求1所述的骨髓保存液，其特征在于，所述骨髓保存液包括：
0.1mM的非必需氨基酸溶液；
10～20mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的骨髓保存液，其特征在于，所述0.1mM的非必需氨基酸溶液由MEM NEAA非必需氨基酸溶液10mM(100X)稀释100倍得到。
4.根据权利要求1所述的骨髓保存液，其特征在于，包括：
0.1mM的非必需氨基酸溶液；
10mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
5.根据权利要求1所述的骨髓保存液，其特征在于，包括：
0.1mM的非必需氨基酸溶液；
15mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的骨髓保存液，其特征在于，包括：
0.1mM的非必需氨基酸溶液；
20mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
7.一种如权利要求1～6任意一项所述的高效获取造血干细胞的骨髓保存液的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
将骨髓与骨髓保存液等体积混合后置于2～8℃的条件下可保存24小时，进行造血干细胞分离。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1349021A1 (ru) * | 1985-04-09 | 1992-01-07 | Центральный научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови | Состав дл замораживани костного мозга |
| CN104830751A (zh) * | 2015-05-29 | 2015-08-12 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种脐带静脉内皮细胞的原代分离培养方法及其试剂盒 |
| CN105230604A (zh) * | 2015-09-21 | 2016-01-13 | 深圳华毓造血干细胞研究有限公司 | 骨髓间充质干细胞保存液及其应用 |
| CN107912421A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-04-17 | 温州医科大学附属第医院 | 一种用于骨髓间充质干细胞移植的干细胞保存液 |
| CN108251353A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-07-06 | 深圳韦拓生物科技有限公司 | 一种人胚胎体外培养液及培养系统 |
| CN108651442A (zh) * | 2018-05-17 | 2018-10-16 | 广东芙金干细胞再生医学有限公司 | 一种间充质干细胞4℃储存液 |
| CN109479873A (zh) * | 2018-12-19 | 2019-03-19 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种脂肪组织保存液及其应用 |
| CN109628380A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-04-16 | 深圳韦拓生物科技有限公司 | 一种人体外受精液及其制备方法 |
| CN113736728A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-12-03 | 内蒙古大学 | 一种小鼠体细胞核移植胚胎培养液及胚胎培养方法 |
-
2022
- 2022-12-30 CN CN202211732366.9A patent/CN115812695A/zh active Pending
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1349021A1 (ru) * | 1985-04-09 | 1992-01-07 | Центральный научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови | Состав дл замораживани костного мозга |
| CN104830751A (zh) * | 2015-05-29 | 2015-08-12 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种脐带静脉内皮细胞的原代分离培养方法及其试剂盒 |
| CN105230604A (zh) * | 2015-09-21 | 2016-01-13 | 深圳华毓造血干细胞研究有限公司 | 骨髓间充质干细胞保存液及其应用 |
| CN107912421A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-04-17 | 温州医科大学附属第医院 | 一种用于骨髓间充质干细胞移植的干细胞保存液 |
| CN108251353A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-07-06 | 深圳韦拓生物科技有限公司 | 一种人胚胎体外培养液及培养系统 |
| CN108651442A (zh) * | 2018-05-17 | 2018-10-16 | 广东芙金干细胞再生医学有限公司 | 一种间充质干细胞4℃储存液 |
| CN109479873A (zh) * | 2018-12-19 | 2019-03-19 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种脂肪组织保存液及其应用 |
| CN109628380A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-04-16 | 深圳韦拓生物科技有限公司 | 一种人体外受精液及其制备方法 |
| CN113736728A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-12-03 | 内蒙古大学 | 一种小鼠体细胞核移植胚胎培养液及胚胎培养方法 |
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