CN104920340A - 一种免疫细胞保存液及其应用 - Google Patents

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CN104920340A CN201510415439.5A CN201510415439A CN104920340A CN 104920340 A CN104920340 A CN 104920340A CN 201510415439 A CN201510415439 A CN 201510415439A CN 104920340 A CN104920340 A CN 104920340A
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Abstract

本发明提供了一种免疫细胞保存液，每100mL免疫细胞保存液中包括水和以下组分：血白蛋白0.1～0.3g；维生素C 0.5～2.5g；葡萄糖0.1～0.3g；氯化钠0.476～0.513g；醋酸钠0.333～0.358g；葡萄糖酸钠0.454～0.489g；氯化钾0.033～0.036g和氯化镁0.027～0.029g。本发明提供的免疫细胞保存液在上述组分的配伍下能够使得免疫细胞在较宽温度下保存，且保持较高的活性。实验结果表明：在20℃下，本发明提供的细胞保存液保存CIK细胞48h，细胞活力可高达91.49％；保存NKT细胞48h，细胞活力可高达87.44％。

Description

一种免疫细胞保存液及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种免疫细胞保存液及其应用。
背景技术
免疫治疗，指的是刺激人体自身免疫系统来抵抗癌症的治疗方法，其中免疫系统是人体抵抗疾病的自身的防卫系统。关于免疫治疗，一个是免疫细胞的治疗，还有一个是药物的治疗。免疫细胞的治疗是指把病人的细胞从血里面分离出来，在体外用一些细胞因子，使它变成一种杀伤细胞，再回输到血液中去，这种杀伤细胞可以识别肿瘤细胞进行杀伤。还有一种是给病人直接用一些免疫制剂，像干扰素还有白介素Ⅱ等等进行治疗，以上这些都可称为免疫治疗。随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展，免疫细胞治疗已被公认为继常规的手术疗法、放射疗法和化学疗法后第四种癌症的治疗方法。免疫治疗疗效显著，弥补了传统治疗方法产生痛苦和副作用的弊端。如今，免疫细胞治疗也常作为肿瘤患者放、化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好效果。
免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，可以分为多种，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。在人体中，各种免疫细胞担任着重要的角色。如今，在临床中使用的免疫细胞主要有DC细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞、NKT细胞、NK细胞等。免疫细胞的治疗效果以及应用前景得到了世界的认可，然而，细胞制品与普通的生物制品和药品不同，细胞活性对治疗效果具有很重大的影响作用，因此，如何在运输过程中保持免疫细胞的最大活性，成为了免疫治疗的关键。
目前免疫细胞治疗大多采用生理盐水作为常用的输注介质，将体外培养扩增好的免疫细胞注射到氯化钠注射液中，加入或者不加入适量的人血白蛋白，置于0～10℃中保存、运输至目的地。虽然现有技术的保存方法简单，在临床上应用安全、方便，但是保存温度范围较窄，只能作为短暂保存，低温保存，不能常温保存，若常温保存，细胞活力下降很快。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种免疫细胞保存液及其应用，本发明提供的免疫细胞保存液使得免疫细胞能够在较宽温度下保存，且能够保持较高的细胞活性。
本发明提供了一种免疫细胞保存液，每100mL免疫细胞保存液中包括水和以下组分：
血白蛋白 0.1～0.3g；
维生素C 0.5～2.5g；
葡萄糖 0.1～0.3g；
氯化钠 0.476～0.513g；
醋酸钠 0.333～0.358g；
葡萄糖酸钠 0.454～0.489g；
氯化钾 0.033～0.036g；
