CN116267889A - 一种延长全骨髓保存时间的保存液以及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种延长全骨髓保存时间的保存液，本发明采用海藻糖和EDTA‑Na2缓冲液配制的骨髓组织保存液，不仅保持骨髓组织的活性，同时防止骨髓组织中多余的血液成分抗凝，达到延长组织保存时间的方法。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种延长全骨髓保存时间的保存液以及使用方法。
背景技术
骨髓移植是通过静脉输注造血干细胞、祖细胞等，重建患者正常造血与免疫系统，从而治疗一系列疾病的治疗方法，是目前治疗白血病最有效的方法，同时也应用于自身免疫性疾病、恶性肿瘤等多种疾病的治疗或辅助性治疗。
对于晚期耐药性的恶性肿瘤，为了提高疗效，可加大化疗剂量，同时合并自身骨髓移植来防止造血系统抑制。但是预先抽取的自身骨髓，如在药物毒性未消失前回输，可导致再输入的细胞受损，所以必须将骨髓在体外保存一段时间再进行移植。对于疗程短、药物半衰期短、毒性作用消失快的化疗或放疗，患者使用4℃短期保存的骨髓作为移植疗效较好，操作方法简单异性。
目前还未有针对骨髓组织保存的专门保存液，很多机构都是抽取骨髓后直接放于4℃短期保存，导致骨髓组织凝固和造血干细胞、祖细胞等细胞数量和活率下降太快，严重影响骨髓移植的效果，因此延长骨髓保存时间是骨髓移植的关键环节之一。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种延长全骨髓保存时间的保存液以及使用方法，本发明提供的保存液不仅保持骨髓组织的活性，同时防止骨髓组织中多余的血液成分凝固，延长骨髓组织保存时间。
本发明提供了一种延长全骨髓保存时间的保存液，包括：海藻糖和EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
海藻糖又名茧蜜糖、蘑菇糖，是动物、植物、微生物中广泛分布的一种低聚糖，由于其具有抗逆、抗寒、抗旱、耐高温、吸水、保湿及保护细胞内的生物大分子等特点，使得它在食品、保健品、医药、化妆品、农业等方面有很大的应用前景。乙二胺四乙酸钠盐中的EDTA对血液中钙离子有很大亲和力，能与钙离子络合而使血液抗凝。
在本发明的一些具体实施方式中，所述延长全骨髓保存时间的保存液包括：
0.5～1.5g/ml的海藻糖；
10～20mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
在本发明的一些具体实施方式中，所述延长全骨髓保存时间的保存液包括：
0.5g/ml的海藻糖；
10mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
在本发明的一些具体实施方式中，所述延长全骨髓保存时间的保存液包括：
1.0g/ml的海藻糖；
15mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
在本发明的一些具体实施方式中，所述延长全骨髓保存时间的保存液包括：
1.5g/ml的海藻糖；
20mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
本发明还提供了一种上述延长全骨髓保存时间的保存液的使用方法，包括以下步骤：
将骨髓与保存液等体积混合，置于2～8℃保存。
本发明采用海藻糖和EDTA-Na2缓冲液配制的骨髓组织保存液，不仅保持骨髓组织的活性，同时防止骨髓组织中多余的血液成分凝固，达到延长组织保存时间的方法。
本发明提供的骨髓保存液对骨髓组织、细胞和人体无副作用，可以用于后续的科研及临床中。该保存液可显著提高骨髓组织的保存时间，防止骨髓凝固，将骨髓保存时间延长至少96小时，同时保证细胞数量、活率和细胞特性不受影响。
结果表明，本发明提供的骨髓保存液保存骨髓组织时间延长至96h，细胞活率仍处于80％以上。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的延长全骨髓保存时间的保存液以及使用方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
1.骨髓组织保存液配方：
实验组：
骨髓组织保存液是0.5-1.5g/ml海藻糖、10-20mg/mlEDTA-Na2的磷酸缓冲液。
表1 实验组配方
| 海藻糖/g/ml | EDTA-Na2的磷酸缓冲液/mg/ml | |
| 实验组1 | 0.5 | 10 |
| 实验组2 | 1 | 15 |
| 实验组3 | 1.5 | 20 |
对比组：
1×PBS磷酸缓冲液
2.骨髓的采集及保存
选取年龄20～35岁、无传染性疾病的供者1名，签署知情同意书和手术同意书，在手术室内，硬膜外麻醉下用封闭式骨髓抽吸装置，有两侧髂骨抽取骨髓，采髓量是60ml，采髓时用含肝素钠抗凝。低温运输至专业实验室，将骨髓分成四份，每份15ml，实验组中加入与骨髓等体积的骨髓组织保存液，对比组中加入相同体积的磷酸缓冲液，并放在2-8摄氏度分别保存，分别保存48h、72h和96h后取骨髓进行造血干细胞的分离。
3.造血干细胞分离
骨髓组织保存48h、72h和96h，分别从实验组和对照组中取20ml骨髓，将骨髓组织转移至150ml储液瓶中，按照4:1的比例加入6％羟乙基淀粉，自然沉降20-30min后，分离上层液体；将上层分离的细胞在4℃、1500r/min离心十分钟，并采用生理盐水清洗2次后进行细胞数量、细胞活率和细胞表面标志物的检测。
4.细胞数量和细胞活率的检测
对各组分离的造血干细胞采用自动细胞计数仪进行细胞数量和细胞活率的计算和比较。
5.细胞表面标记物的检测
取各组分离的造血干细胞，PBS清洗2遍，调整细胞密度为5*105/ml，细胞于CD34-APC流式抗体避光孵育20min。孵育结束后，PBS清洗2遍，洗去未结合的抗体，将细胞样品上机使用流式细胞仪进行检测。
6.结果分析
(1)细胞数量和细胞活率比较
表2细胞数量和细胞活率比较表
由细胞数量和细胞活率结果可以看出，和对比组相比，实验组获得的细胞数量和活率有极显著性差异(P＜0.01)，并且在96h时活率仍高于80％，可得出实验组配方可显著提高骨髓组织的保存时间。
(2)细胞流式鉴定比较
由细胞表面标志物检测可以看出，和对比组相比，实验组获得的细胞表面标志物有极显著性差异(P＜0.01)，并且在96h时仍具有比较高的表达量，可得出实验组配方在显著提高骨髓组织的保存时间的同时，对细胞特性无影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种延长全骨髓保存时间的保存液，其特征在于，包括：海藻糖和EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，包括：
0.5～1.5g/ml的海藻糖；
10～20mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，包括：
0.5g/ml的海藻糖；
10mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，包括：
1g/ml的海藻糖；
15mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
5.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，包括：
1.5g/ml的海藻糖；
20mg/ml的EDTA-Na2的磷酸缓冲液。
6.一种如权利要求1～5任意一项所述的延长全骨髓保存时间的保存液的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
将骨髓与保存液等体积混合，置于2～8℃保存。
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