和氯化镁 0.027～0.029g。
优选地，每100mL免疫细胞保存液中包括血白蛋白0.15～0.25g。
优选地，每100mL免疫细胞保存液中包括维生素C 1.0～2.0g。
优选地，每100mL免疫细胞保存液中包括葡萄糖0.15～0.25g。
优选地，每100mL免疫细胞保存液中包括水和以下组分：
血白蛋白 0.2g；
维生素C 1.5g；
葡萄糖 0.2g；
氯化钠 0.494g；
醋酸钠 0.346g；
葡萄糖酸钠 0.472g；
氯化钾 0.035g；
和氯化镁 0.028g。
本发明提供了一种上述技术方案所述的免疫细胞保存液在免疫细胞保存中的应用。
优选地，所述免疫细胞保存的温度为0℃～30℃。
优选地，所述免疫细胞保存的时间为0h～72h。
优选地，所述免疫细胞包括CIK细胞、DC细胞和NKT细胞中的一种或多种。
优选地，所述免疫细胞的密度为0.8×107个/mL～1.2×107个/mL。
本发明提供了一种免疫细胞保存液，每100mL细胞保存液中包括水和以下组分：血白蛋白0.1～0.3g；维生素C 0.5～2.5g；葡萄糖0.1～0.3g；氯化钠0.476～0.513g；醋酸钠0.333～0.358g；葡萄糖酸钠0.454～0.489g；氯化钾0.033～0.036g和氯化镁0.027～0.029g。本发明提供的免疫细胞保存液在上述组分的配伍下能够使得免疫细胞在较宽温度下保存，且保持较高的活性。实验结果表明：在20℃下，本发明提供的细胞保存液保存CIK细胞48h，细胞活力可高达91.49％；保存NKT细胞48h，细胞活力可高达87.44％。
具体实施方式
本发明提供了一种免疫细胞保存液，每100mL免疫细胞保存液中包括水和以下组分：
血白蛋白 0.1～0.3g；
维生素C 0.5～2.5g；
葡萄糖 0.1～0.3g；
氯化钠 0.476～0.513g；
醋酸钠 0.333～0.358g；
葡萄糖酸钠 0.454～0.489g；
氯化钾 0.033～0.036g；
和氯化镁 0.027～0.029g。
本发明提供的免疫细胞保存液每100mL中包括血白蛋白0.1～0.3g；优选的，每100mL免疫细胞保存液中包括血白蛋白0.15～0.25g。本发明对血白蛋白的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的血白蛋白即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述血白蛋白购自郑州莱士血液制品有限公司，规格可为：10g/瓶，50mL/瓶，血白蛋白的质量浓度为20％。
本发明提供的免疫细胞保存液每100mL中包括维生素C 0.5～2.5g；优选地，每100mL细胞保存液中包括维生素C 1.0～2.0g。本发明对维生素C的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的维生素C即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述维生素C购自广州白云山天心制药股份有限公司，规格可为0.5g/mL。在本发明中，所述维生素C对细胞起到很好的抗氧化保护作用。
本发明提供的免疫细胞保存液每100mL中包括葡萄糖0.1～0.3g；优选地，每100mL细胞保存液中包括葡萄糖0.15～0.25g。本发明对葡萄糖的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的葡萄糖即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述葡萄糖购自中国大冢制药有限公司，规格可为10g/100mL。在本发明中，所述葡萄糖在免疫细胞保存时是重要的能源物质，用来维持细胞的新陈代谢。
本发明提供的免疫细胞保存液每100mL中包括氯化钠0.476～0.513g；优选地，每100mL细胞保存液中包括0.48～0.5g。
本发明提供的免疫细胞保存液每100mL中包括醋酸钠0.333～0.358g；优选地，每100mL细胞保存液中包括0.34～0.35g。
本发明提供的免疫细胞保存液每100mL中包括葡萄糖酸钠0.454～0.489g；优选地，每100mL细胞保存液中包括0.465～0.48g。
本发明提供的免疫细胞保存液每100mL中包括氯化钾0.033～0.036g；优选地，每100mL细胞保存液中包括0.034～0.035g。
本发明提供的免疫细胞保存液每100mL中包括氯化镁0.027～0.029g；优选地，每100mL细胞保存液中包括氯化镁0.0275～0.0285g。
本发明对所述氯化钠、醋酸钠、葡萄糖酸钠、氯化钾和氯化镁的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的氯化钠、醋酸钠、葡萄糖酸钠、氯化钾和氯化镁即可，如可以采用其市售商品。
在本发明中，所述氯化钠、醋酸钠、葡萄糖酸钠、氯化钾和氯化镁的组合，与人体细胞外液的组成相似，为细胞的保存提供适宜的保存介质。
本发明提供的免疫细胞保存液每100mL中包括水。本发明对水没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的水即可，如可以采用其市售商品。
在本发明的具体实施例中，每100mL免疫细胞保存液中优选包括水和以下组分：
血白蛋白 0.2g；
维生素C 1.5g；
葡萄糖 0.2g；
氯化钠 0.494g；
醋酸钠 0.346g；
葡萄糖酸钠 0.472g；
氯化钾 0.035g；
和氯化镁 0.028g。
在本发明中，所述免疫细胞保存液优选按照以下方法制备：
将血白蛋白0.1～0.3g、维生素C 0.5～2.5g、葡萄糖0.1～0.3g、氯化钠0.476～0.513g、醋酸钠0.333～0.358g、葡萄糖酸钠0.454～0.489g、氯化钾0.033～0.036g、氯化镁0.027～0.029g和水混合，得到免疫细胞保存液。
在本发明的具体实施例中，所述免疫细胞保存液优选按照以下方法制备：
将血白蛋白溶液、维生素C溶液、葡萄糖溶液；氯化钠溶液、醋酸钠溶液、葡萄糖酸钠溶液、氯化钾溶液和氯化镁溶液混合，得到免疫细胞保存液；
每100mL免疫细胞保存液中，所述血白蛋白溶液中的血白蛋白、维生素C溶液中的维生素C、葡萄糖溶液中的葡萄糖、氯化钠溶液中的化钠、醋酸钠溶液中的醋酸钠、葡萄糖酸钠溶液中的葡萄糖酸钠、氯化钾溶液中的氯化钾和氯化镁溶液中的氯化镁的质量比为(0.1～0.3)：(0.5～2.5)：(0.1～0.3)：(0.476～0.513)：(0.333～0.358)：(0.454～0.489)：(0.033～0.036)：(0.027～0.029)。
本发明提供了一种上述技术方案所述的免疫细胞保存液在免疫细胞保存中的应用。
本发明将免疫细胞保存于上述技术方案所述的细胞保存液中。
在本发明中，所述免疫细胞保存的温度优选为0℃～30℃，更优选为18℃～25℃。
在本发明中，所述免疫细胞的密度优选为0.8×107个/mL～1.2×107个/mL，更优选为0.9×107个/mL～1.1×107个/mL。
在本发明中，所述免疫细胞优选包括CIK细胞、DC细胞和NKT细胞中的一种或多种，更优选为CIK细胞或NKT细胞。本发明对所述免疫细胞的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的免疫细胞即可，如可以采用其市售商品，也可以采用本领域技术人员熟知的制备免疫细胞的技术方案自行制备。
在本发明具体实施例中，所述CIK细胞优选按照以下方法分离得到：
将外周血和淋巴细胞分离液混合，离心，得到淋巴细胞；
将所述淋巴细胞和白细胞介素-2混合，诱导培养，得到CIK细胞。
本发明将外周血和淋巴细胞分离液混合，离心，得到淋巴细胞。本发明优选将外周血先稀释再和淋巴细胞分离液混合。本发明优选采用生理盐水稀释外周血；所述生理盐水和外周血的体积比优选为1：1。本发明对所述淋巴细胞液的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的淋巴细胞液即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述淋巴细胞液购买于上海博升生物科技有限公司。在本发明中，稀释后的外周血和淋巴细胞液的体积比优选为2:1。本发明优选将稀释后的外周血和淋巴细胞液的混合液在2000rpm下离心30min。
得到淋巴细胞后，本发明将所述淋巴细胞和白细胞介素-2混合，诱导培养，得到CIK细胞。
本发明优选将淋巴细胞进行清洗后再和白细胞介素-2混合。本发明优选采用RPMI 1640培养基进行清洗；所述清洗次数优选为2～3次。本发明将清洗后的淋巴细胞接种于培养瓶中再和白细胞介素-2混合，诱导培养，得到CIK细胞。在本发明中，所述淋巴细胞接种的密度优选为0.8～1.2×106个/mL，更优选为1×106个/mL。本发明优选在淋巴细胞中加入γ-干扰素和培养基；所述γ-干扰素加入的剂量优选为99000～105000U/mL，更优选为100000U/mL；所述培养基优选为X-VIVO 15培养基。
本发明对白细胞介素-2的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的白细胞介素-2即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述白细胞介素-2购买于上海麦约尔生物技术有限公司。在本发明中，所述白细胞介素-2的加入剂量优选为2900～3100ng/mL，更优选为3000ng/mL。
在本发明中，所述诱导培养的条件：温度为37℃、体积浓度为5％的CO2培养箱培养。在本发明中，诱导培养的时间优选为13～15天，更优选为14天。
在本发明中，诱导培养过程中优选每隔2～3天补加X-VIVO 15培养基。
在本发明中，所述免疫细胞保存的时间优选为0h～72h，更优选为6h～48h。
在本发明具体实施例中，所述NKT细胞优选按照以下方法分离得到：
将外周血和淋巴细胞分离液混合，离心，得到淋巴细胞；
将所述淋巴细胞与白细胞介素-2、白细胞介素-15和抗CD3单克隆抗体混合，诱导培养，得到NKT细胞。
本发明将外周血和淋巴细胞分离液混合，离心，得到淋巴细胞。本发明优选将外周血先稀释再和淋巴细胞分离液混合。本发明优选采用生理盐水稀释外周血；所述生理盐水和外周血的体积比优选为1：1。本发明对所述淋巴细胞液的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的淋巴细胞液即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述淋巴细胞液购买于上海博升生物科技有限公司。在本发明中，稀释后的外周血和淋巴细胞液的体积比优选为2:1。本发明优选将稀释后的外周血和淋巴细胞液的混合液在2000rpm下离心30min。
得到淋巴细胞后，本发明将所述淋巴细胞与白细胞介素-2、白细胞介素-15和抗CD3单克隆抗体混合，诱导培养，得到NKT细胞。
本发明优选将淋巴细胞先和白细胞介素-2混合、再和白细胞介素-15混合，最后再向其中加入抗CD3单克隆抗体。本发明优选将所述淋巴细胞进行清洗后再和白细胞介素-2混合。本发明优选采用RPMI 1640培养基进行清洗；所述清洗次数优选为2～3次。本发明将清洗后的淋巴细胞接种于培养瓶中再和白细胞介素-2混合，诱导培养，得到CIK细胞。在本发明中，所述淋巴细胞接种的密度优选为0.8～1.2×106个/mL，更优选为1×106个/mL。在本发明中，所述白细胞介素-2的终浓度优选为2800～3200ng/mL，更优选为3000ng/mL；所述白细胞介素-15的终浓度优选为2800～3200ng/mL，更优选为3000ng/mL；所述抗CD3单克隆抗体的终浓度优选为6800～7200ng/mL，更优选为7000ng/mL。
在本发明中，所述诱导培养的条件：温度为37℃、体积浓度为5％的CO2培养箱培养。在本发明中，诱导培养的时间优选为13～15天，更优选为14天。
在本发明中，诱导培养过程中优选每隔2～3天补加X-VIVO 15培养基。
本发明对经过保存液保存后的免疫细胞进行活力检测和表面抗原检测。在本发明中，所述活力检测的方法为：
将免疫细胞和0.4％台盼蓝体积比为9:1进行染色混匀，通过自动细胞计数仪进行计数，按照公式1计算细胞活力：
本发明采用流式细胞仪对免疫细胞进行免疫细胞的表面抗原特性。在本发明中，所述CIK细胞优选采用CD3抗体和CD56抗体的表面抗原检测。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种细胞保存液及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取30mL外周血，用生理盐水按体积1:1稀释，往两支50mL离心管中各加入15mL淋巴细胞分离液(购自上海博升生物科技有限公司)，把60mL血液稀释液混合均匀后沿离心管壁缓慢加入淋巴细胞分离液上层，每管30mL，2000rpm离心30min；吸取淋巴细胞层，用RPMI1640培养基清洗两次，通过自动细胞计数仪进行计数，根据计数结果按1×106个/mL接种于培养瓶中；向培养瓶中添加体积分数1％ X-VIVO 15培养基、浓度为100000U/mL的IFN-γ(γ-干扰素，购自上海麦约尔生物技术有限公司)，次日再加入1％ X-VIVO 15培养基、浓度为3000ng/mL的IL-2(白细胞介素-2，购自上海麦约尔生物技术有限公司)，诱导培养CIK细胞，往后每隔2～3天进行计数补液处理。
吹散并抽取经过两周体外扩增诱导培养的CIK细胞，按CIK细胞悬液：0.4％台盼蓝体积比为9:1进行染色混匀，通过自动细胞计数仪进行计数，根据计数结果取4×107个平均分成四份，每份1×107个，备用；
配制免疫细胞保存液：
将100μL 0.2g/mL的血白蛋白溶液、200μL 0.5g/mL的维生素C注射液、200μL 10g/100mL葡萄糖注射液、19.5mL 5.26g/1000mL的氯化钠溶液、19.5mL 3.68g/1000mL的醋酸钠溶液、19.5mL 5.02g/1000mL的葡萄糖酸钠溶液、19.5mL 0.37g/1000mL的氯化钾溶液和19.5mL 0.3g/1000mL的氯化镁溶液混合，充分混匀，得到免疫细胞保存液；
将上述备用的一份CIK细胞在400g下离心5min，弃去培养基，采用上述免疫细胞保存液对CIK细胞进行重悬，18℃下保存0h、6h、12h、24h和48h的CIK细胞进行活力检测，检测结果如表1所示，表1为对照组1及实施例1～3培养的CIK细胞的活力检测结果。
对照组1：
将200μL 0.2g/mL的血白蛋白溶液加入19.8mL、0.154mol/L的氯化钠注射液中，充分混匀，常温放置备用，得到普通免疫细胞保存液；将普通免疫细胞培养液对上述备用的CIK细胞进行重悬，18℃下保存0h、6h、12h、24h和48h的CIK细胞进行活力检测，检测结果如表1所示：
表1 对照组1及实施例1～3培养的CIK细胞的活力检测结果
对照组1 实施例1 实施例2 实施例3
0h细胞活力 97.76％ 97.76％ 97.76％ 97.76％
6h细胞活力 86.83％ 96.32％ 96.51％ 95.86％
12h细胞活力 73.47％ 94.18％ 94.33％ 94.07％
24h细胞活力 52.62％ 92.27％ 93.65％ 92.43％
48h细胞活力 37.28％ 89.68％ 91.49％ 90.21％
根据计数结果，取2×106个细胞，平均分至两个离心管中，其中一管作为对照，另一管作为实验组，对照组和实验组分别在1500rpm下离心5min，弃上清液；
加入1mL含10％FBS(胎牛血清)的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清液，重复此步骤1次；
弃上清液后，每管加入200μL含10％FBS的PBS进行重悬细胞，对照组和实验组中分别加入2μL CD3和CD56抗体，避光孵育20min；
对照组和实验组中分别加入500μL含10％FBS的PBS重悬细胞，1500rpm离心5min洗掉剩余抗体；
弃上清液，对照组和实验组中分别加入500μL含10％FBS的RPMI 1640培养基(Gibco，购自上海玉博生物科技有限公司)，过200目筛，上机检测CIK细胞的表面抗原。
本发明将对照组1制备的普通细胞保存液保存CIK细胞48h后的CIK细胞进行流式检测，结果如表2所示，表2为对照组1及实施例1～3培养的CIK细胞的流式检测结果：
表2 对照组及实施例1～3培养的CIK细胞的流式检测结果
实施例2
将200μL 0.2g/mL的血白蛋白溶液、600μL 0.5g/mL的维生素C注射液、400μL 10g/100mL葡萄糖注射液、18.8mL 5.26g/1000mL的氯化钠溶液、18.8mL 3.68g/1000mL的醋酸钠溶液、18.8mL 5.02g/1000mL的葡萄糖酸钠溶液、18.8mL 0.37g/1000mL的氯化钾溶液和18.8mL 0.3g/1000mL的氯化镁溶液混合，充分混匀，得到免疫细胞保存液；
将实施例1备用的一份CIK细胞进行400g离心5min，弃去培养基，采用上述免疫细胞培养液对CIK细胞进行重悬，20℃下保存0h、6h、12h、24h和48h的CIK细胞进行活力检测，检测结果如表1所示。
本发明对本实施例2制备的保存液培养的CIK细胞0h后的流式检测，检测结果见表2所示。
实施例3
将300μL 0.2g/mL的血白蛋白溶液、1mL 0.5g/mL的维生素C注射液、600μL 10g/100mL葡萄糖注射液、18.1mL 5.26g/1000mL的氯化钠溶液、18.1mL 3.68g/1000mL的醋酸钠溶液、18.1mL 5.02g/1000mL的葡萄糖酸钠溶液、18.1mL 0.37g/1000mL的氯化钾溶液和18.1mL 0.3g/1000mL的氯化镁溶液混合，充分混匀，得到免疫细胞保存液；
将实施例1备用的一份CIK细胞进行400g离心5min，弃去培养基，采用上述免疫细胞培养液对CIK细胞进行重悬，25℃下保存0h、6h、12h、24h和48h的CIK细胞进行活力检测，检测结果如表1所示。
发明对实施例3制备的保存液保存CIK细胞48h后进行流式检测，检测结果如表2所示。
实施例4
取30mL外周血，用生理盐水按体积1:1稀释，往两支50mL离心管中各加入15mL淋巴细胞分离液(购自上海博升生物科技有限公司)，把60mL血液稀释液混合均匀后沿离心管壁缓慢加入淋巴细胞分离液上层，每管30mL，2000rpm离心30min；吸取淋巴细胞层，用RPMI1640培养基清洗两次，通过自动细胞计数仪进行计数，根据计数结果按1×106个/mL接种于培养瓶中；向培养瓶中添加体积分数1％ X-VIVO 15培养基、浓度为3000ng/mL的IL-2(白细胞介素-2，购自上海麦约尔生物技术有限公司)和1％ X-VIVO 15培养基、浓度为3000ng/mL的IL-15(白细胞介素-15，购自上海麦约尔生物技术有限公司)以及1％ X-VIVO 15培养基、浓度为7000ng/mL的OKT-3(抗CD3单克隆抗体，购自上海麦约尔生物技术有限公司)，诱导培养NKT细胞，往后每隔2～3天进行计数补液处理。
吹散并抽取经过两周体外扩增诱导培养的NKT细胞，按NKT细胞悬液：0.4％台盼蓝体积比为9:1进行染色混匀，通过自动细胞计数仪进行计数，根据计数结果取4×107个平均分成四份，每份1×107个，备用；
配制NKT细胞保存液：
将100μL 0.2g/mL的血白蛋白溶液、200μL 0.5g/mL的维生素C注射液、200μL 10g/100mL葡萄糖注射液、19.5mL 5.26g/1000mL的氯化钠溶液、19.5mL 3.68g/1000mL的醋酸钠溶液、19.5mL 5.02g/1000mL的葡萄糖酸钠溶液、19.5mL 0.37g/1000mL的氯化钾溶液和19.5mL 0.3g/1000mL的氯化镁溶液混合，充分混匀，得到NKT细胞保存液；
将上述备用的一份NKT细胞在400g下离心5min，弃去培养基，采用上述免疫细胞保存液对NKT细胞进行重悬，18℃下保存0h、6h、12h、24h和48h的NKT细胞进行活力检测，检测结果如表2所示，表2为对照组2及实施例4～6培养的NKT细胞的活力检测结果。
对照组2：
将200μL 0.2g/mL的血白蛋白溶液加入19.8mL、0.154mol/L的氯化钠注射液中，充分混匀，常温放置备用，得到普通免疫细胞保存液；将普通免疫细胞培养液对上述备用的NKT细胞进行重悬，18℃下保存0h、6h、12h、24h和48h的NKT细胞进行活力检测，检测结果如表3所示，表2为对照组2及实施例4～6培养的NKT细胞的活力检测结果：
表3 对照组2及实施例4～6培养的NKT细胞的活力检测结果
对照组2 实施例4 实施例5 实施例6
0h细胞活力 95.48％ 95.48％ 95.48％ 95.48％
6h细胞活力 88.55％ 93.32％ 94.16％ 92.89％
12h细胞活力 75.84％ 91.18％ 92.28％ 90.27％
24h细胞活力 51.57％ 89.27％ 90.56％ 88.73％
48h细胞活力 33.32％ 86.68％ 87.44％ 85.21％
本发明采用流式细胞仪对对照组2细胞保存液保存NKT细胞48h后进行流式检测，检测结果如表4所示，表4为对照组2及实施例4～6培养的NKT细胞的流式检测结果：
表4 对照组2及实施例4～6培养的NKT细胞的流式检测结果
本发明采用流式细胞仪对实施例4制备的细胞保存液保存NKT细胞48h后进行流式检测，检测结果如表4所示。
实施例5
将200μL 0.2g/mL的血白蛋白溶液、600μL 0.5g/mL的维生素C注射液、400μL 10g/100mL葡萄糖注射液、18.8mL 5.26g/1000mL的氯化钠溶液、18.8mL 3.68g/1000mL的醋酸钠溶液、18.8mL 5.02g/1000mL的葡萄糖酸钠溶液、18.8mL 0.37g/1000mL的氯化钾溶液和18.8mL 0.3g/1000mL的氯化镁溶液混合，充分混匀，得到免疫细胞保存液；
将实施例4备用的一份NKT细胞进行400g离心5min，弃去培养基，采用上述免疫细胞培养液对NKT细胞进行重悬，20℃下保存0h、6h、12h、24h和48h的NKT细胞进行活力检测，检测结果如表3所示。
本发明采用流式细胞仪对本实施例5制备的保存液培养的NKT细胞0h后的流式检测，检测结果如表4所示。
本发明采用流式细胞仪对本实施例5制备的保存液培养的NKT细胞48h后进行流式检测，检测结果如表4所示。
实施例6
将300μL 0.2g/mL的血白蛋白溶液、1mL 0.5g/mL的维生素C注射液、600μL 10g/100mL葡萄糖注射液、18.1mL 5.26g/1000mL的氯化钠溶液、18.1mL 3.68g/1000mL的醋酸钠溶液、18.1mL 5.02g/1000mL的葡萄糖酸钠溶液、18.1mL 0.37g/1000mL的氯化钾溶液和18.1mL 0.3g/1000mL的氯化镁溶液混合，充分混匀，得到免疫细胞保存液；
将实施例4备用的一份NKT细胞进行400g离心5min，弃去培养基，采用上述免疫细胞培养液对NKT细胞进行重悬，25℃下保存0h、6h、12h、24h和48h的NKT细胞进行活力检测，检测结果如表3所示。
本发明采用流式细胞仪对实施例6制备的保存液保存NKT细胞48h后进行流式检测，检测结果如表4所示。
由以上实施例可知，本发明提供了一种免疫细胞保存液，每100mL免疫细胞保存液中包括水和以下组分：血白蛋白0.1～0.3g；维生素C 0.5～2.5g；葡萄糖0.1～0.3g；氯化钠0.476～0.513g；醋酸钠0.333～0.358g；葡萄糖酸钠0.454～0.489g；氯化钾0.033～0.036g和氯化镁0.027～0.029g。本发明提供的免疫细胞保存液在上述组分的配伍下能够使得免疫细胞在较宽温度下保存，且保持较高的活性。实验结果表明：在20℃下，本发明提供的细胞保存液保存CIK细胞48h，细胞活力可高达91.49％；保存NKT细胞48h，细胞活力可高达87.44％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种免疫细胞保存液，每100mL免疫细胞保存液中包括水和以下组分：
血白蛋白 0.1～0.3g；
维生素C 0.5～2.5g；
葡萄糖 0.1～0.3g；
氯化钠 0.476～0.513g；
醋酸钠 0.333～0.358g；
葡萄糖酸钠 0.454～0.489g；
氯化钾 0.033～0.036g；
和氯化镁 0.027～0.029g。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞保存液，其特征在于，每100mL免疫细胞保存液中包括血白蛋白0.15～0.25g。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞保存液，其特征在于，每100mL免疫细胞保存液中包括维生素C 1.0～2.0g。
4.根据权利要求1所述的免疫细胞保存液，其特征在于，每100mL免疫细胞保存液中包括葡萄糖0.15～0.25g。
5.根据权利要求1所述的免疫细胞保存液，其特征在于，每100mL免疫细胞保存液中包括水和以下组分：
血白蛋白 0.2g；
维生素C 1.5g；
葡萄糖 0.2g；
氯化钠 0.494g；
醋酸钠 0.346g；
葡萄糖酸钠 0.472g；
氯化钾 0.035g；
和氯化镁 0.028g。
6.一种权利要求1～5任意一项所述的免疫细胞保存液在免疫细胞保存中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞保存的温度为0℃～30℃。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞保存的时间为0h～72h。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞包括CIK细胞、DC细胞和NKT细胞中的一种或多种。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞的密度为0.8×107个/mL～1.2×107个/mL。
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